JP2004329153A - Infant severe myoclonic epilepsy-related gene mutation and diagnostic method for severe infantile myoclonic epilepsy - Google Patents

Abstract

The present invention provides a novel gene mutation related to infant myoclonic epilepsy in SCN1A and a diagnostic method using the gene mutation.
In the specific nucleotide sequence derived from an infant, the following groups: a at position 302g, a deletion at position 429-430gt, c at position 568, t at position 1303g, t at position 2772 Position g is c, position 2772 g is a, position 2801 t is a, position 2806 c is t, position 2807 g is a, position 2825 g is a, position 3494-3495 tt is deleted, C at position 4034, deletion of aat at positions 4641-4643, t at position 4903c, c at position 5045t, g at position 5051a, deletion of ttt at position 5266-5268, position 5312 A polynucleotide having one or more mutations in which position a is g and position 5704 c is t, and a polypeptide having an amino acid mutation caused by the nucleotide mutation.
[Selection diagram] Fig. 1

Description

【００１３】
前記の発明（１）〜（１３）は、以上のとおりの新規な知見に基づいて完成されたものである。
【００１４】
なお、この発明において「許容選択」とは、前記のヌクレオチド変異群（ａ）〜（ｓ）、またはアミノ酸変異群（Ａ）〜（Ｓ）の２以上の変異が存在する場合、その組み合わせの選択が可能であることを意味する。例えば、ヌクレオチド変異（ｅ）および（ｆ）は同一ヌクレオチドに対する異なる置換変異であるため、これらが一つのポリヌクレオチド配列内で同時に存在することはない。従って、変異（ｅ）および（ｆ）の選択が許容されることはない。また、アミノ酸置換（Ｂ）を有するポリペプチドは配列番号２の第１４８位からＣ端側が存在しない短鎖ペプチドであるため、共存しうる変異はアミノ酸変異（Ａ）のみである。同様に、フレームシフトおよび停止コドンを生じさせるアミノ酸変異（Ｄ）、（Ｊ）、（Ｋ）、（Ｎ）は、それらよりＣ端側の変異を共存することはない。
【００１５】
また「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ヌクレオチドＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が１００個以上結合した分子を言い、「オリゴヌクレオチド」とは２−９９個連結した分子を言う。なお、この発明におけるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは１本鎖または２本鎖であり、１本鎖の場合はセンス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方である。
【００１６】
「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）によって互いに結合した３４個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味し、「オリゴヌクレオチド」は２−３３個のアミノ酸残基からなる分子を意味する。
【００１７】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ， １９９５等に記載されている。
【００１８】
【発明の実施の形態】
この出願の発明（１）は、ヒトＳＣＮＡ１Ａ遺伝子に由来する変異ポリヌクレオチドであって、配列番号１のＤＮＡ配列において、表１に示したヌクレオチド変異（ａ）〜（ｓ）のいずれか１以上を有するポリヌクレオチドである。
【００１９】
この発明（１）のポリヌクレオチドは、例えば、後記の発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、ＳＭＥＩ患者の全ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記の発明（４）のプライマーセットを用い、ＳＭＥＩ患者のｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲによって単離することもできる。あるいは、野生型ＳＣＮＡ１ＡのｃＤＮＡに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたｃＤＮＡは、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＮ（Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法およびＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００２０】
この発明（１）のポリヌクレオチドは、後記発明（１０）のＳＭＥＩ診断方法に使用することができる。また、後記発明（６）のポリペプチドを遺伝子工学的に作成する場合の材料としても使用することができる。
【００２１】
この出願の発明（２）は、前記発明（１）のポリヌクレオチドの一部であって、各々の変異箇所を含む２０〜１００の連続したＤＮＡ配列からなるオリゴヌクレオチドである。この発明（２）のオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４７：４１１−４１８； Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６６１； Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２５：３４４０−３４４４； Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １９：３７３−３８０； Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７８８６−７８９６； Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０； Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９； Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ． Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９； 米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。また、発明（１）のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
【００２２】
このようなオリゴヌクレオチドは、特にプローブとして使用する場合には、標識物質によって標識化することができる。標識は、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法または非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ Ｄｙｅ ^ＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ^２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することが好ましい。
【００２３】
発明（２）のオリゴヌクレオチドもまた、後記発明（１０）のＳＭＥＩ診断方法に使用することができる。あるいは、後記発明（７）のオリゴペプチドを遺伝子工学的に作成するための材料として使用することもできる。
【００２４】
この出願の発明（３）は、前記発明（１）ポリヌクレオチドまたは前記発明（２）のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体ＤＮＡ由来のポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）である。ここで、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムＤＮＡとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、ＮａＣｌ約７５０ ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約７５ ｍＭ以下、より好ましくはＮａＣｌ約５００ ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約５０ ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約２５０ ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約２５ ｍＭ以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約３５％以上、最も好ましくは約５０％以上である。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上、より好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）の濃度、およびキャリアーＤＮＡの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好まし態様としては、７５０ ｍＭ ＮａＣｌ、７５ ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび１％ ＳＤＳの条件で、３０℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、１００ μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、３７℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、２５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２５ ｍＭ クエン酸三ナトリウム、１％ ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００ μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの条件で、４２℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはＮａＣｌ約３０ ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約３ ｍＭ以下、最も好ましくはＮａＣｌ約１５ ｍＭ以下およびクエン酸三ナトリウム約１．５ ｍＭ以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、最も好ましくは約６８℃以上である。１つの好ましい態様としては、３０ ｍＭ ＮａＣｌ、３ ｍＭ クエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、２５℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、１５ ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、４２℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、１５ ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ ＳＤＳの条件で、６８℃の温度により洗浄を行うことである。
【００２５】
発明（３）のポリヌクレオチドは、例えば、発明（２）のオリゴヌクレオチドをプローブとして、以上のとおりのストリンジェントはハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、ＳＭＥＩ患者の染色体ＤＮＡから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
【００２６】
この発明（３）のポリヌクレオチドは、後記発明（９）の診断方法において検出対象等となる。
【００２７】
この出願の発明（４）は、前記発明（３）のポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド（ゲノムＤＮＡ）、または前記発明（３）ポリヌクレオチドから転写されるｍＲＮＡをＰＣＲ増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１（ＳＣＮＡ１Ａ）のそれぞれの変異（置換または欠失）箇所を含む１５〜３０ｎｔの連続したＤＮＡ配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の各変異箇所の５’側または３’側の任意の連続ＤＮＡ配列またはその相補配列とすることができる。
【００２８】
これらのプライマーセットは、それぞれの変異箇所含む配列番号１に基づいて公知のＤＮＡ合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（米国）製］、ＧＥＮＥＴＹＸ［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００２９】
この発明（４）のプライマーセットは、後記発明（１２）のＳＭＥＩ診断方法等に使用することができる。
【００３０】
この出願の発明（５）は、前記のポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドをキャプチャープローブとして備えているマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）である。マイクロアレイの作製方法としては、固相担体表面で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（オン・チップ法）と、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する方法とが知られている。この発明のマイクロアレイは、このいずれの方法でも作成することができる。オン・チップ法としては、光照射で選択的に除去される保護基の使用と、半導体製造に利用されるフォトリソグラフィー技術および固相合成技術とを組み合わせて、微少なマトリックスの所定の領域での選択的合成を行う方法（マスキング技術：例えば、Ｆｏｄｏｒ， Ｓ．Ｐ．Ａ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７， １９９１）等によって行うことができる。一方、予め調製したオリゴヌクレオチドを固相担体表面に固定する場合には、官能基を導入したオリゴヌクレオチドを合成し、表面処理した固相担体表面にオリゴヌクレオチドを点着し、共有結合させる（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ， Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２１２１−２１２５， １９９４； Ｇｕｏ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：５４５６−５４６５， １９９４）。オリゴヌクレオチドは、一般的には、表面処理した固相担体にスペーサーやクロスリンカーを介して共有結合させる。ガラス表面にポリアクリルアミドゲルの微小片を整列させ、そこに合成オリゴヌクレオチドを共有結合させる方法も知られている（Ｙｅｒｓｈｏｖ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４９１３， １９９６）。また、シリカマイクロアレイ上に微小電極のアレイを作製し、電極上にはストレプトアビジンを含むアガロースの浸透層を設けて反応部位とし、この部位をプラスに荷電させることでビオチン化オリゴヌクレオチドを固定し、部位の荷電を制御することで、高速で厳密なハイブリダイゼーションを可能にする方法も知られている（Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉ， Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：１１１９−１１２３， １９９７）。この発明のいマイクロアレイは、以上のいずれの方法によっても作製することができる。
【００３１】
この出願の発明（６）は、発明（１）または発明（３）のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、表１に示したアミノ酸変異（Ａ）〜（Ｓ）のいずれか１以上を有するポリペプチドである。
【００３２】
すなわち、これらのポリペプチドにおけるアミノ酸変異は、前記発明（１）のポリヌクレオチドにおけるミスセンス変異または欠失変異によって、正常（野生型）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸が変異するか、フレームシフトまたは停止コドンによって短鎖のポリペプチドとなっている。
【００３３】
これらのポリペプチドは、ＳＭＥＩ患者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは前記発明（１）のポリヌクレオチド（変異ｃＤＮＡ）を用いて組換えＤＮＡ技術で生産する方法などにより取得することができる。この発明（６）のポリペプチドは、例えば、後記発明（２３）のＳＭＥＩ診断方法の検査対象とすることができる。
【００３４】
この出願の発明（７）は、前記発明（６）のポリペプチドの一部であって、各々のアミノ酸変異を含む５−３０の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらのオリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは発明（６）のポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、後記発明（８）の抗体作製のための抗原として使用することができる。
【００３５】
発明（８）の抗体は、前記発明（７）のオリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、発明（６）のポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ断片等が全て含まれる。このような抗体は、例えばポリクローナル抗体の場合には、前記のオリゴペプチドを免疫原として動物を免役した後、血清から得ることができる。あるいは、上記の真核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、動物の筋肉や皮膚に導入した後、血清を採取することによって作製することができる。動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどが用いられる。また、モノクローナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単クローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、１９９０年； ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ” Ｊａｍｅｓ Ｗ． Ｇｏｄｉｎｇ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９６）に従って作成することができる。これらの抗体は、発明（６）のポリペプチドを特異的に認識することができ、後記発明（１２）の診断方法等に使用することができる。
【００３６】
この出願の発明（９）は、被験者が後年、ＳＭＥＩを発症するか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体ＤＮＡを単離し、このＤＮＡ中に、発明（３）のポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者をＳＭＥＩハイリスクと判定する。被験者は、熱性けいれん経験者やその家族とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、発明（１０）または（１１）の方法が好ましい。
【００３７】
発明（１０）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡと、前記発明（１）のポリヌクレオチドまたは発明（２）のオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者がＳＭＥＩに関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体ＤＮＡまたはそのｍＲＮＡとポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、例えば、前記の標識プローブやマイクロアレイを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばＡｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅ法、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法等の公知の方法を採用することができる。また、マイクロアレイでの診断は、例えば以下のとおりに行うことができる。すなわち、被験者の生体試料（例えば血液等）から単離したｍＲＮＡを鋳型として、ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅する。その際に、標識ｄＮＴＰを取り込ませて標識ｃＤＮＡとする。この標識ｃＤＮＡをマクロアレイに接触させ、マイクロアレイのキャプチャープローブ（オリゴヌクレオチド）にハイブリダイズしたｃＤＮＡを検出する。ハイブリダイゼーションは、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注して標識ｃＤＮＡ水性液を、マイクロアレイ上に点着することによって実施することができる。点着の量は、１〜１００ｎｌ程度とすることができる。ハイブリダイゼーションは、室温〜７０℃の温度範囲で、６〜２０時間の範囲で実施することが好ましい。ハイブリダイゼーション終了後、界面活性剤と緩衝液との混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の標識ｃＤＮＡを除去する。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが好ましい。
【００３８】
また発明（１１）の方法では、被験者から単離した染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型とし、前記発明（４）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った場合のＰＣＲ産物の有無を検出する。被験者がＳＭＥＩに関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのＰＣＲ産物が得られる。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＰＣＲ−ＣＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法等を行ってもよい。また、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法、Ｐｒｉｍｅｒ Ｏｌｉｇｏ Ｂａｓｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法の公知の方法を採用することもできる。
【００３９】
この出願の発明（１２）もまた、被験者が後年、ＳＭＥＩを発症するか否かを診断する方法であり、被験者から単離した生体試料中に、前記発明（６）のポリペプチドが存在する場合に、その被験者をＳＭＥＩハイリスクと判定する。ポリペプチドの存在は様々な公知方法によって行うことができるが、発明（１３）の方法が好ましい。発明（１３）の方法は、発明（８）の抗体を用いる方法であって、特に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｎｕｍｂｅｒが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、^１２５Ｉや^３Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ＥＬＩＳＡ法」）も好ましく用いることができる。
【００４０】
以下、前記発明の基礎となった遺伝子変異を確認したスクリーニングの手続と結果を示す。
１．方法
１−１．患者
ＳＭＥＩまたはＳＭＥＢの診断は、まず、小児神経科医により、国際抗てんかん連盟の分類および用語委員会のガイドライン（非特許文献１）等における以下の基準に従った。
（１）家族歴に、てんかんまたは熱性痙攣の高い罹患率があること。
（２）発症前の身体および神経の発育が正常であること。
（３）全身性または一側性の熱性および無熱性の間代性発作、ミオクロニー攣縮の二次的な出現、および頻発性部分発作が生後１年間に出現したこと。
（４）初期の段階における脳波（ＥＥＧ）に発作性波形は存在しないが、光感受性の初期の出現とともに、全身性の棘波、多棘波、および限局性の異常波形が出現したこと。
（５）初期には精神運動性の発育が正常であるが、生後２年目から、失調、錐体路徴候、発作性ミオクローヌスの出現とともに精神遅延が顕在化したこと。
（６）すべての発作型はあらゆる治療手段に対し抵抗性であること。
【００４１】
以上の６基準の全てが満たされた場合に、ＳＭＥＩと診断された。一方、上記の基準に合致している患者に、以下の排他基準がある場合にはＳＭＥＢと診断した。
（７）発作が生後１年以降に始まっている場合。
（８）ミオクロニー発作および／または異型性アブサンスがない場合。
（９）重大な精神運動性遅延の証拠がない場合。
【００４２】
最終的な調査対象は、ＳＭＥＩ２２例（男性９および女性１３）と、ＳＭＥＢ３９例（男性１３および女性２６）である。また健康なボランティア９６例を対照群とした。
１−２．遺伝子分析
ＥＤＴＡ処理した全血標本より、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ１ＢおよびＳＣＮ２Ｂの遺伝子異常のスクリーニングは、自動シーケンサーによる直接的な配列決定法を用いて行った（Ｓｕｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ５７， ７０３−７０５； Ｓｕｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９８（１１）， ６３８４−６３８９）。遺伝子の全てのエクソンをＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびＰＣＲ反応条件は文献（Ｓｕａｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ５８（７）， １１２２−１１２４；Ｓｕｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ５７， ７０３−７０５）の記載されたものを使用した。各ｍＲＮＡの参考配列は、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録配列を使用した。ヒトＳＣＮ２Ａ：Ｍ９４０５５、ヒトＳＣＮ３Ａ：ＡＪ２５１５０７、ヒトＳＣＮ５Ａ：Ｍ７７２３５、ヒトＳＣＮ８Ａ：ＡＢ０２７５６７．１、ヒトＳＣＮ１０Ａ：ＡＦ１１７９０７．１、ラットｓｃｎ１ａ：Ｍ２２２５３、フグ：Ｄ３７９７７、デンキウナギ：Ｍ２２２５２、ショウジョウバエ：Ｍ３２０７８、イカ：Ｌ１９９７９、クラゲ：ＡＦ０４７３８０。
１−３．統計的分析
異常の発生率の差は、χ^２検定を用いた統計的有意性に基づき判定した。Ｐ値が０．０５未満の場合に統計的有意差とした。
２．結果
ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢ群の間には、性比、低−および高度の熱誘導性発作、精神の発育遅滞、光感受性、および治療抵抗性発作の頻度などの主要な兆候について何ら有意差がなかった。ＳＭＥＢ３９例では、３例は生後１年以後に初回の発作があり、４例には見かけ上の精神運動の遅延はなく（ＩＱ，ＤＱ＞８０）、また２６例にはミオクロニー攣縮がなかった。光感受性は１１例の患者に観察された［すなわち、ＳＭＥＩ２２例中８例（３６．４％）、ＳＭＥＢ３９例中３例（７．７％）］。従って、光感受性はＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意であった（ｐ＜０．０５）。
【００４３】
ＳＭＥＩ患者２２例のうち１４例（６３．６％）において、ＳＣＮ１Ａのミスセンス変異３例、ナンセンス変異８例、結果として未成熟の停止を生じるフレームシフト変異２例、インフレーム欠失変異１例が同定された（表２および図１）。またＳＭＥＢ患者３９例のうち１２例（３０．８％）においては、ＳＣＮ１Ａのミスセンス変異９例、ナンセンス変異２例、インフレーム欠失変異１例が検出された（表２および図１）。すなわち図１においてＳＭＥＩの変異は、ミスセンス変異（黒丸数字）、ナンセンス変異（黒四角数字）、結果として停止コドンを生じるフレームシフト（黒三角数字）、およびインフレーム欠失変異（黒ひし形数字）により示されている。またＳＭＥＢの変異はミスセンス変異（白丸数字）、ナンセンス変異（白四角数字）、およびインフレーム欠失変異（白ひし形数字）により示されている。具体的には、ＳＭＥＩにおける変異は以下のとおりである。なお、変異の記載方法は、文献（Ｄｕｎｎｅｎ， Ｊ． ａｎｄ Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ， Ｓ． （２００１） Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， １０９， １２１−１２４）に従った。
ミスセンス変異（黒丸）：
１． ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃ： Ｍ９２４Ｉ
２． ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ： Ｒ９３６Ｃ
３．ｃ．５０５１Ａ＞Ｇ： Ｙ１６８４Ｃ
ナンセンス変異（黒四角）：
１． ｃ．６６４Ｃ＞Ｔ： Ｒ２２２Ｘ
２． ｃ．１３０３Ｇ＞Ｔ： Ｅ４３５Ｘ
３． ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ： Ｒ７０１Ｘ
４． ｃ．２８２５Ｇ＞Ａ： Ｗ９４２Ｘ
５． ｃ．４１８９Ｃ＞Ｔ： Ｒ１３９７Ｘ
６． ｃ．４９０３Ｃ＞Ｔ：Ｒ１６３５Ｘ
７． ｃ．５６４４Ｃ＞Ｔ： Ｒ１８８２Ｘ
フレームシフト変異（黒三角）：
１． ｃ．４９２−３０ｄｅｌＧＴ：Ｖ１４３ｆｓＸ１４８
２． ｃ．３４９４−５ｄｅｌＴＴ：Ｌ１１６５ｆｓＸ１１７２
インフレーム変異（黒ひし形）：
ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ： Ｍ１５４９ｄｅｌ
またＳＭＥＢにおける変異は以下のとおりである。
ミスセンス変異（白丸）：
１． ｃ．３０２Ｇ＞Ａ： Ｒ１０１Ｑ
２． ｃ．５６８Ｔ＞Ｃ： Ｗ１９０Ｒ
３． ｃ．２７７２Ｇ＞Ａ： Ｍ９２４Ｉ
４． ｃ．２８０１Ｔ＞Ｃ： Ｖ９３４Ａ
５． ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ： Ｒ９３６Ｃ
６． ｃ．２８０７Ｇ＞Ａ： Ｒ９３６Ｈ
７． ｃ．４０３４Ｔ＞Ｃ： Ｌ１３４５Ｐ
８． ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ： Ｆ１６８２Ｓ
９． ｃ．５３１２Ａ＞Ｇ： Ｙ１７７１Ｃ
ナンセンス変異（白四角）：
１． ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ： Ｒ７０１Ｘ
２． ｃ．５７０４Ｃ＞Ｔ： Ｒ１９０２Ｘ
インフレーム変異（白ひし形）：
ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ
一方、調べられた領域内では、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、およびＳＣＮ２Ｂの変異は検出されなかった。全調査集団６１例の患者のうち、２６例（４２．６％）に変異が見られ、残りのＳＭＥＩ８例とＳＭＥＢ２７例の患者には変異は見られなかった。従って、変異はＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意に多い（ｐ＜０．０５）。さらに、分子切端ナンセンスまたはフレームシフト変異もＳＭＥＢよりもＳＭＥＩにおいて有意に多く見られた（４５．５対５．１％：ｐ＜０．００１）が、一方ミスセンス変異の発生率では二つの群間に何ら差異がなかった（ＳＭＥＩで１８．２％対ＳＭＥＢで２５．６％、表２）。光感受性と突然変異の間には何ら関係がなかった。
【００４４】
【表２】

【００４５】
興味深いことに、そのような変異の中で、一つのナンセンス変異および二つのミスセンス変異がＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの双方において見られた（図１）。また、先にＳＭＥＩ患者２例について報告されているナンセンス変異ｃ．２１０１Ｃ＞Ｔ：Ｒ７０１Ｘ（Ｏｈｍｏｒｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２９５（１）， １７−２３；Ｓｕａｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ５８（７）， １１２２−１１２４）は、今回の調査でもＳＭＥＩ患者１例と、深度精神運動遅滞のないＳＭＥＢ患者１例において同定された。ミスセンス突然変異（ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ： Ｒ９３６Ｃ）は、ＳＭＥＩ患者１例およびミオクロニー攣縮のない１例のＳＭＥＢにおいて検出された。また同じアミノ酸の置換をもたらす二つのミスセンス変異（ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃ： Ｍ９２４Ｉおよびｃ．２７７２Ｇ＞Ａ： Ｍ９２４Ｉ）が、ＳＭＥＩ患者１例およびミオクロニー攣縮のないＳＭＥＢ患者１例において各々同定された。
【００４６】
８例のナンセンス然変異のうち３例は、ＳＭＥＩ日本人患者における初期の報告と同様であった（Ｏｈｍｏｒｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２９５（１）， １７−２３；Ｓｕａｇａｗａｒａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ， ５８（７）， １１２２−１１２４）。一方、ＳＭＥＩ患者２例において同定された２つのフレームシフト変異は、これまで報告されていない新規変異であった。このようなナンセンス変異およびフレームシフト変異のすべてはヘテロ接合性であり、多くの親の標本が入手されるにつれてｄｅ ｎｏｖｏであることが判明した。すなわち、１３の症例のうち９例について両親が遺伝的分析を受け、ｄｅ ｎｏｖｏであることが確認された。１例については母親のみが突然変異をもたないことが確認された。
【００４７】
ＳＣＮ１Ａ内の二つのインフレーム欠失変異（ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ： Ｍ１５４９ｄｅｌおよびｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ）は、各々ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢであり、それぞれの原因となる遺伝的異常についての新規なメカニズムを提案する（図２）。すなわち、ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ： Ｍ１５４９ｄｅｌをもつ患者は１２歳の少女であり、その臨床的表現型はＳＭＥＩの診断基準を満たしている。このヌクレオチド欠失は、ドメインＩＶの第１のセグメント４の高度に保存されたメチオニンを消失させる（図１、図３Ａおよび３Ｂ）。彼女の両親および兄は見かけ上健康であり、２人の妹にはいくつかの熱性痙攣挿間があった。母親はこの変異について陰性であることがわかったが、父親および兄弟のＤＮＡは入手できなかった。ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌをもつ患者は３７歳の女性であり、ミオクロニー攣縮がないことからＳＭＥＢと診断された。このヌクレオチド欠失は、任意のイオンチャンネルにおける保存された構造であるドメインＩＶのセグメント６からフェニルアラニン残基を消失させる（図１、図３Ｃおよび３Ｄ）。これらのインフレーム欠失変異はともに、対象健常者からの１９２個の染色体には見い出されなかった。従って、これらはＳＭＥＩまたはＳＭＥＢに密接に関連した突然変異であることが確認された。
【００４８】
１１個のミスセンス変異が１２例の患者において同定された。それらはすべて新規であり、かつヘテロ接合性であった。各々の突然変異は一つのアミノ酸残基に対して生じており、それらのアミン酸残基は、ヒトのＮａ^＋チャンネルのサブユニットのサブタイプのみならず、他種のＮａ^＋チャンネルでも高度に保存されている。４つのｄｅ ｎｏｖｏのミスセンス変異は、ドメインＩＩのポアループ付近の３つの保存されたアミノ酸上に密集していた（図１および図３）。それらのうち、ｃ．２７７２Ｇ＞Ｃまたはｃ．２７７２Ｃ＞Ａのいずれかに起因するミスセンス変異Ｍ９２４Ｉは、各々ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの症例で検出された。ｃ．２８０１Ｔ＞Ｃ： Ｖ９３４ＡはＳＭＥＩ患者で検出された。ｃ．２８０６Ｃ＞Ｔ： Ｒ９３６ＣはＳＭＥＩ患者およびＳＭＥＢ患者の双方で同定された。ｃ．２８０７Ｇ＞Ａ： Ｒ９３６Ｈは、ＳＭＥＢ患者に認められた（図３）。さらに、同定された１１個のミスセンス変異のいずれもが、対象健常者から得られた１９２染色体には見い出されなかった。従って、これらは疾患と密接に関連する変異であることが確認された。
【００４９】
同定されたミスセンス変異は、多くの家族の標本が入手されるにつれてｄｅ ｎｏｖｏであることが判明した。すなわち、ＳＭＥＩ患者３例のうち２例と、ＳＭＥＢ患者９例のうち４例について分析した。このうち、ミスセンス変異（ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ： Ｆ１６８２Ｓ）を持つＳＭＥＢ患者の父親は小児期を通じて熱性痙攣挿間があったと報告されている（図４Ａおよび４Ｂ）。この患者の母親および妹は、この変異について陰性であった。このＳＭＥＢ患者は、軽度の脳萎縮症（おそらく新生児仮死により引き起こされた）と、生後１年以降の最初の発作の出現を根拠としてＳＭＥＢと診断されたが、他の点ではＳＭＥＩの診断基準を満たしている。それにもかかわらず、この変異は、ＳＭＥＩ患者のミスセンス変異（ｃ．５０５１Ａ＞Ｇ： Ｙ１６８７Ｃ、図４Ｃ）近傍の高度に保存された第１６８２位のフェニエルアラニンをセリンに置換しており、これは対象健常者の１９２染色体には全く検出されなかった。
【００５０】
なお、先の報告（Ｏｈｍｏｒｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２９５（１）， １７−２３）にあるＳＣＮ１Ａ多型（ｃ．３１６９Ａ＞Ｇ： Ｔ１０５７Ａ）もまた、ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの患者１１例の１１染色体と、健常者２１例の２４染色体において同定された。
【００５１】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、ＳＣＮＡ１Ａに存在する乳児重症ミオクロニーてんかんに関連した新規な遺伝子変異と、この遺伝子変異を利用した乳児重症ミオクロニーてんかん診断方法が提供される。これらの発明によって、乳児重症ミオクロニーてんかんの事前診断を確実に行うことが可能となる。
【００５２】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢにおけるＳＣＮ１Ａ遺伝子変異箇所を示した模式図である。正常な電位依存性Ｎａ^＋チャンネルは、３つのサブユニット（１つのαサブユニットと２つの補助的なβサブユニットβ１およびβ２）からなっている。αサブユニットは大きな孔形成性の鐘型分子であり、その発現だけでＮａ^＋チャンネルとして機能するには充分である。αサブユニットは相同な４つのドメイン（Ｉ〜ＩＶ）をもち、各々は膜にかかる６個のセグメントからなっている。各ドメインの４番目のセグメントは、電位センサーとして機能する。イオン孔は５番目と６番目のセグメントの間に形成されている（Ｈｉｒｏｓｅ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ．，２４， ２１１−２２２）。
【図２】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢの患者における新規なインフレーム欠失変異（ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴ： Ｍ１５４９ｄｅｌおよびｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴ：Ｆ１７５６ｄｅｌ）の解析結果である。Ａは、ｃ．４６４１−３ｄｅｌＡＡＴを検出するための、関連領域のエレクトロフェログラム（波形データ）。矢印はヌクレオチド４６４１〜４６４３を示しており、そこでは一方のアレルにおいてＡＡＴが欠失している。Ｂは、Ｎａ^＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。ヌクレオチドの欠失は、各イオンチャンネルにおける保存された構造であるメチオニン（Ｍ）残基を欠失させた。Ｃは、ｃ．５２６６−８ｄｅｌＴＴＴを検出するための関連領域のエレクロフェログラム。矢印はヌクレオチド５２６６〜５２６８を示しており、そこでは一方のアレルにおいてＴＴＴが欠失している。Ｄは、Ｎａ^＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。ヌクレオチドの欠失は、Ｎａ^＋チャンネルに保存されたフェニルアラニン（Ｆ）残基を欠失させている。
【図３】ＳＭＥＩおよびＳＭＥＢ患者におけるＳＣＮ１Ａのミスセンス変異箇所を示す。この領域は各々のチャンネルのイオン孔の一部を形成する。
【図４】ＳＭＥＢ患者と、単純な熱性痙攣歴を有する父親で同定されたミスセンス変異（ｃ．５０４５Ｔ＞Ｃ： Ｆ１６８２Ｓ）の解析結果である。Ａは、ＳＣＮ１Ａのエクソン２６の関連領域のエレクトロフェログラム。矢印は第５０４５位のヌクレオチドＴからＣへの置換を示す。Ｂは、Ｎａ^＋チャンネルファミリーにおけるアミノ酸配列の比較である。変異を含む領域は、αサブユニットユニットのドメインＩＶにおけるセグメント５に局在する。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The invention of this application relates to a mutation in a gene associated with severe infantile myoclonic epilepsy and a method for diagnosing the mutation. More specifically, a polynucleotide derived from a severe infantile myoclonic epilepsy-related gene characterized by point mutations and deletion mutations, a polypeptide that is a gene product thereof, and severe infantile myoclonic epilepsy directed to these polynucleotides or polypeptides The method relates to a diagnostic method.
[0002]
[Prior art]
Severe myoclonic epilepsy in infants (SMEI) often develops seizures at the onset of fever as an initial symptom, similar to febrile seizures that are common in infants. However, whereas febrile seizures have a good prognosis, SMEI still has frequent epileptic seizures, causing serious impairment such as intellectual regression. For this reason, infants with febrile seizures should be diagnosed promptly to determine whether they are due to febrile seizure or SMEI, and if the latter, early treatment is necessary. It is said. The diagnosis is currently made based on guidelines submitted by the Commission on Classification and Terminology of the International League Against Epilepsy (Non Patent Literature 1).
[0003]
However, since febrile convulsions and SMEI have very similar seizure states, it is extremely difficult to diagnose both by observing physical symptoms at the onset. Therefore, for the diagnosis of SMEI, great expectations are placed on the diagnosis at the gene level. That is, there is a familial causal relationship in the onset of SMEI (Non-Patent Documents 2-4).
[0004]
Gene mutations associated with SMEI include neuronal voltage-dependent Na ⁺ Some abnormalities of the channel α subunit gene (SCNA1A) have been reported (Non-Patent Documents 5-7).
[0005]
[Non-patent document 1]
Commission on Classification and Terminology of the ILAE (1989) Epilepsya, 30, 389-399.
[Non-patent document 2]
Kaneko, S.M. et al. (2002) Neurosci. Res. , 44 (1), 11-30.
[Non-Patent Document 3]
Oguni, H .; et al. (2001) Brain Dev. , 23 (7), 736-748.
[Non-patent document 4]
Dravet, C.E. et al. (2002) John Libbey Co Ltd. , Eastleigh, UK, 81-103.
[Non-Patent Document 5]
Claes, L.A. et al. (2001) Am. J. Hum. Genet. , 68 (6), 1327-1332.
[Non-Patent Document 6]
Ohmori, I .; et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (1), 17-23.
[Non-Patent Document 7]
Suagawara, T .; et al. (2002) Neurology, 58 (7), 1122-1124.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
The identification of gene mutations has opened up new possibilities for diagnosing SMEI and developing preventive and therapeutic methods. For example, for infants who have developed febrile seizures, by examining the presence of the mutant gene and the presence of the mutant protein expressing the mutant gene, it is possible to determine in advance whether or not the seizure is due to SMEI with a high probability. Diagnosis is possible. Such pre-diagnosis also makes it possible to prescribe treatment for prevention or treatment from an early stage.
[0007]
However, the SMEI phenotype has incomplete penetrance and frequent intra-family mutations, so it is necessary to identify as many gene mutations as possible and make a diagnosis by comprehensive judgment of multiple mutations. .
[0008]
The invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and provides a novel gene mutation associated with SMEI present in the SCNA1A gene and a SMEI diagnostic method using the gene mutation. It is an issue.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
This application provides the following inventions (1) to (14) to solve the above problems.
(1) A polynucleotide derived from a gene associated with severe infantile myoclonic epilepsy, which comprises, in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the following group:
(A) g at position 302 is replaced by a;
(B) deletion of gt at positions 429-430;
(C) substitution at position 568 with t for c;
(D) substitution at position 1303g with t;
(E) substitution at position 2772 g with c;
(F) substitution at position 2772 g with a;
(G) substitution at position 2801 t with a;
(H) substitution at position 2806 c with t;
(I) g at position 2807 is substituted with a;
(J) g at position 2825 is replaced by a;
(K) deletion of tt at positions 3494-3495;
(L) substitution at position 4034 t with c;
(M) deletion of positions 4641-4643 aat;
(N) c at position 4903 is replaced by t;
(O) substitution of c at position 5045 with c;
(P) substitution of g at position 5051;
(Q) deletion ttt at positions 5266-5268;
(R) g at position 5312 a;
(S) Replace 5704 c with t
A polynucleotide having one or more mutations that are more tolerated.
(2) An oligonucleotide, which is a part of the polynucleotide of the invention (1) and includes a mutation site thereof.
(3) A polynucleotide derived from human chromosomal DNA that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide of the invention (1) or the oligonucleotide of the invention (2).
(4) A primer set for PCR-amplifying the polynucleotide of the invention (1) or (3), wherein one of the primers is an oligonucleotide containing a mutation site or its complementary sequence.
(5) A microarray comprising the polynucleotide of the invention (1) or the oligonucleotide of the invention (2).
(6) An expression product of the polynucleotide of the invention (1) or (3) derived from a gene associated with severe infantile myoclonic epilepsy, wherein in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the following group:
(A) 101st Atg is substituted with Gln;
(B) substitution of the amino acid sequence of position 143 below Val with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(C) Trp at position 190 replaced with Arg;
(D) deletion at position 435 below Glu;
(E) the 924th Met is replaced by Ile;
(F) 924th Met is replaced with Ile;
(G) Val at position 934 is substituted with Ala;
(H) Arg at position 936 is substituted with Cys;
(I) Arg at position 936 is substituted with His;
(J) deletion at position 942 and below Trp;
(K) substitution of the amino acid sequence at position 1165 Leu and below with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(L) 1345th Leu replaced with Pro
(M) deletion of position 1549 Met;
(N) deletion at position 1635 and below Arg;
(O) Phe at position 1682 is replaced with Ser;
(P) Tyr at position 1684 is substituted with Cys;
(Q) Phe at position 1756 is deleted;
(R) Tyr at position 1771 substituted with Cys; and
(S) Deletion below Arg at position 1902
A polypeptide having one or more mutations that is more tolerated.
(7) An oligopeptide which is a part of the polypeptide of the invention (6) and contains a mutation site.
(8) An antibody prepared using the oligopeptide of the invention (7) as an antigen.
(9) A method for diagnosing severe infant myoclonic epilepsy, which comprises detecting whether or not the polynucleotide of the invention (3) is present in chromosomal DNA isolated from a subject.
(10) The invention for detecting whether a chromosomal DNA or its mRNA isolated from a subject hybridizes with the polynucleotide of the invention (1) or the oligonucleotide of the invention (2) under stringent conditions. The method of (9).
(11) The method according to the invention (9), wherein the presence or absence of a PCR product is detected when PCR is performed using the chromosomal DNA or mRNA isolated from the subject as a template and the primer set of the invention (4).
(12) A method for diagnosing severe infantile myoclonic epilepsy, comprising detecting whether or not the polypeptide of the invention (6) is present in a biological sample isolated from a subject.
(13) The method according to the invention (12), which detects whether or not a polypeptide that reacts with the antibody according to the invention (8) is present in a biological sample isolated from a subject.
[0010]
In other words, the inventors of the present application directly searched for mutations in the SCNA1A gene cDNA (GenBank Accession No. NM — 006920: SEQ ID NO: 1: 6046 nt) in 61 Japanese SMEI patients by the sequencing method. Among the 61 SMEI patients, 22 patients who meet all the criteria of the diagnostic guidelines and patients whose symptoms are the same as those of the SMEI patients but do not completely match the diagnostic criteria of the guidelines (hereinafter, “SMEB: borderline SSMEI”) 39 cases).
[0011]
As a result, one mutation was found in each of the 26 patients. Except for the mutations already reported, 19 new nucleotide mutations (a) to (s) shown in Table 1 were found. Was found. In addition, along with these nucleotide mutations in the SCNA1A gene, amino acid mutations (A) to (S) shown in Table 1 occur in the protein (polypeptide: SEQ ID NO: 1999aa) as an expression product thereof. Was found.
[0012]
[Table 1]

[0013]
The inventions (1) to (13) have been completed based on the above-described new findings.
[0014]
In the present invention, "permissible selection" refers to the case where two or more mutations of the above-described nucleotide mutation groups (a) to (s) or amino acid mutation groups (A) to (S) are present, and selection of a combination thereof. Is possible. For example, since nucleotide mutations (e) and (f) are different substitution mutations for the same nucleotide, they cannot occur simultaneously in a single polynucleotide sequence. Therefore, selection of mutations (e) and (f) is not allowed. Further, since the polypeptide having the amino acid substitution (B) is a short-chain peptide having no C-terminal side from position 148 of SEQ ID NO: 2, the mutation that can coexist is only the amino acid mutation (A). Similarly, amino acid mutations (D), (J), (K), and (N) that result in frameshifts and stop codons do not coexist with mutations C-terminal to them.
[0015]
The term “polynucleotide” refers to a nucleoside phosphate (nucleotide ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP) in which a purine or pyrimidine is β-N-glycoside-linked to a sugar. The term “oligonucleotide” refers to a molecule in which 2-99 molecules are linked. In the present invention, the polynucleotide and the oligonucleotide are single-stranded or double-stranded, and in the case of single-stranded, they are either the sense strand or the antisense strand.
[0016]
"Polypeptide" refers to a molecule composed of 34 or more amino acid residues linked to each other by an amide bond (peptide bond), and "oligonucleotide" refers to a molecule composed of 2-33 amino acid residues. means.
[0017]
Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description and examples of the embodiments of the present invention. Various techniques used for carrying out the present invention can be easily and reliably implemented by those skilled in the art based on known documents and the like, except for the technique whose source is clearly indicated. For example, genetic engineering and molecular biology techniques are described in Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.W. Y, 1995.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The invention (1) of the present application is a mutant polynucleotide derived from the human SCNA1A gene, wherein in the DNA sequence of SEQ ID NO: 1, at least one of the nucleotide mutations (a) to (s) shown in Table 1 is used. Polynucleotide.
[0019]
The polynucleotide of the invention (1) can be isolated, for example, by screening a cDNA library prepared from total mRNA of SMEI patients using the oligonucleotide of the invention (2) described later as a probe. Alternatively, it can also be isolated by RT-PCR using the mRNA of a SMEI patient as a template, using the primer set of the invention (4) described later. Alternatively, it can also be obtained by introducing the above-described base substitution into the cDNA of wild-type SCNA1A using a commercially available mutation kit or the like. The obtained cDNA is subjected to, for example, PCR (Polymerase Chain Reaction) method, NASBN (Nucleic acid sequence based amplification) method, TMA (Transscription-mediated amplification) method, and SDA (Differential Exchange method). Can be amplified.
[0020]
The polynucleotide of the invention (1) can be used in the SMEI diagnostic method of the invention (10) described later. It can also be used as a material when the polypeptide of the invention (6) described later is prepared by genetic engineering.
[0021]
The invention (2) of the present application is an oligonucleotide which is a part of the polynucleotide of the invention (1) and comprises 20 to 100 continuous DNA sequences including each mutation site. The oligonucleotide of this invention (2) can be prepared by a known method (for example, Carruthers (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47: 411-418; Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105: 661). Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380; 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beaucage (1981) Te. .. Ra Lett 22: 1859; by well known chemical synthesis techniques, as described in U.S. Pat. No. 4,458,066), can be synthesized in the in vitro. Alternatively, it can be prepared by a method such as cutting the polynucleotide of the invention (1) with an appropriate restriction enzyme.
[0022]
Such an oligonucleotide can be labeled with a labeling substance, particularly when used as a probe. Labeling can be performed by a radioisotope (RI) method or a non-RI method, but it is preferable to use a non-RI method. Examples of the non-RI method include a fluorescent labeling method, a biotin labeling method, and a chemiluminescent method, and it is preferable to use a fluorescent labeling method. As the fluorescent substance, a substance capable of binding to the base portion of the oligonucleotide can be appropriately selected and used, and a cyanine dye (for example, Cy Dye) ^TM Series Cy3, Cy5, etc.), rhodamine 6G reagent, N-acetoxy-N ² -It is preferable to use acetylaminofluorene (AAF), AAIF (iodine derivative of AAF) and the like.
[0023]
The oligonucleotide of the invention (2) can also be used in the SMEI diagnostic method of the invention (10) described below. Alternatively, the oligopeptide of the invention (7) described later can also be used as a material for preparing a genetic engineering.
[0024]
Invention (3) of this application is a polynucleotide (genomic DNA) derived from human chromosomal DNA that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide of the invention (1) or the oligonucleotide of the invention (2). Here, the stringent condition is a condition that enables selective and detectable specific binding between the polynucleotide or the oligonucleotide and genomic DNA derived from chromosome. Stringent conditions are defined by salt concentration, organic solvent (eg, formamide), temperature, and other known conditions. That is, the stringency is increased by decreasing the salt concentration, increasing the organic solvent concentration, or increasing the hybridization temperature. For example, stringent salt concentrations generally include about 750 mM NaCl or less and about 75 mM trisodium citrate, more preferably about 500 mM NaCl or less and about 50 mM trisodium citrate, and most preferably about 250 mM NaCl. mM and less than about 25 mM trisodium citrate. Stringent organic solvent concentrations are at least about 35% formamide, most preferably at least about 50%. Stringent temperature conditions are about 30 ° C. or higher, more preferably about 37 ° C. or higher, and most preferably about 42 ° C. or higher. Other conditions include a hybridization time, a concentration of a detergent (eg, SDS), the presence or absence of carrier DNA, and the like, and various stringencies can be set by combining these conditions. In one preferred embodiment, hybridization is performed at a temperature of 30 ° C. under the conditions of 750 mM NaCl, 75 mM trisodium citrate and 1% SDS. In a more preferred embodiment, hybridization is performed at a temperature of 37 ° C. under the conditions of 500 mM NaCl, 50 mM trisodium citrate, 1% SDS, 35% formamide, and 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA. In a most preferred embodiment, hybridization is performed at a temperature of 42 ° C. under the conditions of 250 mM NaCl, 25 mM trisodium citrate, 1% SDS, 50% formamide, and 200 μg / ml denatured salmon sperm DNA. Washing conditions after hybridization also affect stringency. The washing conditions are also defined by salt concentration and temperature, with decreasing salt concentration and increasing temperature increasing wash stringency. For example, stringent salt conditions for washing are preferably at or below about 30 mM NaCl and about 3 mM trisodium citrate, most preferably at or below about 15 mM NaCl and about 1.5 mM trisodium citrate. is there. Stringent temperature conditions for washing are about 25 ° C. or higher, more preferably about 42 ° C. or higher, and most preferably about 68 ° C. or higher. In one preferred embodiment, the washing is performed at a temperature of 25 ° C. under the conditions of 30 mM NaCl, 3 mM trisodium citrate and 0.1% SDS. In a more preferred embodiment, the washing is performed at a temperature of 42 ° C. under the conditions of 15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate and 0.1% SDS. In the most preferred embodiment, washing is performed at a temperature of 68 ° C. under the conditions of 15 mM NaCl, 1.5 mM trisodium citrate, and 0.1% SDS.
[0025]
The polynucleotide of the invention (3) is obtained by screening a genomic library prepared from chromosomal DNA of a SMEI patient by, for example, using the oligonucleotide of the invention (2) as a probe and subjecting the above stringents to hybridization and washing. Can be isolated.
[0026]
The polynucleotide of the invention (3) is a detection target or the like in the diagnostic method of the invention (9) described later.
[0027]
The invention (4) of the present application provides PCR amplification of a double-stranded polynucleotide (genomic DNA) comprising the polynucleotide of the invention (3) and its complementary sequence, or mRNA transcribed from the polynucleotide of the invention (3). Primer set for In these primer sets, one of the oligonucleotide primers is composed of a continuous DNA sequence of 15 to 30 nt including the mutation (substitution or deletion) site of SEQ ID NO: 1 (SCNA1A) or its complementary sequence. The other primer can be any continuous DNA sequence 5 ′ or 3 ′ to each mutation site in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence.
[0028]
These primer sets can be prepared by a known DNA synthesis method based on SEQ ID NO: 1 containing each mutation site. In addition, a linker sequence or the like can be added to the end of the primer. In addition, sequence design can be performed using commercially available software such as Oligo ™ [National Bioscience Inc. (USA), GENETYX [Software Development Co., Ltd. (Japan)], and the like.
[0029]
The primer set of this invention (4) can be used for the SMEI diagnostic method and the like of invention (12) described later.
[0030]
The invention (5) of the present application is a microarray (DNA chip) including the polynucleotide and / or the oligonucleotide as a capture probe. As a method for producing a microarray, a method of directly synthesizing an oligonucleotide on the surface of a solid support (on-chip method) and a method of immobilizing an oligonucleotide prepared in advance on the surface of a solid support are known. The microarray of the present invention can be prepared by any of these methods. The on-chip method combines the use of protective groups that are selectively removed by light irradiation with the photolithography and solid-phase synthesis techniques used in semiconductor manufacturing to define a specific area of a tiny matrix. It can be performed by a method of performing selective synthesis (masking technique: for example, Fodor, SPA Science 251: 767, 1991). On the other hand, when the oligonucleotide prepared in advance is immobilized on the surface of the solid support, an oligonucleotide having a functional group introduced is synthesized, and the oligonucleotide is spotted on the surface of the surface-treated solid support and covalently bonded (for example, Guam, Z. et al. Nucl. Acids Res. 22: 5456-5465, 1994), Lamture, JB et al., Nucl. Acids Res. 22: 2121-2125, 1994). Oligonucleotides are generally covalently bonded to a surface-treated solid support via a spacer or a crosslinker. A method is also known in which minute pieces of a polyacrylamide gel are aligned on a glass surface and a synthetic oligonucleotide is covalently bonded thereto (Yershov, G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4913, 1996). ). In addition, an array of microelectrodes was prepared on a silica microarray, a permeation layer of agarose containing streptavidin was provided on the electrodes to serve as a reaction site, and the biotinylated oligonucleotide was immobilized by positively charging this site, A method that enables high-speed and strict hybridization by controlling the charge of the site is also known (Sosnowski, RG et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1119-1123, 1997). The microarray of the present invention can be manufactured by any of the above methods.
[0031]
Invention (6) of the present application is an expression product of the polynucleotide of invention (1) or invention (3), wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has amino acid mutations (A) to (S) shown in Table 1. Is a polypeptide having any one or more of
[0032]
That is, the amino acid mutation in these polypeptides may be caused by a missense mutation or a deletion mutation in the polynucleotide of the invention (1), thereby mutating the amino acid of the normal (wild-type) polypeptide (SEQ ID NO: 2), by performing a frame shift or the like. The stop codon results in a short polypeptide.
[0033]
These polypeptides can be isolated from a biological sample of an SMEI patient according to a known method, a method of preparing a peptide by chemical synthesis based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 containing each mutant amino acid residue, or the method of the invention ( It can be obtained by a method of producing the polynucleotide (mutated cDNA) of 1) by recombinant DNA technology. The polypeptide of this invention (6) can be, for example, a test target of the SMEI diagnostic method of the invention (23) described later.
[0034]
Invention (7) of this application is an oligopeptide having a continuous amino acid sequence of 5 to 30 which is a part of the polypeptide of the invention (6) and includes each amino acid mutation. These oligopeptides can be prepared by a method of chemically synthesizing based on a predetermined amino acid sequence, or a method of digesting the polypeptide of the invention (6) with an appropriate protease. These oligopeptides can be used, for example, as an antigen for producing an antibody of the invention (8) described later.
[0035]
The antibody of the invention (8) is a polyclonal antibody or a monoclonal antibody prepared using the oligopeptide of the invention (7) as an antigen, and comprises a whole molecule capable of binding to the epitope of the polypeptide of the invention (6), and a Fab. , F (ab ') ₂ , Fv fragments and the like. For example, in the case of a polyclonal antibody, such an antibody can be obtained from serum after immunizing an animal using the oligopeptide as an immunogen. Alternatively, it can be prepared by introducing the above expression vector for eukaryotic cells into an animal muscle or skin by injection or gene gun, and then collecting serum. As animals, mice, rats, rabbits, goats, chickens and the like are used. Monoclonal antibodies can be prepared by a known monoclonal antibody preparation method (“monoclonal antibody”, written by Kamei Chomune and Hiroshi Terada, Hirokawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody”, James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996). Can be created according to These antibodies can specifically recognize the polypeptide of the invention (6) and can be used in the diagnostic method and the like of the invention (12) described later.
[0036]
Invention (9) of this application is a method for diagnosing whether or not a subject develops SMEI later. That is, chromosomal DNA is isolated from a biological sample of a subject, and when the polynucleotide of the invention (3) is present in the DNA, the subject is determined to be at high risk of SMEI. The subject can be, but is not limited to, a person with febrile seizures or a family member. The polynucleotide can be detected by a method of directly sequencing the polynucleotide, but the method of the invention (10) or (11) is preferable.
[0037]
In the method of the invention (10), it is determined whether or not the chromosomal DNA or its mRNA isolated from the subject hybridizes with the polynucleotide of the invention (1) or the oligonucleotide of the invention (2) under stringent conditions. To detect. If the subject has a SMEI-related gene mutation, the chromosomal DNA or its mRNA and the polynucleotide or oligonucleotide will hybridize under stringent conditions. Hybridization can be performed simply and with high precision using, for example, the aforementioned labeled probes or microarrays. As a hybridization method using a labeled DNA probe, specifically, a known method such as an Allele-specific Oligonucleotide Probe method, an Oligonucleotide Ligation Assay method, or an Invader method can be used. The diagnosis using the microarray can be performed, for example, as follows. That is, cDNA is synthesized by using mRNA isolated from a biological sample (eg, blood or the like) of a subject as a template, and PCR is amplified. At that time, the labeled dNTPs are incorporated into a labeled cDNA. The labeled cDNA is brought into contact with the macroarray, and the cDNA hybridized to the capture probe (oligonucleotide) of the microarray is detected. Hybridization can be performed by dispensing a 96-well or 384-well plastic plate and spotting the labeled cDNA aqueous solution on a microarray. The amount of spotting can be about 1 to 100 nl. Hybridization is preferably performed at a temperature in the range of room temperature to 70 ° C. for 6 to 20 hours. After the hybridization, washing is performed using a mixed solution of a surfactant and a buffer to remove unreacted labeled cDNA. It is preferable to use sodium dodecyl sulfate (SDS) as the surfactant. As the buffer, a citrate buffer, a phosphate buffer, a borate buffer, a Tris buffer, a Good buffer, and the like can be used, but a citrate buffer is preferably used.
[0038]
In the method of the invention (11), the presence or absence of a PCR product when PCR is performed using the chromosomal DNA or mRNA isolated from the subject as a template and the primer set of the invention (4) is detected. If the subject has a genetic mutation associated with SMEI, a PCR product of the polynucleotide defined by the primer set is obtained. PCR or RT-PCR can be performed by a known method. The nucleotide mutation may be detected by, for example, a PCR-SSCP method, a PCR-CFLP method, a PCR-PHFA method, or the like, in addition to the method of directly sequencing the PCR product. Further, a known method such as a Rolling Circle Amplification method or a Primer Oligo Base Extension method can also be employed.
[0039]
The invention (12) of this application is also a method for diagnosing whether or not a subject will develop SMEI in a later year, wherein the polypeptide of the invention (6) is present in a biological sample isolated from the subject. In such a case, the subject is determined to have SMEI high risk. Although the presence of the polypeptide can be carried out by various known methods, the method of the invention (13) is preferable. The method of the invention (13) is a method using the antibody of the invention (8), and particularly, by using a labeled antibody, simple and highly accurate detection becomes possible. Labels can use enzymes, radioisotopes or fluorescent dyes. The enzyme is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of the substrate, and is used for ordinary EIA. Enzymes, for example, peroxidase, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholinesterase, glucose-6-phosphoryl dehydrogenase, malate dehydrogenase and the like can also be used. In addition, enzyme inhibitors, coenzymes, and the like can also be used. The binding between the enzyme and the antibody can be performed by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used depending on the type of the enzyme to be used. For example, when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzicin can be used. When alkaline phosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used. As radioisotopes, ¹²⁵ I and ³ H and the like used in normal RIA can be used. As the fluorescent dye, those used in ordinary fluorescent antibody methods such as fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used. When an enzyme is used, a substrate that decomposes by the action of the enzyme and develops a color is added, and the enzyme activity is determined by optically measuring the amount of degradation of the substrate. Is used to calculate the amount of antibody. When a radioactive isotope is used, the radiation dose emitted by the radioisotope is measured by a scintillation counter or the like. When a fluorescent dye is used, the amount of fluorescence may be measured by a measuring device combined with a fluorescent microscope. Further, a sandwich method using a primary antibody and a labeled secondary antibody ("ELISA method" when an enzyme is used as a label) can also be preferably used.
[0040]
Hereinafter, the procedure and results of the screening for confirming the gene mutation on which the invention is based will be described.
1. Method
1-1. patient
The diagnosis of SMEI or SMEB was first performed by a pediatric neurologist according to the following criteria in the International Antiepileptic Federation Classification and Terminology Committee guidelines (Non-Patent Document 1).
(1) Family history has high prevalence of epilepsy or febrile seizures.
(2) Normal development of body and nerves before onset.
(3) Systemic or unilateral febrile and afebrile clonic seizures, secondary appearance of myoclonic spasms, and recurrent partial seizures during the first year of life.
(4) There is no paroxysmal waveform in the electroencephalogram (EEG) in the early stage, but systemic spikes, polyspikes, and localized abnormal waveforms appear with the initial appearance of light sensitivity.
(5) Psychomotor development is normal in the early stage, but mental retardation becomes apparent with the appearance of ataxia, pyramidal signs, and paroxysmal myoclonus from the second year of life.
(6) All seizure types are resistant to any therapeutic means.
[0041]
SMEI was diagnosed when all of the above six criteria were satisfied. On the other hand, if a patient meeting the above criteria has the following exclusion criteria, it was diagnosed as SMEB.
(7) Seizures have started after the first year of life.
(8) When there is no myoclonic attack and / or atypical absence.
(9) When there is no evidence of significant psychomotor retardation.
[0042]
The final survey target was 22 SMEIs (9 males and 13 females) and 39 SMEBs (13 males and 26 females). In addition, 96 healthy volunteers were used as a control group.
1-2. Gene analysis
Genomic DNA was prepared from the EDTA-treated whole blood specimen using QIAamp DNA Blood kit (Qiagen, Germany). Screening for genetic abnormalities of SCN1A, SCN2A, SCN1B and SCN2B was performed using a direct sequencing method with an automatic sequencer (Sugawara, T. et al. (2001) Neurology, 57, 703-705; Sugawara, T. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (11), 6384-6389). Primers and PCR reaction conditions for PCR amplifying all exons of a gene are described in the literature (Suagawara, T. et al. (2002) Neurology, 58 (7), 1122-1124; Sugawara, T. et al. (2001)). Neurology, 57, 703-705) was used. The following GenBank registered sequences were used as reference sequences for each mRNA. Human SCN2A: M94055, human SCN3A: AJ251507, human SCN5A: M77235, human SCN8A: AB027567.1, human SCN10A: AF1177907.1, rat scn1a: M22253, pufferfish: D37977, red eel: M22252, Drosophila M: 1 Jellyfish: AF047380.
1-3. Statistical analysis
The difference in the incidence of abnormalities is χ ² Judgment was based on statistical significance using a test. A statistically significant difference was determined when the P value was less than 0.05.
2. result
There were no significant differences between the SMEI and SMEB groups for key signs such as sex ratio, low and high heat-induced seizures, mental retardation, photosensitivity, and frequency of treatment-resistant seizures. Of the 39 SMEB cases, 3 had an initial seizure after 1 year of age, 4 had no apparent psychomotor delay (IQ, DQ> 80), and 26 had no myoclonic spasm. Photosensitivity was observed in 11 patients [ie, 8 out of 22 SMEIs (36.4%) and 3 out of 39 SMEBs (7.7%)]. Thus, photosensitivity was more significant in SMEI than in SMEB (p <0.05).
[0043]
In 14 (63.6%) of 22 SMEI patients, 3 missense mutations of SCN1A, 8 nonsense mutations, 2 frameshift mutations resulting in immature termination, and 1 inframe deletion mutation Identified (Table 2 and FIG. 1). In 12 (30.8%) of 39 SMEB patients, 9 SCN1A missense mutations, 2 nonsense mutations and 1 in-frame deletion mutation were detected (Table 2 and FIG. 1). That is, in FIG. 1, the mutations in SMEI are due to missense mutations (closed circle numbers), nonsense mutations (closed square numbers), frame shifts resulting in stop codons (closed triangle numbers), and in-frame deletion mutations (closed diamond numbers). It is shown. SMEB mutations are indicated by missense mutations (open circle numbers), nonsense mutations (open square numbers), and in-frame deletion mutations (open diamond numbers). Specifically, the mutations in SMEI are as follows. The method of describing the mutation was in accordance with the literature (Dunnen, J. and Antonarakis, S. (2001) Hum. Genet., 109, 121-124).
Missense mutation (black circle):
1. c. 2772G> C: M924I
2. c. 2806C> T: R936C
3. c. 5051A> G: Y1684C
Nonsense mutation (closed square):
1. c. 664C> T: R222X
2. c. 1303G> T: E435X
3. c. 2101C> T: R701X
4. c. 2825G> A: W942X
5. c. 4189C> T: R1397X
6. c. 4903C> T: R1635X
7. c. 5644C> T: R1882X
Frameshift mutation (closed triangle):
1. c. 492-30delGT: V143fsX148
2. c. 3494-5delTT: L1165fsX1172
In-frame mutation (black diamond):
c. 4641-3delAAT: M1549del
The mutations in SMEB are as follows.
Missense mutation (open circle):
1. c. 302G> A: R101Q
2. c. 568T> C: W190R
3. c. 2772G> A: M924I
4. c. 2801T> C: V934A
5. c. 2806C> T: R936C
6. c. 2807G> A: R936H
7. c. 4034T> C: L1345P
8. c. 5045T> C: F1682S
9. c. 5312A> G: Y1771C
Nonsense mutation (open square):
1. c. 2101C> T: R701X
2. c. 5704C> T: R1902X
In-frame mutation (white diamond):
c. 5266-8delTTT: F1756del
On the other hand, no SCN2A, SCN3A, and SCN2B mutations were detected in the examined regions. Of the 61 patients in the total study population, 26 (42.6%) had mutations, and the remaining 8 SMEI and 27 SMEB patients did not. Thus, mutations are significantly more common in SMEI than in SMEB (p <0.05). In addition, molecular truncated nonsense or frameshift mutations were also significantly more common in SMEIs than in SMEBs (45.5 vs. 5.1%: p <0.001), while the incidence of missense mutations was between the two groups. Was not different (18.2% for SMEI vs. 25.6% for SMEB, Table 2). There was no relationship between light sensitivity and mutation.
[0044]
[Table 2]

[0045]
Interestingly, among such mutations, one nonsense mutation and two missense mutations were found in both SMEI and SMEB (FIG. 1). In addition, the nonsense mutation c. Previously reported for two SMEI patients. 2101C> T: R701X (Ohmori, I. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (1), 17-23; Suagawara, T. et al. (2002) Neurology, 58 (7). 1122-1124) were also identified in this study in one SMEI patient and one SMEB patient without deep psychomotor retardation. A missense mutation (c. 2806C> T: R936C) was detected in one SMEI patient and one SMEB without myoclonic spasm. Also, two missense mutations resulting in the same amino acid substitution (c.2772G> C: M924I and c.2772G> A: M924I) were each identified in one SMEI patient and one SMEB patient without myoclonic spasm.
[0046]
Of the eight nonsense mutations, three were similar to earlier reports in SMEI Japanese patients (Ohmori, I. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (1), 17). Suagawara, T. et al. (2002) Neurology, 58 (7), 1122-1124). On the other hand, two frameshift mutations identified in two SMEI patients were novel mutations that have not been reported so far. All such nonsense and frameshift mutations were heterozygous and were found to be de novo as more parental specimens were obtained. That is, the parents were subjected to genetic analysis in 9 of the 13 cases and confirmed to be de novo. In one case, it was confirmed that only the mother had no mutation.
[0047]
The two in-frame deletion mutations in SCN1A (c.4641-3delAAT: M1549del and c.5266-8delTTT: F1756del) are SMEI and SMEB, respectively, and provide a novel mechanism for each causal genetic abnormality. We propose (Fig. 2). That is, c. 4641-3delAAT: The patient with M1549del is a 12 year old girl whose clinical phenotype meets the diagnostic criteria of SMEI. This nucleotide deletion abolishes the highly conserved methionine in the first segment 4 of domain IV (FIGS. 1, 3A and 3B). Her parents and brother were apparently healthy, and their two sisters had some febrile seizures. The mother was found to be negative for this mutation, but no paternal and sibling DNA was available. c. 5266-8delTTT: The patient with F1756del was a 37-year-old woman who was diagnosed with SMEB because of no myoclonic spasm. This nucleotide deletion eliminates a phenylalanine residue from segment 6 of domain IV, a conserved structure in any ion channel (FIGS. 1, 3C and 3D). Neither of these in-frame deletion mutations was found on 192 chromosomes from healthy subjects. Therefore, these were confirmed to be mutations closely related to SMEI or SMEB.
[0048]
Eleven missense mutations were identified in 12 patients. They were all new and heterozygous. Each mutation was made to one amino acid residue and their amino acid residues were ⁺ Not only the subtype of the channel subunit, but also other types of Na ⁺ Highly stored on the channel. The four de novo missense mutations were clustered on three conserved amino acids near the pore loop of domain II (FIGS. 1 and 3). Among them, c. 2772G> C or c. The missense mutation M924I due to either 2772C> A was detected in SMEI and SMEB cases, respectively. c. 2801T> C: V934A was detected in SMEI patients. c. 2806C> T: R936C was identified in both SMEI and SMEB patients. c. 2807G> A: R936H was found in SMEB patients (FIG. 3). Furthermore, none of the 11 missense mutations identified were found on the 192 chromosome obtained from the healthy subject. Therefore, these were confirmed to be mutations closely related to the disease.
[0049]
The identified missense mutation was found to be de novo as samples from many families became available. That is, two out of three SMEI patients and four out of nine SMEB patients were analyzed. Of these, the father of a SMEB patient with a missense mutation (c. 5045T> C: F1682S) has been reported to have febrile seizures throughout childhood (FIGS. 4A and 4B). The patient's mother and sister were negative for the mutation. The SMEB patient was diagnosed with SMEB on the basis of mild cerebral atrophy (probably caused by neonatal asphyxia) and the appearance of the first seizure after the first year of life, but otherwise met the criteria for SMEI. Meets Nevertheless, this mutation replaces the highly conserved phenylene alanine at position 1682 with a serine near the missense mutation (c.5051A> G: Y1687C, FIG. 4C) in SMEI patients. It was not detected at all on the 192 chromosome of the target healthy subject.
[0050]
The SCN1A polymorphism (c.3169A> G: T1057A) in the previous report (Ohmori, I. et al. (2002) Biochem. Biophys. Res. Commun. 295 (1), 17-23) is also described. It was identified on 11 chromosomes of 11 SMEI and SMEB patients and 24 chromosomes of 21 healthy subjects.
[0051]
【The invention's effect】
As described above in detail, the invention of this application provides a novel genetic mutation associated with severe infantile myoclonic epilepsy present in SCNA1A and a method for diagnosing severe infantile myoclonic epilepsy using this genetic mutation. According to these inventions, it is possible to reliably perform a prior diagnosis of severe myoclonic epilepsy in infants.
[0052]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 is a schematic diagram showing the locations of SCN1A gene mutation in SMEI and SMEB. Normal voltage-dependent Na ⁺ The channel is composed of three subunits (one α subunit and two auxiliary β subunits β1 and β2). The α subunit is a large, pore-forming, bell-shaped molecule whose expression alone ⁺ Enough to function as a channel. The α subunit has four homologous domains (I-IV), each consisting of six segments spanning the membrane. The fourth segment of each domain functions as a potential sensor. Ion holes are formed between the fifth and sixth segments (Hirose, S. et al. (2002) Brain Dev., 24, 211-222).
FIG. 2 shows the results of analysis of novel in-frame deletion mutations (c.4641-3delAAT: M1549del and c.5266-8delTTT: F1756del) in SMEI and SMEB patients. A is c. Electropherogram (waveform data) of the relevant region for detecting 4641-3delAAT. The arrow indicates nucleotides 4641 to 4643, where AAT is deleted in one allele. B is Na ⁺ It is a comparison of amino acid sequences in channel families. Deletion of the nucleotide deleted the methionine (M) residue, a conserved structure in each ion channel. C is c. Electropherogram of the relevant area for detecting 5266-8delTTT. The arrow indicates nucleotides 5266-5268, where TTT is deleted in one allele. D is Na ⁺ It is a comparison of amino acid sequences in channel families. Nucleotide deletions are ⁺ The phenylalanine (F) residue conserved in the channel has been deleted.
FIG. 3 shows SCN1A missense mutation sites in SMEI and SMEB patients. This region forms part of the ion hole of each channel.
FIG. 4 shows analysis results of a missense mutation (c. 5045T> C: F1682S) identified in a SMEB patient and a father having a simple history of febrile seizures. A is an electropherogram of the relevant region of exon 26 of SCN1A. The arrow indicates the nucleotide T to C substitution at position 5045. B is Na ⁺ It is a comparison of amino acid sequences in channel families. The region containing the mutation is located in segment 5 in domain IV of the α subunit unit.

Claims (13)

A polynucleotide derived from a gene associated with severe infantile myoclonic epilepsy, which comprises, in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, the following group:
(A) g at position 302 is replaced by a;
(B) deletion of gt at positions 429-430;
(C) substitution at position 568 with t for c;
(D) substitution at position 1303g with t;
(E) substitution at position 2772 g with c;
(F) substitution at position 2772 g with a;
(G) substitution at position 2801 t with a;
(H) substitution at position 2806 c with t;
(I) g at position 2807 is substituted with a;
(J) g at position 2825 is replaced by a;
(K) deletion of tt at positions 3494-3495;
(L) substitution at position 4034 t with c;
(M) deletion of positions 4641-4643 aat;
(N) c at position 4903 is replaced by t;
(O) substitution of c at position 5045 with c;
(P) substitution of g at position 5051;
(Q) deletion ttt at positions 5266-5268;
(R) a polynucleotide having a mutation at position 5312a substituted with g; and (s) one or more mutations permissively selected from substitution at position 5704c with t. An oligonucleotide, which is a part of the polynucleotide of claim 1 and includes a mutation site thereof. A polynucleotide derived from human chromosomal DNA that hybridizes under stringent conditions with the polynucleotide of claim 1 or the oligonucleotide of claim 2. 4. A primer set for PCR-amplifying the polynucleotide of claim 1 or 3, wherein one of the primers is an oligonucleotide containing a mutation site or its complementary sequence. A microarray comprising the polynucleotide according to claim 1 or the oligonucleotide according to claim 2. An expression product of the polynucleotide of claim 1 or 3 derived from a gene associated with severe infantile myoclonic epilepsy, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 comprises the following group:
(A) 101st Atg is substituted with Gln;
(B) substitution of the amino acid sequence of position 143 below Val with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
(C) Trp at position 190 replaced with Arg;
(D) deletion at position 435 below Glu;
(E) the 924th Met is replaced by Ile;
(F) 924th Met is replaced with Ile;
(G) Val at position 934 is substituted with Ala;
(H) Arg at position 936 is substituted with Cys;
(I) Arg at position 936 is substituted with His;
(J) deletion at position 942 and below Trp;
(K) substitution of the amino acid sequence at position 1165 Leu and below with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4;
(L) Leu at position 1345 replaced with Pro (M) Met at position 1549 is deleted;
(N) deletion at position 1635 and below Arg;
(O) Phe at position 1682 is replaced with Ser;
(P) Tyr at position 1684 is substituted with Cys;
(Q) Phe at position 1756 is deleted;
(R) a polypeptide in which Tyr at position 1771 is substituted with Cys; and (S) a polypeptide having one or more mutations in which Arg or less than position 1902 is permissively selected from deletion. An oligopeptide that is part of the polypeptide of claim 6 and that includes a mutation site. An antibody prepared using the oligopeptide of claim 7 as an antigen. A method for diagnosing severe myoclonic epilepsy in infants, comprising detecting whether or not the polynucleotide of claim 3 is present in chromosomal DNA isolated from a subject. The method according to claim 9, wherein it is detected whether or not the chromosomal DNA or its mRNA isolated from the subject hybridizes with the polynucleotide of claim 1 or the oligonucleotide of claim 2 under stringent conditions. The method according to claim 9, wherein the presence or absence of a PCR product is detected when PCR is performed using the chromosomal DNA or mRNA isolated from the subject as a template and the primer set according to claim 4. A method for diagnosing severe infantile myoclonic epilepsy, comprising detecting whether the polypeptide of claim 6 is present in a biological sample isolated from a subject. 13. The method according to claim 12, wherein whether or not a polypeptide that reacts with the antibody according to claim 8 is present in a biological sample isolated from a subject.

Images