JP2004236653A - 植物の隔膜形成体の形成制御及び雄性不稔植物作出の方法 - Google Patents

Abstract

【課題】植物の細胞質分裂制御技術を提供する。また、遺伝的雄性不稔性を持つ植物は有用であり、効率よく且つ広範囲の植物に適用できる不稔性植物作成技術が求められている。
【解決手段】ＮＡＣＫ１ 遺伝子、ＮＡＣＫ２ 遺伝子あるいはその類似遺伝子、さらにはその関連遺伝子の発現の調節や、ＮＡＣＫ１や ＮＡＣＫ２のタンパク質を改変してドミナントネガティブ分子として用いて植物の隔膜形成体の形成および拡大を制御する技術、ＮＡＣＫ１や ＮＡＣＫ２関連遺伝子のプロモーターの花粉形成組織特異的な遺伝子発現調節に関する技術が提供できる。該隔膜形成体の形成および拡大の制御は細胞分裂の改変を可能にし、植物の発生分化を改変した植物の作出、正常な機能を示す花粉の形成を抑制し雄性不稔を示す植物の作出などを可能にして、育種や農作物の生産性向上などをもたらし、農業、園芸分野において有益である。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の隔膜形成体の形成制御及び／又は発生分化制御、並びにそのために用いられる分子に関する。本発明は、植物などにおける細胞質分裂過程制御技術に関する。本発明は、また細胞分裂に関与する遺伝子を制御して作成された雄性不稔性植物並びにその利用技術に関する。さらに、本発明は、稔性が低下した植物を作出する方法、並びにそのために用いられる分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物において隔膜形成体の形成を制御することは、農業分野において様々な重要な意義を有する。例えば、隔膜形成体の形成を制御することによって植物特異的な細胞質分裂過程を制御することができる。新たな産業上利用価値の高い形態を有する植物を作出することが可能となる。特に生殖細胞における減数分裂を抑制することにより稔性が低下した植物を作成することが可能であり、育種技術の向上に貢献する。
細胞分裂は生命の基本現象の一つであり、細胞は分裂を繰り返すことによって増殖する。細胞はＧ１期（ギャップ１）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（ギャップ２）、 Ｍ期（分裂期）の４つの時期からなる細胞周期と呼ばれている一連の過程を経て、２つの娘細胞に分裂する。体細胞の Ｍ期は有糸分裂期とも呼ばれ Ｓ期で複製された染色体が娘細胞に正確に分配される時期である。染色体の分配後に細胞質を二分する過程は細胞質分裂と呼ばれている。細胞質分裂の過程は動物細胞と植物細胞で大きく異なっている。動物細胞の細胞質分裂は染色体の分配後に主にアクチンとミオシンからなる収縮環とよばれる構造体が細胞膜の内側に出現し、この収縮環が収縮することによって細胞膜が内側に引き込まれる。中央体と呼ばれる分離した染色体の中間に存在する紡錘体領域まで収縮環による収縮が進行すると中央体が消失し、細胞質分裂が完了する。これに対して植物細胞では分配された染色体の間に微小管とアクチンを主成分とする隔膜形成体（フラグモプラスト）と呼ばれる構造体が形成される。隔膜形成体に小胞が輸送され、小胞が融合することによって、隔膜形成体の中央部分で細胞板と呼ばれる新しい細胞壁が形成されると考えられている。この細胞板が親細胞の細胞壁に向かって拡大し、親細胞の細胞壁と細胞板が融合することによって細胞質分裂が完了する。
【０００３】
隔膜形成体への小胞の輸送に関しては、キネシン様タンパク質が関与していることが示唆されている。隔膜形成体にタンパク質の局在性を示す、植物の遺伝子として ＫａｔＡｐ、ＴＫＲＰ１２５ 、ＫＣＢＰ、ＡｔＰＡＫＲＰ１が知られている。キネシン様タンパク質の構造、機能上の特徴としてはモータードメインと呼ばれるアミノ酸が保存された領域を介して微小管上を動くこと、モータードメイン以外の領域ではホモダイマーを形成することが報告されている（非特許文献１〜４） 。
生殖細胞の形成は減数分裂と呼ばれる分裂過程を経て形成される。減数分裂は２回の細胞分裂により構成されるがそのうちの１回はＤＮＡ 複製を伴わない。このため花粉形成においては１つの減数母細胞より４つの細胞が形成され、それぞれの核には相同染色体をもたない花粉四分子が形成される。花粉四分子より解離した小胞子はさらに２回の花粉有糸分裂を経て最終的に１つの栄養細胞に２つの精細胞を取り込んだ形の花粉が形成される。
生殖細胞、特に花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子として、例えば、トマトのｌａｔ ５２遺伝子が報告されている。ｌａｔ ５２遺伝子のプロモーター領域には花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子のを転写調節配列として、ＡＧＡＡＡ と ＴＣＣＡＣＣＡＴＡが見出されており、これら２種の配列の協力的な作用が遺伝子発現の特異性を決定していることが報告されている （非特許文献５） 。
【０００４】
タバコのＭｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫＫＫ）であるＮＰＫ１は様々な刺激に関するシグナル伝達に関与していることが示唆されている。例えばオーキシン誘導性遺伝子発現調節や酸化ストレス誘導性遺伝子発現調節に関するシグナル伝達に関与することが報告されている（非特許文献６及び７） 。さらに、隔膜形成体の拡大に関するシグナル伝達にも関与しており、ＮＰＫ１のキナーゼ不活性型の形質転換タバコでは細胞質分裂のみが不完全となり、１つの細胞に複数個の核を持つ細胞となる （非特許文献８） 。しかし、前述のようにＮＰＫ１は様々なシグナルを伝達しているためキナーゼ不活性型形質転換タバコで認められる表現型は細胞質分裂の制御のみが改変された結果であるかは不明であり、細胞質分裂のみを特異的に制御する因子の報告はされていない。
ＮＰＫ１は単独ではキナーゼ活性が不活性状態にある。このＮＰＫ１のキナーゼ活性を酵母において活性化する因子としてキネシン様タンパク質と類似の構造を示すＮＡＣＫ１ タンパク質、ＮＡＣＫ２ タンパク質が知られている。ＮＰＫ１タンパク質は酵母中ではＮＡＣＫ１ タンパク質または、ＮＡＣＫ２ タンパク質と結合することによりキナーゼ活性を示すことが報告されている（非特許文献９）。ＮＰＫ１タンパク質とＮＡＣＫ１ タンパク質の結合に必須なＮＡＣＫ１ タンパク質の領域はモータードメインより Ｃ末端側であり、この領域で形成されると予測されるコイルドコイル構造である（非特許文献１０）。
【０００５】
細胞分裂時の植物細胞中でＮＰＫ１タンパク質とＮＡＣＫ１ タンパク質は共に隔膜形成体に存在することが報告されている。このことより、キネシン様タンパク質と類似性を示すＮＡＣＫ１ タンパク質がＮＰＫ１タンパク質と結合し、微小管構造上を動くことによって隔膜形成体に存在することが示唆されているが、植物内においてＮＡＣＫ１ タンパク質の機能は未だ報告例はない（非特許文献１１）。 ＮＰＫ１タンパク質の細胞周期における蓄積パターンは Ｓ期、Ｇ２期、 Ｍ期であり、ＮＡＣＫ１ タンパク質の細胞周期における蓄積パターンは Ｍ期に特異的である。このことより Ｍ期におけるＮＰＫ１の活性化因子はＮＡＣＫ１ であることが予想されている。しかし、ＮＡＣＫ１ 遺伝子、ＮＡＣＫ２ 遺伝子を構成する塩基配列、およびアミノ酸配列は報告されていない（非特許文献１２）。
ＮＡＣＫ１ 遺伝子、ＮＡＣＫ２ 遺伝子の細胞周期の Ｍ期における特異的な遺伝子発現はそれらのプロモーター領域に存在するＭ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＭＳＡ）と呼ばれる特定の制御配列によって制御されていることが報告されている。しかし、組織特異的発現をもたらす調節領域の存在は報告されていない （非特許文献１３） 。
【０００６】
これまでにＡｒａｂｉｄｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ の細胞質分裂が異常となった突然変異体解析より、細胞質分裂に重要な機能を示す遺伝子が知られている。例えば、ＫＯＬＬＥ 遺伝子、ＫＥＵＬＥ 遺伝子を欠失した植物では細胞板形成が不完全であり、多核化した細胞が認められる。しかし、これらの遺伝子またはこれらの改変遺伝子を形質転換した植物で細胞質分裂を抑制した例は報告されていない （非特許文献１４及び１５） 。
これまでに薬剤を用いて細胞質分裂を制御する方法は知られている。例えばプロピザマイドを植物に処理することでチューブリンの重合が阻害され、細胞質分裂が阻害される。また、ゴルジ体を崩壊させるブレフェルディンＡ の処理でも隔膜形成体の拡大が阻害される。しかしこれらは何れも細胞質分裂に特異的な現象を阻害するものではなく、隔膜形成体の拡大のみを制御する技術は報告されていない （非特許文献１６及び１７） 。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ８：１１９（１９９６）
【非特許文献２】
Ａｓａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １１０：１７９（１９９７）
【非特許文献３】
Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １２：９７９（２０００）
【非特許文献４】
Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， １０：７９７（２０００）
【非特許文献５】
Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４５：５７７（１９９８）
【非特許文献６】
Ｋｏｖｔｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３９５：７１６（１９９８）
【非特許文献７】
Ｋｏｖｔｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９７：２９４０（２０００）
【非特許文献８】
Ｎｉｓｈｉｈａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５：３５２（２０００）
【非特許文献９】
西浜ら、酵母細胞におけるタバコキネシン様タンパク質 ＮＡＫ１ によるＮＰＫ１キナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ）の活性化、日本分子生物学会１９９５年度年会
【非特許文献１０】
石川ら、ＮＰＫ１プロテインキナーゼ （ＭＡＰＫＫＫ） とＮＡＫ１キネシン様タンパク質の相互作用、日本分子生物学会１９９６年度年会
【非特許文献１１】
町田ら、ＮＰＫ１ ＭＡＰＫＫＫが関与しているＭＡＰ キナーゼカスケードと植物細胞の増殖、日本分子生物学会２０００年度年会
【非特許文献１２】
西浜ら、ＮＰＫ１プロテインキナーゼとその活性化因子ＮＡＫｓキネシン様タンパク質の細胞分裂への関与、日本分子生物学会１９９６年度年会
【非特許文献１３】
Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０：３３１（１９９８）
【非特許文献１４】
Ｌｕｃｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ８４：６１（１９９６）
【非特許文献１５】
Ａｓｓａａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １５２：５３１（２００１）
【非特許文献１６】
Ｋａｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ（ｓｕｐｐｌ）， ２：９５（１９８８）
【非特許文献１７】
Ｙａｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ４１：３００（２０００）
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
近年、多くの作物で雑種強勢（ヘテロシス）を利用した一代雑種（Ｆ１）品種の育成が進められている。このＦ１品種のメリットは、雑種強勢の発現により収量性、耐病性などの農業形質が優れたものとなること、単因子優性の農業形質の付与が容易なこと、均一性が高いこと、また、次世代で遺伝形質の分離が起こるため育成者の権利が守られることなどが挙げられる。
Ｆ１品種においては、雑種第１代目の種子を多量に確保する必要があり、そのための技術として、遺伝的雄性不稔性を持つものを母親に使用することが行われてきた。この他に自家不和合性を利用する方法、雄花を人為的に除去する方法、人為的に交配する方法、などがあるが、これらの方法は利用できる植物種が限られている。遺伝的雄性不稔性を利用する方法が、最も汎用性に富んでいるため、Ｆ１種子を確保するために広く用いられてきた。
花粉特異的に発現するプロモーターにＲＮａｓｅＴ１ やｂａｒｎａｓｅ などの細胞に対して毒性を示すタンパク質を連結して植物を形質転換することで生殖細胞、特に花粉形成を抑制する技術は報告されている。しかしこれらは、何れも動物細胞に対しても毒性を示す因子であり、動物に対して安全性が高く、植物細胞でのみ機能する因子を用いての生殖細胞の形成を抑制する技術は報告されていない。
【０００９】
本発明は、植物の細胞質分裂制御技術を提供することを課題としている。本発明はＮＡＣＫ１遺伝子、その類似遺伝子、これらの遺伝子がコードするタンパク質、それらに対してドミナントネガティブに機能するタンパク質及びそれらをコードする遺伝子を提供することを課題とする。また本発明は、これらの遺伝子を利用して植物特有の細胞質分裂装置である隔膜形成体の形成を制御することや発生分化を制御することを課題としている。さらに本発明は、植物体、植物の組織、植物の器官又は植物培養細胞において、ＮＡＣＫ１遺伝子、その類似遺伝子の発現状況を観測することにより、その植物体、植物の組織、植物の器官又は植物培養細胞の状態を評価する方法、又は、それらの検体が置かれた環境条件あるいは生育条件を評価する方法に関する。
また、本発明は、植物の生殖細胞の形成を制御する技術、稔性が低下した植物を効率よく作出する汎用性に富んだ技術を提供することを課題としている。また、本発明はＮＡＣＫ２ 遺伝子がコードするタンパク質を提供することを課題とする。そして、本発明は、この遺伝子を利用して、効率的に稔性が低下した植物を作出する技術を提供することも課題とする。
本発明は、植物に広範囲に応用できる技術開発を課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、ＮＡＣＫ関連遺伝子であるＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡおよびＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡの塩基配列、さらにはそれらのオルソログ遺伝子のｃＤＮＡの決定を行うことに成功し、ＮＡＣＫ関連タンパク質であるＮＡＣＫ１ タンパク質およびＮＡＣＫ２ タンパク質、さらにはそれらのオルソログタンパク質がキネシン様タンパク質のモータードメインと類似したアミノ酸配列を示すことを見出すことに成功した。
本発明者は、これまでにＮＡＣＫ１ タンパク質、ＮＡＣＫ２ タンパク質がＮＰＫ１タンパク質と結合しＮＰＫ１タンパク質のキナーゼ活性を活性化することを既に明らかにしていたが、新たに、これらＮＡＣＫタンパク質の前記モータードメインを欠失した分子が植物の内在性のＮＡＣＫタンパク質に対してドミナントネガティブに機能することを見出すことに成功した。
本発明者は、ＮＡＣＫ１タンパク質の一部をコードする塩基配列を用いて形質転換植物を作出することにより、ＮＡＣＫ遺伝子が植物の細胞分裂に重要な隔膜形成体の形成の制御因子であることを見出すことに成功し、加えてこれらの植物では細胞分裂の過程の内、細胞質分裂が抑制されていることを見出すことにも成功した。
さらに、単子葉植物であるイネのＮＡＣＫ（ＯｓＮＡＣＫ）タンパク質の一部をコードする塩基配列を双子葉植物であるタバコ細胞に導入すると、驚くべきことに、ＮＡＣＫ１タンパク質の場合と同様に、タバコ培養細胞の細胞質分裂を阻害すること、即ち、ＮＡＣＫ関連遺伝子は双子葉植物、単子葉植物の種を越えて機能することを見出した。
以上の知見に基づき本発明は完成されたものである。
【００１１】
本発明において隔膜形成体の形成とは、隔膜形成体の形成、隔膜形成体の拡大、細胞板の形成及び／又は細胞板の拡大を意味する。本発明において発生分化とは、組織の形態、組織の大きさ、器官の形態、器官の大きさ、植物体の形態、植物体の大きさ及び／又は植物体の生育速度を意味する。また本発明において稔性の低下とは花粉形成に係わる細胞、組織、器官の変化も含めた花粉形成の抑制を意味する。本発明において花粉形成に係わる細胞の変化として減数分裂を含めた細胞分裂の変化、細胞に含まれる核数、細胞の大きさ、細胞の数、花粉管発芽能力、受精能の変化などが挙げられる。本発明において花粉形成に係わる組織の変化としては葯の表皮、内被、中間層、タペート組織、胞原組織の変化などが挙げられる。本発明において花粉形成に係わる器官の変化としては葯や花糸の形態、機能の変化などが挙げられる。
即ち、本発明は、植物の細胞分裂も関わるＮＡＣＫ１遺伝子、ＮＡＣＫ２遺伝子、それらの類似遺伝子およびこれら遺伝子がコードするタンパク質、並びにこれら遺伝子を標的とした植物における隔膜形成体の形成、拡大の制御、及び／又は発生分化の制御などに関し、さらには雄性不稔化技術になどに関する。
【００１２】
以下の説明中、あるアミノ酸またはアミノ酸配列と「ポジティブである」とは、Ｐａｉｒｗｉｓｅ ＢｌａｓｔのＢｌａｓｔ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用し、アミノ酸配列を解析した結果において、同一または類似なアミノ酸を指す。即ち二つのアミノ酸配列の比較において、ポジティブなアミノ酸の割合とは同一なアミノ酸及び類似なアミノ酸の割合を加えたものを示す。
更に、前記アミノ酸配列の比較は、対象となる二つのアミノ酸配列を最適な形で並べて行われる。以下の説明中、特に断わらない場合、二つのアミノ酸配列を最適な形で並べて行われたことを示す。
【００１３】
より具体的には、本発明は、次なるものを提供するものである。
（１） 下記（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ：
（ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ） 配列番号：１、３、５、２１または５０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｄ） 配列番号：１、３、５、２１または５０に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｅ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列と６５％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｇ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質若しくはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｈ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質若しくはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列と６５％以上のアミノ酸がポジティブであり、かつ、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有し、及び／ 又は、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質若しくはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１４】
（２） （１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（３） （１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（４） ＤＮＡであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、かつ、（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
（５）ＤＮＡであって、植物細胞における発現時に、ＲＮＡ干渉効果（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：ＲＮＡｉ）により、（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、かつ、（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡと２０塩基以上の（あるいは２５塩基以上又は場合により５０塩基以上の）連続して同一であるＤＮＡ。
（６） ＤＮＡであって、植物細胞における内在性の（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７） 植物の隔膜形成体の形成制御、および／または発生分化制御のために用いるものであることを特徴とする（１）〜（６）のいずれか一に記載のＤＮＡ。
（８） 植物の隔膜形成体の形成および／または拡大の制御による雄性不稔化技術のために用いるものであることを特徴とする（１）〜（６）のいずれか一に記載のＤＮＡ。
【００１５】
（９） 下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の構成要素を含む組換えＤＮＡ又はベクター：
（ｉ） 細胞内で転写可能なプロモーター、
（ｉｉ）該プロモーター配列にセンス方向又はアンチセンス方向で結合した（１）〜（７）のいずれか一に記載のＤＮＡ、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
（１０） （１）〜（８）のいずれか一に記載のＤＮＡまたは（９）に記載の組換えＤＮＡ又はベクターを保持する形質転換細胞。
（１１） （１）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質又は部分ペプチド、あるいは植物細胞における内在性の（１）の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質又はその部分ペプチド。
（１２） （１）に記載のＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（１１）に記載のタンパク質の製造方法。
（１３） （１）〜（８）のいずれか一に記載のＤＮＡまたは（９）に記載の組換えＤＮＡ又はベクターを保持する形質転換植物細胞。
（１４） （１３）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１５） （１４）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１６） 隔膜形成体の形成制御、および／または発生分化制御のために用いるものであることを特徴とする（１４）または（１５）に記載の形質転換植物体。
（１７） 隔膜形成体の形成及び／又は拡大の制御が改変されている（１４）または（１５）に記載の形質転換植物体。
（１８） 稔性の低下している、（１４）または（１５）に記載の形質転換植物体。
（１９） （１３）に記載の植物細胞又は（１４）〜（１８）のいずれかに記載の植物体より製造された食品及び／又は飼料組成物。
（２０） （１３）に記載の植物細胞又は（１４）〜（１８）のいずれかに記載の植物体より製造される化学品。
【００１６】
（２１） 下記の（ｉ）から（ｖｉｉ） のいずれかに記載のＤＮＡ：
（ｉ）配列番号：２０で示した塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号：２０で示した２８０１−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号：２０で示した３４０１−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号：２０で示した３８４４−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｖ）配列番号：２０で示した４０００−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
（ｖｉ）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を少なくとも一ずつ含む配列を有するＤＮＡ：
（ａ）少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、又は塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
（ｂ）塩基配列がＴＴＴＣＴ、又は塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、及び
（ｃ）塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、又はＡＴＧＧＴＧＧＡである配列。
（ｖｉｉ）少なくとも、下記（ａ）のいずれか一つの配列と下記（ｂ）または（ｃ）のいずれか一つとを含む配列を有するＤＮＡ：
（ａ）少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、又は塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
（ｂ）塩基配列がＴＴＴＣＴ、又は塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、及び
（ｃ）塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、又はＡＴＧＧＴＧＧＡである配列。
【００１７】
（２２） （ａ）花粉形成に係わる器官を構成する細胞において特異的に隔膜形成体の形成及び／又は拡大を抑制することにより植物の稔性を低下させる、あるいは（ｂ）花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモータとして使用することを特徴とする（２１）のＤＮＡ。
（２３） （２１）又は（２２）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（２４） （２１）又は（２２）に記載のＤＮＡ、又は（２３）に記載のＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換細胞。
（２５） （２１）又は（２２）に記載のＤＮＡ、又は（２３）に記載のＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換植物細胞。
（２６） （２５）に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
（２７） （２６）に記載の形質転換植物体の子孫または、クローンである形質転換植物体。
（２８） 形質転換した遺伝子が花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現を示す、（２６）又は（２７）に記載の形質転換植物体。
（２９） 形質転換した遺伝子が花粉形成組織特異的発現を示す、（２６）又は（２７）に記載の形質転換植物体。
（３０） （２６）〜（２９）のいずれか一に記載の植物体より製造された食品及び／又は飼料組成物。
（３１） （２６）〜（２９）のいずれか一に記載の植物体より製造された化学品。
（３２） （１）の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物。
（３３） （３２）に記載の転写産物の量を測定する方法。
（３４） 複数の検体中の（３２）に記載の転写産物の量を相対的に比較する方法。
（３５） （１）に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質の量を測定する方法。
（３６） 複数の検体中の（１）に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質の量を相対的に比較する方法。
【００１８】
本発明者はＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子のプロモーターが花粉形成に係わる器官において強い発現が認められることを見出した。前述より、本発明者はＮＡＣＫ関連遺伝子やその類似遺伝子を用いることで花粉形成に係わる器官を構成する細胞において特異的に隔膜形成体の形成および拡大を抑制し植物の稔性を低下させることが可能であることを見出した。即ち、本発明は花粉形成組織特異的遺伝子発現制御の調節領域を含むＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子のプロモーター領域に関するものである。
より具体的には、本発明は、
（３７） 配列番号：２０で示した塩基配列を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
さらに好ましくは、本発明は、
（３８） 配列番号：２０で示した２８０１−４４１８番目の塩基配列を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
さらに好ましくは、本発明は、
（３９） 配列番号：２０で示した３４０１−４４１８番目の塩基配列を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
さらに好ましくは、本発明は、
（４０） 配列番号：２０で示した３８４４−４４１８番目の塩基配列を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
（４１） 配列番号：２０で示した４０００−４４１８ 番目の塩基配列を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
（４２） 下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ） を少なくとも１ずつ含む配列：
（ａ） 少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、または塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
（ｂ） 塩基配列がＴＴＴＣＴ、または塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、
（ｃ） 塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、またはＡＴＧＧＴＧＧＡである配列
を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
（４３） 少なくとも、下記（ａ）のいずれか一つの配列と（ｂ）または（ｃ）のいずれか一つとを含む配列：
（ａ） 少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、または塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
（ｂ） 塩基配列がＴＴＴＣＴ、または塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、
（ｃ） 塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、またはＡＴＧＧＴＧＧＡである配列
を花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモーターに用いることである。
【００１９】
本発明は、また、次なるものを提供する。
（４４） 植物細胞における内在性の（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質の活性を抑制し、もって植物の隔膜形成体の形成制御、及び／又は発生分化制御する方法。
（４５） （１）から（８）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（９）に記載のベクターにより宿主植物細胞を形質転換することを特徴とする形質転換植物の作成法。
（４６） 植物細胞における内在性の（１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡ を含有することを特徴とする植物の隔膜形成体の形成制御、及び／又は発生分化制御試薬。
（４７） （１１）に記載のタンパク質又はその部分ペプチドに対する抗体。
【００２０】
より具体的には、次のものも提供される。
（４８） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（４９） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（５０） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含み、かつ以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ である（６）のＤＮＡ：
（ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列、
（ｂ） キネシン様タンパク質のモータードメインの点変異により微小管への結合能を失ったアミノ酸配列、
（ｃ） キネシン様タンパク質のモータードメインの点変異により微小管上での移動能を失ったアミノ酸配列。
（５１） 植物の隔膜形成体の形成制御、及び／又は発生分化制御活性を有し、
かつ、
（ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｂ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
（ｃ） （ｉ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列及び（ｉｉ）配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
から成る群から選ばれたものであるＤＮＡ。
（５２） 隔膜形成体の形成、隔膜形成体の拡大、細胞板の形成及び／又は細胞板の拡大を抑制あるいは阻害する活性を有するものである（５１）のＤＮＡ。
（５３） 植物組織の形態、組織の大きさ、器官の形態、器官の大きさ、植物体の形態、植物体の大きさ及び／又は植物体の生育速度を制御する活性を有するものである（５１）のＤＮＡ。
（５４） 稔性の低下を起こす活性を有するものである（５１）のＤＮＡ。
（５５） （９）に記載の組換えＤＮＡ 又はベクター中、（ｉ） のプロモーターにおいて植物細胞内で転写可能なプロモーターとして前記（２１）、（２２）及び（３７）から（４３）に記載の塩基配列又はＤＮＡ のいずれか一を用い、且つ（ｉｉｉ） のシグナルにおいて植物で機能するシグナルを用いる組換えＤＮＡ 又はベクター。
（５６）（５５）に記載の組換えＤＮＡ 又はベクターを保持する形質転換細胞。
（５７）（５５）に記載の組換えＤＮＡ 又はベクターを保持する形質転換植物細胞。
（５８）（５７）に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
（５９） （５８）に記載の形質転換植物体の子孫または、クローンである形質転換植物体。
【００２１】
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列とポジティブであるアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は６５％以上あれば良く、望ましくは７１％以上、より望ましくは７７％以上、より望ましくは８６％以上、さらに望ましくは９０％以上である。
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸を含む割合により規定されることもできる。この場合、その割合は５０％以上あれば良く、望ましくは５６％以上、より望ましくは６４％以上、より望ましくは７６％以上、更に望ましくは９０％以上である。
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインのアミノ酸配列とポジティブであるアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は７０％以上あれば良く、望ましくは７９％以上、より望ましくは８３％以上、更に望ましくは９３％以上である。
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと同一のアミノ酸を含む割合により規定されることもできる。この場合、その割合は６０％以上あれば良く、望ましくは６８％以上、より望ましくは７４％以上、より望ましくは８７％以上、更に望ましくは９０％以上である。
【００２２】
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中の、ＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域のアミノ酸配列とポジティブであるアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は７０％以上あれば良く、望ましくは８５％以上、より望ましくは８９％以上、より望ましくは９０％以上、更に望ましくは９７％以上である。
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中の、ＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と同一のアミノ酸を含む割合により規定されることもできる。この場合、その割合は６５％以上あれば良く、望ましくは７２％以上、より望ましくは８０％以上、更に望ましくは９０％以上である。
【００２３】
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列とポジティブであるアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は６０％以上あれば良く、望ましくは６５％以上、より望ましくは６７％以上、より望ましくは７１％以上、より望ましくは７７％以上、更に望ましくは９０％以上である。
本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と同一のアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は４０％以上あれば良く、望ましくは４７％以上、より望ましくは５１％以上、より望ましくは５７％以上、より望ましくは６０％以上、更に望ましくは９０％以上である。
更に本発明により提供されるＤＮＡは、前記（１）及び（４８）から（５１）の記載において、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列に基づいて規定されるが、望ましくは配列番号：２、４または２２に記載のアミノ酸配列に基づいて規定される。
本発明においては、２つＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を最適な形で並べるために、Ｐａｉｒｗｉｓｅ ＢｌａｓｔのＢｌａｓｔ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を用いる。
【００２４】
本発明において、前記（１）から（８）に記載のいずれかのＤＮＡ を植物細胞で転写するため又はＮＡＣＫ関連タンパク質のドミナントネガティブ分子を発現させるための植物細胞内で転写可能なプロモーターとしてはＡｔＮＡＣＫ２ プロモーターに限るものではなく、雄性生殖系の器官または細胞において高い遺伝子発現を示すプロモーターであるシロイヌナズナＡＶＰ１遺伝子プロモーター（Ｍｉｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ４６：１８５（２００１） ）、シロイヌナズナ ＤＡＤ １遺伝子プロモーター（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １３：２１９１（２００１））、タバコＴＡ２０、ＴＡ２９遺伝子プロモーター（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１４６０（１９８８））、イネＯｓｇ６Ｂ 遺伝子プロモーター（Ｔｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， ２６：１７３７（１９９４））、トマトＬａｔ５２ 遺伝子プロモーター（Ｔｗｅｌｌｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １０９：７０５（１９９０）） 、タバコｇ１０ 遺伝子プロモーター（Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４５：５７７（２００１）） 、カリフラワーモザイクウイルス ３５Ｓプロモーターに葯特異的遺伝子発現調節配列を挿入した人工的なプロモーター（Ｉｎｇｒｉｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ４：２５３（１９９２））を用いることができる。
【００２５】
本発明の技術により、外生の（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ＮＡＣＫ関連タンパク質でドミナントネガティブ活性を有するＮＡＣＫストーク（モータードメイン欠損分子）でもって不稔になった植物に対して、このドミナントネガティブの発現をｍＲＮＡ段階で抑制することが可能であり、これを利用した稔性の回復技術が提供できる。該ドミナントネガティブの発現をｍＲＮＡ段階で抑制する場合、内生のＮＡＣＫタンパク質のｍＲＮＡに影響を与えることなく、選択的に外生のドミネガ分子のそれのみを抑制する技術を提供できる。さらに、本発明は、該不稔になった植物に対して、インタクトなＮＡＣＫ分子の過剰発現によっても同様の効果を得る技術をも提供する。
本発明では、次のものも提供される。
（６０） （１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対して、ドミナントネガティブ活性を有するタンパク質であり、且つ外生のタンパク質であるタンパク質の発現により不稔となった植物から、稔性が回復した植物を作出する方法であって、ドミナントネガティブ活性を有するタンパク質の発現を抑制することを特徴とする方法。
（６１） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質が下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかである（６０）に記載の方法。
（ｉ） 配列番号：２の３６１〜９５９番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ１ＳＴ）
（ｉｉ） 配列番号：４の３６０〜９５５番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ２ＳＴ）
（ｉｉｉ） 配列番号：６の３６１〜９７４番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ）
（ｉｖ） 配列番号：２２の３６２〜９５４番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＯｓＮＡＣＫＳＴ）
（ｖ） 配列番号：５１の３５６〜９３８番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ）。
（６２） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質が配列番号：４の３６０〜９５５番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ２ＳＴ）である（６０）に記載の方法。
（６３） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質の発現の抑制がＲＮＡ干渉によるものである（６０）、（６１）、または（６２）のいずれかに記載の方法。
（６４） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質の発現により不稔となった植物と、該タンパク質の発現をＲＮＡ干渉により抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡを有する植物とを交配する工程を含む（６３）に記載の方法。
（６５） ＲＮＡ干渉を生じるＲＮＡをコードするＤＮＡが配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列の一部若しくは全てを含むＤＮＡである（６３）または（６４）のいずれかに記載の方法。
（６６） ＲＮＡ干渉を生じるＲＮＡをコードするＤＮＡが、配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列の一部であって、少なくとも１０塩基以上であり、好ましくは２０塩基以上であり、より好ましくは５０塩基以上であり、より好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは２００塩基以上である（６３）または（６４）のいずれかに記載の方法。
（６７） 配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列の一部であって、少なくとも１０塩基以上であり、好ましくは２０塩基以上であり、より好ましくは５０塩基以上であり、さらに好ましくは２００塩基以上であるＤＮＡがスペーサー配列を挟んで逆位反復した一次構造を有するＤＮＡが、ＲＮＡ干渉を生じるＲＮＡをコードするＤＮＡである（６３）または（６４）のいずれかに記載の方法。
（６８） スペーサー配列を挟んで配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列で表されるＤＮＡが逆位反復した一次構造を有するＤＮＡが、ＲＮＡ干渉を生じるＲＮＡをコードするＤＮＡである（６３）または（６４）のいずれかに記載の方法。
【００２６】
（６９） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質の発現の抑制がアンチセンス配列によるものである（６０）、（６１）、または（６２）のいずれかに記載の方法。
（７０） ドミナントネガティブ活性を有する外生のタンパク質の発現により不稔となった植物と、該タンパク質の発現をアンチセンス配列をコードするＤＮＡを有する植物とを交配する工程を含む（６９）に記載の方法。
（７１） アンチセンス配列をコードするＤＮＡが配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列の一部若しくは全てを含むＤＮＡである（６９）または（７０）のいずれかに記載の方法。
（７２） アンチセンス配列をコードするＤＮＡが、配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列の一部であって、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、より好ましくは２００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である（６９）または（７０）のいずれかに記載の方法。
（７３） アンチセンス配列をコードするＤＮＡが、配列番号：３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列で表されるＤＮＡである（６９）または（７０）のいずれかに記載の方法。
（７４） （１）の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対して、ドミナントネガティブ活性を有するタンパク質の発現により不稔となった植物から、稔性が回復した植物を作出する方法であって、該ＤＮＡがコードするタンパク質を過剰発現させることによりドミナントネガティブ活性を有するタンパク質の効果を低下させることを特徴とする方法。
（７５） ドミナントネガティブ活性を有するタンパク質が下記（ｉ）〜（ｖ）のいずれかである（７４）に記載の方法。
（ｉ） 配列番号：２の３６１〜９５９番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ１ＳＴ）
（ｉｉ） 配列番号：４の３６０〜９５５番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ２ＳＴ）
（ｉｉｉ） 配列番号：６の３６１〜９７４番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ）
（ｉｖ） 配列番号：２２の３６２〜９５４番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＯｓＮＡＣＫＳＴ）
（ｖ） 配列番号：５１の３５６〜９３８番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ）
（７６） ドミナントネガティブ活性を有するタンパク質が配列番号：４の３６０〜９５５番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質（ＮＡＣＫ２ＳＴ）である（７５）に記載の方法。
（７７） 配列番号：４の３６０〜９５５番目のアミノ酸配列で表されるタンパク質の発現により不稔となった植物と、配列番号：４のアミノ酸配列で表されるタンパク質を過剰発現する植物とを交配させることにより稔性が回復した植物を得る方法。
（７８） （６０）〜（７７）のいずれかに記載の方法を施された植物細胞、該植物細胞を含む植物体、該植物体の子孫、またはクローンである植物体。
（７９） （７７）の交配において生じる植物細胞又は種子。
（８０） （７９）に記載の植物細胞又は種子から生じる植物体。
（８１） （７８）又は（８０）に記載のいずれかの植物体の種子。
（８２） （７８）〜（８１）に記載の植物細胞、種子又は植物体より製造された食品及び／又は飼料組成物、あるいは化学品。
（８３） （７８）〜（８１）に記載の植物細胞、種子又は植物体を使用することを特徴とする生物活性を有する物質のスクリーニング法及び該スクリーニング法で同定された物質。
【００２７】
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸を単離・配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のペプチドを得ることができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９ ＆ ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １ ｔｏ ４， （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人 （１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 ＩＩＩ（組換えＤＮＡ 技術）」、東京化学同人 （１９９２）； ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” シリーズ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、例えばＲ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ６８ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）； Ｒ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １００ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｂ） ＆ １０１ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｃ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｒ． Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５３ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｄ）， １５４ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｅ） ＆ １５５ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｆ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ｊ． Ｈ． Ｍｉｌｌｅｒ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２０４， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２１６ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｇ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２１７ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｈ） ＆ ２１８ （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐａｒｔ Ｉ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）； Ｇ． Ｍ． Ａｔｔａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２６０ （Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｐａｒｔ Ａ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）； Ｊ． Ｌ． Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２６２ （ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）； Ｇ． Ｍ． Ａｔｔａｒｄｉ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ２６４ （Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｐａｒｔ Ｂ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９６）； Ｐ． Ｍ． Ｃｏｎｎ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３０２ （Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）； Ｓ． Ｗｅｉｓｓｍａｎ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３０３ （ｃＤＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）； Ｊ． Ｃ． Ｇｌｏｒｉｏｓｏ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３０６ （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）； Ｍ． ｌａｎ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３１３ （Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｒｔ Ａ： Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ＲＮＡ Ｓｔｕｄｉｅｓ） ＆ ３１４ （Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐａｒｔ Ｂ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９９）； Ｊ． Ｔｈｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３２６ （Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｐａｒｔ Ａ： Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）， ３２７ （Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｐａｒｔ Ｂ： Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ） ＆ ３２８ （Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｐａｒｔ Ｃ： Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０００） などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる） 。
【００２９】
本発明は、植物の隔膜形成体形成に関与するＮＡＣＫ１タンパク質及びＮＡＣＫ２タンパク質を提供する。酵母内で発現しているＮＰＫ１のキナーゼ活性を活性化することが明らかになっていたＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡの塩基配列及びＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡの塩基配列を明らかにした。ＮＡＣＫ１ 遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、この遺伝子がコードするＮＡＣＫ１ タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示し、ＮＡＣＫ２ 遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：３に、この遺伝子がコードするＮＡＣＫ２ タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
本発明は、ＮＡＣＫ１ タンパク質、またはＮＡＣＫ１ タンパク質と機能を同等とするタンパク質に対してドミナントネガティブに機能し、隔膜形成体の形成及び／又は拡大を制御するＮＡＣＫ関連タンパク質の一部分及びその使用方法を提供する。
本発明においてＮＡＣＫ関連タンパク質がドミナントネガティブ分子として機能するためには、
（ａ） 配列番号：２に示したＮＡＣＫ１タンパク質であれば ３６１〜９５９番目のアミノ酸配列を用いた分子、
（ｂ） 配列番号：４に示したＮＡＣＫ２タンパク質であれば ３６０〜９５５番目のアミノ酸配列
を用いた分子、
（ｃ） 配列番号：２２に示したＯｓＮＡＣＫタンパク質であれば ３６２〜９５４番目のアミノ酸配列を用いた分子、
（ｄ） 配列番号：６に示したＡｔＮＡＣＫ１タンパク質であれば ３６１〜９７４番目のアミノ酸配列を用いた分子、
（ｅ） 配列番号：５１に示したＡｔＮＡＣＫ２タンパク質であれば ３５６〜９３８番目のアミノ酸配列を用いた分子、
（ｆ） 上記（ａ）〜（ｅ）の分子のいずれか一つと、アミノ酸配列を最適な形で並べて比較した時、６０％のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有する分子、 （ｇ） 上記（ａ）〜（ｅ）の分子のいずれか一つと、アミノ酸配列を最適な形でならべて比較した時、４０％のアミノ酸が同一であるアミノ酸配列を有する分子、
（ｈ） ＮＡＣＫ関連タンパク質のモータードメインのアミノ酸配列の一部を欠失した分子、
（ｉ） ＮＡＣＫ関連タンパク質のモータードメインのアミノ酸配列の一部を欠失することにより、微小管に結合する能力を欠失した分子、
（ｊ） ＮＡＣＫ関連タンパク質のモータードメインのアミノ酸配列においてアミノ酸置換を導入して微小管上の移動能力を欠失した、すなわちキネシン様タンパク質のモーター活性を示さない分子、
（ｋ） ＮＡＣＫ関連タンパク質のコイルドコイル構造が予測されるアミノ酸配列を含む分子が微小管上の移動能力を欠失した、または微小管への結合能力が欠失した、すなわちキネシン様タンパク質のモーター活性を示さない分子
（ｌ） 上記（ｈ）〜（ｋ）においてＮＡＣＫ関連タンパク質がＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、ＡｔＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ２又はＯｓＮＡＣＫである分子
（ｍ） 上記（ｈ）〜（ｋ）においてＮＡＣＫ関連タンパク質がＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、又はＯｓＮＡＣＫである分子
から成る群から選ばれたもののうちの少なくとも一つである分子である。
【００３０】
本発明において提供されるドミナントネガティブとして機能する分子は、前記（ｆ）の記載において、該分子のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、前記（ａ）から（ｅ）に記載の分子のアミノ酸配列とポジティブであるアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は６０％以上あれば良く、望ましくは６５％以上、より望ましくは６７％以上、より望ましくは７１％以上、より望ましくは７７％以上、更に望ましくは９０％以上である。
本発明において提供されるドミナントネガティブとして機能する分子は、前記（ｇ）の記載において、該分子のアミノ酸配列を最適な形で並べた時に、前記（ａ）〜（ｅ）に記載の分子のアミノ酸配列と同一のアミノ酸を含む割合により規定されるが、その割合は４０％以上あれば良く、望ましくは４７％以上、より望ましくは５１％以上、より望ましくは５７％以上、より望ましくは６０％以上、更に望ましくは９０％以上である。
【００３１】
また、本発明においてＮＡＣＫ関連タンパク質がドミナントネガティブ分子として機能するためには，
（ｉ） ＮＡＣＫ関連タンパク質のコイルドコイル構造が予測されるアミノ酸配列を含み且つ微小管上の移動能力を持たない分子、
（ｉｉ） ＮＡＣＫ 関連タンパク質が、ＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、ＡｔＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ２又はＯｓＮＡＣＫである上記（ｉ） の分子、
（ｉｉｉ） キネシン様モータードメインのアミノ酸配列の一部又は全部を欠失しているため微小管上に結合する能力を失ったＮＡＣＫ関連タンパク質、
（ｉｖ） ＮＡＣＫ関連タンパク質が、ＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、ＡｔＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ２又はＯｓＮＡＣＫである上記（ｉｉｉ）の分子、
（ｖ） キネシン様モータードメインのアミノ酸配列においてアミノ酸置換を導入して微小管上を移動する能力を失ったＮＡＣＫ関連タンパク質、
（ｖｉ） ＮＡＣＫ関連タンパク質が、ＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、ＡｔＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ２又はＯｓＮＡＣＫである上記（ｖ）の分子、
（ｖｉｉ） キネシン様モータードメインを欠失しているＮＡＣＫ関連タンパク質、
（ｖｉｉｉ） ＮＡＣＫ関連タンパク質がＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、ＡｔＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ２又はＯｓＮＡＣＫである上記（ｖｉｉ）の分子。
から成る群から選ばれたもののうちの少なくとも一つである分子である。
より望ましくは上記（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）においてＮＡＣＫ関連タンパク質が、ＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２、又はＯｓＮＡＣＫである分子のうちの少なくとも一つの分子である。
従って、ドミナントネガティブ分子として機能するＮＡＣＫ関連タンパク質を細胞内で発現させるためには、上記（ａ）〜（ｍ）または（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかに記載の分子をコードするＤＮＡを用いることができる。
【００３２】
ＮＡＣＫ関連タンパク質の一部分を用いた分子による形質転換植物では隔膜形成体の形成および拡大が不完全であったことは（ 実施例１４、実施例１５及び実施例２３） 、ＮＡＣＫ１ タンパク質、ＮＡＣＫ２ タンパク質が植物の隔膜形成体の形成及び／又は拡大を制御する因子であり、かつこれらのＮＡＣＫ関連タンパク質の一部分を用いた分子がＮＰＫ１タンパク質にドミナントネガティブに機能することを証明するものである。
【００３３】
本発明は、花粉形成特異的な遺伝子発現の調節領域を含む「ＡｔＮＡＣＫ２ 」のプロモーター領域を提供する。この領域を含むゲノムＤＮＡ 配列を配列番号：２０に示す。
実施例１６に示すようにＡｔＮＡＣＫ２ のプロモーター領域には既に Ｍ期特異的遺伝子発現制御に必須であるＭＳＡ 配列近傍に多数の花粉、または花粉形成細胞特異的な遺伝子発現調節領域を見出した。この事実はＡｔＮＡＣＫ２ プロモーターが花粉形成に係わる器官において強く発現するなどの遺伝子発現調節を示すことを証明するものである。
【００３４】
本発明はＮＡＣＫ１あるいはＮＡＣＫ２タンパク質と機能的に同等なタンパク質を提供する。本発明において「同等な機能を有する」または「機能的に同等」とは、タンパク質が植物の隔膜形成体の形成および／または拡大において機能することを指す。タンパク質が植物の隔膜形成体形成において機能するか否かは、変異株におけるタンパク質の発現による機能相補試験や、ドミナントネガティブ分子の形質転換植物における隔膜形成体の形成および拡大の変化（多核化した細胞）の検出及び／又はタンパク質の隔膜形成体の局在性により、決定することが可能である。
ＮＡＣＫ関連タンパク質はアミノ酸配列からも識別し得る。すなわち、実施例５に示すようにＮＡＣＫ１ タンパク質の機能に必須である２つの領域のアミノ酸配列の相同性より明らかとなる。２つの領域とは微小管上における移動能力を示すために必須であるモータードメインとＮＰＫ１関連タンパク質との結合に必須な領域を指す。特にＮＰＫ１関連タンパク質との結合に必須な領域はコイルドコイル構造を形成することが予測されることが重要である。
【００３５】
本発明で特徴付けたタンパク質を単離するための植物としては、特に制限はなく、広く栽培植物あるいは有用植物として知られたものの中から選択して利用でき、穀類、豆類、イモ類、種実類、野菜類、果実類として知られた植物、さらには園芸花木樹木なども挙げられる。該植物としては、例えば、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、ユリ科、セリ科、ウリ科などのものが挙げられ、好ましくはタバコ、シロイヌナズナ、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、ベントグラス、トウモロコシ、アブラナ、ジャガイモ、サツマイモ、タロイモ、コンニャク、キャッサバなどが挙げられる。これらは遺伝子源としても利用できる。
【００３６】
上記したような機能的に同等なタンパク質を取得・単離する方法の一つの態様としては、タンパク質中のアミノ酸に変異を導入する方法が当業者によく知られている。即ち、当業者であれば、公知の方法により、天然型の「ＮＡＣＫ１」タンパク質（例えば、配列番号：２に記載のタンパク質）あるいは天然型の「ＮＡＣＫ２ 」タンパク質（例えば、配列番号：４に記載のタンパク質）中のアミノ酸を適宜置換、欠失、付加などして、これと同等の機能を有する改変タンパク質を調製することが可能である。また、アミノ酸の変異は自然界において生じることもある。本発明のタンパク質には、このように天然型の「ＮＡＣＫ１」タンパク質または天然型の「ＮＡＣＫ２ 」タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有し、天然型のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。タンパク質におけるアミノ酸の改変は、通常、全アミノ酸の５０アミノ酸以内であり、好ましくは３０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内である。アミノ酸の改変は、例えば、変異や置換であれば「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ 」や「ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて行うことが可能であり、また、欠失であれば「Ｑｕａｎｔｕｍ ｌｅａｐ Ｎｅｓｔｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いて行うことが可能である。
【００３７】
変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 ＩＩ 」、ｐ１０５（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）； 日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 ＩＩＩ（組換えＤＮＡ 技術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９２）； Ｒ． Ｗｕ， Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５４， ｐ． ３５０ ＆ ｐ． ３６７， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ｒ． Ｗｕ， Ｌ． Ｇｒｏｓｓｍａｎ， ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １００， ｐ． ４５７ ＆ ｐ． ４６８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８３）； Ｊ． Ａ． Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５， １９８５； Ｔ． Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ３３０５， １９８５； Ｊ． Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ８７６５， １９８５； Ｒ． Ｗｕ ｅｄ．， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １５５， ｐ． ５６８， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）； Ａ． Ｒ． Ｏｌｉｐｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ４４： １７７， １９８６ などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法） （Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７， １９８７； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１， １９８６）， カセット変異導入法 （ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５， １９８５）， 制限部位選択変異導入法 （ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ Ｓｅｒ Ａ， ３１７： ４１５， １９８６），アラニン・スキャンニング法 （Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ＆ Ｗｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５， １９８９）， ＰＣＲ 変異導入法， Ｋｕｎｋｅｌ法， ｄＮＴＰ［αＳ］法（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ），亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。
【００３８】
アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、好ましい変化を与えるものであってよく、当該タンパク質を構成するポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に変化を生ぜしめるものであってよい。該置換、欠失、あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされていないものと実質的に同一であるとされるものであることもできる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。場合によっては、システインをセリンに、グリシンをアラニンやロイシンに、あるいはロイシンをアラニン、イソロイシン、バリンなどに置き換えてもよい。
本発明のタンパク質は、化学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾することもできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾したり、部分分解したりしてその誘導体などにすることができる。
【００３９】
また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然の所定の本発明のタンパク質と実質的に同等の生物学的活性を有しているものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生法を用いることができるが、こうした融合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合タンパク質としては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ） 、マルトース結合タンパク （ＭＢＰ）， グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ （ＧＳＴ）、チオレドキシン （ＴＲＸ）又は Ｃｒｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅのアミノ酸配列に融合せしめられたものなどが挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなエピトープのタグを付加され、該エピトープに特異的に結合する抗体を用いてのイムノアフィニティ・クロマトグラフィーによる精製をなし得るようにすることもできる。より適した実施態様においては、該エピトープタグとしては、例えば ＡＵ５， ｃ−Ｍｙｃ， ＣｒｕｚＴａｇ ０９， ＣｒｕｚＴａｇ ２２， ＣｒｕｚＴａｇ ４１， Ｇｌｕ−Ｇｌｕ， ＨＡ， Ｈａ．１１， ＫＴ３， ＦＬＡＧ （ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ ｔｒａｄｅｍａｒｋ， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）， Ｏｍｎｉ−ｐｒｏｂｅ， Ｓ−ｐｒｏｂｅ， Ｔ７， Ｌｅｘ Ａ， Ｖ５， ＶＰ１６， ＧＡＬ４， ＶＳＶ−Ｇ などが挙げられる。（Ｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ８： ｐｐ．２１５９−２１６５ （１９８８）； Ｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５： ｐｐ．３６１０−３６１６ （１９８５）； Ｐａｂｏｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）： ｐｐ．５４７−５５３ （１９９０）； Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６： ｐｐ．１２０４−１２１０ （１９８８）； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５： ｐｐ．１９２−１９４ （１９９２）； Ｓｋｉｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６： ｐｐ．１５１６３−１５１６６ （１９９１）； Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７： ｐｐ．６３９３−６３９７ （１９９０）など） 。酵母を利用した ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ 法も利用できる。
【００４０】
さらに融合タンパク質としては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付されたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカーは、ビオチン／ストレプトアビジン系のＢｉｏｔｉｎ Ａｖｉ Ｔａｇ、螢光を発する物質などであってよい。該螢光を発する物質としては、オワンクラゲ （Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｅａ）などの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＰ）、それを改変した変異体（ＧＦＰバリアント） 、例えば、ＥＧＦＰ （Ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＧＦＰ）， ｒｓＧＦＰ （ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔ ＧＦＰ）， 黄色螢光タンパク質 （ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＹＦＰ）， 緑色螢光タンパク質 （ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＧＦＰ），藍色螢光タンパク質 （ｃｙａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＣＦＰ）， 青色螢光タンパク質 （ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ： ＢＦＰ）， ウミシイタケ （Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） 由来のＧＦＰ などが挙げられる（宮脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座３−ＧＦＰ とバイオイメージング、羊土社 （２０００年））。また、上記融合タグを特異的に認識する抗体（モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検出を行うこともできる。
本発明のタンパク質及びその一部のペプチドの合成には、当該ペプチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次該樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそれ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
【００４１】
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、天然のタンパク質としての他、遺伝子組換え技術を利用して調製した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質は、例えば、下記の方法により調製された組換えタンパク質をウサギなどの小動物に免疫して得た抗体を適当な吸着体（ＣＮＢｒ活性化アガロースやトシル活性化アガロース）に結合させてカラムを作製し、得られたカラムを利用してイネの葉のタンパク質抽出液を精製することにより調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、常法、例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、該形質転換細胞から精製することにより調製することが可能である。
【００４２】
組換えタンパク質を生産するために用いられる細胞としては、例えば、植物細胞、大腸菌、酵母などの微生物細胞、動物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。また、細胞内で組換えタンパク質を発現させるためのベクターとしては、例えば、植物、酵母細胞用にはプラスミド「ｐＢＩ１２１」や「ｐＢＩ１０１」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、大腸菌用にはプラスミド「ｐＥＴ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ 」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）や「ＧＳＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ 」（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社製）、ほ乳類細胞用にはプラスミド「ｐＭＡＭ」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、昆虫細胞用にはプラスミド「ｐＢａｃＰＡＫ８．９」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などが挙げられる。ベクターへのＤＮＡ の挿入は、常法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ） に記載の方法により行うことができる。また、宿主細胞へのベクターの導入は、常法により宿主細胞に応じてエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法などの方法で行うことが可能である。
得られた形質転換細胞からの本発明の組換えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、ＳＤＳ 電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
【００４３】
得られた形質転換細胞からの本発明の組換えタンパク質の精製は、タンパク質の性質に応じ、塩析や有機溶媒による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、免疫吸着体によるカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過、ＳＤＳ 電気泳動、等電点電気泳動などを適宜組み合わせて行うことが可能である。また、本発明の組換えタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの標識との融合タンパク質として発現させた場合には、該標識に対するアフィニティークロマトグラフィーなどにより精製することも可能である。
【００４４】
また、本発明は、上記本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ を提供する。本発明のＤＮＡ は、本発明のタンパク質をコードし得るものであれば特に制限はなく、ゲノムＤＮＡ 、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ などが含まれる。ゲノムＤＮＡ は、例えば、文献 （Ｒｏｇｅｒｓ ａｎｄ Ｂｅｎｄｉｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ５：６９ （１９８５）） 記載の方法に従って調製したゲノムＤＮＡ を鋳型として、本発明のＤＮＡ の塩基配列（例えば、配列番号：１または配列番号：３に記載の塩基配列）を基に作製したプライマーを用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ＰＣＲ）を行うことにより調製することが可能である。また、ｃＤＮＡであれば、常法 （Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ） により植物からｍＲＮＡを調製し、逆転写反応を行い、上記と同様のプライマーを用いてＰＣＲ を行うことにより調製することが可能である。また、ゲノムＤＮＡ やｃＤＮＡは、常法によりゲノムＤＮＡ ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーに対し、例えば本発明のＤＮＡ の塩基配列（例えば、配列番号：１または３ に記載の塩基配列）を基に合成したプローブを用いてスクリーニングすることによっても調製することが可能である。
【００４５】
また、機能的に同等なタンパク質を単離する方法の他の態様としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８：５０３（１９７５）； Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｒｙ Ｐｒｅｓｓ） やＰＣＲ 技術（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ （ｅｄ．）， ”ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９））が挙げられる。即ち、当業者にとっては、「ＮＡＣＫ１」遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、「ＮＡＣＫ１」遺伝子の塩基配列（配列番号：１）の一部にハイブリダイズするオリゴ塩基をプライマーとして、これと高い相同性を有するＤＮＡを単離して、該ＤＮＡから「ＮＡＣＫ１」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を得ることは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離されたＤＮＡがコードする「ＮＡＣＫ１ 」タンパク質と同等の機能を有するタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。同様なことは、ＮＡＣＫ２ についても適用できる。
【００４６】
本明細書中、ＰＣＲ とは、一般的に、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：４８７（１９８８）； 米国特許第 ４，６８３，１９５号明細書などに記載されたような方法を指し、例えば、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するための方法を指している。一般に、ＰＣＲ は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることのできる２個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、ＰＣＲ 法で用いられるプライマーは、鋳型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なプライマーを使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端において相補的であるか、あるいは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接しているものを好ましく使用することができる。代表的な場合には、５’端側のプライマーとしては、少なくとも開始コドンを含有するか、あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択し、また３’端側のプライマーとしては、少なくともストップコドンを含有するか、あるいは該ストップコドンを含めて増幅できるように選択することが好ましい。プライマーは、好ましくは ５個以上の塩基、さらに好ましくは１０個以上の塩基からなるオリゴヌクレオチド、より好ましくは１８〜３５個の塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００４７】
ＰＣＲ は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば 上記文献の他、Ｒ． Ｓａｉｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０， １９８５； Ｈ． Ａ． Ｅｒｌｉｃｈ ｅｄ．， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８９； Ｄ． Ｍ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｖｏｌ． １， （Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ （１９９５）； Ｍ． Ａ． Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄ．， ”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： ａ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９０））； Ｍ． Ｊ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｐ． Ｑｕｉｒｋｅ ａｎｄ Ｇ． Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ （Ｅｄ．）， ＰＣＲ： ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９９１）； Ｍ． Ａ． Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ８９９８−９００２ （１９８８） などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、ＰＣＲ は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
【００４８】
ＰＣＲ は、代表的な場合には、例えば鋳型（例えば、ｍＲＮＡを鋳型にして合成されたＤＮＡ； １ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ など） と該遺伝子に基づいてデザインされたプライマーとを、１０×反応緩衝液 （Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼに添付されている） 、ｄＮＴＰｓ（デオキシヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＴＴＰの混合物）、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ ２４００ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ などの自動サーマルサイクラーを用いて一般的なＰＣＲ サイクル条件下にそのサイクルを２５〜６０回繰り返すが、増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。ＰＣＲ サイクル条件としては、例えば、変性９０〜９５℃ ５〜１００秒、アニーリング４０〜６８℃ ５〜１５０秒、伸長６５〜７５℃ ３０〜９００秒のサイクル、好ましくは変性 ９４ ℃ １５ 秒、アニーリング ５８℃ １５秒、伸長 ７２℃ ４５秒のサイクルが挙げられるが、アニーリングの反応温度及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の時間も、予想されるＰＣＲ 産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの反応温度は、通常プライマーと鋳型ＤＮＡ とのハイブリッドのＴｍ値に応じて変えることが好ましい。伸長反応の時間は、通常１０００ｂｐの鎖長当たり１ 分程度がおおよその目安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。得られたＤＮＡ の塩基配列は、例えば「シークエンサーＭｏｄｅｌ３１０」（ＡＢＩ 社製）を利用することにより容易に決定することが可能である。本発明のＤＮＡ は、例えば、上記したように組換えタンパク質の調製に用いることができる。さらに、本発明のＤＮＡ を植物体内で発現させることにより、細胞壁成分の合成が促進された形質転換植物体や発生分化が促進された形質転換植物体を得ることも可能である。
【００４９】
ＮＡＣＫ１ と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を単離するためのハイブリダイゼーションは、５５℃でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％ ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣ（３Ｍ ＮａＣｌ， ０．３Ｍ クエン酸ナトリウム）もしくは２ＸＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ， ０．２Ｍリン酸ナトリウム液（ｐＨ７．７）， ０．０２Ｍ Ｎａ_２−ＥＤＴＡ） 中で、５５℃で１０分間の洗浄を合計３回行うという条件で行なうことができる。よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％ ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃で１０分間洗浄を合計３回行えば良い。さらに、よりストリンジェントなハイブリダイゼーションにおいては、６５℃でハイブリダイゼーションさせた後、０．１％ ＳＤＳを含む２ＸＳＳＣもしくは２ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃で１０分間洗浄し、次に０．１％ ＳＤＳを含む１ＸＳＳＣもしくは１ＸＳＳＰＥ液中で、６５℃で１０分間の洗浄を２回行えばよい。ハイブリダイゼーション液は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）」に記載されているもの等を用いればよい。
【００５０】
ハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により得られるＤＮＡがコードするＮＡＣＫ関連タンパク質のアミノ酸配列の相同性は、Ｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？Ｊｆｏｒｍ＝１）やＧｅｎｅ Ｗｏｒｋｓ （Ｉｎｔｅｌｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．） 等による相同性検索により決定することができる。
ＮＡＣＫ１ タンパク質と同等な機能を有するＮＡＣＫ関連タンパク質のアミノ酸配列はそのタンパク質のＮ末端側に見出されるキネシン様タンパク質のモータードメインと相同性が高い領域においてＮＡＣＫ１ タンパク質と６０％以上のアミノ酸配列が同一であり、ＮＡＣＫ１ タンパク質の ６８６〜７５９ 番目のアミノ酸配列に相当する ＮＰＫ１ タンパク質またはそのオルソログ結合領域が６５％以上アミノ酸において同一であり、且つこの領域がコイルドコイル構造を予測するプログラム（ＣＯＩＬＳ ｐｒｏｇｒａｍ， ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ＃ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＃ｌｕｐａｓ．ｈｔｍｌ， Ｌｕｐａｓ ｅｔ ａｌ． １９９１） によってコイルドコイル構造が予測されることである。
【００５１】
また、本発明は、植物体内で本発明のＤＮＡ の発現を抑制し得る分子を提供する。「本発明のＤＮＡ の発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡ の発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡ が植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した （Ｊ．Ｒ．Ｅｃｋｅｒ およびＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ． ８３：５３７２（１９８６））。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスＲＮＡ の発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており （Ａ．Ｒ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら， Ｎａｔｕｒｅ ３３３：８６６（１９８８））、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００５２】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡ ポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡ とのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ） 付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００５３】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡ も、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡ に含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡ は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡ は、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡ の配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡ は、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。配列の相補性は、上記した検索により決定することができる。
アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡ の長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００ 塩基以上であり、より好ましくは２００ 塩基以上であり、さらに好ましくは５００ 塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡ の長さは５ｋｂ よりも短く、好ましくは２．５ｋｂ よりも短い。
【００５４】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡ を利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ 分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡ を切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡ の部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ のように４００ 塩基以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０塩基程度の活性ドメインを有するものもある。
【００５５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５ のＣ１５ の３’側を切断するが、活性にはＵ１４ が９位のＡ と塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣ の他にＡ またはＵ でも切断されることが示されている （Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ ら，（１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８：２２５） 。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ 配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ 中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ 切断リボザイムを作出することが可能である （Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ ら，（１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２３９：２８５、Ｍ．Ｋｏｉｚｕｍｉ ら，（１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７０５９） 。例えば、ＮＡＣＫ２ 遺伝子（配列番号：２）のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ のマイナス鎖に見出される （Ｊ．Ｍ．Ｂｕｚａｙａｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ３２３：３４９， １９８６） 。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ 切断を起こすように設計できることが示されている （Ｙ．Ｋｉｋｕｃｈｉ およびＮ．Ｓａｓａｋｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：６７５１（１９９２））。
【００５６】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ プロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡ の５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡ からリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である （Ｋ．Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， ３：７３３（１９９０）； Ａ．Ｍ．Ｄｚｉａｎｏｔｔ およびＪ．Ｊ．Ｂｕｊａｒｓｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ８６：４８２３（１９８９）； Ｃ．Ａ．Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ およびＲ．Ｔ．Ｃｅｃｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：３８７５（１９９１）； Ｋ．Ｔａｉｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９：５１２５（１９９１）） 。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる （Ｎ．Ｙｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １８６：１２７１， １９９２）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００５７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡ の形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される （Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：Ｒ７９３， １９９７； Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：８１０， １９９６）。例えば、ＮＡＣＫ２ 遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、ＮＡＣＫ２ 遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡ を発現できるように作製したベクターＤＮＡ を目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から多核化した細胞を有する植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
【００５８】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡ の形質転換によってもたらされるＲＮＡｉによっても達成されうる。「ＲＮＡｉ」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡ を形質転換により導入すると、外来ＤＮＡ に由来する二本鎖ＲＮＡ が発現し、標的遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。ＲＮＡ 干渉の機構としては、第一段階として標的遺伝子のｍＲＮＡと導入配列由来の二本鎖ＲＮＡ が複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的なＲＮＡ が合成され、第二段階として内在性ＲＮａｓｅ によってこの複合体が断片化され、第３段階として２０−３０ 塩基対に断片化した二本鎖ＲＮＡ が二次的なＲＮＡ 干渉のシグナルとして機能することによって再び、内在性の標的遺伝子のｍＲＮＡを分解すると考えられている。 （Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：Ｒ７９３， １９９７； Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：８１０， １９９６）。例えば、ＮＡＣＫ１遺伝子あるいはＮＡＣＫ２ 遺伝子がＲＮＡ 干渉によって抑制された植物体を得るためには、ＮＡＣＫ１遺伝子あるいはＮＡＣＫ２ 遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡ を逆位反復に配置したＤＮＡ を発現できるように作製したベクターＤＮＡ を目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から多核化した細胞を有する植物を選択すればよい。ＲＮＡ 干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも１０塩基以上が連続して同一であり、好ましくは２０塩基以上が連続して同一であり、より好ましくは５０塩基以上が連続して同一であり、より好ましくは１００ 塩基以上が連続して同一であり、さらに好ましくは２００ 塩基以上が連続して同一である。配列の同一性は、上記した検索を利用して決定することができる。
また、ＲＮＡｉは植物ウイルスの感染によっても実現可能である。ゲノムとして一本鎖ＲＮＡをもつ植物ウイルスは、その複製過程において二本鎖ＲＮＡ形態をとる。そこで、植物ウイルスゲノム中に目的遺伝子配列を適当なプロモーターと共に挿入し、この組換えウイルスを植物に感染させた場合、該ウイルスの複製に伴い目的遺伝子配列の二本鎖ＲＮＡが生成されることになる。その結果、ＲＮＡｉの効果を得ることができる（Ａｎｇｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２０， ３５７−３６２，（１９９９））。
【００５９】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードする ＤＮＡ」とは、該ＤＮＡ を発現させることによって、植物体が本来持つ本発明の内在性遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ のことを指す。対象となるＤＮＡ が本発明の内在性遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有するか否かは、上述したように、対象となるＤＮＡ が、植物の隔膜形成体の形成および拡大の抑制による多核化した細胞が出現するか否かにより判定することができる。
ドミナントネガティブ分子よる内在性ＮＡＣＫ関連タンパク質の機能低下は、ＮＡＣＫ関連タンパク質を単離した植物種と異なる植物種に形質転換しても良い。
ドミナントネガティブの形質を示すタンパク質としてはＮＡＣＫ１ タンパク質の６８６ 〜７５９番目のアミノ酸を含んでいること、あるいはＮＡＣＫ２ タンパク質の ６８６〜７５９ 番目のアミノ酸を含んでいることが望ましく、且つ該タンパク質が微小管への結合能力を失っているか又はモーター活性が欠失していることが望ましい。モーター活性とはＮＡＣＫ１ タンパク質あるいはＮＡＣＫ２ タンパク質の微小管上を移動する活性のことであり、この活性を欠失させる方法としてはモータードメイン領域の少なくとも１部分のアミノ酸を欠失させることであり、またアミノ酸置換により変異を導入することである。
【００６０】
また、本発明は、上記本発明のＤＮＡ や本発明のＤＮＡ の発現あるいは本発明のＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を抑制するＤＮＡ が挿入された組換えＤＮＡ 又はベクターを提供する。該組換えＤＮＡ 又はベクターとしては、組換えタンパク質の生産に用いる上記したベクターの他、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本発明のＤＮＡ あるいは本発明のＤＮＡ の発現または本発明のＤＮＡにコードされるタンパク質の発現を抑制するＤＮＡ を発現させるためのベクターも含まれる。このような組換えＤＮＡ 又はベクターとしては、植物細胞で転写可能なプロモーター配列と転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を含んでいれば特に制限されず、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ｐＴＡ７００１ 」、「ｐＴＡ７００２ 」（Ａｏｙａｍａ ら（１９９７） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：６０５） などが挙げられる。
本発明の前記組換えＤＮＡ 又はベクターは、本発明のタンパク質を恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有しうる。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１３：８１０（１９８５））、イネのアクチンプロモーター（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ３：１１５５（１９９１）） 、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Ｃｏｒｎｅｊｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２３：５６７（１９９３））などが挙げられる。
【００６１】
また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３０：３８７（１９９６））やタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター（Ｏｈｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：９５（１９９０）） 、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Ａｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．， ２４０：１（１９９３）） 、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Ｖａｎ Ｂｒｅｕｓｅｇｅｍ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔａ， １９３：５７（１９９４）） 、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Ｎｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１４０６（１９９０））、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｌｅｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ８：６５１（１９８９））、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８４：６６２４（１９８７）） などが挙げられる。また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「ｒａｂ１６」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。またグルココルチコイドやエストロジェンの処理によって植物内で誘導的遺伝子発現が可能であるシステムを有するベクター系の使用も含有し得る。グルココルチコイド処理によって発現誘導可能なベクターとしてはｐＴＡ７００１、ｐＴＡ７００２（Ａｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １１：６０５（１９９７）） や、エストロジェン処理によって発現誘導が可能なベクターとしてはｐＥＲ１０（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２４：２６５（２０００）） が挙げられる。
【００６２】
また、花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子のプロモーターであるシロイヌナズナＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子プロモーター、シロイヌナズナＡＶＰ１遺伝子プロモーター、シロイヌナズナＤＡＤ１遺伝子プロモーター、タバコＴＡ２０、ＴＡ２９遺伝子プロモーター、イネＯｓｇ６Ｂ 遺伝子プロモーター、トマトＬａｔ５２ 遺伝子プロモーター、タバコｇ１０ 遺伝子プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス ３５Ｓプロモーターに葯特異的遺伝子発現調節配列を挿入した人工的なプロモーターなどが挙げられる。
【００６３】
また、本発明は、本発明の前記組換えＤＮＡ 又はベクターが導入された形質転換細胞を提供する。本発明のベクターが導入される細胞には、組換えタンパク質の生産に用いる上記した細胞の他に、形質転換植物体作製のための植物細胞が含まれる。植物細胞としては特に制限はなく、知られた植物、例えば栽培植物、有用植物などから選んでそれに適用でき、穀類、豆類、イモ類、種実類、野菜類、果実類として知られた植物、さらには園芸花木樹木などに由来のものを挙げることができる。該植物細胞としては、例えば、ナス科、アブラナ科、イネ科、マメ科、ユリ科、セリ科、ウリ科などのものが挙げられ、好ましくはタバコ、シロイヌナズナ、アブラナ、ダイズ、アズキ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、ゴマ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、エンバク、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、ピーマン、キャベツ、ブロッコリー、パセリ、ホウレンソウ、サツマイモ、タロイモ、コンニャク、キャッサバ、ブドウ、リンゴ、モモ、ナシ、カキ、イチゴ、ブルーベリー、プラム、メロン、キュウリ、サトウキビ、ミカン、レモン、オレンジ、オリーブ、綿花などの細胞が挙げられる。本発明の植物細胞には、培養細胞の他、植物体中の細胞も含まれる。また、プロトプラスト、苗条原基、多芽体、毛状根も含まれる。植物細胞へのベクターの導入は、例えば、アグロバクテリウムを利用した導入方法 （Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．， ２：２１８（１９９３）； Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ６：２７１（１９９４））、エレクトロポレーション法 （Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ， ８０：４７５（１９９０） ） 、ポリエチレングリコール法 （Ｌａｚｚｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ， ８１：４３７（１９９１）） 、パーティクルガン法 （Ｓａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐａｒｔ． Ｓｃｉ． ｔｅｃｈ．， ５：２７（１９８７））などの方法を用いることが可能であり、当該分野で知られた方法の中から適宜選択して利用することが出来る。
【００６４】
形質転換された植物細胞は、再分化させることにより植物体を再生させることが可能である。再分化の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えば、イネであればＦｕｊｉｍｕｒａら （Ｐｌａｎｔ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｅｔｔ．， ２：７４ （１９９５））の方法が挙げられ、トウモロコシであればＳｈｉｌｌｉｔｏら （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７：５８１ （１９８９）） の方法やＧｏｒｄｅｎ−Ｋａｍｍ ら （Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ２：６０３ （１９９０）） が挙げられ、ジャガイモであればＶｉｓｓｅｒら （Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ， ７８：５９４ （１９８９））の方法が挙げられ、タバコであればＮａｇａｔａとＴａｋｅｂｅ （Ｐｌａｎｔａ， ９９：１２ （１９７１）） の方法が挙げられ、シロイヌナズナであればＡｋａｍａ ら （Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， １２：７−１１ （１９９２）） の方法が挙げられる。
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡ あるいは本発明のＤＮＡ の発現を抑制するＤＮＡ が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡ または本発明のＤＮＡ の発現を抑制するＤＮＡ が導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００６５】
本発明の形質転換植物体は、本発明のＤＮＡ の発現の調節により、細胞分裂の変化や花粉形成が正常な個体と比較して変化しうる。「細胞分裂の変化」とは、例えば、隔膜形成体が拡大する変化、隔膜形成体の形成の変化、細胞板が拡大する変化、細胞板の形成の変化、細胞分裂回数の変化、細胞分裂速度の変化、細胞中に含まれる核数の変化、細胞分裂面の変化、細胞形態の変化を包含して指す。「発生分化の変化」とは、例えば、組織の形態変化、組織の大きさの変化、器官の形態変化、器官の大きさの変化、植物体の形態の変化、植物体の大きさの変化、植物体の生育速度の変化を包含して指す。「花粉形成の変化」とは、例えば、花粉形成の抑制、花粉細胞中での核数の変化、花粉細胞の大きさ、花粉管発芽の抑制、受精能力の低下の変化を包含して指す。
本明細書中で開示した関連したタンパク質、そのフラグメント、さらにはＤＮＡ を含めた核酸（ｍＲＮＡ やオリゴヌクレオチドを含む） は、それらを単独あるいは有機的に使用し、更にはアンチセンス技術、モノクローナル抗体を含めた抗体、トランスジェニク植物などとも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテオミックス技術に応用できる。また、二本鎖ＲＮＡ （ｄｓＲＮＡ） を使用してのＲＮＡｉ （ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ） 技術への応用の途もある。かくして、一塩基多型（ＳＮＰ； ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、関連遺伝子解析、農薬解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、ｃＤＮＡライブラリーを使用したり、ＰＣＲ 技術で得たＤＮＡ を基板上にスポッティング装置で高密度に配置して、ハイブリダイゼーションを利用して試料の解析が行われる。
ＲＮＡｉ技術を利用する場合、例えばｓｉＲＮＡ （ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ） をデザインしてそれを導入して行うことをしてもよい。ｓｉＲＮＡ をデザインする場合、代表的な場合、対象遺伝子のスタートコドンから約５０〜１００塩基下流、例えば７５塩基以上下流の領域に存在するＡＡで開始する１９塩基の領域を選択する。好ましくは５’− や３’−ＵＴＲやスタートコドン近傍はそれを避けるが、場合によってはＵＴＲ 領域を対象とすることもできよう。該選択領域のＧＣ含量が約３０〜７０％ 程度、例えば約４５〜５５％ 程度の領域を選択することが好ましい。２塩基（ＡＡ）＋１９ 塩基＝２１塩基の配列、例えばＡＡ（Ｎ１９）（Ｎ は任意のヌクレオチド） をＤＮＡ データベース、例えばＮＣＢＩなどで検索（例えば、ＢＬＡＳＴ サーチなど） してその特異性を確認する。選択した配列をもつ合成ＲＮＡ にはその３’端にｄＴｄＴ（あるいはＵＵ） が付加されていてよい。センス配列の合成ＲＮＡ とそれに対応するアンチセンス配列の合成ＲＮＡ を用意し、該合成ＲＮＡ は、ｄｓＲＮＡ とされて、細胞などに導入される。ｄｓＲＮＡ 作製で使用される典型的なアニーリングバッファとしては、例えば １００ ｍＭ ＫＯＡｃと２ ｍＭ ＭｇＯＡｃを含有する３０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ， ｐＨ ７．４ 液、５０ ｍＭ ＮａＣｌと１ ｍＭ ＥＤＴＡ を含有する１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ７．５〜８．０ 液などが挙げられるが、これに限定されるものではない。アニーリングの代表的な条件は、９５℃２〜３分間とした後４５〜６０分間かけて３７〜２５℃にまで徐々に冷却するという処理条件が挙げられるが、これに限定されるものではない。形成されたｄｓＲＮＡ は、例えばフェノール／クロロホルム抽出−エタノール沈殿で回収できる。ｓｉＲＮＡ を植物などの細胞に導入する方法としては当該分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法（例えば、Ｆ． Ｌ． Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２： ４５６， １９７３など）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（例えば、Ｄ． Ｗａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， ３： ３７１， １９６８など）、カチオン性脂質複合体形成法などのリボソーム法、エレクトロポレーション法（例えば、Ｅ． Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， １： ８４１， １９８２ など）、マイクロインジェクション法、ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ 粒子導入法などが挙げられる。核酸導入法は、トランスフェクションにより効率的に行い得るような技術的改良が図られており、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＱＩＡＧＥＮ社などのキット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。ｓｉＲＮＡ 技術については、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１： ４９４−４９８ （２００１）； Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５： １８８−２００ （２００１）； 多比良和誠編、「実験医学別冊プロトコールシリーズ・遺伝子の機能阻害実験法」、羊土社、２００１年などを参照することができる。
【００６６】
該アレイ化は、針あるいはピンを使用して、あるいはインクジェトプリンティング技術などでもって、スライドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置にＤＮＡ が付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハイブリダイゼーションの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シグナルは、螢光色素などの標識（例えば、Ｃｙ３， Ｃｙ５， ＢＯＤＩＰＹ， ＦＩＴＣ， Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（商品名）， Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ（商品名） など） より得られるものであってよい。検知にはレーザースキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従ったプログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよく、二次元電気泳動（２−ＤＥ）、酵素消化フラグメントを含めての質量分析 （ＭＳ）（これにはエレクトロスプレーイオン化法（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ： ＥＳＩ）， マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ： ＭＡＬＤＩ）などの技術が含まれ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ 分析計、ＥＳＩ−３ 連四重極分析計、ＥＳＩ−イオントラップ分析計などを使用してよい） 、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。したがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できるＮＡＣＫ１又はＮＡＣＫ２ など及びそれに対する抗体に関連したソフトウエア、データベースなども含まれてよい。同様なことはその他のＮＡＣＫ関連タンパク質（オルソログ）についても行なうことが可能である。
【００６７】
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよく、所望のＮＡＣＫ１タンパク質またはＮＡＣＫ２タンパク質、その構成ポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、Ｆ（ａｂ’）_２， Ｆａｂ’ 及びＦａｂ といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原又はエピトープ （ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ）， トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用したり、ＤＮＡ 組換え技術を用いて調製される抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含していてよい。特に好ましい本発明の抗体は、配列番号：２や配列番号：４の１〜３６５番目の領域から選択されたポリペプチドを特異的に識別できるものが挙げられる。
【００６８】
抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られているというその抗体の性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定基（エピトープ） に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリクローナル）抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリン類の夾雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来やイムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せしめたりして得ることができる（例えば、米国特許第４８１６５６７ 号； Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．７９−９７， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７ など） 。
【００６９】
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例には、ハイブリドーマ法 （Ｇ． Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｃ． Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ｐｐ．４９５−４９７ （１９７５））； ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法 （Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， ４， ｐｐ．７２−７９ （１９８３）； Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３， ｐｐ．３００１ （１９８４）； Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ．５１−６３， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）；トリオーマ法； ＥＢＶ−ハイブリドーマ法 （Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ｐｐ．７７−９６ （１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８ 号 （単鎖抗体の産生のための技術） が挙げられる他、抗体に関して以下の文献が挙げられる： Ｓ． Ｂｉｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ， ９， ｐｐ．１０１−１０８ （１９９０）； Ｒ．Ｅ． Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２， ｐｐ．４２３−４２６ （１９８８）； Ｍ．Ａ． Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２， ｐｐ．３７９１−３８０６ （１９８４）； Ｊ． Ｂｕｋｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， ６， ｐｐ．２１９−２２８ （１９８７）； Ｍ． ＤＡＩＮＯ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６６， ｐｐ．２２３−２２９ （１９８７）； Ｊ．Ｓ． Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５， ｐｐ．５８７９−５８８３ （１９８８）； Ｐ．Ｔ． Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１， ｐｐ．５２２−５２５ （１９８６）； Ｊ．Ｊ． Ｌａｎｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． １２１ （Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ： Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８６）； Ｓ． Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１， ｐｐ．６８５１−６８５５ （１９８４）； Ｖ．Ｔ． Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ４， ｐｐ．２１４−２２１ （１９８６）； Ｌ． Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２， ｐｐ．３２３−３２７ （１９８８）； Ａ． Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３， ｐｐ．６７３６−６７４０ （１９８６）； Ｃ． Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１４， ｐｐ．４４６−４４９ （１９８５）； Ｎａｔｕｒｅ， ３１４， ｐｐ．４５２−４５４ （１９８５） あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる） 。本発明の抗体は、当該遺伝子発現物の解析、検知などに利用できる他、様々な利用が可能である。
【００７０】
本明細書中、「転写産物」とは、インビトロ、インビボ、細胞内、細胞外を含めて、遺伝子、ヌクレオチド配列などの転写の結果生成する生産物を包含し、例えばｍＲＮＡなどのＲＮＡ などが挙げられる。
本発明の技術を使用して、当該転写産物をはじめ、当該遺伝子発現物を測定（定性的測定及び定量的測定を含む）することにより、植物の有糸分裂の程度を評価して、植物の生育状態、活性力を判断する材料としたり、植物細胞の増殖性の評価、例えばカルスの増殖力を判定したり、植物が定常状態にあるのか、生育的に活性化しつつあるのかの判定、さらには植物細胞の培養条件などの評価などを行うこともできる。
【００７１】
【実施例】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
なお、ＤＮＡ の切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、ハイブリダイゼーション等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書（例えば「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ） 」）に基本的に従った。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【００７２】
実施例１
酵母を用いたＮＡＣＫ１、ＮＡＣＫ２ 遺伝子のクローニング
各遺伝子のクローニングには出芽酵母の性フェロモンのシグナル伝達経路であるＳｔｅ１１（ＭＡＰＫＫＫ） 、Ｓｔｅ７（ＭＡＰＫＫ） 、ＦＵＳ３／ＫＳＳ１（ＭＡＰＫ） の改変株を用いた。
出芽酵母のＳｔｅ１１（ＭＡＰＫＫＫ） 遺伝子破壊株にＦＵＳ１プロモーターで発現するＨＩＳ３レポーター遺伝子が染色体に挿入されたＳＹ１９８４株 （ＭＡＴ α ｌｅｕ２ ｕｒａ３ ｔｒｐ１ ｈｉｓ３Δｕｒａ３ ｃａｎ１ ＦＵＳ１：：ＨＩＳ３ ｓｔｅ１１Δ：：ｕｒａ３） （Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．， ６：１２９３（１９９２） ）は、ＦＵＳ３のＭＡＰＫ活性をヒスチジン添加、無添加培地における生育でアッセイできる。このＳＹ１９８４株のｔｒｐ１遺伝子座にＣＹＣ プロモーターで発現できるショウジョウバエのＭＡＰＫＫＫである Ｄｓｏｒ１^ｓｕ１ を挿入して１１Ｓｕ１ 株 （Ｉｒｉｅら（１９９４）Ｓｉｅｎｃｅ ２６５：１７１６）が作出された。
１１Ｓｕ１ 株の染色体上、ｌｅｕ２遺伝子座にＧＡＬ１プロモーターで発現できるＮＰＫ１ ｃＤＮＡ を挿入し、１１Ｓｕ１Ｎ株が作出された。１１ＳｕＮ 株はガラクトースの添加により、ＮＰＫ１が発現できる。１１Ｓｕ１Ｎ株においてＮＰＫ１はＳｔｅ１１ の機能を相補可能であるが、全長ＮＰＫ１は単独ではキナーゼ不活性型であるため、ガラクトース添加、ヒスチジン無添加培地では生育出来ない。
【００７３】
１１Ｓｕ１Ｎ株においてＮＰＫ１のキナーゼ活性を活性化するタバコの因子をクローニングするために、増殖期にあるタバコ培養細胞ＢＹ−２のｃＤＮＡライブラリーを作成し、１１ＳｕＮ 株を形質転換した。
ｃＤＮＡライブラリーは植え継ぎ後３日目のＢＹ−２培養細胞より常法によりｍＲＮＡを精製し、逆転写反応を行って ｃＤＮＡ を合成し、ｐＫＴ１１ プラスミドのＥｃｏＲＩ とＳａｌＩサイトにＢＹ−２ ｃＤＮＡ を挿入して作成した。
ｃＤＮＡライブラリーを出芽酵母１１Ｓｕ１Ｎ株に形質転換し、独立した３ ｘ １０^５ 個の形質転換酵母を得た。
形質転換酵母をヒスチジン無添加、ガラクトース添加のＳＧ（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇａｌａｃｔｏｓｅ） 培地（ウラシル、トリプトファン、ロイシン無添加） で生育させると、この培地上で生育するクローンが得られた。
このクローンよりプラスミドを回収し、ｃＤＮＡの塩基配列を決定することによりＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡ、ＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡの塩基が明らかになった。
これらのプラスミドよりＳａｌＩとＮｏｔＩによって ｃＤＮＡ を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ストラタジーン） のＳａｌＩ、ＮｏｔＩサイトに挿入し、ｐ０５１ＳＫ （ＮＡＣＫ１）、ｐＮＡＫ２ＳＫ （ＮＡＣＫ２） を生成した。酵母で発現しているＮＰＫ１を活性化する因子としてクローニングされたＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡ配列を配列番号：１に、またＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡ配列を配列番号：３に示した。
【００７４】
実施例２
ＮＡＣＫ１ のアミノ酸配列を配列番号：２に、またＮＡＣＫ２ のアミノ酸配列を配列番号：４に示した
【００７５】
実施例３
データベースの相同性探索により見出されたシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の配列を基に、配列番号：９、配列番号：１０ で示した合成オリゴＤＮＡ をプライマーに用い、シロイヌナズナのｃＤＮＡよりＰＣＲ によって単離したＡｔＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：５で示した。
【００７６】
実施例４
配列番号：５で示したＡｔＮＡＣＫ１ の ｃＤＮＡ にコードされるＡｔＮＡＣＫ１ タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示した。
【００７７】
実施例５
データベースの相同性探索により、配列番号：２で示したＮＡＣＫ１ タンパク質と高い類似性を示すイネのタンパク質のアミノ酸配列を見出した。このタンパク質をＯｓＮＡＣＫとし、アミノ酸配列を配列番号：７に示した。
【００７８】
実施例６
配列番号：７で示したＯｓＮＡＣＫタンパク質のアミノ酸配列をコードした領域を含むイネゲノムＤＮＡ の塩基配列を配列番号：８に示した。
【００７９】
実施例７
配列番号：８を基に設計した合成オリゴＤＮＡ をプライマーに用い、イネのｃＤＮＡを鋳型に用いてＰＣＲ を行うことでＯｓＮＡＣｋ ｃＤＮＡ を単離することが出来る。
【００８０】
実施例８
ＮＡＣＫ関連タンパク質アミノ酸配列の類似性
ＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ１、ＯｓＮＡＣＫにつき、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を図１〜３に示した。同一アミノ酸の割合、類似アミノ酸の割合を表１〜３に示した。解析にはＰａｉｒｗｉｓｅ ＢｌａｓｔのＢｌａｓｔ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用した。使用時の主なパラメーター等の設定はＭａｔｒｉｘがＢＬＯＳＵＭ６２、ｇａｐ ｏｐｅｎが１１、ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎが１、ｄｒｏｐｏｆｆが５０、ｅｘｐｅｃｔが１０．０であり、その他も初期設定の状態で使用した。二つのアミノ酸配列の類似性を示す出力結果で、ポジティブとは同一なアミノ酸に加え、類似なアミノ酸を加えた割合を示す。 ＮＡＣＫ１とＡｔＮＡＣＫ１は７６％のアミノ酸が同一であり、８６％のアミノ酸がポジティブであった。また、ＮＡＣＫ１とＯｓＮＡＣＫでは６５％のアミノ酸が同一であり、７９％のアミノ酸がポジティブであった。キネシン様タンパク質のモータードメインはＮＡＣＫ１タンパク質のアミノ酸配列において２７−３６４番目が相当し、ＡｔＮＡＣＫ１タンパク質のアミノ酸では２８−３６４番目が、ＯｓＮＡＣＫタンパク質のアミノ酸配列では３１−３６２番目が相当する。この領域ではＮＡＣＫ１とＡｔＮＡＣＫ１では８７％のアミノ酸が同一であり、９３％のアミノ酸がポジティブであった。またＮＡＣＫ１とＯｓＮＡＣＫでは７６％のアミノ酸が同一であり、８６％のアミノ酸がポジティブであった。ＮＰＫ１タンパク質とＮＡＣＫ１タンパク質の結合に必須な領域であるＮＡＣＫ１タンパク質のアミノ酸配列は６８６−７５９番目であり、ＡｔＮＡＣＫ１タンパク質のアミノ酸では６９９−７７３番目が、ＯｓＮＡＣＫタンパク質のアミノ酸配列では６７５−７４９番目が相当する。この領域においてはＮＡＣＫ１とＡｔＮＡＣＫ１では８２％が同一であり、９５％がポジティブであった。またＮＡＣＫ１とＯｓＮＡＣＫでは８０％が同一であり、９０％がポジティブであった。
【００８１】
【表１】

【００８２】
【表２】

【００８３】
【表３】

【００８４】
実施例９
ＮＡＣＫ関連タンパク質の構造的類似性
コイルドコイル構造を予測するプログラム（ＣＯＩＬＳ ｐｒｏｇｒａｍ， ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ ｌｕｐａｓ．ｈｔｍｌ， Ｌｕｐａｓ ｅｔ ａｌ． １９９１） によってＮＡＣＫ１ タンパク質、ＡｔＮＡＣＫ１ タンパク質、ＯｓＮＡＣＫタンパク質のアミノ酸配列からコイルドコイル構造を予測した結果を図４に示す。ＮＡＣＫ１ タンパク質がＮＰＫ１タンパク質と結合するために必須な領域と類似する領域でいずれのタンパク質においてもコイルドコイル構造を形成することが予測された。
実施例８、実施例９で示されたモータードメインを構成するアミノ酸配列の高い類似性、ＮＰＫ１タンパク質と結合する領域での高い類似性、ＮＰＫ１タンパク質と結合する領域で形成されるコイルドコイル構造からＡｔＮＡＣＫ１ タンパク質、ＯｓＮＡＣＫタンパク質ともにＮＡＣＫ１ タンパク質と同様の機能を示すことが示された。
【００８５】
実施例１０
ＮＡＣＫ関連タンパク質の細胞内局在の確認
実施例８、実施例９によって示されるアミノ酸配列がＮＡＣＫ１ タンパク質と機能が同等であることは、次の実験によって示される。一つは目的タンパク質の Ｃ末端側にＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ＧＦＰ） を機能的に融合したタンパク質を作成し、このタンパク質が３５Ｓ プロモーターの制御下で発現できるプラスミド、例えばｐＢＩ１２１のＧＵＳ 遺伝子領域と置換することによってアグロバクテリウム法でタバコ培養細胞ＢＹ−２に遺伝子導入可能なバイナリーベクターを構築する。このバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４ 株（Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎ） とＢＹ−２細胞を２５℃暗黒下で共培養し、培養２日後にＢＹ−２細胞をＬＳＤ 培地で洗浄する。洗浄したＢＹ−２細胞を蛍光顕微鏡を用いて観察する。隔膜形成体にＧＦＰ タンパク質が発する蛍光が局在しているＢＹ−２細胞が観察されることと、以下の実施例１１の結果を併せて目的タンパク質がＮＡＣＫ１ タンパク質と同様の機能を示すことを証明可能である。
【００８６】
実施例１１
ＮＡＣＫ関連タンパク質の機能確認
実施例１０に加え、次に、目的タンパク質においてモータードメインであると想定されるアミノ酸配列より Ｎ末端側の領域、実施例２であれば１−３６０ 番目のアミノ酸配列を、実施例４であれば１−３５９ 番目のアミノ酸配列を欠失したタンパク質をコードしているＤＮＡ 配列をｐＴＡ７００１ バイナリーベクターに挿入する。このバイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４ 株（Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎ） を用いてタバコ培養細胞ＢＹ−２を形質転換する。得られる形質転換ＢＹ−２細胞を０．１ μＭ デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） 添加のＬＳＤ 液体培地 （Ｎａｇａｔａら（１９８１） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １８４：１６１）で震盪培養を行い、培養３日目に培養後の細胞は３．７％フォルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５） を添加して１時間静置して固定する。その後、０．００５％カルコフロール（ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）、１ μｇ／ｍｌプロピディウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ 、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ） を用いて細胞壁および核を染色する。細胞は蛍光顕微鏡を用いて観察する。
実施例１０において隔膜形成体にＧＦＰ タンパク質が発する蛍光が局在して、かつ実施例１１において多核化したＢＹ−２細胞が観察されることで、目的タンパク質がＮＡＣＫ１ タンパク質と同様の機能を示すことが証明可能である。
【００８７】
実施例１２
ＮＡＣＫ１ およびＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡのクローニング
ＮＡＣＫ１ およびＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡをクローニングするためには、実験書や、市販の各種試薬の説明書に基づいて行う。培養３日目のＢＹ−２細胞より全ＲＮＡ を抽出し、ｍＲＮＡを精製する。このｍＲＮＡよりスーパースクリプトラムダシステム（インビトロジェン社）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作成し、プラークハイブダイゼーションを行うことによってＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡを単離することができる。ハイブリダイゼーションに用いるプローブは配列番号：１１、配列番号：１２で示した合成オリゴＤＮＡ をプライマーに用いて前述のｍＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行い、作成することが可能である。得られたクローンをＳａｌＩとＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ストラタジーン） のＳａｌＩ、ＮｏｔＩの切断で生じた部位に挿入することによってｐ０５１ＳＫ（ＮＡＣＫ１） 、ｐＮＡＫＳＫ（ＮＡＣＫ２） を生成することができる。
【００８８】
実施例１３
ｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ の構築
配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、で示された合成オリゴＤＮＡ 配列を混合し、９４℃に過熱後、徐冷することによって会合したＤＮＡ 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ− のＥｃｏＲＩ とＢａｍＨＩ の切断によって生じた部位に挿入することによってｐＳＫＨＡ２が生成される。
配列番号：１９と配列番号：１８で示された合成オリゴＤＮＡ をプライマーとして用い、配列番号：１で示されたｃＤＮＡの塩基配列の１１９７番目から３２０６番目までをＰＣＲ 反応を用いて増幅した。増幅されたＤＮＡ 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ− のＳａｌＩとＮｏｔＩ部位に挿入することによりｐＮＡＣＫ１：ＳＴＳＫが生成される。
ｐＮＡＣＫ１：ＳＴＳＫのＢａｍＨＩ とＮｏｔＩで切断し、配列番号：１で示された配列を含む断片をｐＳＫＨＡ２のＢａｍＨＩ とＮｏｔＩサイトに挿入することにより ｐＳＫＨＡ２ＮＡＣＫ１：ＳＴ が生成される。このプラスミドにはＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ をコードするＤＮＡ が含まれる。
ｐＳＫＨＡ２ＮＡＣＫ１：ＳＴをＮｏｔＩで切断し、ＮｏｔＩ生成端をＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端化し、さらにＳａｌＩで切断した。得られた配列４で示された配列を含む断片をｐＴＡ７００１ のＳｐｅＩで切断し、さらにＳｐｅＩ生成端をＤＮＡ ポリメラーゼのクレノウ断片により平滑末端化した後にＸｈｏＩで切断したサイトに挿入し、ｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ が生成される。したがってｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ は、それを導入した植物に対するデキサメタゾンの処理によって、配列番号：１７で示したタンデムのヘマグルチニンポリペプチドと配列番号：２で示したＮＡＣＫ１ タンパク質の３６１ 番目から９５９ 番目のアミノ酸が機能的に融合した融合タンパク質であるＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ を、発現誘導可能な植物形質転換用のバイナリーベクターである。ｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 構築過程を図５に示した。
【００８９】
実施例１４
ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴによるＢＹ−２の細胞質分裂阻害
細胞レベルでＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ の機能を詳細に決定するために、ｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ またはベクターコントロールとしてのｐＴＡ７００１ を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４ 株（Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎ） を介してタバコ培養細胞ＢＹ−２の形質転換を行った。新しいＬＳＤ 液体培地に植え継いで３日目のタバコ培養細胞ＢＹ−２とｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ またはベクターコントロールとしてのｐＴＡ７００１ を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４ 株をＹＥＢ 培地で二日間培養した培養物を混合し、２５℃、暗黒下で共培養を行った。二日後にタバコ培養細胞ＢＹ−２をＬＳＤ 液体培地を用いて洗浄した後に、ハイグロマイシンＢ ５０μｇ／ｍｌとカルベニシリン３００ μｇ／ｍＬを含有するＬＳＤ−０．２％ゲルライト培地に細胞を播き２５℃暗黒下で培養を行った。２−３ 週間後に得られたハイグロマイシンＢ 耐性カルスを形質転換体としてＬＳＤ 液体培地に移し懸濁培養で形質転換細胞を維持した。
増殖が定常期にあるＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換培養細胞ＢＹ−２形質転換細胞をデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）０．１μＭ およびハイグロマイシンＢ ５０μｇ／ｍｌを添加したＬＳＤ 液体培地または、ハイグロマイシンＢ ５０μｇ／ｍｌを添加したＬＳＤ 液体培地に植え継ぎ、培養開始後２−４ 日に表現型の観察を行った。培養後の細胞は３．７％フォルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．５） 、を添加して１時間静置して固定した。その後、０．００５％カルコフロール（ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）、１ μｇ／ｍｌプロピディウムアイオダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、１０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ 、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含むｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ） を用いて細胞壁および核を染色した。細胞は蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【００９０】
デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） を添加し、形質転換ＢＹ−２細胞でＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ の発現を誘導した場合のみに一つの細胞に複数個の核を有する多核化細胞が多数認められた。多核化細胞の出現頻度は培養日数が長くなるほど高くなった。また、多核化した細胞の中には不完全な細胞壁が含まれていた。すなわちＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換ＢＹ−２細胞においては細胞周期の進行においてＧ１期、 Ｓ期、Ｇ２期までの進行は正常であり、 Ｍ期において隔膜形成体によって形成される細胞板の正常な形成のみが制御されていた。図６に多核化したＢＹ−２細胞と正常なＢＹ−２細胞の比較の写真を示した。−ＤＥＸとはＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換ＢＹ−２細胞をデキサメタゾン無添加で培養した場合であり、＋ＤＥＸはＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換ＢＹ−２細胞をデキサメタゾンを添加して培養し、多核化した細胞を示した。Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４とは一つの細胞内に認められた複数の核を示し、矢印は不完全な細胞板を示した。
多核化した細胞の大きさを計測した結果を図７に示す。デキサメタゾン添加培地で培養したＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 細胞で多核化した細胞を１３個（ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ） 、野生型の表現型を示した細胞を１２個（Ｗｔ）、それぞれ細胞の長さ、幅を計測した。多核化した細胞では細胞の長さにおいて約４倍有意に長くなっていた。
【００９１】
実施例１５
ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ によるタバコ植物体の細胞質分裂阻害
トランスジェニックのタバコにおけるＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ の機能を決定するために、ｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ またはベクターコントロールとしてのｐＴＡ７００１ を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４ 株（Ａｇｏｒｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＬＢＡ４４０４ ｓｔｒａｉｎ） を介してリーフディスク法によりニコチアナ タバカム 品種ＳＲ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｖｅｒ． ＳＲ１） の形質転換を行った。
得られたハイグロマイシンＢ 耐性個体より得られた種子より発生したＴ２植物を用いて表現型の観察を行った。デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） を０．１ μＭ とハイグロマイシンＢ ５０μｇ／ｍＬを含有するＭＳ−０．２％ ゲルライト培地または、ハイグロマイシンＢ ５０μｇ／ｍＬを含有するＭＳ−０．２％ ゲルライト培地にエタノールと次亜塩素酸によって滅菌した種子を播種し、２５℃１６時間照明、８時間暗黒の条件下で植物の生育を行った。播種後１１日目の幼苗を実体顕微鏡で観察した後に８０％ エタノール、２０％ 酢酸を用いて固定と脱色を行い、その後１％オルセインを含有する乳酸、プロピオン酸の等量混合物で核染色を行った。さらに８０％ エタノール、２０％ 酢酸を用いて洗浄を行い、子葉を微分干渉顕微鏡を用いて観察した。ｐＴＡ７００１ ベクターを用いて形質転換した植物においてはデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） の植物への処理に依存してＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ の遺伝子発現が誘導される。
デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） 添加ＭＳ培地に播種したベクター形質転換タバコ、デキサメタゾンを添加していないＭＳ培地に播種したベクター形質転換タバコ、ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換タバコでは全て正常に生育し、形態的、組織的、細胞的な表現型は認められなかった。しかし、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ） 添加培地に播種したＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換タバコにおいては子葉の小型化が認められ、細胞を観察した結果では一つの細胞に複数個の核を有する多核化細胞が多数認められた。多核化細胞は子葉においては葉肉細胞、孔辺細胞、表皮細胞で認められた。ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ 形質転換タバコは細胞周期の進行においてＧ１期、 Ｓ期、Ｇ２期までの進行は正常であり、 Ｍ期において隔膜形成体によって形成される細胞板の正常な形成のみが制御されていた。形質転換植物の写真を図８に示した。
【００９２】
実施例１６
ＡｔＮＡＣＫ２ プロモーター
配列番号：２０に示す塩基配列はシロイヌナズナのゲノムＤＮＡ 配列であり、ＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子のプロモーター領域が含まれている。ＡｔＮＡＣＫ２ の構造遺伝子の翻訳開始コドンより、１７２０塩基上流付近には植物における転写終結をしめすポリアデニレーションの付加シグナルが多数見出され、この領域がＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子と隣接する遺伝子の終端である。
８４３ 塩基、７３４ 塩基、５５２ 塩基、５１３ 塩基、４４４ 塩基上流には細胞質分裂 Ｍ期に特異的な遺伝子発現をもたらすことで知られているＭＳＡ 配列が集合して認められることより、この近傍の配列がＡｔＮＡＣＫ２ の転写制御に重要であることが明らかになった。
ＭＳＡ 配列の近傍には花粉特異的な遺伝子発現を誘導するＰＰＬＬＥＮ１ＬＥＬＡ５２配列が９反復、また、ＰＰＬＬＥＮ１ＬＥＬＡ５２配列と協力的に機能するＴＣＣＡＣＣＡＴ配列と非常に類似したＴＣＣＡＣＣＡ が認められることを見出した。これらより、ＡｔＮＡＣＫ２ プロモーターは花粉形成に係わる器官において強い発現を示し、かつ Ｍ期に遺伝子の転写制御を行うことが明らかになった。これら調節配列の存在場所は図９に示した。
【００９３】
実施例１７
ＡｔＮＡＣＫ２ プロモーターの遺伝子発現パターン
ＡｔＮＡＣＫ２ のプロモーター領域として配列番号：２０で示した塩基配列または、配列番号：２０で示した２８０１−４４１８ 番目の塩基配列または、３４０１−４４１８ 番目の塩基配列をｐＢＩ−１２１ （クロンテック）の３５Ｓ プロモーターと置換する。
これらのプラスミドは実施例１５で示した方法により、よりニコチアナ タバカム 品種ＳＲ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ． ＳＲ１）を形質転換できる。またはシロイヌナズナであればエコタイプ コロンビア種をこれらのプラスミドを保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を介しＦｌｏｒａｌ Ｄｉｐ法（Ｃｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， １６：７３５（１９９８）） によって形質転換することが可能である。
次いで、この形質転換植物においては花粉形成に係わる器官においてＧＵＳ 酵素活性が発現し、Ｘ−Ｇｕｌｃ （５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｒｉｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を基質とした染色を行うことで雄性生殖系の器官または細胞において強い染色が観察される。
【００９４】
実施例１８
ＡｔＮＡＣＫ２ プロモーター：ＮＡＣＫ２：ＳＴ形質転換植物の稔性低下
ＮＡＣＫ２ タンパク質の３６０−９５５番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと実施例１７により雄性生殖系の器官または細胞において最も強く、且つ特異性が認められたＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子のプロモーター領域と、ＮＡＣＫ２ タンパク質の３６０−９５５番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ を機能的に融合し、ｐＢＩ−１２１（クロンテック）の３５Ｓ プロモーターとＧＵＳ 遺伝子とを置換する。生成されたプラスミドでもって実施例１７の方法により、タバコ、シロイヌナズナを形質転換することができる。この形質転換植物においては雄性生殖系の器官または細胞において細胞質分裂を抑制し、稔性が低下した植物が作出される。
【００９５】
実施例１９
ＡＶＰ１プロモーター：ＮＡＣＫ２：ＳＴ形質転換植物の稔性低下
ＮＡＣＫ２タンパク質の３６０−９５５番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとシロイヌナズナＡＶＰ１遺伝子の転写開始点近傍より上流の約４００ 塩基のＤＮＡ 配列を機能的に融合し、ｐＢＩ−１２１（クロンテック）の３５Ｓ プロモーターとＧＵＳ 遺伝子とを置換する。生成されたプラスミドでもって実施例１７の方法により、タバコ、シロイヌナズナを形質転換することができる。この形質転換植物においては雄性生殖系の器官または細胞において細胞質分裂を抑制し、稔性が低下した植物が作出される。
【００９６】
実施例２０
ＴＡ２９プロモーター：ＮＡＣＫ２ ：ＳＴ形質転換植物の稔性低下
ＮＡＣＫ２ タンパク質の３６０−９５５番目のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ とタバコＴＡ２９遺伝子の転写開始点近傍の約１５００塩基のＤＮＡ 配列を機能的に融合し、ｐＢＩ−１２１ （クロンテック）の３５Ｓ プロモーターとＧＵＳ 遺伝子とを置換する。生成されたプラスミドでもって実施例１７の方法により、タバコ、シロイヌナズナを形質転換することができる。この形質転換植物においては雄性生殖系の器官または細胞において細胞質分裂を抑制し、稔性が低下した植物が作出される。
【００９７】
実施例２１
イネのＮＡＣＫ遺伝子ｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
イネ（品種 日本晴）種子より籾を取り除きアンチホルミンを用いて滅菌した後に、Ｎ６ＣＩ培地（Ｎ６無機塩、Ｎ６ビタミン（Ｃｈｕら（１９７５）， Ｓｉｅｎｔｉａ Ｓｉｎｉｃａ １８： ６５９） にｓｕｃｒｏｓｅ，３０ｇ／ｌ、２，４−Ｄ ２ｍｇ／ｌ、ｇｅｌｒｉｔｅ ２ｇ／ｌを添加。ｐＨ５．８）上で胚盤に由来するカルスを誘導した。
このカルス１３０ｍｇよりＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて総ＲＮＡを抽出した。抽出した総ＲＮＡの４．５μｇを鋳型にしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） を用いてｃＤＮＡを合成し、合成された５０μｌのうち２μｌを使用してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応に用いたプライマーはプライマー１（５’− ＡＴＧＧＧＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣ −３’； 配列番号：２３）及びプライマー２（５’− ＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＴＧＡＴＣ −３’；配列番号：２４）である。反応はＥｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ社）を用い、Ｅｘ ｔａｑに付属する反応バッファー、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、プライマー１およびプライマー２を各１μＭ用いて、５０μｌの液量で行った。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて９４℃を３０秒、６４℃を３０秒、７２℃を１５分のステップを４５サイクル繰り返した。反応終了後、アガロースゲルを用いて解析したところ、約３ｋｂｐの単一のＤＮＡが増幅していることが確認されたため、このＤＮＡ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＥｃｏＲＶ切断部位に挿入しクローニングした。得られたプラスミドｐＢＳ−ＯｓＮＡＣＫの塩基配列を決定し、その塩基配列を配列番号：２１ に、このｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を配列番号：２２ に示した。
【００９８】
実施例２２
ＮＡＣＫ２ＳＴ を発現する形質転換植物における花粉形成の抑制
（１）形質転換のためのバイナリーベクターの生成
ｐＢＩ１２１ （クロンテック）を鋳型としてプライマーＲＢ−５（５’− ｇｃｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇａａｃｃｃｔｇ −３’；配列番号：２５）とプライマーＲＢ−３（５’− ａｇａｔｔｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃ −３’； 配列番号：２６）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＲｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＲＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＫｐｎＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲを生成した。ｐＢＩ１２１ （クロンテック）を鋳型として、プライマーＬＢ−５（５’− ｃａｇｔａｃａｔｔａａａａａｃｇｔｃｃｇｃａａｔｇ −３’； 配列番号：２７）とプライマーＬＢ−３（５’− ｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｇａｔｃａｇｃｃｇ −３’；配列番号：２８）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＬｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＬＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＲをＳａｃＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲＬを生成した。ｐＲＬをＸｈｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：ＨＰＴ：Ｎｏｓターミネーターから構成されるハイグロマイシン耐性遺伝子を含む平滑末端のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲＨＬを生成した。ｐＲＨＬをＢｇｌＩＩで切断し、切り出されるＲＢ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＬＢを含むＤＮＡ断片をｐＢＩ１２１ （クロンテック）をＢｇｌＩＩで切断して生成される断片と置換しｐＢＩ−ＲＨＬを生成した。ｐＢＩ２２１ （クロンテック）由来のＮｏｓターミネーターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）をＸｂａＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて平滑化したサイトに挿入し、ｐＴｎｏｓを生成した。
ＮＡＣＫ２の全長ｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型にして、プライマーＮＡＣＫ２−１０７８Ｆ（５’− ｔｃｃｃｃｇｃｇｇａｃｔｇｃｇｃａａｇｔａａａｃａｔｇｇ −３’； 配列番号：２９）、プライマーＮＡＣＫ２−Ｒ（５’− ｃｔａｃａａｇｔｇｔａｇｔａａｇｔｔｔｇａ −３’； 配列番号：３０） を用いてＰＣＲ反応を行い、モーター領域を欠失したＮＡＣＫ２−ＳＴを増幅した。このＤＮＡ断片はＮＡＣＫ２の３６０〜９５５番目のアミノ酸をコードする。このＤＮＡ断片をＳａｃＩＩで切断し、ｐＴｎｏｓをＮｏｔＩ切断、Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑化、ＳａｃＩＩ切断したサイトに挿入し、ｐＮＡＣＫ２ＳＴ−Ｔを生成した。
ｐＮＡＣＫ２ＳＴ−ＴをＳａｃＩＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑化、ＳｐｅＩでの切断によって切り出されるＮＡＣＫ２ＳＴとＮｏｓターミネーターを含むＤＮＡ断片をｐＢＩ−ＲＨＬをＢａｍＨＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑化、ＳｐｅＩで切断したサイトに挿入し、ｐＢＩＨｍ−ＮＡＣＫ２ＳＴを生成した。ｐＢＩＨｍ−ＮＡＣＫ２ＳＴをＳｍａＩで切断したサイトにインビトロジェン社より市販されているＲｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ ＡのＤＮＡ断片を挿入し、ｐＤＢＩＮＡＣＫ２ＳＴを生成した。ｐＤＢＩＮＡＣＫ２ＳＴはインビトロジェン社のＧａｔｅｗａｙシステムを利用してＮＡＣＫ２ＳＴ発現用プロモーターを挿入できるアグロバクテリウム法による植物形質転換用プラスミドである。
【００９９】
ＮＡＣＫ２ＳＴ発現用プロモーターとしては葯で発現が高いと報告されているシロイヌナズナＡＶＰ１遺伝子のプロモーター領域、タバコＴＡ２９遺伝子のプロモーター領域、またシロイヌナズナＡｔＮＡＣＫ２遺伝子のプロモーター領域を用いた。
ＡＶＰ１プロモーターはシロイヌナズナエコタイプＣｏｌ−０より常法によりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＡＶＰ１＋４Ａ（５’− ｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｔｃｃｔｃｃｇｔａｔａａｇａｇ −３’；配列番号：３１）、プライマーＡＶＰ１−２９８ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃａａａｔｔｃｇｇａｃａａａｔａｇａｇｃｇｔａｇｔｃａａｃ −３’； 配列番号：３２）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲＡＶＰ１を生成した。
ＴＡ２９プロモーターはタバコ品種ＳＲ１より常法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＴＡ２９＋５２Ａ（５’− ｃｔａａｇｃｔｔａｇｃａａａａｔｃａｔａａａａｇ −３’；配列番号：３３）、プライマーＴＡ２９−１４７７ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃｇｇｃｔａｔａｔｔａａｔｔｇｔｔｔａｃｔｔｔｔｔｃｔａａｃ −３’； 配列番号：３４）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲＴＡ２９を生成した。
ＡｔＮＡＣＫ２プロモーターはシロイヌナズナエコタイプＣｏｌ−０より常法によりゲノムＤＮＡを抽出し、ＡｔＮＡＣＫ２開始コドンより１６１８塩基上流までをプライマーＮＡＣＫ２＋４（５’− ａｃａｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃａａａａｔｃｇａａａｃｃ −３’；配列番号：３５）、プライマーＮＡＣＫ２−１６１８ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃｔａａａｃａａａｔｔｔｃａａａａｔａｃａｔｔａｇｔａａｔａｔａａｃ −３’；配列番号：３６）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ１．６を生成した。
ＡｔＮＡＣＫ２開始コドンより１０１８塩基上流までをプライマーＮＡＣＫ２＋４（５’− ａｃａｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃａａａａｔｃｇａａａｃｃ −３’；配列番号：３５）、プライマーＮＡＣＫ２−１０１８ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃｔｔｔａｇｔａｔｔｔａｔａｃａｃｇａｇａｃｇｔｇ −３’； 配列番号：３７）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ１．０を生成した。ＡｔＮＡＣＫ２開始コドンより５７５塩基上流までをプライマーＮＡＣＫ２＋４（５’− ａｃａｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃａａａａｔｃｇａａａｃｃ −３’；配列番号：３５）、プライマーＮＡＣＫ２−５７５ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃｃｔｃｇｔｔａａｇａａｃｃｃｔｔｇｃａｔｃ −３’； 配列番号：３８）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ０．６を生成した。
ＡｔＮＡＣＫ２開始コドンより４１９塩基上流までをプライマーＮＡＣＫ２＋４（５’− ａｃａｔｃｔｔｃｔａｃａｃａｃａａａａｔｃｇａａａｃｃ −３’；配列番号：３５）、プライマーＮＡＣＫ２−４１９ｓ（５’− ｃｇｇｇａｔｃｃｇａｔｔｔｔｇｃｃｔｃｔｇｃｇａａａａｃ −３’；配列番号：３９）を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅されたＤＮＡ断片をインビトロジェン社のｐＥＮＴＲ２ＢをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ０．４を生成した。これまでのプラスミド構築時に行ったＰＣＲ反応はＴａｋａｒａ社のＰｙｒｏｂｅｓｔを用い酵素に添付された推奨条件で反応を行った。
【０１００】
これらのプロモーター領域を含むプラスミドをそれぞれｐＤＢＩＮＡＣＫ２ＳＴと混合し、インビトロジェン社のＬＲ ｃｌｏｎａｓｅに添付のプロトコルに従い反応を行い、プロモーター配列をＮＡＣＫ２ＳＴの上流に挿入し、
▲１▼ ＡＶＰ１ プロモーターによってＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＡＶＰ１−ＳＴ、
▲２▼ ＴＡ２９ プロモーターによってＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＴＡ２９−ＳＴ、
▲３▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（１６１８ｂｐ）でＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ１．６−ＳＴ、
▲４▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（１０１８ｂｐ）でＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ１．０−ＳＴ、
▲５▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（５７５ｂｐ）でＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ０．６−ＳＴ、
▲６▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（４１９ｂｐ）でＮＡＣＫ２ＳＴが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ０．４−ＳＴを生成した。
【０１０１】
（２）シロイヌナズナの形質転換
前記（１）で生成した▲１▼〜▲６▼のバイナリーベクターを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてＦｌｏｒａｌ ｄｉｐ法によりシロイヌナズナ エコタイプＣｏｌ−０を形質転換した。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られた種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、ハイグロマイシン２５μｇ／ｍｌ、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ倍地上に播種した。ハイグロマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択し、これらを土に植え替え、２０℃ １６時間明期、８時間暗黒の条件で栽培した。
【０１０２】
（３）形質転換植物の稔性低下
前記（１）の▲１▼、▲２▼、▲３▼、▲４▼、▲５▼又は▲６▼のバイナリーベクターを使用して、前記（２）で選ばれた形質転換植物の鞘中に形成される種子を観察したところ、複数のラインにおいて明らかに、野生型より種子の数が減少していた。
【０１０３】
実施例２３
キネシン様モータードメインを欠失させたＮＡＣＫによる細胞質分裂阻害
（１）形質転換のためのベクターの生成
ｐＢＩ１２１（クロンテック）を鋳型としてプライマーＲＢ−５（５’− ｇｃｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇａａｃｃｃｔｇ −３’；配列番号：２５）とプライマーＲＢ−３（５’− ａｇａｔｔｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃ −３’； 配列番号：２６）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＲｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＲＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＫｐｎＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲを生成した。ｐＢＩ１２１ （クロンテック）を鋳型として、プライマーＬＢ−５（５’− ｃａｇｔａｃａｔｔａａａａａｃｇｔｃｃｇｃａａｔｇ −３’； 配列番号：２７）とプライマーＬＢ−３（５’− ｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｇａｔｃａｇｃｃｇ −３’；配列番号：２８）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＬｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＬＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＲをＳａｃＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲＬを生成した。ｐＲＬをＸｈｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて切断末端を平滑化したサイトにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：ＨＰＴ：Ｎｏｓターミネーターから構成されるハイグロマイシン耐性遺伝子を含む平滑末端のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲＨＬを生成した。ｐＲＨＬをＢｇｌＩＩで切断し、切り出されるＲＢ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＬＢを含むＤＮＡ断片をｐＢＩ１２１（クロンテック）をＢｇｌＩＩで切断して生成される断片と置換しｐＢＩ−ＲＨＬを生成した。ｐＵＣ１９（タカラ）をＳｍａＩで切断したサイトにインビトロジェン社より市販されているＲｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ ＡのＤＮＡ断片を挿入し、ｐＵＣ−ＲＦＡを生成した。ｐＢＩ−ＲＨＬをＢａｍＨＩとＳｐｅＩで切断したサイトにｐＵＣ−ＲＦＡをＢａｍＨＩとＳｐｅＩで切断して切り出されるＲｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ａを挿入し、ｐＤＥＳＴＢＩ−２を生成した。
インビトロジェン社より市販されているプラスミドｐＥＮＴＲ２ＢのＥｈｅＩサイトにｐＢＩ２２１（クロンテック）由来のＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターを、ＥｃｏＲＶサイトにｐＢＩ２２１（クロンテック）由来のＮｏｓターミネーターを挿入し、ｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１を生成した。
【０１０４】
ＯｓＮＡＣＫ ｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（スタラタジーン）挿入されたプラスミドｐＢＳ−ＯｓＮＡＣＫを鋳型としてプライマーＯｓＮＡＣＫ−１０７１Ｆ（５’− ｇｇｇｇｔａｃｃｔｇｃａａａａｇｔｔａａｔａｔｇｇｔｇｇｔａ −３’；配列番号：４０）とプライマーＴ３（５’− ａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇ −３’；配列番号：４１）を用いてＰＣＲ反応を行い、モータードメインを欠失したＯｓＮＡＣＫＳＴのＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片はＯｓＮＡＣＫの３５８〜９５４ 番目のアミノ酸をコードし、３６２〜９５４番目のアミノ酸配列からなるタンパク質を発現可能である。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断後、ｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１のＫｐｎＩとＮｏｔＩ切断によったサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ３５ＳＯｓＮＡＣＫＳＴを生成した。前記実施例１３に記載のｐＳＫＨＡ２ＮＡＣＫ１：ＳＴからＳａｌＩとＮｏｔＩによって切り出されるＨＡ２ＮＡＣＫ１：ＳＴを含むＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１のＳａｌＩとＮｏｔＩの切断によったサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴを生成した。
ｐＢＩ２２１（クロンテック）を鋳型にしてプライマー２２１−２５Ｆ（５’− ｇｇｇｇｔａｃｃａｇａｔｔａｇｃｃｔｔｔｔｃａａｔｔｔｃａｇ−３’；配列番号：４２）とプライマー２２１−８９９Ｒ（５’− ａｃａｔａａｇｇｇａｃｔｇａｃｃａｃｃｃ −３’；配列番号：４３）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域を増幅した。このＤＮＡ断片をＫｐｎＩで切断し、ｐＥＮＴＲ２Ｂ（インビトロジェン社製）をＫｐｎＩ、ＥｃｏＲＶで切断したサイトに挿入してｐＥＮＴＲ３５Ｓを生成した。
ｓＧＦＰを含むプラスミドｐＴＨ２（Ｃｈｉｕら，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９９６ Ｍａｒ １；６（３）：３２５−３０ ）よりＳａｌＩとＮｏｔＩによる切断でｓＧＦＰをコードするＤＮＡ断片を切り出し、ｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１をＳａｌＩとＮｏｔＩ切断により生じるサイトに挿入しｐＥＮＴＲＧＦＰを生成した。
ｐＤＥＳＴＢＩ−２とｐＥＮＴＲ３５ＳＯｓＮＡＣＫＳＴを混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩＯｓＮＡＣＫＳＴを生成した。ｐＤＥＳＴＢＩ−２とｐＥＮＴＲＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴを混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴを生成した。
前記実施例２２に記載のｐＤＢＩＮＡＣＫ２ＳＴとｐＥＮＴＲ３５Ｓを混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩ３５ＳＮＡＣＫ２ＳＴを生成した。ｐＤＥＳＴＢＩ−２とｐＥＮＴＲＧＦＰを混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩＧＦＰを生成した。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応は付属のプロトコルに従って行った。
前記ｐＤＢＩＯｓＮＡＣＫＳＴ、ｐＤＢＩＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴ、ｐＤＢＩ３５ＳＮＡＣＫ２ＳＴ及びｐＤＢＩＧＦＰは、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターによりそれぞれ、ＯｓＮＡＣＫＳＴ、ＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴ、ＮＡＣＫ２ＳＴ、ｓＧＦＰを発現するプラスミドベクターであり、アグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。
【０１０５】
（２）タバコ培養細胞の形質転換と細胞質分裂の抑制
前記（１）のバイナリーベクター、ｐＤＢＩＯｓＮＡＣＫＳＴ、ｐＤＢＩＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴ、ｐＤＢＩ３５ＳＮＡＣＫ２ＳＴ及びｐＤＢＩＧＦＰを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を形質転換した。これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムをＹＥＢ培地を用いて３０℃、２日間振揺培養し、培養液を１００μｌとＬＳＤ液体培地で培養し植え継ぎ後３日目のＢＹ−２細胞４ｍｌを混合し、暗所、２５℃で共培養した。共培養後のＢＹ−２細胞を１％オルセインを含む乳酸、プロピオン酸の等量混合物で固定、核染色を行い、微分干渉顕微鏡下で細胞の観察を行った。その結果、ＯｓＮＡＣＫＳＴ、ＨＡ２ＮＡＣＫ１ＳＴ、ＮＡＣＫ２ＳＴをアグロバクテリウムを介して発現させたＢＹ−２細胞ではＧＦＰを発現させた細胞よりも高率に多核化した細胞が観察された。多核細胞の出現頻度を表４に示した。カッコ内の数値は 多核細胞数 ／ 観察細胞数を示す。単子葉植物であるイネのＮＡＣＫＳＴ（ＯｓＮＡＣＫＳＴ）を双子葉植物であるタバコ細胞に導入すると、ＮＡＣＫ２ＳＴやＮＡＣＫ１ＳＴと同様にタバコ培養細胞の細胞質分裂を阻害した。驚くべきことに、ＮＡＣＫ関連遺伝子は双子葉植物、単子葉植物の種を越えて機能することが明らかに示された。
【０１０６】
【表４】

【０１０７】
実施例２４
ＡｔＮＡＣＫ２プロモーターの遺伝子発現パターン
（１）形質転換のためのベクターの生成
ｐＢＩ１２１（クロンテック）を鋳型としてプライマーＲＢ−５（５’− ｇｃｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇａａｃｃｃｔｇ −３’；配列番号：２５）とプライマーＲＢ−３（５’− ａｇａｔｔｇｔｃｇｔｔｔｃｃｃｇｃｃｔｔｃ −３’； 配列番号：２６）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＲｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＲＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＫｐｎＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲを生成した。ｐＢＩ１２１（クロンテック）を鋳型として、プライマーＬＢ−５（５’− ｃａｇｔａｃａｔｔａａａａａｃｇｔｃｃｇｃａａｔｇ −３’； 配列番号：２７）とプライマーＬＢ−３（５’− ｃａｇａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｇａｔｃａｇｃｃｇ −３’；配列番号：２８）を用いてＰＣＲ反応を行い、Ｔ−ＤＮＡのＬｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ（ＬＢ）を含む配列を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＲをＳａｃＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトに挿入しｐＲＬを生成した。ｐＲＬをＸｈｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ 断片を用いて切断末端を平滑化したサイトにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター：ＨＰＴ：Ｎｏｓターミネーターから構成されるハイグロマイシン耐性遺伝子を含む平滑末端のＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲＨＬを生成した。ｐＲＨＬをＢｇｌＩＩで切断し、切り出されるＲＢ、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＬＢを含むＤＮＡ断片をｐＢＩ１２１（クロンテック）をＢｇｌＩＩで切断して生成される断片と置換しｐＢＩ−ＲＨＬを生成した。ＰＢＩ２２１を鋳型にしてプライマー（５’− ｔｃｃｃｃｇｃｇｇａｔｇｔｔａｃｇｔｃｃｔｇｔａｇａａａｃ −３’； 配列番号：４４）とプライマー（５’− ｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ−３’；配列番号：４５）を行いＧＵＳとＮｏｓターミネーターを含んだＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（スタラタジーン）をＳｍａＩで切断したサイトに挿入しｐＧＵＳ−Ｔを生成した。
ｐＧＵＳ−ＴをＳａｃＩＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑化、ＳｐｅＩ切断後にＧＵＳとＮｏｓターミネーターを含んだＤＮＡ断片をｐＢＩ−ＲＨＬをＢａｍＨＩ切断、Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑化、ＳｐｅＩ切断によって生じたサイトに挿入し、ｐＢＩＨｍ−ＧＵＳを生成した。ＰＢＩＨｍ−ＧＵＳをＳｍａＩで切断後Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ａ（インビトロジェン）を挿入し、ｐＤＢＩ−ＧＵＳを生成した。
ｐＤＢＩ−ＧＵＳと前記実施例２２で生成したプラスミドｐＥＮＴＲＡＶＰ１、ｐＥＮＴＲＴＡ２９、ｐＥＮＴＲＮ１．６、ｐＥＮＴＲＮ１．０、ｐＥＮＴＲ０．６、ｐＥＮＴＲ０．４をそれぞれ混合し、インビトロジェン社のＬＲ ｃｌｏｎａｓｅに添付のプロトコルに従い反応を行い、プロモーター配列をＧＵＳの上流に挿入し、
▲１▼ ＡＶＰ１ プロモーターによってＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＡＶＰ１−ＧＵＳ、
▲２▼ ＴＡ２９ プロモーターによってＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＴＡ２９−ＧＵＳ、
▲３▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（１６１８ｂｐ）でＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ１．６−ＧＵＳ、
▲４▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（１０１８ｂｐ）でＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ１．０−ＧＵＳ、
▲５▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（５７５ｂｐ）でＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ０．６−ＧＵＳ、
▲６▼ ＡｔＮＡＣＫ２プロモーター（４１９ｂｐ）でＧＵＳが発現するプラスミドｐＥｘｐＮ０．４−ＧＵＳ
を生成した。
【０１０８】
（２）シロイヌナズナの形質転換とＧＵＳ発現パターンの観察
前記（１）の▲１▼〜▲６▼のプラスミドを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてＦｌｏｒａｌ ｄｉｐ法によりシロイヌナズナ エコタイプＣｏｌ−０を形質転換する。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られた種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、ハイグロマイシン２５μｇ／ｍｌ、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ倍地上に播種する。ハイグロマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択し、これらを土に植え替え、２０℃ １６時間明期、８時間暗黒の条件で栽培する。形質転換植物で開花した花をＸ−Ｇｌｕｃ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｒｉｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）を基質とした染色を行うことで、雄性生殖系の器官または細胞において強いＧＵＳ染色が観察される。
【０１０９】
実施例２５
シロイヌナズナＮＡＣＫ遺伝子のｃＤＮＡの単離と塩基配列の決定
（１） ＡｔＮＡＣＫ１ のクローニング
シロイヌナズナ（エコタイプＣｏｌ−０）の幼苗よりＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ 社） を用いて総ＲＮＡ を抽出した。抽出した総ＲＮＡ の４．５ μｇを鋳型にしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） を用いてｃＤＮＡを合成し、合成された５０μｌ のうち２μｌ を使用してＰＣＲ 反応を行った。ＰＣＲ 反応に用いたプライマーは配列番号：９、配列番号：１０ に示す。プライマーは配列番号：４７ に示したゲノムＤＮＡ の塩基配列を元に設計した。反応はＥｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ 社） を用い、Ｅｘ ｔａｑに付属する反応バッファー、各 ２００μＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびプライマーを各１μＭ 用いて、５０μｌ の液量で行った。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社） を用いて９４℃を３０秒、６４℃を３０秒、７２℃を１５分のステップを４５サイクル繰り返した。反応終了後、アガロースゲルを用いて解析したところ、約３ｋｂｐ の単一のＤＮＡ が増幅していることが確認されたため、このＤＮＡ 断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社） のＥｃｏＲＶ 切断部位に挿入しクローニングした。得られたプラスミドｐＢＳ−ＡｔＮＡＣＫ１ の塩基配列を決定し、その塩基配列を配列番号：５に、このｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を配列番号：６に示した。
【０１１０】
（２） ＡｔＮＡＣＫ２ のクローニング
シロイヌナズナ（エコタイプＣｏｌ−０ ）の花芽よりＲＮｅａｓｙ ｐｌａｎｔ ｍｉｎｉ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ 社） を用いて総ＲＮＡ を抽出した。抽出した総ＲＮＡ の ４．５μｇを鋳型にしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｓｙｎｔｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） を用いてｃＤＮＡを合成し、合成された５０μｌ のうち２μｌ を使用してＰＣＲ 反応を行った。ＰＣＲ 反応に用いたプライマーは配列番号：４８ 、配列番号：４９ に示す。プライマーは配列番号：４７ に示したゲノムＤＮＡ の塩基配列を元に設計した。反応はＥｘ ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ 社） を用い、Ｅｘ ｔａｑに付属する反応バッファー、各 ２００μＭ のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびプライマーを各１μＭ 用いて、５０μｌ の液量で行った。ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 社） を用いて９４℃を３０秒、６４℃を３０秒、７２℃を１５分のステップを４５サイクル繰り返した。反応終了後、アガロースゲルを用いて解析したところ、約２．８ｋｂｐの単一のＤＮＡ が増幅していることが確認されたため、このＤＮＡ 断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社） のＥｃｏＲＶ 切断部位に挿入しクローニングした。得られたプラスミドｐＢＳ−ＡｔＮＡＣＫ２ の塩基配列を決定し、その塩基配列を配列番号：５０ に、このｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を配列番号：５１ に示した。
【０１１１】
実施例２６
キネシン様モータードメインを欠失させたＡｔＮＡＣＫによる細胞質分裂阻害
（１） 形質転換のためのベクターの生成
ＡｔＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（スタラタジーン） 挿入されたプラスミドｐＢＳ−ＡｔＮＡＣＫ１ を鋳型としてプライマー（５’− ｇｇｇｇｇｔａｃｃａｔｇｇｔｔｇｔｃｔｃｔｇａｔａａｇｃａａｃ −３’； 配列番号：５２）とプライマーＴ３（５’− ａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇ −３’；配列番号：４１）を用いてＰＣＲ 反応を行い、モーター領域を欠失したＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ のＤＮＡ 断片を増幅する。ＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ ＤＮＡ は配列番号：６に示したＡｔＮＡＣＫ１ のアミノ酸配列の３６１番目から９７４番目のアミノ酸をコードし、モータードメインを欠失している。このＤＮＡ 断片をＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断後、ｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１ のＫｐｎＩとＮｏｔＩ切断によるサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ３５ＳＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ を生成する。
ＡｔＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡがｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（スタラタジーン） 挿入されたプラスミドｐＢＳ−ＡｔＮＡＣＫ２ を鋳型としてプライマー（５’− ｇｇｇｇｇｔａｃｃａｔｇｇｔｔｇｔｃｔｃａｇａａａａａａａｇ −３’；配列番号：５３）とプライマーＴ３（５’− ａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇ −３’；配列番号：４１）を用いてＰＣＲ 反応を行い、モーター領域を欠失したＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ のＤＮＡ 断片を増幅する。ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ ＤＮＡ は配列番号：５１ に示したＡｔＮＡＣＫ２ のアミノ酸配列の３５６番目から９３８番目のアミノ酸をコードし、モータードメインを欠失している。このＤＮＡ 断片をＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断後、ｐＥＮＴＲ３５ＳＴ−１ のＫｐｎＩとＮｏｔＩ切断によるサイトに挿入し、ｐＥＮＴＲ３５ＳＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ を生成する。
ｐＤＥＳＴＢＩ−２ とｐＥＮＴＲ３５ＳＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ を混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ を用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ を生成する。ｐＤＥＳＴＢＩ−２ とｐＥＮＴＲ３５ＳＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ を混合し、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘを用いた部位特異的組み換え反応によりｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ を生成する。Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｍｉｘ を用いた部位特異的組み換え反応は付属のプロトコルに従って行う。ｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ 、ｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ はＣａＭＶ ３５ＳプロモーターによりＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ 、ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ が発現するアグロバクテリウム法で植物の形質転換が可能なバイナリーベクターである。
【０１１２】
（２） タバコ培養細胞の形質転換と細胞質分裂の抑制
前記（１） のバイナリーベクター、ｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ 、ｐＤＢＩＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ およびｐＤＢＩ３５ＳＧＦＰを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を形質転換する。これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムをＹＥＢ 培地で３０℃、２日間振揺培養し、培養液を １００μｌ とＬＳＤ 液体培地で培養し植え継ぎ後３日目のＢＹ−２細胞４ｍｌ を混合し、暗所、２５℃で共培養する。共培養後のＢＹ−２細胞を１％オルセインを含む乳酸、プロピオン酸の等量混合物で固定、核染色を行い、微分干渉顕微鏡下で細胞の観察を行う。その結果、ＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ 、ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ をアグロバクテリウムを介して発現させるＢＹ−２細胞ではＧＦＰ を発現させる細胞よりも高率に多核化した細胞が観察される。ＡｔＮＡＣＫ１ＳＴ 、ＡｔＮＡＣＫ２ＳＴ もＮＡＣＫ１ＳＴ と同様に細胞質分裂を阻害することが明らかに出来る。
【０１１３】
実施例２７
稔性回復系統の作出
外生のＮＡＣＫ２ＳＴ（実施例２２に記載）の発現により不稔性となったシロイヌナズナから、以下の（１）から（４）に記載の方法により、稔性が回復した系統を作出することができる。手短には、ＮＡＣＫ２ＳＴを発現する親株より受け継がれるＮＡＣＫ２ＳＴの発現をＲＮＡ干渉によって抑制することで、稔性を回復させることが可能であり、また、ＮＡＣＫ関連タンパク質として正常に機能するＮＡＣＫ２を過剰発現させ、内生のシロイヌナズナＡｔＮＡＣＫ２とともに、細胞分裂を阻害するＮＡＣＫ２ＳＴと競合させることで、ＮＡＣＫ２ＳＴの効果が低下する結果、前記不稔性シロイヌナズナから、稔性を回復させることが可能である。
【０１１４】
（１）ＲＮＡ干渉のためのプラスミドの構築
前記実施例２２に記載のプラスミドｐＲＨＬをＡｐａＩで切断し、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってｐＲＨＬ２を構築した。ｐＲＨＬ２をＸｈｏＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってｐＲＨＬ３を構築した。ｐＲＨＬ３をＳｐｅＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて突出末端を平滑化後にセルフライゲーションを行なうことによってｐＲＨＬ４を構築した。
ｐＥＮＴＲ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＥｃｏＲＩで切断して切り出されるｃｃｄＢカセットを含むＤＮＡ断片を、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて突出末端を平滑化し、ｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＸｍｎＩとＢｓａＡＩを用いて生成される部位に挿入してｐＤＯＮＲ２０１ΔＣｍ１を構築した。挿入されたＤＮＡ断片がｐＤＯＮＲ２０１ΔＣｍ１と逆向きであるプラスミドをｐＤＯＮＲ２０１ΔＣｍ３とした。ｐＤＯＮＲ２０１ΔＣｍ１をＡｐａＩとＳｍａＩで切断し、切り出されるＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＡｐａＩとＳｍａＩで切断して生成される部位に挿入しｐＢＳ−ａｔｔＰを構築した。
【０１１５】
ｐＤＨｕ１−１（名古屋大学理学研究科上野宜久助手より分譲された）をＥｃｏＲＩで切断し、切り出されたＤＮＡの突出末端をＫｌｅｎｏｗ断片を用いて平滑化した後に、ｐＲＨＬ４をＳｍａＩで切断して生成される部位に挿入しｐＲＨＧＵＳＲｉＬを構築した。ｐＤＯＮＲ２０１ΔＣｍ３をＡｐａＩとＮｒｕＩで切断して切り出されるＤＮＡ断片をｐＲＨＧＵＳＲｉＬをＡｐａＩとＳｍａＩで切断して生成される部位に挿入してｐＲＨＧＵＳＲｉＰ１を構築した。ｐＢＳ−ａｔｔＰをＡｐａＩで切断後、突出末端をＴ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて平滑化し、さらにＳｐｅＩで切断することによって切り出されるＤＮＡ断片をｐＲＨＧＵＳＲｉＰ１をＸｈｏＩで切断後、突出末端をＫｌｅｎｏｗ断片を用いて平滑化し、さらにＳｐｅＩで切断することによって生成される部位に挿入し、ｐＲＨＧＵＳＲｉＰ２を構築した。
ｐＲＨＧＵＳＲｉＰ２をＢｇｌＩＩで切断し切り出されるＤＮＡ断片をｐＢＩ１２１をＢｇｌＩＩで切断し切り出されたＤＮＡ断片を取り除いて生成される部位に挿入してｐＢＩ−ＧＵＳＲｉＰ１を構築した。
実施例１にて記述したプラスミドｐＮＡＫ２ＳＫを鋳型にプライマーＮＡＣＫ２−１３１１Ｆ（５’− ＧＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＧ −３’；配列番号： ５４） とプライマーＮＡＣＫ２−２０７１Ｒ（５’− ＴＡＣＡＧＴＴＡＴＣＧＴＣＣＴＴＡＣＴＴ −３’；配列番号： ５５）を用いてＰＣＲを行ない、タバコＮＡＣＫ２遺伝子の部分配列を得た（配列番号３の１４０２から２１６２番目までの塩基配列で表されるＤＮＡ断片）。これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳｍａＩサイトにクローニングし、ｐＥＮＡＣＫ２Ｒｉを構築した。
【０１１６】
ｐＥＮＡＣＫ２Ｒｉを鋳型にプライマーａｔｔＢ１’−ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（５’− ＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＧＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧ −３’； 配列番号： ５６） 、プライマーａｔｔＢ２’−ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ（５’− ＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＧＡＴＣＣＣ −３’； 配列番号： ５７）、プライマーａｔｔＢ１ ａｄａｐｔｅｒ（５’− ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴ −３’；配列番号： ５８） 、およびプライマーａｔｔＢ２ ａｄａｐｔｅｒ（５’− ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴ −３’；配列番号： ５９）を用いてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌの通りにＰＣＲを行ない、両末端にＧａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のａｔｔＢ１、ａｔｔＢ２配列が付加されたＮＡＣＫ２遺伝子の部分ＤＮＡ断片（ａｔｔＢ−ＮＡＣＫ２Ｒｉ）を得た。このＤＮＡ断片（ａｔｔＢ−ＮＡＣＫ２Ｒｉ）とプラスミドｐＢＩ−ＧＵＳＲｉＰ１ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社）を混合し、ＢＰ Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＢＰ反応を行い、ＮＡＣＫ２の一部分を含む前記ＤＮＡ断片をｐＢＩ−ＧＵＳＲｉＰ１ に逆位反復に位置するように挿入し、ｐＢＩ−Ｎ２Ｒｉを構築した。
すなわち、ｐＢＩ−Ｎ２Ｒｉは、ＮＡＣＫ２の一部分をコードするＲＮＡがＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターにより２本鎖形態で発現するアグロバクテリウム法で形質転換可能なバイナリーベクターであり、形質転換植物はハイグロマイシンで選抜可能である。このバイナリーベクターを用いて得られた形質転換植物では発現した２本鎖ＲＮＡが引き金となり、植物体中でＮＡＣＫ２遺伝子のｍＲＮＡ量が低下した、すなわちＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の効果を得ることが可能である。
【０１１７】
（２）正常型ＮＡＣＫ２過剰発現用プラスミドの構築
実施例２２に記載のプラスミドｐＲＨＬのＳｍａＩサイトにＧａｔｅｗａｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＲｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ａを挿入し、ｐＲＨＲＬを構築した。このプラスミドｐＲＨＲＬをＢｇｌＩＩ処理して得られるＧａｔｅｗａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のａｔｔＲ１、ａｔｔＲ２配列を含む断片と、バイナリベクターｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）をＢｇｌＩＩ処理して得られる複製起点を含むＤＮＡ断片とをライゲーションし、ｐＤＥＳＴ−ＢＩ１を構築した。
ｐＴＨ−２（静岡県立大学の丹羽康夫助手より分譲。Ｃｈｉｕ Ｗら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ Ｍａｒ １；６（３）：３２５−３０．）をＥｃｏＲＩ処理した後、Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いて突出末端を平滑化し、ＮｏｔＩ処理して得られたＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＥＮＴＥＲ２ＢをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶを用いて生成される部位に挿入し、ｐＥＮＴＥＲＮＯＳＴ１を構築した。実施例１にて記述したプラスミドｐＮＡＫ２ＳＫをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで処理し得られた断片を、ｐＥＮＴＥＲＮＯＳＴ１をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを用いて生成される部位に挿入し、ｐＥＮＡＣＫ２を構築した。
実施例２２に記載のプラスミドｐＥＮＴＲＡＶＰ１を鋳型にプライマーＫｐｎＩ−ＡＶＰ１−Ｆ（５’− ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＡＡＴＡＧＡＧ −３’；配列番号： ６０） 、プライマーＡＶＰ１Ｐ−ＥｃｏＲＩ−Ｒ（５’− ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＧＴＡＴＡＡＧ −３’；配列番号： ６１）を用いたＰＣＲによって得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで処理した後、ｐＥＮＡＣＫ２をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩを用いて生成される部位に挿入してｐＥＡＮＡＣＫ２を構築した。
プラスミドｐＥＡＮＡＣＫ２とｐＤＥＳＴ−ＢＩ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社）を混合し、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＬＲ反応を行い、ＡＶＰ１プロモーターによってＮＡＣＫ２遺伝子を発現させるＤＮＡ断片をハイグロマイシン耐性遺伝子を有するバイナリベクター上に挿入し、ｐＢＩ−ＡＮ２を構築した。
すなわち、ｐＢＩ−ＡＮ２は、ＮＡＣＫ２遺伝子をコードするＲＮＡがＡＶＰ１プロモーターにより発現するアグロバクテリウム法で形質転換可能なバイナリーベクターであり、形質転換植物はハイグロマイシンで選抜可能である。このバイナリーベクターを用いて得られた形質転換植物では、ＮＡＣＫ２遺伝子が葯特異的に発現する。
【０１１８】
（３）プラスミド（ｐＢＩ−Ｎ２Ｒｉ、ｐＢＩ−ＡＮ２）によるシロイヌナズナの形質転換
前記（２）で構築したプラスミド（ｐＢＩ−Ｎ２Ｒｉ、ｐＢＩ−ＡＮ２）を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０１株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ ＥＨＡ１０１ ｓｔｒａｉｎ）を形質転換し、これらのプラスミドを保持するアグロバクテリウムを用いてＦｌｏｒａｌ ｄｉｐ法によりシロイヌナズナ エコタイプＣｏｌ−０を形質転換した。アグロバクテリウムを感染させた花芽より得られた種子を次亜塩素酸と滅菌水を用いて滅菌し、ハイグロマイシン２５μｇ／ｍｌ、カルベニシリン１００μｇ／ｍｌを含むＭＳ倍地上に播種した。ハイグロマイシン添加培地上で生育可能な形質転換植物を選択した（ｐＢＩ−Ｎ２Ｒｉで形質転換したシロイヌナズナをＡｔＮ２Ｒｉ、ｐＢＩ−ＡＮ２で形質転換したシロイヌナズナをＡｔＡＮ２と名付けた）。
【０１１９】
（４）回復系統を用いた稔性の回復したハイブリッド種子（Ｆ１種子）の生産
前記（３）で作出したシロイヌナズナＡｔＮ２Ｒｉの葯より生産される花粉を実施例２２で作出したＡＶＰ１プロモーターによりＮＡＣＫ２ＳＴを発現する株（実施例２２の▲１▼）の雌しべに受粉させることで得られる次世代の植物（Ｆ１）は、ＲＮＡｉ効果によってＮＡＣＫ２ＳＴを発現する親株より受け継がれるＮＡＣＫ２ＳＴのｍＲＮＡが減少し、結果的にＮＡＣＫ２ＳＴの発現が低下して稔性が回復する。すなわち、前記（３）で作出したシロイヌナズナＡｔＮ２Ｒｉを用いることで、稔性の回復したハイブリッド種子（Ｆ１種子）を得ることができる。
また、前記（３）で作出したシロイヌナズナＡｔＡＮ２の葯より生産される花粉を実施例２２で作出したＡＶＰ１プロモーターによりＮＡＣＫ２ＳＴを発現する株（実施例２２の▲１▼）の雌しべに受粉させることで得られる次世代の植物（Ｆ１）は、正常な細胞分裂を阻害するＮＡＣＫ２ＳＴに対して細胞分裂を正常に進めるＮＡＣＫ２とシロイヌナズナＡｔＮＡＣＫ２が競合し、結果的にＮＡＣＫ２ＳＴの効果が低下して稔性が回復する。すなわち、前記（３）で作出したシロイヌナズナＡｔＡＮ２を用いることで、稔性の回復したハイブリッド種子（Ｆ１種子）を得ることができる。
これらのＦ１種子より生まれた個体は、稔性が回復しており、自家受精による結実が可能となる。
【０１２０】
【発明の効果】
本発明により、ＮＡＣＫ１ 遺伝子あるいはＮＡＣＫ２ 遺伝子並びにその類似遺伝子の発現の調節や、ＮＡＣＫ１ やＮＡＣＫ２ タンパク質を改変してドミナントネガティブ分子として用いて植物の隔膜形成体の形成および拡大を制御する技術、ＮＡＣＫ２ 関連遺伝子のプロモーターの花粉形成組織特異的な遺伝子発現調節に関する技術が提供された。隔膜形成体の形成および拡大の制御は細胞分裂の改変を可能にし、植物の発生分化を改変した植物の作出などを可能にしたり、正常な機能を示す花粉の形成を抑制し、雄性不稔を示す植物の作出などを可能にすることより、育種や農作物の生産性向上などをもたらし、農業、園芸分野において有益である。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【０１２１】
＜配列表フリーテキスト＞
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １， ｔｏｂａｃｃｏ ＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３， ｔｏｂａｃｃｏ ＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５， Ａｒａｂｉｄｐｓｉｓ ｔｈａｌｌｉａｎａ Ｃｏｌ−０ ＡｔＮＡＣＫ１ ｃＤＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＮＡＣＫ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＮＡＣＫ１
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３， Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ＨＡ ｅｐｉｔｏｐｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４， Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ＨＡ ｅｐｉｔｏｐｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５， Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ＨＡ ｅｐｉｔｏｐｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６， Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ＨＡ ｅｐｉｔｏｐｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７， ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ） ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇ， ｈｅｍａｇｇｔｉｎｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＮＡＣＫ１：ＳＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＮＡＣＫ１：ＳＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３７， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３８， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３９， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４０， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４１， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４２， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４３， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４４， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４８， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４９， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ２
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５０， Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｃｏｌ−０ ＡｔＮＡＣＫ２ ｃＤＮＡ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５２， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ１−ＳＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５３， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＡｔＮＡＣＫ２−ＳＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５４， ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５５， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５６， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５７， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５８， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５９， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６０， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６１， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｏ ａｃｔ ａｓ ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ＰＣＲ
【０１２２】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡＣＫ関連タンパク質である ＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ１ 、ＯｓＮＡＣＫにつき、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図２及び３に連続する。
【図２】ＮＡＣＫ関連タンパク質である ＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ１ 、ＯｓＮＡＣＫにつき、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図１の続きで、図３に連続する。
【図３】ＮＡＣＫ関連タンパク質である ＮＡＣＫ１、ＡｔＮＡＣＫ１ 、ＯｓＮＡＣＫにつき、最適な形で並べたアミノ酸配列の比較を示す。配列は図１及び２からの続きである。
【図４】コイルドコイル構造を予測するプログラム（ＣＯＩＬＳ ｐｒｏｇｒａｍ， ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｐｓａ ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ ｌｕｐａｓ．ｈｔｍｌ， Ｌｕｐａｓ ｅｔ ａｌ． １９９１） によってＮＡＣＫ１ タンパク質、ＡｔＮＡＣＫ１ タンパク質、ＯｓＮＡＣＫタンパク質のアミノ酸配列からコイルドコイル構造を予測した結果を示す。
【図５】ベクターｐＴＡ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１：ＳＴ （図では、ｐＴ７１−ＨＡ−ＮＡＣＫ１ＳＴ と表示）の構築過程を示す。
【図６】多核化したＢＹ−２細胞と正常なＢＹ−２細胞とを比較して示す細胞の形態を示す写真である。
【図７】多核化したＢＹ−２細胞の大きさを計測した結果を示す。ｗｔ： ワイルドタイプＢＹ−２細胞
【図８】本発明に従った形質転換植物（多核化したタバコ個体）の外観及びその細胞の形態を示す写真である。
【図９】ＡｔＮＡＣＫ２ 遺伝子のプロモーター領域を含む制御配列の構造を示す。

Claims (49)

1. 下記（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡ：
   （ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｂ） 配列番号：１、３、５、２１または５０に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
   （ｃ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加したアミノ酸配列を有し、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｄ） 配列番号：１、３、５、２１または５０に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｅ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列と６５％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｆ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｇ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｈ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   （ｉ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列と６５％以上のアミノ酸がポジティブであり、かつ、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインと７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有し、及び／ 又は、配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであって、それぞれ配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ 。
2. 請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
3. 請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
4. ＤＮＡであって、植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、かつ、請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ。
5. ＤＮＡであって、植物細胞における発現時に、ＲＮＡ干渉効果により、請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードし、かつ、請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡと２０塩基以上の連続して同一であるＤＮＡ。
6. ＤＮＡであって、植物細胞における内在性の請求項１の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 植物の隔膜形成体の形成制御、および／または発生分化制御のために用いるものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一に記載のＤＮＡ。
8. 植物の隔膜形成体の形成および／または拡大の制御による雄性不稔化技術のために用いるものであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一に記載のＤＮＡ。
9. 下記の（ｉ）から（ｉｉｉ）の構成要素を含む組換えＤＮＡ又はベクター：
   （ｉ） 細胞内で転写可能なプロモーター、
   （ｉｉ） 該プロモーター配列にセンス方向又はアンチセンス方向で結合した請求項１〜７のいずれか一に記載のＤＮＡ、
   （ｉｉｉ） ＲＮＡ 分子の転写終結およびポリアデニル化に関するシグナル。
10. 請求項１〜８のいずれか一に記載のＤＮＡまたは請求項９に記載の組換えＤＮＡ又はベクターを保持する形質転換細胞。
11. 請求項１に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質又は部分ペプチド、あるいは植物細胞における内在性の、請求項１の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブ活性を示すタンパク質又はその部分ペプチド。
12. 請求項１に記載のＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項１１に記載のタンパク質の製造方法。
13. 請求項１〜８のいずれか一に記載のＤＮＡまたは請求項９に記載の組換えＤＮＡ又はベクターを保持する形質転換植物細胞。
14. 請求項１３に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
15. 請求項１４に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
16. 隔膜形成体の形成制御、および／または発生分化制御のために用いるものであることを特徴とする請求項１４または１５に記載の形質転換植物体。
17. 隔膜形成体の形成及び／又は拡大の制御が改変されている請求項１４または１５に記載の形質転換植物体。
18. 稔性の低下している、請求項１４または１５に記載の形質転換植物体。
19. 請求項１３に記載の植物細胞又は請求項１４〜１８のいずれかに記載の植物体より製造された食品及び／又は飼料組成物。
20. 請求項１３に記載の植物細胞又は請求項１４〜１８のいずれかに記載の植物体より製造される化学品。
21. 請求項１３に記載の植物細胞又は請求項１４〜１８のいずれかに記載の植物体を用いて化学品を製造する方法。
22. 下記の（ｉ）から（ｖｉｉ） のいずれかに記載のＤＮＡ：
    （ｉ）配列番号：２０で示した塩基配列を有するＤＮＡ、
    （ｉｉ）配列番号：２０で示した２８０１−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
    （ｉｉｉ）配列番号：２０で示した３４０１−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
    （ｉｖ）配列番号：２０で示した３８４４−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ、
    （ｖ）配列番号：２０で示した４０００−４４１８番目の塩基配列を有するＤＮＡ
    （ｖｉ）下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を少なくとも一ずつ含む配列を有するＤＮＡ：
    （ａ）少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、又は塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
    （ｂ）塩基配列がＴＴＴＣＴ、又は塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、及び
    （ｃ）塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、又はＡＴＧＧＴＧＧＡである配列。
    （ｖｉｉ）少なくとも、下記（ａ）のいずれか一の配列と下記（ｂ）または（ｃ）のいずれか一とを含む配列を有するＤＮＡ：
    （ａ）少なくとも塩基配列がＡＡＣＧＧである、又は塩基配列がＣＣＧＴＴであるＭＳＡ配列、
    （ｂ）塩基配列がＴＴＴＣＴ、又は塩基配列がＡＧＡＡＡである配列、及び
    （ｃ）塩基配列がＴＣＣＡＣＣＡＴ、又はＡＴＧＧＴＧＧＡである配列。
23. （ａ）花粉形成に係わる器官を構成する細胞において特異的に隔膜形成体の形成及び／又は拡大を抑制することにより植物の稔性を低下させる、あるいは（ｂ）花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現のプロモータとして使用することを特徴とする請求項２２のＤＮＡ。
24. 請求項２２又は２３に記載のＤＮＡを含むベクター。
25. 請求項２２又は２３に記載のＤＮＡ、又は請求項２４に記載のＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換細胞。
26. 請求項２２又は２３に記載のＤＮＡ、又は請求項２４に記載のＤＮＡを含むベクターを保持する形質転換植物細胞。
27. 請求項２６に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
28. 請求項２７に記載の形質転換植物体の子孫または、クローンである形質転換植物体。
29. 形質転換した遺伝子が花粉形成に係わる器官において強く発現する遺伝子発現を示す、請求項２７又は２８に記載の形質転換植物体。
30. 形質転換した遺伝子が花粉形成組織特異的発現を示す、請求項２７又は２８に記載の形質転換植物体。
31. 請求項２７〜３０のいずれか一に記載の植物体より製造された食品及び／又は飼料組成物。
32. 請求項２７〜３０のいずれか一に記載の植物体より製造された化学品。
33. 請求項１の（ａ）〜（ｉ）のいずれかに記載のＤＮＡの転写産物。
34. 請求項３３に記載の転写産物の量を測定する方法。
35. 複数の検体中の請求項３３に記載の転写産物の量を相対的に比較する方法。
36. 請求項１に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質の量を測定する方法。
37. 複数の検体中の請求項１に記載のＤＮＡにコードされるタンパク質の量を相対的に比較する方法。
38. 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質又はそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡである請求項６のＤＮＡ。
39. 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡである請求項６のＤＮＡ。
40. 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含み、かつ以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ である請求項６のＤＮＡ：
    （ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列、
    （ｂ） キネシン様タンパク質のモータードメインの点変異により微小管への結合能を失ったアミノ酸配列、
    （ｃ） キネシン様タンパク質のモータードメインの点変異により微小管上での移動能を失ったアミノ酸配列。
41. 植物の隔膜形成体の形成制御、及び／又は発生分化制御活性を有し、かつ、
    （ａ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ、
    （ｂ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、及び
    （ｃ） （ｉ） 配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列中のＮＰＫ１タンパク質またはそのオルソログとの結合領域と７０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列及び（ｉｉ）配列番号：２、４、６、２２または５１に記載のアミノ酸配列からそれぞれの配列中のキネシン様タンパク質のモータードメインを欠失させたアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸がポジティブであるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
    から成る群から選ばれたものであるＤＮＡ。
42. 隔膜形成体の形成、隔膜形成体の拡大、細胞板の形成及び／又は細胞板の拡大を抑制あるいは阻害する活性を有するものである請求項４１のＤＮＡ。
43. 植物組織の形態、組織の大きさ、器官の形態、器官の大きさ、植物体の形態、植物体の大きさ及び／又は植物体の生育速度を制御する活性を有するものである請求項４１のＤＮＡ。
44. 稔性の低下を起こす活性を有するものである請求項４１のＤＮＡ。
45. 請求項９に記載の組換えＤＮＡ 又はベクター中、（ｉ） のプロモーターにおいて植物細胞内で転写可能なプロモーターとして請求項２２又は２３に記載の塩基配列又はＤＮＡ のいずれか一を用い、且つ（ｉｉｉ） のシグナルにおいて植物で機能するシグナルを用いる組換えＤＮＡ 又はベクター。
46. 請求項４５に記載の組換えＤＮＡ 又はベクターを保持する形質転換細胞。
47. 請求項４５に記載の組換えＤＮＡ 又はベクターを保持する形質転換植物細胞。
48. 請求項４７に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
49. 請求項４８に記載の形質転換植物体の子孫または、クローンである形質転換植物体。

Images