【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトの胎盤組織および臍帯組織由来の造血支持能を有する細胞を用いることを特徴とする、ＣＤ３４陽性細胞を含むヒト造血幹および前駆細胞を増幅する方法に関する。さらに詳しくは、ヒト胎盤および臍帯組織由来の造血支持細胞と、該ヒト造血幹及び／または前駆細胞との共存下、各種サイトカイン含有若しくは非含有栄養培地中で、該造血幹及び／または前駆細胞を増殖させる方法、該増幅方法によって得られたヒト造血幹及び／または前駆細胞、及び該造血幹及び／または前駆細胞を用いた細胞治療法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中には、生体機能を司る血球細胞として酸素運搬に関わる赤血球系、血小板を産生する巨核球系、感染防御に関わる顆粒球、単球及び／またはマクロファージなどの骨髄球系、免疫を担当するＴ細胞・Ｂ細胞などのリンパ球系の各細胞系列がある。血球細胞のいずれの細胞も、共通の起源である造血幹細胞より分化・成熟することにより、一生を通じて維持、産生されている。造血幹細胞は、リンパ球、赤血球、血小板等の機能細胞に分化し得る多能性と、そのような多能性を維持したまま自己増殖する能力（自己複製能）を兼ね備えており、造血制御機構によって造血幹細胞が枯渇しないように自己複製を行うと共に、各種血球細胞に分化・成熟していく。これまでの多くの研究から、造血幹細胞が各種血球細胞へ分化する過程は多段階の分化決定によって各血球系列への分化が方向づけられている。
【０００３】
造血幹細胞は、まず骨髄球系及びリンパ球系の２系列へ方向づけられ、それぞれ骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及びリンパ球系幹細胞へ分化し、さらに骨髄系幹細胞は赤血球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、ＣＦＵ−Ｅを経て赤血球に、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）を経て好中球に、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）を経て好酸球に、顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）を経て単球・好中球・好塩基球になり、またリンパ球系幹細胞はＴ前駆細胞を経てＴ細胞に、Ｂ前駆細胞を経てＢ細胞になる。骨髄系幹細胞及びこれから派生する各種前駆細胞の特定方法については、各種サイトカインの存在下における半固形培地中でできるコロニーの性状によってこれらの細胞を特定するいわゆるコロニー形成法が知られている。この方法によって、骨髄系幹細胞である顆粒球・赤血球系・単球系・巨核球系コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）及び前駆細胞である顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）等の骨髄系の前駆細胞を特定することが可能である（非特許文献１）。
【０００４】
ヒトにおいて、生体外でコロニーを形成する前駆細胞が、細胞表面抗原であるＣＤ３４分子を発現している細胞集団に濃縮されることから（非特許文献２）、Ｂｅｒｅｎｓｏｎらは血球細胞死滅処理したがん患者へＣＤ３４陽性細胞の移植を試みたところ造血系の再構築が認められ、造血能を有する造血幹細胞はＣＤ３４陽性細胞の集団に含まれることが臨床的にも認められるようになった（非特許文献３）。一方、造血幹細胞は、主として骨髄、臍帯血などに存在し、さらに末梢血中にも存在することが明らかにされている（非特許文献４）。多くの研究者が造血幹細胞の実体を明らかにするために均一の細胞として生体から分離する試みが行われているものの、現在もなお成功していない。造血幹細胞には、放射線照射によって造血幹細胞を含む血球細胞を完全に死滅させた個体に移植したときに、その個体で産生されるべきすべての血球細胞系列を再び構築できる“造血再構築能”をもつことが必須の条件であるといわれている。
【０００５】
造血再構築能を有する造血幹細胞は、骨髄移植治療をおこなうことによって、一生涯にわたり各種血球細胞を産生する造血幹細胞を提供者（ドナー）から受容者（レシピエント）の骨髄に定着させ、血液に関連する各種疾患を根治できるのではないかと考えられた。初期には実験的治療法であったものの、現在では確立された治療法となった。現在では、急性白血病をはじめとする腫瘍性血液疾患や、重症免疫不全、アデノシンデアミナーゼ欠損症、再生不良性貧血等の疾患に対し、骨髄移植治療が施されている。さらに、これら造血幹細胞が少量ながら末梢血にも存在することが明らかになるにつれ、顆粒球―コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）製剤を投与して造血幹細胞を含む末梢血を用いた移植も普及しつつある（非特許文献５，６）。この方法は、骨髄移植が大量の骨髄細胞を必要とするためドナーの心身への負担が大きいのに対して、ドナーに対して心身への負担が軽減され、また白血球や血小板の回復が早いという利点がある。
【０００６】
また最近になって、臍帯血が骨髄と同程度の造血幹細胞を含むことが明らかにされ、移植治療に有用であることが明らかにされた（非特許文献７）。臍帯血は、骨髄や末梢血と比べて重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発生率が低く、その有用性が期待されている。しかしながら臍帯血の場合、採取量の少なさが問題とされ、１個体に由来する臍帯血では体重４０ｋｇ程度までのレシピエントにのみ移植可能であると考えられている（非特許文献４）。骨髄移植においては、ドナー由来のＴ細胞の混入によるＧＶＨＤの発症や、自己移植の際のがん細胞の混入による再発が問題となっている（非特許文献８）。
【０００７】
一方、造血幹細胞は、上述したようにＣＤ３４陽性の細胞集団として濃縮することができるため、不要な細胞を除去できる可能性があることから、今日ではＣＤ３４陽性幹細胞移植が行われるようになっている（非特許文献３，９）。このような進歩にともなって、移植治療の確実性を高め、より効率的な実施を行うべく、数多くのドナーに由来する造血幹細胞バンクの整備が急務となりつつある（非特許文献１０）。同時に、このような造血幹細胞を効率的に増幅する試みも行われている（非特許文献４）。また、幼弱な造血幹細胞を多く含む臍帯血についても同様に移植応用への期待が高まっているものの、前述のとおり採取量が少ないことから、造血幹細胞を増幅するシステムが期待されている（非特許文献４）。
このように造血幹細胞を安定かつ確実に入手できるシステムの構築は、移植以外に治療法のない前記難治性血液疾患の患者にとっては生命に関わる問題であり、社会的にも重要な果たすべき課題であるといえる。
【０００８】
造血幹細胞およびこれら造血幹細胞から派生する各種前駆細胞は、ＣＤ３４陽性細胞集団に含まれていることが明らかにされているため、分離、濃縮するのに好適であり、増幅のための出発材料として利用されている（非特許文献４）。これらＣＤ３４陽性細胞は、骨髄や臍帯血の血液細胞中に１〜２％存在している。ＣＤ３４陽性細胞の分離は、細胞表面のＣＤ３４分子を認識する抗体と反応性を有する陽性細胞を回収することが基本原理である。ＣＤ３４抗体をビオチンや磁気ビーズで標識し、分離したい細胞群と反応させ、その後それぞれアビジンビーズや磁石でＣＤ３４陽性細胞を回収する方法や、ＣＤ３４抗体をコートした培養器具に細胞を入れ、ＣＤ３４抗体と反応しない細胞を除去した後、ＣＤ３４陽性細胞を回収する方法がよく使用されており、いずれの方法であっても質的には差のないＣＤ３４陽性細胞が回収できる（非特許文献１１，１２）。臨床では、磁気標識したＣＤ３４抗体と磁石を利用した機器が開発され、日本でも医薬審議会において希少疾患治療器具として認定されている。
【０００９】
ＣＤ３４陽性細胞の増幅は、一般に液体培養にて行われるが、個々の造血幹細胞や前駆細胞に対する特異的増殖因子が明らかになっていないために、それぞれの血球細胞に作用する各種サイトカインの組み合わせが用いられており、これまでに多くの報告がなされている（非特許文献１３）。サイトカインの組み合わせによるＣＤ３４陽性細胞の増幅では、培養後の全血球細胞数は増加するものの、培養中に分化誘導が促進され、結果的に最終分化した血球細胞が増加する一方、増幅の源となったＣＤ３４陽性細胞自体はほとんど枯渇されてしまう傾向があることが知られている（非特許文献４）。これまでに報告されたＣＤ３４陽性細胞の増幅においては、前駆細胞であるＣＦＵ−ＧＭの増幅が指標にされていることが多い。
【００１０】
例えばＨａｙｌｏｃｋらは、末梢血ＣＤ３４陽性細胞をインターロイキン１β（ＩＬ−１β）、およびＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦの存在下で１４日培養して、ＣＦＵ−ＧＭを２０−６０倍に増幅したと報告している（非特許文献１４）。またＣＤ３４陽性細胞をＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの存在下で７日間培養してＣＦＵ−ＧＭを５７倍増幅したとの報告もある（非特許文献１５）。また骨髄系幹細胞であるＣＦＵ−ＧＥＭＭの増幅の報告もされており、Ｂｒａｇｇｅｒらは末梢血ＣＤ３４陽性細胞をＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、ＥＰＯで１２日間培養し、ＣＦＵ−ＧＥＭＭを２５０倍に増幅した（非特許文献１６）。またＳＣＦおよびＩＬ−６、ｓＩＬ−６Ｒでの培養によってもＣＦＵ−ＧＥＭＭの増幅は可能との報告もある（特許文献１）。
【００１１】
以上の報告では、特定の細胞系列への方向づけが既に決定された前駆細胞であるＣＦＵ−ＧＭや、造血幹細胞ではあるものの既に分化がおきた骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を対象としているため、造血再構築能を有する造血幹細胞の増幅とは言い難いものであった。そのため、ＣＦＵ−ＧＥＭＭよりも造血幹細胞により近い細胞の同定法として、長期培養を可能にさせる細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）を検出する評価法を用いた解析が試みられたが、ごくわずか増幅するか維持されるだけで、ＣＦＵ−ＧＭのように著しい増幅は認められなかった（非特許文献１６，１７）。
【００１２】
一方、ＣＤ３４陽性細胞の増幅方法として、ヒト骨髄由来のストローマ細胞を株化し、この細胞を支持体として造血幹細胞・前駆細胞の維持・増殖させる方法が試みられている（非特許文献１８）。また、ストローマ細胞を異種動物由来たとえばマウス由来の細胞ＨＥＳＳ−５を用いた方法も試みられている （非特許文献１９，特許文献２）。ストローマ細胞は、造血幹細胞の維持に重要な役割を果たすと考えられているが、実際の造血幹細胞との相互作用はよく理解されていない。杉浦らは、ストローマ細胞と造血幹細胞との相互作用に着目して研究した結果、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、すなわちヒトでいうＨＬＡの一致が重要であり、不一致な場合よりも良いことを明らかにしている（非特許文献２０）。
【００１３】
また、ストローマ細胞に異種動物由来細胞を用いる場合には、増殖後にレシピエントの生体内で免疫反応が起こる危険性があるため、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を完全に分離して、ＣＤ３４陽性細胞のみを移植しなければならない。さらには異種動物由来の未知の病原体があった場合、その存在を確認することはできないという問題点がある。この点に関連して厚生労働省は、異種移植に伴う感染症問題に関する指針を、２００２年７月９日、各都道府県に通知している。同指針は、異種移植のリスクとして、ブタ内在性のレトロウイルスがヒトに感染するなど、異種移植により未知の感染症が誘発される危険性が指摘されたことを受け作成している。異種動物由来のストローマを用いた造血細胞の増幅方法においても、従来ヒトに感染しなかったウイルスなどの病原体が培養することによって、あるいは直接ヒトに移植されることにより、感染性を獲得する器具も指摘されており、臨床応用にあたっては慎重な検討が必要である（非特許文献２１）。
【００１４】
特許文献３には、ある種のストローマ細胞と白血病阻害因子（ＬＩＦ）を必須のサイトカインとして用い、その他の数種のサイトカインとの共存下でのＣＤ３４陽性細胞の増殖が認められる旨の記載がある。しかしながら、培養期間が数週間と長期であり、臨床で使用して行くには困難であると考えられている。
【００１５】
近年、ヒト造血幹細胞の骨髄再構築能を実験的に検証する手段として、糖尿病マウスと免疫不全マウスを掛け合わせて作られたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにヒトの造血幹細胞が定着して、長期にわたってヒト細胞が産生されることが明らかとなり、この手法により骨髄再構築能を有する造血幹細胞の存在を調べる方法が見出されようになった（非特許文献２２）。この方法により測定される細胞は、ＳＣＩＤ−ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ （ＳＲＣ）と呼ばれ、現時点で測定可能なヒト造血幹細胞に、最も近い細胞と考えられており、ＳＲＣをいかに増幅できるかが、最近の造血幹細胞の増幅研究の焦点となっている。
【００１６】
造血幹細胞の増幅システムの構築は、前述のように多数の課題がある。また、移植以外に治療法のない前記難治性血液疾患の患者にとっては生命に関わる問題であり、社会的にも重要な果たすべき課題であるといえる。また、簡便に安定してさらに効率良く増幅可能な方法が望まれており、このようなシステムが移植等の臨床上での使用に有用であろうと考えられる。
【００１７】
【特許文献１】
国際公開第９６／１５２３０号パンフレット
【特許文献２】
特開平１０−２９５３６９号公報
【特許文献３】
特開平７−５０４３３１７号公報
【００１８】
【非特許文献１】
Ｌｕ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．； Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， １１， ７２１−９， １９８３
【非特許文献２】
Ｅｍａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ７５， １９４１−６， １９９０
【非特許文献３】
Ｂｅｒｅｎｓｏｎ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ７７， １７１７−２２， １９９１
【非特許文献４】
Ｅｍｅｒｓｏｎ， Ｓ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ８７， ３０８２−８， １９９６
【非特許文献５】
Ｔａｋａｕｅ， Ｙ．； Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．， ２， ５１３−８， １９９３
【非特許文献６】
Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｎ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．； Ｌａｎｃｅｔ， ３４１， １４８２， １９９３
【非特許文献７】
Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．； Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ．．Ｍｅｄ．， ３３５， １５７−６６， １９９６
【非特許文献８】
Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｍ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．； Ｌａｎｃｅｔ， ３４１， ８５−６， １９９３
【非特許文献９】
Ｓｈｐａｌｌ， Ｅ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １２， ２８−３６， １９９４
【非特許文献１０】
Ｂｅｒｅｎｓｏｎ， Ｒ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．； Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ． Ｐｒｏｃ．， ２４， ３０３２−４， １９９２
【非特許文献１１】
Ｉｓｈｉｚａｗａ， Ｌ． ｅｔ ａｌ．； Ｊ Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．， ２， ３３３−８， １９９３
【００１９】
【非特許文献１２】
Ｃａｓｓｅｌ， Ａ． ｅｔ ａｌ．； Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２１， ５８５−９１， １９９３
【非特許文献１３】
Ｅｍｅｒｓｏｎ， Ｓ．Ｇ． ； Ｂｌｏｏｄ， ８７， ３０８２−８， １９９６
【非特許文献１４】
Ｈａｙｌｏｃｋ， Ｄ．Ｎ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ８０， １４０５−１２， １９９２
【非特許文献１５】
Ｓａｔｏ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ８２， ３６００−９， １９９３
【非特許文献１６】
Ｂｒａｇｇｅｒ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ８１， ２５７９−８４， １９９３
【非特許文献１７】
Ｈｅｎｓｃｈｌｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ， ８４， ２８９８−９０３， １９９４
【非特許文献１８】
Ａｉｚａｗａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．； Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２， ４８２−７， １９９４
【非特許文献１９】
Ｋａｗａｄａ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．； Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ５， ９０４−１５， １９９９
【非特許文献２０】
Ｓｕｇｉｕｒａ Ｋ． ｅｔ ａｌ． ；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ， １５， ４６１−８， １９９７
【非特許文献２１】
中畑龍俊；臨床病理レビュー， １２２， １０２−９， ２００２
【非特許文献２２】
Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ．； Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２， １３２９−３７， １９９６
【００２０】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べてきたように、造血再構築能を有する造血幹細胞をはじめとするＣＤ３４陽性細胞の増幅は、増幅を行う過程でおこる分化をいかに抑制してＣＤ３４陽性細胞自体の増殖をいかに可能にするかが大きな課題となっている。また生体外で簡便に、かつできる限り短い培養期間で、安定して増幅できる培養法の開発が待たれていた。本発明は、胎盤組織および臍帯組織由来のストローマ細胞を、ヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅に応用したものである。胎盤または臍帯由来のストローマ細胞がＣＤ３４陽性細胞を含めたヒトの造血幹細胞にいかなる作用を及ぼすのかという効果に関しては、これまでに知見がなく、本発明において初めて明らかになった。
すなわち、本発明は、ヒト造血幹及び／または前駆細胞の分化を抑制して短時間に安定して増幅する方法を提供しようとするものである。さらに、本発明は、このような増幅方法によって増幅されたヒト造血幹及び／または前駆細胞、及びこの細胞を用いる細胞治療方法を提供しようとするものである。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ様細胞との共存下において顕著に増殖させることができ、必要に応じて栄養培地中にサイトカインを混合させることで、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞及びＳＲＣを増殖させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２２】
即ち、本発明によればヒト造血幹細胞は、従来ストローマ細胞として用いてきたマウス由来細胞やヒト骨髄由来のストローマ細胞よりも、胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下においてより顕著に増幅することができる。また、必要に応じて１種または２種以上のサイトカインを栄養培地中に混合させることにより、造血幹細胞はさらに自己複製させることができる。
また、造血幹細胞より若干分化段階の進んだ造血前駆細胞群についても同様に増殖を誘導する。
【００２３】
さらに本発明によれば、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ， ＨＬＡ）が適合したストローマ細胞を用いれば、増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増殖した細胞を採取することができ、直接増殖させた細胞を輸注することができるという利点がある。なお、ＣＤ３４陽性細胞としてはこれらの細胞に特に限定される訳ではなく、ＣＤ３４陽性率が弱いものから強い細胞が広範囲で含まれていることが好ましい。また、場合によってはＣＤ３４陽性ではない細胞群であっても、造血幹細胞としての性質、すなわち従来の技術の項で説明したような分化能と自己複製能を兼ね備えた細胞であれば、本発明による造血幹細胞の範疇に入るものと見なすことができる。また純粋な血液細胞のみならずこのような細胞を含む組織であってもよい。
【００２４】
すなわち、本発明は以下の内容から構成される。
（１） ヒト造血幹及び／または前駆細胞を、ヒト胎盤組織または臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養することを特徴とする、ヒト造血幹及び／または前駆細胞の増幅方法。
（２） ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ヒト臍帯血、骨髄、肝臓、脾臓又は末梢血に由来する造血幹及び／または前駆細胞である前記（１）に記載の増幅方法。
（３） ヒト造血幹及び／または前駆細胞が、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹及び／または前駆細胞である前記（１）または（２）に記載の増幅方法。
（４） ヒト造血幹及び／または前駆細胞と、ヒト胎盤組織または臍帯組織のＨＬＡが適合することを特徴とする前記（１）乃至（３）のいずれかに記載の増幅方法。
【００２５】
（５） ヒト造血幹及び／または前駆細胞の培養を、サイトカインの存在下で行うことを特徴とする前記（１）乃至（４）のいずれかに記載の増幅方法。
（６） サイトカインが、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、可溶性インターロイキン―６受容体 （ｓＩＬ−６Ｒ）、インターロイキン―６ （ＩＬ−６）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ）からなる群から選ばれる１種または２種以上のサイトカインであることを特徴とする前記（５）に記載の増幅方法。
【００２６】
（７） 前記（１）乃至（６）のいずれかに記載の増幅方法により増幅されたヒト造血幹及び／または前駆細胞。
（８） 前記（７）に記載のヒト造血幹及び／または前駆細胞をヒトに移植する細胞治療方法。
【００２７】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明に用いられる造血幹細胞とは、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞であり、主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。幹細胞とは、造血幹細胞及びこれから分化したリンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を意味する。これらの細胞はＣＤ３４陽性細胞である。
【００２８】
前駆細胞とは、造血幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないがすでに赤血球系など一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。具体的には血小板コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＭＥＧ）、好酸球コロニー形成細胞（ＥＯ−ＣＦＣ）、顆粒球単球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤血球形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ）、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞などである。これらはいずれもＣＤ３４陽性細胞である。組織とは、特定方向に分化し、同一の機能、形態をもつ細胞集団をいう。
【００２９】
ＣＤ３４陽性細胞とは、抗原表現型の一つであるＣＤ３４を発現している細胞を意味し、具体的には造血幹細胞、ＨＰＰ−ＣＦＣ等の造血幹細胞、リンパ球系幹細胞、骨髄系幹細胞等の幹細胞、Ｔ前駆細胞、Ｂ前駆細胞、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣ、ＣＦＵ−ＧＭ等の前駆細胞がこれに該当する。
【００３０】
ストローマ細胞とは、従来、骨髄、脾臓などに由来する基質細胞または間質細胞を指してきたが、本発明においては、ヒトのＣＤ３４陽性細胞を増殖する能力を有するストローマ細胞として胎盤または臍帯組織由来の細胞を用いることができる。
【００３１】
栄養培地とは、天然培地、半合成培地、合成培地、固形培地、半固形培地、液体培地などが挙げられるが、前述に定義されるＣＤ３４陽性細胞を、自己を含めた増殖、分化、成熟または保存させるために用いられるものであり、通常、細胞培養に用いられるようなものであれば如何なる培地であってもよい。例を挙げると、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ基本培地、または無血清培養用の培地で既に臨床試験にも用いられているＸ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５ （Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社）などを用いることができる。
基本成分としてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
【００３２】
サイトカインとは、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質であって、具体的にはＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７， ＩＬ−１８インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＦＬ（ＦＩＴ‐３リガンド）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）などが挙げられ、好ましくはＦＬ、ＳＣＦ、ｓＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯまたはＴＰＯなどが挙げられる。
【００３３】
コロニーとは、固型培地で１個の細胞から出発してできた可視的な集塊をいう。
【００３４】
分化とは、ここではＣＤによって表される表面抗原分子が変化して、次の段階の細胞になることをいう。具体的には幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−）からリンパ系幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋）または骨髄系幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＣＤ３３＋）のように分化抗原の表原型が変化することをいい、リンパ系幹細胞からＴ前駆細胞またはＢ前駆細胞、骨髄系幹細胞からＢＦＵ−Ｃ、ＣＦＣ−ＭＥＧ、ＥＯ−ＣＦＣまたはＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥからＣＦＵ−Ｅ、Ｔ前駆細胞からＴ細胞、Ｂ前駆細胞からＢ細胞、ＣＦＵ−Ｅから赤血球、ＣＦＣ−ＭＥＧから血小板、ＥＯ−ＣＦＣから好酸化球、ＣＦＵ−ＧＭから単球や好中球または好塩基球になることをいう。
【００３５】
本発明における細胞培養とは、常法に従って、例えば下記のように実施することができる。すなわち培養容器中で、必要に応じてナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有したα−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＭＥＭ基本培地などの栄養培地中あるいはＸ−ＶＩＶＯ１０やＸ−ＶＩＶＯ１５などの培地中に、ストローマ細胞の存在下、必要に応じて５ｎｇ／ｍｌ乃至２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ乃至１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７， ＩＬ−１８， ＩＦＮ−α， ＩＦＮ−β， ＩＦＮ−γ， Ｇ−ＣＳＦ， ＧＭ−ＣＳＦ， ＳＣＦ， ＦＬ， ＥＰＯ， ＴＰＯなどのサイトカイン の存在下、ＣＤ３４陽性細胞を播種し、３０℃乃至４０℃、好ましくは３７℃で培養できる。培養期間は、数時間レベルの短期間のものから、おおよそ１年間にわたって行うような長期間のものまでを挙げることができる。長期間の場合は、定期的な培地交換を行い、温度、湿度、二酸化炭素濃度等をモニタリングして培養維持することにより、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞を増殖させることが可能である。
【００３６】
本発明による細胞培養に用いる培養容器には、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材・形状のものを用いてもよい。例えば、支持台の素材としては具体的にはガラス、合成樹脂、天然樹脂または金属などが挙げられる。培養容器はまた、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる素材、形状のものを用いてもよい。具体的には培養容器の素材としてはガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂、または金属などが挙げられ、形状としては具体的には三角柱、立方体、直方体などの多角柱、三角錐、四角錐などの多角錘、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形などが挙げられる。培養は開放条件下であってもよいし、閉鎖（密閉）条件下であってもよい。
【００３７】
培養液（培地）については、ストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞および前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる培養液（培地）を用いることができる。培養するにあたり、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、酸素、炭酸ガス、ｐＨ、酸化還元電位などの化学的環境条件としてはストローマ細胞が維持・生存でき、ＣＤ３４陽性細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ如何なる環境条件であってもよい。温度については具体的には、３０℃乃至４０℃であり、好ましくは３７℃である。
【００３８】
浸透圧については、具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。光としては暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。酸素濃度としては具体的には培養系が気相中の酸素濃度が１０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度乃至気相中の酸素濃度が３０％の気相と接触している状態での酸素濃度であってもよく、好ましくは気相中の酸素濃度が２０％の気相と接触している状態での溶存酸素濃度の気相と接触している状態での酸素濃度である。培養系において一般的にｐＨをコントロールするためのｐＨとして具体的にはｐＨ６．０乃至ｐＨ８．０であり、好ましくは生理条件と同等のｐＨである。ｐＨをコントロールする為には二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。炭酸ガスの濃度としては具体的には培養系が５％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００３９】
さらに、培養容器中の培地（培養液）には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖または目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。ストローマ細胞、哺乳動物から採取したＣＤ３４陽性細胞（好ましくはヒト由来のＣＤ３４陽性細胞）または培養し増殖したＣＤ３４陽性細胞を保存（長期間も含む）する場合、通常の方法を用いることができる。保存の方法としては例えば凍結保存法が挙げられ、この場合必要に応じてグリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、蔗糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの凍結防御剤を加え、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素などの中に保存すればよい。
【００４０】
これまでＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を移植するにあたっては、増殖に用いた第２の細胞、具体的にはストローマ細胞が、従来の異種動物由来である場合あるいは同種の動物の場合であっても別の個体や株化した細胞を用いる場合には増殖後のレシピエントの生体内で免疫反応が起こる可能性があるため、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞を分離し、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞のみを移植に用いることが必要とされてきた。しかしながら、本発明による培養による増幅法を用いれば、ストローマ細胞とＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞が両者ともヒト由来であり、互いの細胞の分離・精製に必要がなくなり、ＣＤ３４陽性細胞を含む造血幹細胞の移植が素早くしかも安全に行うことができる。さらに同一の組織すなわち胎盤組織から採取したストローマ細胞と臍帯血を用いた培養を行う場合は、ＨＬＡが一致した条件となるため、より効率よく造血幹細胞および前駆細胞を増幅することができる。
また、本発明による胎盤および臍帯組織由来の造血ストローマ細胞を用いれば、造血幹細胞だけではなく、肝臓、すい臓、および腎臓を構成しうる幹細胞も増殖することができることを発見した。
【００４１】
【発明の実施の形態】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を具体的に説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００４２】
【実施例１】
ヒト胎盤からの造血ストローマ細胞の分離回収
東京臍帯血バンクにおいて、臍帯血採取後の胎盤を、インフォームドコンセントを得た後入手した。全て３８週から４０週までの正期産で、重量は４２０から６３０ｇ（中央値５５２ｇ）であった。搬送は氷冷にて行い、４８時間以内に細胞採取を開始した。採取は胎盤切片からのｏｕｔｇｒｏｗｔｈを利用したエクスプラント法を用いて行った。すなわち、胎盤から臍帯と羊膜を除去した後、母体側からハサミで組織を採取した。
さらにメスで１ｍｍ角に細切した後、カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝液［ＰＢＳ（−）］で血液を可及的に除いた。このようにして１個の胎盤より２００から３００ｇの胎盤切片が採取できた。これら組織切片を培養皿に張り付け、クリーンベンチ内で１５−３０分間放置した後、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ， ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ， Ｓｉｇｍａ）＋１０％ＦＢＳを加え１０日から１４日培養した後回収した。
【００４３】
【実施例２】
ヒト臍帯血からの ＣＤ３４ 陽性細胞の採取及び調製
ヒト臍帯血は、東京臍帯血バンクにおいてに充分なインフォームドコンセントを行なった上で、バンク指定病院より採取されたものを入手した。臍帯血液サンプルは、採取後、４℃に保存し、４８時間内にファイコールパックを用いて単核細胞を回収した。次に、臍帯血単核細胞をＣＤ３４ ｓｅｐａｒｅｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて、ＡｕｔｏＭＡＣＳ （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）によりＣＤ３４陽性細胞を分画した。
【００４４】
【実施例３】
臍帯血 ＣＤ３４ 陽性細胞と胎盤由来造血ストローマ細胞との共培養
実施例２で得られた臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（５ｘ１０３細胞／ｍｌ）を２４ウェ ル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各々のウェル中に １％ ＢＳＡを添加したＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）を１ｍｌを加え、さらにサイトカイン（ｒｈ−ＩＬ−６及びＳＣＦ）の存在下において、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で実施例１で得られたヒト胎盤由来造血ストローマ細胞と共培養した。培養１０日後、ピペッティングにより細胞を回収し、遠心分離して培養細胞を採取して増殖能の解析を行った。
【００４５】
【実施例４】
臍帯血 ＣＤ３４ 陽性細胞の増幅能の解析
実施例３の培養細胞の増殖能の解析は以下の手法により行った。すなわち、市販の半固形のＭｅｔｈｏｃｕｌｔ ＧＦ Ｈ４４３４Ｖ （Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製、０．９％Ｉｓｃｏｖｅメチルセルロース、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、３Ｕ／ｍｌエリスロポエチン、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＳＣ Ｆ、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−Ｇ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＬ−６を含有している）培地を用いて、培養後の前記臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、二次培養として、３７℃、５％二酸化炭素雰囲気下で１４日および２１日培養して、培地中に形成されたＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭからなる赤血球系コロニー、ＣＦＵ−ＧＭコロニー及び直径 １．０ｍｍ以上の大きさのＨＰＰ−ＣＦＣコロニーの数を測定し、造血幹細胞及び前駆細胞の数を測定した。ＨＰＰ−ＣＦＣコロニーは、さらに直径１．０−２．５ｍｍの小型ＨＰＰ−ＣＦＣ、直径が２．５ｍｍより大きい大型ＨＰＰ−ＣＦＣとして算定した。
【００４６】
増幅率は、培養前の臍帯血ＣＤ３４陽性細胞の半固形培地中でのコロニー形成数に対する培養細胞のコロニー形成数の割合を百分率で示した。対照として、胎盤細胞と共培養しない臍帯血ＣＤ３４陽性細胞を用いた。
小型および大型ＨＰＰ−ＣＦＣコロニー数の増幅率、ＣＦＵ−ＧＭのコロニー数の増幅率、赤血球系コロニーのコロニー数の増幅率を調べた結果、大型および小型ＨＰＰ−ＣＦＣのコロニー数と、赤血球系コロニー、ＣＦＵ−ＧＭコロニーの増幅率においては、何れにおいても、胎盤由来細胞の存在下での培養細胞の方が、非存在下での培養細胞よりも著しい増幅効果がみられた。
【００４７】
【発明の効果】
従来、臍帯血は採取量が限られているため、４０ ｋｇ以下の個体にしか移植が困難であるなど、実際に臍帯血幹細胞移植が骨髄移植に代わりうる様になるためには解決すべき点は多かった。しかしながら、本発明の方法を用いれば、ヒトＣＤ３４陽性幹細胞を簡便にしかも安全に増幅することが可能であることから、任意の成人患者にも移植できる上に、数回にわたる継続投与が可能となる。臍帯血を一度採取しておけば必要なときに必要な量だけ造血幹細胞を供給することができる。
【００４８】
また本発明によれば、骨髄移植においても大量の骨髄細胞を必要とせず、 しかも骨髄の採取に伴うドナーの心身への負担や安全性の問題などを回避することができる。また、造血幹細胞を自己増殖させることにより、急性白血病をはじめとする腫瘍性疾患や重症免疫不全、先天性酵素異常症、再生不良性貧血などの疾患に対し必要最小限の造血幹細胞の採取で治療できると共に、出産に伴って世界中で廃棄されている臍帯血を有効に活用し、幅の広い移植抗原を有する造血幹細胞を保有することによって移植抗原の適合する移植を可能とするため重症の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを極めて軽減することができる。
【００４９】
臍帯血幹細胞を保存する場合、本発明を用いれば、効率的な保存が可能であると共に、保存量の大幅な減少につながり、また一度採取した血液を登録しておくことでより効率的な造血幹細胞バンクを構築することができる。
さらに、増殖した細胞を凍結保存などの長期保存を行うことにより、必要なときに必要とされる移植抗原を有するＣＤ ３４陽性細胞を素早く使用することができる。
さらに本発明によれば、臍帯血由来の造血幹細胞を増幅する際に、同一の胎盤から単離したＨＬＡが適合したストローマ細胞を用いれば、増幅後もストローマ細胞を分離する必要がなく、極めて容易に増殖した細胞を採取することができ、直接増殖させた細胞を輸注することができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for amplifying human hematopoietic stem and progenitor cells including CD34 positive cells, characterized by using cells having hematopoietic support ability derived from human placenta tissue and umbilical cord tissue. More specifically, the hematopoietic stem and / or progenitor cells in various nutrient media containing or not containing cytokines in the presence of hematopoietic support cells derived from human placenta and umbilical cord tissue and the human hematopoietic stem and / or progenitor cells. The present invention relates to a proliferation method, a human hematopoietic stem and / or progenitor cell obtained by the amplification method, and a cell therapy method using the hematopoietic stem and / or progenitor cell.
[0002]
[Prior art]
In the blood, the erythroid system involved in oxygen transport as a blood cell that controls biological functions, the megakaryocyte system that produces platelets, the granulocyte, monocyte and / or macrophage involved in the defense of infection, and in charge of immunity There are lymphocyte lineages such as T cells and B cells. All cells of blood cells are maintained and produced throughout life by differentiation and maturation from hematopoietic stem cells, which are common origins. Hematopoietic stem cells combine pluripotency that can differentiate into functional cells such as lymphocytes, erythrocytes, and platelets, and the ability to self-proliferate while maintaining such pluripotency (self-replicating ability). Self-replicates so that hematopoietic stem cells are not depleted, and differentiates and matures into various blood cells. From many studies so far, the process of differentiation of hematopoietic stem cells into various blood cells is directed to differentiation into each blood cell lineage by multi-stage differentiation determination.
[0003]
Hematopoietic stem cells are first oriented into two lineages, myeloid and lymphoid, and differentiate into myeloid stem cells (CFU-GEMM) and lymphoid stem cells, respectively, and the myeloid stem cells are erythrocyte burst-forming cells (BFU-E). ), CFU-E, red blood cells, megakaryocyte colony forming cells (CFC-MEG), neutrophils, eosinophil colony forming cells (EO-CFC), eosinophils, granulocytes / macrophage colonies Monocytes, neutrophils, and basophils are transformed through forming cells (CFU-GM), and lymphocyte stem cells are transformed into T cells via T precursor cells and B cells through B precursor cells. As a method for identifying myeloid stem cells and various progenitor cells derived therefrom, a so-called colony formation method is known in which these cells are identified by the properties of colonies formed in a semi-solid medium in the presence of various cytokines. By this method, granulocytes, erythrocytes, monocytes, megakaryocytes colony forming cells (CFU-GEMM) which are myeloid stem cells and granulocytes / macrophage colony forming cells (CFU-GM) which are progenitors, erythrocyte burst It is possible to identify myeloid progenitor cells such as forming cells (BFU-E), megakaryocyte colony forming cells (CFU-MEG), and eosinophil colony forming cells (EO-CFC) (Non-patent Document 1). ).
[0004]
In humans, since progenitor cells that form colonies in vitro are concentrated in a cell population that expresses the CD34 molecule that is a cell surface antigen (Non-patent Document 2), Berenson et al. Attempts were made to transplant CD34 positive cells into cancer patients, and the hematopoietic system was reconstructed, and it was clinically recognized that hematopoietic stem cells having hematopoietic potential were included in the population of CD34 positive cells (non-) Patent Document 3). On the other hand, it has been clarified that hematopoietic stem cells are mainly present in bone marrow, umbilical cord blood and the like, and are also present in peripheral blood (Non-patent Document 4). Although many researchers have attempted to isolate hematopoietic stem cells from the living body as uniform cells in order to clarify the substance of hematopoietic stem cells, they are still unsuccessful. Hematopoietic stem cells have “hematopoietic remodeling ability” that can reconstruct all blood cell lineages that should be produced in an individual when transplanted to an individual who has completely killed blood cells containing hematopoietic stem cells by irradiation. It is said that it is an essential condition.
[0005]
Hematopoietic stem cells with the ability to reconstruct hematopoiesis can be established in the bone marrow of donors (donors) to recipients (recipients) by transplanting bone marrow transplantation treatments into the bone marrow of donors (donors) to recipients (recipients). It was thought that various related diseases could be cured. Although it was initially an experimental treatment, it is now an established treatment. Currently, bone marrow transplantation is being performed for neoplastic blood diseases including acute leukemia, diseases such as severe immunodeficiency, adenosine deaminase deficiency, and aplastic anemia. Furthermore, as it becomes clear that these hematopoietic stem cells are also present in peripheral blood in a small amount, transplantation using peripheral blood containing hematopoietic stem cells by administering a granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) preparation has become widespread. (Non-Patent Documents 5 and 6). In this method, bone marrow transplantation requires a large amount of bone marrow cells, so the burden on the mind and body of the donor is large. On the other hand, the burden on the mind and body of the donor is reduced, and the recovery of white blood cells and platelets is fast. There are advantages.
[0006]
Recently, it has been clarified that umbilical cord blood contains hematopoietic stem cells of the same level as bone marrow, which has proved useful for transplantation treatment (Non-patent Document 7). Umbilical cord blood has a lower incidence of severe acute graft-versus-host disease (GVHD) than bone marrow and peripheral blood, and its usefulness is expected. However, in the case of umbilical cord blood, a small amount of collection is a problem, and it is considered that umbilical cord blood derived from one individual can be transplanted only to a recipient weighing up to about 40 kg (Non-patent Document 4). In bone marrow transplantation, the onset of GVHD due to contamination of donor-derived T cells and recurrence due to contamination of cancer cells during autotransplantation are problematic (Non-patent Document 8).
[0007]
On the other hand, since hematopoietic stem cells can be concentrated as a CD34-positive cell population as described above, unnecessary cells may be removed. Therefore, CD34-positive stem cell transplantation is now performed. (Non-patent documents 3, 9). Along with such progress, in order to increase the certainty of transplantation treatment and perform more efficient implementation of a hematopoietic stem cell bank derived from a large number of donors is becoming an urgent task (Non-patent Document 10). At the same time, attempts have been made to efficiently amplify such hematopoietic stem cells (Non-patent Document 4). Similarly, umbilical cord blood containing a lot of juvenile hematopoietic stem cells is also expected to be applied for transplantation. However, as described above, a system for amplifying hematopoietic stem cells is expected due to the small amount of collection (as described above). Patent Document 4).
Thus, the construction of a system that can stably and reliably obtain hematopoietic stem cells is a life-related problem for patients with the above-mentioned refractory blood diseases that have no treatment other than transplantation, and is an important social issue. It can be said that there is.
[0008]
Hematopoietic stem cells and various progenitor cells derived from these hematopoietic stem cells have been shown to be contained in the CD34 positive cell population, and are therefore suitable for separation and enrichment and used as starting materials for amplification (Non-Patent Document 4). These CD34 positive cells are present in 1 to 2% in blood cells of bone marrow and cord blood. Separation of CD34 positive cells is based on the basic principle of recovering positive cells that are reactive with antibodies that recognize CD34 molecules on the cell surface. The CD34 antibody is labeled with biotin or magnetic beads and reacted with a group of cells to be separated, and then the CD34 positive cells are collected with avidin beads or magnets, respectively, or the cells are put into a culture apparatus coated with CD34 antibody. A method of recovering CD34-positive cells after removing unreacted cells is often used, and any method can recover CD34-positive cells having no qualitative difference (Non-patent Documents 11 and 12). . In clinical practice, a device using a magnetically labeled CD34 antibody and a magnet has been developed, and in Japan, it is certified as a rare disease treatment device by the Pharmaceutical Council.
[0009]
Amplification of CD34 positive cells is generally performed in liquid culture, but since specific growth factors for individual hematopoietic stem cells and progenitor cells have not been clarified, a combination of various cytokines acting on each blood cell is used. Many reports have been made so far (Non-patent Document 13). In the amplification of CD34 positive cells by the combination of cytokines, the number of whole blood cells after culture increases, but differentiation induction is promoted during the culture, and as a result, the number of terminally differentiated blood cells increases, which is the source of amplification. It is known that CD34 positive cells themselves tend to be almost depleted (Non-patent Document 4). In the amplification of CD34 positive cells reported so far, amplification of CFU-GM which is a progenitor cell is often used as an index.
[0010]
For example, Haylock et al. Cultured peripheral blood CD34 positive cells for 14 days in the presence of interleukin 1β (IL-1β) and IL-3, IL-6, GM-CSF, G-CSF, SCF, and CFU- It has been reported that GM was amplified 20-60 times (Non-Patent Document 14). There is also a report that CD34 positive cells were cultured in the presence of IL-3, IL-6, SCF, G-CSF, and GM-CSF for 7 days to amplify CFU-GM 57 times (Non-patent Document 15). . Also, amplification of CFU-GEMM, which is a myeloid stem cell, has been reported, and Bragger et al. Cultured peripheral blood CD34-positive cells in IL-1β, IL-3, IL-6, interferon γ (IFNγ), EPO for 12 days. And CFU-GEMM was amplified 250 times (nonpatent literature 16). There is also a report that CFU-GEMM can be amplified by culturing with SCF, IL-6, and sIL-6R (Patent Document 1).
[0011]
In the above reports, because CFU-GM, which is a progenitor cell whose orientation to a specific cell lineage has already been determined, and myeloid stem cells (CFU-GEMM) that have already differentiated but are hematopoietic stem cells, The amplification of hematopoietic stem cells having hematopoietic remodeling ability was difficult to say. Therefore, an analysis using an evaluation method for detecting cells (LTC-IC) that enables long-term culture as an identification method of cells closer to hematopoietic stem cells than CFU-GEMM has been attempted. As a result, no significant amplification was observed as in CFU-GM (Non-Patent Documents 16 and 17).
[0012]
On the other hand, as a method for amplifying CD34-positive cells, a method has been attempted in which human bone marrow-derived stromal cells are stocked and hematopoietic stem cells / progenitor cells are maintained and proliferated using these cells as a support (Non-patent Document 18). In addition, a method using stromal cells derived from heterogeneous animals such as mouse-derived cells HESS-5 has also been attempted (Non-patent Document 19, Patent Document 2). Although stromal cells are thought to play an important role in the maintenance of hematopoietic stem cells, the interaction with actual hematopoietic stem cells is not well understood. Sugiura et al. Conducted research focusing on the interaction between stromal cells and hematopoietic stem cells. As a result, it was important to match the major histocompatibility complex (MHC), that is, HLA in humans. (Non-patent Document 20).
[0013]
In addition, when heterologous animal-derived cells are used as stromal cells, there is a risk that an immune reaction will occur in the recipient's living body after growth. Therefore, stromal cells and CD34-positive cells are completely separated, and only CD34-positive cells are isolated. Must be transplanted. Furthermore, when there is an unknown pathogen derived from a different animal, there is a problem that its existence cannot be confirmed. In this regard, the Ministry of Health, Labor and Welfare notified each prefecture on July 9, 2002, about guidelines on infectious diseases associated with xenotransplantation. The guidelines have been prepared in response to the risk of xenotransplantation, in which the risk of xenotransplantation inducing unknown infections, such as human infection with porcine endogenous retroviruses. Even in the method of amplifying hematopoietic cells using stroma derived from a heterologous animal, there are also devices that acquire infectivity by culturing pathogens such as viruses that have not been infected with humans or by being transplanted directly into humans. It has been pointed out and careful examination is necessary for clinical application (Non-patent Document 21).
[0014]
Patent Document 3 describes that proliferation of CD34 positive cells is observed in the presence of some stromal cells and leukemia inhibitory factor (LIF) as essential cytokines and coexistence with several other cytokines. . However, the culture period is as long as several weeks, and it is considered difficult to use in clinical practice.
[0015]
In recent years, human hematopoietic stem cells have become established in NOD / SCID mice produced by combining diabetic mice and immunodeficient mice as a means to experimentally verify the bone marrow remodeling ability of human hematopoietic stem cells. As a result, it has become clear that a method for examining the presence of hematopoietic stem cells having bone marrow remodeling ability has been found (Non-patent Document 22). Cells measured by this method are called SCID-repopulating cells (SRC), and are considered to be the closest cells to human hematopoietic stem cells that can be measured at the present time. How can SRC be amplified? It has become the focus of stem cell amplification research.
[0016]
As described above, the construction of an amplification system for hematopoietic stem cells has many problems. Moreover, it is a life-related problem for patients with the above-mentioned refractory blood disease who have no treatment other than transplantation, and can be said to be an important social issue. In addition, a method that can be simply and stably amplified more efficiently is desired, and such a system would be useful for clinical use such as transplantation.
[0017]
[Patent Document 1]
International Publication No. 96/15230 Pamphlet
[Patent Document 2]
JP-A-10-295369
[Patent Document 3]
JP-A-7-5043317
[0018]
[Non-Patent Document 1]
Lu, L.L. et al. Exp. Hematol. , 11, 721-9, 1983
[Non-Patent Document 2]
Ema, H.M. et al. Blood, 75, 1941-6, 1990
[Non-Patent Document 3]
Berenson, R.A. J. et al. et al. Blood, 77, 1717-22, 1991
[Non-Patent Document 4]
Emerson, S.M. G. et al. Blood, 87, 3082-8, 1996;
[Non-Patent Document 5]
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[Non-Patent Document 6]
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Brenner, M.M. K. et al. Lancet, 341, 85-6, 1993
[Non-patent document 9]
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[Non-Patent Document 11]
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[0019]
[Non-Patent Document 12]
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[Non-Patent Document 13]
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Sugiura K.M. et al. Stem Cells, 15, 461-8, 1997
[Non-patent document 21]
Nakabata Tatsutoshi; Clinical Pathology Review, 122, 102-9, 2002
[Non-Patent Document 22]
Larochel, A.M. et al. Nat. Med. , 2, 1329-37, 1996
[0020]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, the amplification of CD34 positive cells including hematopoietic stem cells having hematopoietic remodeling ability suppresses the differentiation that occurs during the amplification process, and enables the proliferation of CD34 positive cells themselves. Has become a major issue. In addition, development of a culture method capable of amplifying stably and conveniently in vitro and in as short a culture period as possible has been awaited. In the present invention, stromal cells derived from placental tissue and umbilical cord tissue are applied to the amplification of human CD34 positive cells. The effect of placental or umbilical cord-derived stromal cells on human hematopoietic stem cells including CD34-positive cells has not been known so far and has been clarified for the first time in the present invention.
That is, the present invention intends to provide a method for stably amplifying in a short time by suppressing the differentiation of human hematopoietic stem and / or progenitor cells. Furthermore, the present invention intends to provide a human hematopoietic stem and / or progenitor cell amplified by such an amplification method, and a cell therapy method using this cell.
[0021]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors can proliferate hematopoietic stem cells containing CD34-positive cells in the presence of stromal cells derived from human placenta tissue or umbilical cord tissue. It was found that hematopoietic stem cells and SRCs containing CD34-positive cells can be proliferated by mixing cytokines in a nutrient medium as necessary, and the present invention has been completed.
[0022]
That is, according to the present invention, human hematopoietic stem cells are more significantly amplified in the presence of stromal cells derived from placental tissue or umbilical cord tissue than mouse-derived cells or human bone marrow-derived stromal cells conventionally used as stromal cells. be able to. In addition, hematopoietic stem cells can be further self-replicated by mixing one or more cytokines in the nutrient medium as necessary.
Moreover, proliferation is similarly induced in the hematopoietic progenitor cell group that is slightly differentiated from the hematopoietic stem cell.
[0023]
Further, according to the present invention, when stromal cells adapted to human leukocyte antigen (HLA) isolated from the same placenta are used when amplifying umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells, stromal cells are also amplified after amplification. Therefore, there is an advantage that cells proliferated can be collected very easily, and directly proliferated cells can be transfused. The CD34-positive cells are not particularly limited to these cells, and it is preferable that cells having a low CD34-positive rate to strong cells are included in a wide range. Further, according to the present invention, even if it is a cell group that is not CD34 positive in some cases, as long as it has the characteristics as a hematopoietic stem cell, that is, a cell having both differentiation ability and self-replication ability as described in the section of the prior art, It can be regarded as falling within the category of hematopoietic stem cells. Moreover, not only a pure blood cell but the structure | tissue containing such a cell may be sufficient.
[0024]
That is, the present invention comprises the following contents.
(1) A method for amplifying human hematopoietic stem and / or progenitor cells, comprising culturing human hematopoietic stem and / or progenitor cells in the presence of stromal cells derived from human placenta tissue or umbilical cord tissue.
(2) The amplification method according to (1), wherein the human hematopoietic stem and / or progenitor cell is a hematopoietic stem and / or progenitor cell derived from human umbilical cord blood, bone marrow, liver, spleen, or peripheral blood.
(3) The amplification method according to (1) or (2), wherein the human hematopoietic stem and / or progenitor cell is a hematopoietic stem and / or progenitor cell containing CD34 positive cells.
(4) The amplification method according to any one of (1) to (3), wherein human hematopoietic stem and / or progenitor cells are compatible with HLA of human placental tissue or umbilical cord tissue.
[0025]
(5) The amplification method according to any one of (1) to (4), wherein the human hematopoietic stem and / or progenitor cell is cultured in the presence of a cytokine.
(6) Cytokines are Flt-3 ligand (FL), stem cell factor (SCF), soluble interleukin-6 receptor (sIL-6R), interleukin-6 (IL-6), granulocyte colony stimulating factor (G -CSF), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), erythropoietin (EPO) and thrombopoietin (TPO), which is one or more cytokines (5) ) Amplification method.
[0026]
(7) A human hematopoietic stem and / or progenitor cell amplified by the amplification method according to any one of (1) to (6).
(8) A cell therapy method for transplanting the human hematopoietic stem and / or progenitor cell according to (7) above to a human.
[0027]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The hematopoietic stem cell used in the present invention is a cell having the ability to differentiate into all kinds of blood cells and having the ability to reconstruct hematopoiesis, and is mainly present in bone marrow, umbilical cord blood, spleen or liver, and a small amount of peripheral blood. Also exists. Stem cells mean hematopoietic stem cells, and lymphoid stem cells and myeloid stem cells (CFU-GEMM) differentiated therefrom. These cells are CD34 positive cells.
[0028]
A progenitor cell means a cell that can not be differentiated from a hematopoietic stem cell from each hematopoietic stem cell, but can only differentiate into a unidirectional blood cell such as erythroid. Specifically, platelet colony forming cells (CFC-MEG), eosinophil colony forming cells (EO-CFC), granulocyte monocyte colony forming cells (CFU-GM), erythropoiesis cells (BFU-E, CFU-E). ), T precursor cells, B precursor cells, and the like. These are all CD34 positive cells. A tissue refers to a cell population that differentiates in a specific direction and has the same function and morphology.
[0029]
CD34 positive cells mean cells expressing CD34, which is one of the antigen phenotypes, specifically hematopoietic stem cells, hematopoietic stem cells such as HPP-CFC, lymphocyte stem cells, myeloid stem cells, etc. This includes precursor cells such as stem cells, T precursor cells, B precursor cells, BFU-E, CFU-E, CFU-MEG, EO-CFC, and CFU-GM.
[0030]
The stromal cell has been conventionally referred to a matrix cell or stromal cell derived from bone marrow, spleen, etc. In the present invention, it is derived from placenta or umbilical cord tissue as a stromal cell having the ability to proliferate human CD34 positive cells. Cells can be used.
[0031]
The nutrient medium includes a natural medium, a semi-synthetic medium, a synthetic medium, a solid medium, a semi-solid medium, a liquid medium, etc., and CD34 positive cells as defined above can be grown, differentiated, matured or self-included. Any medium may be used as long as it is used for storage and is usually used for cell culture. For example, α-MEM medium, RPMI-1640 medium, MEM basic medium, or medium for serum-free culture, such as X-VIVO10 and X-VIVO15 (Bio Whittaker) already used in clinical trials. Can be used.
As basic components, sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acids, vitamins, hormones, antibiotics, fatty acids, sugars, or other chemical components or biological components such as serum may be contained depending on the purpose.
[0032]
Cytokines are protein factors that are released from cells and mediate cell-cell interactions, and are substances that control immune responses, have antitumor effects, antiviral effects, regulate cell proliferation / differentiation, etc. Specifically, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 interferon α (IFN-α), interferon β (IFN-β), interferon γ (IFN-γ), G -CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor), SCF (stem cell factor), FL (FIT-3 ligand), EPO (erythropoietin), TPO (Throne) Poechin) and the like, preferably FL, SCF, sIL-6R, IL-6, G-CSF, GM-CSF, etc. EPO or TPO, and the like.
[0033]
A colony refers to a visible clump formed from a single cell in a solid medium.
[0034]
Differentiation here means that the surface antigen molecule represented by CD changes to become the next stage cell. Specifically, it refers to a change in the epigenetic type of a differentiation antigen such as a stem cell (CD34 + CD38−) to a lymphoid stem cell (CD34 + CD38 +) or a myeloid stem cell (CD34 + CD38 + CD33 +). Myeloid stem cells to BFU-C, CFC-MEG, EO-CFC or CFU-GM, BFU-E to CFU-E, T precursor cells to T cells, B precursor cells to B cells, CFU-E to red blood cells, CFC- It means that MEG becomes platelets, EO-CFC becomes eosinophils, and CFU-GM becomes monocytes, neutrophils, or basophils.
[0035]
Cell culture in the present invention can be carried out according to a conventional method, for example, as follows. That is, in the culture vessel, if necessary, biological components such as sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acids, vitamins, hormones, antibiotics, fatty acids, sugars or other chemical components or serum as required In a nutrient medium such as α-MEM medium, RPMI-1640 medium or MEM basal medium, or medium such as X-VIVO10 or X-VIVO15 in the presence of stromal cells, as needed, from 5 ng / ml to 200 ng IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 at a concentration of 10 ng / ml, preferably 10 ng / ml to 100 ng / ml IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 , IFN-α, IFN-β, IFN-γ, G-CSF, GM-CSF, SCF, FL, EPO, TPO and the like, seeded with CD34 positive cells, preferably 30 ° C to 40 ° C, preferably Incubate at 37 ° C. The culture period can range from a short period of several hours to a long period of time over approximately one year. In the case of long-term, hematopoietic stem cells and progenitor cells including CD34 positive cells can be proliferated by periodically changing the medium, monitoring the temperature, humidity, carbon dioxide concentration, etc. and maintaining the culture. .
[0036]
The culture vessel used for cell culture according to the present invention may be of any material and shape as long as hematopoietic stem cells and progenitor cells including CD34 positive cells do not inhibit maintenance, survival, differentiation, maturation or self-replication. It may be used. For example, specific examples of the material for the support table include glass, synthetic resin, natural resin, and metal. The culture vessel can also be of any material and shape as long as it can maintain and survive stromal cells and does not inhibit hematopoietic stem and progenitor cells, including CD34 positive cells, from maintaining, surviving, differentiating, maturing or self-replicating. May be used. Specific examples of the culture vessel material include glass, synthetic resin including nonwoven fabric, natural resin, and metal. Specific examples of the shape include a triangular prism, a cube, a rectangular parallelepiped, a triangular pyramid, and a quadrangular pyramid. And any shape such as a gourd, a sphere, a hemisphere, a circle, an ellipse, and a semicircle. Cultivation may be under open conditions or under closed (sealed) conditions.
[0037]
Any culture solution (medium) can be used as long as it can maintain and survive stromal cells and does not inhibit hematopoietic stem cells and progenitor cells including CD34 positive cells from maintaining, survival, differentiation, maturation, and self-replication. (Medium) can be used. In culturing, stromal cells can be maintained and survived, and physical environment conditions such as temperature, osmotic pressure, and light, and chemical environmental conditions such as oxygen, carbon dioxide, pH, and oxidation-reduction potential, and CD34 positive cells can be maintained and survived. Any environmental condition is acceptable as long as it does not inhibit differentiation, maturation or self-replication. Specifically, the temperature is 30 ° C. to 40 ° C., preferably 37 ° C.
[0038]
The osmotic pressure is specifically an osmotic pressure under physiological conditions, and preferably an osmotic pressure equal to that of physiological saline. The light may be as dark as a dark room, or as bright as the brightness outside in sunny weather. Specifically, as the oxygen concentration, the culture system is in contact with the gas phase having a dissolved oxygen concentration in the state where the oxygen concentration in the gas phase is 10% or from the gas phase having an oxygen concentration in the gas phase of 30%. The oxygen concentration may be the oxygen concentration in a state of being in contact with the gas phase, preferably in the state of being in contact with the gas phase having a concentration of oxygen in the gas phase of 20%. Concentration. In general, the pH for controlling the pH in the culture system is specifically pH 6.0 to pH 8.0, preferably the pH equivalent to physiological conditions. Carbon dioxide may be used to control the pH, or any other buffer may be used. Specifically, the concentration of carbon dioxide is the concentration of dissolved carbon dioxide in a state where the culture system is in contact with the 5% gas phase.
[0039]
In addition, the culture medium (culture solution) in the culture container contains inorganic substances such as sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, amino acids, vitamins, hormones, antibiotics, cytokines, fatty acids, sugars or other depending on the purpose. It can also contain biological components such as chemical components or serum. When storing stromal cells, CD34-positive cells collected from mammals (preferably human-derived CD34-positive cells) or cultured and expanded CD34-positive cells (including long-term), ordinary methods can be used. Examples of the storage method include a cryopreservation method. In this case, a cryoprotectant such as glycerin, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), sucrose, glucose, polyvinylpyrrolidone (PVP) is added as necessary, and a program freezer, etc. Can be frozen slowly and then stored in liquid nitrogen or the like.
[0040]
Until now, when transplanting hematopoietic stem cells containing CD34 positive cells, even if the second cell used for proliferation, specifically the stromal cell, is derived from a conventional heterogeneous animal or the same species of animal, When another individual or established cell line is used, an immune reaction may occur in the recipient's living body after growth. Therefore, hematopoietic stem cells containing stromal cells and CD34 positive cells are isolated, and CD34 positive cells are isolated. Only hematopoietic stem cells containing it have been required to be used for transplantation. However, if the amplification method by culture according to the present invention is used, hematopoietic stem cells containing stromal cells and CD34-positive cells are both derived from humans and are no longer necessary for the separation and purification of each other, and hematopoietic stem cells containing CD34-positive cells. Transplantation can be done quickly and safely. Furthermore, when culturing using stromal cells collected from the same tissue, that is, placental tissue, and umbilical cord blood, the conditions are matched with HLA, so that hematopoietic stem cells and progenitor cells can be amplified more efficiently.
Further, it has been discovered that by using the hematopoietic stromal cells derived from placenta and umbilical cord tissue according to the present invention, not only hematopoietic stem cells but also stem cells that can constitute the liver, pancreas, and kidney can be proliferated.
[0041]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the technical scope of the present invention.
[0042]
[Example 1]
Isolation and recovery of hematopoietic stromal cells from human placenta
In Tokyo umbilical cord blood bank, the placenta after umbilical cord blood collection was obtained after obtaining informed consent. All were full-term products from 38 to 40 weeks and weighed 420 to 630 g (median 552 g). The transfer was performed on ice and cell collection was started within 48 hours. Collection was performed using the explant method using outgrowth from placenta sections. That is, after removing the umbilical cord and amniotic membrane from the placenta, the tissue was collected from the maternal side with scissors.
After further chopping into 1 mm squares with a scalpel, blood was removed as much as possible with a calcium and magnesium-free phosphate buffer [PBS (−)]. In this way, a placenta section of 200 to 300 g could be collected from one placenta. After these tissue sections were attached to a culture dish and allowed to stand for 15-30 minutes in a clean bench, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, low glucose, Sigma) + 10% FBS was added and cultured for 10 to 14 days. It was collected.
[0043]
[Example 2]
From human umbilical cord blood CD34 Collection and preparation of positive cells
Human umbilical cord blood was collected from a bank-designated hospital after sufficient informed consent was given to the Tokyo umbilical cord blood bank. The umbilical cord blood sample was stored at 4 ° C. after collection, and mononuclear cells were collected within 48 hours using a Ficoll pack. Next, umbilical cord blood mononuclear cells were fractionated from CD34 positive cells by AutoMACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) using CD34 separation kit.
[0044]
[Example 3]
Cord blood CD34 Co-culture of positive cells and placenta-derived hematopoietic stromal cells
Cord blood-derived CD34-positive cells obtained in Example 2 (5 × 10 531 ml of X-VIVO15 medium (Biowhittaker, Walkersville, MD) supplemented with 1% BSA was added to each well of a 24-well tissue culture plate (Falcon), and a cytokine (rh-IL) was added. −6 and SCF) and co-cultured with human placenta-derived hematopoietic stromal cells obtained in Example 1 at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere. After 10 days of culture, the cells were collected by pipetting, centrifuged, and the cultured cells were collected and analyzed for proliferation ability.
[0045]
[Example 4]
Cord blood CD34 Analysis of positive cell amplification
Analysis of the proliferation ability of the cultured cells of Example 3 was performed by the following method. That is, commercially available semisolid GF H4434V (manufactured by Stemcell Technology Inc., 0.9% Iscove methylcellulose, 30% FCS, 1% BSA, 10-4M 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 3U / umbilical cord blood-derived CD34 after culturing using a medium containing ml erythropoietin, 50 ng / ml rh-SC F, 10 ng / ml rh-G-CSF and 10 ng / ml rh-IL-6. A positive cell is cultured as a secondary culture at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide atmosphere for 14 and 21 days, and an erythroid colony consisting of BFU-E and CFU-GEMM formed in the medium, CFU-GM Colonies and HPP-CFC colonies with a diameter of 1.0 mm or more It was measured to determine the number of hematopoietic stem cells and progenitor cells. HPP-CFC colonies were further calculated as small HPP-CFCs with a diameter of 1.0-2.5 mm and large HPP-CFCs with a diameter greater than 2.5 mm.
[0046]
The amplification rate was expressed as a percentage of the number of colonies formed by cultured cells relative to the number of colonies formed in the semisolid medium of cord blood CD34-positive cells before culture. As a control, cord blood CD34 positive cells not co-cultured with placental cells were used.
As a result of examining the amplification rate of the small and large HPP-CFC colonies, the amplification rate of the CFU-GM colonies, and the amplification number of the erythroid colonies, the colonies of the large and small HPP-CFCs and the erythroid colonies In any case, in the amplification rate of CFU-GM colonies, the cultured cells in the presence of placenta-derived cells showed a remarkable amplification effect compared to the cultured cells in the absence.
[0047]
【The invention's effect】
Conventionally, since cord blood is collected in limited quantities, it can only be transplanted to individuals weighing 40 kg or less. For example, cord blood stem cell transplantation can replace bone marrow transplantation. There were many. However, by using the method of the present invention, human CD34-positive stem cells can be amplified easily and safely, so that it can be transplanted to any adult patient and can be continuously administered several times. . Once umbilical cord blood is collected, hematopoietic stem cells can be supplied in the required amount when necessary.
[0048]
Furthermore, according to the present invention, a large amount of bone marrow cells are not required for bone marrow transplantation, and the burden on the mind and body of the donor and safety problems associated with the collection of bone marrow can be avoided. In addition, self-proliferation of hematopoietic stem cells enables treatment by collecting the minimum necessary number of hematopoietic stem cells for diseases such as neoplastic diseases such as acute leukemia, severe immunodeficiency, congenital enzyme disorders, and aplastic anemia. Severe acute in order to enable transplantation that is compatible with transplantation antigens by effectively utilizing umbilical cord blood that is discarded around the world with birth and holding hematopoietic stem cells with a wide range of transplantation antigens The risk of graft versus host disease (GVHD) can be greatly reduced.
[0049]
When umbilical cord blood stem cells are preserved, the present invention enables efficient preservation and leads to a significant reduction in the amount preserved, and more efficient hematopoiesis by registering once collected blood. A stem cell bank can be constructed.
Furthermore, by performing long-term storage such as cryopreservation of the proliferated cells, it is possible to quickly use CD34 positive cells having a transplanted antigen required when necessary.
Further, according to the present invention, when umbilical cord blood-derived hematopoietic stem cells are amplified, if stromal cells compatible with HLA isolated from the same placenta are used, it is not necessary to separate the stromal cells after amplification, which is extremely easy. Cells can be collected and directly expanded cells can be transfused.