JP2004254658A

JP2004254658A - Method for producing virus-resistant plant and virus-resistant plant

Info

Publication number: JP2004254658A
Application number: JP2003051915A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Ishikawa; 石川　　雅之; Satoru Naito; 内藤　　哲; Momoko Asano; 桃子浅野; Junko Mochizuki; 淳子望月; Masamichi Nishiguchi; 正通西口
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Japan Science and Technology Agency
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-16

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for producing a plant having resistance to a virus by suppressing the expression of an endogenous gene of the plant participating to the proliferation of the virus, and to provide the virus-resistant plant that is produced according to this method. <P>SOLUTION: The expression of a gene encoding the host factors participating to the proliferation of a virus is suppressed with RNAi whereby a plant that having resistance to the virus can be produced. Further, in the case where a plurality of the host factors are involved, the expression of all the host factors are prohibited whereby a plant having strong resistance to the virus is produced. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス（例えば、トバモウイルス）に対して抵抗性を示す植物の生産方法、およびこの方法により生産されるウイルス抵抗性植物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
トバモウイルス（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ）グループは、幅広い種類の植物に感染するウイルスグループであり、種々の植物病に対する疾病の原因として知られている。なかでも特に、タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ、以下、単にＴＭＶと称する）によって引き起こされる植物病がよく知られている。
【０００３】
ＴＭＶの感染によって引き起こされるタバコモザイク病は、古くから知られた植物病の一つで、葉にモザイク症状が生じ、成長が悪くなったり葉に奇形を生じたりする植物病である。このＴＭＶは、単子葉植物を含む数多くの植物に対して寄生性を有することが知られている。
【０００４】
このようなＴＭＶ等のトバモウイルスによって引き起こされる植物病の防除手段としては、従来から農薬の散布等が知られている。さらに、近年では、遺伝子工学的手法により、ウイルス抵抗性植物の分子育種が試みられている。このような分子育種としては、ウイルス遺伝子等の外来遺伝子の導入によって植物ウイルス感染を阻害する方法が一般的に行われている。例えば、ＴＭＶのＣＰ（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入したウイルス抵抗性植物は、５％程度のみがウイルス感染によって病徴を示す（例えば、非特許文献１参照）。また、この他にも弱毒ウイルス株のゲノム遺伝子を植物体に発現させて、ウイルス抵抗性を付与する方法が知られている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００５】
ところで、このようなＴＭＶ等のウイルスが有するウイルスゲノムは、限られた遺伝情報しかコードしていないため、ウイルスの増殖にはウイルス自身がコードする因子の他に、宿主細胞（宿主生物）内の宿主因子が必要不可欠であることが知られている。
【０００６】
かかる宿主因子として、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）のＴＯＭ１（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ１）遺伝子、ＴＯＭ３（ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ３）遺伝子が知られている（例えば、非特許文献３、４参照）。ＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子は、シロイヌナズナのゲノムから、ＴＭＶ等のトバモウイルスの増殖に関与する宿主因子をコードする遺伝子として同定、単離されたものである。これらの遺伝子は互いにホモログの関係にあり、いずれも７回膜貫通タンパク質をコードしていると予測されている。
【０００７】
そして、上記ＴＯＭ１遺伝子を欠損するシロイヌナズナ突然変異株では、ＴＭＶの増殖が野生型に比べて低く抑えられることが知られている。さらに、そのホモログであるＴＯＭ３遺伝子をも欠損する二重突然変異株では、ＴＭＶの増殖が完全に抑えられることがわかっている（例えば、非特許文献４参照）。
【０００８】
【非特許文献１】
Ｐｏｗｅｌｌ−Ａｂｅｌ，Ｐ．他著、「Ｄｅｌａｙｏｆｄｉｓｅａｓｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｔｈａｔｅｘｐｒｅｓｓｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２、ｐ．７３８−７４３、（１９８６）
【０００９】
【非特許文献２】
ＹａｍａｙａＪ．他著、「ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ」、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．３１５，ｐ．１７３−１７５、１９８８
【００１０】
【非特許文献３】
ＴａｋｕｙａＹａｍａｎａｋａ他著、「ＴＯＭ１，ａｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ，ｅｎｃｏｄｅｓａｐｕｔａｔｉｖｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ａｕｇｕｓｔ２９，２０００、ｖｏｌ．９７、ｎｏ．１８、ｐ．１０１０７−１０１１２
【００１１】
【非特許文献４】
ＴａｋｕｙａＹａｍａｎａｋａ他著、「ＣｏｍｐｌｅｔｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓＭｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｂｙＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＭｕｔａｔｉｏｎｓｉｎＴｗｏＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓＨｏｓｔＧｅｎｅｓ」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７６、Ｎｏ．５、Ｍａｒ．２００２，ｐ．２４９１−２４９７
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来のような農薬による植物病の防除では、残留農薬の問題や環境、動植物、および人に対する安全上の問題がある。
【００１３】
また、上述のような外来遺伝子、特にウイルス遺伝子を植物体に導入してウイルス抵抗性植物を作製する場合は、例えば、ウイルス遺伝子を導入した形質転換植物において、植物体内で発現するウイルスＲＮＡの一部が外から感染してくるウイルスＲＮＡと組換えを起こし、自然界に存在し得ない新たなウイルスが出現するという問題がある。また、ウイルス遺伝子を導入した植物が、長期的に人体や環境へどのような影響を及ぼすのか不明であるといった安全性や環境への問題もある。
【００１４】
したがって、環境、植物、動物、および人への安全性がより高いウイルス抵抗性植物、およびその生産方法が強く望まれていた。
【００１５】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウイルスの増殖に関与する植物の内在性遺伝子の発現を抑制して、ウイルスに対する抵抗性を有する植物を生産する方法、および当該生産方法によって生産されたウイルス抵抗性植物を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）ｃＤＮＡライブラリーから、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子およびＴＯＭ３遺伝子のホモログＮｔＴＯＭ１（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ−ＴＯＭ１Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）遺伝子およびＮｔＴＯＭ３（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ−ＴＯＭ３Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）遺伝子を単離・同定し、ＲＮＡｉにより当該遺伝子の発現を抑制したところ、当該形質転換タバコ体内におけるＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現抑制に伴って、ＴＭＶの増殖が抑制されることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産することを特徴としている。
【００１８】
上記の方法によれば、ＲＮＡｉによってウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を効果的に抑制することができる。このため、植物に感染したウイルスが植物体内で増殖することを抑制できる。したがって、ウイルスに対して抵抗性を有する植物を容易に生産することが可能となる。さらに、本発明によれば、外来遺伝子、特にウイルス遺伝子等を植物体に導入することがないため、環境、動植物、および人に対する安全性の高い植物を生産することが可能となる。
【００１９】
なお、上記宿主因子が複数ある場合は、複数の宿主因子をコードする遺伝子の発現を共に抑制することにより、ウイルスに対してより強力な抵抗性を有する植物を生産できる。
【００２０】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記ウイルスが、トバモウイルスであることを特徴としている。
【００２１】
上記の方法によれば、幅広い植物に感染するトバモウイルスに対する抵抗性を有する植物を容易に生産することができる。
【００２２】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記ウイルスが、タバコモザイクウイルスであることを特徴としている。
【００２３】
上記の方法によれば、トマト、メロン、タバコ等の多くの農業的に有用な植物資源に感染するＴＭＶに対する抵抗性を有する植物を容易に生産することができる。
【００２４】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がシロイヌナズナである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ａ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００２５】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＴＯＭ１遺伝子またはＴＯＭ３遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、シロイヌナズナに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して高い抵抗性を有するシロイヌナズナを容易に生産することができる。
【００２６】
なお、ＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制した上で、さらにＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制することがより好ましい。これによってより強力にウイルス抵抗性を有するシロイヌナズナを生産できる。
【００２７】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がタバコである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｃ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００２８】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、タバコに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して高い抵抗性を有するタバコを容易に生産することができる。
【００２９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、さらに、上記宿主因子である、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することにより、ウイルスに対してより強い抵抗性を有する植物を生産することを特徴としている。（ｅ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｆ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３０】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＮｔＴＯＭ１遺伝子とＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を同時に抑制することができるため、ウイルスに対してより強い抵抗性を有するタバコを容易に生産することができる。
【００３１】
なお、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された植物個体を生産する具体的な方法としては、例えば、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されている個体（タバコ）と、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されている個体とを掛け合わせる方法、または一個体に、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現とＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現とを抑制するためのＲＮＡｉプラスミド（１または複数のプラスミドでもかまわない）を導入する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００３２】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がトマトである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｇ）または（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｇ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｈ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３３】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、ＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、またはＬｅＴＨ３遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、トマトに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して抵抗性を有するトマトを容易に生産することができる。
【００３４】
なお、ＬｅＴＨ３遺伝子の発現を抑制した上で、さらにＬｅＴＨ１遺伝子、及び／またはＬｅＴＨ２遺伝子の発現を抑制することがより好ましい。これによってより強力にウイルス抵抗性を有するトマトを生産できる。
【００３５】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、上記の課題を解決するために、上記植物がメロンである場合、上記宿主因子をコードする遺伝子は、以下の（ｉ）または（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子であることを特徴としている。（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｊ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。
【００３６】
上記の方法によれば、例えば、ウイルス（例えば、トバモウイルス、またはＴＭＶ等）の増殖に関連する宿主因子であるＣｍＴＨ１遺伝子の発現を確実に抑制することができる。これによって、メロンに感染したウイルスの増殖を効果的に抑制することができるため、ウイルスに対して抵抗性を有するメロンを容易に生産することができる。
【００３７】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、上記の課題を解決するために、上記いずれかウイルス抵抗性植物生産方法によって生産されることを特徴としている。
【００３８】
上記の構成によれば、本発明にかかるウイルス抵抗性植物（例えば、タバコ、シロイヌナズナ、トマト、またはメロン等）は、ウイルスに対して高い抵抗性を有する。さらに、外来遺伝子、特にウイルス遺伝子等を植物体に導入していないため、環境、動植物、および人に対して非常に安全性が高い。
【００３９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＲＮＡｉを利用し、ウイルスの増殖に必要な宿主因子をコードする遺伝子の発現を抑制することによって、ウイルスが植物に感染しても当該植物体内で増殖できないウイルス抵抗性植物を生産することができる方法、およびこの方法によって生産されるウイルス抵抗性植物を提供するものである。そこで以下では、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法、およびウイルス抵抗性植物について説明することとする。
【００４０】
本発明のウイルス抵抗性植物生産方法、およびウイルス抵抗性植物に関する実施の一形態について図１〜図１３に基づいて説明すれば以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
（１）ウイルス抵抗性植物生産方法
本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法は、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を、ＲＮＡｉによって抑制することにより、上記ウイルスに対して抵抗性を有する植物を生産する方法であればよく、その他の工程、条件等は特に限定されるものではない。
ＲＮＡｉとは、ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡ干渉）によって特定の遺伝子の発現を抑制する技術である。ＲＮＡｉは、例えば、短鎖の二本鎖ＲＮＡを細胞、組織、器官、個体等に導入することにより、引き起こすことができる。短鎖の二本鎖ＲＮＡが細胞内に導入されると、それとハイブリダイズするｍＲＮＡの分解が促進されるために、標的遺伝子の発現が抑制されることになる。細胞への二本鎖ＲＮＡ注入法は、リポソーム法、電気穿孔方、マイクロインジェクション等が挙げられるが、特に限定されるものではない。なお、注入する二本鎖ＲＮＡは、２１〜２３塩基対であることがより好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
また、上記の方法以外にＲＮＡｉを実施する方法として、発現を抑制したい遺伝子のセンス鎖とアンチセンス鎖とが転写されるようにリンカー配列を介して接続した遺伝子カセットを宿主細胞内でｉｎｖｉｖｏ転写させ、分子内で２本鎖を形成するようなＲＮＡ（ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ）を生成させることによって、当該ＲＮＡに相当する宿主遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられる。この方法によれば、前述の方法に比べて、より継続的に細胞、組織、器官、個体等においてＲＮＡｉを発生させることができ、その結果としてより持続的に標的遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４３】
具体的には、例えば、図２（ａ）に示すように、図中Ｐ３５Ｓで示すカリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡプロモーター下流に、ウイルスの増殖に関与する宿主因子であるＴＯＭ１ホモログ（例えば、ＮｔＴＯＭ１遺伝子）の逆向きｃＤＮＡ、リンカー配列としてのＧＵＳ（β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）遺伝子断片、ＴＯＭ１ホモログ（例えば、ＮｔＴＯＭ１遺伝子）の順向きｃＤＮＡを順に挿入したコンストラクト（ＲＮＡｉプラスミド）を作製する。そして、このＲＮＡｉプラスミドを植物内に導入して、ｉｎｖｉｖｏ転写させることにより、図２（ｂ）に示すような分子内で２本鎖を形成するｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡを生成させる。これによって、植物体内の当該ＲＮＡ（遺伝子）に相当する内在性ＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されることになる。
【００４４】
なお、上記ＲＮＡｉプラスミドに用いる宿主因子をコードする遺伝子としては、ＴＯＭ１ホモログ遺伝子に限られるものではなく、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子、および種々の植物のＴＯＭ１ホモログ遺伝子、ＴＯＭ３ホモログ遺伝子であってもよいことはいうまでもない。また、上記ＲＮＡｉプラスミドに組み込まれるアンチセンス鎖の遺伝子とセンス鎖の遺伝子との並ぶ順序、向き等は、植物体内でｉｎｖｉｖｏ転写され生成されるＲＮＡが、ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡとして分子内で２本鎖を形成するような順序、向き等であればよく、特に限定されるものではない。
【００４５】
また、上記ＲＮＡｉの実施方法およびベクター等の材料は、植物体内の目的遺伝子の発現を抑制できる方法、材料等であればよく、上記の方法、材料等に限定されるものではなく、従来公知のＲＮＡｉの実施方法、材料等を利用することができる。具体的には、例えば、ＴＯＭ１ホモログアンチセンス鎖とＴＯＭ１ホモログセンス鎖とを接続するリンカー配列は、β−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子断片に限られるものではなく、ｉｎｖｉｖｏ転写で生成されるＲＮＡが、分子内で２本鎖を形成するｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ構造をとることができる従来公知のリンカー配列であればよく、そのリンカー配列の塩基配列、長さ、向き等は特に限定されるものではない。また、プロモーター配列もカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに限られるわけではなく、分子内で２本鎖を形成することになるｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡをｉｎｖｉｖｏ転写で生成できる従来公知のプロモーター（強力で恒常的に読まれるもの）であればよい。なお、特定の発生時期あるいは特定の組織、器官等で機能するプロモーター、または特定の条件で機能するプロモーター等を用いることも可能である。
【００４６】
また、上記ＲＮＡｉプラスミドを作製する方法も、従来公知の方法を利用することができ、特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲ、制限酵素処理等の従来公知の遺伝子工学的方法が利用できる。
【００４７】
また、上記プラスミドを植物体内に導入する方法としては、従来公知の遺伝子工学的方法、物理的方法、または化学的方法等が挙げられる。例えば、後述する実施例に示すように、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたリーフディスク法、微小ガラス管で顕微鏡下に直接ＤＮＡを注入するマイクロインジェクション法、瞬時の高電圧によって細胞膜に微小な穴を開けるエレクトロポレーション法、金粒子にＤＮＡを結合させ特殊な銃で組織に撃ち込む粒子銃を利用した方法等の従来公知の方法が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００４８】
また、上記ウイルスは、トバモウイルスであることが好ましい。トバモウイルスグループは、アルファ様ウイルススーパーグループに分類される、プラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスである。また、トバモウイルスの中でも、特に、ＴＭＶであることが好ましい。ＴＭＶをはじめとするトバモウイルスは、多くの植物に感染し、植物病の原因となるウイルスである。このため、ＴＭＶ等のトバモウイルスの植物体内での増殖を抑えることにより、ＴＭＶ等のトバモウイルスの感染、増殖によって引き起こされる植物病の発生を確実に抑制することができる。
【００４９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がシロイヌナズナである場合、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ａ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号２、または４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号１に示されるＴＯＭ１ｃＤＮＡ、配列番号３に示されるＴＯＭ３ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００５０】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がタバコである場合、以下の（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｃ）配列番号６、または８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｄ）配列番号６、または８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号５で示されるＮｔＴＯＭ１ｃＤＮＡ等が挙げられる。なお、上記タバコは、ウイルス（ＴＭＶ）抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有していることが好ましいが、特に限定されるものではない。
【００５１】
また、ＲＮＡｉにより、上記（ｃ）または（ｄ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し、さらに、以下の（ｅ）または（ｆ）のタンパク質をコードする遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制することによって、ウイルスに対してより強い抵抗性を有する植物を生産する方法であることが好ましい。（ｅ）配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｆ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子として、例えば、配列番号７で示されるＮｔＴＯＭ３ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００５２】
すなわち、ＲＮＡｉにより、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制したうえで、さらに、ＲＮＡｉにてＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制する場合等が挙げられる。これは、後述する実施例に示すように、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現のみを抑制した場合は、十分なウイルス増殖抑制効果が得られなかったが、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現のみを抑制した場合は十分なウイルス増殖抑制効果が得られ、さらに、ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を同時に抑制すると、より強力なウイルス増殖抑制効果を得ることができるためである。
【００５３】
なお、ＲＮＡｉによって複数のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現を同時に抑制された植物個体を生産する具体的な方法としては、例えば、後述する実施例に示すように、ＲＮＡｉによって一つのＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されている植物個体と、ＲＮＡｉによって他のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現が抑制されている植物個体とを掛け合わせる方法、または複数のＴＯＭ１ホモログ遺伝子の発現を同時に抑制するためのＲＮＡｉプラスミド（１または複数のプラスミドでもかまわない）を一植物個体に導入する方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００５４】
ここで、ＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子について詳細に説明する。ＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子のタバコホモログとして見出された遺伝子であり、トバモウイルスのタバコ内での増殖に関与する宿主因子をコードしている。シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子は、配列番号１に示される塩基配列のうち、１３９〜１０１４番目の塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有する１２１５塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号２に示される２９１残基のアミノ酸配列からなるＴＯＭ１タンパク質をコードしている。また、ＴＯＭ３遺伝子は、配列番号３に示される塩基配列をＯＲＦとして有する９１２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号４に示される３０３残基のアミノ酸配列からなるＴＯＭ３タンパク質をコードしている。
【００５５】
また、タバコのＮｔＴＯＭ１遺伝子は、配列番号５に示される塩基配列のうち、１２４〜９９０番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１１０６塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号６に示される２８８残基のアミノ酸配列からなるＮｔＴＯＭ１タンパク質をコードしている。ＮｔＴＯＭ３遺伝子は、配列番号７に示される塩基配列のうち、９８〜９８２番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１１２２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号８に示される２９４残基のアミノ酸配列からなるＮｔＴＯＭ３タンパク質をコードしている。
【００５６】
これらＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１に示す。図中、線で囲んでいる領域は、これらのタンパク質相互間で相同性の高い領域を示す。この図１に示すように、ＴＯＭ１タンパク質とＮｔＴＯＭ１タンパク質とは高い相同性を示し、ＴＯＭ３タンパク質とＮｔＴＯＭ３タンパク質とは高い相同性を示している。また、これら４つのタンパク質はそれぞれ高い相同性を示している。さらに、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質は、７回膜貫通型のタンパク質であると予測され、ＮｔＴＯＭ１タンパク質は、６回膜貫通型のタンパク質であると予測される。
【００５７】
上述のように、ＴＯＭ１とＮｔＴＯＭ１とは相同性が高く、ＴＯＭ３とＮｔＴＯＭ３とは相同性が高いことから、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法において、植物がシロイヌナズナである場合、ＲＮＡｉによりＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制することによって、効率的に高いウイルス抵抗性シロイヌナズナを生産することができると思われる。また、ＲＮＡｉによるＴＯＭ１遺伝子の発現抑制とともに、さらに、ＴＯＭ３遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、ほぼ完全にウイルスの増殖を抑制できるウイルス抵抗性シロイヌナズナを生産することができると考えられる。
【００５８】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）である場合、以下の（ｇ）または（ｈ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｇ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｈ）配列番号１０、１２、または１４に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子としては、例えば、配列番号９で示されるＬｅＴＨ１（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ１）ｃＤＮＡ、配列番号１１で示されるＬｅＴＨ２（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ２）ｃＤＮＡ、配列番号１３で示されるＬｅＴＨ３（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ−ＴＯＭ１Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ３）ｃＤＮＡ等を挙げることができる。
【００５９】
また、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする遺伝子は、上記植物がメロン（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ）である場合、以下の（ｉ）または（ｊ）のタンパク質をコードする遺伝子であればよい。（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｊ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／または付加されたアミノ酸配列からなる、ウイルスの増殖に関与する宿主因子。これらの遺伝子としては、例えば、配列番号１５に示されるＣｍＴＨ１（Ｃｕｃｕｍｉｓｍｅｌｏ−ＴＯＭ１Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ１）ｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００６０】
上記ＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、およびＬｅＴＨ３遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子のトマトホモログとして単離、同定された遺伝子である。また、ＣｍＴＨ１遺伝子は、シロイヌナズナのＴＯＭ１遺伝子のメロンホモログとして単離、同定された遺伝子である。これらの遺伝子はいずれも、トバモウイルスのトマトまたはメロン内での増殖に関与する宿主因子をコードしている。ＬｅＴＨ１遺伝子は、配列番号９に示される塩基配列のうち、１６０〜１０４７番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１３５３塩基対のｃＤＮＡに対応し、配列番号１０に示される２９５残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ１タンパク質をコードしている。また、ＬｅＴＨ２遺伝子は、配列番号１１に示される塩基配列のうち、１５６〜１０４９番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１３１６塩基対のｃＤＮＡに対応し、配列番号１２に示される２９７残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ２タンパク質をコードしている。また、ＬｅＴＨ３遺伝子は、配列番号１３に示される塩基配列のうち、３１〜８９７番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１２７８塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号１４に示される２８８残基のアミノ酸配列からなるＬｅＴＨ３タンパク質をコードしている。
【００６１】
また、ＣｍＴＨ１遺伝子は、配列番号１５に示される塩基配列のうち、２２４〜１１０２番目の塩基配列をＯＲＦとして有する１２４２塩基対からなるｃＤＮＡに対応し、配列番号１６に示される２９２残基のアミノ酸配列からなるＣｍＴＨ１タンパク質をコードしている。
【００６２】
これらＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列とを比較したアライメントを図９に示す。また、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１０に示す。また、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１１に示す。なお、図中線で囲む領域は、相同性が高い領域を示す。
【００６３】
これらの結果から、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高く、ＬｅＴＨ３タンパク質は、ＴＯＭ１タンパク質とより相同性が高いことがわかった。このため、ＬｅＴＨ３タンパク質はＴＯＭ１タンパク質のトマトホモログ、ＬｅＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のトマトホモログ、ＣｍＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のメロンホモログである可能性がある。なお、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質は６回膜貫通型タンパク質と予測され、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は７回膜貫通型のタンパク質と予測された。
【００６４】
さらに、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１２に示す。図中、線で囲んだ範囲は、同一のアミノ酸残基であることを示し、色（グレー）を付した箇所は、類似のアミノ酸残基であることを示す。また、図中の矢印は、ＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＬｅＴＨ２タンパク質と比較して、ＬｅＴＨ３タンパク質が有する独特のアミノ酸残基を示す。同図に示すように、これら８つのタンパク質は、相互に高い相同性を有していることがわかる。
【００６５】
また、上記のタンパク質のアライメントの結果に基づいて作成したＴＯＭ１ホモログのアミノ酸配列に基づいた系統樹を図１３に示す。なお、上記系統樹は、ＧＥＮＥＴＹＸＭａｃ（Ｍｅｔｈｏｄ：ＵＰＧＭＡ）を用いて作成した。この図に示すように、ＬｅＴＨ３タンパク質とＮｔＴＯＭ１タンパク質とが近縁であり、いずれもＴＯＭ１ホモログと考えられる。また、ＬｅＴＨ１タンパク質とＮｔＴＯＭ３タンパク質とが近縁であり、いずれもＴＯＭ３ホモログと考えられる。また、ＣｍＴＨ１タンパク質もＴＯＭ３ホモログと考えられる。なお、ＬｅＴＨ２タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質よりもＴＯＭ１タンパク質に近縁であることがわかった。
【００６６】
これらのことから、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法において、植物がトマトである場合、ＲＮＡｉによりＬｅＴＨ３遺伝子の発現を抑制することによって、効率的に高いウイルス抵抗性トマトを生産することができると思われる。また、ＲＮＡｉによるＬｅＴＨ３遺伝子の発現抑制とともに、さらに、ＬｅＴＨ１遺伝子、及び／またはＬｅＴＨ２遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、ほぼ完全にウイルスの増殖を抑制できるウイルス抵抗性トマトを生産することができると思われる。
【００６７】
また、本発明のウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする「遺伝子」には、ＲＮＡ及びＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡにはｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。さらに、本発明のウイルス抵抗性植物生産方法に用いられる、宿主因子をコードする「遺伝子」は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６のタンパク質をコードする配列以外に、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００６８】
以上のように、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法によれば、植物体内でウイルスの増殖に関連する宿主因子の発現がＲＮＡｉによって抑制されることにより、当該植物に感染したウイルスは増殖することができなくなる。このため、環境、動植物、および人に対して危険の大きい、ウイルス由来の遺伝子等の外来性遺伝子を導入することなく、ウイルスの増殖を効率的に抑制することが可能である。このため、ＴＭＶ等のウイルスに対して優れた抵抗性を有するとともに、環境、動植物、および人に対して安全性の高い植物を容易に生産することが可能である。
【００６９】
さらに、本発明は、ＲＮＡｉを利用して、ウイルスの増殖に関連する宿主因子をコードする遺伝子の発現を抑制しているため、例えば、当該宿主因子をノックアウトする場合（例えば、当該宿主因子をコードする遺伝子に変異を導入して機能欠損植物を作製する場合等）に比べて、植物に対する負荷も少なくてすむ。さらに、植物の特定遺伝子をノックアウトする場合よりも、簡単に特定遺伝子の機能を抑えた植物を生産できる。したがって、本発明にかかるウイルス抵抗性生産方法は、簡便かつ安全性の高い技術であるといえる。
【００７０】
（２）本発明にかかるウイルス抵抗性植物
本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、上記のウイルス抵抗性植物生産方法によって生産される植物であればよく、その他の構成等は特に限定されるものではない。
【００７１】
本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、ＲＮＡｉによって、ウイルスの増殖に関与する宿主因子の発現が抑制されるため、当該植物にウイルスが感染した場合でも、ウイルスの増殖が効率的に抑制されることになる。したがって、本発明にかかるウイルス抵抗性植物は、ウイルスに対して高い抵抗性を有する植物である。さらに、ウイルス由来の遺伝子等の外来性遺伝子を有しないため、環境、動植物、および人に対して非常に安全性の高い植物でもある。
【００７２】
以下添付した図面に沿って実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７３】
【実施例】
〔１〕実験材料および方法
まず、本実施例に用いた実験材料および実験方法について説明する。まず、植物としてタバコを使用した。より具体的には、ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ、およびＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．ｃｖ．ＳａｍｓｕｎＮＮを用いた。上記Ｓａｍｓｕｎ系統は、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子をもたず、ＴＭＶが全身感染する系統であり、上記ＳａｍｓｕｎＮＮ系統は、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有し、ＴＭＶ感染によって壊死病斑を形成する系統である。
【００７４】
植物体への接種に使用したウイルスは、ＴＭＶ−Ｌ株（タバコモザイクウイルス，トマト系統）（Ｏｈｎｏｅｔａｌ．，１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９６，ｐ．１９１５−１９２３）、ＣＭＶ−Ｙ株（キュウリモザイクウイルス，黄斑系統）（Ｓｕｚｕｋｉｅｔａｌ．，１９９１、「ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｅｌｅｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡ３ｕｓｉｎｇａｎｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８３，ｐ．１０６−１１３）である。また、タバコにＲＮＡｉを引き起こすプラスミドを導入するためのリーフディスク法に使用した菌株は、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５株である。
【００７５】
タバコの生育条件は、育苗用培養土を用いて、１６時間日長、２３℃での温室で水道水を与えて育てた。タバコの交雑は、雌親にするつぼみを選び，そのつぼみから花弁および雄しべをピンセットを用いて取り除き，雌しべを露出させた。そして、雄親にする花から雄しべをピンセットで取り出し、雌しべの柱頭に接触させて花粉を付着させた。ピンセットは７０％エタノールで消毒しながら行った。また、タバコのＲＮＡ抽出は、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、方法は添付の説明書に従った。
【００７６】
〔２〕シロイヌナズナＴＯＭ１、ＴＯＭ３のタバコホモログの単離
シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子（配列番号１参照）、ＴＯＭ３遺伝子（配列番号３参照）のタバコにおけるホモログを同定、単離した。具体的には、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子のホモログのｃＤＮＡ断片を、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅＰＣＲ法を用いてタバコｃＤＮＡライブラリーから増幅し、クローン化した後、シークエンスにより塩基配列を決定した。さらに、得られた２種類の塩基配列情報をもとに、５’末端および３’末端ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法を用いて完全長のｍＲＮＡ配列を決定した。それぞれの配列上には、図１に示すように、シロイヌナズナＴＯＭ１遺伝子、ＴＯＭ３遺伝子と相同性の高いアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、それらに対応する遺伝子をそれぞれＮｔＴＯＭ１遺伝子（配列番号５参照）、ＮｔＴＯＭ３遺伝子（配列番号７参照）と命名した。
【００７７】
〔３〕ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現抑制
タバコにおいてＮｔＴＯＭ１遺伝子、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制することにより、ＴＭＶ耐性を付与できるのではないかと考え、ＲＮＡｉにより、上記遺伝子の発現抑制を試みた。
【００７８】
具体的には、図２（ａ）に示すように、ベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロモーター下流に、ＮｔＴＯＭ１の逆向きｃＤＮＡ、ＧＵＳフラグメント（図中、ＧＵＳｆｒ．で示すβ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅの遺伝子断片）、ＮｔＴＯＭ１の順向きｃＤＮＡを順に挿入したＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を従来公知のＰＣＲ、制限酵素処理等によって作製した。また、同様に、ベクターｐＢＩ１２１の３５Ｓプロモーター下流に、ＮｔＴＯＭ３の逆向きｃＤＮＡ、ＧＵＳフラグメント、ＮｔＴＯＭ３の順向きｃＤＮＡを順に挿入したＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を作製した。これらのＲＮＡｉプラスミドをタバコに導入することによって、図２（ｂ）に示すように、分子内で当該遺伝子の配列が２本鎖を形成するようなＲＮＡがｉｎｖｉｖｏ転写で生成され、タバコ体内でｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡが生じる。
【００７９】
なお、ここで使用したベクターｐＢＩ１２１は、１３ｋｂの大きさを持つＴ−ＤＮＡベクターであり、抗生物質耐性マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を有しており、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと、このプロモーターにドライブされるＧＵＳフラグメント、およびポリＡ（アデニル酸）付加配列を有する。
【００８０】
その後、このＲＮＡｉプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いたリーフディスク法によりタバコに導入した。アグロバクテリウムを用いたリーフディスク法によるタバコの形質転換は、基本的にＨｏｌｓｔｅｒらの方法に従った（Ｈｏｌｓｔｅｒｅｔａｌ．，１９７８、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６３，ｐ．１８１−１８７）。詳細には、ＲＮＡｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの溶液中に葉の断片を入れた後、ディスクを植物ホルモン（０．１ｍｇ／Ｌａ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎａｃｅｔｉｃａｃｉｄｓ（ＮＡＡ（ＢＡ））、１ｍｇ／Ｌ６−ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ）と５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＭＳ培地に静置した。この培地上で出芽した形質転換体シュートを選択し、この形質転換体シュートを選択培地（５０ｍｇ／Ｌカナマイシン）で生育させた。なお、形質転換にはＴＭＶに全身感染するＳａｍｓｕｎ系統と、ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するＳａｍｓｕｎＮＮ系統の２種類のタバコを用いた。そこで、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し形質転換した系統を、それぞれＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）と示して説明し、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し形質転換した系統を、それぞれＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）と示して以下説明する。
【００８１】
〔４〕ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の解析
次に、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子をもち、ＴＭＶの感染に伴って局所壊死病斑を形成するタバコＳａｍｓｕｎＮＮ系統に、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子を発現抑制した株について、ノザンハイブリダイゼーション解析、およびＴＭＶローカルリージョンアッセイを行った。
【００８２】
まず、野生型ＳａｍｓｕｎＮＮ（ｗｔ）、およびＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）からそれぞれＲＮＡを抽出し、ＲＮＡｉによって、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されているか否かをノザンハイブリダイゼーション解析により調べた。ノザンハイブリダイゼーションによる解析は、基本的には、Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従った（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．，ｅｔａｌ、「ＥｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｔｏｍｌｍｕｔａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｏｎｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＲＮＡｉｎｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ」、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，ｐ．５３２８−５３３８，（１９９３））。具体的には、ＲＮＡ量は１サンプルにつき、１０μｇを用いた。また、プローブは、ＮｔＴＯＭ１ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を鋳型として、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片を用いた。
【００８３】
その結果、図３（ｂ）に示すように、野生型ＳａｍｓｕｎＮＮ（図中ｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡが、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡで示す位置）。一方、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ１ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。なお、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）３は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００８４】
続いて、ＴＭＶローカルリージョンアッセイについて説明する。ＴＭＶローカルリージョンアッセイとは、ウイルス抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するタバコを用いたウイルスアッセイであり、具体的には以下のように行った。
【００８５】
ＴＭＶ抵抗性遺伝子であるＮ遺伝子を有するタバコはウイルスを接種した場合、局所病斑（葉中の白い斑点）ができるが、この病斑の大きさや数によってウイルスの増殖の程度を観察できる。この性質を利用して、播種後約２ヶ月のタバコＳａｍｓｕｎＮＮおよびＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の約１０〜１５ｃｍの若い葉に、精製したＴＭＶ−Ｌを０．０５μｇ／ｍｌの濃度で接種した後、５日目または７日目に感染後の局所病斑を観察した。観察時にデジタルカメラで記録を保持した。
【００８６】
その結果、図３（ａ）に示すように、野生型ＳａｍｓｕｎＮＮ（ｗｔ）の葉には、ＴＭＶの感染によって局所壊死病斑が形成されたが、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されたＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１、２、４〜７の葉には、局所壊死病斑がほとんど形成されなかった。このことから、ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現抑制によって、ＴＭＶ感染による局所病斑の形成がほぼ完全に抑えられたと考えられる。なお、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）３の葉には、野生型Ｓａｍｓｕｎと同様に局所壊死病斑が形成された。これは、上述したように、内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されていないためと考えられた。
【００８７】
以上のことから、ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現抑制にともなって、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体タバコ内でのＴＭＶの増殖を抑制することができることが明らかになった。
【００８８】
〔５〕ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）の解析
次いで、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有するＳａｍｓｕｎＮＮ系統に、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法で、ノザンハイブリダイゼーション解析、およびＴＭＶローカルリージョンアッセイを行った。
【００８９】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図４（ｂ）に示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ３ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。この図４（ｂ）に示すように、野生型ＳａｍｓｕｎＮＮ（ｗｔ）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡが、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１、３〜５では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡで示す位置）。一方、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１、３〜５では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ３ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。また、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）２は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９０】
続いて、ＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を図４（ａ）に示す。同図に示すように、野生型ＳａｍｓｕｎＮＮ（ｗｔ）も、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３を発現抑制したＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）も、いずれも局所壊死病斑形成がほぼ同様に起こった。
【００９１】
以上の結果から、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３の発現を単独で抑制しても、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体においては、それほどＴＭＶの増殖抑制効果が認められないことがわかった。
【００９２】
〔６〕Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）の解析
次に、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有しない、ＴＭＶの全身感染を許容するＳａｍｓｕｎ系統タバコに、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法でノザンハイブリダイゼーション解析を行い、さらに、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積について解析を行った。
【００９３】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図５のパネルＢに示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ１ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。同図に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコ（図中Ｓｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１〜７では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）１〜７では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ１ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９４】
続いて、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。具体的には、ＴＭＶ接種後４日目の接種葉を刈り取り、抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＣＢＢにて染色しＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。
【００９５】
その結果を図５のパネルＡに示す。Ｓｗｔは、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示し、Ｓｗｔ（１／１０）は、１０倍希釈したＳｗｔのタンパク質抽出物を示す。同図に示すように、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコに比較して、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積が少ないが、全く蓄積されていないわけではないことがわかった。
【００９６】
以上のことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）において、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現を抑制することによって、ＴＭＶの増殖を抑制することができるが、完全には抑制できないことがわかった。
【００９７】
〔７〕Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）の解析
続いて、上記〔３〕で作製したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）について詳細に解析した。具体的には、Ｎ遺伝子を有しない、ＴＭＶの全身感染を許容するＳａｍｓｕｎ系統タバコに、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入し、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ３遺伝子を発現抑制した株について、上記〔４〕と同様な方法でノザンハイブリダイゼーション解析を行い、さらに上記〔６〕と同様の方法でＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積について解析を行った。
【００９８】
ノザンハイブリダイゼーション解析の結果を図６のパネルＢに示す。プローブには、ＮｔＴＯＭ３ｃＤＮＡのＯＲＦ領域を用いた。同図に示すように、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコ（図中Ｓｗｔで示す）で確認された内在性ＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡが、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１〜４、６では確認できなかった（図中ＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡで示す位置）。一方、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）１〜４、６では、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）由来のＲＮＡ（ＮｔＴＯＭ３ｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡ）が検出された（図中ＩＲで示す位置）。また、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）５は、ＲＮＡｉプラスミドが導入できていないか、またはＲＮＡｉが十分に発生していないことによって、内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されていないと考えられた。これらのことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体において、ＲＮＡｉによって内在性のＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されることがわかった。
【００９９】
続いて、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。その結果を図６のパネルＡに示す。Ｓｗｔは、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示し、Ｓｗｔ（１／１０）は、１０倍希釈したＳｗｔのタンパク質抽出物を示す。同図に示すように、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）では、野生型Ｓａｍｓｕｎタバコに比較して、ほぼ同様にＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質が蓄積されることがわかった。
【０１００】
以上のことから、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）において、ＲＮＡｉによりＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を単独で抑制しても、十分にＴＭＶの増殖を抑制することができないことがわかった。
【０１０１】
〔８〕ＲＮＡｉによるＮｔＴＯＭ１、ＮｔＴＯＭ３の同時抑制の効果
次に、ＲＮＡｉによって、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子が共に発現抑制される個体を作製し、その性質を解析した。具体的には、図７に示すように、ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）と、ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制したＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）とを掛け合わせたタバコを作製した。なお、ＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）では，ＴＭＶ感染による局所病斑の形成がほぼ完全に見られなくなったため、掛け合わせにはＳａｍｓｕｎ形質転換体のみ用いた。また、掛け合わせには形質転換当代の株同士を用い、交雑によって得られたＦ１個体にＳｄ１−１、Ｓｄ１−２、・・・、Ｓｄ１−ｘと名前をつけた。ここで、Ｆ０植物個体である、Ｓａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ１）とＳａｍｓｕｎ形質転換体（ＮｔＴＯＭ３）とが、トランスジーンを独立な遺伝子座にそれぞれヘテロに有する場合、Ｆ１植物個体（Ｓｄ１−ｘ）の約１／４が、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体となると考えられる。
【０１０２】
そこで、掛け合わされたタバコ（Ｓｄ１−ｘ）について、ノザンハイブリダイゼーション解析を行い、内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体の有無を調べた。
【０１０３】
その結果を図８（ｂ）に示す。ＴｏｔａｌＲＮＡは、全体のＲＮＡ量を示す。ｗｔは野生型Ｓａｍｓｕｎタバコを示す。同図に示すように、Ｓｄ１−８、Ｓｄ１−１１、およびＳｄ１−１４以外の個体が、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子の発現が抑制されている個体であった。一方、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が抑制されている個体は、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６のみであった。以上の結果から、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６が、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体であることがわかった。これらの株を図中に○（まる）をつけて示す。
【０１０４】
次に、掛け合わされたタバコ（Ｓｄ１−ｘ）について、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。具体的には、ＴＭＶ−Ｌの接種４、７、１３、４３日後にウイルス接種葉を刈り取り、そこからタンパク質を抽出した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＣＢＢ染色によって、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた。その結果を図８（ａ）に示す。
【０１０５】
同図に示すように、Ｓｄ１−２、Ｓｄ１−４、Ｓｄ１−９、およびＳｄ１−１６のみ、ウイルス接種４〜１３日後まで、ＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積がみられなかった。以上のことから、ＲＮＡｉによって内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制された個体では、ＴＭＶの増殖はほぼ完全に抑制されたことがわかった。ただし、ＴＭＶ接種後４０日以上経過すると低レベルのＴＭＶの増殖が観察された。
【０１０６】
また、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現が共に抑制されても、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の増殖は影響を受けなかった（結果は不図示）。ＣＭＶは、アルファ様ウイルススーパーグループに属するが、トバモウイルスとは異なるウイルスである。これらのことから、ＲＮＡｉによる内在性ＮｔＴＯＭ１遺伝子とＮｔＴＯＭ３遺伝子との発現抑制によって、ＴＭＶの増殖が抑制される効果は、非特異的な効果ではないと考えられた。
【０１０７】
〔９〕タバコ以外の植物におけるＴＯＭ１ホモログについて
タバコの他にも、トマトに３つ、メロンに１つ、ＴＯＭ１ホモログが存在することが明らかとなり、これらを同定・単離し、それぞれＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、ＬｅＴＨ３遺伝子、およびＣｍＴＨ１遺伝子と名づけた。
【０１０８】
これらのＴＯＭ１ホモログ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図９に示す。同図に示すように、ＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、ＬｅＴＨ３遺伝子、およびＣｍＴＨ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列とは、高い相同性を示すことがわかった。
【０１０９】
まず、これらＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質のアミノ酸配列と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列とを比較したアライメントを図９に示す。図中線で囲む領域は、相同性が高い領域を示す。この図９に示すように、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質と、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質とは、高い相同性を示すことがわかった。また、ＬｅＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高いことがわかった。
【０１１０】
また、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１０に示す。同図に示すように、ＣｍＴＨ１タンパク質とＴＯＭ３タンパク質とは、高い相同性を示すことがわかった。
【０１１１】
また、ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質のアミノ酸配列を比較したアライメントを図１１に示す。同図に示すように、これら６つのタンパク質は、相互に高い相同性を有していることがわかった。
【０１１２】
これらの結果から、ＬｅＴＨ３タンパク質は、ＴＯＭ１タンパク質と相同性が高く、ＬｅＴＨ１タンパク質およびＣｍＴＨ１タンパク質は、ＴＯＭ３タンパク質とより相同性が高いことがわかった。このため、ＬｅＴＨ３タンパク質はＴＯＭ１タンパク質のトマトホモログ、ＬｅＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のトマトホモログ、ＣｍＴＨ１タンパク質はＴＯＭ３タンパク質のメロンホモログである可能性がある。なお、タンパク質構造予測プログラムＳＯＳＵＩによれば、ＬｅＴＨ１タンパク質、ＬｅＴＨ２タンパク質は６回膜貫通型タンパク質と予測され、ＬｅＴＨ３タンパク質、ＣｍＴＨ１タンパク質は７回膜貫通型のタンパク質と予測された。
【０１１３】
以上のことから、トマトの内在性のＬｅＴＨ１遺伝子、ＬｅＴＨ２遺伝子、およびＬｅＴＨ３遺伝子のうち、いずれかの遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、トマト内におけるＴＭＶの増殖を抑制できる可能性が極めて高いと考えられる。また、同様に、メロンの内在性のＣｍＴＨ１遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制することによって、メロン内におけるＴＭＶの増殖を抑制できる可能性が極めて高いと考えられる。
【０１１４】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかるウイルス抵抗性植物生産方法によれば、高いウイルス抵抗性を有する植物を容易に生産することができるという効果を奏する。さらに、当該植物は、ウイルス遺伝子等の外来遺伝子を導入していないため、環境、植物、動物、および人に対して安全性の高い植物を提供可能であるという効果を奏する。
【０１１５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、およびＮｔＴＯＭ３タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。
【図２】（ａ）は、ＴＯＭ１ホモログのＲＮＡｉプラスミドの構造を模式的に示す図であり、（ｂ）は、（ａ）のＲＮＡｉプラスミドによって生成されるｉｎｖｅｒｔｅｄｒｅｐｅａｔＲＮＡを模式的に示す図である。
【図３】（ａ）は、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入したＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体におけるＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換体におけるＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図４】（ａ）は、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入したＳａｍｓｕｎＮＮ形質転換体におけるＴＭＶローカルリージョンアッセイの結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換体におけるＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図５】パネルＡは、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ１）を導入したＳａｍｓｕｎ形質転換体におけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、パネルＢは、上記Ｓａｍｓｕｎ形質転換体におけるＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図６】パネルＡは、ＲＮＡｉプラスミド（ＮｔＴＯＭ３）を導入したＳａｍｓｕｎ形質転換体におけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、パネルＢは、上記Ｓａｍｓｕｎ形質転換体におけるＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図７】ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制した形質転換タバコを掛け合せにより作製した方法の説明図である。
【図８】（ａ）は、ＲＮＡｉによってＮｔＴＯＭ１遺伝子およびＮｔＴＯＭ３遺伝子の発現を抑制した形質転換タバコにおけるＴＭＶ−Ｌ外被タンパク質の蓄積を調べた結果を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の形質転換タバコにおけるＮｔＴＯＭ１ｍＲＮＡおよびＮｔＴＯＭ３ｍＲＮＡの蓄積を調べたノザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図９】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１０】ＴＯＭ３タンパク質、メロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１１】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）、およびメロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１２】ＴＯＭ１タンパク質、ＴＯＭ３タンパク質、ＮｔＴＯＭ１タンパク質、ＮｔＴＯＭ３タンパク質、トマトのＴＯＭ１ホモログ（ＬｅＴＨ１〜ＬｅＴＨ３）、およびメロンのＴＯＭ１ホモログ（ＣｍＴＨ１）のアミノ酸配列を比較したアライメントを示す図である。
【図１３】各種植物におけるＴＯＭ１ホモログのアミノ酸配列に基づいた系統樹を示す図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for producing a plant that exhibits resistance to a virus (eg, a tobamovirus), and a virus-resistant plant produced by the method.
[0002]
[Prior art]
The tobamovirus group is a group of viruses that infect a wide variety of plants and is known as a cause of various plant diseases. Above all, plant diseases caused by tobacco mosaic virus (hereinafter simply referred to as TMV) are well known.
[0003]
Tobacco mosaic disease caused by TMV infection is one of the plant diseases that has been known for a long time, and is a plant disease that causes mosaic symptoms on leaves, causes poor growth and causes malformation on leaves. This TMV is known to have parasitic properties on many plants including monocotyledonous plants.
[0004]
As means for controlling plant diseases caused by such tobamoviruses such as TMV, spraying of pesticides and the like have been conventionally known. Furthermore, in recent years, molecular breeding of virus-resistant plants has been attempted by genetic engineering techniques. As such molecular breeding, a method of inhibiting plant virus infection by introducing a foreign gene such as a viral gene is generally performed. For example, only about 5% of virus-resistant plants into which the CP (coat protein) gene of TMV has been introduced show symptoms due to viral infection (for example, see Non-Patent Document 1). In addition, a method of imparting virus resistance by expressing a genomic gene of an attenuated virus strain in a plant is known (for example, see Non-Patent Document 2).
[0005]
By the way, the virus genome of a virus such as TMV encodes only limited genetic information. Therefore, in order to propagate the virus, in addition to factors encoded by the virus itself, in the host cell (host organism), It is known that host factors are essential.
[0006]
As such host factors, the TOM1 (tobamovirus multiplication 1) gene and the TOM3 (tobamovirus multiplication 3) gene of Arabidopsis thaliana are known (for example, see Non-Patent Documents 3 and 4). The TOM1 gene and the TOM3 gene have been identified and isolated from the Arabidopsis genome as genes encoding host factors involved in the growth of tobamovirus such as TMV. These genes are homologous to each other, and all are predicted to encode seven transmembrane proteins.
[0007]
It is known that in the Arabidopsis thaliana mutant strain deficient in the TOM1 gene, TMV proliferation is suppressed to be lower than that in the wild type. Furthermore, it has been found that TMV proliferation is completely suppressed in a double mutant strain that also lacks the homologous TOM3 gene (for example, see Non-Patent Document 4).
[0008]
[Non-patent document 1]
Powell-Abel, P .; Et al., "Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic virus coat protein gene", Science, 232, p. 738-743, (1986)
[0009]
[Non-patent document 2]
Yamaya J. et al. Other Expressions, “Expression of tobacco Mosaic Virus RNA in transgenic plants”, Mol. Gen. Genet. 315, p. 173-175, 1988
[0010]
[Non-Patent Document 3]
Takuya Yamanaka et al., "TOM1, an Arabidopsis gene required for efficient multiplication of a tobamovirus, encodes aproducer. Natl. Acad. Sci. USA, August 29, 2000, vol. 97, no. 18, p. 10107-10112
[0011]
[Non-patent document 4]
Takayama Yamanaka et al., "Complete Inhibition of Tobamovirs Multiplication by Simultaneous Mutations in Two Homologus Host Genes. 76, No. 5, Mar. 2002, p. 2491-2497
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
However, conventional control of plant diseases by pesticides involves problems of residual pesticides and safety problems for the environment, animals, plants, and humans.
[0013]
In the case where a foreign gene as described above, particularly a virus gene, is introduced into a plant to produce a virus-resistant plant, for example, in a transformed plant into which the virus gene has been introduced, one of the viral RNAs expressed in the plant is obtained. There is a problem that a part of the virus recombines with a virus RNA which is infected from the outside and a new virus which cannot exist in nature appears. In addition, there is also a problem with safety and the environment that it is unclear how the plant into which the virus gene has been introduced has a long-term effect on the human body and the environment.
[0014]
Therefore, there is a strong need for a virus-resistant plant that is more safe for the environment, plants, animals, and humans, and a method for producing the same.
[0015]
The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for producing a plant resistant to a virus by suppressing the expression of an endogenous gene of a plant involved in the propagation of the virus. And a virus-resistant plant produced by the production method.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems, and as a result, from the tobacco (Nicotiana tabacum) cDNA library, a homologue of the Arabidopsis thaliana TOM1 gene and the TOM3 gene, NtTOM1 (Nicotiana tabacum-TOM1 Homelogue) gene and NtTOM3Tam3NiCoMtOmTam3NiCoMtNiMatMtNiCoMtOmTam3NiTam3NiMo (Homologue) gene was isolated and identified, and the expression of the gene was suppressed by RNAi. It was originally reported that TMV growth was suppressed along with the suppression of NtTOM1 gene and NtTOM3 gene expression in the transformed tobacco. As a result, the present invention has been completed.
[0017]
That is, the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention solves the above-mentioned problems by suppressing the expression of a gene encoding a host factor related to the growth of the virus by RNAi, And produce plants having resistance.
[0018]
According to the above method, the expression of a gene encoding a host factor related to the propagation of a virus can be effectively suppressed by RNAi. For this reason, it can control that the virus which infected the plant multiplies in a plant. Therefore, it is possible to easily produce a plant having resistance to the virus. Furthermore, according to the present invention, since a foreign gene, particularly a virus gene, etc. is not introduced into a plant, it is possible to produce a plant which is highly safe for the environment, animals and plants, and humans.
[0019]
When there are a plurality of the above host factors, a plant having stronger resistance to the virus can be produced by suppressing the expression of genes encoding the plurality of host factors.
[0020]
In addition, a method for producing a virus-resistant plant according to the present invention is characterized in that the virus is a tobamovirus in order to solve the above problems.
[0021]
According to the above method, plants having resistance to tobamovirus that infects a wide range of plants can be easily produced.
[0022]
Further, the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention is characterized in that the virus is a tobacco mosaic virus in order to solve the above problems.
[0023]
According to the above method, a plant having resistance to TMV that infects many agriculturally useful plant resources such as tomato, melon and tobacco can be easily produced.
[0024]
In order to solve the above-mentioned problems, the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, when the above-mentioned plant is Arabidopsis thaliana, the gene encoding the above host factor is the following (a) or (b): It is characterized by being a gene encoding a protein. (A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4; (B) a host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 wherein one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.
[0025]
According to the above method, for example, the expression of the TOM1 gene or TOM3 gene, which is a host factor associated with the growth of a virus (eg, tobamovirus, TMV, etc.), can be reliably suppressed. As a result, the growth of a virus infected with Arabidopsis thaliana can be effectively suppressed, so that Arabidopsis thaliana having high resistance to the virus can be easily produced.
[0026]
In addition, after suppressing the expression of the TOM1 gene, it is more preferable to further suppress the expression of the TOM3 gene. As a result, Arabidopsis thaliana having a stronger virus resistance can be produced.
[0027]
Further, in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, when the plant is tobacco, the gene encoding the host factor may be any of the following (c) or (d): It is characterized by being a gene encoding a protein. (C) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. (D) a host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.
[0028]
According to the above method, for example, the expression of the NtTOM1 gene, which is a host factor associated with the propagation of a virus (eg, tobamovirus, TMV, etc.), can be reliably suppressed. As a result, the growth of the virus that has infected the tobacco can be effectively suppressed, so that tobacco having high resistance to the virus can be easily produced.
[0029]
Further, in order to solve the above-mentioned problems, the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention further comprises expressing the expression of a gene encoding the following protein (e) or (f), which is a host factor, by RNAi , Whereby plants having stronger resistance to viruses are produced. (E) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. (F) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.
[0030]
According to the above method, for example, the expression of the NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene, which are host factors related to the propagation of a virus (eg, tobamovirus, TMV, etc.), can be suppressed at the same time. It is possible to easily produce cigarettes having properties.
[0031]
As a specific method for producing a plant individual in which both the expression of the NtTOM1 gene and the expression of the NtTOM3 gene are suppressed by RNAi, for example, an individual (tobacco) in which the expression of the NtTOM1 gene is suppressed by RNAi and a RNAi Or an RNAi plasmid (or one or more plasmids) for suppressing the expression of the NtTOM1 gene and the expression of the NtTOM3 gene in one individual. Examples include a method for introduction, but the method is not particularly limited.
[0032]
Further, in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, in order to solve the above problems, when the plant is a tomato, the gene encoding the host factor is represented by the following (g) or (h): It is characterized by being a gene encoding a protein. (G) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14; (H) a host involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14 wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. factor.
[0033]
According to the above-described method, for example, the expression of LeTH1, LeTH2, or LeTH3 genes, which are host factors associated with the propagation of viruses (eg, tobamovirus, TMV, etc.), can be reliably suppressed. As a result, the growth of the virus that has infected the tomato can be effectively suppressed, so that a tomato having resistance to the virus can be easily produced.
[0034]
In addition, after suppressing the expression of the LeTH3 gene, it is more preferable to further suppress the expression of the LeTH1 gene and / or the LeTH2 gene. This makes it possible to produce tomatoes that have stronger virus resistance.
[0035]
Further, in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, in order to solve the above problems, when the plant is melon, the gene encoding the host factor is the following (i) or (j): It is characterized by being a gene encoding a protein. (I) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; (J) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.
[0036]
According to the above method, for example, the expression of the CmTH1 gene, which is a host factor associated with the growth of a virus (eg, tobamovirus or TMV), can be reliably suppressed. Thereby, the growth of the virus infected with the melon can be effectively suppressed, so that the melon having the resistance to the virus can be easily produced.
[0037]
Further, in order to solve the above problems, the virus-resistant plant according to the present invention is produced by any one of the above-described methods for producing a virus-resistant plant.
[0038]
According to the above configuration, the virus-resistant plant according to the present invention (for example, tobacco, Arabidopsis, tomato, melon, or the like) has high resistance to viruses. Furthermore, since a foreign gene, particularly a virus gene, etc., is not introduced into a plant, it is extremely safe for the environment, animals, plants, and humans.
[0039]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention produces a virus-resistant plant that cannot grow in a plant even if the virus infects the plant, by using RNAi to suppress the expression of a gene encoding a host factor required for the growth of the virus. And virus-resistant plants produced by this method. Therefore, the method for producing a virus-resistant plant and the virus-resistant plant according to the present invention will be described below.
[0040]
One embodiment of the method for producing a virus-resistant plant and the virus-resistant plant of the present invention will be described below with reference to FIGS. Note that the present invention is not limited to this.
[0041]
(1) Method for producing virus-resistant plant
The method for producing a virus-resistant plant according to the present invention is a method for producing a plant resistant to the virus by suppressing the expression of a gene encoding a host factor related to the growth of the virus by RNAi. Other steps, conditions, and the like are not particularly limited.
RNAi is a technology that suppresses the expression of a specific gene by RNA interference (RNA interference). RNAi can be induced, for example, by introducing short double-stranded RNA into cells, tissues, organs, individuals, and the like. When short double-stranded RNA is introduced into cells, degradation of mRNA that hybridizes with the double-stranded RNA is promoted, so that expression of the target gene is suppressed. The method for injecting double-stranded RNA into cells includes a liposome method, an electroporation method, and microinjection, but is not particularly limited. The double-stranded RNA to be injected is more preferably 21 to 23 base pairs, but is not limited thereto.
[0042]
In addition to the above-mentioned method, as a method for performing RNAi, a gene cassette connected via a linker sequence so that the sense strand and the antisense strand of the gene whose expression is to be suppressed is transcribed may be transcribed in a host cell in vivo. Then, an RNA (inverted repeat RNA) that forms a double strand in the molecule is generated, thereby suppressing the expression of a host gene corresponding to the RNA. According to this method, RNAi can be generated more continuously in cells, tissues, organs, individuals, and the like than in the above-described method, and as a result, the expression of the target gene can be suppressed more continuously. it can.
[0043]
Specifically, for example, as shown in FIG. 2 (a), downstream of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter indicated by P35S in the figure, the reverse of the TOM1 homolog (for example, the NtTOM1 gene), which is a host factor involved in virus propagation, A construct (RNAi plasmid) is prepared by sequentially inserting a direction cDNA, a GUS (β-Glucuronidase) gene fragment as a linker sequence, and a forward cDNA of a TOM1 homolog (for example, the NtTOM1 gene). Then, the RNAi plasmid is introduced into a plant and transcribed in vivo, thereby generating an inverted repeat RNA which forms a double strand in the molecule as shown in FIG. 2 (b). Thereby, the expression of the endogenous TOM1 homolog gene corresponding to the RNA (gene) in the plant is suppressed.
[0044]
The gene encoding the host factor used in the RNAi plasmid is not limited to the TOM1 homolog gene, and may be the TOM1 gene and the TOM3 gene of Arabidopsis thaliana, and the TOM1 homolog gene and the TOM3 homolog gene of various plants. It goes without saying that it is good. The order and orientation of the antisense strand gene and the sense strand gene to be incorporated into the RNAi plasmid are such that RNA that is transcribed and generated in vivo in a plant is double-stranded as inverted repeat RNA in the molecule. Is not particularly limited as long as the order, orientation, and the like are such as to form.
[0045]
In addition, the method for performing RNAi and the materials such as vectors may be any method or material that can suppress the expression of the target gene in the plant, and are not limited to the above methods and materials, and may be any of conventionally known methods. RNAi implementation methods, materials and the like can be used. Specifically, for example, the linker sequence connecting the TOM1 homolog antisense strand and the TOM1 homolog sense strand is not limited to the β-Glucuronidase gene fragment, and RNA generated by in vivo transcription is not included in the molecule. Any linker sequence may be used as long as it is a conventionally known linker sequence that can take an inverted repeat RNA structure that forms a double strand, and the base sequence, length, direction, and the like of the linker sequence are not particularly limited. In addition, the promoter sequence is not limited to the cauliflower mosaic virus 35S promoter, and a conventionally known promoter capable of generating an inverted repeat RNA that forms a double strand in a molecule by in vivo transcription (a strong and constantly read promoter). Can be used. In addition, it is also possible to use a promoter that functions at a specific development time, a specific tissue, an organ, or the like, or a promoter that functions under specific conditions.
[0046]
In addition, the method for producing the RNAi plasmid may be a conventionally known method, and is not particularly limited. For example, conventionally known genetic engineering methods such as PCR and restriction enzyme treatment can be used.
[0047]
Examples of a method for introducing the above plasmid into a plant include a conventionally known genetic engineering method, a physical method, and a chemical method. For example, as shown in Examples described later, a leaf disk method using Agrobacterium tumefaciens, a microinjection method in which DNA is directly injected under a microscope with a microscopic glass tube, and an electroporation method that makes a microhole in a cell membrane by instantaneous high voltage. Conventionally known methods such as a translation method and a method using a particle gun in which DNA is bound to gold particles and shot into a tissue with a special gun are used, but are not particularly limited.
[0048]
Further, the virus is preferably a tobamovirus. The tobamovirus group is a positive-stranded, single-stranded RNA virus classified in the alpha-like virus supergroup. Among tobamoviruses, TMV is particularly preferable. Tobamoviruses including TMV are viruses that infect many plants and cause plant diseases. Therefore, by suppressing the growth of a tobamovirus such as TMV in a plant, the occurrence of a plant disease caused by the infection and growth of a tobamovirus such as TMV can be surely suppressed.
[0049]
Further, a gene encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention may be a gene encoding the following protein (a) or (b) when the plant is Arabidopsis thaliana. Good. (A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4; (B) a host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 wherein one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added. These genes include, for example, the TOM1 cDNA shown in SEQ ID NO: 1 and the TOM3 cDNA shown in SEQ ID NO: 3.
[0050]
Further, the gene encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention may be a gene encoding the following protein (c) or (d) when the plant is tobacco. Good. (C) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8; (D) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 8, wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. These genes include, for example, NtTOM1 cDNA shown in SEQ ID NO: 5. The tobacco preferably has an N gene that is a virus (TMV) resistance gene, but is not particularly limited.
[0051]
In addition, RNAi suppresses the expression of a gene encoding the above-described protein (c) or (d), and further suppresses the expression of a gene encoding the following protein (e) or (f) by RNAi. Thus, a method for producing a plant having higher resistance to a virus is preferred. (E) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8. (F) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added. These genes include, for example, NtTOM3 cDNA shown in SEQ ID NO: 7 and the like.
[0052]
That is, there is a case where the expression of the NtTOM1 gene is further suppressed by RNAi after the expression of the NtTOM1 gene is suppressed by RNAi. This is because, as shown in the examples described later, when only the expression of the NtTOM3 gene was suppressed, a sufficient virus growth inhibitory effect was not obtained, but when only the expression of the NtTOM1 gene was suppressed, sufficient virus growth was suppressed. This is because a suppressive effect is obtained, and when the expression of the NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene is simultaneously suppressed, a stronger virus growth suppressive effect can be obtained.
[0053]
In addition, as a specific method for producing a plant individual in which the expression of a plurality of TOM1 homolog genes is simultaneously suppressed by RNAi, for example, as shown in Examples described later, the expression of one TOM1 homolog gene is suppressed by RNAi. A method of multiplying a plant individual that has been subjected to expression of another TOM1 homolog gene by RNAi, or an RNAi plasmid (one or more (Which may be a plasmid) is introduced into a single plant, but the method is not particularly limited.
[0054]
Here, the NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene will be described in detail. The NtTOM1 gene and NtTOM3 gene are genes found as tobacco homologs of the TOM1 gene and TOM3 gene of Arabidopsis thaliana, and encode host factors involved in tobamovirus growth in tobacco. The Arabidopsis thaliana TOM1 gene corresponds to a cDNA consisting of 1215 base pairs having the 139th to 1014th base sequences as an open reading frame (ORF) among the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, and 291 shown in SEQ ID NO: 2. It encodes a TOM1 protein consisting of the amino acid sequence of the residues. Further, the TOM3 gene corresponds to a cDNA consisting of 912 base pairs having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 as an ORF, and encodes a TOM3 protein consisting of an amino acid sequence of 303 residues shown in SEQ ID NO: 4.
[0055]
The NtTOM1 gene of tobacco corresponds to a cDNA consisting of 1106 base pairs having the 124- to 990-th base sequence as an ORF of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5, and has 288 residues of SEQ ID NO: 6. It encodes an NtTOM1 protein consisting of an amino acid sequence. The NtTOM3 gene corresponds to a cDNA consisting of 1122 base pairs having the 98th to 982nd base sequences as ORFs in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7, and comprises an amino acid sequence of 294 residues shown in SEQ ID NO: 8. It encodes the NtTOM3 protein.
[0056]
FIG. 1 shows an alignment in which the amino acid sequences of the TOM1 protein, TOM3 protein, NtTOM1 protein, and NtTOM3 protein are compared. In the figure, regions surrounded by lines indicate regions having high homology between these proteins. As shown in FIG. 1, the TOM1 protein and the NtTOM1 protein show high homology, and the TOM3 protein and the NtTOM3 protein show high homology. In addition, these four proteins show high homology, respectively. Further, according to the protein structure prediction program SOSUI, the TOM1 protein, the TOM3 protein, and the NtTOM3 protein are predicted to be seven transmembrane proteins, and the NtTOM1 protein is predicted to be a six transmembrane protein. Is done.
[0057]
As described above, since TOM1 and NtTOM1 have high homology and TOM3 and NtTOM3 have high homology, in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, when the Arabidopsis thaliana plant is used, the TOM1 gene is expressed by RNAi. It is thought that by suppressing the expression of E. coli, high virus-resistant Arabidopsis thaliana can be efficiently produced. In addition, it is considered that by inhibiting the expression of the TOM1 gene by RNAi and further suppressing the expression of the TOM3 gene by RNAi, it is possible to produce virus-resistant Arabidopsis thaliana that can almost completely suppress virus growth.
[0058]
The gene encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention encodes the following protein (g) or (h) when the plant is tomato (Lycopersicon esculentum). Any gene can be used. (G) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14; (H) a host involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14 wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. factor. These genes include, for example, LeTH1 (Lycopersicon esculentum-TOM1 Homologue 1) cDNA shown in SEQ ID NO: 9, LeTH2 (Lycopersicon esculentum-TOM1 Homlogue 2) cDNA shown in SEQ ID NO: 11, and cDNA shown in SEQ ID NO: 13 shown in SEQ ID NO: 13 Lycopersicon esculentum-TOM1 homologue 3) cDNA and the like.
[0059]
Further, the gene encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention encodes the following protein (i) or (j) when the plant is melon (Cucumis melo): Any gene can be used. (I) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; (J) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added. These genes include, for example, CmTH1 (Cucumis melo-TOM1 Homelogue 1) cDNA shown in SEQ ID NO: 15.
[0060]
The LeTH1, LeTH2, and LeTH3 genes are genes isolated and identified as tomato homologs of the TOM1 gene of Arabidopsis thaliana. Further, the CmTH1 gene is a gene isolated and identified as a melon homolog of the TOM1 gene of Arabidopsis thaliana. All of these genes encode host factors involved in the growth of tobamovirus in tomato or melon. The LeTH1 gene corresponds to a 1353 base pair cDNA having the 160th to 1047th base sequences as ORFs in the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, and has a 295 residue amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10. Encodes a protein. Also, the LeTH2 gene corresponds to a 1316 base pair cDNA having the base sequence at positions 156 to 1049 as an ORF in the base sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the amino acid sequence of 297 residues shown in SEQ ID NO: 12 LeTH2 protein. In addition, the LeTH3 gene corresponds to a cDNA consisting of 1278 base pairs having the 31st to 897th base sequences as ORFs in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13, and has an amino acid sequence of 288 residues shown in SEQ ID NO: 14. Encoding a LeTH3 protein consisting of
[0061]
In addition, the CmTH1 gene corresponds to a cDNA consisting of 1242 base pairs having the 224-1102th base sequence as an ORF in the base sequence shown in SEQ ID NO: 15, and an amino acid sequence of 292 residues shown in SEQ ID NO: 16. Encoding a CmTH1 protein consisting of
[0062]
FIG. 9 shows an alignment in which the amino acid sequences of these LeTH1, LeTH2, and LeTH3 proteins were compared with the amino acid sequences of the TOM1 and TOM3 proteins. FIG. 10 shows an alignment obtained by comparing the amino acid sequences of the CmTH1 protein and the TOM3 protein. FIG. 11 shows an alignment comparing the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, the LeTH1 protein, the LeTH2 protein, the LeTH3 protein, and the CmTH1 protein. The region surrounded by the line in the figure indicates a region with high homology.
[0063]
From these results, it was found that the LeTH1 protein and the CmTH1 protein had higher homology with the TOM3 protein, and the LeTH3 protein had higher homology with the TOM1 protein. Therefore, there is a possibility that the LeTH3 protein is a tomato homolog of the TOM1 protein, the LeTH1 protein is a tomato homolog of the TOM3 protein, and the CmTH1 protein is a melon homolog of the TOM3 protein. According to the protein structure prediction program SOSUI, the LeTH1 protein and LeTH2 protein were predicted to be six transmembrane proteins, and the LeTH3 protein and CmTH1 protein were predicted to be seven transmembrane proteins.
[0064]
Further, FIG. 12 shows an alignment comparing the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, the NtTOM1 protein, the NtTOM3 protein, the LeTH1 protein, the LeTH2 protein, the LeTH3 protein, and the CmTH1 protein. In the figure, a range surrounded by a line indicates the same amino acid residue, and a colored portion (gray) indicates a similar amino acid residue. Arrows in the figure indicate unique amino acid residues of the LeTH3 protein as compared to the TOM1, NtTOM1, and LeTH2 proteins. As shown in the figure, these eight proteins have high homology to each other.
[0065]
FIG. 13 shows a phylogenetic tree based on the amino acid sequence of the TOM1 homolog created based on the results of the protein alignment described above. The phylogenetic tree was created using GENETYX Mac (Method: UPGMA). As shown in this figure, the LeTH3 protein and the NtTOM1 protein are closely related, and both are considered to be TOM1 homologs. In addition, LeTH1 protein and NtTOM3 protein are closely related, and both are considered to be TOM3 homologs. The CmTH1 protein is also considered to be a TOM3 homolog. The LeTH2 protein was found to be closer to the TOM1 protein than the TOM3 protein.
[0066]
From these facts, in the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, when the plant is a tomato, high expression of a virus-resistant tomato can be efficiently produced by suppressing the expression of the LeTH3 gene by RNAi. I think that the. In addition, by suppressing the expression of LeTH3 gene by RNAi and further suppressing the expression of LeTH1 gene and / or LeTH2 gene by RNAi, it is possible to produce virus-resistant tomato that can almost completely suppress the growth of virus. I think that the.
[0067]
The “gene” encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant of the present invention includes RNA and DNA. RNA includes mRNA, and DNA includes, for example, cDNA and genomic DNA obtained by cloning and chemical synthesis techniques or a combination thereof. The DNA may be double-stranded or single-stranded. Further, the “gene” encoding a host factor used in the method for producing a virus-resistant plant of the present invention is a gene other than the sequence encoding the protein of SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, or 16. In addition, it may include a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
[0068]
As described above, according to the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, the expression of host factors related to the growth of the virus in the plant is suppressed by RNAi, so that the virus infected to the plant grows. You can't do that. For this reason, it is possible to efficiently suppress the growth of the virus without introducing an exogenous gene such as a virus-derived gene which is highly dangerous to the environment, animals and plants, and humans. For this reason, it is possible to easily produce a plant that has excellent resistance to viruses such as TMV and is highly safe for the environment, animals and plants, and humans.
[0069]
Furthermore, since the present invention suppresses the expression of a gene encoding a host factor associated with the growth of a virus by using RNAi, for example, when the host factor is knocked out (for example, when the host factor is encoded) (E.g., when a function-deficient plant is produced by introducing a mutation into a gene), the load on the plant can be reduced. Furthermore, a plant in which the function of a specific gene is suppressed can be produced more easily than when knocking out a specific gene of a plant. Therefore, it can be said that the virus-resistant production method according to the present invention is a simple and highly safe technique.
[0070]
(2) Virus-resistant plant according to the present invention
The virus-resistant plant according to the present invention may be a plant produced by the above-described method for producing a virus-resistant plant, and other configurations and the like are not particularly limited.
[0071]
In the virus-resistant plant according to the present invention, the expression of host factors involved in virus growth is suppressed by RNAi. Therefore, even when the plant is infected with a virus, the virus growth is efficiently suppressed. become. Therefore, the virus-resistant plant according to the present invention is a plant having high resistance to viruses. Furthermore, since it does not have an exogenous gene such as a gene derived from a virus, it is a plant that is extremely safe for the environment, animals and plants, and humans.
[0072]
Hereinafter, embodiments will be described with reference to the accompanying drawings, and embodiments of the present invention will be described in further detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in detail. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various changes can be made within the scope shown in the claims, and embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means are also described. It is included in the technical scope of the invention.
[0073]
【Example】
[1] Experimental materials and methods
First, an experimental material and an experimental method used in this example will be described. First, tobacco was used as a plant. More specifically, Nicotiana tabacum L. cv. Samsun, and Nicotiana tabacum L .; cv. Samsun NN was used. The Samsun strain does not have the N gene, which is a TMV resistance gene, and is a strain in which TMV is systemically infected. The Samsun NN strain has the N gene, which is a TMV resistance gene, and is necrotic due to TMV infection. It is a line that forms plaques.
[0074]
The viruses used for inoculation into plants were TMV-L strain (tobacco mosaic virus, tomato line) (Ohno et al., 1984, J. Biochem. 96, p. 1915-1923) and CMV-Y strain (cucumber). Mosaic virus, macular line) (Suzuki et al., 1991, "Functional analysis of deletion mutants of cucumber mosaic virus RNA3 using an in vitro strophy, lipotripsy lipolysis, in vitro liposcopy, lipolysis, lipolysis, lipolysis, liposome, liposome, etc.). The strain used in the leaf disk method for introducing a plasmid that causes RNAi into tobacco is Agrobacterium tumefaciens EHA105 strain.
[0075]
The tobacco was grown on a culture soil for raising seedlings by supplying tap water in a greenhouse at 23 ° C. for a period of 16 hours. For tobacco crosses, the buds to be female parents were selected, petals and stamens were removed from the buds using tweezers, and the pistils were exposed. Then, the stamen was taken out of the flower to be the masculine with tweezers, and brought into contact with the stigma of the pistil to attach pollen. Tweezers were performed while disinfecting with 70% ethanol. RNA extraction of tobacco used RNeasy mini kit (Qiagen), and the method followed the attached instructions.
[0076]
[2] Isolation of tobacco homologues of Arabidopsis TOM1 and TOM3
The homologs of the Arabidopsis thaliana TOM1 gene (see SEQ ID NO: 1) and the TOM3 gene (see SEQ ID NO: 3) in tobacco were identified and isolated. Specifically, a cDNA fragment of a homolog of the Arabidopsis thaliana TOM1 gene and the TOM3 gene was amplified from a tobacco cDNA library using the degenerate PCR method, cloned, and then subjected to sequencing to determine the nucleotide sequence. Further, based on the obtained information on the two types of base sequences, a full-length mRNA sequence was determined by using the 5′-terminal and 3′-terminal rapid amplification of cDNA ends (RACE). As shown in FIG. 1, an open reading frame (ORF) encoding an amino acid sequence highly homologous to the Arabidopsis thaliana TOM1 gene and the TOM3 gene is present on each of the sequences, and the corresponding genes are represented by the NtTOM1 gene ( SEQ ID NO: 5) and NtTOM3 gene (see SEQ ID NO: 7).
[0077]
[3] Suppression of NtTOM1 gene and NtTOM3 gene expression by RNAi
We thought that TMV resistance could be imparted by suppressing the expression of the NtTOM1 gene and NtTOM3 gene in tobacco, and we attempted to suppress the expression of the above genes by RNAi.
[0078]
Specifically, as shown in FIG. 2 (a), an inverted cDNA of NtTOM1, a GUS fragment (in the figure, a gene fragment of β-Glucuronidase indicated by GUS fr.) And a NtTOM1 downstream of the 35S promoter of the vector pBI121. An RNAi plasmid (NtTOM1) into which forward cDNA was inserted in order was prepared by conventionally known PCR, restriction enzyme treatment and the like. Similarly, an RNAi plasmid (NtTOM3) in which a reverse cDNA of NtTOM3, a GUS fragment, and a forward cDNA of NtTOM3 were sequentially inserted downstream of the 35S promoter of the vector pBI121 was prepared. By introducing these RNAi plasmids into tobacco, as shown in FIG. 2 (b), RNA in which the sequence of the gene forms a double strand in the molecule is generated by in vivo transcription, and in the tobacco body. Inverted repeat RNA results.
[0079]
The vector pBI121 used here is a T-DNA vector having a size of 13 kb, has a kanamycin resistance gene as an antibiotic resistance marker, and has a cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter and a It has a driven GUS fragment and a poly A (adenylic acid) addition sequence.
[0080]
Thereafter, this RNAi plasmid was introduced into tobacco by a leaf disk method using Agrobacterium tumefaciens. Transformation of tobacco by the leaf disk method using Agrobacterium basically followed the method of Holster et al. (Holster et al., 1978, Mol. Gen. Genet., 163, p. 181-187). Specifically, after placing leaf fragments in a solution of Agrobacterium tumefaciens containing an RNAi plasmid, discs were planted with plant hormones (0.1 mg / L a-naphthalen acetic acids (NAA (BA)), 1 mg / L 6-benzylideneine). ) And 50 mg / L kanamycin. The transformant shoots that germinated on this medium were selected, and the transformant shoots were grown on a selection medium (50 mg / L kanamycin). For transformation, two types of tobacco, a Samsun strain that is systemically infected with TMV and a SamsunNN strain that has an N gene, which is a TMV resistance gene, were used. Therefore, the lines transformed by introducing the RNAi plasmid (NtTOM1) are described as Samsun transformants (NtTOM1) and Samsun NN transformants (NtTOM1), respectively, and transformed by introducing the RNAi plasmid (NtTOM3). The lines will be described as Samsun transformant (NtTOM3) and Samsun NN transformant (NtTOM3), respectively.
[0081]
[4] Analysis of Samsun NN transformant (NtTOM1)
Next, the Samsun NN transformant (NtTOM1) prepared in the above [3] was analyzed in detail. Specifically, a strain in which an RNAi plasmid (NtTOM1) was introduced into a tobacco Samsun NN strain having an N gene and forming local necrotic lesions upon infection with TMV and the expression of the NtTOM1 gene was suppressed by RNAi, was used in Northern plants. Hybridization analysis and TMV local region assay were performed.
[0082]
First, RNA was respectively extracted from wild-type Samsun NN (wt) and a Samsun NN transformant (NtTOM1), and it was examined by Northern hybridization analysis whether or not the expression of the endogenous NtTOM1 gene was suppressed by RNAi. . The analysis by Northern hybridization was basically performed according to the method of Ishikawa et al. (Ishikawa, M., et al., "Effect of the tommutation of Arabidopsis thorapsia opticamplification RNA." Virol., 67, p.5328-5338, (1993)). Specifically, the amount of RNA was 10 μg per sample. As a probe, a DNA fragment amplified by PCR using the ORF region of NtTOM1 cDNA as a template was used.
[0083]
As a result, as shown in FIG. 3 (b), endogenous NtTOM1 mRNA confirmed in wild-type Samsun NN (indicated by wt in the figure) was reduced in Samsun NN transformants (NtTOM1) 1, 2, 4 to 7. It could not be confirmed (position indicated by NtTOM1 mRNA in the figure). On the other hand, in the Samsun NN transformant (NtTOM1) 1, 2, 4 to 7, RNA (NtTOM1 inverted repeat RNA) derived from the RNAi plasmid (NtTOM1) was detected (the position indicated by IR in the figure). In addition, it was considered that the expression of the endogenous NtTOM1 gene was not suppressed in the Samsun NN transformant (NtTOM1) 3 because the RNAi plasmid could not be introduced or the RNAi was not sufficiently generated. . From these results, it was found that in the Samsun NN transformant (NtTOM1), the expression of the endogenous NtTOM1 gene was suppressed by RNAi.
[0084]
Next, the TMV local region assay will be described. The TMV local region assay is a virus assay using tobacco having the N gene, which is a virus resistance gene, and was specifically performed as follows.
[0085]
When a virus is inoculated to a tobacco having the N gene, which is a TMV resistance gene, local lesions (white spots in leaves) are formed, and the degree of virus growth can be observed based on the size and number of the lesions. By utilizing this property, purified TMV-L is inoculated at a concentration of 0.05 μg / ml into young leaves of about 10 to 15 cm of tobacco Samsun NN and a Samsun NN transformant (NtTOM1) about 2 months after sowing. On the 5th or 7th day, local lesions after infection were observed. Records were kept with a digital camera during observation.
[0086]
As a result, as shown in FIG. 3 (a), local necrotic lesions were formed in the leaves of wild-type Samsun NN (wt) by infection with TMV, but expression of the endogenous NtTOM1 gene was suppressed by RNAi. Almost no local necrotic lesions were formed on the leaves of the resulting Samsun NN transformant (NtTOM1) 1, 2, 4 to 7. This suggests that the suppression of NtTOM1 gene expression by RNAi almost completely suppressed the formation of local lesions due to TMV infection. In addition, local necrotic lesions were formed on the leaves of the Samsun NN transformant (NtTOM1) 3 as in the case of the wild-type Samsun. This was considered because the expression of the endogenous NtTOM1 gene was not suppressed as described above.
[0087]
From the above, it was revealed that TMV growth in Samsun NN transformant tobacco can be suppressed with the suppression of NtTOM1 gene expression by RNAi.
[0088]
[5] Analysis of Samsung NN transformant (NtTOM3)
Next, the Samsung NN transformant (NtTOM3) prepared in [3] above was analyzed in detail. Specifically, an RNAi plasmid (NtTOM3) was introduced into a Samsun NN strain having an N gene, and the NtTOM3 gene expression was suppressed by RNAi. A TMV local region assay was performed.
[0089]
The result of the Northern hybridization analysis is shown in FIG. The ORF region of NtTOM3 cDNA was used as a probe. As shown in FIG. 4B, endogenous NtTOM3 mRNA confirmed in wild-type Samsun NN (wt) could not be confirmed in Samsun NN transformants (NtTOM3) 1, 3 to 5 (NtTOM3 in the figure). position indicated by mRNA). On the other hand, in the Samsun NN transformants (NtTOM3) 1, 3 to 5, RNA (NtTOM3 inverted repeat RNA) derived from the RNAi plasmid (NtTOM3) was detected (the position indicated by IR in the figure). In addition, it was considered that the expression of the endogenous NtTOM3 gene was not suppressed in the Samsun NN transformant (NtTOM3) 2 because the RNAi plasmid could not be introduced or the RNAi was not sufficiently generated. . From these results, it was found that in the Samsung NN transformant (NtTOM3), the expression of the endogenous NtTOM3 gene was suppressed by RNAi.
[0090]
Subsequently, the result of the TMV local region assay is shown in FIG. As shown in the figure, the formation of local necrotic lesions occurred almost in the same manner in both wild-type Samsun NN (wt) and a Samsun NN transformant (NtTOM3) in which NtTOM3 expression was suppressed by RNAi.
[0091]
From the above results, it was found that even when the expression of NtTOM3 was solely suppressed by RNAi, the effect of suppressing the growth of TMV was not so significant in the Samsun NN transformant.
[0092]
[6] Analysis of Samsun transformant (NtTOM1)
Next, the Samsun transformant (NtTOM1) prepared in the above [3] was analyzed in detail. Specifically, a strain in which an RNAi plasmid (NtTOM1) was introduced into a Samsun tobacco which does not have an N gene and allows systemic infection with TMV and the expression of the NtTOM1 gene was suppressed by RNAi was the same as in the above [4]. Northern hybridization analysis was performed by the method, and further, the accumulation of TMV-L coat protein was analyzed.
[0093]
The results of Northern hybridization analysis are shown in panel B of FIG. The ORF region of NtTOM1 cDNA was used as a probe. As shown in the figure, endogenous NtTOM1 mRNA confirmed in wild-type Samsun tobacco (indicated by Swt in the figure) could not be confirmed in Samsun transformants (NtTOM1) 1 to 7 (in the figure, NtTOM1 mRNA). Position shown). On the other hand, in the Samsun transformants (NtTOM1) 1 to 7, RNA (NtTOM1 inverted repeat RNA) derived from the RNAi plasmid (NtTOM1) was detected (the position indicated by IR in the figure). From these results, it was found that in the Samsun transformant, the expression of the endogenous NtTOM1 gene was suppressed by RNAi.
[0094]
Subsequently, the accumulation of TMV-L coat protein was examined. Specifically, the inoculated leaves on the fourth day after TMV inoculation were cut off, the extracted protein was subjected to SDS-PAGE, and then stained with CBB to examine the accumulation of TMV-L coat protein.
[0095]
The result is shown in panel A of FIG. S wt indicates wild-type Samsun tobacco, and S wt (1/10) indicates a 10-fold diluted S wt protein extract. As shown in the figure, the Samsun transformant (NtTOM1) showed less accumulation of TMV-L coat protein than wild-type Samsun tobacco, but did not mean that it did not accumulate at all.
[0096]
From the above, it was found that, in the Samsun transformant (NtTOM1), by suppressing the expression of the NtTOM1 gene by RNAi, the proliferation of TMV can be suppressed, but not completely.
[0097]
[7] Analysis of Samsun transformant (NtTOM3)
Subsequently, the Samsun transformant (NtTOM3) prepared in the above [3] was analyzed in detail. Specifically, a strain obtained by introducing an RNAi plasmid (NtTOM3) into a Samsun tobacco which does not have an N gene and allows systemic infection with TMV, and in which NtTOM3 gene expression is suppressed by RNAi, is the same as [4]. Northern hybridization analysis was performed by the same method, and the accumulation of TMV-L coat protein was analyzed by the same method as in the above [6].
[0098]
The results of Northern hybridization analysis are shown in panel B of FIG. The ORF region of NtTOM3 cDNA was used as a probe. As shown in the figure, endogenous NtTOM3 mRNA confirmed in wild-type Samsun tobacco (indicated by Swt in the figure) could not be confirmed in Samsun transformants (NtTOM3) 1 to 4 and 6 (NtTOM3 in the figure). position indicated by mRNA). On the other hand, in the Samsun transformants (NtTOM3) 1 to 4 and 6, RNA (NtTOM3 inverted repeat RNA) derived from the RNAi plasmid (NtTOM3) was detected (the position indicated by IR in the figure). In addition, it was considered that the expression of the endogenous NtTOM3 gene in the Samsun transformant (NtTOM3) 5 was not suppressed because the RNAi plasmid could not be introduced or RNAi was not sufficiently generated. From these results, it was found that in the Samsun transformant, the expression of the endogenous NtTOM3 gene was suppressed by RNAi.
[0099]
Subsequently, the accumulation of TMV-L coat protein was examined. The result is shown in panel A of FIG. S wt indicates wild-type Samsun tobacco, and S wt (1/10) indicates a 10-fold diluted S wt protein extract. As shown in the figure, it was found that the TMV-L coat protein was accumulated in the Samsun transformant (NtTOM3) almost similarly to wild-type Samsun tobacco.
[0100]
From the above, it was found that, in the Samsun transformant (NtTOM3), even when the expression of the NtTOM3 gene alone was suppressed by RNAi, the growth of TMV could not be sufficiently suppressed.
[0101]
[8] Effect of simultaneous suppression of NtTOM1 and NtTOM3 by RNAi
Next, an individual in which the expression of both the endogenous NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene was suppressed by RNAi was prepared, and its properties were analyzed. Specifically, as shown in FIG. 7, a Samsun transformant (NtTOM1) in which the expression of the NtTOM1 gene was suppressed by RNAi and a Samsun transformant (NtTOM3) in which the expression of the NtTOM3 gene was suppressed by RNAi. Tobacco was made. In the case of the Samsun NN transformant (NtTOM1), the formation of local lesions due to TMV infection was almost completely absent, so that only the Samsun transformant was used for crossover. In addition, the transgenic lines were used for crossing, and F1 individuals obtained by the crossing were named Sd1-1, Sd1-2,..., Sd1-x. Here, when the F0 plant individuals, the Samsun transformant (NtTOM1) and the Samsun transformant (NtTOM3) each have a transgene heterozygously at an independent locus, the F1 plant individual (Sd1-x) About 考え of the individuals are considered to be individuals in which both the expression of the endogenous NtTOM1 gene and NtTOM3 gene are suppressed.
[0102]
Thus, Northern hybridization analysis was performed on the multiplied tobacco (Sd1-x) to examine the presence or absence of an individual in which both the expression of the endogenous NtTOM1 gene and the expression of the NtTOM3 gene were suppressed.
[0103]
FIG. 8B shows the result. Total RNA indicates the total RNA amount. wt indicates wild-type Samsun tobacco. As shown in the figure, individuals other than Sd1-8, Sd1-11, and Sd1-14 were individuals in which the expression of the endogenous NtTOM1 gene was suppressed by RNAi. On the other hand, the individuals in which the expression of the endogenous NtTOM3 gene was suppressed by RNAi were only Sd1-2, Sd1-4, Sd1-9, and Sd1-16. From the above results, it was found that Sd1-2, Sd1-4, Sd1-9, and Sd1-16 were individuals in which the expression of the endogenous NtTOM1 gene and NtTOM3 gene were both suppressed by RNAi. These strains are indicated by circles in the figure.
[0104]
Next, the accumulated tobacco (Sd1-x) was examined for the accumulation of TMV-L coat protein. Specifically, the virus-inoculated leaves were cut off 4, 7, 13, and 43 days after inoculation of TMV-L, proteins were extracted therefrom, and the accumulation of TMV-L coat protein was determined by SDS-PAGE and CBB staining. Examined. The result is shown in FIG.
[0105]
As shown in the figure, only Sd1-2, Sd1-4, Sd1-9, and Sd1-16 showed no accumulation of TMV-L coat protein until 4 to 13 days after virus inoculation. From the above, it was found that TMV proliferation was almost completely suppressed in individuals in which both the expression of the endogenous NtTOM1 gene and the expression of the NtTOM3 gene were suppressed by RNAi. However, a low level of TMV proliferation was observed 40 days or more after the inoculation of TMV.
[0106]
In addition, even when the expression of both the NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene was suppressed by RNAi, the growth of cucumber mosaic virus (CMV) was not affected (the results are not shown). CMV belongs to the alpha-like virus supergroup, but is a different virus from tobamovirus. From these facts, it was considered that the effect of suppressing the growth of TMV by suppressing the expression of the endogenous NtTOM1 gene and NtTOM3 gene by RNAi was not a nonspecific effect.
[0107]
[9] Homolog of TOM1 in plants other than tobacco
In addition to tobacco, it was found that there were three homologs of TOM1 in tomato and one in melon, and these were identified and isolated and named LeTH1 gene, LeTH2 gene, LeTH3 gene and CmTH1 gene, respectively.
[0108]
FIG. 9 shows an alignment obtained by comparing the amino acid sequences of the proteins encoded by these TOM1 homolog genes. As shown in the figure, it was found that the amino acid sequences of the proteins encoded by the LeTH1, LeTH2, LeTH3, and CmTH1 genes and the amino acid sequence of the protein encoded by the TOM1 gene showed high homology.
[0109]
First, FIG. 9 shows an alignment in which the amino acid sequences of these LeTH1, LeTH2, and LeTH3 proteins are compared with the amino acid sequences of the TOM1 and TOM3 proteins. A region surrounded by a line in the figure indicates a region with high homology. As shown in FIG. 9, it was found that the LeTH1, LeTH2, and LeTH3 proteins, and the TOM1 and TOM3 proteins showed high homology. In addition, it was found that the LeTH1 protein had higher homology with the TOM3 protein.
[0110]
FIG. 10 shows an alignment obtained by comparing the amino acid sequences of the CmTH1 protein and the TOM3 protein. As shown in the figure, it was found that the CmTH1 protein and the TOM3 protein showed high homology.
[0111]
FIG. 11 shows an alignment comparing the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, the LeTH1 protein, the LeTH2 protein, the LeTH3 protein, and the CmTH1 protein. As shown in the figure, it was found that these six proteins had high homology to each other.
[0112]
From these results, it was found that the LeTH3 protein had a high homology with the TOM1 protein, and the LeTH1 protein and the CmTH1 protein had a higher homology with the TOM3 protein. Therefore, there is a possibility that the LeTH3 protein is a tomato homolog of the TOM1 protein, the LeTH1 protein is a tomato homolog of the TOM3 protein, and the CmTH1 protein is a melon homolog of the TOM3 protein. According to the protein structure prediction program SOSUI, the LeTH1 protein and LeTH2 protein were predicted to be six transmembrane proteins, and the LeTH3 protein and CmTH1 protein were predicted to be seven transmembrane proteins.
[0113]
From the above, it is extremely likely that TMV growth in tomato can be suppressed by suppressing the expression of any of the endogenous LeTH1, LeTH2, and LeTH3 genes of tomato by RNAi. it is conceivable that. Similarly, by suppressing the expression of the endogenous CmTH1 gene of the melon by RNAi, it is very likely that the proliferation of TMV in the melon can be suppressed.
[0114]
【The invention's effect】
As described above, according to the method for producing a virus-resistant plant according to the present invention, there is an effect that a plant having high virus resistance can be easily produced. Furthermore, since the plant has not introduced a foreign gene such as a virus gene, it has an effect that a plant with high safety can be provided to the environment, plants, animals, and humans.
[0115]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a view showing an alignment of amino acid sequences of a TOM1 protein, a TOM3 protein, an NtTOM1 protein, and an NtTOM3 protein.
FIG. 2 (a) is a diagram schematically illustrating the structure of an RNAi plasmid of a TOM1 homolog, and FIG. 2 (b) is a diagram schematically illustrating an inverted repeat RNA generated by the RNAi plasmid of (a). is there.
FIG. 3 (a) shows the results of a TMV local region assay in a Samsun NN transformant into which an RNAi plasmid (NtTOM1) has been introduced, and FIG. 3 (b) shows the result of NtTOM1 mRNA in the transformant of (a). FIG. 3 is a view showing the results of Northern hybridization analysis in which the accumulation of was analyzed.
FIG. 4 (a) shows the results of a TMV local region assay in a Samsun NN transformant into which an RNAi plasmid (NtTOM3) has been introduced, and FIG. 4 (b) shows the result of NtTOM3 mRNA in the transformant of (a). FIG. 3 is a view showing the results of Northern hybridization analysis in which the accumulation of was analyzed.
FIG. 5 shows the results of examining the accumulation of TMV-L coat protein in a Samsun transformant into which an RNAi plasmid (NtTOM1) was introduced, and FIG. 5B shows the result of NtTOM1 in the Samsun transformant. FIG. 4 shows the results of Northern hybridization analysis in which the accumulation of mRNA was examined.
FIG. 6 shows the results of examining the accumulation of TMV-L coat protein in a Samsun transformant into which an RNAi plasmid (NtTOM3) was introduced, and FIG. 6B shows the result of NtTOM3 in the Samsun transformant. FIG. 4 shows the results of Northern hybridization analysis in which the accumulation of mRNA was examined.
FIG. 7 is an explanatory diagram of a method for producing a transgenic tobacco in which the expression of the NtTOM1 gene and the NtTOM3 gene is suppressed by RNAi, by crossing.
FIG. 8 (a) shows the results of examining the accumulation of TMV-L coat protein in transgenic tobacco plants in which the expression of NtTOM1 gene and NtTOM3 gene was suppressed by RNAi, and FIG. FIG. 4 is a diagram showing the results of Northern hybridization analysis in which the accumulation of NtTOM1 mRNA and NtTOM3 mRNA in the transformed tobacco of Example 1) was examined.
FIG. 9 is a view showing an alignment in which the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, and the TOM1 homologue of tomato (LeTH1 to LeTH3) are compared.
FIG. 10 is a view showing an alignment in which the amino acid sequences of the TOM1 homolog (CmTH1) of the TOM3 protein and melon are compared.
FIG. 11 is a diagram showing an alignment in which the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, the tomographic TOM1 homolog (LeTH1 to LeTH3), and the melon TOM1 homolog (CmTH1) are compared.
FIG. 12 is a view showing an alignment in which the amino acid sequences of the TOM1 protein, the TOM3 protein, the NtTOM1 protein, the NtTOM3 protein, the tomographic TOM1 homolog (LeTH1 to LeTH3), and the melon TOM1 homolog (CmTH1) are compared.
FIG. 13 is a diagram showing a phylogenetic tree based on the amino acid sequence of the TOM1 homolog in various plants.

Claims

A method for producing a virus-resistant plant, comprising producing a plant resistant to the virus by suppressing the expression of a gene encoding a host factor related to the growth of the virus by RNAi.

The method for producing a virus-resistant plant according to claim 1, wherein the virus is a tobamovirus.

3. The method for producing a virus-resistant plant according to claim 1, wherein the virus is a tobacco mosaic virus.

When the plant is Arabidopsis thaliana, the gene encoding the host factor is a gene encoding the following protein (a) or (b): The method for producing a virus-resistant plant according to the above. (A) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4;
(B) a host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4 wherein one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.

When the plant is tobacco, the gene encoding the host factor is a gene encoding a protein of the following (c) or (d): The method for producing a virus-resistant plant according to the above.
(C) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
(D) a host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.

Furthermore, by suppressing the expression of a gene encoding the following protein (e) or (f), which is a host factor, by RNAi, a plant having higher resistance to virus is produced. The method for producing a virus-resistant plant according to claim 5.
(E) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
(F) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.

When the plant is a tomato, the gene encoding the host factor is a gene encoding the following protein (g) or (h): The method for producing a virus-resistant plant according to the above.
(G) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14;
(H) a host involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, 12, or 14 wherein one or more amino acids are substituted, deleted, inserted, and / or added. factor.

When the plant is a melon, the gene encoding the host factor is a gene encoding a protein of the following (i) or (j): The method for producing a virus-resistant plant according to the above.
(I) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16;
(J) A host factor involved in the propagation of a virus, comprising an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added.

A virus-resistant plant produced by the method for producing a virus-resistant plant according to claim 1.