JP2004105075A - コーヒー由来カフェインシンターゼおよび該酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、カフェインシンターゼをコードするＤＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、
▲１▼工業用、食品用または医療用酵素として利用できるカフェインシンターゼを効率よく生産する。▲２▼カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する。
▲３▼カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。等の課題を達成する。
【解決手段】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し、カフェインシンターゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含むベクターで形質転換された微生物または植物体または培養細胞を用いてカフェインシンターゼを生産する、またはアンチセンスＲＮＡによりカフェインシンターゼの発現量を抑制する。
【効果】本発明方法は、植物中のカフェイン含有量を変化させ得る。またカフェインシンターゼを生産できる。
【選択図】　なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カフェインシンターゼ、該酵素をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された微生物および植物、ならびに該植物またはその培養細胞または組織を用いて、カフェイン及びカフェインまたはその前駆体を製造する方法、該ＲＮＡを含む核酸構造物によりカフェイン及びテオブロミンまたはその前駆体量を変化させる方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３１，　２５７５−（１９９２）
【０００４】
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１４６，　８７−（１９７５）
【０００５】
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３７，　１５７７−（１９９４）
【０００６】
【非特許文献４】Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，　９８，　６２９−（１９９６）
【０００７】
【特許文献１】特願平１１−１４６３５８号公報
【０００８】
【特許文献２】特願２０００−１５１７１８号公報
【０００９】
【特許文献３】特願２０００−２７５０６３）号公報
【００１０】
【特許文献４】特願２００１−２０９０７２公報
カフェインは、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）などのツバキ科ツバキ属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ　）等のアカネ科コーヒー属植物等に含まれるプリンアルカロイドであり、医薬品原料や食品添加物として使用されている。現在のところ、カフェインは前記植物種を始めとするカフェイン産生植物からの抽出、または有機合成によって製造されている。また、チャやコーヒーなどの嗜好品においては、それらの刺激性を緩和また又は増強するために、古典的な育種手法等を用いてカフェインおよびその中間体の含有量の低減または増加が試みられている。
【００１１】
カフェインはキサントシンからテオブロミンを経て３段階のＮ−メチル化により生合成されることが１４Ｃ−トレーサー実験により明らかにされている。　［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３１，　２５７５−（１９９２）］。このメチル化を触媒する酵素活性は、１９７５年にチャ葉の粗抽出液を用いた研究で最初に報告された［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，　１４６，　８７−（１９７５）］。コーヒーでメチルトランスフェラーゼの精製が試みられているが［Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　３７，　１５７７−（１９９４）］、精製倍率はきわめて低かった。チャでは、メチルトランスフェラーゼの部分精製の報告はあるが［Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．，　９８，　６２９−（１９９６）］、酵素タンパク質は単離されていなかった。このような中、カフェインシンターゼ、即ち、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに関しては、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）から加藤等が世界に先駆けて単離精製し、報告している（特願平１１−１４６３５８、特願２０００−１５１７１８、特願２０００−２７５０６３）。
【００１２】
また、コーヒーにおいては７−メチルキサンチン〜テオブロミンの一段階のみのメチル化を触媒する酵素の存在については、同グループが世界に先駆けて単離し報告している（特願２００１−２０９０７２）。しかしながら、コーヒーにおいて、カフェイン生合成の最終反応である７−メチルキサンチン〜テオブロミン〜カフェインの２段階のメチル化反応を触媒するＮ−メチルトランスフェラーゼの存在は、これまでのところ全く知られていなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、カフェインシンターゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの全部もしくは一部を微生物または植物細胞にセンスまたはアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的を達成しようとするものである。
（１）　工業用、食品用または医療用酵素として利用できるカフェインシンターゼを効率よく生産する。
（２）　カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する。
（３）　カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、先に単離したチャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のカフェインシンターゼのＤＮＡ配列を基にＤＮＡプローブを作成し、このプローブを用いてコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果コーヒーから目的ＤＮＡを単離していたが、これらは７−メチルキサンチンのみを基質とするテオブロミンシンターゼであった。そこで本発明者らは、鋭意研究の結果、本発明者らがこれまでに単離したテオブロミンシンターゼの異なる保存配列に着目し、全く新たなホモログ遺伝子を単離した。このＤＮＡをベクターに組み込んだ後大腸菌に導入し、当該ＤＮＡに由来するタンパク質を大量に発現させた。このタンパク質の酵素学的性質を調べたところ、７−メチルキサンチン以外に、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミンを基質として認識することが示され、当該ＤＮＡがカフェイン生合成経路の主要なメチル化を触媒する新規なカフェインシンターゼをコードする遺伝子であることを確認した。本発明者らは以上の知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１５】
則ち本発明は以下のとおりである。
［１］　以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得られた変異ヌクレオチド配列
のいずれかを有することを特徴とするＤＮＡ分子。
［２］　前記ヌクレオチド配列（ａ）と前記変異ヌクレオチド配列（ｂ）とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである請求項１に記載のＤＮＡ分子。
［３］　前記ヌクレオチド配列（ａ）が、配列表の配列番号：２のヌクレオチド配列からなる請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。
［４］　以下のヌクレオチド配列：
（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得られた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有することを特徴とするＲＮＡ分子。
［５］　前記ヌクレオチド配列（ａ）と、前記変異ヌクレオチド配列（ｂ）がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである請求項４に記載のＲＮＡ分子。
［６］　前記配列（ａ）が、配列表の配列番号：２のヌクレオチド配列からなる請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
［７］　上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ分子と、該ＤＮＡ分子によりコードされた前記Ｎ−メチルトランスフェラーゼを植物細胞中で発現させるための構成と、を有することを特徴とする発現用ベクター。
［８］　宿主細胞を上記［７］に記載の発現用ベクターで形質転換して得られたものであることを特徴とする形質転換細胞。
［９］　前記宿主細胞が微生物細胞である上記［８］に記載の形質転換細胞。
［１０］　上記［８］または［９］に記載の形質転換細胞を培養して、前記酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼの製造方法。
［１１］　上記［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＤＮＡ分子。
［１２］　上記［４］〜［６］のいずれかに記載のＲＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＲＮＡ分子。
［１３］　上記［１］〜［６］及び［１１］〜［１２］のいずれかに記載のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含むベクター。
［１４］　微生物および植物の少なくとも一方の細胞内で、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させることができるか、もしくは該Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有する上記［１３］に記載のベクター。
［１５］　上記［１３］または［１４］に記載のベクターで形質転換された微生物。
［１６］　上記［１３］または［１４］に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
［１７］　上記［１３］または［１４］に記載のベクターが、感染により導入された上記［１６］に記載の植物細胞、植物組織または植物体。
［１８］　上記［１６］または［１７］に記載の植物細胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
［１９］　上記［１６］または［１７］に記載の植物細胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物の組成を改変する方法。
［２０］　上記［１６］または［１７］に記載の植物細胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植物二次代謝産物を製造する方法。
［２１］　上記［１６］または［１７］に記載の植物細胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植物二次代謝産物の組成を改変する方法。
［２２］　植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、パラキサンチン、カフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２３］　形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物体である上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法。
［２４］　７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼであって、
（ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列、または
（ｂ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列に、該アミノ酸配列に、前記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有することを特徴とするＮ−メチルトランスフェラーゼ。
［２５］　前記アミノ酸配列（ａ）をコードするヌクレオチド配列と、前記変異アミノ酸配列（ｂ）をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである上記［２４］に記載のＮ−メチルトランスフェラーゼ。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下本発明を詳細に説明する。
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼは、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を同時に有するコーヒー由来のポリペプチドである。
【００１７】
このＮ−メチルトランスフェラーゼとしては、配列番号：１に示したアミノ酸配列を有しているもの、配列番号：１のアミノ酸配列に、所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を損なわない範囲で、アミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有しているものを挙げることができる。すなわち、所望とする上記のＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチドをＮ−メチルトランスフェラーゼと総称する。
【００１８】
上記の変異アミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、それ自身が実質的にコーヒーのＮ−メチルトランスフェラーゼと同等の機能を有し、且つ配列番号：１のアミノ酸配列と酵素活性にかかわる部位においてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドを挙げることができる。
【００１９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、すなわちＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としては、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号：１のＤＮＡ配列、配列番号：２のＲＮＡ配列を挙げることができる。これらのＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記Ｎ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も、本発明におけるＮ−メチルトランスフェラーゼをコード遺伝子に含まれる。
【００２０】
所望とするＮ−メチルトランスフェラーゼ活性を維持した変異アミノ酸配列としては、この変異アミノ酸配列をコードする変異ヌクレオチド配列と、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。
【００２１】
また、変異Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としても、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例としては、配列番号：１のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ分子及び配列番号：２のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＲＮＡ分子を挙げることができる。
【００２２】
このストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ；　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイブリダイゼーションを行うことができる。
【００２３】
試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を、製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０容のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては、例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌＴＭ４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５培濃度で調製したものを１／２０に希釈して使用することができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは、３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは、４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの温度は、４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は、６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは２×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を、プローブに用いた標識を利用して識別することができる。
【００２５】
なお、変異は、自然界において生じたものでもよく、ヌクレオチド配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでも良い。
【００２６】
本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子は、例えば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲ技術（植物のＰＣＲ実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２）秀潤社（１９９５））を利用して、本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼを生産する細胞から分離することができる。
【００２７】
具体的には、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡにリンカーを結合させ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを構成するアミノ酸配列をコードするＤＮＡとリンカー間でＰＣＲを行うこと等により、目的ｃＤＮＡの全長配列を単離することができる。
【００２８】
このようなハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術により得られるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ分子は、少なくとも単離に使用する部位においては、配列番号：１に記載のＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドである。
【００２９】
本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（遺伝子）を有するＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を単離するために用いる生物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する生物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００３０】
次にカフェインシンターゼを含む発現ベクターの構築方法ならびに形質転換植物の作製方法及びＲＮＡｉ法によるカフェインシンターゼ酵素の発現抑制方法について説明する。
【００３１】
本報告中のカフェインシンターゼ遺伝子もしくはそのアンチセンスＲＮＡを植物細胞内で発現させるためには、（ｉ）植物細胞内で転写可能なプロモーター、（ｉｉ）プロモーターの下流にセンス方向またはアンチセンス方向に連結したカフェインシンターゼ遺伝子ＤＮＡの全部または一部、（ｉｉｉ）必要に応じて該遺伝子ＤＮＡの下流に連結された転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列、を含む発現カセットを植物細胞に導入する。
【００３２】
ここでアンチセンスＲＮＡの鋳型としては、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列、あるいはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有するＲＮＡ分子の全部または一部またはそれらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＲＮＡ分子をアンチセンス方向に連結したヌクレオチド配列であって、カフェインまたはその前駆体を産生する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有するものを挙げることができる。
【００３３】
ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアンチセンスＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアンチセンスｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００３４】
アンチセンスｍＲＮＡ形成用のＤＮＡ分子としては、例えば、配列番号：１のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子を挙げることができ、アンチセンスＲＮＡ分子としては、配列番号：２のヌクレオチド配列の全部または一部と相補性を有しているＲＮＡ分子を挙げることができる。これらのヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る変異配列の全部または一部と相補性を有しているＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子もこのような目的に用いることができる。
【００３５】
これらの阻害用のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子自体は、必ずしも本発明にかかるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするものでなくともよい。
【００３６】
発現カセットは、挿入されているＤＮＡを恒常的または誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター、イネのアクチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散布等の外因によって発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌、細菌、ウイルスの感染や侵入によって発現するイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターやタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーター、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「ＨＳＰ１８．２」遺伝子のプロモーター、乾燥によって誘導されるイネの「ｒａｂ」遺伝子のプロモーター、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター等が挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸等の特定の化合物によって、イネの「ｒａｂ」遺伝子プロモーターは植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。
【００３７】
或いはまた、発現カセットに挿入されているＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、カフェインシンターゼ遺伝子のプロモーターを単離して利用する方法も挙げられる。具体的なプロモーターの単離方法の一例には、カフェインシンターゼ遺伝子、例えばカフェインシンターゼ遺伝子のＤＮＡの全部又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション技術の利用により、ゲノムＤＮＡ断片を選択し、該遺伝子の上流部ＤＮＡを特定する方法を挙げることができる。
【００３８】
組み換えＤＮＡ分子の植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマーカー遺伝子を含むクローニングベクターが数多く利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ系、Ｍ１３ｍｐ系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をベクターに導入することができる。得られたプラスミドＤＮＡの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的−分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミドＤＮＡを切断して、別のＤＮＡに結合させることができる。各プラスミドＤＮＡの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。
【００３９】
植物宿主細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または、アグロバクテリウム　リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクション法、エレクトロポレーション法等）、パーティクルガン法等やその他の可能性が含まれる。
【００４０】
プロトプラストへの直接導入では、特別に必要とされるベクターはない。例えば、ｐＵＣ誘導体のような単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他のＤＮＡ配列が必要になることもある。例えばＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の少なくとも右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となるように接続しなければならない。
【００４１】
アグロバクテリウム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。中間ベクターはアグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム属菌の中に移行される。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの配列と相同な領域をもつため、相同組換えによって、アグロバクテリウム属菌のＴｉまたはＲｉプラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるアグロバクテリウム属菌には、ｖｉｒ領域が含まれている必要がある。通常ＴｉまたはＲｉプラスミドにｖｉｒ領域が含まれており、その働きにより、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４２】
一方、バイナリーベクターはアグロバクテリウム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはエレクトロポレーション法によってアグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主のｖｉｒ領域の働きによって、バイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡを植物細胞に移行させることができる。
【００４３】
なお、このようにして得られた発現カセットを含む中間ベクターまたはバイナリーベクター、及びこれを含む大腸菌やアグロバクテリウム属菌等の微生物も本発明の対象である。
【００４４】
形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばイネではＦｕｊｉｍｕｒａら［Ｐｌａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｅｔｔ．，　２，　７４−（１９９５）］の方法、トウモロコシでは、Ｓｈｉｌｌｉｔｏら［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　７，５８１−（１９８９）］の方法、シロイヌナズナではＡｋａｍａらの方法［Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐ．，１２，
７−（１９９２）］などが挙げられる。
【００４５】
これらの方法により作出された植物体は、カフェイン及びカフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のカフェインシンターゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン及びテオブロミン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）もしくは培養細胞を指す。
【００４６】
前記のＳＡＭをメチル基供与体としてカフェインを生成する植物としては、チャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物など、カフェイン産生植物を例示することができる。
【００４７】
本発明にかかるカフェインシンターゼをコードするＤＮＡを導入してカフェインシンターゼタンパク質を大量に発現させるための微生物としては、大腸菌や枯草菌等の細菌及びバキュロウイルス等のウイルスを例示することができる。
【００４８】
また、ホスト細胞の代謝を改変して特定化合物の生産性向上や特定の化合物群の生成比改変を図ることを目的に、本発明にかかるカフェインシンターゼをコードするＤＮＡをセンスまたはアンチセンスの形で組み込む植物としては、カフェインまたはその前駆体を産生する植物であればすべて使用できるが、中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、カカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを例示することができる。
【００４９】
これらの方法により作出された植物体は、カフェインまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼの発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られたトランスジェニック植物は本発明の対象である。
【００５０】
また近年、植物のポストトランスレーショナルなジーンサイレンシングの研究から、ウイルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機項を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Ｃｅｌｌ，９５，１７７−１８７（１９９８）、化学と生物、３７、５３２−（１９９９）、蛋白質核酸酵素、４４、１３９６−（１９９９））。これによれば、ＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの鋳型からアベラントＲＮＡを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖ＲＮＡを形成する。この二本鎖ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ｃｅｌｌ，９６，　３０３−（１９９９））。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発現抑制方法は、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子またはＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部の配列またはそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全部または一部を含む二本鎖ＲＮＡや、二本鎖ＤＮＡを持つアグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させる。ここで、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用のｍＲＮＡ、すなわちアベラントなＲＮＡが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させるためのｍＲＮＡと結合して、宿主細胞におけるＮ−メチルトランスフェラーゼの発現が阻害される部分である。この部分としては、このようなアベラントなｍＲＮＡの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも１４塩基長の長さの部分を挙げることができる。
【００５１】
これらの方法を施された植物体は、カフェインまたはテオブロミンまたはその前駆体を産生する野生型の植物体と比較して本発明のＮ−メチルトランスフェラーゼタンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるカフェイン代謝系化合物群の生成比の変化が起こる。このようにして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織または細胞も含まれる。
【００５２】
上記の構成のベクターで形質転換されたもしくはベクターの感染された植物細胞または植物組織を培養して、あるいは同様に形質転換された植物体を栽培して、カフェイン及びテオブロミン合成系にかかる二次代謝産物の製造やこれらの形質転換体で生産される二次代謝産物の組成の改変を行うことができる。この二次代謝産物としては、例えば、７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物を挙げることができる。
【００５３】
形質転換に用いる植物細胞、植物組織または植物体の供給原としては、例えば、形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物を挙げることができる。中でもチャなどのツバキ科ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒーなどのアカネ科コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキなどのアオギリ科コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物などを好ましいものとして例示することができる。
【００５４】
【実施例】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］　コーヒーからのＲＮＡの調製
（１）ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの単離
筑波大学農林技術センターから入手した０．５ｇのコーヒー（Ｃｏｆｆｅａ　ａｒａｂｉｃａ）の登熟種子胚乳を液体窒素存在下で乳棒、乳鉢を用いて破砕した。液体窒素の昇華後、５ｍｌの２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．５）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣｌ、５％β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌに溶かして６５℃に１０分放置する。等量のクロロホルム液を加えて撹拌し、総量で１０ｍｌ程度にした。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層をとり、２．５ｍｌの１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除去し、沈殿を１ｍｌのＴＥに溶解し、再度、遠心分離を行った。上清を回収し、１ｍｌのＴＥ飽和フェノール溶液を加えて転倒混和し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。さらに上清にフェノール／クロロホルムを加えて撹拌し、１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行った。水層を回収し、等量のクロロホルム液を加え、撹拌する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、水層を回収し、１／４倍量の１０Ｍ塩化リチウム液を加え、少なくとも２時間、−２０℃に放置する。１５，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた沈殿に７０％　エタノールを加えて、再度、遠心分離を行った。沈殿を真空ポンプでドライアップした後、２００μｌの水に溶解しｔｏｔａｌ　ＲＮＡの画分とした。
【００５５】
（２）　ｍＲＮＡの単離
上述の方法で得たｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（２ｍｇ）に６５℃、５分間の熱処理を行った後、等量の２倍濃度Ａ液（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳ、０．５Ｍ　ＮａＣｌ）と混合した。０．１ｇのｏｌｉｇｏ（ｄＴ）−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｔｙｐｅ７（ファルマシア）を２ｍｌのＢ液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．１％　ＳＤＳ、０．１Ｍ　　ＮａＣｌ）中で膨潤させ、その懸濁液を先端にガラスウールをつめたブルーチップに注ぎ、２．５　ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨで洗浄した後、５ｍｌのＡ液を流して平衡化した。このカラムにｔｏｔａｌ　ＲＮＡをアプライし、３ｍｌのＡ液、４ｍｌのＢ液を流した後に、ｍＲＮＡを３ｍｌのＣ液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．０５％　ＳＤＳ）で溶出した。溶出液をエタノール沈殿によって濃縮し、ドライアップした後水に溶解し−８０℃で保存した。
【００５６】
［実施例２］　コーヒーからのカフェインシンターゼｃＤＮＡの単離
（１）３‘−ＲＡＣＥ法による３’末端側の単離
これまでに本発明者等はコーヒーからＮ−メチルトランスフェラーゼを複数単離しているが、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼはコーヒーからは単離できなかった。そこで、本発明者等がこれまでに単離したコーヒー由来Ｎ−メチルトランスフェラーゼであるＣＴＳ１（配列番号３）及びＣＴＳ２（配列番号４）を元に、新たに配列番号５〜６のプライマーを設計し、新規なカフェインシンターゼｃＤＮＡ部分配列の単離を行なった。３’−ＲＡＣＥは３’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　ＣＯＲＥ　Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を使用し、下記の反応液中で１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成した。

反応条件は３０℃１０分、５０℃４０分、９５℃５分後氷冷とした。
【００５７】
得られた生成物を鋳型とし、以下の反応溶液中で、９５℃／１分間反応させた後、９４℃／１分間、５５℃／１分間、７２℃／１．５分間を３０サイクルでＰＣＲを行なった。Ｐｒｉｍｅｒ１には配列番号５の配列を用いた。

【００５８】
得られた生成物を鋳型とし、以下の反応液中で、９４℃／１分間、５５℃／１分間、７２℃／４０秒間を３０サイクルでＰＣＲを行ない、ＰＣＲ増幅産物を得た。Ｐｒｉｍｅｒ１には配列番号６の配列を用いた。

【００５９】
得られた反応生成物を０．８％　アガロースゲルを用いてＴＡＥ中で電気泳動し、得られた目的生成物のバンドを切り取り、ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ（フナコシ）を用いてゲルからＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡをｐＴ７ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした後、大腸菌ＤＨ５αにトランスフォーメーションした。Ｘ−ｇａｌを用いてカラーセレクションを行った後に、アンピシリンを含むＬＢ培地で液体培養を行い、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。インサートの有無はアガロース電気泳動によって確認した。
【００６０】
得られた生成物の塩基配列を決定するため、単離したプラスミドを用いて下記の反応液中でプライマーエクステンションを行った。反応条件は９６℃／１分間反応させた後、９６℃／０．２分間、５０℃／０．１分間、６０℃／４分間を２５サイクル行った。反応液に対してエタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡ　をＴｅｍｐｌａｔｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔに溶解し、ＡＢＩ−３１０ジェネティックアナライザーを用いて分析した。
【００６１】
プライマーエクステンション反応液
プラスミドＤＮＡ　（２０ｎｇ）　２μｌ
Ｐｒｅｍｉｘ　　　　　　　　　　４μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ　　　　　　　　　　１μｌ
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　３μｌ
【００６２】
（２）　５’ＲＡＣＥ法による５’上流域の単離
５’上流域の単離には、５’−Ｆｕｌｌ　ＲＡＣＥ　Ｃｏｒｅ　Ｓｅｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いた。３’−ＲＡＣＥ法で得られた配列を元に配列番号７〜９のプライマーを設計し、下記の反応液中で１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを合成した。反応中のＰｒｉｍｅｒには配列番号７の配列を用いた。
変性ＲＮＡ（約１５μｇ）　　　　　　　　　　　　　　１５μｌ
１０×ＲＴバッファー　　　　　　　　　　　　　　　　　３μｌ
ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　　　　　　　　　　　　　１μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（ＣＳ１０ｒ）　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
ＡＭＶ　ＲＴ　ｅｎｚｙｍｅ　　　　　　　　　　　　　　　１μｌ
【００６３】
得られた３０μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに、２５μｌ　　５×バッファー、４５μｌ　　Ｈ２Ｏ、２μｌ　　ＲＮａｓｅＨを加え、３０℃　１ｈｒで反応させ、ＲＮＡを分解した。得られた１本鎖ｃＤＮＡは、Ｔ７−ＲＮＡ　ｌｉｇａｓｅでセルフライゲーションまたはコンカテマー化した。これを鋳型にし、以下の反応溶液中で、９４℃／１分間、６２℃／１分間、７２℃／１．５分間を３０サイクルでＰＣＲを行い反応生成物を得た。Ｐｒｉｍｅｒ１、２は、配列番号８、９の配列を用いた。アクリルアミド電気泳動により反応生成物のバンドを分離し、ゲルからＤＮＡを回収し、ｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。

サブクローニングした配列の塩基配列は上述の方法で決定した。得られた塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００６４】
［実施例３］　カフェインシンターゼの大腸菌での発現と活性測定
単離した新規カフェインシンターゼ遺伝子を発現ベクターｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にトランスフォーメーションした。得られた大腸菌を３７℃で２時間培養した後に、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭになるように加え、２５℃でさらに８時間培養を行った。培養終了後集菌し、２００μｌのＴＥＳ−Ｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５ｍＭ　ＤＴＴ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ−Ｎａ２、２０％　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁し、−８０℃で凍結後、１分間断続的に超音波破砕を行った。これを１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を酵素液とした。
【００６５】
カフェインシンターゼ活性測定のための反応液は、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、０．２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　７−メチルキサンチン、４μＭ　［メチル−１４Ｃ］Ｓ−アデノシルメチオニン（０．９ｋＢｑ）に酵素液１０μｌを加えた物とし、反応液の体積は１００μｌとした。２７℃で１０分間の反応を行い、得られた１４Ｃ−カフェインを１ｍｌのクロロホルムを加えて抽出し、クロロホルム層の放射活性を測定した。対照としては、反応液から７−メチルキサンチンを除いたものを用いた。活性測定の結果、カフェインが生成したことが判明した。
【００６６】
組み換え酵素の基質特異性を表１に示す。７−メチルキサンチンに対する活性を１００としたときの相対活性（％）で示した。比較のため、チャ（Ｃａｍｅｌｌｉａ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ）葉由来カフェインシンターゼの基質特異性も記載した。
【００６７】
【表１】

【００６８】
［実施例４］　　アンチセンス法によるカフェイン生合成の抑制
アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する組換えベクターを以下の方法により構築した。
実施例２で得られたコーヒー由来新規カフェインシンターゼ遺伝子を、ｐＢＩベクター（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に該遺伝子がアンチセンス方向に挿入される様に連結した。このようにして、アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子が挿入された所望の組換えベクターを得た。そしてこれを以下の形質転換に用いた。
【００６９】
コーヒーの組織培養によるカフェイン生合成の従来法については、これまでにもＰｌａｎｔａ，　１０８，　３３９　（１９７２），　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２，　１０９　（１９８３）などの多くの報告がある。これらの従来法に従ってコーヒーの茎頂ないし幼葉からカルスを誘導した。得られたカルスにパーティクルガン法で上記で構築された組換えベクターを導入した。もしくは、該カルスのプロトプラストを調製して、このプロトプラストにエレクトロポレーション法により組換えベクターを導入した。導入後、マーカー耐性を示す細胞を選抜した。選択された細胞は明条件下で培養し、形質転換細胞に対して実施例３に記載の方法により酵素活性を測定した。その結果、アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを導入した細胞におけるカフェインの生産は、アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを導入していない通常細胞と比較して有意に減少していることが判明した。
【００７０】
さらに、形質転換したコーヒー培養細胞を再分化させ、幼植物体を得た。再分化の方法はＺ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｂｄ．，　８１，　３９５　（１９７７）、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，　Ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄＯｒｇａｎ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，　８，　２４３　（１９８７）を含む文献に記載の従来法に従って行った。幼植物体の葉を用いて実施例３に記載の方法により酵素活性を測定した。その結果、アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを導入した植物体のカフェイン生産は、アンチセンスＮ−メチルトランスフェラーゼＤＮＡを導入していない植物体と比較して有意に減少していることが判明した。
【００７１】
【発明の効果】
本発明によれば、工業用、食品用または医療用酵素として利用できるカフェインシンターゼを効率よく生産する事が可能になる。
本発明によれば、カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物を効率よく生産する事が可能になる。
本発明によれば、カフェイン産生植物、植物組織または植物細胞のカフェイン生合成代謝を改変してカフェイン代謝系の化合物群の生成比を改変することが可能になる。
【００７２】
【配列表】

Claims (25)

1. 以下のヌクレオチド配列：
   （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、
   （ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得られた変異ヌクレオチド配列
   のいずれかを有することを特徴とするＤＮＡ分子。
2. 前記ヌクレオチド配列（ａ）と前記変異ヌクレオチド配列（ｂ）とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである請求項１に記載のＤＮＡ分子。
3. 前記ヌクレオチド配列（ａ）が、配列表の配列番号：２のヌクレオチド配列からなる請求項１または２に記載のＤＮＡ分子。
4. 以下のヌクレオチド配列：
   （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列を有し、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するポリペプチドであるＮ−メチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、
   （ｂ）前記ヌクレオチド配列（ａ）に、該ヌクレオチド配列（ａ）がコードするポリペプチドが前記酵素活性を維持し得る範囲内で、ヌクレオチドの置換、欠失または挿入を行って得られた変異ヌクレオチド配列のいずれかを有することを特徴とするＲＮＡ分子。
5. 前記ヌクレオチド配列（ａ）と、前記変異ヌクレオチド配列（ｂ）がストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである請求項４に記載のＲＮＡ分子。
6. 前記配列（ａ）が、配列表の配列番号：２のヌクレオチド配列からなる請求項４または５に記載のＲＮＡ分子。
7. 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子と、該ＤＮＡ分子によりコードされた前記Ｎ−メチルトランスフェラーゼを植物細胞中で発現させるための構成と、を有することを特徴とする発現用ベクター。
8. 宿主細胞を請求項７に記載の発現用ベクターで形質転換して得られたものであることを特徴とする形質転換細胞。
9. 前記宿主細胞が微生物細胞である請求項８に記載の形質転換細胞。
10. 請求項８または９に記載の形質転換細胞を培養して、前記酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼの製造方法。
11. 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＤＮＡ分子。
12. 請求項４〜６のいずれかに記載のＲＮＡ分子の有するヌクレオチド配列の全部又は一部に相補的なヌクレオチド配列であって、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得ることを特徴とするＲＮＡ分子。
13. 請求項１〜６及び１１〜１２のいずれかに記載のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含むベクター。
14. 微生物および植物の少なくとも一方の細胞内で、７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼの酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼを発現させることができるか、もしくは該Ｎ−メチルトランスフェラーゼの発現を阻害する機能を有する請求項１３に記載のベクター。
15. 請求項１３または１４に記載のベクターで形質転換された微生物。
16. 請求項１３または１４に記載のベクターで形質転換された植物細胞、植物組織または植物体。
17. 請求項１３または１４に記載のベクターが、感染により導入された請求項１６に記載の植物細胞、植物組織または植物体。
18. 請求項１６または１７に記載の植物細胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物を製造する方法。
19. 請求項１６または１７に記載の植物細胞、植物組織または植物体を用いて植物二次代謝産物の組成を改変する方法。
20. 請求項１６または１７に記載の植物細胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植物二次代謝産物を製造する方法。
21. 請求項１６または１７に記載の植物細胞または植物組織を培養するか、植物体を栽培して、植物二次代謝産物の組成を改変する方法。
22. 植物二次代謝産物が、キサントシン、７−メチルキサントシン、１−メチルキサンチン、３−メチルキサンチン、７−メチルキサンチン、テオブロミン、テオフィリン、パラキサンチン、カフェインからなる群から選ばれる少なくとも１つ以上の化合物である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
23. 形質転換植物体が、ツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ）属植物、コーヒー（Ｃｏｆｆｅａ）属植物、コラノキ（Ｃｏｌａ）属植物、モチノキ（Ｉｌｅｘ）属植物、ネエア（Ｎｅｅａ）属植物、アオギリ（Ｆｉｒｍｉａｎａ）属植物、ポーリニア（Ｐａｕｌｌｉｎｉａ）属植物又はカカオノキ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）属植物体である請求項１８〜２１のいずれかに記載の方法。
24. ７−メチルキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼ、テオブロミンＮ１メチルトランスフェラーゼ及びパラキサンチンＮ３メチルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有するＮ−メチルトランスフェラーゼであって、
    （ａ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列、または
    （ｂ）配列表の配列番号：１のアミノ酸配列に、該アミノ酸配列に、前記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置換、挿入または欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有することを特徴とするＮ−メチルトランスフェラーゼ。
25. 前記アミノ酸配列（ａ）をコードするヌクレオチド配列と、前記変異アミノ酸配列（ｂ）をコードするヌクレオチド配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るものである請求項２４に記載のＮ−メチルトランスフェラーゼ。