JP2004024140A

JP2004024140A - New gene for gluconobacter bacteria and method for producing aimed substance

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Publication number: JP2004024140A
Application number: JP2002186487A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Sugiyama; 杉山　雅一; Naohito Sotouchi; 外内　尚人; Kenzo Yokozeki; 横関　健三
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2002-06-26
Filing date: 2002-06-26
Publication date: 2004-01-29
Anticipated expiration: 2022-06-26
Also published as: JP4333088B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To identify and obtain an enzyme and a gene involved in NADH production for Gluconobacter bacteria, intensify the NADH productivity of the Gluconobacter bacteria by utilizing the gene, and thereby improve the ability to produce a useful substance such as xylitol. <P>SOLUTION: A method for producing an aimed substance needing NADH for its reducing reaction in biosynthesis involves using Gluconobacter bacteria enhanced in the activity of one or more enzymes involved in NADH production, e.g. a trans-aldolase-glucose-6-phosphate isomerase conjugate, 6-phosphogluconate dehydrogenase, ribulokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規遺伝子、及びＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌に関する。本発明の細菌は、キシリトール等の有用物質の生産に有用である。
【０００２】
【従来の技術】
天然に存在する糖アルコールであるキシリトールの需要は今後増加することが予想される。キシリトールは、蔗糖よりもカロリーが低く、蔗糖に匹敵する甘味を呈するため低カロリー甘味料として将来有望である。加えて、抗う蝕性を有しており、虫歯予防甘味料として利用されている。さらに、キシリトールは血糖値を上昇させないため、糖尿病治療の際の輸液として利用されている。
【０００３】
現在、キシリトールは主として米国特許第４，００８，８２５号に記載されるようなＤ−キシロースの水素添加により工業生産されている。原料となるＤ−キシロースは、硬木、藁、とうもろこしの穂軸、オート麦の外皮、その他キシランに富んだ植物材料を出発材料とし、これを加水分解することによって得られる。
【０００４】
また近年は、微生物を用いてキシリトールを製造する方法が開発されている。例えば、他のペンチトールを出発原料としてキシリトールを生産する方法が開発されてきた。容易に手に入るペンチトールのひとつがＤ−アラビトールであり、Ｄ−アラビトールは酵母を用いて製造できる（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１　（１９８５）　４６７−４７１、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３９　（１９９３）　１０４７−１０５４）。そこで、Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法がいくつか開発されている。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，　１８　（１９６９）　１０３１−１０３５には、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｈａｎｓｅｎｉｉ）　ＡＴＣＣ２０１２１を用いて、発酵によりグルコースからＤ−アラビトールを生産し、次に、アセトバクター・サブオキシダとしてンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｃｅ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、さらにキャンディダ・ギリエルモンディ・ヴァリ．ソヤ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ　ｖａｒ．　ｓｏｙａ）を同Ｄ−キシルロースに作用させキシリトールに変換する方法が報告されている。
【０００５】
さらに、耐浸透圧酵母を用いてＤ−アラビトールを発酵生産し、次にアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属細菌またはクレブジエラ属細菌を用いて同Ｄ−アラビトールをＤ−キシルロースに変換し、次いで同キシルロースにグルコース（キシロース）イソメラーゼを作用させてキシロースおよびキシルロース混合物を生成し、さらに生成したキシロース／キシルロースに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている（ヨーロッパ特許出願公開第４０３３９２号および同第４２１８８２号）。また、同キシロース／キシルロース混合物中のキシロースを予備濃縮し、これに水素添加してキシリトールに変換する方法が開示されている。
【０００６】
しかし、上記Ｄ−アラビトールを原料とするキシリトール生産法は、比較的高収率でキシリトールを生成することができるが、多段階の反応ステップを必要とするためにプロセスが煩雑なものとなるという欠点があり、そのため経済的にも満足のいくものではなかった。
【０００７】
これらの問題点を解決するものとして、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ微生物を見出し、該微生物をＤ−アラビトールに作用させ、生成するキシリトールを採取することを特徴とするキシリトールの製造法を開発した（ヨーロッパ特許出願公開第１　０２６　２５４号）。前記微生物としては、グルコノバクター・サブオキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）等のグルコノバクター属細菌またはアセトバクター属細菌等が含まれる。
【０００８】
上記の方法は、発酵法によって、Ｄ−アラビトールを簡単な一段階のプロセスで効率よくキシリトールに変換できる優れた方法であるが、反応の安定性や、キシリトールの収率に改善の余地があった。そこで、本発明者らはＤ−アラビトールをキシリトールに直接変換する能力を持つ菌を解析し、本変換反応においてはＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼ活性およびＤ−キシルロースリダクターゼ活性が関与することを明らかにした。そしてＤ−アラビトールからキシリトールへの変換反応の際に炭素源又は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を添加して反応を行うことによって、安定して高収率でキシリトールが生産できることを見出している（ヨーロッパ特許出願公開第１　０２６　２５５号）。
【０００９】
一方、遺伝子操作技術によりキシリトール発酵菌の育種が試みられている。クレブジエラ属細菌由来のアラビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、アラビトール発酵菌（キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属またはチゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母）に導入した遺伝子組換え菌を用いて、グルコースからキシリトールの発酵生産が試みられている（ＷＯ９４／１０３２５号国際公開パンフレット）。
【００１０】
さらに、エシェリヒア属細菌等の還元力供給能を有する微生物にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入し、同微生物をＤ−キシルロースに作用させ、キシリトールを生成させる方法が開発されている（米国特許第６，２４２，２２８号）。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
上述のように、グルコノバクター属細菌等を用いてＤ−アラビトールからキシリトールを製造する方法が開発されているが、Ｄ−キシルロースを還元してキシリトールに変換する工程の収率には改善の余地があった。本発明者らは、この反応（キシリトールデヒドロゲナーゼ反応）には補酵素ＮＡＤＨが必要であることから、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨの供給能を上昇させることにより、キシリトール生産能が向上すると考えた。しかし、グルコノバクター属細菌は、一般的にＮＡＤＨ生成経路とされるＴＣＡ回路が不完全であることが知られており、ＮＡＤＨの生成経路は不明であった。
【００１２】
本発明は、上記観点からなされたものであり、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する酵素及び遺伝子を同定、取得し、さらにそれらの遺伝子を利用してグルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成能を強化させ、それによってキシリトール等の有用物質の生産能を向上させることを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系を構築し、キシリトール収率を向上させる因子を単離、同定することに成功した。さらにこれらの因子の一つをコードする遺伝子がオペロンを形成しており、オペロン中の他の遺伝子もキシリトール収率を向上させる因子であることを見出した。そして、これらの遺伝子の発現を強化することにより、キシリトール生産能を向上させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（２）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号１８に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質。
（３）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（２）のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（３）のＤＮＡ。
【００１５】
（５）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（６）下記（Ｃ）又は（Ｄ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｄ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（７）下記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡである（６）のＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（７）のＤＮＡ。
【００１６】
（９）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１０）下記（Ｅ）又は（Ｆ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｅ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｆ）配列番号２１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質。
（１１）下記（ｅ）又は（ｆ）に示すＤＮＡである（１０）のＤＮＡ。
（ｅ）配列番号２０に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｆ）配列番号２０記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１２）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１１）のＤＮＡ。
【００１７】
（１３）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１４）下記（Ｇ）又は（Ｈ）に示すタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｇ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｈ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（１５）下記（ｇ）又は（ｈ）に示すＤＮＡである（１４）のＤＮＡ。
（ｇ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列を含むＤＮＡ。
（ｈ）配列番号２２に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１６）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行われる条件である（１５）のＤＮＡ。
【００１８】
（１７）グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応に還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドを必要とし、かつ、前記細菌は還元型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法。（１８）前記酵素活性が、トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ複合体、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リブロキナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性である（１７）の方法。
（１９）前記酵素活性の増強が、それぞれの酵素をコードする遺伝子の発現の増強によるものである（１９）の方法。
（２０）前記遺伝子の細胞内のコピー数を高めること、又は前記遺伝子の発現調節配列の機能が強化されることにより、同遺伝子の発現が強化されたことを特徴とする（１９）の方法。
（２１）前記目的物質がキシリトールであり、前記還元反応がＤ−キシルロースからキシリトールへの変換反応である（１７）〜（２０）のいずれかの方法。
（２２）前記細菌は、さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２１）の方法。
（２３）前記細菌は、グルコノバクター・オキシダンスである（１７）〜（２２）のいずれかの方法。
（２４）トランスアルドラーゼ−グルコース−６−リン酸イソメラーゼ遺伝子、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リブロキナーゼ遺伝子、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれる１又は２以上の遺伝子の発現が強化されるように改変されたグルコノバクター属細菌。
（２５）さらにキシリトールデヒドロゲナーゼ活性が上昇するように改変された（２４）のグルコノバクター属細菌。
（２６）グルコノバクター・オキシダンスである（２３）又は（２５）のグルコノバクター属細菌。
【００１９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する
＜１＞本発明のタンパク質及びＤＮＡ
本発明の第一のタンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の少なくとも一方又は両方を有するタンパク質（以下、「ＴＡＬ−ＰＧＩ」ともいう）であり、本発明の第一のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｔａｌ−ｐｇｉ」ともいう）である。同タンパク質は、トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性の両方を有するタンパク質であることが好ましい。トランスアルドラーゼ活性及びグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性を単一ペプチド上に有するタンパク質は今まで報告されておらず、新規な酵素である。尚、本明細書において、ＴＡＬ−ＰＧＩは、トランスアルドラーゼ活性に言及するときは「ＴＡＬ」、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性に言及するときは「ＰＧＩ」ということがある。
【００２０】
本発明の第二のタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「６ＰＧＡＤＨ」ともいう）であり、本発明の第二のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｇｎｄ」ともいう）である。
【００２１】
本発明の第三のタンパク質は、リブロキナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「ＲＫ」ともいう）であり、本発明の第三のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｒｋ」ともいう）である。
【００２２】
本発明の第四のタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質（以下、「Ｇ６ＰＤＨ」ともいう）であり、本発明の第四のＤＮＡは、同タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「ｚｗｆ」ともいう）である。
【００２３】
本発明のＤＮＡは、上記のタンパク質の１又はそれ以上をコードするものであってもよい。特に、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡから、本発明の第一のＤＮＡ及び第二のＤＮＡは、単一ＤＮＡ断片として取得され得る。
【００２４】
これらのＤＮＡは、本発明を完成するに際しては、グルコノバクター・オキシダンスの無細胞抽出液を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応アッセイ系において、キシリトール収率を向上させる因子として単離された因子をコードする遺伝子、及びそれに隣接する遺伝子として取得されたものである。しかし、本発明によってそれらの塩基配列が明らかになったので、それらの塩基配列に基づいてプライマーを合成し、グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより増幅することによって、取得することができる。また、前記塩基配列に基づいて調製したプローブ、又はＰＣＲにより増幅した部分断片をプローブに用いたコロニーハイブリダイゼーションによっても、本発明のＤＮＡは取得され得る。グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（Ｈ．　Ｓａｉｔｏ　ａｎｄ　Ｋ．Ｍｉｕｒａ，　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ　ｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，　７２，　６１９　（１９６３）、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。
前記プライマーとしては、表６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２５】
グルコノバクター属細菌としては、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・サブオキシダンス等が、具体的にはグルコノバクター・オキシダンスＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）、グルコノバクター・サブオキシダンスＮＲＲＬ　Ｂ−７７５株が挙げられる。同株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，　Ｍａｎａｓｓａｓ，　ＶＡ　２０１１０−２２０９，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）及びアグリカルチュアル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ））（１８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｔｒｅｅｔ，　Ｐｅｏｒｉａ，　Ｉｌｌｉｏｉｓ　６１６０４，　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ）から入手することができる。
【００２６】
本発明のＤＮＡの取得、及び、後述する本発明の細菌の構築に際して、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．，　Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．　Ｆ．，　Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，　１．２１　（１９８９）等に記載されている。
【００２７】
上記のようにして得られる本発明のｔａｌ−ｐｇｉを含むＤＮＡ断片の塩基配列の一例を配列番号１６に示す。このＤＮＡ断片中には、ＴＡＬ−ＰＧＩをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流及び下流のそれぞれに、別のＯＲＦが見出された。これらは、トランスケトラーゼ及び６ＰＧＡＤＨをそれぞれコードしており、前記ＤＮＡ断片は、オペロンを形成していると推定された。トランスケトラーゼのアミノ酸配列を配列番号１７に、ＴＡＬ−ＰＧＩのアミノ酸配列を配列番号１８に、６ＰＧＡＤＨのアミノ酸配列を配列番号１９に示す。
【００２８】
また、本発明のｒｋ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るＲＫのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
さらに、本発明のｚｗｆを含むＤＮＡ断片の塩基配列及びこの配列がコードし得るＧ６ＰＤＨのアミノ酸配列の一例を、配列番号２０及び２１に示す。
【００２９】
本発明の第一のＤＮＡは、コードされるタンパク質のトランスアルドラーゼ活性又はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性、好ましくはこれらの両方の活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＴＡＬ−ＰＧＩをコードするものであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３０】
本発明の第二のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含む６ＰＧＡＤＨであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３１】
本発明の第三のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、リブロキナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＲＫであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３２】
本発明の第四のＤＮＡによりコードされるタンパク質は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性が損なわれない限り、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むＧ６ＰＤＨであってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には２から５０個、好ましくは、２から１０個、より好ましくは２から５個である。
【００３３】
上記のようなＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、ｔａｌ−ｐｇｉ、ｇｎｄ、ｒｋ、又はｚｗｆの塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
【００３４】
上記のような変異を有するＤＮＡを、適当な細胞で発現させ、発現産物の活性を調べることにより、ＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変異を有するＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨをコードするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配列番号１６に記載の塩基配列のうち、塩基番号２４３７〜５３１０からなる塩基配列もしくは塩基番号５３１４〜６３１２からなる塩基配列、配列番号２０に記載の塩基配列のうち、塩基番号１９６〜１８１５からなる塩基配列、配列番号２２に記載の塩基配列のうち、塩基番号９８３〜２４４９からなる塩基配列、又はこれらの塩基配列の一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性グルタミンシンテターゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、ＴＡＬ−ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、又はＧ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３５】
プローブとして、配列番号１６、２０又は２２の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００３６】
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、それらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎトランスアルドラーゼ活性もしくはグルコース−６−リン酸イソメラーゼ活性又はこれらの両方の活性、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性、リブロキナーゼ活性、又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を、例えば後述の実施例８に記載の方法で、それぞれ測定することによって、容易に選別することができる。
【００３７】
ＴＡＬ−ＰＧＩと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＴＡＬ−ＰＧＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３８】
また、６ＰＧＡＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号１９に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ６ＰＧＡＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００３９】
ＲＫと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２１に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＲＫ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４０】
また、Ｇ６ＰＤＨと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡとして具体的には、配列番号２３に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＧ６ＰＤＨ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００４１】
＜２＞ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌
本発明の細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されたグルコノバクター属細菌である。
本発明の細菌は、具体的には、細胞内の、ＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌である。本発明の細菌として、例えば、ＴＡＬ、ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、Ｇ６ＰＤＨよりなる群から選ばれる１又は２以上の酵素の活性が増強されるように改変されたグルコノバクター属細菌が挙げられる。これらの酵素のうち、好ましくは２つの酵素、より好ましくは３つの酵素、さらに好ましくは４つ、最も好ましくは５つ全ての酵素活性が増強されることが望ましい。尚、ＴＡＬ活性、ＰＧＩ活性を有する酵素としては、ＴＡＬ−ＰＧＩ複合体が挙げられるが、ＴＡＬ−ＰＧＩは、少なくともいずれか一方の活性を有していればよく、両方の活性を有していてもよい。ＴＡＬ、ＰＧＩ、６ＰＧＡＤＨ、ＲＫ、及びＧ６ＰＤＨは、いずれも触媒する反応によって直接ＮＡＤ^＋からＮＡＤＨを生成するか、あるいは、ペントースリン酸回路全体の活性あるいは速度を増加させるか、又は、ペントースリン酸回路に流入する炭素源を増加させる反応を触媒し、結果としてＮＡＤＨの産生に寄与する。
【００４２】
本発明のグルコノバクター属細菌として具体的には、ＮＡＤＨを必要とする還元反応を含む生合成経路によって生成する目的物質を産生する細菌が挙げられる。このような目的物質としては、その生合成に還元反応を含み、同反応にＮＡＤＨを必要とする限り特に制限されず、キシリトール等の糖類、光学活性アルコール類、糖アルコール類等が挙げられる。「目的物質を産生する」とは、本発明の細菌を培養したときに、目的物質を培地中、又は細菌の細胞内に蓄積すること、好ましくは培地中に目的物質を蓄積することをいう。この目的物質を産生する性質は、グルコノバクター属細菌の野生株の性質として有するものであってもよく、育種によって付与または増強された性質であってもよい。
【００４３】
「酵素活性が増強されるように改変された」とは、細胞当たりの遺伝子産物の活性が非改変株、例えば野生型のグルコノバクター属細菌のそれよりも高くなったことをいう。例えば、細胞当たりの遺伝子産物の分子の数が増加した場合や、遺伝子産物の分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。また、比較対象となる野生型のグルコノバクター属細菌とは、例えばグルコノバクター・オキシダンスＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）である。
【００４４】
酵素活性の増強は、例えば、該酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。遺伝子の発現量の増強は、該遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、目的とする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これを目的物質生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。また、目的物質生産能を有しないグルコノバクター属細菌に上記組換えＤＮＡを導入して形質転換株を得、その後当該形質転換株に目的物質生産能を付与してもよい。
【００４５】
導入する遺伝子は、エシェリヒア・コリにおいて自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリに導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９，　ｐＨＳＧ３９９，　ｐＨＳＧ３９８，　ＲＳＦ１０１０，　ｐＢＲ３２２，　ｐＡＣＹＣ１８４，　ｐＭＷ２１９等が挙げられる。
【００４６】
グルコノバクター属細菌で機能するベクターとは、例えばグルコノバクター属細菌で自律複製できるプラスミドである。具体的には、グルコノバクター・オキシダンスＩＦＯ３１７１株由来の内在性プラスミドｐＡＧ５、またはその誘導体が挙げられる（米国特許第６，１２７，１７４号）。また、これらのベクターからグルコノバクター属細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びグルコノバクター属細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。このようなシャトルベクターとしては、ｐＳＧ８、ｐＳＧ６、及び実施例に記載したｐＳＡ１９（Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５８（１０），　１８９９−１９０１，　１９９４）等が挙げられる。
【００４７】
なお、ｐＳＧ８を保持するエシェリヒア　コリＪＭ１０９株は、プライベートナンバーＡＪ１３４８５が付与され、平成１９９８年７月２１日に独立行政法人　産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６　日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６郵便番号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１６９０３が付与され、１９９９年６月１４日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ−６７６０が付与されている。
【００４８】
上記ベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びＳＤＳを用いて溶菌し、３００００×ｇで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【００４９】
目的遺伝子とグルコノバクター属細菌で機能するベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４　ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
【００５０】
組換えＤＮＡをグルコノバクター属細菌に導入するには、通常の形質転換法、例えば電気パルス法等を用いることができる（米国特許第６，１２７，１７４号）。
目的遺伝子のコピー数を高めることは、該遺伝子をグルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。グルコノバクター属細菌の染色体ＤＮＡ上に目的遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペティティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、目的遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
【００５１】
遺伝子の発現の強化は、上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上またはプラスミド上の目的遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される。例えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。また、国際公開ＷＯ００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より強力なものに改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変により目的遺伝子の発現が強化される。これら発現調節配列の改変は、遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００５２】
発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いた遺伝子置換と同様にして行うことができる。
本発明のグルコノバクター属細菌を用いてキシリトールを効率よく生産するには、ＮＡＤＨ生成能の強化と同時に、キシリトール生合成に関与する酵素の活性が上昇するにように改変されたた菌株を用いるのが好ましい。このような酵素としては、例えばキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）が挙げられる。キシリトールデヒドロゲナーゼは、Ｄ−キシリトールからキシリトールを生成する反応を触媒するＤ−キシルロースリダクターゼ活性を有している。本発明においては、この活性を、ＸＤＨ活性という。
【００５３】
ＸＤＨ活性の増強は、例えば、ＸＤＨをコードする遺伝子の発現を増強することによって達成される。同遺伝子の発現量の増強は、ＸＤＨをコードする遺伝子のコピー数を高めることによって達成される。例えば、ＸＤＨをコードする遺伝子断片を、グルコノバクター属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えＤＮＡを作製し、これをキシリトール生産能を有する宿主に導入して形質転換すればよい。
【００５４】
ＸＤＨをコードする遺伝子としては、ピヒア・スティピティス（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．，　３２４，　９　（１９９３））及びモルガネラ・モルガニ（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｌ３４３４５）由来の遺伝子、及び、グルコノバクター・オキシダンスのＸＤＨ１遺伝子、及びＸＤＨ２遺伝子（米国特許第６，２４２，２２８号）が挙げられる。発現容易の観点からは、グルコノバクター属細菌由来の遺伝子を用いることが好ましい。
【００５５】
グルコノバクター属細菌のＸＤＨをコードする遺伝子（ｇｄｈ遺伝子）の塩基配列は、既に明らかにされている（米国特許第６，２４２，２２８号）ので、その塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば表１１に示すプライマーを用いて、グルコノバクター属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって、ＸＤＨ遺伝子を取得することができる。グルコノバクター属細菌等の他の微生物のＸＤＨをコードする遺伝子も、同様にして取得され得る。
【００５６】
ＸＤＨ遺伝子のグルコノバクター属細菌への導入は、前記のＮＡＤＨ生成に関与する遺伝子と同様にして行うことができる。
【００５７】
＜３＞目的物質の製造法
本発明の方法は、グルコノバクター属細菌を目的物質の生合成原料に作用させて目的物質を生成せしめる、目的物質の製造法において、前記目的物質はその生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とし、かつ、前記細菌はＮＡＤＨ生成に関与する一又は複数の酵素の活性が増強されるように改変されたことを特徴とする方法である。
【００５８】
本発明のグルコノバクター属細菌は、ＮＡＤＨ生成能が強化されており、生合成における還元反応にＮＡＤＨを必要とする目的物質を効率良く産生することができる。
【００５９】
目的物質の生合成原料としては、目的物質によって、本発明のグルコノバクター属細菌の培養に必要とするグルコース等の炭素源であってもよいし、目的物質の生合成の中間体であってもよい。例えば、目的物質がキシリトールである場合は、原料としてはＤ−アラビトール、Ｄ−キシルロースが挙げられる。
【００６０】
本発明のグルコノバクター属細菌を生合成原料に作用させるには、同細菌を培養する培地に前記原料を添加してもよいし、同細菌の菌体と原料を液体中で混合してもよい。さらに、本発明の細菌又はその処理物を固定化した担体を詰めたカラムに、原料溶液を通液してもよい。
【００６１】
以下に、目的物質としてキシリトールを製造する方法を例示する。
本発明の細菌を培養する培地は格別の制限はなく、該細菌によって利用される通常の炭素源、窒素源、リン源、無機イオン、更に必要ならば有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、等が使用される。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、硝酸塩その他が用いられる。リン源としてはリン酸のカリウム塩、ナトリウム塩等が使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、硫酸イオンその他が必要に応じ適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有するレバーエキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜用いられる。
【００６２】
また、本発明の細菌が持つＤ−アラビトールデヒドロゲナーゼまたはキシリトールデヒドロゲナーゼの誘導剤として、Ｄ−キシロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−アラビトール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、キシリトールなどの糖類や糖アルコールを培地に添加することによって、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する反応に関与する酵素の活性が向上する場合がある。
【００６３】
培養条件にも格別の制限はなく、例えば、好気的条件下ｐＨ５〜８及び温度２５〜４０℃の範囲内で、ｐＨ及び温度を適当に制限しつつ１２〜７２時間程度培養を行なえばよい。
【００６４】
かくして培養されたグルコノバクター属細菌を、Ｄ−アラビトールに接触反応させることにより、反応液中にキシリトールを生成することができる。本発明の方法において前記「グルコノバクター属細菌」は、菌体そのものであってもよいし、Ｄ−アラビトールをキシリトールに変換する能力を有する限り菌体の処理物であってもよい。具体的には、菌体を含む培養物、該培養物から分離・回収した菌体、該菌体固定化処理物、アセトン処理または凍結乾燥等した菌体、菌体破砕液、Ｄ−アラビトールデヒドロゲナーゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼを含む菌体破砕液の分画物もしくは精製酵素画分、又はこれらの処理物の固定化物等が挙げられる。
【００６５】
Ｄ−アラビトール濃度に格別の制限はなく、通常１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜４０％（ｗ／ｖ）が好ましい結果を与える。また反応の際、基質のＤ−アラビトールを分割添加することにより収率が向上する場合がある。反応条件にも格別の制限はなく、通常は、好気的条件下で、反応温度２０〜６０℃、望ましくは３０〜４０℃で、反応ｐＨ３．０〜１０．０望ましくはｐＨ４．０〜７．０で好結果を与える。尚、反応液に炭酸カルシウムを例えば２％（ｗ／ｖ）となるように添加するなどして、反応時のｐＨの低下を防ぐと、キシリトールの収率を高めることができる場合がある。反応には、静置反応あるいは撹はん反応のいずれの方法も採用し得る。反応時間は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、１〜１００時間が望ましい。
【００６６】
本発明において、菌体を用いる場合には反応系に炭素源を添加することが、収率の点から好ましい。また、菌体処理物を用いる場合には反応系にさらにＮＡＤＨ又はＮＡＤ^＋を添加してもよい。
【００６７】
前記炭素源としては、代謝される際にＮＡＤＨの生成を伴う炭素源であれば特に制限はないが、糖、糖の誘導体、アルコール類、アルデヒド類、および有機酸類等が挙げられる。糖としてはグルコース、フルクトース、スクロース、ラクトースが挙げられる。糖の誘導体としてはソルビトール、マンニトール、グリセロール等の糖アルコール、グルコン酸等のアルドン酸等が挙げられる。また、アルコール類としてはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオールなどが、アルデヒド類としてはホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、イソブチルアルデヒド、グリセロアルデヒドなどが、また有機酸類としてはギ酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸などが挙げられる。これらの炭素源は、単独で使用してもよく、任意の２種または３種以上の炭素源を混合物として使用してもよい。これら炭素源の添加量は、使用する菌体の活性、Ｄ−アラビトール濃度などの条件によって異なるが、合計で０．２〜４０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜２０％（ｗ／ｖ）が好ましい結果を与える。これらの炭素源の添加時期は格別の制限はなく、反応開始時から添加しても、反応途中で添加しても、また分割添加してもよい。
【００６８】
本発明の細菌を用いたＤ−アラビトール→キシリトール変換反応の進行には、Ｃｏ^２＋イオンの存在が有効である。本発明の方法によるキシリトールの生産においては、前記変換反応は、０．１ｍＭ以上のＣｏ^２＋イオンの存在下で行うことが好ましい。
【００６９】
上記のようにして培養液中に生成したキシリトールは、常法に従って反応液より採取分離される。具体的には、遠心分離、ろ過等により固形物を除去した後、活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩し、その溶液から結晶化する方法が採用できる。
【００７０】
また、キシリトール以外の目的物質についても、目的物質に応じて採取分離方法を適宜選択すればよい。
【００７１】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００７２】
【実施例１】インビトロ再構成系でのアラビトール→キシリトール変換反応系の構築
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの可溶性画分に存在するキシリトール収率向上因子を単離・精製するために、以下のアッセイ系を構築した。
【００７３】
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）をＹＰＧプレート（３ｇ／ｄｌ　グルコース、０．５ｇ／ｄｌ　イーストエキストラクト、０．３ｇ／ｄｌペプトン、２ｇ／ｄｌ　寒天末）で３０℃、２４ｈｒ、リフレッシュ培養したのちに、ＳＲ培地（２ｇ／ｄｌ　グルコン酸ナトリウム、０．５ｇ／ｄｌ　グルコース、０．３ｇ／ｄｌ　グリセロール、０．３ｇ／ｄｌ　イーストエキストラクト、０．２ｇ／ｄｌ　ペプトン、ｐＨ　６．５）を５０ｍｌ入れた坂口フラスコに一白金耳接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液を５０ｍｌ　のＳＲ培地を入れた坂口フラスコ４本に５％接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。
【００７４】
上記培養液から遠心分離により集菌し、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ６．５）（以下、ＫＰＢと略する）で洗浄した湿菌体２ｇを１０ｍｌのＫＰＢ　（ｐＨ６．５）に懸濁し、４℃で３０分間超音波破砕した。８０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を２回行って菌体残さを除いた上清を、５００００ｒｐｍで３０分間超遠心分離した。得られた上清を可溶性画分として得た。一方沈殿をＫＰＢで洗浄した後に２ｍｌのＫＰＢに溶解し、膜画分を調製した。
【００７５】
上記のようにして調製した膜画分と可溶性画分を用いて、以下の組成の反応液でアラビトール→キシリトール変換反応を行った。反応は１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ中で３０℃で２４時間行った。
【００７６】
〔反応溶液組成〕
０．５ｇ／ｄｌ　　Ｄ−アラビトール
２０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５．０）
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ　膜画分
１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ可溶性画分
【００７７】
上記反応液２００μｌをサンプリングし、１０μｌの１００％　ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を添加して、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してタンパク質を沈殿させ、得られた上清に１０μｌの６Ｎ　ＫＯＨを添加して中和した後に、下記条件のＨＰＬＣにて生成キシリトール量を定量した。その結果、０．５ｇ／ｄｌのＤ−アラビトールから０．１４ｇ／ｄｌのキシリトールが生成した。
【００７８】
〔ＨＰＬＣ分析条件〕
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　ＳＣ１２１１〔昭和電工社製品〕
移動層：　５０ｐｐｍ　Ｃａ−ＥＤＴＡ水溶液
流　速：１　ｍｌ／分
温　度：８０℃
検　出：ＲＩ検出器
【００７９】
【実施例２】アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）、１ｇ／ｄｌ　アラビトール、１０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５）、１ｍｇ　タンパク質／ｍｌ膜画分、１ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分からなる反応液に、以下に示す金属イオンを終濃度１ｍＭとなるように添加して３０℃で６時間反応を行い、アラビトール→キシリトール変換反応に対する金属イオンの添加効果を検討した。
【００８０】
〔添加金属イオン〕
ＣａＣｌ_２、ＭｇＣｌ_２、ＣｏＳＯ_４、ＮｉＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４、ＥＤＴＡ
【００８１】
反応液中のキシリトール、Ｄ−キシルロース及びＤ−アラビトールをＨＰＬＣにより定量した結果を表１に示す。ＣｏＳＯ_４添加区において、生成キシリトール量の増加が認められ、Ｄ−アラビトールからのキシリトール生産にＣｏ^２＋が効果的であることが明らかとなった。
【００８２】
【表１】

【００８３】
【実施例３】Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの還元力供給因子の精製
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株（ＡＴＣＣ６２１）の可溶性画分から還元力供給因子の精製を以下の通り行った。還元力供給能は、インビトロのＤ−アラビトール→キシリトール変換反応系での生成キシリトールの増加で検出した。反応条件を示す。
【００８４】
〔反応溶液組成〕
５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１ｇ／ｄｌ　アラビトール
１０ｍＭ　ＮＡＤ　（ｐＨ５）
１ｍｇタンパク質／ｍｌ膜画分
１ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分
１ｍＭ　ＣｏＣｌ_２
【００８５】
〔反応条件〕
３０μｌ酵素画分／２００μｌ反応液、３０℃、１６時間反応後、ＴＣＡ処理・中和処理を行いＨＰＬＣにて定量した。
【００８６】
（１）可溶性画分の調製：
洗浄菌体約１０ｇ（１Ｌ培養分）を４５ｍｌの５０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ　６．５）に懸濁し、４℃で２０分間超音波破砕した。破砕液を遠心分離（×８０００ｒｐｍ、１０分間×２回）により菌体残渣を除き、さらに超遠心分離（ｘ５００００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた上清を可溶性画分とした。また、沈殿は適宜ＫＰＢに懸濁し、膜画分としてインビトロ再構成系での酵素源とした。
【００８７】
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー：Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ
上記の可溶性画分１８ｍｌをバッファーＡ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ　２６／１０（ファルマシア社製、ＣＶ＝２０ｍｌ）に供して担体に吸着させた。担体に吸着しなかったタンパク質（非吸着タンパク質）をバッファーＡを用いて洗い流した後、ＫＣｌ濃度を０Ｍから０．７Ｍまで直線的に変化させて吸着したタンパク質の溶出を行った（総溶出液量１００ｍｌ）。各溶出画分についてインビトロ再構成系に供してキシリトール生成量の増加効果を検出したところ、３５０〜４５０ｍＭに相当する位置と、５５０ｍＭに相当する位置の２箇所にキシリトール生成活性（以下、「ＮＲＦ活性」ということがある）のピークを検出した。以下、それぞれのピークを順に「ＮＲＦ１」、「ＮＲＦ２」ということがある。また、これらを総称してＮＲＦと呼ぶことがある。
【００８８】
（３）　ゲルろ過クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　２００　ＨＰ）
ＮＲＦ１、ＮＲＦ２を含む画分をそれぞれ集めて、バッファーＡに対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液（それぞれ３０ｍｌ、６ｍｌ）を、限外ろ過膜ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ　１０（アミコン社製）を用いて濃縮した。得られた濃縮液を、バッファーＢ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６），０．１Ｍ　ＫＣｌ）で平衡化されたゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　２００　ＨＰ（ファルマシア社製））にアプライし、１ｍｌ／分の流速で溶出した。ＮＲＦ１は２回に分けて、ＮＲＦ２は１回で、それぞれ０．８ｍｌずつ分離操作を行った。この操作によりＮＲＦ１及びＮＲＦ２は、それぞれ、６９〜７２ｍｌ、７０〜７４ｍｌの画分に溶出された。
【００８９】
（４）陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／５）
得られた画分（ＮＲＦ１：１２ｍｌ、ＮＲＦ２：４ｍｌ）を０．４５μｍのフィルターで濾過した。ここで得られた濾液を、バッファーＡで平衡化された陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｍｏｎｏ−Ｑ　ＨＲ　５／５（ファルマシア社製））に供した。この操作により、ＮＲＦは担体に吸着した。
【００９０】
バッファーＡにより非吸着タンパク質を洗い流した後、ＫＣｌ濃度を直線的に０ｍＭから７００ｍＭへ変化させてタンパク質の溶出を行った（総液量１５ｍｌ）。各溶出画分についてＮＲＦ活性を測定し、ＫＣｌ濃度が３００ｍＭ　、５００ｍＭの溶出位置にそれぞれＮＲＦ活性が認められた。
【００９１】
（５）疎水性クロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ＨＰ　ＨＲ　５／５）
活性が検出されたそれぞれの溶液をバッファーＣ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ　７．０）に対して透析し、０．４５μｍのフィルターで濾過した。得られた濾液を、バッファーＣで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラム（Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　ＨＰ（ファルマシア社製））に供した。この操作によりＮＲＦは担体に吸着した。
【００９２】
担体に吸着しなかった非吸着タンパク質をバッファーＣを用いて洗い流した後、硫酸アンモニウム濃度を１Ｍから０Ｍまで直線的変化させてＮＲＦを溶出をさせた。得られた各溶出画分についてＮＲＦ活性を測定し、硫酸アンモニウム濃度がおよそ２００〜４００ｍＭ、１００〜２００ｍＭの溶出位置にＮＲＦ活性がそれぞれ認められた。
【００９３】
以上のカラムクロマト操作により精製した画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＮＲＦ１画分については約１００ｋＤａに相当する位置にほぼ単一なバンドとして検出された。またＮＲＦ２画分は約６０ｋＤａのバンドが検出された。
【００９４】
【実施例４】ＮＲＦ１、ＮＲＦ２のＮ末アミノ酸配列の決定
精製したＮＲＦ１、およびＮＲＦ２について、タンパク量約１０μｇ分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、ゲル中のＮＲＦ１およびＮＲＦ２をミリポア社ミニブロットを用いてＰＶＤＦフィルターに転写し、プロテインシーケンサー（ＡＢＩ社製、モデル４７６Ａ）によってアミノ酸配列をＮ末端から解析した。
【００９５】
また、ＮＲＦ１の内部アミノ酸配列についても解析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中の試料をリジルエンドペプチダーゼ処理し（ｐＨ８．５、３５℃、２０時間）、逆相ＨＰＬＣに供して断片ペプチドを分離した。分取した画分のうち、１つのフラクションについてアミノ酸配列を決定した。結果を表２に示す。表中、カッコ内はアミノ酸配列決定において不明瞭であったアミノ酸残基を示す。
【００９６】
【表２】

【００９７】
【実施例５】ｎｒｆ１、ｎｒｆ２遺伝子のクローニング
Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１株をＹＰＧ培地を用いて３０℃で一晩培養した。この培養液５ｍｌを種菌として、１００ｍｌの　ＹＰＧ　培地を用いて本培養を行った。対数増殖後期まで培養した後、培養液１００ｍｌを遠心分離操作（１２０００×Ｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を用いて定法に従って染色体ＤＮＡを調製した。
【００９８】
決定したＮＲＦ１、ＮＲＦ２それぞれのＮ末端アミノ酸配列およびＮＲＦ１の内部アミノ酸配列をもとに、以下のミックスプライマーを合成した（表３）。
【００９９】
【表３】

【０１００】
作製したミックスプライマーを用いて、カセットＰＣＲ法によるｎｒｆ１，ｎｒｆ２遺伝子断片の取得を行った。カセットＰＣＲ法はＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　インビトロ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造社）を使用し、本キットに添付に添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。
【０１０１】
塩基配列の決定は、Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＡＢＩ社製）を用いたＰＣＲ反応により行った。また電気泳動は、ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ｍｏｄｅｌ　３７３もしくはｍｏｄｅｌ　３１１（ＡＢＩ社製）を用いて行った。
【０１０２】
カセットＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片の一部を用いて、サザン解析およびコロニーハイブリダイゼーションによって全長遺伝子の取得を行った。ＤＮＡプローブの作製はＤＩＧ　Ｈｉｇｈ　Ｐｒｉｍｅ（ロシュダイアグノスティック社製）を使用して、説明書通りに３７℃で一晩インキュベートしてプローブの標識を行った。プローブとして用いたＤＮＡ断片の増幅に用いたＰＣＲプライマーの配列を表４に示す。
【０１０３】
【表４】

【０１０４】
サザン解析は、染色体ＤＮＡ　１μｇを各種制限酵素で完全に消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動したのちに、ナイロンメンブレンにブロッティングし、以下キットに添付のマニュアルに従って行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ　ＥａｓｙＨｙｂ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行い、５０℃　で１時間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、Ｏ／Ｎでハイブリダイゼーションさせた。バンドの検出はＤＩＧ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いて行った。
【０１０５】
コロニーハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処理後、サザン解析にて検出されたバンド長に相当する大きさの断片を回収してｐＵＣ１８又はｐＵＣ１１８に連結し、連結反応液でＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９を形質転換してライブラリーを作製した。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社製）に移し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂを用いて行った。フィルターをバッファー中に浸し、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、作製した標識プローブを添加し、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。ＳＳＣでの洗浄後、プローブとハイブリダイズするコロニーの検出を、ＤＩＧ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて行った。
【０１０６】
（１）ｎｒｆ１（ｔａｌ−ｐｇｉ）およびｇｎｄ遺伝子のクローニング
ｎｒｆ１のクローニングは、以下のようにして行った。まず決定したＮ末アミノ酸配列の情報を基にカセットＰＣＲ法でコード領域を取得した。次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約８．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
【０１０７】
カセットＰＣＲ法によるｎｒｆ１遺伝子断片の取得はＴａＫａＲａ　ＬＡ　ＰＣＲ　インビトロ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（宝酒造社）を使用し、本キットに添付のマニュアルに記載の方法に準じて行った。まず、染色体ＤＮＡ　５μｇをＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次に、制限酵素断片にＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃａｓｓｅｔｔｅを連結し、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃ１とＰｒｉｍｅｒ　ＮＲＦ１−Ｎ１を使用して１回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　ＰＥＲＳＯＮＥＬ（宝酒造社製）を用いて行い、以下の条件で３０サイクル行った。９４℃　３０秒、５５℃　２分、７２℃　１分。
【０１０８】
次に、この反応液を１００倍に希釈して、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｃ２及びＰｒｉｍｅｒ　　ＮＲＦ１−Ｎ２を新たに加えて２回目のＰＣＲを行った。条件は１回目と同じであった。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＮＲＦ１のＮ末端アミノ酸配列と一致しており、目的のｎｒｆ１遺伝子が取得されたことが確認された。
【０１０９】
ｎｒｆ１遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したｎｒｆ１遺伝子の内部を表３に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、それぞれプローブと強くハイブリダイズする約３．６ｋｂｐのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片（上流域）と、約４．８ｋｂｐのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片（下流域）を検出した。そこで、定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれらの断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号１６）。
【０１１０】
ｎｒｆ１遺伝子をクローニングした結果、本遺伝子のコード領域は２８７１ｂｐで、９５７アミノ酸残基からなる１０３ｋＤａのタンパク質をコードしていた。推定されるアミノ酸配列（配列番号１７）を相同性検索にかけたところ、Ｎ末側の１７〜３８１番残基はトランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）との相同性が認められ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ由来ＴＡＬと４６％の相同性を有していた。また、Ｃ末側の４３４〜７６９番残基はグルコース−６−リン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）との相同性が認められ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来ＰＧＩと２７％の相同性を有していた。
【０１１１】
また、ｎｒｆ１の周辺領域をクローニングした結果、ｎｒｆ１の上流、下流に１つずつｏｒｆが存在しており、これら３つの遺伝子はオペロンを形成していると推定された。上流のｏｒｆ１は６８５アミノ酸残基からなる７３．５ｋＤａのタンパク質をコードしており（配列番号１８）、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）との相同性を有していた。また、下流のｏｒｆ２は３３２アミノ酸残基からなる３５．９ｋＤａのタンパク質をコードしており（配列番号１９）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（「６ＰＧＡＤＨ」または「ＧＮＤ」と省略する。またこれをコードする遺伝子を「ｇｎｄ」と略す。）との相同性を有していた。具体的には、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ由来ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤと４３％の相同性を示した。このことから、ｎｒｆ１オペロンは、ペントースリン酸回路の遺伝子をコードしているものと推定された。一般的に、ＧＮＤはＮＡＰＤ型であることが広く知られているが、ｏｒｆ２はＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤとより高い相同性が認められられたことから、本遺伝子産物がＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤである場合には、還元力（ＮＡＤＨ）供給遺伝子としての効果を有する可能性が考えられた。
【０１１２】
（２）ｎｒｆ２（ＲＫ）遺伝子のクローニング
ｎｒｆ２のクローニングは、以下のようにして行った。まず、遺伝子の上流領域をカセットＰＣＲで取得し、次に取得した遺伝子断片をプローブとしたサザン解析とコロニーハイブリダイゼーションにより、合わせて約４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
【０１１３】
ｎｒｆ１遺伝子断片のクローニングと同様に、カセットＰＣＲ法により、Ｐｒｉｍｅｒ　ＮＲＦ２ＡＳ１とＮＲＦ２ＡＳ３を用いてｎｒｆ２遺伝子上流域の増幅を行ったところ、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１８にクローニングし、塩基配列を決定したところ、取得したＤＮＡ断片から推定されるアミノ酸配列が、ＮＲＦ２のＮ末端アミノ酸配列と一致しており、目的のｎｒｆ２遺伝子の上流領域が取得されたことが確認された。
【０１１４】
ｎｒｆ２遺伝子全長の取得は以下の方法で行った。まず取得したｎｒｆ２遺伝子の内部を表４に示すプライマーを用いて増幅し、これらをプローブとしてサザン解析を行ったところ、プローブと強くハイブリダイズする約４．２ｋｂｐのＥｃｏＲＩ断片を検出した。そこで定法に従いコロニーハイブリダイゼーションによりこれら断片を取得し、塩基配列を決定した（配列番号２０）。
【０１１５】
ｎｒｆ２遺伝子のコード領域は１６４４ｂｐであり、５４８アミノ酸残基からなる５９ｋＤａのタンパク質（配列番号２１）をコードしていた。アミノ酸配列の相同性検索を行ったところ、ＲＫ、リビトールキナーゼやキシルロキナーゼなどのシュガーキナーゼとの高い相同性が認められた。具体的には、Ｅ．　ｃｏｌｉ由来リビトールキナーゼと４４％の相同性を示した。
【０１１６】
【実施例６】Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのＮＡＤ−ＮＡＤＰ型Ｇ６ＰＤＨおよびＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ活性の検出
以上の結果より、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのペントースリン酸回路を強化することにより還元力（ＮＡＤＨ）が得られることが示された。そこで、以下の方法で、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓのペントースリン酸回路の酵素活性を測定したところ、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにおいてＮＡＤＨを供給する酵素として、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）と６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＡＤＨ）を新たに見出した。
【０１１７】
〔グルコース−６−リン酸　（Ｇ６Ｐ）デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４（ｐＨ８．２）
０．５ｍＭ　ＮＡＤ（Ｐ）
１５ｍＭ　グルコース−６−リン酸
【０１１８】
〔６−ホスホグルコン酸　（６ＰＧＡ）デヒドロゲナーゼ活性測定反応液〕
１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ_２ＳＯ_４（ｐＨ８．２），　０．５ｍＭ　ＮＡＤ（Ｐ），　１５ｍＭ　６−ホスホグルコン酸
【０１１９】
ともに、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの可溶性画分を酵素源とし、３４０ｎｍの吸光度の増加を測定した。また、それぞれの酵素活性のｐＨプレフィールを測定した。ｐＨプレフィール作成には、酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０〜６．５）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ　７．０〜８．５）、グリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ　９．０〜１０．５）の各バッファーを用いた。結果を図１及び図２に示す。
【０１２０】
以上の検討により、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにおいて、Ｇ６ＰＤＨと６ＰＧＡＤＨの２つの酵素が、ＮＡＤとＮＡＤＰのいずれも補酵素とし得るＮＡＤ−ＮＡＤＰ型酵素であることを見出した。
広く一般的には、これらの酵素はＮＡＤＰ特異的酵素として知られているが、Ｇ６ＰＤＨについては、ある特定の種においては（例えばＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型活性を示すことが報告されている（Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，　１６９，　３３４　（１９８７））。しかし、酢酸菌においてはＧ６ＰＤＨはＮＡＤＰ型とされており（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｒｅｖ．　５５，　３５　（１９９１）；　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　６０，　１３７７　（１９９６））、酢酸菌Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤにも活性を示すことを今回はじめて見出した。
【０１２１】
なお、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍにおいては、ＮＡＤＰ型酵素に加えて、ＮＡＤ型の酵素が報告されている　（Ｊ．　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２４８，　１６０３　（１９７３）；　Ａｒｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．，　３１０，　３６０　（１９９４））。ただし、このＮＡＤ型の酵素はＧ６Ｐだけでなくグルコースも基質とし、しかもｐＨ５．６に至適を持つ特異な酵素である。しかし、今回Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓに見出されたＮＡＤ型活性の至適ｐＨは約９．５であり、また、ＮＡＤを補酵素とした場合、グルコースを基質としたときには活性が検出されなかった。従って、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓにはＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍのような特異な酵素は存在せず、Ｇ６ＰＤＨがＮＡＤ−ＮＡＤＰ型の活性も示すと考えられる。一方、６ＰＧＡＤＨについては、酢酸菌においてはこれまで全く報告が無く、こちらも新規な酵素である。
【０１２２】
【実施例７】Ｇ６ＰＤＨ遺伝子（ｚｗｆ）のクローニング
Ｅ．　ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表５に示すプライマーを用いて、Ｅ．　ｃｏｌｉのＧ６ＰＤＨ遺伝子（ｚｗｆ）の一部を増幅した。得られた断片をプローブとして使用し、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓの染色体ＤＮＡに対してサザンハイブリダイゼーションを行なったところ、バンドが検出された。このうち、約４ｋｂのＢａｍＨＩ切断断片について、ｐＵＣ１８をベクターとして約５０００クローンよりなるライブラリーを構築した。このライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーションにより目的クローンを選抜した。挿入断片の塩基配列を決定し（配列番号２２）、ｚｗｆ遺伝子と推定される読み取り枠を見出した。この読み取り枠は、４８８アミノ酸残基よりなるタンパク質をコードしており（配列番号２３）、そのタンパク質はＥ．　ｃｏｌｉのＧ６ＰＤＨと４３．６％の相同性を示した。
【０１２３】
【表５】

【０１２４】
【実施例８】ｔａｌ−ｐｇｉ、ｒｋ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型Ｇ６ＰＤＨ（ｚｗｆ）およびＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ（ｇｎｄ）のＥ．　ｃｏｌｉでの発現と酵素活性測定
ｎｒｆ１、ｎｒｆ２遺伝子をクローニングした結果、相同性検索からＮＲＦ１はトランスアルドラーゼとグルコースリン酸イソメラーゼの２機能酵素であることが、ＮＲＦ２はリブロキナーゼであることが示唆され、また、ｎｒｆ１の下流にＮＡＤ型６ＰＧＡＤＨの相同遺伝子が存在することが判明した。そこで、これらの遺伝子産物の機能を特定するために、Ｅ．　ｃｏｌｉでの発現と酵素活性の測定を行った。
【０１２５】
まず、ｎｒｆ１（ｔａｌ−ｐｇｉ）、ｎｒｆ２（ｒｋ）をＥ．　ｃｏｌｉで発現させるために、それぞれの遺伝子のＣ末に６×Ｈｉｓ−Ｔａｇを連結したものをｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流に挿入したプラスミドｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓ、ｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを構築した。プラスミドの構築に先立ち、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１株の染色体ＤＮＡを定法にしたがって調製し、これを鋳型として表６に示すプライマーを用いてそれぞれの遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。
【０１２６】
ｔａｌ−ｐｇｉおよびｒｋ発現プラスミド構築の際に使用したＰＣＲプライマーは、５’側はＳＤ配列の上流に制限酵素部位を導入し、３’側はｔａｌ−ｐｇｉおよびｒｋについては６×Ｈｉｓ−Ｔａｇを連結後に、終止コドンと制限酵素部位を導入するようにそれぞれ設計した。プライマーＴａｌ５’−ＳａｌおよびＴａｌ３’−Ｈｉｓ−Ｓｐｈを用いてＧ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１染色体ＤＮＡより増幅した断片をＳａｌＩ／ＳｐｈＩ消化し、ｐＵＣ１８のＳａｌＩ／ＳｐｈＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓを構築した。また、プライマーＲＫ５’−ＥｃｏおよびＲＫ３’−Ｈｉｓ−Ｂａｍを用いてＧ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＴＣＣ６２１染色体ＤＮＡより増幅した断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入したプラスミドｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを構築した。
【０１２７】
また、ｎｒｆ１の下流に見出されたｇｎｄ相同遺伝子およびｚｗｆ遺伝子についても表６記載の配列のプライマーを用いて増幅し、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩに連結したプラスミドｐＵＣＧＮＤ、ｐＵＣＺＷＦをそれぞれ作製した。
【０１２８】
【表６】

【０１２９】
構築した発現プラスミドをそれぞれＥ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９に導入した。形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で一昼夜３７℃で振盪培養した。前培養液を５０ｍｌのＬＢ培地に１％シードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始約２時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３時間培養を行った。培養終了後、集菌、洗浄を行い、５ｍｌの５０ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．５）に懸濁し、マルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて菌体を破砕した。破砕液を１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した上清を粗酵素液とした。
【０１３０】
トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、グルコースリン酸イソメラーゼ（ＰＧＩ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）　シュガーキナーゼの酵素活性の測定法は、以下に示す方法で行った。一分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生じる活性を１Ｕとした。なおＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍにおける分子吸光係数はε＝６．３×１０^３として算出した。
【０１３１】
〔ＴＡＬ活性測定〕
５０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ７．６）
５ｍＭ　　フルクトース−６−リン酸
５ｍＭ　　エリスロース−４−リン酸
０．５ｍＭ　　ＮＡＤＨ
２Ｕ／ｍｌ　　グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ／トリオースリン酸イソメラーゼ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の減少を測定
【０１３２】
〔ＰＧＩ活性測定〕
５０ｍＭ　　ＫＰＢ　（ｐＨ７．０）
５ｍＭ　　フルクトース−６−リン酸
１ｍＭ　　ＮＡＤＰ
５Ｕ／ｍｌ　　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３３】
〔６ＰＧＡＤＨ活性測定〕
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ８．０）
１０ｍＭ　　６−ホスホグルコン酸
１ｍＭ　　ＭｇＣｌ_２
１ｍＭ　　ＮＡＤ／ＮＡＤＰ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３４】
〔Ｇ６ＰＤＨ活性測定法〕
５０ｍＭ　　グリシン−ＮａＯＨ　（ｐＨ９．５）
１０ｍＭ　　グルコース−６−リン酸
１ｍＭ　　ＮＡＤ／ＮＡＤＰ
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の増加を測定
【０１３５】
〔シュガーキナーゼ活性測定〕
５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．０）
５ｍＭ　　　　　　ＭｇＣｌ_２
１ｍＭ　　ＡＴＰ
８．３Ｕ／ｍｌ　ラクテートデヒドロゲナーゼ
８．３Ｕ／ｍｌ　ピルビン酸キナーゼ
０．３ｍＭ　　　ＮＡＤＨ
１ｍＭ　　ホスホエノールピルビン酸
５ｍＭ　　基質糖
３０℃での３４０ｍＭの吸光度の減少を測定
【０１３６】
前述の方法で、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＵＣＴＡＬ−Ｈｉｓ及びｐＵＣＳＫ−Ｈｉｓを１Ｌづつ培養した。集菌、洗浄して得られた湿菌体３ｇから組換え酵素を精製した。精製はＨｉＴｒａｐキレートカラム（アマシャムファルマシア製）を用いて、プロトコル通りに行った。５００ｍＭのイミダゾールを含む溶出画分を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７．６）に透析して酵素溶液とした。その結果、それぞれ、１００ｋＤａ、６０ｋＤａに相当するバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認された。さらに可溶性画分よりＮｉカラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｃｈｅｌａｔｅ　カラム、アマシャムファルマシア製）で精製することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でほぼ単一のバンドとしてそれぞれのタンパク質が精製された。
【０１３７】
調製した組換え酵素を用いて遺伝子の相同性が認められたＴＡＬ、ＰＧＩおよびシュガーキナーゼの活性を測定した。その結果（表７）、ＮＲＦ１についてはＴＡＬ活性およびＰＧＩ活性の両方が検出され、本酵素がＴＡＬ−ＰＧＩの２機能酵素であることが明らかとなった。
【０１３８】
【表７】

【０１３９】
また、ＮＲＦ２（シュガーキナーゼ）については基質特異性の特定のために、以下の基質について反応性を検討した。Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−キシロース、Ｄ−アラビトール、キシリトール、リビトール、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−リボース、Ｄ−グリセロール、Ｄ−ソルビトール。その結果（表８）、ＮＲＦ２はＤ−リブロースにのみ作用したことから、リブロキナーゼであることが明らかとなった。
【０１４０】
【表８】

【０１４１】
また、ｎｒｆ１の下流に見出したｇｎｄ相同遺伝子についてもＥ．　ｃｏｌｉで発現させて酵素活性を測定し、補酵素特異性について検討した。その結果（表９）、対照株ではＮＡＤＰ依存的６ＰＧＡＤＨ活性のみ検出されたが、ｐＵＣＧＮＤ導入株においてはＮＡＤ依存的６ＰＧＡＤＨ活性も検出された。また、ＮＡＤ依存的活性（１．３Ｕ／ｍｇ）をＮＡＤＰ依存的活性の増加分（０．４９Ｕ／ｍｇ）と比較することにより、本遺伝子はＮＡＤＰとＮＡＤの双方を補酵素とする６ＰＧＡＤＨであること、およびＮＡＤＰよりＮＡＤに対してより高活性（約２．５倍）なＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ＧＮＤであることが明らかとなった。
【０１４２】
【表９】

【０１４３】
また、ｚｗｆ遺伝子についてもＥ．　ｃｏｌｉで発現させたところ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型のＧ６ＰＤＨ活性が検出され、クローニングした遺伝子が、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｚｗｆであることが示された（表１０）。
【０１４４】
【表１０】

【０１４５】
ＴＡＬ−ＰＧＩ、ＲＫが目的とする還元力供給因子であることを確認するために、調製した組換え酵素をインビトロ再構成系に添加してキシリトール生成量の増加効果について検討した。
【０１４６】
調製したＴＡＬ−ＰＧＩを０．１ｍｇ／ｍｌ、又はＲＫを０．０５ｍｇ／ｍｌ添加した区をそれぞれ設定し、３０℃で４０時間下記の反応液で反応を行って、生成キシリトール量を定量した。
【０１４７】
〔反応溶液〕
１００ｍＭ　ＫＰＢ　（ｐＨ６．０）
１０ｍＭ　ＮＡＤ
１ｇ／ｄｌ　アラビトール
１ｍｇタンパク質／ｍｌ膜画分
０．５ｍｇタンパク質／ｍｌ可溶性画分
１ｍＭ　ＣｏＣｌ_２
【０１４８】
その結果（図３）、アラビトールからの生成キシリトール量が、ＴＡＬ−ＰＧＩ添加区（０．１ｍｇ／ｍｌ）、ＲＫ添加区（０．０５ｍｇ／ｍｌ）ともにコントロール区と比較して増加しており、これらの酵素がインビトロ再構成系における還元力供給因子であることが確認された。尚、図３中、「ｓｏｌ　Ｘ３」は、反応系の可溶性画分量を１．５ｍｇタンパク／ｍｌ可溶性画分に増加した区を示す。
【０１４９】
【実施例９】ｔａｌ−ｐｇｉ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｚｗｆ、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型ｇｎｄおよびｒｋのＧ．　ｏｘｙｄａｎｓでの増幅効果検討
ｔａｌ−ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｇｎｄ、ｒｋの各遺伝子とｘｄｈ（米国特許第６，２４２，２２８号に記載のｘｄｈ２）との共発現株を作製するために、それぞれの遺伝子をＥ．　ｃｏｌｉとＧｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒのシャトルベクターであるｐＳＡ１９に連結した発現プラスミドを構築した。ｐＳＡ１９は外内らによってＢｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　５８（１０），　１８９９−１９０１，　１９９４にその構築方法が記載されている。具体的には、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｍ）ＢＰＲ２００１株の内在性プラスミドであるｐＡＨ４を定法（アルカリ−ＳＤＳ法）に従って単離し、ｐＡＨ４においてユニークな制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結してシャトルベクターｐＳＡ１９を得た。尚、ＢＰＲ２００１株は、現在はグルコノバクター・キシリナス　サブスピーシーズ　スクロファーメンタンス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）ＡＴＣＣ７００１７８と命名されている。
【０１５０】
発現プラスミド構築のために作製したプライマーの配列を表１１に、構築方法の模式図を図４〜６に示す。
【０１５１】
【表１１】

【０１５２】
ｐＳＡ１９にそれぞれの遺伝子を連結したプラスミドｐＳＡＴＡＬ、ｐＳＡＺＷＦ、ｐＳＡＧＮＤと、共発現プラスミドｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨをそれぞれ構築し、Ｇ．　ｏｘｙｄａｎｓ　ＡＪ２８４７株に導入した。得られた形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＹＰＧ（ＹＰＧ−Ａｍｐ）プレートでリフレッシュ後、５０ｍｌのＳＲ培地に接種して、３０℃で２４時間培養した。集菌・洗浄後、前述の方法にしたがって菌体を破砕し、酵素活性を測定した。
【０１５３】
その結果、ｚｗｆ発現プラスミド導入株では、ＮＡＤ型Ｇ６ＰＧＨ活性が親株の４．３倍に増加しており、発現量の増加が認められた（表１２）。
ｇｎｄ発現プラスミド導入株では、ＮＡＤ−ＮＡＤＰ型６ＰＧＡＤＨ活性が親株の約３倍に増加しており、発現量の増加が認められた（表１３）。さらに、ｇｎｄの下流にｘｄｈ遺伝子を連結した共発現プラスミド（ｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨ）の導入株においては６ＰＧＡＤＨ活性、ＸＤＨ活性ともに増加しており、共発現株が作製できた。
【０１５４】
また、ＴＡＬ−ＰＧＩ発現プラスミド導入株では、ＰＧＩ活性で親株の約１．３倍発現していた（表１４）。
【０１５５】
【表１２】

【０１５６】
【表１３】

【０１５７】
【表１４】

【０１５８】
【実施例１０】ペントース系遺伝子発現プラスミド導入株でのアラビトール→キシリトール変換反応の検討
ＹＰＧ−Ａｍｐプレート上で３０℃、２４時間リフレッシュ培養した菌体を３ｍｌのＹＰＧ−Ａｍｐに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られた培養液を５０ｍｌのシード培地を含む坂口フラスコに５％シードし、３０℃で２４時間振盪培養した。遠心分離で集菌後、５０ｍｌの変換培地に懸濁し、３０℃で振盪させてアラビトール→キシルロース変換反応を開始した。変換開始１６時間後に２５ｍｌずつ坂口フラスコに分注し、キシルロース→キシリトール変換反応を行った。後段の反応は２ｇ／ｄｌグルコース添加区及び無添加区を設定し、振とう反応にて実施した。
【０１５９】
〔シード培地〕
５ｇ／ｄｌ　グリセロール、０．３ｇ／ｄｌ　ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１ｇ／ｄｌ　Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．０５ｇ／ｄｌ　ＭｇＳＯ_４、０．５ｇ／ｄｌ　ＹＥ、０．５ｇ／ｄｌカザミノ酸、１ｇ／ｄｌ　Ｌ−グルタミン酸酸ナトリウム、金属混合物、ビタミン混合物。
【０１６０】
〔変換培地〕
１０ｇ／ｄｌアラビトール、０．３ｇ／ｄｌ　ＫＨ_２ＰＯ_４、０．１ｇ／ｄｌ　Ｋ_２ＨＰＯ_４、０．０５ｇ／ｄｌ　ＭｇＳＯ_４、０．５ｇ／ｄｌ　ＹＥ、０．５ｇ／ｄｌペプトン、金属混合物、ビタミン混合物、２ｇ／ｄｌ　炭酸カルシウム。
【０１６１】
１０ｇ／ｄｌのアラビトールを含む変換培地にシード培養で得た菌体全量を接種し、３０℃で１６時間振盪反応によってキシルロースへと変換し、さらに２ｇ／ｄｌのグルコースを添加して反応を行った。その結果（表１５）、還元力供給遺伝子導入株においては、グルコース添加区・無添加区ともにキシリトール生成量の増加が認められた。グルコース添加区においては、１０ｇ／ｄｌのアラビトールからのキシリトール収率がコントロール株で１２％であるのに対して、ｔａｌ−ｐｇｉ、ｚｗｆ、ｇｎｄおよびｇｎｄ−ｘｄｈ導入株ではそれぞれ１８％、１７％、１５％、２４％とキシリトール蓄積の増加が認められた。
【０１６２】
【表１５】

【０１６３】
【発明の効果】
本発明により、グルコノバクター属細菌のＮＡＤＨ生成に関与する新規酵素及びそれらをコードする遺伝子が提供される。
本発明のグルコノバクター属細菌は、同細菌を用いた目的物質の製造に好適に用いることができる。特に、本発明の方法は、キシリトールの製造に好適である。
【０１６４】
【配列表】

【０１６５】

【０１６６】

【０１６７】

【０１６８】

【０１６９】

【０１７０】

【０１７１】

【０１７２】

【０１７３】

【０１７４】

【０１７５】

【０１７６】

【０１７７】

【０１７８】

【０１７９】

【０１８０】

【０１８１】

【０１８２】

【０１８３】

【０１８４】

【０１８５】

【０１８６】

【０１８７】

【０１８８】

【０１８９】

【０１９０】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＮＡＤＰ（●）又はＮＡＤ（黒三角）を補酵素としたときのＧ６ＰＤＨ活性（相対活性）を示す図。
【図２】ＮＡＤＰ（●）又はＮＡＤ（黒三角）を補酵素としたときの６ＰＧＤＨ活性（Ｕ／ｍｇ）を示す図。
【図３】インビトロ再構築系によるアラビトール→キシリトール変換反応におけるＴＡＬ−ＰＧＩ及びＲＫの効果を示す図。
【図４】ｔａｌ−ｐｇｉを含むプラスミドｐＳＡＴＡＬの構築を示す図。
【図５】ｇｎｄ、又はｇｎｄ及びｘｄｈを含むプラスミドｐＳＡＧＮＤ及びｐＳＡＧＮＤ−ＸＤＨの構築を示す図。
【図６】ｚｗｆを含むプラスミドｐＳＡＺＷＦの構築を示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel gene involved in NADH production by a Gluconobacter bacterium, and a Gluconobacter bacterium having an enhanced NADH-producing ability. The bacterium of the present invention is useful for producing useful substances such as xylitol.
[0002]
[Prior art]
Demand for xylitol, a naturally occurring sugar alcohol, is expected to increase in the future. Xylitol is lower in calories than sucrose and has a sweetness comparable to that of sucrose, so that it is promising as a low-calorie sweetener in the future. In addition, it has anti-caries properties and is used as a sweetener for preventing tooth decay. In addition, xylitol does not increase blood sugar levels and is therefore used as an infusion solution for treating diabetes.
[0003]
Currently, xylitol is produced industrially primarily by the hydrogenation of D-xylose as described in U.S. Pat. No. 4,008,825. D-xylose as a raw material is obtained by starting from hardwood, straw, corn cobs, oat hulls, and other xylan-rich plant materials, and hydrolyzing them.
[0004]
In recent years, a method for producing xylitol using a microorganism has been developed. For example, a method for producing xylitol using other pentitols as a starting material has been developed. One readily available pentitol is D-arabitol, which can be produced using yeast (Can. J. Microbiol., 31 (1985) @ 467-471, J. Gen. Microbiol., 139). (1993) {1047-1054). Therefore, several methods for producing xylitol using D-arabitol as a raw material have been developed. Applied @ Microbiology. , {18} (1969) {1031-1035, describe the use of Debaryomyceshansenii @ATCC 20121 to produce D-arabitol from glucose by fermentation, and then use Acetobacter suboxydancedance as an Acetobacter suboxidase. The D-arabitol was converted to D-xylulose, and further converted to Candida gilielmondi vari. A method has been reported in which soya (Candida @ guilliermondii @ var. @ Soya) is allowed to act on the D-xylulose to convert it into xylitol.
[0005]
Furthermore, D-arabitol is produced by fermentation using osmotic yeast, and then D-arabitol is converted to D-xylulose using bacteria of the genus Acetobacter, Gluconobacter or Klebsiella. And then reacting the same xylulose with glucose (xylose) isomerase to produce xylose and a mixture of xylulose, and hydrogenating the resulting xylose / xylulose to convert it to xylitol (European Patent Application). Publication Nos. 403392 and 421882). Also disclosed is a method in which xylose in the same xylose / xylulose mixture is pre-concentrated and hydrogenated to convert it into xylitol.
[0006]
However, the above xylitol production method using D-arabitol as a raw material can produce xylitol in a relatively high yield, but requires a multi-step reaction step, which makes the process complicated. Therefore, it was not economically satisfactory.
[0007]
In order to solve these problems, the present inventors have found a microorganism capable of directly converting D-arabitol to xylitol, act on the microorganism with D-arabitol, and collect the produced xylitol. (EP-A-1 026-254). Examples of the microorganism include bacteria belonging to the genus Gluconobacter or genus Acetobacter such as Gluconobacter suboxydans, Gluconobacter oxydans, Acetobacter xylinum, and Acetobacter xylinum. included.
[0008]
The above method is an excellent method that can efficiently convert D-arabitol to xylitol by a simple one-step process by fermentation, but there is room for improvement in the stability of the reaction and the yield of xylitol. . Therefore, the present inventors analyzed bacteria having the ability to directly convert D-arabitol to xylitol, and revealed that the present conversion reaction involves D-arabitol dehydrogenase activity and D-xylulose reductase activity. . By adding a carbon source or reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) during the conversion reaction from D-arabitol to xylitol and performing the reaction, xylitol can be stably produced in high yield. (EP-A-1 026-255).
[0009]
On the other hand, breeding of xylitol fermentation bacteria has been attempted by genetic engineering techniques. The arabitol dehydrogenase gene derived from a Klebsiella bacterium and the xylitol dehydrogenase gene derived from a yeast belonging to the genus Pichia were transformed into fermented arabitol (Candida), Torulopsis or Zygosaccharomyces belonging to the genus Zygosaccharomyces. The production of xylitol from glucose by fermentation has been attempted using the transgenic bacteria introduced in WO94 / 10325 (WO94 / 10325).
[0010]
Furthermore, there is a method in which a xylitol dehydrogenase gene derived from Gluconobacter oxydans is introduced into a microorganism having an ability to supply reducing power, such as a bacterium belonging to the genus Escherichia, and the microorganism is allowed to act on D-xylulose to produce xylitol. (US Pat. No. 6,242,228).
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, a method for producing xylitol from D-arabitol using a bacterium belonging to the genus Gluconobacter has been developed, but there is room for improvement in the yield of the step of reducing D-xylulose and converting it to xylitol. was there. The present inventors considered that the coenzyme NADH is required for this reaction (xylitol dehydrogenase reaction), and therefore thought that increasing the ability of Gluconobacter bacteria to supply NADH would improve the xylitol producing ability. However, it is known that the bacterium belonging to the genus Gluconobacter has an incomplete TCA cycle, which is generally regarded as a pathway for producing NADH, and the pathway for producing NADH was unknown.
[0012]
The present invention has been made from the above viewpoint, and identifies and obtains enzymes and genes involved in NADH production of Gluconobacter bacteria, and further utilizes these genes to produce NADH-producing ability of Gluconobacter bacteria. And thereby improve the ability to produce useful substances such as xylitol.
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have constructed a D-arabitol → xylitol conversion reaction assay system using a cell-free extract of Gluconobacter oxydans and succeeded in isolating and identifying a factor that improves xylitol yield. . Furthermore, they found that the gene encoding one of these factors forms an operon, and that the other genes in the operon are also factors that improve xylitol yield. By enhancing the expression of these genes, the ability to produce xylitol was successfully improved, and the present invention was completed.
[0014]
That is, the present invention is as follows.
(1) A protein represented by the following (A) or (B):
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, and at least one of transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity; A protein having one or both.
(2) DNA encoding a protein shown in the following (A) or (B).
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, and at least one of transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity; A protein having one or both.
(3) The DNA of (2), which is a DNA shown in the following (a) or (b):
(A) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 2437 to 5310 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16;
(B) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, hybridizes with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotide numbers 2437 to 5310 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence under stringent conditions, and has a transaldolase activity and DNA encoding a protein having at least one or both of glucose-6-phosphate isomerase activities.
(4) The DNA according to (3), wherein the stringent condition is that washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.
[0015]
(5) a protein represented by the following (C) or (D):
(C) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(D) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity;
(6) DNA encoding the protein shown in (C) or (D) below.
(C) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(D) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity;
(7) The DNA of (6), which is the DNA shown in (c) or (d) below.
(C) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotides 5314 to 6312 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
(D) hybridizing under stringent conditions with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotides 5314 to 6312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and 6-phosphoglucone DNA encoding a protein having acid dehydrogenase activity.
(8) The DNA according to (7), wherein the stringent condition is that washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.
[0016]
(9) A protein represented by the following (E) or (F):
(E) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(F) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having a lipokinase activity;
(10) DNA encoding a protein shown in the following (E) or (F).
(E) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(F) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having a lipokinase activity;
(11) The DNA of (10), which is a DNA shown in (e) or (f) below.
(E) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 196 to 1815 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
(F) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, hybridizes with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotide numbers 196 to 1815 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence under stringent conditions, and has a lipokinase activity. DNA encoding a protein.
(12) The DNA according to (11), wherein the stringent conditions are conditions under which washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.
[0017]
(13) A protein represented by the following (G) or (H):
(G) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(H) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity;
(14) DNA encoding a protein represented by the following (G) or (H):
(G) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(H) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity;
(15) The DNA according to (14), which is a DNA represented by the following (g) or (h):
(G) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 983 to 2449 out of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22;
(H) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, hybridizes under stringent conditions to at least a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 983 to 2449 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and glucose-6- DNA encoding a protein having phosphate dehydrogenase activity.
(16) The DNA according to (15), wherein the stringent condition is that washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.
[0018]
(17) In a method for producing a target substance, wherein a target substance is produced by causing a bacterium belonging to the genus Gluconobacter to act on a raw material for biosynthesis of the target substance, the target substance is subjected to reduced nicotinamide adenine. A method comprising requiring a dinucleotide, and wherein the bacterium has been modified to have enhanced activity of one or more enzymes involved in the production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide. (18) The enzyme activity is one or two or more selected from the group consisting of transaldolase-glucose-6-phosphate isomerase complex, 6-phosphogluconate dehydrogenase, ribobrokinase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase. The method according to (17), which is an activity of an enzyme.
(19) The method according to (19), wherein the enhancement of the enzyme activity is due to enhancement of the expression of a gene encoding each enzyme.
(20) The method according to (19), wherein the expression of the gene is enhanced by increasing the intracellular copy number of the gene or by enhancing the function of an expression regulatory sequence of the gene.
(21) The method according to any one of (17) to (20), wherein the target substance is xylitol, and the reduction reaction is a conversion reaction from D-xylulose to xylitol.
(22) The method according to (21), wherein the bacterium is further modified to increase xylitol dehydrogenase activity.
(23) The method according to any one of (17) to (22), wherein the bacterium is Gluconobacter oxydans.
(24) expression of one or more genes selected from the group consisting of transaldolase-glucose-6-phosphate isomerase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, ribobrokinase gene, and glucose-6-phosphate dehydrogenase; A Gluconobacter bacterium modified to be enhanced.
(25) The bacterium of the genus Gluconobacter according to (24), further modified to increase xylitol dehydrogenase activity.
(26) The bacterium belonging to the genus Gluconobacter according to (23) or (25), which is Gluconobacter oxydans.
[0019]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
<1> Protein and DNA of the present invention
The first protein of the present invention is a protein having at least one or both of transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity (hereinafter, also referred to as “TAL-PGI”), and the first DNA of the present invention. Is a DNA encoding the same protein (hereinafter, also referred to as “tal-pgi”). The protein is preferably a protein having both transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity. A protein having transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity on a single peptide has not been reported so far and is a novel enzyme. In this specification, TAL-PGI may be referred to as "TAL" when referring to transaldolase activity, and may be referred to as "PGI" when referring to glucose-6-phosphate isomerase activity.
[0020]
The second protein of the present invention is a protein having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity (hereinafter, also referred to as “6PGADH”), and the second DNA of the present invention is a DNA encoding the protein (hereinafter, “6PGADH”). gnd ").
[0021]
The third protein of the present invention is a protein having a librokinase activity (hereinafter also referred to as “RK”), and the third DNA of the present invention is a DNA encoding the same protein (hereinafter also referred to as “rk”). ).
[0022]
The fourth protein of the present invention is a protein having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity (hereinafter, also referred to as “G6PDH”), and the fourth DNA of the present invention is a DNA encoding the protein (hereinafter, referred to as “G6PDH”). "Zwf").
[0023]
The DNA of the present invention may encode one or more of the above proteins. In particular, the first DNA and the second DNA of the present invention can be obtained as single DNA fragments from the chromosomal DNA of a Gluconobacter bacterium.
[0024]
Upon completion of the present invention, these DNAs were isolated as factors that improve the xylitol yield in a D-arabitol-> xylitol conversion reaction assay system using a cell-free extract of Gluconobacter oxydans. It is obtained as a gene encoding a factor and a gene adjacent thereto. However, since their nucleotide sequences have been elucidated by the present invention, primers are synthesized based on those nucleotide sequences and obtained by amplifying by PCR using chromosomal DNA of Gluconobacter bacteria as a template. Can be. The DNA of the present invention can also be obtained by colony hybridization using a probe prepared based on the above nucleotide sequence or a partial fragment amplified by PCR as a probe. The chromosomal DNA of a bacterium belonging to the genus Gluconobacter can be obtained from a bacterium serving as a DNA donor, for example, according to the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619) (1963). Experimental book, edited by the Society of Biotechnology, Japan, pages 97-98, Baifukan, 1992).
Examples of the primer include an oligonucleotide having a base sequence shown in Table 6.
[0025]
Examples of the bacteria belonging to the genus Gluconobacter include Gluconobacter oxydans, Gluconobacter suboxydans, and the like. Specifically, Gluconobacter oxydans strain AJ2847 (ATCC621), Gluconobacter suboxydans NRRLＲB -775 strains. The strains are the American Type Culture Collection (10801 University, Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America) and the Agricultural Research Service Culture Collection (Agricultural Research RL). (1815 \ North \ University \ Street, \ Peoria, \ Illiois \ 61604, \ United \ States \ of \ America).
[0026]
In obtaining the DNA of the present invention and constructing the bacterium of the present invention described below, methods such as preparation of a chromosomal DNA library, hybridization, PCR, preparation of plasmid DNA, cutting and ligation of DNA, transformation, etc. are described in Sambrook. , @J. , Fritsch, E. F. , Maniatis, T. , {Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1.21} (1989).
[0027]
An example of the base sequence of the DNA fragment containing tal-pgi of the present invention obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 16. In this DNA fragment, different ORFs were found upstream and downstream of the open reading frame (ORF) encoding TAL-PGI. These encode transketolase and 6PGADH, respectively, and the DNA fragment was presumed to form an operon. The amino acid sequence of transketolase is shown in SEQ ID NO: 17, the amino acid sequence of TAL-PGI is shown in SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence of 6PGADH is shown in SEQ ID NO: 19.
[0028]
In addition, examples of the nucleotide sequence of the DNA fragment containing the rk gene of the present invention and the amino acid sequence of RK that can be encoded by this sequence are shown in SEQ ID NOS: 20 and 21.
Furthermore, an example of the nucleotide sequence of the DNA fragment containing zwf of the present invention and an amino acid sequence of G6PDH that can be encoded by this sequence are shown in SEQ ID NOS: 20 and 21.
[0029]
The first DNA of the present invention may comprise one or more amino acid substitutions or deletions as long as the transaldolase activity or glucose-6-phosphate isomerase activity of the encoded protein, and preferably both activities are not impaired. , TAL-PGI including insertion, addition or addition. Here, "several" differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 50, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5 Individual.
[0030]
The protein encoded by the second DNA of the present invention may be 6PGADH containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions or additions as long as the 6-phosphogluconate dehydrogenase activity is not impaired. Here, "several" differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 50, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5 Individual.
[0031]
The protein encoded by the third DNA of the present invention may be an RK containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions or additions, as long as the librokinase activity is not impaired. Here, "several" differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 50, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5 Individual.
[0032]
The protein encoded by the fourth DNA of the present invention may be G6PDH containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions or additions, as long as glucose-6-phosphate dehydrogenase activity is not impaired. . Here, "several" differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 2 to 50, preferably 2 to 10, and more preferably 2 to 5 Individual.
[0033]
DNA encoding a protein substantially the same as TAL-PGI, 6PGADH, RK, or G6PDH as described above may be obtained by substituting, deleting, or inserting amino acid residues at specific sites by, for example, site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying the base sequence of tal-pgi, gnd, rk, or zwf so as to include addition or inversion. The modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment. Examples of the mutation treatment include a method in which DNA before the mutation treatment is treated in vitro with hydroxylamine or the like, and a microorganism having the DNA before the mutation treatment, such as a bacterium belonging to the genus Escherichia, irradiated with ultraviolet light or N-methyl-N′-nitro-N -A method of treating with a mutagen that is commonly used for mutagenesis such as nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid.
[0034]
By expressing the DNA having the above mutation in an appropriate cell and examining the activity of the expression product, a DNA encoding a protein substantially identical to TAL-PGI, 6PGADH, RK, or G6PDH can be obtained. . In addition, from a DNA encoding TAL-PGI, 6PGADH, RK, or G6PDH having a mutation or a cell retaining the same, for example, a base sequence or base sequence consisting of base numbers 2437 to 5310 in the base sequence described in SEQ ID NO: 16 No. 5314 to 6312, a base sequence of SEQ ID No. 20 among the base sequences of base numbers 196 to 1815, and a base sequence of SEQ ID No. 22 among base sequences of base numbers 983 to 2449 Or a probe having a part of these nucleotide sequences, which hybridizes under stringent conditions, and transaldolase activity or glucose-6-phosphate isomerase activity glutamine synthetase activity or both activities, 6-phospho Gluconate dehydrogenase activity, Isolation of a DNA encoding a protein having kinase activity or glucose-6-phosphate dehydrogenase activity also yields a DNA encoding a protein substantially identical to TAL-PGI, 6PGADH, RK, or G6PDH. Can be The term "stringent conditions" as used herein refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, DNAs having high homology, for example, DNAs having homology of 50% or more hybridize to each other, and DNAs having lower homology A salt corresponding to 60 ° C., 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 60 ° C., which is a condition under which they do not hybridize with each other, or a washing condition for ordinary Southern hybridization. Conditions for hybridizing at a concentration are listed.
[0035]
A part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, 20, or 22 can also be used as a probe. Such a probe can be prepared by PCR using oligonucleotides prepared based on these base sequences as primers and a DNA fragment containing these base sequences as a template. When a DNA fragment having a length of about 300 bp is used as a probe, the washing conditions for hybridization include 50 ° C., 2 × SSC, and 0.1% SDS.
[0036]
Some of the genes that hybridize under the above conditions include those in which a stop codon has been generated in the middle and those that have lost their activity due to mutations in the active center, but these are linked to a commercially available activity expression vector. The transaldolase activity or glucose-6-phosphate isomerase activity or both activities, 6-phosphogluconate dehydrogenase activity, lipokinase activity, or glucose-6-phosphate dehydrogenase activity are described, for example, in Example 8 below. According to the method described above, it is possible to easily sort by measuring each.
[0037]
Specifically, DNA encoding a protein substantially identical to TAL-PGI specifically has a homology of 50% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18. And DNA encoding a protein having TAL-PGI activity.
[0038]
In addition, specifically as DNA encoding a protein substantially identical to 6PGADH, specifically 50% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19. And DNA encoding a protein having 6PGADH activity.
[0039]
Specifically, the DNA encoding a protein substantially identical to RK has a homology of preferably 50% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21. And a DNA encoding a protein having RK activity.
[0040]
Specifically, the DNA encoding a protein substantially identical to G6PDH is specifically 50% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more homologous to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23. And DNA encoding a protein having G6PDH activity.
[0041]
<2> Gluconobacter bacteria with enhanced NADH-producing ability
The bacterium of the present invention is a bacterium belonging to the genus Gluconobacter with enhanced NADH-producing ability.
Specifically, the bacterium of the present invention is a bacterium of the genus Gluconobacter that has been modified so that the activity of one or more enzymes involved in NADH production in a cell is enhanced. Examples of the bacterium of the present invention include a bacterium belonging to the genus Gluconobacter modified so that the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of TAL, PGI, 6PGADH, RK, and G6PDH is enhanced. Of these enzymes, it is desirable that the activity of two enzymes, more preferably three enzymes, even more preferably four, and most preferably all five enzymes be enhanced. In addition, examples of the enzyme having TAL activity and PGI activity include a TAL-PGI complex, and TAL-PGI may have at least one activity, and may have both activities. Is also good. TAL, PGI, 6PGADH, RK, and G6PDH are all directly linked to NAD by a catalyzed reaction.⁺Or catalyzes a reaction that increases the activity or rate of the entire pentose phosphate cycle or increases the carbon source flowing into the pentose phosphate cycle, thereby contributing to the production of NADH.
[0042]
Specific examples of the bacterium of the genus Gluconobacter of the present invention include a bacterium that produces a target substance produced by a biosynthetic pathway including a reduction reaction requiring NADH. Such a target substance is not particularly limited as long as the biosynthesis includes a reduction reaction and NADH is required for the reaction, and examples thereof include saccharides such as xylitol, optically active alcohols, and sugar alcohols. "Producing a target substance" refers to accumulating the target substance in a medium or bacterial cells when the bacteria of the present invention are cultured, and preferably accumulating the target substance in the medium. The property of producing the target substance may be a property of a wild strain of a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, or may be a property imparted or enhanced by breeding.
[0043]
“Modified to enhance the enzyme activity” means that the activity of the gene product per cell is higher than that of a non-modified strain, for example, a wild-type Gluconobacter bacterium. For example, the case where the number of molecules of the gene product per cell increases or the case where the specific activity per molecule of the gene product increases. The wild type Gluconobacter bacterium to be compared is, for example, Gluconobacter oxydans AJ2847 strain (ATCC621).
[0044]
Enhancement of an enzyme activity is achieved by, for example, enhancing expression of a gene encoding the enzyme. Enhancement of the expression level of a gene can be achieved by increasing the copy number of the gene. For example, a gene fragment of interest is ligated to a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, preferably a multicopy type vector to produce a recombinant DNA, which is introduced into a host having the ability to produce the target substance. Transformation may be used. Alternatively, a transformant may be obtained by introducing the recombinant DNA into a bacterium belonging to the genus Gluconobacter having no target substance-producing ability, and then imparting the target substance-producing ability to the transformant.
[0045]
The gene to be introduced is connected to a vector DNA capable of autonomous replication in Escherichia coli to prepare a recombinant DNA, which is then introduced into Escherichia coli to facilitate subsequent operations. Examples of vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli cells include pUC19, pUC18, pHSG299, ΔpHSG399, ΔpHSG398, ΔRSF1010, ΔpBR322, ΔpACYC184, and ΔpMW219.
[0046]
A vector that functions in Gluconobacter bacteria is, for example, a plasmid that can autonomously replicate in Gluconobacter bacteria. Specific examples include endogenous plasmid pAG5 derived from Gluconobacter oxydans IFO3171 or a derivative thereof (US Pat. No. 6,127,174). When a DNA fragment having the ability to autonomously replicate a plasmid in a Gluconobacter bacterium is extracted from these vectors and inserted into the Escherichia coli vector, both the Escherichia coli and the Gluconobacter bacterium can be obtained. Can be used as a so-called shuttle vector capable of autonomous replication. Examples of such shuttle vectors include pSG8, pSG6, and pSA19 (Biosci. Biotech. Biochem., 58 (10), 1899-901, 1994) described in Examples.
[0047]
The Escherichia coli JM109 strain carrying pSG8 is assigned a private number AJ13485, and on July 21, 1998, an incorporated administrative agency, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, the Patent Organism Depositary Center (託 305-8566, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) Deposit No. 1-1, No. 1, Central No. 6 postal code), assigned a deposit number FERM @ P-16903, transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on June 14, 1999, and received a deposit number FERM @ BP-6760. Has been granted.
[0048]
The vector is obtained from the deposited microorganism as follows. The cells collected in the logarithmic growth phase were lysed using lysozyme and SDS, centrifuged at 30,000 × g, and polyethylene glycol was added to the supernatant obtained from the lysate. Cesium chloride-ethidium bromide equilibrium density gradient centrifugation Separation and purification by separation.
[0049]
In order to prepare a recombinant DNA by ligating the target gene with a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, the vector is cut with a restriction enzyme that matches the end of the target gene. The ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase.
[0050]
In order to introduce the recombinant DNA into a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, a usual transformation method such as an electric pulse method can be used (US Pat. No. 6,127,174).
Increasing the copy number of the target gene can also be achieved by causing the gene to exist in multiple copies on the chromosomal DNA of a Gluconobacter bacterium. In order to introduce the target gene in multiple copies on the chromosomal DNA of the bacterium belonging to the genus Gluconobacter, homologous recombination is performed using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target. As a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA, repetitive DNA and inverted repeats present at the end of a transposable element can be used. Alternatively, as disclosed in JP-A-2-109985, it is also possible to mount a target gene on a transposon, transfer it, and introduce multiple copies into chromosomal DNA.
[0051]
Enhancement of gene expression can also be achieved by replacing an expression control sequence such as a promoter of a target gene on chromosomal DNA or a plasmid with a strong one, in addition to the above-described gene amplification. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter and the like are known as strong promoters. In addition, as disclosed in International Publication WO00 / 18935, it is also possible to introduce a base substitution of several bases into the promoter region of the target gene to modify it into a stronger one. These promoter substitutions or modifications enhance the expression of the target gene. These modifications of the expression control sequence may be combined with increasing the copy number of the gene.
[0052]
The replacement of the expression control sequence can be performed, for example, in the same manner as the gene replacement using a temperature-sensitive plasmid.
In order to efficiently produce xylitol using the Gluconobacter bacterium of the present invention, a strain modified so as to increase the activity of an enzyme involved in xylitol biosynthesis at the same time as enhancing NADH-producing ability is used. Is preferred. Examples of such an enzyme include xylitol dehydrogenase (XDH). Xylitol dehydrogenase has D-xylulose reductase activity that catalyzes a reaction for producing xylitol from D-xylitol. In the present invention, this activity is called XDH activity.
[0053]
The enhancement of XDH activity is achieved by, for example, enhancing the expression of a gene encoding XDH. The expression level of the gene can be increased by increasing the copy number of the gene encoding XDH. For example, a gene fragment encoding XDH is ligated to a vector that functions in a bacterium belonging to the genus Gluconobacter, preferably a multicopy vector, to produce a recombinant DNA, which is introduced into a host having xylitol-producing ability. Transformation may be used.
[0054]
Examples of XDH-encoding genes include genes derived from Pichia stipitis (FEBS @ Lett., $ 324, $ 9 (1993)) and Morganella Morgani (DDBJ / GenBank / EMBL @accession No. L34345), and Gluconobacter oxydans XDH1 gene and XDH2 gene (US Pat. No. 6,242,228). From the viewpoint of easy expression, it is preferable to use a gene derived from a bacterium belonging to the genus Gluconobacter.
[0055]
The nucleotide sequence of the gene encoding the XDH of the genus Gluconobacter (gdh gene) has already been elucidated (US Pat. No. 6,242,228), and a primer prepared based on the nucleotide sequence, for example, Using the primers shown in Table 11, the XDH gene can be obtained by a PCR method using chromosomal DNA of a bacterium belonging to the genus Gluconobacter as a template. Genes encoding XDH of other microorganisms such as Gluconobacter bacteria can be obtained in the same manner.
[0056]
The introduction of the XDH gene into a bacterium belonging to the genus Gluconobacter can be carried out in the same manner as the above-mentioned gene involved in NADH production.
[0057]
<3> Manufacturing method of target substance
The method of the present invention provides a method for producing a target substance, wherein a target substance is produced by allowing a bacterium belonging to the genus Gluconobacter to act on a raw material for biosynthesis of the target substance. In addition, the method is characterized in that the bacterium has been modified so that the activity of one or more enzymes involved in NADH production is enhanced.
[0058]
The bacterium of the genus Gluconobacter of the present invention has enhanced NADH-producing ability and can efficiently produce a target substance that requires NADH for a reduction reaction in biosynthesis.
[0059]
Depending on the target substance, the raw material for biosynthesis of the target substance may be a carbon source such as glucose required for culturing the Gluconobacter bacterium of the present invention, or may be an intermediate for biosynthesis of the target substance. Is also good. For example, when the target substance is xylitol, the raw materials include D-arabitol and D-xylulose.
[0060]
In order to cause the Gluconobacter bacterium of the present invention to act on a biosynthetic raw material, the raw material may be added to a culture medium for culturing the bacterium, or the cells of the bacterium and the raw material may be mixed in a liquid. Good. Further, the raw material solution may be passed through a column packed with a carrier on which the bacterium of the present invention or a processed product thereof is immobilized.
[0061]
Hereinafter, a method for producing xylitol as a target substance will be exemplified.
The medium for culturing the bacterium of the present invention is not particularly limited, and may be a normal medium containing a normal carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source, an inorganic ion, and, if necessary, an organic nutrient used by the bacterium. As the carbon source, carbohydrates such as glucose, alcohols such as glycerol, organic acids, and the like are used. As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt, nitrate and the like are used. As the phosphorus source, a potassium salt, a sodium salt or the like of phosphoric acid is used. As the inorganic ion, a magnesium ion, a potassium ion, an iron ion, a manganese ion, a sulfate ion and others are appropriately used as needed. As the organic nutrients, vitamins, amino acids and the like, and liver extracts, yeast extracts, malt extracts, peptones, meat extracts, corn steep liquor, casein hydrolyzate, and the like containing them are appropriately used.
[0062]
Further, as an inducer of D-arabitol dehydrogenase or xylitol dehydrogenase possessed by the bacterium of the present invention, saccharides or sugar alcohols such as D-xylose, D-xylulose, D-arabitol, D-sorbitol, D-mannitol, xylitol, etc. In some cases, the activity of an enzyme involved in the reaction for converting D-arabitol to xylitol may be improved.
[0063]
There is no particular limitation on the culturing conditions. For example, culturing may be performed for about 12 to 72 hours under aerobic conditions at pH 5 to 8 and temperature of 25 to 40 ° C. while appropriately controlling the pH and temperature. .
[0064]
Xylitol can be produced in the reaction solution by contacting the thus cultured Gluconobacter bacterium with D-arabitol. In the method of the present invention, the “Gluconobacter bacterium” may be a cell itself or a processed product of the cell as long as it has the ability to convert D-arabitol to xylitol. Specifically, a culture containing cells, cells separated and recovered from the culture, cells treated with the cells, cells treated with acetone or freeze-dried, cell disrupted liquid, D-arabitol A fraction of a cell lysate or a purified enzyme fraction containing dehydrogenase and xylitol dehydrogenase, or an immobilized product of these processed products may be used.
[0065]
There is no particular limitation on the D-arabitol concentration, and usually 1 to 50% (w / v), preferably 5 to 40% (w / v) gives a preferable result. In addition, during the reaction, the yield may sometimes be improved by adding D-arabitol as a substrate in portions. There are no particular restrictions on the reaction conditions, and the reaction temperature is usually 20 to 60 ° C, preferably 30 to 40 ° C, and the reaction pH is 3.0 to 10.0, preferably pH 4.0 to 7, under aerobic conditions. 0.0 gives good results. Incidentally, when the pH during the reaction is prevented from lowering by, for example, adding calcium carbonate to the reaction solution so as to be 2% (w / v), the xylitol yield may be increased in some cases. For the reaction, any of a static reaction and a stirring reaction can be employed. The reaction time varies depending on conditions such as the activity of the cells used and the concentration of D-arabitol, but is preferably 1 to 100 hours.
[0066]
In the present invention, when using cells, it is preferable to add a carbon source to the reaction system from the viewpoint of yield. When a treated bacterial cell is used, NADH or NAD is added to the reaction system.⁺May be added.
[0067]
The carbon source is not particularly limited as long as it is a carbon source accompanied by the production of NADH when metabolized, and examples thereof include sugars, sugar derivatives, alcohols, aldehydes, and organic acids. Sugars include glucose, fructose, sucrose, and lactose. Derivatives of sugar include sugar alcohols such as sorbitol, mannitol and glycerol, and aldonic acids such as gluconic acid. Further, as alcohols, methanol, ethanol, propanol, isopropyl alcohol, 1,4-butanediol, 2,3-butanediol, etc., and as aldehydes, formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, isobutyraldehyde, glyceraldehyde, etc. Examples of the organic acids include formic acid, citric acid, fumaric acid, malic acid and the like. These carbon sources may be used alone, or two or more arbitrary carbon sources may be used as a mixture. The addition amount of these carbon sources varies depending on conditions such as the activity of the bacterial cells used and the D-arabitol concentration, but is 0.2 to 40% (w / v) in total, preferably 0.5 to 20% (w). / V) gives favorable results. The timing of adding these carbon sources is not particularly limited, and they may be added from the beginning of the reaction, during the reaction, or in portions.
[0068]
The progress of the D-arabitol → xylitol conversion reaction using the bacterium of the present invention requires Co²⁺The presence of ions is effective. In the production of xylitol according to the method of the present invention, the conversion reaction is carried out at 0.1 mM or more of Co.²⁺It is preferable to carry out in the presence of ions.
[0069]
Xylitol produced in the culture solution as described above is collected and separated from the reaction solution according to a conventional method. Specifically, a method of removing solids by centrifugation, filtration, or the like, followed by decolorization and desalting with activated carbon and an ion exchange resin, and crystallization from the solution can be adopted.
[0070]
For the target substance other than xylitol, the sampling and separation method may be appropriately selected according to the target substance.
[0071]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0072]
[Example 1] Construction of a reaction system for converting arabitol to xylitol in an in vitro reconstitution system
G. FIG. The following assay system was constructed in order to isolate and purify the xylitol yield improving factor present in the soluble fraction of Oxydans.
[0073]
G. FIG. oxydans strain AJ2847 (ATCC 621) was refresh-cultured on a YPG plate (3 g / dl glucose, 0.5 g / dl yeast extract, 0.3 g / dl peptone, 2 g / dl agar powder) at 30 ° C. for 24 hours, followed by SR. Sakaguchi flask containing 50 ml of medium (2 g / dl sodium gluconate, 0.5 g / dl glucose, 0.3 g / dl glycerol, 0.3 g / dl yeast extract, 0.2 g / dl peptone, pH 6.5) Was inoculated with a platinum loop and cultured at 30 ° C. overnight with shaking. The resulting culture was inoculated 5% into four Sakaguchi flasks containing 50 ml of SR medium and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours.
[0074]
The cells were collected from the culture by centrifugation, and 2 g of wet cells washed with 50 mM potassium phosphate buffer solution (pH 6.5) (hereinafter abbreviated as KPB) were suspended in 10 ml of KPB (pH 6.5). Ultrasonic crushing was performed at 4 ° C. for 30 minutes. Centrifugation at 8,000 rpm for 5 minutes was performed twice to remove the supernatant, and the supernatant was ultracentrifuged at 50,000 rpm for 30 minutes. The obtained supernatant was obtained as a soluble fraction. On the other hand, the precipitate was washed with KPB and dissolved in 2 ml of KPB to prepare a membrane fraction.
[0075]
Using the membrane fraction and the soluble fraction prepared as described above, an arabitol → xylitol conversion reaction was carried out in a reaction solution having the following composition. The reaction was performed at 30 ° C. for 24 hours in a 1.5 ml Eppendorf tube.
[0076]
(Reaction solution composition)
0.5g/dl@D-arabitol
20 mM {NAD} (pH 5.0)
50 mM {KPB} (pH 6.0)
1 mg protein / ml membrane fraction
1mg protein / ml soluble fraction
[0077]
200 μl of the above reaction solution was sampled, 10 μl of 100% ΔTCA (trichloroacetic acid) was added, and the mixture was centrifuged at 15000 rpm for 10 minutes to precipitate the protein. 10 μl of 6N ΔKOH was added to the resulting supernatant. After the addition, the amount of xylitol produced was quantified by HPLC under the following conditions. As a result, 0.14 g / dl xylitol was produced from 0.5 g / dl D-arabitol.
[0078]
[HPLC analysis conditions]
Column: Shodex @ SC1211 [Showa Denko KK]
Moving bed: {50ppm} Ca-EDTA aqueous solution
Flow speed: 1 ml / min
Temperature: 80 ° C
Detection: RI detector
[0079]
Example 2 Effect of metal ion addition on arabitol → xylitol conversion reaction
The reaction solution consisting of 50 mM KPB (pH 6.0), 1 g / dl arabitol, 10 mM NAD (pH 5), 1 mg protein / ml membrane fraction, and 1 mg protein / ml soluble fraction has a final concentration of the following metal ions of 1 mM. The reaction was carried out at 30 ° C. for 6 hours, and the effect of addition of metal ions on the arabitol → xylitol conversion reaction was examined.
[0080]
(Additive metal ion)
CaCl₂, MgCl₂, CoSO₄, NiCl₂, MnSO₄, ZnSO₄, EDTA
[0081]
Table 1 shows the results of quantifying xylitol, D-xylulose and D-arabitol in the reaction solution by HPLC. CoSO₄In the added group, an increase in the amount of xylitol produced was observed, and the production of xylitol from D-arabitol was²⁺Was found to be effective.
[0082]
[Table 1]

[0083]
Embodiment 3 Purification of the reducing power supply factor of Oxydans
G. FIG. Purification of reducing power-supplying factor was performed as follows from the soluble fraction of oxydans AJ2847 strain (ATCC621). The reducing power supply ability was detected by an increase in xylitol produced in the in vitro D-arabitol → xylitol conversion reaction system. The reaction conditions are shown.
[0084]
(Reaction solution composition)
50 mM {KPB} (pH 6.0)
1g / dl @ arabitol
10 mM NAD (pH 5)
1 mg protein / ml membrane fraction
1mg protein / ml soluble fraction
1 mM @ CoCl₂
[0085]
(Reaction conditions)
After reacting 30 μl of the enzyme fraction / 200 μl of the reaction solution at 30 ° C. for 16 hours, TCA treatment / neutralization treatment was performed and quantification was performed by HPLC.
[0086]
(1) Preparation of soluble fraction:
About 10 g (1 L culture) of the washed cells was suspended in 45 ml of 50 mM KPB (pH 6.5), and sonicated at 4 ° C for 20 minutes. The crushed liquid was centrifuged (× 8000 rpm, 10 minutes × 2 times) to remove bacterial cell residues, and further ultracentrifuged (× 50000 rpm, 30 minutes), and the obtained supernatant was used as a soluble fraction. The precipitate was appropriately suspended in KPB and used as an enzyme source in an in vitro reconstitution system as a membrane fraction.
[0087]
(2) Anion exchange chromatography: Q-Sepharose @ FF
The soluble fraction (18 ml) was applied to an anion exchange chromatography column Q-Sepharose (FF) 26/10 (Pharmacia, CV = 20 ml) equilibrated with buffer A (20 mM Tris-HCl (pH 7.6)). Was adsorbed. After the protein not adsorbed on the carrier (non-adsorbed protein) was washed out using buffer A, the adsorbed protein was eluted by linearly changing the KCl concentration from 0 M to 0.7 M (total eluate volume). 100 ml). When each of the eluted fractions was subjected to an in vitro reconstitution system to detect the effect of increasing the amount of xylitol production, the xylitol production activity (hereinafter referred to as “NRF activity”) was detected at two positions: 350 to 450 mM and 550 mM. Is sometimes detected). Hereinafter, the respective peaks may be referred to as “NRF1” and “NRF2” in this order. These may be collectively called NRF.
[0088]
(3) Gel filtration chromatography (Sephadex 200 HP)
Fractions containing NRF1 and NRF2 were collected, dialyzed against buffer A, and filtered through a 0.45 μm filter. The obtained filtrates (30 ml and 6 ml, respectively) were concentrated using an ultrafiltration membrane centriprep # 10 (manufactured by Amicon). The obtained concentrated solution was applied to a gel filtration column (Sephadex 200 HP (manufactured by Pharmacia)) equilibrated with buffer B (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.1 M KCl), and 1 ml / min. At a flow rate of NRF1 was divided into two times, and NRF2 was performed once, and the separation operation was performed by 0.8 ml each. By this operation, NRF1 and NRF2 were eluted in 69-72 ml and 70-74 ml fractions, respectively.
[0089]
(4) Anion exchange chromatography (Mono Q HR 5/5)
The obtained fractions (NRF1: 12 ml, NRF2: 4 ml) were filtered with a 0.45 μm filter. The filtrate obtained here was applied to an anion exchange chromatography column (Mono-Q HR 5/5 (Pharmacia)) equilibrated with buffer A. By this operation, NRF was adsorbed on the carrier.
[0090]
After the non-adsorbed protein was washed away with the buffer A, the KCl concentration was linearly changed from 0 mM to 700 mM to elute the protein (total volume: 15 ml). The NRF activity was measured for each eluted fraction, and NRF activity was observed at elution positions where the KCl concentration was 300 mM and 500 mM, respectively.
[0091]
(5) Hydrophobic chromatography (Phenyl Superose HP HR 5/5)
Each solution in which the activity was detected was dialyzed against buffer C (50 mM @ Tris-HCl (pH 7.6), 1 M ammonium sulfate, pH @ 7.0) and filtered through a 0.45 μm filter. The obtained filtrate was applied to a hydrophobic chromatography column (Phenyl \ Superose \ HP (Pharmacia)) equilibrated with buffer C. By this operation, NRF was adsorbed on the carrier.
[0092]
After the non-adsorbed protein not adsorbed on the carrier was washed away using buffer C, NRF was eluted by linearly changing the concentration of ammonium sulfate from 1M to 0M. The NRF activity was measured for each of the obtained eluted fractions, and the NRF activity was observed at elution positions where the ammonium sulfate concentration was about 200 to 400 mM and 100 to 200 mM, respectively.
[0093]
When the fractions purified by the above column chromatography were subjected to SDS-PAGE, the NRF1 fraction was detected as a substantially single band at a position corresponding to about 100 kDa. A band of about 60 kDa was detected in the NRF2 fraction.
[0094]
Example 4 Determination of N-terminal amino acid sequence of NRF1 and NRF2
After subjecting purified NRF1 and NRF2 to about 10 μg of protein for SDS-PAGE, NRF1 and NRF2 in the gel were transferred to a PVDF filter using a Millipore mini-blot, and a protein sequencer (ABI, model 476A), the amino acid sequence was analyzed from the N-terminus.
[0095]
The analysis was also performed on the internal amino acid sequence of NRF1. The sample in the SDS-PAGE gel was treated with lysyl endopeptidase (pH 8.5, 35 ° C., 20 hours), and subjected to reverse phase HPLC to separate fragment peptides. The amino acid sequence of one fraction among the fractions collected was determined. Table 2 shows the results. In the table, parentheses indicate amino acid residues that were unclear in amino acid sequencing.
[0096]
[Table 2]

[0097]
Example 5 Cloning of nrf1 and nrf2 genes
G. FIG. The oxydans ATCC 621 strain was cultured overnight at 30 ° C. using a YPG medium. Main culture was carried out using 5 ml of this culture as a seed bacterium and 100 ml of {YPG} medium. After culturing until the late stage of logarithmic growth, 100 ml of the culture was subjected to a centrifugation operation (12000 × G, 4 ° C., 15 minutes) to collect the cells. Using these cells, chromosomal DNA was prepared according to a standard method.
[0098]
Based on the determined N-terminal amino acid sequences of NRF1 and NRF2 and the internal amino acid sequence of NRF1, the following mixed primers were synthesized (Table 3).
[0099]
[Table 3]

[0100]
Using the prepared mixed primers, nrf1 and nrf2 gene fragments were obtained by the cassette PCR method. The cassette PCR method used TaKaRa \ LA \ PCR \ Invitro \ Cloning \ Kit (Takara Shuzo) according to the method described in the manual attached to this kit.
[0101]
The nucleotide sequence was determined by a PCR reaction using Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by ABI). The electrophoresis was performed using DNA Sequencer model 373 or model 311 (manufactured by ABI).
[0102]
Using a part of the DNA fragment amplified by the cassette PCR, a full-length gene was obtained by Southern analysis and colony hybridization. The DNA probe was prepared by using DIG High Prime (manufactured by Roche Diagnostics) and incubating overnight at 37 ° C. according to the instruction to label the probe. Table 4 shows the sequences of the PCR primers used for the amplification of the DNA fragment used as the probe.
[0103]
[Table 4]

[0104]
Southern analysis was performed by completely digesting 染色体 1 μg of chromosomal DNA with various restriction enzymes, electrophoresing on a 0.8% agarose gel, blotting on a nylon membrane, and following the manual attached to the kit. Hybridization was performed using DIG {EasyHyb (manufactured by Roche Diagnostics), and prehybridization was performed at 50 ° C. for 1 hour, followed by addition of a probe and hybridization with O / N. Band detection was performed using DIG \ Nucleotide \ Detection \ Kit.
[0105]
Colony hybridization was performed as follows. After treating the chromosomal DNA with an appropriate restriction enzyme, a fragment having a size corresponding to the band length detected by Southern analysis is recovered and ligated to pUC18 or pUC118. E. coli JM109 was transformed to produce a library. The colonies were transferred to a nylon membrane filter (Hybond-N, manufactured by Amersham), and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using DIG Easy Easy Hyb. The filter was immersed in the buffer and prehybridized at 42 ° C. for 1 hour. Thereafter, the prepared labeled probe was added, and hybridization was performed at 42 ° C. for 16 hours. After washing with SSC, detection of colonies hybridizing with the probe was performed using DIG Nucleotide Detection Kit (manufactured by Roche Diagnostics).
[0106]
(1) Cloning of nrf1 (tal-pgi) and gnd genes
Cloning of nrf1 was performed as follows. First, a coding region was obtained by a cassette PCR method based on information on the determined N-terminal amino acid sequence. Next, a DNA fragment of about 8.5 kbp in total was obtained by Southern analysis and colony hybridization using the obtained gene fragment as a probe.
[0107]
The acquisition of the nrf1 gene fragment by the cassette PCR method was performed using TaKaRa \ LA \ PCR \ Invitro \ Cloning \ Kit (Takara Shuzo) according to the method described in the manual attached to this kit. First, 染色体 5 μg of chromosomal DNA was digested with HindIII. Next, HindIII @ Cassette was ligated to the restriction enzyme fragment, and the first PCR was performed using Primer @ C1 and Primer @ NRF1-N1. The PCR reaction was performed using PCR @ Thermal @ PERSONEL (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) for 30 cycles under the following conditions. 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 2 minutes, 72 ° C for 1 minute.
[0108]
Next, this reaction solution was diluted 100-fold, and Primer C2 and Primer NRF1-N2 were newly added to perform a second PCR. The conditions were the same as the first time.
When the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, amplification of a DNA fragment of about 2.2 kb was confirmed. When this DNA fragment was cloned into pUC18 and its nucleotide sequence was determined, the amino acid sequence deduced from the obtained DNA fragment was consistent with the N-terminal amino acid sequence of NRF1, indicating that the target nrf1 gene was obtained. confirmed.
[0109]
The full length of the nrf1 gene was obtained by the following method. First, the inside of the obtained nrf1 gene was amplified using the primers shown in Table 3, and Southern analysis was performed using these as probes. An XhoI / EcoRI fragment (upstream region) of about 3.6 kbp, which strongly hybridized with each probe, was obtained. And a XhoI / BamHI fragment (downstream) of about 4.8 kbp. Therefore, these fragments were obtained by colony hybridization according to a standard method, and the nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 16).
[0110]
As a result of cloning the nrf1 gene, the coding region of this gene was 2871 bp and coded a 103 kDa protein consisting of 957 amino acid residues. When the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) was subjected to homology search, homology was found at residues 17 to 381 on the N-terminal side with transaldolase (TAL), and 46% of TAL derived from Nostoc punctiforme Had homology. Further, residues 434 to 769 on the C-terminal side were homologous to glucose-6-phosphate isomerase (PGI), and had 27% homology to PGI derived from Thermotoga maritima.
[0111]
In addition, as a result of cloning the region around nrf1, it was presumed that one orf was present upstream and one downstream of nrf1, and these three genes formed an operon. Upstream orf1 encodes a 73.5 kDa protein consisting of 685 amino acid residues (SEQ ID NO: 18) and has homology to transketolase (TKT). Also, downstream orf2 encodes a 35.9 kDa protein consisting of 332 amino acid residues (SEQ ID NO: 19), and is abbreviated as 6-phosphogluconate dehydrogenase ("6PGADH" or "GND". Gene is abbreviated as “gnd”). Specifically, it showed 43% homology with NAD-NADP-type GND derived from Methylobacillus flagellatus. From this, it was presumed that the nrf1 operon encodes a gene for the pentose phosphate cycle. Generally, it is widely known that GND is of the NAPD type, but since orf2 has higher homology with NAD-NADP type GND, the gene product is NAD-NADP type GND. In some cases, it was considered that the gene may have an effect as a reducing power (NADH) supply gene.
[0112]
(2) Cloning of nrf2 (RK) gene
Cloning of nrf2 was performed as follows. First, an upstream region of the gene was obtained by cassette PCR, and then a DNA fragment of about 4.2 kbp in total was obtained by Southern analysis and colony hybridization using the obtained gene fragment as a probe.
[0113]
Similar to the cloning of the nrf1 gene fragment, the upstream region of the nrf2 gene was amplified by Primer NRF2AS1 and NRF2AS3 by the cassette PCR method. As a result, amplification of a DNA fragment of about 1.5 kb was confirmed. When this DNA fragment was cloned into pUC18 and its nucleotide sequence was determined, the amino acid sequence deduced from the obtained DNA fragment was identical to the N-terminal amino acid sequence of NRF2, and the upstream region of the target nrf2 gene was obtained. It was confirmed that.
[0114]
The full length of the nrf2 gene was obtained by the following method. First, the inside of the obtained nrf2 gene was amplified using the primers shown in Table 4, and Southern analysis was performed using these as probes. As a result, an EcoRI fragment of about 4.2 kbp that strongly hybridized with the probe was detected. Therefore, these fragments were obtained by colony hybridization according to a standard method, and the nucleotide sequence was determined (SEQ ID NO: 20).
[0115]
The coding region of the nrf2 gene was 1644 bp, and encoded a 59-kDa protein (SEQ ID NO: 21) consisting of 548 amino acid residues. When a homology search of the amino acid sequence was performed, high homology with sugar kinases such as RK, ribitol kinase and xylulokinase was found. Specifically, E.I. It showed 44% homology with ribitol kinase derived from E. coli.
[0116]
Embodiment 6 FIG. Detection of Oxydans NAD-NADP-type G6PDH and NAD-NADP-type 6PGADH activities
From the above results, G. It has been shown that reducing the pentose phosphate cycle of Oxydans provides a reducing power (NADH). Therefore, G.G. The enzyme activity of the pentose phosphate cycle of Oxydans was measured. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGADH) have been newly found as enzymes that supply NADH in Oxydans.
[0117]
[Glucose-6-phosphate} (G6P) dehydrogenase activity measurement reaction solution]
100 mM @ Tris-H₂SO₄(PH 8.2)
0.5mM NAD (P)
15 mM @ glucose-6-phosphate
[0118]
[Reaction solution for measuring 6-phosphogluconate (6PGA) dehydrogenase activity]
100 mM @ Tris-H₂SO₄(PH 8.2), {0.5 mM} NAD (P), {15 mM} 6-phosphogluconic acid
[0119]
In both cases, G. Using the soluble fraction of @oxydans as an enzyme source, the increase in absorbance at 340 nm was measured. In addition, the pH prefeel of each enzyme activity was measured. For the preparation of the pH prefil, each buffer of sodium acetate (pH 、 5.0 to 6.5), Tris-HCl (pH 7.0 to 8.5), and glycine-NaOH (pH 9.0 to 10.5) Was used. The results are shown in FIGS.
[0120]
Based on the above examination, G. In Oxydans, it was found that two enzymes, G6PDH and 6PGADH, were NAD-NADP-type enzymes capable of using both NAD and NADP as coenzymes.
Broadly and generally, these enzymes are known as NADP-specific enzymes, but it has been reported that G6PDH exhibits NAD-NADP-type activity in certain species (eg, Leuconostoc @ mesenteroides). (J. {Bacteriol., {169, {334} (1987)). However, in acetic acid bacteria, G6PDH is classified as NADP type (Microbiol. Rev. 55, 35 (1991); Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 1377 (1996)), and acetic acid G6PDH also has an activity on NAD. This is the first time I have found it.
[0121]
In Acetobacter xylinum, NAD-type enzymes have been reported in addition to NADP-type enzymes {(J. Biological. Chemistry, 248, 1603 (1973); Arch. Biochem. Biophys., 310, 94). ). However, this NAD-type enzyme is a specific enzyme that uses not only G6P but also glucose as a substrate and has an optimum pH of 5.6. However, this time G. The optimal pH of NAD-type activity found in @oxydans was about 9.5, and when NAD was used as a coenzyme, no activity was detected when glucose was used as a substrate. Therefore, G. Oxydans does not have a specific enzyme such as Acetobacter xylinum, and it is considered that G6PDH also exhibits NAD-NADP-type activity. On the other hand, 6PGADH has never been reported in acetic acid bacteria, and is also a novel enzyme.
[0122]
Example 7 Cloning of G6PDH gene (zwf)
E. FIG. A chromosomal DNA of the E. coli W3110 strain was prepared according to a standard method, and this was used as a template with the primers shown in Table 5 to obtain E. coli strain W3110. A portion of the E. coli G6PDH gene (zwf) was amplified. The obtained fragment was used as a probe, When Southern hybridization was performed on the chromosomal DNA of Oxydans, a band was detected. Among them, a library consisting of about 5000 clones was constructed for the about 4 kb BamHI digested fragment using pUC18 as a vector. From this library, a target clone was selected by colony hybridization. The nucleotide sequence of the inserted fragment was determined (SEQ ID NO: 22), and an open reading frame presumed to be the zwf gene was found. This open reading frame encodes a protein consisting of 488 amino acid residues (SEQ ID NO: 23), and the protein is E. coli. E.coli showed 43.6% homology with G6PDH.
[0123]
[Table 5]

[0124]
Example 8 E. coli of tal-pgi, rk, NAD-NADP type G6PDH (zwf) and NAD-NADP type 6PGADH (gnd) Expression and enzyme activity measurement in E. coli
As a result of cloning the nrf1 and nrf2 genes, homology search suggested that NRF1 was a bifunctional enzyme of transaldolase and glucose phosphate isomerase, and that NRF2 was a librokinase. It was found that a homologous gene of 6PGADH was present. Therefore, in order to identify the functions of these gene products, E. coli Expression in E. coli and measurement of enzyme activity were performed.
[0125]
First, nrf1 (tal-pgi) and nrf2 (rk) were converted to E. coli. In order to express in E. coli, plasmids pUCTAL-His and pUCSK-His were constructed in which 6 × His-Tag was ligated to the C-terminal of each gene and inserted downstream of the lac promoter of pUC18. Prior to plasmid construction, G. The chromosomal DNA of the {oxydans} ATCC621 strain was prepared in accordance with a standard method, and each gene fragment was amplified by PCR using this as a template and the primers shown in Table 6.
[0126]
The PCR primers used in constructing the tal-pgi and rk expression plasmids were such that a restriction enzyme site was introduced upstream of the SD sequence on the 5 ′ side, and 6 × His-Tag for tal-pgi and rk on the 3 ′ side. After ligation, each was designed to introduce a stop codon and a restriction enzyme site. G. was performed using primers Tal5'-Sal and Tal3'-His-Sph. A fragment amplified from the chromosomal DNA of oxydans ATCC621 was digested with SalI / SphI to construct a plasmid pUCTAL-His inserted into the SalI / SphI site of pUC18. In addition, using primers RK5'-Eco and RK3'-His-Bam, G. A fragment amplified from oxydansＤＮＡATCC621 chromosomal DNA was digested with EcoRI / BamHI to construct a plasmid pUCSK-His inserted into the EcoI / BamHI site of pUC18.
[0127]
The gnd homologous gene and zwf gene found downstream of nrf1 were also amplified using primers having the sequences shown in Table 6, and plasmids pUCGND and pUCZWF ligated to EcoRI / BamHI downstream of the lac promoter of pUC18, respectively. did.
[0128]
[Table 6]

[0129]
Each of the constructed expression plasmids was E. coli. E. coli was introduced into JM109. The transformant was cultured with shaking at 37 ° C. overnight in an LB medium containing 50 μg / ml ampicillin. The preculture was seeded at 1% in 50 ml of LB medium, and main culture was performed at 37 ° C. About 2 hours after the start of the culture, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was further performed for 3 hours. After completion of the culture, the cells were collected, washed, suspended in 5 ml of 50 mM {KPB} (pH 6.5), and the cells were disrupted using a multi-beads shocker (manufactured by Yasui Kikai). The supernatant obtained by centrifuging the crushed liquid at 15,000 rpm for 10 minutes was used as a crude enzyme liquid.
[0130]
The method for measuring the enzyme activity of transaldolase (TAL), glucose phosphate isomerase (PGI), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and 6-phosphogluconate dehydrogenase (6PGDH) sugar kinase is performed by the following method. Was. The activity producing 1 μmol of NADH per minute was defined as 1 U. The molecular absorption coefficient of NADH and NADPH at 340 nm is ε = 6.3 × 10³It was calculated as
[0131]
[TAL activity measurement]
50 mM {KPB} (pH 7.6)
5 mM @ fructose-6-phosphate
5 mM @ erythrose-4-phosphate
0.5mM NADH
2U / ml @ glycerol-3-phosphate dehydrogenase / triose phosphate isomerase
Measures 340 mM absorbance decrease at 30 ° C
[0132]
[PGI activity measurement]
50 mM {KPB} (pH 7.0)
5 mM @ fructose-6-phosphate
1 mM NADP
5 U / ml @ glucose-6-phosphate dehydrogenase
Measures 340 mM absorbance increase at 30 ° C
[0133]
[6 PGADH activity measurement]
50 mM {Tris-HCl} (pH 8.0)
10 mM @ 6-phosphogluconic acid
1 mM @ MgCl₂
1 mM NAD / NADP
Measures 340 mM absorbance increase at 30 ° C
[0134]
[G6PDH activity measurement method]
50 mM {glycine-NaOH} (pH 9.5)
10 mM glucose-6-phosphate
1 mM NAD / NADP
Measures 340 mM absorbance increase at 30 ° C
[0135]
(Sugar kinase activity measurement)
50 mM {Tris-HCl} (pH 7.0)
5mM MgCl₂
1 mM @ ATP
8.3 U / ml @ lactate dehydrogenase
8.3 U / ml pyruvate kinase
0.3 mM NADH
1mM phosphoenolpyruvate
5mM substrate sugar
Measures 340 mM absorbance decrease at 30 ° C
[0136]
In the manner described above, E.I. {E. coli} JM109 / pUCTAL-His and pUCSK-His were cultured 1 L each. The recombinant enzyme was purified from 3 g of wet cells obtained by collecting and washing cells. Purification was performed according to the protocol using a HiTrap chelate column (manufactured by Amersham Pharmacia). The eluted fraction containing 500 mM imidazole was dialyzed against 20 mM {Tris-HCl} (pH 7.6) to obtain an enzyme solution. As a result, bands corresponding to 100 kDa and 60 kDa were confirmed on SDS-PAGE, respectively. Further, by purifying the soluble fraction with a Ni column (HiTrap {Chelate} column, manufactured by Amersham Pharmacia), each protein was purified as a substantially single band on SDS-PAGE.
[0137]
Using the prepared recombinant enzyme, the activity of TAL, PGI and sugar kinase in which homology of the gene was recognized was measured. As a result (Table 7), both the TAL activity and the PGI activity of NRF1 were detected, which revealed that the present enzyme was a bifunctional TAL-PGI enzyme.
[0138]
[Table 7]

[0139]
For NRF2 (sugar kinase), the reactivity of the following substrates was examined in order to identify the substrate specificity. D-ribulose, D-xylulose, D-xylose, D-arabitol, xylitol, ribitol, D-glucose, D-fructose, D-ribose, D-glycerol, D-sorbitol. As a result (Table 8), NRF2 acted only on D-ribulose, which revealed that it was a ribobrokinase.
[0140]
[Table 8]

[0141]
In addition, the gnd homologous gene found downstream of nrf1 was also used in E. coli. The enzyme activity was measured by expressing in E. coli, and the coenzyme specificity was examined. As a result (Table 9), only NADP-dependent 6PGADH activity was detected in the control strain, but NAD-dependent 6PGADH activity was also detected in the pUCGND-introduced strain. By comparing NAD-dependent activity (1.3 U / mg) with an increase in NADP-dependent activity (0.49 U / mg), this gene is 6PGADH using both NADP and NAD as coenzymes. And NAD-NADP-type GND having higher activity (approximately 2.5 times) for NAD than for NADP.
[0142]
[Table 9]

[0143]
The zwf gene was also used for E. coli. When expressed in E. coli, NAD-NADP-type G6PDH activity was detected, indicating that the cloned gene was NAD-NADP-type zwf (Table 10).
[0144]
[Table 10]

[0145]
In order to confirm that TAL-PGI and RK are target reducing power supply factors, the prepared recombinant enzyme was added to an in vitro reconstitution system, and the effect of increasing xylitol production was examined.
[0146]
Sections to which the prepared TAL-PGI was added at 0.1 mg / ml or RK was added at 0.05 mg / ml were respectively set, and the reaction was carried out at 30 ° C. for 40 hours with the following reaction solution to quantify the amount of xylitol produced.
[0147]
(Reaction solution)
100 mM {KPB} (pH 6.0)
10mM NAD
1g / dl @ arabitol
1 mg protein / ml membrane fraction
0.5mg protein / ml soluble fraction
1 mM @ CoCl₂
[0148]
As a result (FIG. 3), the amount of xylitol produced from arabitol increased in both the TAL-PGI-added group (0.1 mg / ml) and the RK-added group (0.05 mg / ml) as compared to the control group. These enzymes were confirmed to be reducing power supply factors in the in vitro reconstitution system. In FIG. 3, "sol @ X3" indicates a section in which the amount of soluble fraction of the reaction system was increased to 1.5 mg protein / ml soluble fraction.
[0149]
Example 9 tal-pgi, NAD-NADP type zwf, NAD-NADP type gnd and rk G. Examination of amplification effect in oxydans
tal-pgi, zwf, gnd, and rk genes and xdh (xdh2 described in U.S. Pat. No. 6,242,228) in order to produce a co-expressing strain, each gene was transformed into E. coli. An expression plasmid linked to pSA19, which is a shuttle vector of E. coli and Gluconobacter, was constructed. pSA19 has been described in Biosci. ＴｅBiotech. Biochem. , $ 58 (10), $ 1899-1901, $ 1994, describe its construction method. Specifically, pAH4 which is an endogenous plasmid of Acetobacter xylinum BPR2001 strain was isolated according to a conventional method (alkaline-SDS method), digested with HindIII which is a unique restriction enzyme in pAH4, and HindIII of pUC18. The site was ligated to obtain the shuttle vector pSA19. The BPR2001 strain is currently named Gluconactobacter xylinus subspecies @ scrofermentans (Gluconacetobacter @ xylinus @ subsp. @ Sucrofermentans) ATCC 700178.
[0150]
Table 11 shows the sequences of the primers prepared for the construction of the expression plasmid, and FIGS.
[0151]
[Table 11]

[0152]
Plasmids pSATAL, pSAZWF, and pSAGND in which each gene was ligated to pSA19, and a co-expression plasmid pSAGND-XDH were respectively constructed. Oxydans AJ2847 strain. The obtained transformant was refreshed on a YPG (YPG-Amp) plate containing 50 μg / ml ampicillin, inoculated into 50 ml of SR medium, and cultured at 30 ° C. for 24 hours. After collecting and washing the cells, the cells were disrupted according to the method described above, and the enzyme activity was measured.
[0153]
As a result, in the zwf expression plasmid-introduced strain, the NAD-type G6PGH activity was increased 4.3-fold compared to the parent strain, and the expression level was increased (Table 12).
In the gnd expression plasmid-introduced strain, NAD-NADP-type 6PGADH activity was increased about three times that of the parent strain, and the expression level was increased (Table 13). Furthermore, in the strain into which the co-expression plasmid (pSAGND-XDH) in which the xdh gene was linked downstream of gnd, both the 6PGADH activity and the XDH activity increased, and a co-expression strain could be produced.
[0154]
In the TAL-PGI expression plasmid-introduced strain, the PGI activity was about 1.3 times higher than that of the parent strain (Table 14).
[0155]
[Table 12]

[0156]
[Table 13]

[0157]
[Table 14]

[0158]
Example 10 Examination of arabitol → xylitol conversion reaction in a strain into which a pentose gene expression plasmid was introduced
The cells, which had been refresh-cultured at 30 ° C. for 24 hours on a YPG-Amp plate, were inoculated with one platinum loop into 3 ml of YPG-Amp and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. The obtained culture solution was seeded at 5% in a Sakaguchi flask containing 50 ml of a seed medium, and cultured with shaking at 30 ° C. for 24 hours. After collecting the cells by centrifugation, the cells were suspended in 50 ml of a conversion medium and shaken at 30 ° C. to start an arabitol → xylulose conversion reaction. Sixteen hours after the start of the conversion, 25 ml of the mixture was dispensed into a Sakaguchi flask, and a xylulose → xylitol conversion reaction was performed. In the latter reaction, a 2 g / dl glucose-added section and a non-added section were set, and a shaking reaction was performed.
[0159]
[Seed medium]
5 g / dl @ glycerol, 0.3 g / dl @ KH₂PO₄, 0.1g/dl@K₂HPO₄, 0.05g/dl@MgSO₄0.5 g / dl @ YE, 0.5 g / dl casamino acid, 1 g / dl @ L-sodium glutamate, metal mixture, vitamin mixture.
[0160]
(Conversion medium)
10 g / dl arabitol, 0.3 g / dl @ KH₂PO₄, 0.1g/dl@K₂HPO₄, 0.05g/dl@MgSO₄0.5 g / dl @ YE, 0.5 g / dl peptone, metal mixture, vitamin mixture, 2 g / dl @ calcium carbonate.
[0161]
A total amount of the cells obtained by seed culture was inoculated into a conversion medium containing 10 g / dl arabitol, converted to xylulose by shaking at 30 ° C. for 16 hours, and further reacted by adding 2 g / dl glucose. . As a result (Table 15), an increase in xylitol production in the glucose-supplemented group and the non-glucose-added group was observed in the transgenic strains with reducing power supply. In the glucose-added group, the yield of xylitol from 10 g / dl of arabitol was 12% in the control strain, whereas the tal-pgi, zwf, gnd and gnd-xdh-introduced strains were 18% and 17%, respectively. An increase in xylitol accumulation was observed at 15% and 24%.
[0162]
[Table 15]

[0163]
【The invention's effect】
According to the present invention, there are provided novel enzymes involved in the production of NADH by Gluconobacter bacteria and genes encoding them.
The bacterium of the genus Gluconobacter of the present invention can be suitably used for production of a target substance using the bacterium. In particular, the method of the present invention is suitable for producing xylitol.
[0164]
[Sequence list]

[0165]

[0166]

[0167]

[0168]

[0169]

[0170]

[0171]

[0172]

[0173]

[0174]

[0175]

[0176]

[0177]

[0178]

[0179]

[0180]

[0181]

[0182]

[0183]

[0184]

[0185]

[0186]

[0187]

[0188]

[0189]

[0190]

[0191]

[0192]

[0193]

[0194]

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing G6PDH activity (relative activity) when NADP (●) or NAD (closed triangle) is used as a coenzyme.
FIG. 2 is a graph showing 6PGDH activity (U / mg) when NADP (●) or NAD (closed triangle) is used as a coenzyme.
FIG. 3 shows the effects of TAL-PGI and RK on arabitol → xylitol conversion reaction by an in vitro reconstitution system.
FIG. 4 is a diagram showing the construction of a plasmid pSATAL containing tal-pgi.
FIG. 5 shows the construction of plasmids pSAGND and pSAGND-XDH containing gnd or gnd and xdh.
FIG. 6 is a diagram showing the construction of a plasmid pSAZWF containing zwf.

Claims

A protein shown in the following (A) or (B).
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, and at least one of transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity; A protein having one or both.

DNA encoding the protein shown in the following (A) or (B).
(A) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18;
(B) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, which comprises an amino acid sequence containing one or more amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions, and at least one of transaldolase activity and glucose-6-phosphate isomerase activity; A protein having one or both.

The DNA according to claim 2, which is a DNA shown in (a) or (b) below.
(A) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 2437 to 5310 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16;
(B) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, hybridizes with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotide numbers 2437 to 5310 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence under stringent conditions, and has a transaldolase activity and DNA encoding a protein having at least one or both of glucose-6-phosphate isomerase activities.

The DNA according to claim 3, wherein the stringent condition is a condition in which washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.

A protein represented by the following (C) or (D):
(C) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(D) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity;

DNA encoding the protein shown in the following (C) or (D).
(C) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19;
(D) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having 6-phosphogluconate dehydrogenase activity;

The DNA according to claim 6, which is a DNA shown in (c) or (d) below.
(C) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotides 5314 to 6312 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
(D) hybridizing under stringent conditions with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotides 5314 to 6312 of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and 6-phosphoglucone DNA encoding a protein having acid dehydrogenase activity.

The DNA according to claim 7, wherein the stringent condition is a condition in which washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.

A protein shown in the following (E) or (F).
(E) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(F) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having a lipokinase activity;

DNA encoding the protein shown in the following (E) or (F).
(E) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21;
(F) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having a lipokinase activity;

The DNA according to claim 10, which is a DNA represented by the following (e) or (f):
(E) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 196 to 1815 in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
(F) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20, hybridizes with a nucleotide sequence consisting of at least nucleotide numbers 196 to 1815 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence under stringent conditions, and has a lipokinase activity. DNA encoding a protein.

The DNA according to claim 11, wherein the stringent condition is a condition in which washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.

A protein represented by the following (G) or (H):
(G) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(H) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity;

DNA encoding the protein shown in the following (G) or (H).
(G) a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23;
(H) a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 including substitution, deletion, insertion or addition of one or more amino acids and having glucose-6-phosphate dehydrogenase activity;

The DNA according to claim 14, which is a DNA represented by the following (g) or (h):
(G) a DNA comprising at least the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 983 to 2449 out of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22;
(H) of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22, hybridizes under stringent conditions to at least a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 983 to 2449 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and glucose-6- DNA encoding a protein having phosphate dehydrogenase activity.

The DNA according to claim 15, wherein the stringent condition is a condition in which washing is performed at 60 ° C. at a salt concentration corresponding to 1 × SSC and 0.1% SDS.

A method for producing a target substance, wherein a target substance is produced by causing a bacterium belonging to the genus Gluconobacter to act on a raw material for biosynthesis of the target substance. The method of claim 1 wherein the bacterium is required and has been modified such that the activity of one or more enzymes involved in the production of reduced nicotinamide adenine dinucleotide is enhanced.

The enzyme activity is the activity of one or more enzymes selected from the group consisting of transaldolase, glucose-6-phosphate isomerase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, lipokinase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase. The method according to claim 17.

19. The method according to claim 18, wherein the enhancement of the enzyme activity is due to enhancement of the expression of a gene encoding each enzyme.

20. The method according to claim 19, wherein the expression of the gene is enhanced by increasing the intracellular copy number of the gene or enhancing the function of an expression regulatory sequence of the gene.

The method according to any one of claims 17 to 20, wherein the target substance is xylitol, and the reduction reaction is a conversion reaction from D-xylulose to xylitol.

22. The method of claim 21, wherein the bacterium has been further modified to increase xylitol dehydrogenase activity.

23. The method according to any one of claims 17 to 22, wherein the bacterium is Gluconobacter oxydans.

The expression of one or more genes selected from the group consisting of transaldolase-glucose-6-phosphate isomerase gene, 6-phosphogluconate dehydrogenase gene, ribobrokinase gene, and glucose-6-phosphate dehydrogenase is enhanced. Gluconobacterium bacterium modified as described above.

25. The bacterium of the genus Gluconobacter according to claim 24, further modified to increase xylitol dehydrogenase activity.

The bacterium of the genus Gluconobacter according to claim 24 or 25, which is Gluconobacter oxydans.