【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タキサン類産生微生物およびその培養によるタキサン類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タキソールは、種々の癌細胞に対して強力な抗ガン作用を示し、特に、乳癌、卵巣癌、胃癌などに有効な制癌剤として日本でも既に承認されている（１９９７年７月）。
【０００３】
当初、タキソールは、イチイの樹皮から採取されていたが、自然保護の観点からイチイの木の伐採が禁止され、その入手が困難になった。しかし、最近ではイチイの葉からタキソールの前駆体である１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（１０−ＤＡＢと略す）が得られるようになった（例えば非特許文献１参照）。このような背景から、半合成法が実用的且つ重要な供給法となっている。該半合成法としては、例えば１０−ＤＡＢの１３位の水酸基でβ−ラクタムを開環する方法（例えば非特許文献２参照）及び１０−ＤＡＢの１３位の水酸基とフェニルイソセリン側鎖のカルボン酸をエステル化によって連結する方法（例えば非特許文献３参照）が知られている。
【０００４】
しかしながら、上記半合成法において出発原料とするイチイの葉に由来する前記前駆体は、その樹木中の含有量が低いと共に、樹木の成長管理が煩雑であり且つ広大な土地（植林地）と長期間の栽培を要するために、尚その供給が不安定で、スケールアップは容易でない不利がある。また該樹木からの抽出、精製操作なども煩雑である欠点が認められる。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｋｙｒｉａｃｏｓ Ｃｏｓｔａ Ｎｉｃｏｌａｏｕ， ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， １９９４， ３３， １５−４４
【０００６】
【非特許文献２】
Ｏｊｉｍａ， Ｉ．； Ｈａｂｕｓ， Ｉ．； Ｚｈａｏ， Ｍ．； Ｚｕｃｃｏ， Ｍ．； Ｐａｒｋ， Ｙ． Ｈ．； Ｓｕｎ， Ｃ． Ｍ．； Ｂｒｉｇａｕｄ， Ｔ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９２， ４８， ６９８５−７０１２．
【０００７】
【非特許文献３】
Ｋａｎａｚａｗａ， Ａ． Ｍ．； Ｄｅｎｉｓ， Ｊ．； Ｇｒｅｅｎｅ， Ａ． Ｅ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９４， ５９， １２３８−１２４０． （ｂ） Ｇｅｎｎａｒｉ， Ｃ．； Ｃａｒｃａｎｏ， Ｍ．； Ｄｏｎｇｈｉ， Ｍ．；Ｍｏｎｇｅｌｌｉ， Ｎ．； Ｖａｎｏｔｔｉ， Ｅ．； Ｖｕｌｐｅｔｔｉ， Ａ． Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ６２， ４７４６−４７５５．
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、タキソールの半合成法のための出発原料である前記前駆体を、樹木の栽培によることなく、微生物の培養によって安定して且つ大量に供給する、新しい方法およびそのための微生物を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、イチイ属樹木の一種に生息するある種の糸状菌を単離、同定するに成功すると共に、該菌が上記目的に合致するタキソール前駆体の産生能を有しており、しかもその産生能がかなり高く、従って該菌の培養によって前記前駆体を容易に且つ大量に製造できるという新しい知見を得た。本発明はこの新知見を基礎として更に研究を重ねた結果、完成されたものである。
【００１０】
本発明の要旨は、下記項１−４に記載の通りである。
項１． ペスタロッチア属に属し、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ（以下、「１０−ＤＡＢ」と略す）産生能を有することを特徴とするタキサン類産生微生物。
項２． ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８５である項１に記載の微生物。
項３． 項１に記載の１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−ＤＡＢを採取することを特徴とする１０−ＤＡＢの製造方法。
項４． 微生物がＦＥＲＭ−Ｐ１８９８５である項３に記載の方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明微生物およびこれを利用するタキサン類（１０−ＤＡＢ）の製造方法につき詳述する。
【００１２】
１． 本発明微生物
本発明微生物は、ペスタロッチア属に属し、１０−ＤＡＢ産生能を有することを特徴としている。
【００１３】
本発明微生物の一具体例としては、本発明者が、愛媛大学校内に栽培されているヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）の内樹皮から新たに分離し、「ＴＷ−３」と命名した菌株を挙げることができる。該菌株は以下の性質を示す。
【００１４】
（１） 形態学的特徴
本株は、麦芽エキス寒天培地、ポテト−デキストロース寒天（ＰＤＡ）培地、オートミール寒天培地などで良好に生育する。
【００１５】
気生菌糸は、白色で隔壁を有する。その表面は滑らかで、直径は約１−３μｍである。分化生子柄は、褐色から暗黒色で気生菌糸上に直立して形成される。その表面は平滑で棍棒状をしており、先端は最大約３０μｍまで膨れる。
【００１６】
分生子は、ａｒｔｈｒｏｓｐｏｒｅ型で出芽により連鎖し、紡錘形または楕円形であり、分生子の構成細胞数は５細胞である。厚さ最大約１０μｍまでの明瞭な淡黒色の隔壁を有する。型は長楕円形を示し、白色から淡褐色で、表面は平滑である。中心の３細胞は色が濃く（暗色）、先端細胞に１−４個の付属子が認められる。後部細胞の付属子は１本である。付属子を除いた分生子の大きさは、約１０−２５×５−１０μｍであり、先端細胞の付属子の大きさは約５−１５μｍであり、後部細胞の付属子の大きさは約２−６μｍである。
【００１７】
（２） 各種培地上での性状
（２−１） バレイショ−ブドウ糖寒天（ＰＤＡ）培地
生育は良好で、２５℃、２週間後のコロニーの直径は９０ｍｍ である。表面は綿毛状の菌糸体よりなり、外縁は規則正しく縁取られている。気生菌糸の発達は良好であり、培養２週間で分生子の形成が認められる。中央部から中間部にかけて淡黄灰色からオリーブ色を呈し、周辺部は象牙色を呈する。中央部に部分的に暗褐色色素の生成が認められる。裏面中央部から中間部にかけて暗褐色を呈し、周辺部は灰白色を呈する。可溶性色素の生成は認められない。
【００１８】
（２−２） 麦芽エキス寒天培地
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００１９】
（２−３） オートミール寒天培地
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００２０】
（２−４） プレーンアガー培地（２％寒天培地）
ＰＤＡ培地における生育状況とほぼ同様である。
【００２１】
（３） 生理学的性質
本菌株の生育条件をＰＤＡ培地で調べた。生育温度範囲は４−３０℃であり、生育ｐＨ範囲は４−１０である。至適温度範囲は２０−２５℃であり、至適ｐＨ範囲は５−９である。
【００２２】
以上の菌学的性状を基に、不完全菌類Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｄｅ Ｎｏｔ．の文献（Ｍｅｍ． Ｒ． Ａｃｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｔｏｒｉｎｏ ２，３： ８０， １８３９； Ｇｕｂａ， １９３２， １９６１； Ｓｔｅｙａｅｒｔ， １９４９， １９５５，１９５６； Ｓｕｔｔｏｎ， １９６９； Ｄｕｂｅ ＆ Ｂｉｌｇｒａｍｉ， １９６６； Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８６）；Ｓｍｉｔｈ Ｇ．， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｇ． Ｃ． Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｐ． Ｈ． Ａ． Ｓｎｅａｔｈ ｅｄ．， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ （１９６２）， ｐ．１１１および「植物病原菌類図説」編者：小林享夫、勝本謙、我孫子和雄、阿部恭久、柿島真、全国農村教育協会発行、１９９２年、ｐ．５６７を検索したところ、本菌株はペスタロッチア・ペジゾイデス デ ノット（Ｐｅｓｔａｌｏｔｉａ ｐｅｚｉｚｏｉｄｅｓ ｄｅ Ｎｏｔ．）を基準種とするペスタロッチア菌種に属するものと判定された。しかるに、従来ペスタロッチア菌が１０−ＤＡＢ産生能を有することは報告された例がなく、そのような１０−ＤＡＢ産生能を有する点で、本菌株は公知のペスタロッチア菌株とは区別される。従って、本発明者は本菌株を、不完全菌ペスタロッチア属に属する新しい菌株と同定した。
【００２３】
本菌株は、平成１４年８月２７日に茨城県つくば市東１−１−３、独立行政法人産業技術総合研究所 微生物寄託センターに、微生物の表示「ＴＷ−３」として受託されており、その受託番号は「ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８５」である。
【００２４】
上記ＴＷ−３株はヨーロッパイチイの内樹皮から得られたものであるが、本発明者らはヨーロッパイチイをはじめとして、太平洋イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、日本イチイ（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ）、キャラボク（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ． ｎａｎａ Ｒｅｈｄｅｒ）などのイチイ属樹木から、上記ＴＷ−３以外にも各種のペスタロッチア属菌株を単離しており、これらの内にも、ＴＷ−３と同様に１０−ＤＡＢ産生能を有する菌株が存在することを確認している。従って、本発明微生物には、そのような各種イチイ属樹木から単離され、ペスタロッチア属に属し、且つ１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物が包含される。
【００２５】
尚、ペスタロッチア属菌は、微生物の一般的性質として自然に変異を起こし得る。また通常の変異処理、例えばＸ線、γ線、紫外線などの放射線照射、種々の変異誘導剤による処理、薬剤を含有する培地上での培養などによって変異を誘導し得る。このような変異処理による変異株あるいは自然に得られる変異株であっても、１０−ＤＡＢ産生能を有するものは、すべて本発明に包含される。
【００２６】
また、本発明者らは、研究の結果、本発明微生物のうちに、１０−ＤＡＢ産生能のみならず、これと共に、タキソール産生能やその他のタキサン類の産生能を有するものが存在することをＴＬＣなどにより確認している。
【００２７】
２． タキサン類の製造
本発明はペスタロッチア属に属し１０−ＤＡＢ産生能を有する微生物を培養し、培養物中に生成蓄積される１０−ＤＡＢを採取する１０−ＤＡＢの製造法を提供する。
【００２８】
本発明方法において、微生物の培養に用いられる培地は、用いる菌株が利用し得る栄養源を含むことを必須として、通常の各種のものから適宜選択することができる。また該培地は、液状でも固体状でもよい。特に、大量の微生物の培養には液状培地が適している。
【００２９】
培地に含ませる栄養源は、微生物が同化し得る炭素源、窒素源、無機物質乃至有機塩類、微量栄養源などの通常の栄養源のいずれでもよい。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、乳糖、ショ糖、麦芽糖、デキストリン、澱粉、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、油脂類（綿実油、大豆油、ラード油、チキン油など）、ｎ−パラフィンなどを例示することができる。
【００３１】
窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、生大豆粉、綿実粉、トマトペースト、ピーナッツミール、廃糖蜜、尿素、アンモニア塩類（硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど）などを例示することができる。
【００３２】
無機物質乃至有機塩類および微量栄養源としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの金属の塩類（リン酸、ホウ酸、硫酸などの無機酸の塩類、酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩類）；鉄、マンガン、亜鉛、コバルト、ニッケルなどの微量金属の塩類（上記と同様の無機酸および有機酸の塩類）などを例示することができる。
【００３３】
更に培地には、必要に応じて、アミノ酸（グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、リシン、メチオニン、プロピンなど）、ペプチド（ジペプチド、トリペプチドなど）、ビタミン類（ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ニコチン酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＣなど）、核酸類（プリン、ピリミジン、それらの誘導体など）などを含有させることができる。
【００３４】
また培地には、培地のｐＨを調整するために、無機酸、有機酸などの酸類、水酸化ナトリウムなどのアルカリ類、緩衝剤などを加えることもでき、消泡のために、油脂類、界面活性剤などを添加することもできる。
【００３５】
尚、微生物の培養のために各種の栄養源を配合して調製された各種の培地が、既に市販されており、本発明ではそのような市販の栄養培地を利用することもできる。
【００３６】
微生物の培養は、静置培養、振とう培養、通気攪拌培養などによることができる。大量培養には、いわゆる深部通気攪拌培養を採用するのが望ましい。培養条件は、培地の種類（組成）、菌株の種類、培養方法などに応じて適宜決定することができる。一般には、微生物の至適温度およびｐＨ条件、即ち約２０−２５℃の温度および約５−９のｐＨが採用されるが、特にこれに限定されるわけではない。培養時間は前記培地条件、培養条件などに応じて一定しないが、目的とするタキサン類の生産蓄積量が最大となるまで培養するのが望ましい。一般には、例えば液体培地を用いる振とう培養または通気攪拌培養の場合、通常約７−１４日間とするのが適当である。
【００３７】
上記微生物の培養によって目的とするタキサン類が培養液中に生産、蓄積される。培養液からの目的化合物の採取は、該化合物の理化学的性質などを利用した通常の方法に従って行うことができる。例えば、目的とするタキサン類は油溶性であるのでこの性質を利用して、一般的な有機溶媒による抽出手段により目的化合物を採取することができる。より詳しくは、培養液または培養濾液に炭酸水素ナトリウムを添加後、適当な有機溶媒、例えばジクロロメタンなどのハロゲン化炭化水素類；酢酸エチルなどのエステル類；メチルエチルケトンなどのケトン類；イソブチルアルコールなどのアルコール類などを加えて、目的とするタキサン類を抽出することができる。得られた有機溶媒層を水で洗浄後、乾燥および濃縮して所望化合物を含有する粗生成物を得ることができる。
【００３８】
上記で得られる粗生成物は、更に精製して純粋な化合物とすることができる。
該精製手段としては、公知の各種の手段をいずれも採用できる。より詳しくは、吸着クロマトグラフィー、分子篩いクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法などが挙げられる。
【００３９】
得られる目的化合物は、各種の物理化学的データ、ＮＭＲスペクトル分析などにより同定できる。
【００４０】
かくして、本発明微生物の利用によれば、樹木の栽培に比して、非常に短時間に、容易に、安定して、大量のタキサン類（１０−ＤＡＢ）を得ることでき、しかもその精製も、植物起源のそれに比して簡単である。
【００４１】
殊に、本発明により得られる１０−ＤＡＢは、種々の癌細胞に対して強力な抗ガン作用を示し、既に制癌剤として承認されているタキソールの合成原料として有用である。また、該タキソールよりも抗ガン性が高いことが報告されており、制癌剤としての用途が期待されるタキソール・アナログ（Ｑ． Ｃｈｅｎｇ， Ｔ． Ｏｒｉｔａｎｉ， Ｔ． Ｏｒｉｇｕｃｈｉ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ５６， １６６７−１６６９ （２０００））、タキソールの７位にキシロースが結合した化合物（Ｍａｔｔｈｅｗ Ｓｕｆｆｎｅｓｓ， ”ＴＡＸＯＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， ＣＲＣＰｒｅｓｓ， ＮｅｗＹｏｒｋ， １９９５， ｐ．３１７−３７５）などの製造原料としても有用である。更に、このものを免疫抗原として利用することによって、タキサン類を選択的に認識する抗体、特にモノクローナル抗体を製造することができ、該抗体は、例えば植物抽出物や組織培養物などの試料中のタキサン類の検出、定量や、該試料からのタキサン類の精製に有用である。
３． タキソールの製造
本発明方法に従い得られるタキサン類、即ち、１０−ＤＡＢからのタキソールの合成は、例えば前述した公知の方法、即ち１０−ＤＡＢの１３位の水酸基でβ−ラクタムを開環する方法（非特許文献１参照）、１０−ＤＡＢの１３位の水酸基とフェニルイソセリン側鎖のカルボン酸をエステル化によって連結する方法（非特許文献２参照）などに従い実施することができる。
【００４２】
また、上記以外にも各種の半合成法が既に報告されており、これらの報告に従うことも可能である（例えば、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９８８， １１０，５９１７−５９１９； Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． ３３， Ｎｏ． ３６， ｐｐ． ５１８５−５１８８， １９９２など参照）。
【００４３】
得られるタキソールは、種々の癌細胞に対する強力な制癌作用を有しており、特に、乳癌、卵巣癌、胃癌などに対する制癌剤として有用である。
【００４４】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。尚、各例における％は、特記しない限り重量基準（ｗ／ｗ％）による。
【００４５】
【実施例１】ペスタロッチア属菌のスクリーニング
（１） イチイ科樹木試料
ヨーロッパイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、太平洋イチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、日本イチイ（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ）およびキャラボク（Ｔａｘｕｓ ｃｕｓｐｉｄａｔａ ｖａｒ． ｎａｎａ Ｒｅｈｄｅｒ）の茎を試料として利用した。
【００４６】
（２） 微生物培養用培地
培地としては、以下の通り調製したＰＤＡ培地を用いた。即ち、皮を剥いたジャガイモ２００ｇを細かく刻み、蒸留水を加えて約１時間蒸煮後、つぶして更に約１５分間蒸煮し、ガーゼで濾過し、得られた濾液にグルコース２０ｇを加え、更に全量が１Ｌとなるように蒸留水を加えた後、０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨを５．６に調整した。このものに寒天２０ｇを溶解し、オートクレーブで高圧滅菌（１２１℃、２０分間）し、直径９ｍｍの滅菌シャーレに１０ｍＬずつ分注した。
【００４７】
（３） 試料の滅菌と培地への植え込み
植物体から採取した試料（枝先端部分から約３０ｃｍにあたる枝部分、直径約１ｃｍ程度）を、１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液（アンチホルミン）で１０分間殺菌した。殺菌後、試料をクリーンベンチ内に入れ、滅菌水で３回洗浄した。試料の茎を０．５ｃｍずつに切り（葉は切り落とす）、更に縦に半分に切り、切り口が培地と接するように置床した。２５℃、暗所で、１−２週間静置培養した。
【００４８】
（４） ペスタロッチア菌の単離
（３）に従う１−２週間の培養後、シャーレ上に生育してくる黒色の胞子を形成している菌叢（ペスタロッチア菌）をかきとり、新しく調製したＰＤＡ培地に移して継代して純化した。継代はシャーレいっぱいに広がった菌（２週間培養）をクリーンベンチ内でＰＤＡ培地を分注したシャーレに白金耳を使って植え付け、２５℃、暗所で２週間培養することにより実施した。最終培養後、シャーレをパラフィンフィルム（商品名「パラフィルム」）でシールし、冷蔵庫保存した。
【００４９】
上記に従って、ヨーロッパイチイから３種のペスタロッチア菌を単離し、それぞれ「ＷＴ−１」、「ＷＴ−２」および「ＷＴ−３」と命名した。
【００５０】
得られたペスタロッチア菌ＷＴ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９８５）は、前述した形態学的特徴、ＰＤＡ培地上での性状および生理学的性質を有していた。その分生子の顕微鏡写真撮影結果を図１に示す。
【００５１】
【実施例２】ペスタロッチア菌の培養
（１） 液体培養
ペスタロッチア菌の培養には下記表１記載の組成に調製した改良Ｍ１Ｄ培地を使用した。
【００５２】
【表１】
【００５３】
クリーンベンチ内で２Ｌの培養フラスコに改良Ｍ１Ｄ培地５００ｍＬを分注したものに、実施例１で継代、純化したペスタロッチア菌（シャーレで２週間培養したもの）を、直径５ｍｍのコルクボーラーで培地ごと打ち抜いたものを５個加えた。その後、綿栓をして、２５℃、暗所で３週間静置培養した。
【００５４】
（２） 培地中タキサン類の抽出
上記（１）の培養後、ブフナー濾斗を用いて菌体と培養濾液に分けた。培養濾液に０．１２５ｇ（培養濾液５００ｍＬ当たり）の炭酸水素ナトリウムを添加した後、ジクロロメタン２５０ｍＬで分層した。この操作を２回行い、ジクロロメタン可溶部を得た。
更に、水層を酢酸エチル２５０ｍＬで分層した。この操作を２回行い、酢酸エチル可溶部を得た。各可溶部を減圧濃縮し、ジクロロメタン抽出物と酢酸エチル抽出物を得た。得られた各抽出物は、真空乾燥機中、減圧下に五酸化二リン上で充分に乾燥した。
【００５５】
【実施例３】タキサン類の同定
（１） 抽出物中のタキソールのイムノアッセイによる定量
市販のタキソールイムノアッセイキット（Ｈａｗａｉｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ， ＩＮＣ．，Ｔａｘｏｌ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｋｉｔ， Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ． ＴＡ０２）を用いて、ジクロロメタン抽出物中のタキソールを定量した。
【００５６】
結果を図２（縦軸：タキソール生産量（μｇ／Ｌ）、横軸：培養菌の種類（ＴＷ−１， ＴＷ−２， ＴＷ−３））に示す。
【００５７】
図２に示される結果から、ＴＷ−３菌が最も多量のタキソールを産生することが判る。尚、このイムノアッセイは、高い分析精度を有しており、抗原抗体反応の特異性も高いため、得られた結果に他のタキサン類の混入による影響はないと考えられたが、タキソールのイムノアッセイではある種のタキサン類も検出されるといわれていることから、このタキサン類の検出のために、以下のＴＬＣ分析およびＬＣ／ＭＳ分析を実施した。
【００５８】
（２） 抽出物のＴＬＣ分析
実施例２で得た各抽出物をメタノール１ｍＬに溶解し、薄層クロマトグラフプレート上にスポットした。また、標品としてタキソールおよび１０−ＤＡＢの各１ｍｇ／ｍＬメタノール溶液をスポットとした。展開溶媒としては、クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）を用いた。展開後、紫外線吸収でスポットを確認した後、１％バニリン硫酸で呈色して、タキサン類の検出を行った。
【００５９】
結果を図３に示す。
【００６０】
図３は、タキソール標品、実施例２で得たジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物、並びに１０−ＤＡＢ標品について行われたＴＬＣ分析の結果を示す図であり、レーン１はタキソール標品の結果であり、レーン２はジクロロメタン抽出物の結果であり、レーン３は酢酸エチル抽出物の結果であり、レーン４は１０−ＤＡＢ標品の結果である。
【００６１】
該図に示される結果から、ジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物のいずれについても、タキソールと同じ位置（Ｒｆ値、レーン１参照）に紫外線吸収および呈色反応を示すスポットは確認できないことが判った（レーン２，３参照）。また、ジクロロメタン抽出物（レーン２）には、タキサン類の呈色を示すスポットが２つ確認された。更に、酢酸エチル抽出物（レーン３）について、１０−ＤＡＢと同一Ｒｆ値（レーン４参照）に、同一の呈色反応を示すスポットの存在を確認した。
【００６２】
これらのことから、試験したＴＷ−３培養物中におけるタキソール量は検出限界以下であったのに対して、１０−ＤＡＢおよび他のタキサン類が産生蓄積されることが明らかとなった。
【００６３】
（３） 抽出物のＬＣ／ＭＳによる分析
実施例２で得た各抽出物をそれぞれ適量のメタノールに溶解し、フィルターを通した後、以下の条件でＬＣ／ＭＳ分析を行った。
ＬＣ条件（カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ ＴＭ−ＬＣ−Ｆ； ＵＶ波長：２２７ｎｍ； 流速： １．５ｍＬ／ｍｉｎ； 展開溶媒： アセトニトリル：テトラヒドロフラン：水＝１７：２８：５５（ｖ／ｖ））
ＭＳ条件（Ｓｏｕｒｃｅ ｓｅｔｔｉｎｇ： Ｓｐｒａｙ ｔｉｐ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ３６０２．９７； ＡＰＩ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｓｅｔｔｉｎｇ： Ｎｏｚｚｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ８０．８； Ｓｋｉｍｍｅｒ １ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ １２．０１； Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＤＣ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ７．６９； Ｄｅｆｒｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｔａｇｅ ０．４９； Ｅｉｎｚｅｌ ｌｅｎｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ −３５．０１； Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＲＦ ｖｉｌｔａｇｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｔｅｍｐａｒａｔｕｒｅ ２００．０１； Ｎｏｚｚｌｅ ｔｅｍｐｒａｔｕｒｅ ２００．０１；Ａｎａｌｙｚｅｒｓｅｔｔｉｎｇ： Ｐｕｓｈ ｐｕｌｓｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ６５６．１３； Ｐｕｌｌ ｐｕｌｓｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ １３９９．９９； Ｄｅｔｅｃｔｅｒ ｖｏｌｔａｇｅ １８４９．６９； Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｃｑｕｉｓｉｏｎ ｓｅｔｔｉｎｇ： Ｆｉｒｓｔ ｍａｓｓ ２５０．００； Ｌａｓｔ ｍａｓｓ １０００．００）
その結果、タキソール標品（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて同様に実施されたスタンダードの結果と対比して、ジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物のいずれの場合も、ＬＣ分析結果を示すＴＩＣチャートにおいて、同一ピークは観察されず、このことから、各抽出物中にタキソールは実質的に存在しないと考えられた。
【００６４】
また、ＭＳ分析結果を示すチャートでも、タキソールにプロトンが付加したマスピーク（ｍ／Ｚ＝８５４）は確認されなかった。但し、この結果は、各抽出物中のタキソール含量が低すぎたことに基づくものであり、別途、高濃度抽出物について行った同一試験では、ピークが観察された。
【００６５】
また、酢酸エチル抽出物については、ＭＳ分析の結果、１０−ＤＡＢのマスピーク（Ｍ＋＋Ｈ＝５４５）が観察され、これは１０−ＤＡＢ標品におけるそれと一致した。一方、ジクロロメタン抽出物については、ＭＳ分析によって、タキサン類のキシロサイドを示唆するマスピーク（ｍ／Ｚ＝６４１）が観察された。
【００６６】
（４） 抽出物のＨＰＬＣ分析
実施例２で得た酢酸エチル抽出物をメタノール２ｍＬに溶解し、フィルターを通した後、その５μｌをサンプル管に注入して、以下の条件でＨＰＬＣ分析を行った。尚、メタノールに溶解した１０−ＤＡＢ標品についても同一試験を実施した。
【００６７】
１０−ＤＡＢの同定は、該標品とのリテンションタイムの一致およびスパンキングにより行った。
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ ＴＭ−ＬＣ−Ｆ； ＵＶ波長：２２７ｎｍ； 流速： １．５ｍＬ／ｍｉｎ； 移動相： アセトニトリル：テトラヒドロフラン：水＝１７：２８：５５（ｖ／ｖ）
結果（ＨＰＬＣチャート）を図４に示す。図４において、上段は１０−ＤＡＢ標品の結果であり、下段が酢酸エチル抽出物の結果である。また、矢印で示したピークが１０−ＤＡＢ（１０−ｄｅａｃｅｔｙｌｂａｃｃａｔｉｎ ＩＩＩ）である。
【００６８】
該図に示されるとおり、酢酸エチル抽出物中の１０−ＤＡＢに相当するリテンションタイムを持つピークは、１０−ＤＡＢ標品のそれと一致した。またスパンキングによってもこれらが同一物であることが確認された。このことから、酢酸エチル抽出物中には、１０−ＤＡＢが存在することが明らかとなった。
【００６９】
更に、予め作製した検量線を用いて、該１０−ＤＡＢの定量を行った結果、ＴＷ−３菌は、約０．１５ｍｇ／Ｌの１０−ＤＡＢを生産することが判った。
【００７０】
（５） ＴＷ−３菌の大量培養による１０−ＤＡＢの単離
実施例２の（１）および（２）と同様にして、ＴＷ−３菌を培養した培養液（５０Ｌ）から、ジクロロメタン抽出物８．２ｇおよび酢酸エチル抽出物１０．２ｇを得た。
【００７１】
得られた酢酸エチル抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１， ３０：１， １０：１および５：１（ｖ／ｖ））にかけて精製した。ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ））でモニターしながら、１０−ＤＡＢを含むフラクションを得た。このフラクションを分取ＴＬＣ（クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ））にかけて、１０−ＤＡＢを６．１ｍｇ（融点： ２４３−２４６℃（分解））得た。
【００７２】
かくして単離された化合物が１０−ＤＡＢであることは、１０−ＤＡＢ標品と融点が一致すること、混融試験による融点降下が認められないことなどから確認された。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、１０−ＤＡＢ産生微生物および該微生物の培養による１０−ＤＡＢの製造法が提供される。該１０−ＤＡＢは、例えば制癌効果を有するタキソールの合成中間体として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明微生物ＴＷ−３の分生子の顕微鏡写真撮影結果を示す図である。
【図２】本発明微生物の培養によって得られる培養物のジクロロメタン抽出物中のタキソールを定量した結果を示すグラフである。
【図３】タキソール標品、実施例２で得たジクロロメタン抽出物および酢酸エチル抽出物、並びに１０−ＤＡＢ標品について行われたＴＬＣ分析の結果を示す図である。
【図４】実施例３の（４）に従い得られた本発明微生物を培養した培養抽出物のＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a taxane-producing microorganism and a method for producing taxanes by culturing the same.
[0002]
[Prior art]
Taxol has a strong anticancer effect on various cancer cells, and has already been approved in Japan as an effective anticancer agent especially for breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer and the like (July 1997).
[0003]
At first, taxol was collected from the bark of the yew tree, but it was banned from cutting yew trees from the viewpoint of conservation of nature, making it difficult to obtain it. However, recently, 10-deacetylbaccatin III (abbreviated as 10-DAB), which is a precursor of taxol, has been obtained from yew leaves (for example, see Non-Patent Document 1). Against this background, the semi-synthetic method has become a practical and important supply method. Examples of the semi-synthesis method include a method of opening a β-lactam at a hydroxyl group at the 13-position of 10-DAB (for example, see Non-Patent Document 2) and a method of synthesizing a hydroxyl group at the 13-position of 10-DAB and a phenyl isoserine side chain. A method of linking acids by esterification (for example, see Non-Patent Document 3) is known.
[0004]
However, the precursor derived from yew leaves as a starting material in the above semi-synthesis method has a low content in the tree, the growth management of the tree is complicated, and the length of the land (forest plantation) is long. Since the cultivation of the period is required, the supply is still unstable, and there is a disadvantage that the scale-up is not easy. Further, there are disadvantages in that extraction and purification operations from the tree are complicated.
[0005]
[Non-patent document 1]
Kyriacos, Costa, Nicolaou, et al. , {Angew. {Chem. {Int. {Ed. {Engl. , $ 1994, $ 33, $ 15-44
[0006]
[Non-patent document 2]
Ojima, {I. \ Habus, \ I. Zhao, M. Zucco, M. @Park, @Y. H. @Sun, @C. M. \ Brigaud, \ T. Tetrahedron, 1992, 48, 6985-7012.
[0007]
[Non-Patent Document 3]
Kanagawa, {A. M. Denis, J .; Greene, A .; E. {J. {Org. {Chem. , 1994, 59, −１1238-1240. {(B)} Gennari, {C. Carcano, M. Donghi, M. Mongelli, {N. @Vanotti, @E. \ Vulpetti, \ A. {J. {Org. {Chem. , 1997, 62, 4746-4755.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a new method and a novel method for supplying the precursor, which is a starting material for a taxol semi-synthesis method, stably and in large quantities by culturing microorganisms without cultivating trees. To provide microorganisms.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
In view of the above problems, the present inventor has conducted intensive studies, and as a result, succeeded in isolating and identifying a certain filamentous fungus inhabiting a kind of Taxus genus tree, and at the same time, the taxol satisfying the above purpose. It has a new finding that it has a precursor-producing ability, and its production ability is considerably high, so that the precursor can be easily and mass-produced by culturing the bacterium. The present invention has been completed as a result of further research based on this new finding.
[0010]
The gist of the present invention is as described in the following items 1-4.
Item 1. (4) A taxane-producing microorganism, which belongs to the genus Pestalothia and has the ability to produce 10-deacetylbaccatin III (hereinafter, abbreviated as "10-DAB").
Item 2. Item 4. The microorganism according to Item 1, which is FERM P-18985.
Item 3.方法 A method for producing 10-DAB, comprising culturing the microorganism having 10-DAB-producing ability according to item 1 and collecting 10-DAB produced and accumulated in the culture.
Item 4.方法 The method according to item 3, wherein the microorganism is FERM-P18985.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, the microorganism of the present invention and a method for producing taxanes (10-DAB) using the microorganism will be described in detail.
[0012]
1. The microorganism of the present invention
The microorganism of the present invention belongs to the genus Pestalothia, and is characterized by having an ability to produce 10-DAB.
[0013]
As a specific example of the microorganism of the present invention, a strain newly isolated from the inner bark of the European yew (Taxus @ baccata) cultivated in Ehime University and named "TW-3" may be mentioned. Can be. The strain has the following properties:
[0014]
(1) Morphological characteristics
This strain grows well on malt extract agar medium, potato-dextrose agar (PDA) medium, oatmeal agar medium, and the like.
[0015]
The aerial mycelium is white and has a septum. Its surface is smooth and about 1-3 μm in diameter. The differentiated viable stalk is formed upright on the aerial mycelium from brown to dark black. Its surface is smooth and club-shaped, with its tip bulging to a maximum of about 30 μm.
[0016]
Conidia are arthrospore-type, linked by budding, spindle-shaped or elliptical, and the number of constitutive cells is 5 cells. It has clear, pale black partitions up to a thickness of about 10 μm. The shape is oblong, white to light brown, and the surface is smooth. The central three cells are dark (dark), and the tip cells have 1-4 appendages. The posterior cell has one appendage. The size of the conidia excluding the appendages is about 10-25 × 5-10 μm, the size of the appendages of the tip cells is about 5-15 μm, and the size of the appendages of the posterior cells is about 2 −6 μm.
[0017]
(2) Properties on various media
(2-1) Potato-glucose agar (PDA) medium
The growth is good, and the diameter of the colony after 2 weeks at 25 ° C. is 90 mm. The surface is made of fluffy mycelium and the outer edge is regularly bordered. The development of aerial mycelia is good, and conidium formation is observed in 2 weeks of culture. It has a pale yellowish gray to olive color from the center to the middle, and has an ivory color at the periphery. The formation of a dark brown pigment is partially observed at the center. It has a dark brown color from the center to the middle of the rear surface, and has a grayish white color at the periphery. No soluble dye formation is observed.
[0018]
(2-2) Malt extract agar medium
It is almost the same as the growth situation in the PDA medium.
[0019]
(2-3) Oatmeal agar medium
It is almost the same as the growth situation in the PDA medium.
[0020]
(2-4) Plain agar medium (2% agar medium)
It is almost the same as the growth situation in the PDA medium.
[0021]
(3) physiological properties
The growth conditions of this strain were examined on a PDA medium. The growth temperature range is 4-30 ° C and the growth pH range is 4-10. The optimal temperature range is 20-25 ° C, and the optimal pH range is 5-9.
[0022]
Based on the mycological properties described above, the incomplete fungus Pestalotia de de Not. (Rem Accad. Sci., Torino 2,3: 80, 1839; Guba, 1932, 1961; Steyaert, 1949, 1955, 1956; Sutton, 1969; Dube, Alba, Walt. 1986); Smith @ G. , {Microbial} Classification, {G. C. Ainsworth and P. H. A. {Sneath} ed. , {Cambridge} Univ. {Press, {Cambridge} (1962), {p. 111 and "Illustrations of Plant Pathogenic Fungi", edited by Yoshio Kobayashi, Ken Katsumoto, Kazuo Abiko, Yasuhisa Abe, Makoto Kakishima, published by The National Rural Education Association, 1992, p. When 567 was searched, this strain was determined to belong to the species of Pestalozia with Pestalozia pezoides @ de @ Not. As a reference species. However, there has been no report that Pestallotia bacterium has 10-DAB-producing ability, and this strain is distinguished from known Pestallotia strains in that it has such 10-DAB-producing ability. Therefore, the present inventor has identified this strain as a new strain belonging to the incomplete fungus genus Pestalozia.
[0023]
This strain was deposited on August 27, 2002 at 1-1-3 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref., National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Microorganisms Depositary Center under the designation of microorganism "TW-3". The deposit number is “FERM @ P-18985”.
[0024]
The above-mentioned TW-3 strain was obtained from the inner bark of the European yew, but the present inventors, including the European yew, the Pacific yew (Taxus brevifolia), the Japanese yew (Taxus cuspidata), and the caraboku (Taxus cuspidata). var. {nana} Rehder) and other various strains of the genus Pestalothia besides the above-mentioned TW-3, and also has a 10-DAB-producing ability similarly to TW-3. We have confirmed that the strain is present. Therefore, the microorganism of the present invention includes microorganisms that are isolated from such various Yew trees, belong to the genus Pestalothia, and have the ability to produce 10-DAB.
[0025]
It should be noted that the genus Pestalothia can naturally mutate as a general property of microorganisms. In addition, mutation can be induced by ordinary mutation treatment, for example, irradiation with X-rays, γ-rays, ultraviolet rays, etc., treatment with various mutagenic agents, culture on a medium containing the agent, and the like. Even mutants obtained by such a mutation treatment or naturally obtained mutants having 10-DAB-producing ability are included in the present invention.
[0026]
In addition, the present inventors have found that, as a result of the research, among the microorganisms of the present invention, there are microorganisms having not only 10-DAB producing ability but also taxol producing ability and other taxane producing ability. Confirmed by TLC.
[0027]
2. Production of taxanes
The present invention provides a method for producing 10-DAB, which comprises culturing a microorganism belonging to the genus Pestallotsia and having the ability to produce 10-DAB, and collecting 10-DAB produced and accumulated in the culture.
[0028]
In the method of the present invention, the medium used for culturing the microorganism is required to contain a nutrient that can be used by the strain used, and can be appropriately selected from various ordinary ones. The medium may be liquid or solid. In particular, a liquid medium is suitable for culturing a large number of microorganisms.
[0029]
The nutrient to be contained in the medium may be any of ordinary nutrients such as a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance or an organic salt, and a trace nutrient which can be assimilated by the microorganism.
[0030]
Examples of the carbon source include glucose, lactose, sucrose, maltose, dextrin, starch, glycerin, mannitol, sorbitol, fats and oils (such as cottonseed oil, soybean oil, lard oil, and chicken oil), and n-paraffin. .
[0031]
Nitrogen sources include meat extract, yeast extract, malt extract, dried yeast, soy flour, corn steep liquor, peptone, raw soy flour, cottonseed flour, tomato paste, peanut meal, molasses, urea, ammonium salts ( Ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium acetate, etc.).
[0032]
Salts of metals such as sodium, potassium, calcium and magnesium (salts of inorganic acids such as phosphoric acid, boric acid and sulfuric acid, salts of organic acids such as acetic acid and propionic acid) as inorganic substances or organic salts and trace nutrients Salts of trace metals such as iron, manganese, zinc, cobalt and nickel (salts of the same inorganic acids and organic acids as mentioned above).
[0033]
Further, the medium may contain, if necessary, amino acids (glycine, glutamic acid, aspartic acid, alanine, lysine, methionine, propyne, etc.), peptides (dipeptides, tripeptides, etc.), vitamins (vitamin B1, vitamin B2, nicotinic acid, Vitamin B12, vitamin C, etc.), nucleic acids (purines, pyrimidines, derivatives thereof, etc.) and the like.
[0034]
In addition, the medium can be added with acids such as inorganic acids and organic acids, alkalis such as sodium hydroxide, and buffering agents to adjust the pH of the medium. An activator or the like can be added.
[0035]
Various media prepared by blending various nutrient sources for culturing microorganisms are already commercially available, and such a commercially available nutrient medium can be used in the present invention.
[0036]
The microorganism can be cultured by static culture, shaking culture, aeration-agitation culture, or the like. For mass culture, it is desirable to employ so-called deep aeration stirring culture. Culture conditions can be appropriately determined according to the type (composition) of the medium, the type of strain, the culture method, and the like. Generally, the optimal temperature and pH conditions for the microorganism, ie, a temperature of about 20-25 ° C and a pH of about 5-9, are employed, but are not limited thereto. The culturing time is not fixed depending on the above-mentioned medium conditions, culturing conditions and the like, but it is desirable to perform culturing until the production and accumulation of the target taxanes is maximized. In general, for example, in the case of shaking culture using a liquid medium or aeration-agitation culture, it is generally appropriate to set the period to about 7-14 days.
[0037]
The target taxanes are produced and accumulated in the culture solution by culturing the microorganism. The target compound can be collected from the culture solution according to a usual method utilizing the physicochemical properties of the compound. For example, since the target taxane is oil-soluble, by utilizing this property, the target compound can be collected by a common organic solvent extraction means. More specifically, after adding sodium bicarbonate to a culture solution or a culture filtrate, a suitable organic solvent, for example, a halogenated hydrocarbon such as dichloromethane; an ester such as ethyl acetate; a ketone such as methyl ethyl ketone; an alcohol such as isobutyl alcohol , Etc., to extract the desired taxanes. The obtained organic solvent layer is washed with water, dried and concentrated to obtain a crude product containing a desired compound.
[0038]
The crude product obtained above can be further purified to a pure compound.
As the purification means, any of various known means can be adopted. More specifically, examples thereof include adsorption chromatography, molecular sieve chromatography, silica gel column chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC).
[0039]
The obtained target compound can be identified by various physicochemical data, NMR spectrum analysis and the like.
[0040]
Thus, according to the use of the microorganism of the present invention, a large amount of taxanes (10-DAB) can be easily and stably obtained in a very short time as compared with the cultivation of trees, and the purification thereof can be performed. Simpler than that of plant origin.
[0041]
In particular, 10-DAB obtained by the present invention has a strong anticancer effect on various cancer cells and is useful as a raw material for synthesizing taxol, which has already been approved as an anticancer agent. In addition, it has been reported that taxol has a higher anticancer property than taxol, and taxol analogs (Q. Cheng, T. Oritani, T. Origuchi, Tetrahedron, 56, 1667-1669) which are expected to be used as anticancer agents (Q. 2000)) and compounds in which xylose is bonded to the 7-position of taxol (Matthew Suffness, "" TAXOL Science and applications "," CRC Press, "New York," 1995, pp. 317-375). Furthermore, by utilizing this as an immunizing antigen, an antibody that selectively recognizes taxanes, in particular, a monoclonal antibody can be produced, and the antibody can be used, for example, in a sample such as a plant extract or a tissue culture. It is useful for detecting and quantifying taxanes and for purifying taxanes from the sample.
3. Manufacture of taxol
The synthesis of taxol from the taxanes obtained according to the method of the present invention, that is, taxol from 10-DAB is carried out, for example, by the above-mentioned known method, that is, a method of opening a β-lactam at the hydroxyl group at the 13-position of 10-DAB (Non-Patent Document 1), a method of linking the hydroxyl group at the 13-position of 10-DAB and the carboxylic acid of the phenyl isoserine side chain by esterification (see Non-Patent Document 2), and the like.
[0042]
In addition, various semi-synthetic methods other than the above have already been reported, and these reports can be followed (for example, J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 5917-5919; Tetrahedron Letters, Vol. $ 33, $ No. $ 36, $ pp. $ 5185-5188, $ 1992, etc.).
[0043]
The obtained taxol has a strong anticancer effect on various cancer cells, and is particularly useful as an anticancer agent for breast cancer, ovarian cancer, gastric cancer and the like.
[0044]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In addition,% in each example is based on weight (w / w%) unless otherwise specified.
[0045]
[Example 1] Screening of Pestallotia spp.
(1) Yew tree sample
The stems of European yew (Taxus @ baccata), Pacific yew (Taxus @ brevifolia), Japanese yew (Taxus @ cuspidata) and caraboku (Taxus @ cuspidata @ var. @ Nana @ Rehder) were used as samples.
[0046]
(2) Medium for culturing microorganisms
As the medium, a PDA medium prepared as follows was used. That is, 200 g of the peeled potato is finely chopped, distilled water is added, steamed for about 1 hour, crushed and steamed for about 15 minutes, filtered with gauze, and 20 g of glucose is added to the obtained filtrate. After adding distilled water to 1 L, the pH was adjusted to 5.6 with 0.1N HCl. 20 g of agar was dissolved in this, sterilized by high pressure in an autoclave (121 ° C., 20 minutes), and dispensed 10 mL each in a sterilized petri dish having a diameter of 9 mm.
[0047]
(3) Sterilization of sample and implantation into culture medium
A sample (branch portion about 30 cm from the tip of the branch, about 1 cm in diameter) collected from the plant was sterilized with a 1% aqueous solution of sodium hypochlorite (antiformin) for 10 minutes. After sterilization, the sample was placed in a clean bench and washed three times with sterile water. The stem of the sample was cut into 0.5 cm pieces (leaves were cut off), further cut in half vertically, and placed on a floor so that the cut surface was in contact with the medium. The culture was allowed to stand in a dark place at 25 ° C for 1-2 weeks.
[0048]
(4) Isolation of Pestalotia bacteria
After culturing for 1-2 weeks according to (3), the microflora (Pestalottia) forming black spores growing on the petri dish is scraped, transferred to a freshly prepared PDA medium, and passaged for purification. did. The subculture was carried out by inoculating, using a platinum loop, a fungus (cultured for 2 weeks) spread over the Petri dish into a Petri dish into which a PDA medium was dispensed in a clean bench, followed by culturing in a dark place at 25 ° C for 2 weeks. After the final culture, the petri dish was sealed with a paraffin film (trade name “Parafilm”) and stored in a refrigerator.
[0049]
In accordance with the above, three species of P. stallotia were isolated from the yew tree and named "WT-1," "WT-2," and "WT-3," respectively.
[0050]
The resulting P. WT-3 (FERM @ P-18985) had the above-mentioned morphological characteristics, properties and physiological properties on a PDA medium. FIG. 1 shows the results of microscopic photography of the conidium.
[0051]
[Example 2] Culture of Pestallotia
(1) Liquid culture
An improved M1D medium prepared in the composition shown in Table 1 below was used for cultivation of Pestarocia.
[0052]
[Table 1]
[0053]
In a clean bench, 500 mL of the improved M1D medium was dispensed into a 2 L culture flask, and the subcultured and purified Pestalotsia bacteria (cultured in a petri dish for 2 weeks) in Example 1 were cultured in a cork borer having a diameter of 5 mm. Five punches were added. Thereafter, a cotton plug was attached, and the mixture was allowed to stand and cultured at 25 ° C in a dark place for 3 weeks.
[0054]
(2) Extraction of taxanes from medium
After the culture in the above (1), the cells were separated into the culture cells and the culture filtrate using a Buchner funnel. After 0.125 g (per 500 mL of the culture filtrate) of sodium bicarbonate was added to the culture filtrate, the mixture was separated with 250 mL of dichloromethane. This operation was performed twice to obtain a dichloromethane-soluble portion.
Further, the aqueous layer was separated with 250 mL of ethyl acetate. This operation was performed twice to obtain an ethyl acetate-soluble portion. Each soluble portion was concentrated under reduced pressure to obtain a dichloromethane extract and an ethyl acetate extract. Each of the obtained extracts was sufficiently dried over diphosphorus pentoxide in a vacuum dryer under reduced pressure.
[0055]
Example 3 Identification of taxanes
(1) Quantification of taxol in extract by immunoassay
Taxol in the dichloromethane extract was quantified using a commercially available taxol immunoassay kit (Hawaii Biotechnology Group, INC., Taxol Immunoassay kit, Catalog No. TA02).
[0056]
The results are shown in FIG. 2 (vertical axis: taxol production (μg / L), horizontal axis: types of cultured bacteria (TW-1, ΔTW-2, ΔTW-3)).
[0057]
From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the TW-3 bacterium produces the largest amount of taxol. Since this immunoassay has high analytical accuracy and high specificity of antigen-antibody reaction, it was considered that the obtained result was not affected by contamination of other taxanes. Since it is said that certain taxanes are also detected, the following TLC analysis and LC / MS analysis were performed for the detection of the taxanes.
[0058]
(2) TLC analysis of extract
Each extract obtained in Example 2 was dissolved in 1 mL of methanol, and spotted on a thin-layer chromatography plate. In addition, a 1 mg / mL methanol solution of each of taxol and 10-DAB was spotted as a standard. As a developing solvent, chloroform: methanol = 9: 1 (v / v) was used. After the development, spots were confirmed by ultraviolet absorption, and then colored with 1% vanillin sulfate to detect taxanes.
[0059]
The results are shown in FIG.
[0060]
FIG. 3 is a diagram showing the results of TLC analysis performed on the taxol standard, the dichloromethane extract and the ethyl acetate extract obtained in Example 2, and the 10-DAB standard, and lane 1 shows the taxol standard. Lane 2 shows the result of the dichloromethane extract, lane 3 shows the result of the ethyl acetate extract, and lane 4 shows the result of the 10-DAB standard.
[0061]
From the results shown in the figure, it was found that neither the dichloromethane extract nor the ethyl acetate extract confirmed spots exhibiting ultraviolet absorption and color reaction at the same position as that of taxol (Rf value, see lane 1). (See lanes 2 and 3). Further, in the dichloromethane extract (lane 2), two spots showing the coloration of taxanes were confirmed. Furthermore, for the ethyl acetate extract (lane 3), the presence of a spot showing the same color reaction at the same Rf value as 10-DAB (see lane 4) was confirmed.
[0062]
These facts revealed that the amount of taxol in the tested TW-3 culture was below the detection limit, whereas 10-DAB and other taxanes were produced and accumulated.
[0063]
(3) Analysis of extract by LC / MS
Each extract obtained in Example 2 was dissolved in an appropriate amount of methanol, passed through a filter, and then subjected to LC / MS analysis under the following conditions.
LC conditions (column: SUPELCOSIL TM-LC-F; UV wavelength: 227 nm; flow rate: 1.5 mL / min; developing solvent: acetonitrile: tetrahydrofuran: water = 17:28:55 (v / v))
MS conditions (Source setting: Spray tip potential 3602.97; API interface setting: Nozzle potential 80.8; Skimmer 1 potential 12.01; Quadrupole DC potential 7.69; Defrection voltage 0.49; Einzel lens potential -35.01 Quadrupole RF virtage ｏｌQuadrupole template 200.01; Nozzle template 200.01; Analysissetting: Push pulse potential 656.13; P ll pulse potential 1399.99; Detecter voltage 1849.69; Spectrum acquision setting: First mass 250.00; Last mass 1000.00)
As a result, in the case of the dichloromethane extract and the ethyl acetate extract, in the TIC chart showing the LC analysis results, as compared with the result of the standard similarly performed using the taxol standard (1 mg / mL), The same peak was not observed, which suggested that taxol was substantially absent in each extract.
[0064]
Also, in the chart showing the results of the MS analysis, no mass peak (m / Z = 854) at which a proton was added to taxol was observed. However, this result was based on the fact that the taxol content in each extract was too low, and a peak was observed in the same test separately performed on the high-concentration extract.
[0065]
As for the ethyl acetate extract, as a result of MS analysis, the mass peak of 10-DAB (M++ H = 545) was observed, consistent with that in the 10-DAB standard. On the other hand, regarding the dichloromethane extract, a mass peak (m / Z = 641) suggesting xyloside of the taxanes was observed by MS analysis.
[0066]
(4) HPLC analysis of extract
The ethyl acetate extract obtained in Example 2 was dissolved in 2 mL of methanol, and after passing through a filter, 5 μl of the extract was injected into a sample tube, and subjected to HPLC analysis under the following conditions. The same test was performed on a 10-DAB sample dissolved in methanol.
[0067]
Identification of 10-DAB was performed by matching retention time with the sample and by spanking.
<HPLC conditions>
Column: SUPELCOSIL ™ -LC-F; UV wavelength: 227 nm; flow rate: 1.5 mL / min; mobile phase: acetonitrile: tetrahydrofuran: water = 17: 28: 55 (v / v)
The results (HPLC chart) are shown in FIG. In FIG. 4, the upper row shows the results of the 10-DAB standard, and the lower row shows the results of the ethyl acetate extract. The peak indicated by the arrow is 10-DAB (10-deacetylbaccatin III).
[0068]
As shown in the figure, the peak having a retention time corresponding to 10-DAB in the ethyl acetate extract coincided with that of the 10-DAB standard. They were also confirmed to be the same by spanking. From this, it became clear that 10-DAB was present in the ethyl acetate extract.
[0069]
Furthermore, as a result of quantifying the 10-DAB using a calibration curve prepared in advance, it was found that the TW-3 bacterium produced about 0.15 mg / L of 10-DAB.
[0070]
(5) Isolation of 10-DAB by large-scale culture of ΔTW-3 bacteria
In the same manner as in (1) and (2) of Example 2, 8.2 g of a dichloromethane extract and 10.2 g of an ethyl acetate extract were obtained from a culture solution (50 L) in which TW-3 bacteria were cultured.
[0071]
The obtained ethyl acetate extract was purified by silica gel column chromatography (chloroform: methanol = 50: 1, # 30: 1, # 10: 1 and 5: 1 (v / v)). While monitoring by TLC (chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)), a fraction containing 10-DAB was obtained. This fraction was subjected to preparative TLC (chloroform: methanol = 9: 1 (v / v)) to obtain 6.1 mg of 10-DAB (melting point: 243-246 ° C. (decomposition)).
[0072]
The fact that the compound thus isolated was 10-DAB was confirmed by the fact that the melting point of the compound was the same as that of the 10-DAB sample, and that no decrease in the melting point was observed in the melting test.
[0073]
【The invention's effect】
According to the present invention, a 10-DAB-producing microorganism and a method for producing 10-DAB by culturing the microorganism are provided. The 10-DAB is useful, for example, as a synthetic intermediate for taxol having an anticancer effect.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the results of microscopic photographing of conidia of the microorganism TW-3 of the present invention.
FIG. 2 is a graph showing the results of quantifying taxol in a dichloromethane extract of a culture obtained by culturing the microorganism of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing the results of TLC analysis performed on a taxol standard, a dichloromethane extract and an ethyl acetate extract obtained in Example 2, and a 10-DAB standard.
FIG. 4 is a graph showing the results of HPLC analysis of a culture extract obtained by culturing the microorganism of the present invention obtained according to (3) of Example 3.