JP2003534022A - Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療に有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高アフィニティー中和ｍＡｂから由来のキメラ、ヒト化および他のＲＡＮＫ−ＬｍＡｂ、それらを含有する医薬組成物、治療および診断方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、ＲＡＮＫリガンドにより介在される症状の治療および診断
に有用な抗体に、さらに詳細には、ｍＡｂ、改変、Ｆａｂ、キメラおよびヒト化
抗体に関する。

【０００２】 （従来技術） ＲＡＮＫ−Ｌは腫瘍壊死スーパーファミリーの一の構成員である。 ヒトＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）は、免疫系、骨の発育およびホメオス
タシスの重要な調節物質であることが知られている腫瘍壊死因子ファミリーの蛋
白の一の構成員である（Andersonら、Nature 390：175-179、1997）。このリガ
ンドはまた、腫瘍壊死因子関連の活性化誘発のサイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）（
Wongら、J.Exp.Med. 186：2075、1997）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰ
ＧＬ）（Laceyら、Cell 93：165、1998）および破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）（Y
asudaら、Proc.Natl.Acad.Sci. 95：3597、1998）と称される。腫瘍壊死因子フ
ァミリーの構成員は、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化などの多様な、
時に正反対の生物学的応答を媒介する。今日まで記載されているＴＮＦファミリ
ーのリガンドのさらなる構成員として、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０Ｌ
、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＯＸ
４０Ｌ、ＴＮＦａ、Ｔｒａｉｌ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＴＷＥＡＫが挙げられる（
Wongら、J.Leukocyte Biol.：65 715、1999およびKwonら、Curr Opin Immunol 1
1：340、1999を参照のこと）。これらの他のリガンドのうち、ＲＡＮＫＬは、Ｃ
Ｄ４０Ｌと最大の相同性を共有する（細胞外領域にて約２８％の同一性を有する
）。

【０００３】 ＴＮＦリガンドファミリーの他の構成員と同様に、ＲＡＮＫ−Ｌは、ショート
細胞質テイルと、ＲＡＮＫ−Ｌ受容体、すなわちＲＡＮＫのための結合部位を含
む、細胞外ＴＮＦ核ドメインとを有するＩＩ型膜蛋白として発現される。その受
容体結合ドメインは蛋白分解的に切断され、一定の距離にある受容体の機能を刺
激することが可能な、可溶性ＲＡＮＫＬを放出することができる。この切断はメ
タロプロテアーゼの阻害剤により遮断され、精製されたＴＮＦアルファ変換酵素
（ＴＡＣＥ）が切断を誘発することができる。このことはこのプロセシングがＴ
ＡＣＥにより、あるいは類似する酵素により媒介されることを示唆する（Lumら
、J.Biol.Chem. 274：13613、1999）。ＲＡＮＫ−Ｌは活性化されたＴ−細胞、
活性化された骨芽細胞および骨髄間質細胞上で発現され、免疫系生態学と骨生態
学とを関連付ける。生化学的な証拠はＲＡＮＫ−Ｌがグリコシル化されているこ
とを示している。細胞質テイルはＳＨ３ドメイン含有蛋白のためのドッキング部
位として働きうるモチーフを有し、したがって受容体との結合の際に逆シグナル
化を媒介する可能性がある。

【０００４】 ＲＡＮＫ−Ｌの受容体 ＲＡＮＫ−Ｌについての２つの受容体、ＲＡＮＫおよびＯＰＧが同定された。
ＲＡＮＫはＣＤ４０と最も関連しているＴＮＦ受容体ファミリーの構成員である
（Andersonら、Nature 390：175、1997）。ＲＡＮＫは、１８４個のアミノ酸の
細胞外ドメイン、貫膜ドメインおよび３８３個のアミノ酸のラージ細胞質ドメイ
ンを有する６１６個のアミノ酸のＩ型膜受容体である。ｍＲＮＡとして広範囲に
わたって発現するが、ＲＡＮＫ蛋白の細胞表面での発現は脾臓、リンパ節および
骨髄由来の樹状細胞および破骨細胞先祖細胞に限定されるようである（Wongら、
J.Exp.Med., 186：2075、1997；Andersonら、Nature 390：175、1997；laceyら
、Cell 93：165、1998）。ＴＮＦ受容体ファミリーの多くの構成員と同様に、Ｒ
ＡＮＫの細胞質ドメインはＴＮＦ−受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られて
いるアダプター分子との相互作用を介してシグナル変換を媒介していると考えら
れる。ＴＲＡＦは、順次、ＮＦ−ｋＢおよびミトゲン−誘発の蛋白キナーゼ（Ｍ
ＡＰＫ）、例えば、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端蛋白キナーゼ（ＪＮＫ）および細胞外
シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）などのいくつかの異なる経路を活性化する。こ
れらの異なるシグナル変換経路は、多方面にわたり、細胞生存シグナル、アポト
ーシス、分化、サイトカイン分泌および／または細胞活性化を媒介している。し
たがって、ＲＡＮＫ−ＬとＲＡＮＫの相互作用は、免疫機能および骨ホメオスタ
シスの制御において一の重要な役割を果たしている可能性がある。生化学的およ
び遺伝学な遺伝子ノックアウトの研究により、ＴＲＡＦ−６ならびにＴＲＡＦ−
２およびＴＲＡＦ−５もまた、ＲＡＮＫの細胞質領域と結合するこのファミリー
の主たる構成員であることがわかる。

【０００５】 第２の同定されたＲＡＮＫ−Ｌ受容体がオステロプロテゲリン（ＯＰＧ）であ
り、それは貫膜領域を欠き、ＲＡＮＫ−Ｌとその同族細胞表面受容体ＲＡＮＫの
間のシグナル化を遮断するように作用する可溶性デコイ受容体ＲＡＮＫとして機
能するようである。ＯＰＧは骨吸収の強力な阻害剤であることが知られており、
インビトロおよびインビボにてＲＡＮＫ−Ｌ介在破骨細胞形成を阻害することが
できる（Laceyら、Cell 93：165、1998；Yasudaら、PNAS 95：3597、1998；Tomo
yasuら、Biochem.Biophys.Res.Commun. 245：382、1998；TsudaおよびHigashio
、Nippon Rinsho 56：1435、1998）。ＯＰＧはまたＴＮＦリガンドのＴＲＡＩＬ
と結合する（Emeryら、J.Biol.Chem. 273：14363、1998）。

【０００６】 樹状細胞生態学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割 成熟骨髄樹状細胞および脾臓樹状細胞はその細胞表面上で高レベルのＲＡＮＫ
を発現し、このことはＲＡＮＫ−Ｌが樹状細胞生態学の制御において中心的な役
割を果たしていることを示唆する（Wongら、J.Exp.Med.、186：2075、1997）。
ＲＡＮＫ−Ｌの一の主たる作用は、おそらく、十分に研究されているアポトーシ
スのサプレッサーである、Ｂｃｌ−ｘＬをアップレギュレートさせて、成熟樹状
細胞の生存率を向上させることである（Wongら、J.Exp.Med.、186：2075、1997
）。ＤＣ生存率の向上は、抗原／ＭＨＣ複合体および共同刺激性細胞、例えば、
Ｂ７−１およびＢ７−２の刺激表示を伸ばすことにより、順次、Ｔ細胞増殖応答
の強化をもたらすことができる（Wongら、J.Exp.Med.、186：2075、1997）。Ｒ
ＡＮＫ−Ｌによる樹状細胞の刺激はまた、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１お
よびＩＬ−６などの数種のサイトカイン遺伝子の転写を誘発することも知られて
いる（Wongら、J.Leukocyte Biol. 65：715、1999）。これらのサイトカインは
免疫応答の強度および型を制御する。ＣＤ４０Ｌのノックアウト実験において、
ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ経路が残りのウイルス耐性を媒介する（Bachmanら、J.Exp
.Med. 189：1017−1020）。また、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫのノックアウトマウス
はリンパ節器官形成の機能を欠いており、ＢおよびＴ細胞の初期発生にていくつ
かの欠損を示す（Kongら、Nature 397：315、1999；Dougallら、Genes and Deve
lopment 13：2412、1999；Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97：1566、2000）。この
ように、ＲＡＮＫ−Ｌは、免疫系の発生において、および免疫応答の特性および
強度の制御において一の役割を果たしているようである。

【０００７】 骨生態学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割 ＲＡＮＫ−Ｌは破骨細胞の発生および活性化のための重要な分化因子であり、
それ自体が骨ホメオスタシスおよびカルシウム代謝を維持するのに主たる役割を
果たしている。ＲＡＮＫ−Ｌは骨吸収性破骨細胞の脊髄前駆体からの分化を刺激
することができる（Laceyら、Cell 93：165、1998；Yasudaら、PNAS 95：3597、
1998）。このように、ＲＡＮＫ−ＬおよびＲＡＮＫのノックアウトマウスは、破
骨細胞の分化機能を完全に欠くため、重度の骨石化症を有すると特徴付けられた
（Kongら、Nature 397：315、1999；Dougallら、Genes and Development 13：24
12、1999；Liら、Proc.Natl.Acad.Sci. 97：1566、2000）。さらには、トランス
ジェニックマウスにおけるＲＡＮＫ−Ｌデコイ受容体ＯＰＧの組織的過剰発現も
、可溶性ＲＡＮＫドメイン外蛋白の組織的投与（Fullerら、J.Exp.Med. 188：99
7、1998）と同様に、骨石化症を発症することが判明した（Simonetら、Cell 89
：309、1997）。ＲＡＮＫ−Ｌはまた破骨細胞を刺激し、成熟破骨細胞の運動性
、拡張および生存率の増加をもたらす。この刺激は、破骨細胞の活性化により、
順次、より効果的な骨吸収をもたらす。かくして、骨ホメオスタシスは、少なく
ともいくらかはＲＡＮＫ−ＬとＯＰＧの発現の均衡に依存しているようである。
したがって、骨の疾患は、ＲＡＮＫ−Ｌの作用を亢進または減衰させることによ
り治療することができる。例えば、Ｔ細胞を活性化することでＲＡＮＫＬの発現
がアップレギュレートされ（Josienら、J.Immunol 162：2562-2568、1999；Kong
ら、Nature 402：304-309、1999）、ポリクローナル活性化されたｃｔｌａ４ノ
ックアウトマウスから由来のＴ細胞はｒａｇノックアウトマウスへの養子免疫伝
達により骨喪失を誘発するが、それはＯＰＧを投与することで阻害される（Kong
ら、Nature 402：304-309、1999）。また、ラットにおけるアジュバント誘発の
関節炎において、ＯＰＧ蛋白の投与は、炎症性反応に影響を及ぼすことなく、骨
および軟骨喪失を阻害する（Kongら、Nature 402：304-309、1999）。

【０００８】 要約すれば、ＲＡＮＫとＲＡＮＫ−Ｌのライゲーションは、骨髄における破骨
細胞の分化、または骨吸収の亢進および免疫応答の強化に至る、リンパ器官にお
ける樹状細胞の生存およびサイトカインの産生をもたらす。したがって、ＲＡＮ
Ｋ−Ｌは免疫系障害および骨ホメオスタシスの疾患の新規な療法を開発するため
の望ましい標的である。 中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体はヒトにおける病理学的な骨喪失および関連する徴候を
緩和するのに有用でありうる。中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体はまたヒトにおける炎症お
よび自己免疫疾患および関連する徴候を緩和するのに有用である可能性がある。
かくして、当該分野において、ＲＡＮＫ−Ｌ介在の破骨細胞の分化および活性化
ならびにそのような骨疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトＲＡ
ＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体を創製することについて一の要求があ
る。さらに、当該分野において、ＲＡＮＫ−Ｌの介在する免疫応答の強化ならび
にそのような免疫系の疾患および関連する徴候を減少させるであろう、ヒトＲＡ
ＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体などの高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌ
アンタゴニストを創製することについて一の要求がある。アンタゴニストである
ＲＡＮＫＬモノクローナル抗体は、ＴＲＡＩＬなどの他のＴＮＦ関連のリガンド
と相互作用する可能性のあるＯＰＧ蛋白よりもその作用においてより選択的であ
ると考えられる。

【０００９】 （発明の開示） 本発明は、第１の態様において、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的であり、次に記載
されているように結合アフィニティーが約１０^−１０Ｍ以下の解離定数により特
徴付けられる、中和モノクローナル抗体を提供する。このようなモノクローナル
抗体の具体例がマウスモノクローナル抗体２Ａ４である。本発明のもう一つ別の
態様はハイブリドーマ２４１３２Ａ４（２）Ｂ１１である。本発明は、関連する
態様において、本発明の齧歯動物の中和モノクローナル抗体のＦｃ領域を欠失さ
せることで産生されるヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的な中和Ｆａｂフラグメントまた
はそのＦ（ａｂ’）_２フラグメントを提供する。

【００１０】 さらに別の関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは約１０^{− １０} Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナ
ル抗体（ｍＡｂ）から由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、ヒトＲＡＮＫ−
Ｌに特異的な改変抗体およびその抗体をコードする核酸分子を提供する。改変抗
体がヒト化抗体である場合、ヒト以外の生物の免疫グロブリンからの相補性決定
領域（ＣＤＲ）をコードする配列を、第１免疫グロブリンパートナーの少なくと
も１つの、好ましくはすべての相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト以外の生物のモ
ノクローナル抗体から由来のＣＤＲによって置き換えられている、その第１免疫
グロブリンパートナーに挿入する。その上、第１免疫グロブリンパートナーは、
免疫グロブリン定常鎖のすべてまたは一部を含む、第２免疫グロブリンパートナ
ーに作動的に連結していることが好ましい。

【００１１】 関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは約１０^−１０Ｍ以下
の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）から由来のＣＤＲおよびかかるＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。 もう一つ別の態様において、ヒト重鎖および軽鎖定常領域と、ヒトＲＡＮＫ−
Ｌでは約１０^−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中
和モノクローナル抗体から由来の重鎖および軽鎖可変領域とを含有する、キメラ
抗体が提供される。 さらにもう一つ別の態様において、本発明は、１（またはそれ以上）の上記し
た改変抗体および医薬上許容される担体を含有する、医薬組成物を提供する。

【００１２】 さらなる態様において、本発明は、免疫系または骨の疾患、特に慢性関節リウ
マチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨
溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（
ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減
少症についての、ヒトにおける過剰量のＲＡＮＫ−Ｌに付随する症状の治療方法
であって、ヒトに有効量の本発明の医薬組成物を投与することを特徴とする方法
を提供する。

【００１３】 さらに別の態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌでは１０^−１０Ｍ以下
の解離定数により特徴付けられるヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体（ｍ
Ａｂ）から由来の改変抗体（例えば、操作された抗体、ＣＤＲ、ＦａｂまたはＦ
（ａｂ）_２フラグメントまたはそのアナログ）の組換え体を産生する方法、およ
びその産生に有用な成分を提供する。これらの成分は、その成分をコードする単
離された核酸配列、および組換えプラスミドであって、選択された制御配列の下
で、その組換えプラスミドをトランスフェクトした宿主細胞（好ましくは哺乳動
物細胞）にてその発現を指令する能力を有する、その核酸配列を含有する組換え
プラスミドを包含する。この産生方法は、改変抗体、好ましくはヒト化抗体が該
細胞にて発現されるような条件下で本発明のトランスフェクトされた宿主細胞系
を培養し、その発現産物をそこから単離することを含む。

【００１４】 本発明のさらにもう一つ別の態様は、ヒトにおいて、Ｔｈ１Ｔ細胞の過剰な活
性または破骨細胞の発生および活性化に付随する症状、特に慢性関節リウマチ（
ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解ま
たは骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤ
Ｍ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を
診断する方法であって、患者から由来の生物学的流体の試料を得、ＲＡＮＫ−Ｌ
／抗体（モノクローナルまたは改変抗体）の複合体が形成されるような条件下で
本発明の抗体および改変抗体をかかる試料と接触させるようにし、そのＲＡＮＫ
−Ｌ／抗体の複合体の有無を検出することを含む方法である。 本発明の他の態様および利点を、以下の記載およびその好ましい具体例に詳述
する。

【００１５】 （発明を実施するための最良の形態） 表Ｉはマウス抗体２Ａ４の軽鎖可変領域のｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列（
各々、配列番号：１および２）を示す。囲まれている領域（表Ｉのボックス内）
は３つのＣＤＲ（配列番号：５、６および７）およびそのＣＤＲをコードする各
ポリヌクレオチド（配列番号：１３、１４および１５）を示す。太字領域は縮重
プライマー配列（配列番号：１１）を示す。

【００１６】 表Ｉ

【表１】

【００１７】 表ＩＩはマウス抗体２Ａ４の重鎖可変領域のｃＤＮＡおよび推定アミノ酸配列
（各々、配列番号：３および４）を示す。囲まれている領域（表ＩＩのボックス
内）は３つのＣＤＲ（配列番号：８、９および１０）およびそのＣＤＲをコード
する各ポリヌクレオチド（配列番号：１６、１７および１８）を示す。太字領域
は縮重プライマー配列（配列番号：１２）を示す。

【００１８】 表ＩＩ

【表２】

【００１９】 本発明は、その可変軽鎖および重鎖領域を表ＩおよびＩＩに示す、マウスモノ
クローナル抗体２Ａ４に例示されるように、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ結合特異性、中和
活性およびヒトＲＡＮＫ−Ｌとの高アフィニティーにより特徴付けられる、種々
の抗体、改変抗体およびそれらのフラグメントを提供する。本発明のモノクロー
ナル抗体を従来のハイブリドーマ技法により調製し、新規な中和抗体を生成した
。本発明の抗体はＲＡＮＫ−Ｌ介在障害、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、
骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関
節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎
症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を治療する
ための治療用および医薬用組成物に有用である。この生成物はまた、ヒトにおけ
る外因的ＲＡＮＫ−Ｌレベルまたは活性化細胞からエクスビボにて放出されるＲ
ＡＮＫ−Ｌを（例えば、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）で）測
定することにより、ＲＡＮＫ−Ｌ介在症状を診断するのに有用である。

【００２０】 Ｉ．定義 「抗体」は、モノクローナル抗体、改変抗体、ヒト化抗体、操作された抗体お
よびキメラ抗体を包含するが、これらに限定されない。 「モノクローナル抗体」とは、ポリクローナル抗体と反対のものであり、慣用
的なハイブリドーマ技法、ファージ表示コンビナトリアルライブラリー、免疫グ
ロブリンチェーンシャフリングおよびヒト化技法により調製することができる、
免疫グロブリンをいう。 「改変抗体」とは、改変免疫グロブリンのコード化領域によりコードされた蛋
白をいい、かかる蛋白は選択された宿主細胞中で発現させることにより得ること
ができる。かかる改変抗体は操作された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体
）あるいは免疫グロブリンの定常領域、例えばＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）_２ などのすべてまたは一部を欠いている抗体フラグメントである。 「改変免疫グロブリンのコード化領域」とは、本発明の改変抗体をコードする
核酸配列をいう。改変抗体がＣＤＲ−グラフトまたはヒト化抗体である場合、第
１免疫グロブリンパートナーを含むヒト可変フレームワーク配列がヒト以外の生
物の免疫グロブリンから由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列と置
き換えられている。所望により、第１免疫グロブリンパートナーは第２免疫グロ
ブリンパートナーと作動的に結合していてもよい。

【００２１】 「第１免疫グロブリンパートナー」とは、未変性（または天然に存在する）Ｃ
ＤＲ−コード化領域がドナー抗体のＣＤＲ−コード化領域により置き換えられて
いるところの、ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリンの可変領域をコー
ドする核酸配列をいう。ヒト可変領域は免疫グロブリンの重鎖または軽鎖（また
は両鎖）、そのアナログあるいは機能的フラグメントとすることができる。抗体
（免疫グロブリン）の可変領域内にあるかかるＣＤＲ領域は、当該分野にて既知
の方法により決定することができる。例えば、Kabatら（Sequences of Proteins
of Immunological Interest、第４版、U.S.Department of Health and Human S
ervices、National Institutes of Health（1987））は、ＣＤＲを位置付けるた
めのルールを開示している。加えて、ＣＤＲ領域／構造を同定するのに有用なコ
ンピュータープログラムも知られている。

【００２２】 「中和」とは、ヒトＲＡＮＫ−Ｌとその特異的受容体との結合を妨げることに
より、あるいは結合が生じたとしても、ＲＡＮＫ−Ｌのその受容体を介するシグ
ナル化を阻害することにより、ＲＡＮＫ−Ｌ活性を阻害する抗体をいう。ＲＡＮ
Ｋ−Ｌ中和アッセイにて測定した場合に、ＲＡＮＫ−Ｌ活性を阻害するのにｍＡ
ｂが９０％効果的、好ましくは９５％効果的、最も好ましくは１００％効果的で
あるならば、そのｍＡｂは中和抗体である。 「高アフィニティー」なる語は、光バイオセンサー分析法により測定した場合
に、ヒトＲＡＮＫ−Ｌと１０^−１０Ｍ以下のＫｄにより特徴付けられる結合アフ
ィニティーを有する抗体をいう。 「ヒトＲＡＮＫ−Ｌとの結合特異性」とは、ネズミＲＡＮＫ−Ｌまたは他のＲ
ＡＮＫ−ＬよりもヒトＲＡＮＫ−Ｌとより高いアフィニティーを有することを意
味する。

【００２３】 「第２免疫グロブリンパートナー」とは、第１免疫グロブリンパートナーがフ
レームにて融合するか、または任意の従来のリンカー配列により融合している（
すなわち、作動的に結合した）蛋白またはペプチドをコードするもう一つ別のヌ
クレオチド配列をいう。免疫グロブリン遺伝子であることが好ましい。第２免疫
グロブリンパートナーは、目的とする同じ抗体（すなわち、相同的抗体−第１お
よび第２改変抗体が同じ供給源から誘導されている）または付加的な抗体（すな
わち、異種抗体）のその全体の定常領域をコードする核酸配列を含んでいてもよ
い。免疫グロブリンの重鎖または軽鎖（あるいは単一ペプチドの一部としての両
鎖）であってもよい。第２免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリン種
またはイソ型に限定されるものではない。加えて、第２免疫グロブリンパートナ
ーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）_２に見られるような、免疫グロブリン定常領域の
一部（すなわち、適当なヒト定常領域またはフレームワーク領域の別個の部分）
を含んでいてもよい。かかる第２免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、フ
ァージ表示ライブラリーの一部として、宿主細胞の表面で曝される内在性膜蛋白
をコードする配列、あるいは分析または診断検出のための蛋白、例えば西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードする配列を含んでいて
もよい。

【００２４】 Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）_２なる語は標準的な意味で用いら
れる（例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual、Cold Spring Harb
or Laboratory（1988））。 本明細書中で使用される「操作された抗体」とは、一定の型の改変抗体、すな
わち、選択された受容体の抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの一部が
選択されたエピトープに対して特異性を有する１またはそれ以上のドナー抗体か
ら由来の類似する部分により置き換えられているところの、全長の合成抗体（例
えば、抗体フラグメントとは反対のキメラまたはヒト化抗体）として記載する。
例えば、かかる分子は非修飾軽鎖（またはキメラ軽鎖）と関連するヒト化重鎖に
より特徴付けられる抗体、またはその逆の抗体を包含する。操作された抗体はま
た、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体の軽鎖および／
または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列を変更するこ
とで特徴付けることもできる。これらの抗体はアクセプター抗体からの１または
それ以上のＣＤＲ（好ましくはすべてのＣＤＲ）を本明細書に記載のドナー抗体
からのＣＤＲと置き換えたものとすることができる。

【００２５】 「キメラ抗体」とは、ドナー抗体から由来の天然に存在する可変領域（軽鎖お
よび重鎖）を、アクセプター抗体から由来の軽鎖および重鎖定常領域と組み合わ
せて含有する一の型の操作された抗体である。 「ヒト化抗体」とは、ヒト以外の生物のドナー免疫グロブリンから由来のＣＤ
Ｒを有し、その分子の残りの免疫グロブリン誘導の部分が１の（またはそれ以上
の）ヒト免疫グロブリンから由来している、操作された一の型の抗体をいう。加
えて、フレームワーク支持残基を改変し、結合アフィニティーを保存させること
もできる（例えば、Queenら、Proc.Natl Acad Sci USA、86：10029-10032（1989
）；Hodgsonら、Bio/Technology、9：421（1991）を参照のこと）。

【００２６】 「ドナー抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンのコード化配列を提供し
、ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有する改変抗体の発現が
得られるように、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能的フラグメントあるいは
そのアナログの核酸配列を第１免疫グロブリンパートナーに寄与する、抗体（モ
ノクローナルまたは組換え抗体）をいう。本発明における使用に適する一のドナ
ー抗体は、２Ａ４と称される、ヒト以外の生物の中和モノクローナル抗体である
。抗体２Ａ４はヒトＲＡＮＫ−Ｌと高アフィニティーを有し、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ
特異的（すなわち、ネズミＲＡＮＫ−Ｌを認識しない）である、イソ型ＩｇＧ２
ａ／カッパの中和抗体として定義される。この抗体は、適当なネズミＩｇＧ定常
領域上に、各々、配列番号：１および２の可変軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列；
および各々、配列番号：３および４の可変重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を有す
る。

【００２７】 「アクセプター抗体」なる語は、その重鎖および／または軽鎖フレームワーク
領域および／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードする核酸配列
のすべて（またはいずれかの部分であるが、好ましくはすべてである）を第１免
疫グロブリンパートナーに寄与する、ドナー抗体に対して異種構造を有する抗体
（モノクローナルまたは組換え抗体）をいう。ヒト抗体はアクセプター抗体であ
ることが好ましい。 「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域である、抗体の
相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences
of Proteins of Immunological Interest、第４版、U.S.Department of Health
and Human Services,National Institutes of health（1987）を参照のこと。
免疫グロブリンの可変部には３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ（またはＣＤ
Ｒ領域）がある。かくして、本明細書中で用いる「ＣＤＲ」とは、３つすべての
重鎖ＣＤＲまたは３つすべての軽鎖ＣＤＲ（または、適当ならば、すべての重鎖
およびすべての軽鎖の両方のＣＤＲ）をいう。

【００２８】 ＣＤＲは抗体の抗原またはエピトープとの結合のための接触残基の大部分を提
供する。本発明で目的とするＣＤＲはドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列から
誘導され、そのＣＤＲが誘導されるドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／ま
たは中和能を共有するかまたは保持する、天然に存在するＣＤＲのアナログを包
含する。 抗原結合特異性または中和能を共有するとは、例えば、ｍＡｂ２Ａ４は特定レ
ベルの抗原アフィニティーにより特徴付けることができるが、適当な構造環境下
で２Ａ４の核酸配列によりコードされるＣＤＲはより低いまたはより高いアフィ
ニティーを有するかもしれないことを意味する。にもかかわらず、そのような環
境下で、２Ａ４のＣＤＲは２Ａ４と同じエピトープを認識すると考えられる。２
Ａ４の代表的な軽鎖ＣＤＲは、配列番号：５；配列番号：６；配列番号：７を包
含し、２Ａ４の代表的な重鎖ＣＤＲとして、配列番号：８；配列番号：９；配列
番号：１０が挙げられる。

【００２９】 「機能的フラグメント」とは、フラグメントを誘導した抗体と同じ抗原結合特
異性および／または中和能を保持する、部分的な重鎖または軽鎖可変配列（例え
ば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端で少し欠失した配列
）である。 「アナログ」とは、少なくとも1個のアミノ酸が修飾されたアミノ酸配列をい
い、かかる修飾は化学的であってもよく、あるいは少しの（例えば、好ましくは
１０個以下の）アミノ酸の置換または再配列とすることができる。かかる修飾は
アミノ酸配列が生物学的特性、例えば、非修飾配列の抗原特異性および高アフィ
ニティーを保持することを可能とする。例えば、特定のエンドヌクレアーゼ制限
部位がＣＤＲ−コード化領域の範囲内であるいはその周辺で形成される場合、置
換を介して（サイレント）変異を構築することができる。

【００３０】 アナログはまた、対立遺伝子変形として生成することもできる。「対立遺伝子
変形または修飾」は、本発明のアミノ酸またはペプチド配列をコードする核酸配
列の変化である。かかる変形または修飾は遺伝的コードの縮重によるものであっ
ても、あるいは所望の特性を得るために意図的に操作したものであってもよい。
これらの変形または修飾はコードされたアミノ酸配列に変化を与えても与えなく
てもどちらでもよい。 フラグメント、アナログおよび対立遺伝子変形の概念は「同一性」なる語で表
すこともできる。例えば、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択さ
れる配列と少なくとも９０％、より好ましくは９５％同一である、ポリヌクレオ
チドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する
。

【００３１】 「同一性」は、当該分野で公知であり、配列を比較することで決定されるよう
な、２またはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２またはそれ以上のポリヌク
レオチド配列の間の関係である。また、当該分野では、「同一性」は、場合によ
っては、配列の鎖間の対合によって決定されるような、ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列間の配列の関連性の度合を意味する。「同一性」および「類似
性」は、Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.編，Oxford University
Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects, S
mith, D.W.編，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Seque
nce Data，Part I，Griffin, A.M.およびGriffin, H.G.編，Humana Press，New
Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，Von Heinje,G．Acad
emic Press，1987；およびSequence Analysis Primer，Gribskov,M.およびDever
eux, J.編，M Stockton Press，New York，1991；およびCarillo,HおよびLipman
,D.、SIAM J.Applied Math., 48：1073（1988）に記載されている方法（これら
に限らない）を含め、公知方法により容易に決定することができる。同一性を決
定する好ましい方法は、テストする配列間に最大の対合を与えるように設計され
ている。同一性および類似性を測定する方法は公に入手できるコンピュータ・プ
ログラムに集成されている。２つの配列の間の同一性および類似性を測定する好
ましいコンピュータ・プログラム方法は、GCGプログラムパッケージ（Devereux,
J.ら、Nucleic Acids Research 12（1）：387（1984））、BLASTP、BLASTNおよ
びFASTA（Atschul,S. F.ら、J.Molec.Biol. 215：403−410（1990））を包含す
るが、これに限らない。BLAST XプログラムはNCBIおよび他の供給源（BLAST Man
ual，Altschul, S．ら、NCBI NLM NIH Bethesda，MD２０８９４；Altschul,S．
ら、J．Mol．Biol.，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手でき
る。また、周知のスミス・ウォーターマン（Smith Waterman）アルゴリズムを用
いて同一性を決定することもできる。

【００３２】 ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含す
る： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48：443−453（1970
） 比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 89：
10915−10919（1992）からのBLOSSUM 62 ギャップペナルティー：１２ ギャップ長ペナルティー：４。 これらのパラメーターを用いて有用なプログラムは、Genetics Computer Grou
p, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして公に利用できる。上記パラメ
ーターはペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップ
についてペナルティーを伴わない）。

【００３３】 ポリヌクレオチドの比較のための好ましいパラメーターは以下のものを包含す
る： １）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol. 48：443−453（1970
） 比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０ ギャップペナルティー：５０ ギャップ長ペナルティー：３。 Genetics Computer Group, Madison WI.から「ギャップ」プログラムとして利
用できる。これらは核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。

【００３４】 例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は配列番号：１の対照となる配列と同
じ、すなわち１００％同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較して
ある程度の数までのヌクレオチドの変化を有していてもよい。かかる変化は、少
なくとも１個のヌクレオチドの欠失、置換（トランジションおよびトランスバー
ジョンを含む）または挿入からなる群より選択され、その変化は対照となるヌク
レオチド配列の５’または３’末端の位置あるいはそれらの末端位置の間のどの
位置において生じてもよく、対照となる配列中のヌクレオチドにおいて個々に、
あるいは対照となる配列中の１またはそれ以上の連続した群として散在してもよ
い。ヌクレオチドの変化した数は、配列番号：１中の全ヌクレオチド数と個々の
同一性パーセント値（１００で割ったもの）とをかけて、その積を配列番号：１
中の全ヌクレオチド数から差し引くことにより、あるいは ｎｎ≦ｘｎ−（ｘｎ・ｙ） 式中、ｎｎはヌクレオチドの変化した数であり、ｘｎは配列番号：１中の全ヌク
レオチド数であり、ｙは、例えば、７０％ならば０.７０であり、８０％ならば
０.８０であり、８５％ならば０.８５であり、９０％ならば０.９０であり、９
５％ならば０.９５などであり、ｘｎとｙとの整数でない積は切り捨てにより最
も近い整数とした後、それをｘｎから差し引くことにより、決定される。配列番
号：２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変化は、このコード
化配列中のナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト変異をもたらす可能性
があり、それゆえ、かかる変化に伴ってポリヌクレオチドによりコードされるポ
リペプチドが変化する。

【００３５】 同様に、本発明のポリペプチド配列は配列番号：２の対照となる配列と同じ、
すなわち、１００％同一であってもよく、あるいは対照となる配列と比較してあ
る程度の数までのアミノ酸の変化を有していてもよい（その場合、同一性％は１
００％未満である）。かかる変化は、少なくとも１個のアミノ酸の欠失、置換（
同類または非同類置換を含む）または挿入からなる群より選択され、該変化は対
照となるポリペプチド配列のアミノ−またはカルボキシ−末端の位置あるいはそ
れらの末端位置の間のどの位置において生じてもよく、対照となる配列中のアミ
ノ酸において個々に、あるいは対照となる配列中の１またはそれ以上の連続した
群として散在してもよい。所定の％同一性についてのアミノ酸の変化した数は、
配列番号：２中のアミノ酸の総数と個々の同一性パーセント値（１００で割った
もの）とをかけて、その積を配列番号：２中のアミノ酸の総数から差し引くこと
により、あるいは ｎａ≦ｘａ−（ｘａ・ｙ） 式中、ｎａはアミノ酸の変化した数であり、ｘａは配列番号：２中のアミノ酸の
総数であり、ｙは、例えば、７０％ならば０.７０であり、８０％ならば０.８０
であり、８５％ならば０.８５などであり、ｘａとｙとの整数でない積は切り捨
てにより最も近い整数とした後、それをｘａから差し引くことにより、決定され
る。

【００３６】 「エフェクター剤」なる語は、改変抗体および／またはドナー抗体の天然また
は合成軽鎖または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントが常套手段により
結合しうる非蛋白キャリア分子をいう。かかる非蛋白キャリアは、診断の分野に
て使用される通常のキャリア、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビ
ーズ、例えば、ＢＩＡコア（ファルマシア）系にて用いられるような多糖類、あ
るいは医薬の分野にて、さらにはヒトおよび動物に安全に投与するために有用な
他の非蛋白物質を包含しうる。他のエフェクター剤は重金属原子または放射性同
位元素をキレートするためのマクロサイクリルを包含しうる。かかるエフェクタ
ー剤、例えばポリエチレングリコールはまた、改変抗体の半減期を伸ばすのに有
用でありうる。

【００３７】 ＩＩ．高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌモノクローナル抗体 本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントを構築するのに用いるために、ヒ
ト以外の種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、齧歯動物（例えば、ネズ
ミおよびラット）など）を利用し、未変性ヒトＲＡＮＫ−Ｌまたはそのペプチド
エピトープと一緒に表示して望ましい免疫グロブリンを生成することができる。
一般的なハイブリドーマ技法を利用してヒト以外の生物のｍＡｂ ＲＡＮＫ−Ｌ
を分泌するハイブリドーマ細胞系を生成する。ついで、かかるハイブリドーマを
、実施例のセクションに記載されるように、９６−ウェルプレートにコーティン
グしたＲＡＮＫ−Ｌを用いるか、あるいはまた、ストレプタビジンをコーティン
グしたプレートに結合したビオチニル化ＲＡＮＫ−Ｌを用いて、結合についてス
クリーニングする。

【００３８】 本発明の一の具体例である高アフィニティー中和抗体が、以下の実施例により
詳細に記載されている、キメラまたはヒト化抗体の形成に用いることができる、
ｍＡｂ２Ａ４（その重鎖および軽鎖可変領域を表ＩおよびＩＩに示す）、マウス
抗体である。２Ａ４ｍＡｂは約Ｋｄ１０^−１０ＭのヒトＩＬ−１ＲＡＮＫ−Ｌと
の抗原特異性により特徴付けられる。このｍＡｂはイソ型ＩｇＧ２ａ／カッパで
あることで特徴付けられる。 本発明は２Ａ４またはその超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定され
るものではない。ヒトＲＡＮＫ−Ｌおよび対応する抗−ＲＡＮＫ−ＬＣＤＲとの
約１０^−１０Ｍ以下の解離定数により特徴付けられる他の適当な高アフィニティ
ーＲＡＮＫ−Ｌ抗体を代わりに用いることもできる。以下の記載において、ドナ
ー抗体が２Ａ４として同定されている場合にはいつも、この明示は説明のためで
あって、単に記載を簡単にするためのものである。

【００３９】 ＩＩＩ．抗体フラグメント 本発明はまたヒトＲＡＮＫ−Ｌに対向するｍＡｂから由来のＦａｂフラグメン
トまたはＦ（ａｂ）_２フラグメントの使用を包含する。これらのフラグメントは
、ＲＡＮＫ−ＬおよびＴｈ１Ｔ細胞介在症状を拮抗するインビボでの保護剤とし
て、あるいは特に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性およ
び原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫
疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多
発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症の、インビトロにおけるＲＡＮＫ−Ｌ診断
薬の一部として有用である。Ｆａｂフラグメントは軽鎖全体および重鎖のアミノ
末端部を含有し；Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは２個のＦａｂをジスルフィド結
合により結合させることにより形成されるフラグメントである。ｍＡｂ２Ａ４お
よび他の類似する高アフィニティーのＲＡＮＫ−Ｌ結合抗体はＦａｂフラグメン
トおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントの供給源を提供し、それらは、例えば、そ
のｍＡｂを適当な蛋白分解酵素、パパインおよび／またはペプシンを用いて切断
する、常套手段により、あるいは組換え技法により得ることができる。これらの
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントは、それ自体が治療薬、予防薬または
診断薬として有用であり、また可変領域および本明細書に記載の組換え体または
ヒト化抗体の形成に有用なＣＤＲ配列を含む配列のドナーとして有用である。

【００４０】 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントはコンビナトリアルファージライブ
ラリー（例えば、Winterら、Ann.Rev.Immunol.、12：433-455（1994）を参照の
こと）を介して、あるいは免疫グロブリンチェーンシャフリング（例えば、Mark
sら、Bio／Technology、10：779-783（1992）を参照のこと、この両方を出典明
示により本明細書の一部とする）を介して構築することができ、この場合、選択
された抗体（例えば、２Ａ４）から由来のＦｄまたはＶ_Ｈ免疫グロブリンが軽鎖
免疫グロブリンのレパートリー、Ｖ_Ｌ（またはＶ_Ｋ）と結合し、新規なＦａｂが
形成される。反対に、選択された抗体から由来の軽鎖免疫グロブリンが重鎖免疫
グロブリンのレパートリー、Ｖ_Ｈ（またはＦｄ）と結合し、新しいＦａｂを形成
することもできる。

【００４１】 ＩＶ．目的とする抗−ＲＡＮＫ−Ｌアミノ酸およびヌクレオチド配列 上記したｍＡｂ２Ａ４または他の抗体は、ドナー抗体の抗原結合特異性により
特徴付けられる種々の改変抗体を設計および獲得するのに有用な、可変重鎖およ
び／または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、ＣＤＲ配列、機能性配列お
よびそのアナログ、ならびにそれらをコードする核酸配列などの配列を付与する
ことができる。 一例として、本発明は、ＲＡＮＫ−ＬｍＡｂ２Ａ４からの可変軽鎖および可変
重鎖配列およびそれらから由来の配列を提供する。

【００４２】 可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードする、本発明の核酸配列またはその
フラグメントはまた、特定の変化をＣＤＲをコードする核酸配列またはフレーム
ワーク領域内で変異誘発を導入するのに、および得られた修飾または融合核酸配
列を発現プラスミドに組み込むのに有用である。 遺伝コードの縮重を鑑みれば、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列およ
びＣＤＲ配列、ならびにドナー抗体の抗原特性を共有する機能性フラグメントお
よびそのアナログをコードする種々のコード化配列を構築することができる。可
変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードする、本発明の単離された核酸配列また
はそのフラグメントを用いて、第２免疫グロブリンパートナーと作動的に組み合
わせた場合に、本発明の改変抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体あるいは他
の操作された抗体を産生することができる。

【００４３】 一の具体例において、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８
、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群より選択され
る構成員と、少なくとも９０％同一の、より好ましくは９５％同一のポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドを含む、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関す
る。もう一つ別の具体例において、本発明は、配列番号：１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群よ
り選択されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。さらにもう一つ別
の具体例において、本発明は、配列番号：２、４、５、６、７、８、９および１
０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと、少
なくとも９０％同一の、より好ましくは９５％同一のポリヌクレオチドを含むポ
リヌクレオチドに関する。

【００４４】 本発明は、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：２およ
び４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、抗体に関する。配列番号：５
、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を
コードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号
：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリ
ヌクレオチドも含まれる。 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組
換え宿主細胞とを含む発現系も包含される。さらに、配列番号：５、６、７、８
、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であ
って、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基
から抗体を回収することを含む方法も含まれる。

【００４５】 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコ
ードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含
む発現系も包含される。さらに、配列番号：２および４のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件
下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含
まれる。 本発明はまた、配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：２のアミノ酸配列
を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号：５、６および７のアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本発明
の範囲内に含まれる。さらには、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。

【００４６】 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体
をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる発現ベクター
を含む組換え宿主細胞もまた含まれる。さらに、配列番号：５、６および７のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生
するのに十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収する
ことを含む方法も含まれる。 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする
ポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系
もまた包含される。さらに、配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主
細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。

【００４７】 本発明はまた、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含む抗体に関する。さらには、本発明はまた、配列番号：４のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。配列番号：８、９および１０のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも本
発明の範囲内に含まれる。さらには、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗
体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞
とを含む発現系も含まれる。さらに、配列番号：８、９および１０のアミノ酸配
列を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに
十分な条件下でこの宿主細胞を培養し、その培養基から抗体を回収することを含
む方法も含まれる。

【００４８】 発現ベクターが適合可能な宿主細胞中にある場合に抗体を産生することができ
る、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする
ポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系
も含まれる。さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む
抗体の産生方法であって、該抗体を産生するのに十分な条件下でこの宿主細胞を
培養し、その培養基から抗体を回収することを含む方法も含まれる。

【００４９】 本明細書に記載の改変抗体の一部をコードする単離された核酸配列に加えて、
未変性ＣＤＲコード化配列に相補的な核酸配列またはＣＤＲコード化領域を囲む
修飾ヒトフレームワーク領域に相補的な核酸配列などの、他の核酸配列も本発明
に包含される。有用なＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ配列にとってストリンジェント
なハイブリダイゼーション条件（T.Maniatisら、Molecular Cloning（A Laborat
ory Manual）、Cold Spring Harbor Laboratory（1982）、387ないし389頁を参
照のこと）下で、本明細書に開示されるいずれかのポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズするものを包含する。かかるストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件の一例が、６５℃で４ＸＳＳＣとハイブリダイズさせ、つづいて６５℃で０
．１ＸＳＳＣ中にて1時間洗浄するものである。また、一の代表的なストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件が、４２℃で５０％ホルムアミド、４ＸＳ
ＳＣを用いるものである。これらのハイブリダイズに付すＤＮＡ配列は長さが少
なくとも約１８個のヌクレオチド、すなわち、略ＣＤＲの大きさであることが好
ましい。

【００５０】 Ｖ．改変された免疫イムノグロブリン分子および改変抗体 改変された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体などの操作さ
れた抗体を含む、改変抗体をコードすることができる。望ましい改変された免疫
グロブリンコード化領域は、ＲＡＮＫ−Ｌ抗体、好ましくは本発明により提供さ
れるような第１免疫グロブリンパートナー（ヒトフレームワークまたはヒト免疫
グロブリン可変領域）に挿入された高アフィニティー抗体、の抗原特異性を有す
るポリペプチドをコードするＣＤＲコード化領域を含有する。 第１免疫グロブリンパートナーは第２免疫グロブリンパートナーと作動的に連
結していることが好ましい。第２免疫グロブリンパートナーは上記に定義したと
おりであり、目的とする第２抗体領域、例えばＦｃ領域をコードする配列を含ん
でいてもよい。第２免疫グロブリンパートナーはまた、軽鎖または重鎖の定常領
域がフレームにてまたはリンカー配列により融合する別の免疫グロブリンをコー
ドする配列を含んでいてもよい。ＲＡＮＫ−Ｌの機能性フラグメントまたはアナ
ログに拮抗するように指令された操作された抗体は同じ抗体との結合の強化を惹
起するように設計することができる。

【００５１】 第２免疫グロブリンパートナーはまた、その第２免疫グロブリンパートナーが
常套手段により作動的に連結することができる、非蛋白キャリア分子を含む、上
記したエフェクター剤と結合してもよい。 第２免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列と、エフェクター剤との間
の融合または連結は、適当な手段のよるもの、例えば慣用的な共有またはイオン
結合、蛋白融合または異種二機能性クロスリンカー、例えば、カルボジイミド、
グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技法は当該分野にて
知られており、一般的な化学および生化学のテキストに広く記載されている。

【００５２】 加えて、第２免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に望ましい大
きさの空間を簡単に付与する従来のリンカー配列もまた、改変された免疫グロブ
リンをコードする領域中に構築させてもよい。かかるリンカーの設計は当該分野
にて周知である。 加えて、本発明の分子のシグナル配列を修飾して発現を強化することもできる
。 代表的な改変抗体は、ｍＡｂ２Ａ４の抗原特異性を有する可変重鎖および／ま
たは軽鎖のペプチドまたは蛋白配列、例えば、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖を含有する。本
発明のさらに別の望ましい改変抗体は、アミノ酸配列がマウス抗体分子２Ａ４の
重鎖および／または軽鎖の可変領域の少なくとも1個の、好ましくはすべてのＣ
ＤＲを含有し、残りの配列がヒト供給源から由来するか、またはその機能性フラ
グメントまたはアナログであることにより特徴付けられる。

【００５３】 さらなる態様において、本発明の操作された抗体は付加的な物質が結合してい
てもよい。例えば、組換えＤＮＡ技法の操作を用いて、完全な抗体分子のＦｃフ
ラグメントまたはＣＨ２ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すな
わち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）で置き換えられている
、本発明の操作された抗体を産生してもよい。 第２免疫グロブリンパートナーはまた、例えば、マウス２Ａ４の抗原特異性を
有するＣＤＲ−含有配列と異種構造の非免疫グロブリンのペプチド、蛋白または
そのフラグメントと作動的に連結していてもよい。得られた蛋白は抗−ＲＡＮＪ
−Ｌ抗原特異性および非免疫グロブリンの発現に関する特性の両方を示すかもし
れない。融合パートナーそれ自体が治療蛋白であるか、または付加的な抗原特性
を有するならば、その融合パートナー特性は、例えば、別の結合または受容体ド
メインまたは治療特性などの機能的特性であってもよい。

【００５４】 本発明のもう一つ別の望ましい蛋白は、全長の重鎖および軽鎖、またはＦａｂ
またはＦ（ａｂ’）_２フラグメントなどのその別個のフラグメント、重鎖ダイマ
ー、またはＦｖまたは一本鎖抗体（ＳＣＡ）などのその最小組換えフラグメント
あるいは選択されたドナーｍＡｂ、例えばｍＡｂ２Ａ４と同じ特異性を有する別
の分子を有する、完全な抗体分子を含んでいてもよい。かかる蛋白は改変抗体の
形成に用いてもよく、あるいは融合していない形態にて用いてもよい。 第２免疫グロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、イソ型ま
たはイソ種の免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域から誘導される場合
は必ず、操作された抗体が得られる。操作された抗体は、一の供給源、例えば、
アクセプター抗体からの免疫グロブリン（Ｉｇ）の定常領域と、可変フレームワ
ーク領域、ならびにドナー抗体、例えば本明細書に記載の抗−ＲＡＮＫ−Ｌ抗体
から由来の１またはそれ以上の（好ましくはすべての）ＣＤＲを含むことができ
る。加えて、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するために、核酸またはアミノ酸
レベルでアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメインフレームワー
ク領域を、またはドナーＣＤＲ領域を、改変、例えば、欠失、置換または付加に
付すこともできる。

【００５５】 かかる操作された抗体は、ＲＡＮＫ−ＬｍＡｂ（所望により、上記したように
修飾されていてもよい）の１の（または両方の）可変重鎖および／または軽鎖あ
るいは１またはそれ以上の下記の重鎖または軽鎖ＣＤＲを用いて設計される。操
作された抗体が中和抗体であると、すわなち、それらは望ましくはＲＡＮＫ−Ｌ
蛋白の受容体との結合を遮断し、ＲＡＮＫ−Ｌ依存性細胞の増殖を遮断または防
止すると考えられる。 かかる操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンのフレームワーク領
域またはサブタイプを含有するヒト化抗体、あるいはＲＡＮＫ−Ｌ抗体機能性フ
ラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含有するキメラ抗体を包含
する。適当なヒト（または他の動物）アクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレ
オチドおよびアミノ酸配列との相同性により、通常のデータベース、例えば、KA
BAT（登録商標）データーベース、Los AlamosデータベースおよびSwiss Protein
データベースから選択されるものであってもよい。ドナー抗体のフレームワーク
領域との相同性（アミノ酸を基礎として）により特徴付けられるヒト抗体は、ド
ナーＣＤＲを挿入するための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワー
ク領域を提供するのに適している可能性がある。軽鎖定常または可変フレームワ
ーク領域の付与能を有する適当なアクセプター抗体は同様にして選択することが
できる。アクセプター抗体の重鎖および軽鎖は同じアクセプター抗体を起源とす
る必要はない。

【００５６】 異種構造のフレームワークおよび定常領域は、ＩｇＧ（サブタイプ１ないし４
）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥなどのヒト免疫グロブリン種およびイソ型から
選択されることが望ましい。しかしながら、アクセプター抗体はヒト免疫グロブ
リン蛋白配列だけを含むことを必要としない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の
一部をコードするＤＮＡ配列が、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分
子などの免疫グロブリンでないアミノ酸配列に融合されるところの、遺伝子を構
築することもできる。 特に望ましい一例としてのヒト化抗体は、選択されたヒト抗体配列のフレーム
ワーク領域に挿入された２Ａ４のＣＤＲを含有するであろう。中和ヒト化抗体の
場合、ＲＡＮＫ−Ｌ抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域からの１、２または
好ましくは３個のＣＤＲを選択されたヒト抗体配列のフレームワーク領域中に挿
入し、その後者の抗体の未変性ＣＤＲと置き換える。

【００５７】 好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ド
メインが１またはそれ以上のＣＤＲ置換により操作されている。６個すべてのＣ
ＤＲまたは６個よりも少ないＣＤＲを種々組み合わせて用いることが可能である
。好ましくは６個すべてのＣＤＲを置き換える。軽鎖としてヒトアクセプター抗
体からの非修飾軽鎖を用い、ヒト重鎖におけるＣＤＲだけを置き換えることも可
能である。さらに別法として、一般的な抗体データベースに基づいて別のヒト抗
体から適合可能な軽鎖を選択することもできる。残りの操作された抗体は適当な
アクセプターヒト免疫グロブリンから誘導することができる。 かくして、操作されたヒト化抗体は、天然のヒト抗体またはそのフラグメント
の構造を有し、有効な治療に用いるのに必要な、例えばヒトにおけるＲＡＮＫ−
Ｌ介在炎症性疾患の治療にまたは診断薬として使用するのに必要な特性を組み合
わせて有することが好ましい。

【００５８】 ドナー抗体の特異性および高アフィニティーに必ずしも影響を与えることなく
、可変ドメインアミノ酸にて変形することにより改変抗体をさらに修飾できるこ
と（すなわち、アナログ）は当業者であれば理解できるであろう。重鎖および軽
鎖アミノ酸は可変ドメインフレームワークまたはＣＤＲあるいはその両方で他の
アミノ酸で置換することができる。 加えて、定常領域を改変し、本発明の分子の選択特性、例えば、二量化、Ｆｃ
受容体との結合または補体を結合させ、活性化する能力を亢進または減少させる
こともできる（例えば、Angalら、Mol.Immunol. 30：105-108（1993）；Xuら、J
.Biol.Chem. 269：3469-3474（1994）；Winterら、EP 307434-Bを参照のこと）
。 キメラ抗体である改変抗体は、フレームワーク領域を含め、両鎖のためのヒト
免疫グロブリン定常領域と一緒になって、完全なヒト以外の生物のドナー抗体重
鎖および軽鎖可変領域を提供することで、上記したヒト化抗体と異なる。本発明
のヒト化抗体に関連する付加的なヒト以外の生物の配列を保持するキメラ抗体は
ヒトにおいて有意な免疫応答を惹起することができると考えられる。

【００５９】 かくして、一の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号：１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８か
らなる群より選択される構成員と、少なくとも９０％、より好ましくは少なくと
も９５％同一の、１またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含
む。もう一つ別の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号：２、４、５
、６、７、８、９および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドと、少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同
一の、１またはそれ以上のポリヌクレオチドを含む。 かかる抗体は、上記したような、ＲＡＮＫ−Ｌ介在障害の予防または知慮に有
用とすることができる。

【００６０】 ＶＩ．改変抗体の産生および改変抗体 好ましくは、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築においては、ｍ
Ａｂ２Ａ４または他の適当なドナーｍＡｂの可変軽鎖および／または重鎖配列お
よびＣＤＲ、ならびにそのコード化核酸配列を以下の方法にて利用する。また、
同じまたは類似する方法を用いて本発明の他の具体例を形成することもできる。 一般には、選択されたドナーｍＡｂ、例えばマウス抗体２Ａ４を産生するハイ
ブリドーマをクローン処理に付し、当業者に公知の方法、例えば、Sambrookら（
Molecular Cloning（A Laboratory Manual）、第２版、Cold Spring Harbor Lab
oratory（1989））に記載の方法により重鎖および軽鎖の可変領域のＤＮＡを得
る。少なくともＣＤＲコード化領域、およびドナーｍＡｂ結合特異性を保持する
ために必要なアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖の可変ドメインフレー
ムワーク領域の部分、ならびにヒト免疫グロブリンから由来の抗体鎖の残りの免
疫グロブリン誘導部分を含有する２Ａ４の可変重鎖および軽鎖領域は、ポリヌク
レオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得ることができる。ＣＤＲのコー
ド化領域を既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することにより同定する
。

【００６１】 ついで、マウス／ヒトのキメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイしても
よい。かかるキメラ抗体は、両方の鎖のためのヒトＩｇ定常領域と一緒に、完全
なヒト以外の生物のドナー抗体Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域を含有する。 ヒト化抗体はキメラ抗体から誘導してもよく、あるいは重鎖および軽鎖からの
ドナーｍＡｂＣＤＲコード化領域を選択された重鎖および軽鎖フレームワークに
挿入することにより合成して製造することが好ましい。別法として、本発明のヒ
ト化抗体は標準的な変異誘発技法を用いて調製することもできる。かくして、得
られたヒト化抗体はヒトフレームワーク領域およびドナーｍＡｂＣＤＲ−コード
化領域を含有する。その後でフレームワークの残りを操作してもよい。得られた
ヒト化抗体を組換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたは骨髄腫細胞中で発
現させることができる。他の適当なＲＡＮＫ−Ｌ特異的であり、中和作用を示す
、高アフィニティーのヒト以外の生物の抗体にこの技法を用い、他のヒト化抗体
を調製してもよい。

【００６２】 通常の発現ベクターまたは組換えプラスミドは、改変抗体についてのこれらの
コード化配列を、宿主細胞での複製および発現を、および／またはその細胞から
の分泌を調節する能力を有する通常の調節制御配列と作動的に共同して置くこと
により産生することができる。調節配列はプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプ
ロモーターおよびシグナル配列を包含し、それらは他の既知の抗体から誘導する
ことができる。同様に、相補的な抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列
を有する第２発現ベクターを産生することもできる。好ましくは、この第２発現
ベクターは、ポリペプチド鎖が、各々、できる限り多く機能的に発現するように
、そのコード化配列および選択可能なマーカーが関連付けられる範囲では、第１
のものと同じである。また、改変抗体の重鎖および軽鎖のコード化配列が単一の
ベクター上に存在していてもよい。

【００６３】 選択された宿主細胞を慣用的技法により第１および第２の両方のベクターを用
いて共同してトランスフェクトし（あるいは単一のベクターで簡単にトランスフ
ェクトし）、組換えまたは合成の軽鎖および重鎖の両方を含むトランスフェクト
された本発明の宿主細胞を創製する。ついで、そのトランスフェクトされた細胞
を慣用的技法により培養し、本発明の操作された抗体を産生する。組換え重鎖お
よび／または軽鎖の両方を含むヒト化抗体をＥＬＩＳＡまたはＲＩＡなどの適当
なアッセイにより培養物からのスクリーニングに付す。類似する慣用的な技法を
用いて本発明の他の改変抗体または分子を構築することもできる。 本発明の方法および組成物の構築に利用されるクローニングおよびサブクロー
ニング工程に適するベクターは当業者により選択される。例えば、従来のｐＵＣ
シリーズのクローニングベクターを用いてもよい。使用される一のベクターはｐ
ＵＣ１９であり、そのベクターは、Amersham（Buckinghamshire、英国）またはP
harmacia（Uppsala、スウェーデン）などの会社から商業的に入手可能である。
加えて、容易に複製することができ、一の存在量のクローニング部位および選択
可能な遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、そして操作が簡単なベクターは
いずれもクローニングに用いることができる。

【００６４】 同様に、本発明に係る操作された抗体の発現のために利用されるベクターは、
当業者によって一般的なベクターから選択され得る。ベクターはまた、選択され
た宿主細胞にて異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指令する選択された調節配列
（ＣＭＶプロモーターなど）を含有する。これらのベクターは操作された抗体ま
たは改変された免疫グロブリンのコード化領域をコードする上記されたＤＮＡ配
列を含有する。加えて、ベクターは、操作を容易にするために望ましい制限部位
を挿入することによって修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込むこ
ともできる。 発現ベクターはまた、異種ＤＮＡ配列の発現を増幅するのに適する遺伝子、例
えば、哺乳動物のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）により特徴付け
ることもできる。他の好ましいベクター配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）お
よびベータグロビンプロモーター配列（ベータグロプロ）からなどの、ポリＡシ
グナル配列を包含する。本明細書にて有用な発現ベクターは当業者に周知の技法
を用いて合成することができる。

【００６５】 かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プ
ロモーター、シグナル配列等は、市販のまたは天然の供給源から得てもよく、あ
るいは選択された宿主にて組換えＤＮＡの産物を発現および／または分泌するの
に関連して使用される既知の操作により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫
、酵母および真菌の発現について当該分野にて公知である多種の他の適当な発現
ベクターをこの目的のために選択することもできる。 本発明はまた、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコ
ード化配列を含有する組換えプラスミドを用いてトランスフェクトされた細胞系
を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有
用な宿主細胞もまた一般的なものである。しかしながら、イー・コリの種々の菌
株から由来の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築
における他の工程に使用するのが最も望ましい。

【００６６】 本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適する宿主細胞または細胞系
は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および脊髄細胞などの哺乳
動物細胞が好ましく、ＣＨＯまたは脊髄細胞がより好ましい。ヒト細胞を用いて
、その分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することもできる。別法として、
他の真核細胞系を利用することもできる。適当な哺乳動物の宿主細胞および形質
転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物の産生および精製の方法の選択は
当該分野にて知られている。例えば、Sambrookら、前掲を参照のこと。

【００６７】 細菌細胞が宿主細胞として本発明の組換えＦａｂの発現に適することを証明す
ることができる（例えば、Pluckthum,A.、Immunol.Rev.、130：151-1881992）を
参照のこと）。しかしながら、細菌細胞中で発現される蛋白は折りたたまれてい
ないか不当に折りたたまれた形態あるいはグリコシル化されていない形態である
ため、細菌細胞中で産生された組換えＦａｂは抗原結合能の保持についてスクリ
ーニングする必要がある。細菌細胞により発現された分子がうまく折りたたまれ
た形態にて産生されたならば、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、
発現のために使用されるイー・コリの種々の菌株は生物学の分野における宿主細
胞として周知である。ビー・サチリス、ストレプトマイセス、他の細菌等の種々
の菌株もまた、この方法にて利用することができる。

【００６８】 望ましい場合には、当業者に公知の酵母菌の細胞、ならびに昆虫細胞、例えば
、ドロソフィラおよびレピドプテラ、およびウイルス発現系を宿主細胞として利
用することもできる。例えば、Millerら、Genetic Engineering、8：277-298、P
lenum Press（1986）およびその中で引用されている文献を参照のこと。 本発明のベクターを構築する一般的な方法、本発明の宿主細胞を産生するのに
必要なトランスフェクション方法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変抗体
を産生するのに必要な培養方法は、そのすべてが慣用的な方法である。同様に、
一旦産生されれば、本発明の改変抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティ
ーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該分野の標準
的操作に従って細胞培養基から精製することもできる。かかる技法は当該分野に
おける技術の範囲内にあり、本発明を制限するものではない。

【００６９】 ヒト化抗体を発現させるもう一つ別の方法は、米国特許第４８７３３１６号に
記載されるように、トランスジェニック動物での発現を利用する。この方法は、
トランスジェニック操作により哺乳動物に組み込まれた場合に、雌体の乳中に所
望の組換え蛋白を産生させる、動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関
する。 所望の方法により発現されると、次に操作された抗体を適当なアッセイを用い
て試験する。現在のところ一般的なＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを利用して
操作された抗体とＲＡＮＫ−Ｌとの定量的および定性的結合を評価する。加えて
、また、通常のクリアランス機構にも拘わらずに体内で残っている操作された抗
体を評価するのになされるその後のヒト臨床実験の前に、別のインビトロアッセ
イを用いて中和効率を検証してもよい。

【００７０】 ヒト化抗体の産生について記載されている一般的操作に従って、当業者はまた
、本明細書に記載の他のドナーＲＡＮＫ−Ｌ抗体、可変領域配列およびＣＤＲペ
プチドからヒト化抗体を構築することもできる。操作された抗体は、その改変抗
体の受容体により「自己」として認識される可能性のある可変領域のフレームワ
ークを有するように産生できる。可変領域のフレームワークを少し修飾して、受
容体に対する免疫原性を著しく増大させることなく、抗原結合を大きく増大させ
ることができる。かかる操作された抗体はＲＡＮＫ−Ｌ介在状態についてヒトを
効果的に治療することができる。かかる抗体は上記した症状の診断においても有
用である。

【００７１】 ＶＩＩ．治療的／予防的使用 本発明はまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および
原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾
患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発
性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を患っているヒトを治療する方法であって、
有効量の本明細書に記載の１またはそれ以上の操作された抗体または改変抗体あ
るいはそのフラグメントを包含する抗体を投与することからなる方法に関する。

【００７２】 本発明の分子を用いることで誘発される治療応答はヒトＲＡＮＫ−Ｌとの結合
により形成され、その後に破骨細胞および樹状細胞の発生および機能を阻害する
。すなわち、治療的使用に適する調製物および処方物にある場合の、本発明の分
子は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌
、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インス
リン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（
ＭＳ）を含む、骨減少症（これに限定されない）などの骨ホメオスタシスの障害
を患っているヒトにとって極めて望ましい。治療的使用に適する調製物および処
方物にある場合の、本発明の分子はまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症
（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（Ｏ
Ａ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾
患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を患っているヒトにとっても極めて望
ましい。

【００７３】 本発明の抗体およびそのフラグメントはまた、サイトカイン抑制性抗炎症薬（
Cytokine Suppressive Anti-Inflammatory Drugs（CSAIDS^ＴＭ）または他の抗体
、特に本発明の抗体と関連する症状の原因である他のマーカー（エピトープ）と
反応的なヒトｍＡｂなどのサイトカイン阻害剤と一緒に用いることができる。 本発明の治療薬は、２日ないし６月の、あるいは必要に応じて、骨減少症また
は自己免疫症状の治療に望ましいと考えられる。例えば、慢性関節リウマチ（Ｒ
Ａ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解また
は骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ
）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を治
療する場合には、より長期の治療が望ましい。用量および治療期間は、本発明の
分子がヒトの循環下にある相対的な期間と関連しており、当業者が患者の治療さ
れるべき状態および一般的な健康に応じて調節することができる。

【００７４】 本発明の治療薬の投与方法は、該薬を宿主に送達する任意の適当な経路とする
ことができる。本発明の抗体およびそのフラグメント、および医薬組成物は、非
経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内投与に特に有用である
。

【００７５】 本発明の治療薬は、活性成分として有効量の本発明の抗体（例えば、ヒト化抗
体）を医薬上許容される担体中に含有する医薬組成物として調製することができ
る。本発明の予防薬において、抗体を含有する水性懸濁液または溶液で、好まし
くは生理的ｐＨに緩衝され、すぐに注射できる形態のものが好ましい。非経口投
与用組成物は、通常、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体に溶かした本
発明の抗体またはそのカクテルの溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば
、０．４％セイライン、０．３％グリシン等を用いることができる。これらの溶
液は、滅菌され、一般に粒状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、よく知
られた滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌することができる。組成物は、生理
学的状態に近づけるために必要な医薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節
剤および緩衝剤等を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明の抗体の濃
度は広範囲に変えることができ、すなわち、約０．５重量％未満、通常約１重量
％または少なくとも約１重量％から１５または２０重量％まで変化し、主に流体
の体積、粘度等に応じて、選択される具体的な投与方法に従って選択される。

【００７６】 従って、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、および
約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇまたはより好
ましくは約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の抗体を含むように調製することが
できる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌの滅菌リ
ンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇないし約２５ｍ
ｇの本発明の抗体を含有するように調製することができる。実際の非経口投与可
能な組成物の調製法は当業者に周知であるか明らかであり、例えば、"Remington
's Pharmaceutical Science"、第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pen
nsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。

【００７７】 医薬調製物である場合の、本発明の治療薬は、単位投与形であることが好まし
い。治療的に有効な適当な用量は当業者が容易に決定できる。ヒトまたは他の動
物における炎症性障害を有効に治療するために、体重７０ｋｇあたり０．１ｍｇ
ないし約２０ｍｇの一回用量の本発明の蛋白または抗体を非経口的に、好ましく
は静脈内または筋肉内投与する。かかる投与は、必要ならば、その疾患の間、医
師により適当に選択される適当な間隔で繰り返すことができる。 本発明の抗体はまた、例えば、ＲＡＮＫ−Ｌ介在障害を測定するための、また
はかかる障害の治療の進行度を追跡するための診断用方法にて用いることもでき
る。診断薬としてのこれらの抗体は、一般に、ＥＬＩＳＡにて、ならびに血清、
血漿または他の適当な組織中のＲＡＮＫ−Ｌレベルを測定するための、もしくは
培養基中でのヒト細胞の放出を測定するための他の慣用的アッセイフォーマット
にて用いるために標識されていてもよい。抗体を使用するアッセイの特性は標準
的なものであり、この開示を限定するものではない。

【００７８】 かくして、本発明の一の具体例は、患者における、骨ホメオスタシスの障害ま
たは自己免疫疾患および破骨細胞またはＴ細胞活性の過剰または不足に付随する
他の症状（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性およ
び原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免疫
疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多
発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症）の診断を補助する方法であって、その患
者から得られる試料（血漿または組織）中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの量を測定し、そ
の測定した量と正常な集団のヒトＲＡＮＫ−Ｌの平均の量とを比較し、それによ
れば、患者の試料中でＲＡＮＫ−Ｌが有意に高い量で存在することは骨または自
己免疫疾患および破骨細胞またはＴ細胞の過剰な数または活性に付随する疾患を
意味する、方法に関する。同様に、患者の試料中でＲＡＮＫ−Ｌが有意に低い量
で存在することは破骨細胞の数または活性の不足に伴う骨疾患を意味する。

【００７９】 本明細書に記載されている抗体またはそのフラグメントは貯蔵のために凍結乾
燥させ、使用前に適当なキャリアー中で復元することができる。これらの技法は
通常の免疫グロブリンで効果的であることがわかっており、当該分野にて公知の
凍結乾燥法および復元法を利用することができる。 かくして、本発明は（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体；
（ｂ）モノクローナル抗体２Ａ４の識別特性を有するモノクローナル抗体；およ
び（ｃ）モノクローナル抗体２Ａ４に関する。 本発明はまた、（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体の免疫グロブリン相補
性決定領域を含む単離されたポリペプチド；（ｂ）モノクローナル抗体２Ａ４の
抗体特性の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離されたポリペプチド；およ
び（ｃ）モノクローナル抗体２Ａ４の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離
されたポリペプチドに関する。さらに本発明は（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドに
関する。

【００８０】 本発明のポリペプチドは、とりわけ、配列番号：５、６、７、８、９および１
０からなる群より選択されるポリペプチドを含む、免疫グロブリン相補性決定領
域に関する。本発明のポリヌクレオチドは、とりわけ、配列番号：５、６、７、
８、９および１０からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含むポリヌクレオチドに関する。本発明は（ａ）免疫グロブリン相補
性決定領域が配列番号：５、６、７、８、９および１０からなる群より選択され
るポリペプチドを含むところのヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体
；（ｂ）配列番号：２に示されるようなポリペプチドの重鎖可変領域および／ま
たは配列番号：４に示されるようなポリペプチドの軽鎖可変領域を含む、モノク
ローナル抗体に関する。

【００８１】 本発明のポリヌクレオチドはまた、配列番号：２および配列番号：４からなる
群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された
ポリヌクレオチドに関する。 本発明はモノクローナル抗体２Ａ４の識別特性を有するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞系に関する。 （ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合するモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル
抗体２Ａ４の識別特性を有するモノクローナル抗体；および（ｃ）モノクローナ
ル抗体２Ａ４を含む医薬組成物も含まれる。

【００８２】 本発明は、試料中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの存在を検出する方法であって、 ａ）該試料をヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体に曝し；および ｂ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合する抗体を検出する、ことを含む方法に関する。 抗体に曝露する前に、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ蛋白が抗体による結合の影響を受けや
すいように、試料が処理されている方法が好ましい。ヒトＲＡＮＫ−Ｌと結合す
る好ましい抗体はモノクローナル抗体２Ａ４の識別特性を有しており、より好ま
しいのはモノクローナル抗体２Ａ４そのものである。

【００８３】 以下の実施例は、代表的な操作された抗体の構築および適当なベクターおよび
宿主細胞中でのその発現を含む、本発明の種々の態様を説明するが、本発明の範
囲を限定するものではない。アミノ酸はすべて慣用的な３文字または１文字コー
ドで同定されている。必要な制限部位、プラスミド、ならびに他の試薬および材
料はすべて、特記しない限り、商業的に入手されたものである。一般的なクロー
ニングライゲーションおよび他の組換えＤＮＡ方法は、T.Maniatisら（前掲）ま
たは同じ出版人（「Sambrook」ら）による、その第二版（１９８９）、Sambrook
ら編に記載されるように行った。

【００８４】 （実施例） 実施例１−ＲＡＮＫ−Ｌに対するｍＡｂの産生 Ａ．ＣＢ６ｆ１マウスに可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白を複数回投与して免疫処理す
ることでモノクローナル抗体を産生した。免疫処理したマウスから抗血清を採取
し、抗−ＲＡＮＫＬ抗体について力価測定を行った。出血免疫アッセイ試験に基
づいて、反応の最も優れたマウスを脾摘出術の３日および１日前にブースター処
理に付した。脾臓を摘出し、ポリエチレングリコール方法を用いてその脾臓細胞
をＸ６３ＡＧ８６５３骨髄腫細胞と融合させた。ついで、その融合細胞を２０ｘ
９６ウェルの組織培養プレートにて培養した。融合した１４日後に、そのハイブ
リドーマをＲＡＮＫＬ蛋白との抗体結合についてアッセイした。ＲＡＮＫＬとの
抗体結合を有するそれらのハイブリドーマをそのハイブリドーマの成長速度に合
わせて段々により大きな組織培養プレートに広げた。そのハイブリドーマからの
上澄を免疫アッセイにて使用し、抗体特異性およびＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ結合を
中和することにおけるその生物学的活性を確認した。活性が確認されたならば、
そのハイブリドーマ細胞系を低温保存し、血清不含培地にて抗体を産生するため
に秤量した。

【００８５】 ＲＡＮＫＬ蛋白に対する抗体を産生する際の大きな問題はハイブリドーマ培養
物のアポトーシスにあった。このことは、通常、ハイブリドーマ拡張の初期の段
階で起り、細胞系を完全に死滅させるか、あるいは生産体でないハイブリドーマ
細胞系を産生し、これにより抗体合成のスイッチはオフとなる。この問題は、我
々の行った１００種以上の他の抗原を用いる観察との関連で、どちらかと言えば
ＲＡＮＫＬ抗原に独特であった。この作用は、おそらく、ＲＡＮＫＬ抗体のネズ
ミＲＡＮＫＬとの弱い交差反応性に由来するものである。ＲＡＮＫＬがハイブリ
ドーマ細胞上にあるならば、そのハイブリドーマ培養基にある相対的に高い濃度
のＲＡＮＫＬ抗体はＲＡＮＫＬと結合し、アポトーシスの誘発をもたらしうる。
ハイブリドーマ成長因子を添加してその成長を刺激し、アポトーシスの作用をオ
フセットしようとする試みがなされたが、大部分のハイブリドーマ細胞系で効果
がないことが実証された。この問題の結果は、細胞系の死滅か、ＩｇＧ合成のシ
ャットダウンのいずれかであり、ハイブリドーマの９０％より多くがその融合体
から失われた。ある融合体では、この方法ですべてのハイブリドーマが喪失した
。 この作用を根絶するために、多数のマウスを免疫処理し、その脾臓を連続的に
使用し、生物学的アッセイにおける評価のための抗−ＲＡＮＫＬ抗体を分泌する
一連の安定したハイブリドーマを産生した。

【００８６】 Ｂ．２Ａ４ｍＡｂの精製および配列決定 製造業者の指示に従ってProsepA（Bio Processing、Consett、UK）クロマトグ
ラフィーにより２Ａ４ｍＡｂを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによればそのｍＡｂ
は＞９５％純度であった。Ｎ−末端配列を分析するために、重鎖および軽鎖のポ
リペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフル
オリド）膜に移し、直接配列決定した（P.Matsudaira、J.Biol.Chem. 262：1003
5-10038、1987）。 Ｃ．ｍＡｂのイソ型化 ネズミＲＡＮＫＬ ｍＡｂ２Ａ４を市販のキット（Zymed、Amerscham）でイソ
型化し、ＩｇＧ２ａ／カッパであることが判明した。

【００８７】 実施例２−アッセイ Ａ．溶液での検出のためにプラスチック上に被覆したヒトＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋
白およびビオチニル化可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白を用いる競合ＥＬＩＳＡを確立
した。ＲＡＮＫ−ＦｃおよびＲＡＮＫＬ蛋白を、各々、ＣＨＯ細胞およびピチア
・パストリス（Pichia pastoris）中で産生し、均質性が＞９０％となるまで精
製した。ｓｈＲＡＮＫＬ（可溶性ヒトＲＡＮＫＬ）蛋白を、製造業者の指示に従
って、ＮＨＳ−ビオチンの蛋白（Pierce、Rockford、IL）に対するモル比を２０
：１でビオチニル化した。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６のカ
ーボネート−ビカ−ボネートバッファー中、４℃で一夜、５０ｎｇ／ウェル（０
．５３ナノモル）のＲＡＮＫ−Ｆｃで被覆した。プレートを０．１％ツィーン２
０を含有するｐＨ７．４のトリス−セイラインバッファーにて洗浄し、１％ＢＳ
Ａ／ＰＢＳにて室温で２時間ブロックした。競合物質の蛋白（ＲＡＮＫ−Ｆｃ；
死滅受容体５（ＤＲ５）−Ｆｃ；ＯＰＧ−Ｆｃ；ＲＡＮＫＬｍＡｂ２Ａ４）を０
．０１％ツィーン２０／ＰＢＳにて希釈し、ビオチニル化ｓｈＲＡＮＫＬ（０．
４３ｎＭ）を添加する前にウェルに加え、結合した試料を室温で２時間インキュ
ベートした。被覆したＲＡＮＫ−Ｆｃ（＋／−競合物質）に結合したビオチニル
化ｓｈＲＡＮＫＬの量をアルカリ性ホスファターゼ複合ストレプタビジンを用い
て測定した。シグナル検出のための基質は１０５ＰＮＰＰ（Pierce Inc.、Rockf
ord、IL）であり、Spectra Max 340プレートリーダーを用いて４０５ｎｍの吸光
度を測定した。ＤＲ５−Ｆｃ蛋白は、種々の他の研究から考えられるような、阻
害を示さず、それは該蛋白がＲＡＮＫＬと相互作用しないことを意味する。数種
の並行したアッセイにおいて、ＯＰＧ−ＦｃはＲＡＮＫ−Ｆｃよりも強力な阻害
剤であり、各々、約０．５および６ｎＭのＩＣ５０を有した。２Ａ４ｍＡｂはＯ
ＰＧ−Ｆｃと近い効能を示し、そのＩＣ５０は約２ｎＭであった。

【００８８】 Ｂ．ヒト単球由来の樹状細胞の培養基中での成熟の阻害 グラジエント単離法により精製された新鮮なヒト単球を組換えヒトＩＬ−４（
２５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）と一緒に培養基中
で６日間処理し、抗原捕獲表現型の樹状細胞（未成熟ＤＣ）を得た。６日目に、
ＴＮＦαアンタゴニストＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（３０μｇ／ｍｌ）またはＲＡＮＫ
ＬｍＡｂ２Ａ４（３０μｇ／ｍｌ）の存在または不存在下、組換えヒトＴＮＦα
（３０ｎｇ／ｍｌ）または可溶性ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを添
加して培養基を変化させた。ＴＮＦαまたはＲＡＮＫＬは単独で表現型、形態学
および機能的特性により測定される、成熟ＤＣの形成を誘発した。すなわち、細
胞は細胞表面ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＭＨＣＩＩのアップレギュレ
ーションを示し、ＣＤ１ａのダウンレギュレーションを示した。未成熟細胞は、
マクロ飲作用の指標である、ＦＩＴＣ−デキストランの著しい取りこみを示すの
に対して、成熟細胞は実質的にこの能力を喪失していた。ＴＮＦαは成熟を誘発
するにおいてＲＡＮＫＬよりも効果的であり、本質的に、同種の成熟ＤＣの集合
体が得られる。対照的に、ＲＡＮＫＬで処理することで類似する表現型の細胞の
集合体が得られるが、該細胞の一のフラクション（異なるドナーから得られた単
球を用いる異なる実験にて３０−８０％）だけがＲＡＮＫＬで処理した細胞にお
いてこの表現型を示した。ＲＡＮＫＬｍＡｂ２Ａ４はｓＲＡＮＫＬで処理した細
胞の成熟を遮断するが、ＴＮＦαで処理した細胞に対しては効果がなかった。同
様に、ＴＮＦＲＩ−ＦｃはＴＮＦαで処理した細胞の成熟を遮断するが、ｓＲＡ
ＮＫＬで処理した細胞に対しては効果がなかった。かくして、ＲＡＮＫＬｍＡｂ
２Ａ４はＲＡＮＫＬ誘発のＤＣ成熟の機能的活性を特異的に阻害するものである
。

【００８９】 Ｃ．細胞培養基におけるヒトｓＲＡＮＫＬ刺激のネズミ骨髄破骨細胞形成の阻害 ６週齢のＢａｌｂ／Ｃマウスの大腿骨から骨髄細胞を集め、３回洗浄し、数を
数え、ついで再び培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン／ス
トレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性
ＲＡＮＫＬ）に懸濁させた。これらの細胞を、Nunc ２４−ウェルのマルチウェ
ルプレート（４重反復にて）中、５ｘ１０^５／ウェルにてプレートし、７−１０
日間、培養（３７℃、５％ＣＯ_２）した。試験物質（例えば、抗体、ＯＰＧ−Ｆ
ｃ）を培養を行う際に添加した。培地および試験物質を３ないし４日毎に交換し
た。培養期間の最後に、細胞を固定し、Sigmaキット３８６−１を用い、製造業
者の指示に従って、酒石酸耐性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）について染色した。
各ウェル中の破骨細胞（３個以上の核を有するＴＲＡＰ陽性細胞として定義され
る）の数を顕微鏡で数えた。ＲＡＮＫＬｍＡｂ２Ａ４およびＯＰＧ−Ｆｃは共に
、ウェル当たりに発生した破骨細胞の数からわかるように、１μｇ／ｍｌの濃度
で完全に破骨細胞形成を阻害し、共にこのアッセイにて約２００ｎｇ／ｍｌのＩ
Ｃ５０を示した。反対に、ＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白は１０μｇ／ｍｌで十分な阻害を
示したが、２μｇ／ｍｌでは効果がなかった。

【００９０】 Ｄ．ＲＡＮＫＬにより媒介されるヒト単球破骨細胞形成の阻害 ヒト単球を上記したセクションＢの樹状細胞成熟について記載されているよう
に調製した。これらの細胞を５０ｎｇ／ｍｌのヒト可溶性ＲＡＮＫＬ＋２５ｎｇ
／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦの存在下で６‐８日間培養し、骨吸収活性を有する破骨
細胞を形成させた。阻害実験のために、ＲＡＮＫＬｍＡｂ２Ａ４またはＲＡＮＫ
−Ｆｃ蛋白を培養を行う際に加え、破骨細胞の形成を多核細胞の形成によりモニ
ター観察した。該アッセイにおいて、ネズミ破骨細胞形成アッセイ（上記したセ
クションＣ）における観察とは異なり、２Ａ４ｍＡｂは約４μｇ／ｍｌのＩＣ５
０を付与するのに対して、ＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白のＩＣ５０は約５００ｎｇ／ｍｌ
とさらに活性であった。 要約すれば、これらの結果はＲＡＮＫｍＡｂがヒトＲＡＮＫＬとその受容体Ｒ
ＡＮＫの間の相互作用の強力な阻害剤であることを示す。この阻害はＲＡＮＫＬ
−介在のＤＣ成熟ならびに破骨細胞の発生および機能の阻害作用をもたらす。

【００９１】 実施例３−ＣＤＲ配列 遺伝子クローニングおよび配列分析 可変重鎖および軽鎖遺伝子を、以下に簡単に記載する標準的な分子生物学的方
法を用いてハイブリドーマ細胞よりクローンした。全ＲＮＡをトライゾール試薬
（TRIzol Reagent）（Life Technologies Cat.# 15596-026）を用い、製造業者
のプロトコルに従って、そのハイブリドーマ細胞より単離した。プライミング用
のポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドを用い、製造業者（Boehringer Mannheim Cat.
No. 1483-188）の指示に従って、ＲＴ−ＰＣＲキットを用いてＲＮＡを逆転写
させた。最初のｃＤＮＡ鎖合成の後に、重鎖および軽鎖Ｖ領域を３’定常領域特
異的プライマーおよび縮重５’プライマーを用いてＰＣＲ増幅に付した。その縮
重５’プライマー配列は、可変重鎖または軽鎖領域の以前に測定されたＮ末端ア
ミノ酸配列をコードするように設計された。複数のクローンから由来の全長配列
を各ＰＣＲ増幅物から得、並べてコンセンサス配列を得た。従って、重鎖および
軽鎖両方のＤＮＡ配列の最初の１７個の塩基はＰＣＲプライマーにより生成され
ているが、翻訳された蛋白の配列は本来のままである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 19/02 Ａ６１Ｐ 19/08 19/08 19/10 19/10 25/28 25/28 29/00 １０１ 29/00 １０１ 35/00 35/00 35/04 35/04 37/00 37/00 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ０７Ｋ 16/24 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 スミスクライン ビーチャム パブリック リミテッド カンパニー ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ ｐ．ｌ．ｃ． イギリス国 ティダブリュ８ ９ジーエ ス，ミドルセックス，ブレントフォード， グレート ウェスト ロード 980 (72)発明者 サイモン・エム・ブレイク アメリカ合衆国ペンシルベニア州キング・ オブ・プルシア、スウェードランド・ロー ド709番 (72)発明者 レイモンド・ダブリュー・スウィート アメリカ合衆国19004ペンシルベニア州バ ラ・シンウィド、エッジヒル・ロード108 番 (72)発明者 アレキサンダー・エイチ・テイラー アメリカ合衆国19341ペンシルベニア州エ クストン、ウエストフィールド・ドライブ 522番 (72)発明者 トレバー・エイ・ワッタム イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA44 DA02 DA05 DA11 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG27 CA01 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA90X AA90Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA25 CA44 4C085 AA13 AA14 AA16 BB41 CC23 CC24 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 モノクローナル抗体２Ａ４の識別特性を有するモノクローナ
   ル抗体。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体２Ａ４である、請求項１記載のモノクロ
   ーナル抗体。
3. 【請求項３】 モノクローナル抗体２Ａ４の免疫グロブリン相補性決定領域
   を含む抗体。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む
   単離されたポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を
   有するポリペプチドを含む抗体。
6. 【請求項６】 配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチド
   を含む抗体。
7. 【請求項７】 配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を
   有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチド
   を含む抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 発現ベクターが適合的宿主細胞中に存在する場合に抗体を産
   生することのできる配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を
   有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベ
   クターを含む組換え宿主細胞とを含む発現系。
10. 【請求項１０】 配列番号：５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列
    を有するポリペプチドを含む抗体の産生方法であって、かかる抗体を産生するの
    に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培養基から抗体を回収することを含む、抗
    体の産生方法。
11. 【請求項１１】 発現ベクターが適合的宿主細胞中に存在する場合に抗体を
    産生することのできる配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドと、かかる発現ベクターを含む組換
    え宿主細胞とを含む発現系。
12. 【請求項１２】 配列番号：２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ドを含む抗体の産生方法であって、かかる抗体を産生するのに十分な条件下で宿
    主細胞を培養し、培養基から抗体を回収することを含む、抗体の産生方法。
13. 【請求項１３】 慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性お
    よび原発性骨癌、磨耗破片誘発の骨溶解または骨関節炎（ＯＡ）、乾癬を含む免
    疫疾患、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または
    多発性硬化症（ＭＳ）を含む、骨減少症を治療または予防する方法であって、有
    効量の請求項１、２、３、５または６記載の抗体またはポリペプチドをその治療
    または予防を必要とする患者に投与する、方法。