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JP2003531181A - 核酸を細胞に投与するための粒状複合体 - Google Patents

核酸を細胞に投与するための粒状複合体

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JP2003531181A
JP2003531181A JP2001577998A JP2001577998A JP2003531181A JP 2003531181 A JP2003531181 A JP 2003531181A JP 2001577998 A JP2001577998 A JP 2001577998A JP 2001577998 A JP2001577998 A JP 2001577998A JP 2003531181 A JP2003531181 A JP 2003531181A
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Abstract

(57)【要約】 核酸と生分解性カチオン化ポリヒドロキシル化分子を含む粒状複合体を含む粒状複合体が提供される。この場合、ポリヒドロキシル化分子は電荷を約１．０ｍｅｑ／ｇまで有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本発明は、核酸分子を細胞に投与するための粒状複合体およびその使用に関す
る。
【０００２】 リポソーム、ナノ粒子、ポリマー粒子、免疫複合体、リガンド複合体、および
シクロデキストリンなどの、活性物質を細胞に投与する多くのシステムが既に知
られている（「抗菌抗癌性化学療法における薬物輸送」：Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓ
ｐｏｒｔ ｉｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｐａｐａｄａｋｏｕ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１
９９５）。しかしながら、これらのどのシステムも、例えば、デオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）などの核酸をｉｎ ｖｉｖｏで本当に満足に輸送できるものではない
ことが分かっている。
【０００３】 細胞への満足のいくｉｎ ｖｉｖｏ核酸輸送は、例えば、遺伝子療法において
必要である。遺伝子療法とは、遺伝子などの核酸ベースの産物を、ある生物の細
胞にトランスフェクションすることである。遺伝子は生物に導入された後に細胞
において発現される。
【０００４】 現在、いくつかの細胞トランスフェクション法が存在する。これらの方法は、
以下のように分類することができる： リン酸カルシウム、マイクロインジェクション、原形質融合の使用； 遊離ＤＮＡのエレクトロポレーションおよび注射； ウイルス感染； 合成ベクター。
【０００５】 最初のグループの方法はｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションに適用すること
ができない。結果として、現在行われているほとんどの遺伝子療法の初期臨床試
験はレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターの使用に基づいてい
る。試されているウイルスベクターの例として、レトロウイルスベクター、ヘル
ペスウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターが挙げられる。これらの
レトロウイルスベクターは、発現のために異種遺伝子を一部の細胞に安定にトラ
ンスフェクトするのに有効な場合がある。しかしながら、ウイルス起源のベクタ
ーの臨床使用は、その特異性、免疫原性、高い生産コスト、および潜在的な毒性
のために問題があるように思われる。
【０００６】 遊離ＤＮＡのエレクトロポレーションおよび注射は有用な代替法である。しか
しながら、これらの方法は他と比べて効果がなく、局所投与のみに限定される。
【０００７】 脂質ベクターまたはポリペプチドベクターなどの合成ベクターの使用に関心が
高まっている。合成ベクターはウイルスベクターより毒性が低いように思われる
。
【０００８】 合成ベクターの中でリポソームなどの脂質ベクターは潜在的に免疫原性が低く
、当面の間、効率的であるという点でポリペプチドベクターより有利であるよう
に思われる。しかしながら、従来のＤＮＡ送達用リポソームの使用は、封入率が
低く、核酸などの大きな分子を圧縮できないために非常に限られていた。
【０００９】 カチオン性脂質とのＤＮＡ複合体の形成は様々な研究室で研究されている（Ｆ
ｅｌｇｎｅｒら，ＰＮＡＳ ８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｇａｏら
，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，２８０−
２８５，（１９９１）；Ｂｅｈｒ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５，３８２−３
８９（１９９４））。これらのＤＮＡ−カチオン性脂質複合体はまた、用語リポ
プレックスを用いて過去に設計されている（Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｈｕｍ．Ｇ
ｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．，８，５１１−５１２，１９９７）。カチオン性脂質を用
いると、ポリアニオン性物質であるＤＮＡと比較的安定な静電気的複合体を形成
することができる。
【００１０】 カチオン性脂質の使用は、細胞培養においてＤＮＡを輸送するのに有効である
ことが示されている。しかしながら、遺伝子導入のための（特に、全身投与後の
）これらの複合体のｉｎ ｖｉｖｏでの適用はほとんど記録に残っていない（Ｚ
ｈｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，２０９−２１１（１９９３）；Ｔｈｉｅｒｒ
ｙら，ＰＮＡＳ ９２，９７４２−９７４６（１９９５）；Ｈｏｆｌａｎｄら，
ＰＮＡＳ ９３，７３０５−７３０９（１９９６））。
【００１１】 カチオン化ポリマーはまた、ＤＮＡをトランスフェクトするためのベクター複
合体として調べられている。例えば、カチオン性多糖マトリックスを含む「ニュ
ートラプレックス（Ｎｅｕｔｒａｐｌｅｘ）」と呼ばれるベクターが、Ｂｉｏｖ
ｅｃｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｏｆ Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ
が所有する米国特許第６，０９６，３３５号で述べられている。このようなベク
ターもまた脂質などの両親媒性化合物を含む。
【００１２】 ペンダントガラクトース残基を有するキトサンコンジュゲートもまた遺伝子送
達ベクターとして調べられている。Ｍｕｒａｔａら「遺伝子送達ツールとしての
ペンダントガラクトース残基を有する第４級キトサンの適用の可能性」：「Ｐｏ
ｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｈａｖｉｎｇ Ｐｅｎｄａｎｔ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ Ｒｅｓ
ｉｄｕｅｓ ａｓ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｏｏｌ」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ
ｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，２９（１）：６９−７４（１９９６）；Ｍｕｒａｔａ
ら「遺伝子送達ツールとしてのアンテナリーガラクトース残基を有する第４級キ
トサンコンジュゲートの設計」：「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ
Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｈａｖｉｎｇ Ａｎｔｅｎｎａｒｙ Ｇａ
ｌａｃｔｏｓｅ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ ａｓ ａ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｔｏｏ
ｌ」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３２：１０５−１０９（１９
９７）を参照のこと。キトサンはカチオン性の天然多糖である。しかしながら、
キトサンは強力に荷電している。従って、キトサンは核酸とあまりにも強く複合
体を形成するので、標的細胞に達した時に核酸を適切に放出することができない
。
【００１３】 ガラクトシル化ポリエチレンイミン／ＤＮＡ複合体もまた調べられている。Ｂ
ｅｔｔｉｎｇｅｒら「ガラクトシル化ＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のサイズ縮小が肝細
胞へのレクチンを介した遺伝子導入を改善する」：Ｓｉｚｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ＰＥＩ／ＤＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ
Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｌｅｃｔｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅ
ｒ ｉｎｔｏ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．
，１０：５５８−５６１（１９９９）を参照のこと。しかしながら、このような
複合体は、ＤＮＡを放出するために、リソソームにおけるｐＨ低下に依存してい
る。従って、この機構はｉｎ ｖｉｖｏでの適用に拡大することができない。
【００１４】 従って、核酸分子を細胞に投与するための改良された粒子状ベクターが必要と
される。
【００１５】
【発明の概要】
当業者に明らかなように、これらの発明および他の発明は、核酸と生分解性カ
チオン化ポリヒドロキシル化分子を含む粒状複合体を作成することによって達成
された。この場合、前記分子は電荷を約１．０ｍｅｑ／ｇまで有する。
【００１６】 ［発明の詳細な説明］ 本発明者らは、驚くべきことに、核酸分子と生分解性カチオン化ポリヒドロキ
シル化分子との粒状複合体が、核酸分子を細胞にトランスフェクトするのに有利
であることを発見した。このベクター上の電荷は核酸を安定に結合するのに十分
でなければならない。同時に、電荷は核酸分子の必要な放出を可能にするのに十
分に低いままでなければならない。
【００１７】 「核酸」は、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドと定義される。核酸として
、例えば、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその混合物が挙げられる
。核酸は、天然の配列もしくは化学的に改変された配列またはその誘導体を含ん
でもよい。核酸はまた異なる核酸の混合物でもよい。
【００１８】 ポリヌクレオチドはその目的に応じて任意のサイズでよい。本明細書で使用す
る用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二重鎖、または複数の鎖の形をとる、
１を超えるヌクレオチドからなるＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列を含む。ポリヌク
レオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチドは、短
い長さの（通常、３０塩基長未満の）一本鎖ポリヌクレオチド鎖である。ポリヌ
クレオチドは一般的に３０を超える塩基を含み、上限なくそれよりずっと長くて
もよい。
【００１９】 ポリヌクレオチドは、好ましくは、遺伝子の構造（コード）領域を含む。ポリ
ヌクレオチドはまた、シグナル配列（例えば、プロモーター領域、オペレーター
領域、転移シグナル、終結領域、その組み合わせ）または他の任意の遺伝的に関
連する物質をコードしてもよい。トランスフェクトされる遺伝子は構造領域だけ
を含んでもよく、トランスフェクトされる細胞のＤＮＡに存在する非構造領域（
例えば、シグナル配列）に依存してもよい。ポリヌクレオチドはまた、所望であ
れば、シグナル配列だけをコードしてもよい。トランスフェクトすることができ
るオリゴヌクレオチドの例は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよび
ＲＮＡ）、リボザイム、ならびに３重鎖形成オリゴヌクレオチドである。任意に
、核酸は裸でもよく、本発明の粒状複合体以外のベクター（例えば、プラスミド
ＤＮＡ）の一部でもよい。
【００２０】 核酸は、カチオン化ポリヒドロキシル化分子と複合体化される。好ましいポリ
ヒドロキシル化分子として、例えば、糖、ポリグリコール、ポリビニルアルコー
ル、ポリノキシリンが挙げられる。糖として、単糖、オリゴ糖、および多糖が挙
げられる。糖は天然でもよく合成でもよい。
【００２１】 多糖の例として、デンプン、グリコーゲン、アミロース、およびアミロペクチ
ンが挙げられる。オリゴ糖の例として、マルトース、マルトデキストリン、ラク
トース、およびスクロースが挙げられる。単糖の例として、ガラクトース、マン
ノース、フコース、リボース、アラビノース、キシロース、およびラムノースが
挙げられる。
【００２２】 Ｇｌｕｃｉｄｅｘは、本発明の複合体に使用することができるマルトデキスト
リンの一例である。Ｇｌｕｃｉｄｅｘは、分子量サイズと逆に対応する数で呼ば
れる。例えば、実施例１の表１に示すように、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ２は１０ｋＤａ
の平均分子量を有する。１６個の糖単位でできたＧｌｕｃｉｄｅｘ６は３ｋＤａ
の平均分子量を有する。Ｇｌｕｃｉｄｅｘ１２は１．４ｋＤａの平均分子量を有
し、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ２１は０．８ｋＤａの平均分子量を有する。
【００２３】 ポリヒドロキシル化分子は、この分子に適切なカチオン性部分をグラフト重合
することによってカチオン化することができる。このようなカチオン性部分の例
として、第２級アミノ基もしくは第３級アミノ基、第４級アンモニウムイオン、
またはその組み合わせが挙げられる。グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＴ
ＭＡ）が好ましいカチオン基である。
【００２４】 カチオン化ポリヒドロキシル化分子は生分解性である。「生分解性」は、身体
から代謝および／または排出される断片を得るために、哺乳動物に天然に存在す
る加水分解酵素によって分子が分解できることを意味する。このような酵素の例
として、グリコシダーゼ、アミラーゼ、およびグルコサミニダーゼが挙げられる
。
【００２５】 カチオン化ポリヒドロキシル化分子は、約１．０ｍｅｑ／ｇまでの正電荷を有
する。電荷は、０．００１ｍｅｑ／ｇと小さくてもよく、好ましくは０．０１ｍ
ｅｑ／ｇ、より好ましくは０．１〜０．５ｍｅｑ／ｇである。１．０ｍｅｑ／ｇ
を超える電荷を有する分子は生分解性が低い。従って、ポリヒドロキシル化分子
は、キトサン、第４級化キトサン、またはＤＥＡＥ−デキストランを含まない。
【００２６】 ポリヒドロキシル化分子上での最適電荷は、分子のサイズおよびグラフト重合
される核酸の状態によって異なる。最適電荷は当業者によって決定することがで
きる。ポリヒドロキシル化分子は約０．１〜約０．８５ｍｅｑ／ｇの電荷を有す
ることが好ましい。ＧＴＭＡおよびＧｌｕｃｉｄｅｘの場合、ｍｅｑ／ｇで表さ
れるこのような電荷は、１モルのＧｌｕｃｉｄｅｘ２につき１〜１０モルのグラ
フトＧＴＭＡ、または１モルのＧｌｕｃｉｄｅｘ６につき０．３〜３のグラフト
ＧＴＭＡに対応する。
【００２７】 カチオン化ポリヒドロキシル化分子は、約０．１８ＫＤａ〜１，０００ＫＤａ
の分子量を有することが好ましく、より好ましくは約０．５ＫＤａ〜約５００Ｋ
Ｄａの分子量を有する。
【００２８】 カチオン化ポリヒドロキシル化分子と核酸を結合して、本発明の粒状複合体を
形成する。ポリヒドロキシル化分子および核酸は、当該技術分野において周知の
方法によって結合またはグラフト重合することができる。ポリヒドロキシル化分
子および核酸は、その反対の電荷のために、例えば、溶液中で単に混合すること
によって結合することができる。混合の順番は重要でない。例えば、糖粉末を糖
溶液に可溶化してもよい。このプロセスにおいて、さらなるステップ（例えば、
ホモジナイゼーション、凍結乾燥、濃縮、蒸発、および限界濾過）を用いてもよ
い。
【００２９】 粒状複合体は任意に脂質成分を含む。好ましい態様において、粒状複合体には
カチオン性脂質成分が無い。
【００３０】 粒状複合体は、様々なサイズの核酸および生分解性カチオン化ポリヒドロキシ
ル化分子を含むことができる。従って、本発明の粒状複合体の分子量は変化する
。好ましい粒状複合体のサイズは全体的に見て約１００ｎｍ〜約１０μｍであり
、より好ましくは２００ｎｍ〜１μｍである。
【００３１】 本発明の粒状複合体の全体的な電荷は正電荷と負電荷の相対数の結果であり、
電荷比率で表すことができる。本明細書では、電荷比率は、Ｆｅｌｇｎｅｒら「
合成遺伝子送達システムの用語」：「Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，８：５１１−５１２（１９９７）に従って定義される。 電荷比率＝ ポリヒドロキシル化分子の正電荷（ｍｅｑ／ｇ）×質量（ｇ） 核酸の負電荷（ｍｅｑ／ｇ）×質量（ｇ）
【００３２】 ポリヒドロキシル化分子の正電荷は全てのカチオン性成分を含む。核酸の負電
荷は全てのアニオン性成分を含む。電荷比率はまた、得られた分数を１００で掛
けることによってパーセントで表すことができる。図１では、電荷比率をこのよ
うに示す。
【００３３】 粒状複合体を含む溶液のζ電位は、カチオン化ポリヒドロキシル化分子／核酸
の電荷比率と直接相関する実験パラメータである。電荷比率が＜１である場合、
ζ電位は−であり、粒子上の表面が負に荷電していることを示す。あるいは、こ
の電荷比率が＞１である場合、ζ電位は＋であり、粒子上の表面が正に荷電して
いることを示す。実験的に、ζ電位（ｍＶで表される）は粒子の電荷比率を示す
。ζ電位はζ電位分析器で測定することができる。
【００３４】 本発明の粒状複合体は、正電荷を帯びてもよく負電荷を帯びてもよい。正電荷
の複合体または負電荷の複合体の選択は投与経路によって左右される。静脈内投
与の場合、負電荷の複合体がより適している。粘膜投与の場合、正電荷の複合体
が好ましい。
【００３５】 好ましい態様において、複合体は、約０．３：１のカチオン化ポリヒドロキシ
ル化分子：核酸の電荷比率を有し、この場合、複合体は全体的に負電荷を帯びて
いる。別の好ましい態様において、複合体は、１：約２０のカチオン化ポリヒド
ロキシル化分子：核酸の電荷比率を有し、この場合、複合体は全体的に正電荷を
帯びている。
【００３６】 粒状複合体の電荷比率と核酸放出のキネティクスには密接な関係があることが
発見されている。その結果として、核酸放出のキネティクスは、放出された核酸
のトランスフェクション効率に影響を及ぼす。各複合体の最適電荷比率は、前記
に示したパラメータ内で当業者によって決定することができる。
【００３７】 複合体が全体的に正電荷を帯びている場合、核酸と完全に複合体化するのに必
要な量より多いカチオン化ポリヒドロキシル化分子がある。
【００３８】 別の好ましい態様において、前記のように全体的に正電荷を帯びた複合体を含
み、核酸と複合体化しない過剰なポリヒドロキシル化分子をさらに含む、溶液が
提供される。理論に拘束されるものではないが、過剰なポリヒドロキシル化分子
（例えば、多糖）はトランスフェクション促進剤として働く可能性があると考え
られる。これは、ポリヒドロキシル化分子またはその分解産物とＤＮＡおよび細
胞膜との相互作用による可能性があり、この相互作用によって細胞へのＤＮＡの
透過が促進される。
【００３９】 核酸分子を細胞にトランスフェクトする時に核酸分子を保護する方法も提供さ
れる。この方法は、核酸とカチオン化ポリヒドロキシル化分子を複合体化して前
記の粒状複合体を形成するステップを含む。
【００４０】 別の異なる態様において、核酸分子を細胞に投与する方法が提供される。細胞
への投与はｅｘ ｖｉｖｏで行われてもよく、ｉｎ ｖｉｖｏで哺乳動物細胞に行
われてもよい。この方法は、核酸とカチオン化ポリヒドロキシル化分子を複合体
化して前記の粒状複合体を形成するステップを含む。次いで、周知の手段による
核酸分子の細胞へのトランスフェクションにおいて粒状複合体が用いられる。
【００４１】 １つの態様において、核酸分子は、病原体に見出される免疫原性タンパク質と
少なくとも１つのエピトープを共有するペプチドまたはタンパク質をコードする
。病原体は、例えば、ウイルス、細菌、または原生動物でもよい。ウイルス病原
体の例として、ヒト免疫不全症ウイルス，ＨＩＶ；ヒトＴ細胞白血病ウイルス，
ＨＴＬＶ；インフルエンザウイルス；Ａ型肝炎ウイルス，ＨＡＶ；Ｂ型肝炎ウイ
ルス，ＨＢＶ；Ｃ型肝炎ウイルス，ＨＣＶ；ヒトパピローマウイルス，ＨＰＶ；
単純ヘルペスウイルス１，ＨＳＶ１；単純ヘルペスウイルス２，ＨＳＶ２；サイ
トメガロウイルス，ＣＭＶ；エプスタインバーウイルス，ＥＢＶ；リノウイルス
；およびコロナウイルスが挙げられる。細菌の例として髄膜炎菌、結核菌、連鎖
球菌、および破傷風菌が挙げられる。原生動物の例としてマラリアまたはトリパ
ノソーマが挙げられる。複合体は、免疫応答を誘導するように哺乳動物に投与さ
れる。
【００４２】 前記方法はまた、免疫応答の調節が重要な非病原体性哺乳動物病理に対して用
いられる。非病原体性病理の例として、癌、自己免疫疾患、およびアレルギーが
挙げられる。
【００４３】 粒状複合体は、任意の周知の手段によって哺乳動物に投与することができる。
例えば、投与方法として、粘膜、腫瘍内、肺、静脈内、筋肉内、壁内、眼球内、
皮膚、皮内、皮下、またはその組み合わせを挙げることができる。
【００４４】 本発明の方法に従って治療される哺乳動物は、家畜、ペット動物、実験動物、
およびヒトを含む霊長類などの任意の哺乳動物でよい。家畜として、例えば、ウ
シ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、およびウマが挙げられる。ペット動物として、例えば
、イヌおよびネコが挙げられる。実験動物として、例えば、ウサギ、マウス、お
よびラットが挙げられる。
【００４５】 別の態様において、核酸は、治療用タンパク質を細胞において合成するために
、少なくとも、治療用タンパク質のコード領域を含む。治療用タンパク質の例と
して、酵素、ホルモン、抗原、凝固因子、調節タンパク質、転写因子、および受
容体が挙げられる。治療用タンパク質のある特定の例として、エリスロポエチン
、ソマトスタチン、組織プラスミノゲンアクチベーター、第ＶＩＩＩ因子などが
挙げられる。核酸は、リボザイム、アンチセンス、および遺伝子転写物などの細
胞内オリゴヌクレオチドを得るように設計することができる。この態様において
、核酸は、少なくとも、遺伝子発現を阻害するのに用いられるオリゴヌクレオチ
ドのコード領域を含む。
【００４６】 別の態様において、粒状複合体を含む薬学的組成物が投与される。薬学的組成
物は周知の手段によって製造することができ、一般的な成分を含んでもよい。例
えば、薬学的組成物は、薬学的に許容される希釈剤もしくは担体、緩衝剤、防腐
剤もしくは安定剤、補助剤、および／または賦形剤を含んでもよい。
【００４７】 好ましい態様において、薬学的組成物はトランスフェクション促進剤をさらに
含む。トランスフェクション促進剤の例として、脂質、界面活性剤、酵素、ペプ
チド、または酵素阻害剤が挙げられる。
【００４８】
【実施例１】０．２〜１ｍＥｑ／ｇの電荷を有する生分解性カチオン化糖の調製 表１に示すように、様々な分子量のマルトデキストリン（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ２
、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ６、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ１２、Ｇｌｕｃｉｄｅｘ２１，Ｒｏｑ
ｕｅｔｔｅ，Ｌｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）またはアミロペクチン（Ｗａｘｉｌｙ
ｓ ２００，Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）２０グラムを２Ｎ ＮａＯＨに分散させた。懸濁
液が均一になったら、塩化グリシジルトリメチルアンモニウム（ＧＴＭＡ）（Ｆ
ｌｕｋａ，Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を
添加した。糖におけるイオングラフト重合の程度は、塩化グリシジルトリメチル
アンモニウム量を変えることによって調節した（表１）。この反応によって、糖
に３−（Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアミノ）−２−オール−１−プロピルオキシ基が
グラフト重合された。
【００４９】 反応混合物を室温で５時間攪拌した。次いで、グラフト重合された糖の溶液を
濃酢酸でｐＨ５〜７にし、次いで、蒸留水を添加することで分散させた。
【００５０】 塩および反応副産物を全て除去するために、ポリマー分子量に応じて適切なカ
ットオフを有する膜を用いて、懸濁液を限外濾過した（Ｍｉｎｉｓｅｔｔｅシス
テム、Ｆｉｌｔｒｏｎ、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによる接触限
外濾過）（表１を参照のこと）。小さな分子量のポリマー（Ｇｌｕｃｉｄｅｘ１
２およびＧｌｕｃｉｄｅｘ２１）は無水エタノールで沈殿させた。
【００５１】 ０．２μｍポリエーテルスルホン膜（ＳｐｉｒａｌＣａｐ（登録商標） カプ
セル、Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に通す濾過によって、ポリマ
ー懸濁液を滅菌した。グラフト重合率をプロトンＮＭＲによる窒素元素分析によ
って測定した。結果を表１に示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【実施例２】ＤＮＡ／生分解性カチオン化糖複合体の調製 ボルテックスで攪拌しながら最終体積１ｍｌで、ＤＮＡ １００μｇと必要量
のカチオン化糖を含む溶液を混合することによって、ＤＮＡ／生分解性カチオン
化糖複合体を形成した。添加されるカチオン化糖の量は、必要とされるＤＮＡ／
ポリマー比によって決定した。室温で３０分間のインキュベーション後、複合体
溶液１ｍｌを酢酸緩衝液（２００ ｍＭ，ｐＨ５．３）１２５μｌと混合した。
結果として生じた混合物をボルテックスミキサーでホモジナイズし、４℃で保存
した。
【００５４】 ＤＮＡ／生分解性カチオン化糖複合体の特徴付け 複合体の視覚的外観は透明および均一であった。複合体の特徴を表２にまとめ
た。ＤＮＡ／生分解性カチオン化糖複合体の直径は６０〜３，０００ｎｍである
ようにみえた（光散乱測定（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｎ４ ＳＤ）によって測定した）。
【００５５】
【表２】
【００５６】 ＤＮＡ会合のパーセントを１％アガロースゲル、ＴＡＥ １Ｘで評価した。配
合物２０μｌをロード溶液１０Ｘ（グリセロール５０％、ブロモフェノールブル
ー０．０２５％）２μｌと混合し、次いで、結果として生じた溶液２０μｌをウ
ェルごとにロードした。ロードされたＤＮＡの計算量は１．６μｇ／ウェルであ
った。対照として同量のＤＮＡをロードした。９０Ｖで４０分間のゲルの移動後
、ゲルをＢＥＴ浴中で染色し、その後、紫外光の下で視覚化した。
【００５７】 試験したロードされたＤＮＡ／カチオン化糖複合体についてＤＮＡの移動は検
出されなかった。移動は、カチオン化糖にグラフト重合されていない遊離ＤＮＡ
でしか観察されなかった。これらの結果は、ＤＮＡ初期投入量の１００％が糖に
よって複合体化されたことを証明している。
【００５８】
【実施例３】カチオン化糖の生分解性および封入されたＤＮＡの遊離 ＤＮＡ／カチオン化糖複合体の生分解性をｉｎ ｖｉｔｒｏ分解アッセイでア
ッセイした。２００μｌの配合物を、４０μｌのアミラーゼカクテル（クエン酸
緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ５）に溶解した１ｍｇ／ｍｌ α−アミラーゼ、１ｍ
ｇ／ｍｌアミログルコシダーゼ）に添加した。室温で回転攪拌しながら一晩イン
キュベーションした後、処理試料２０μｌを１％アガロースゲルにロードした。
【００５９】 アミラーゼが省かれた時に、ロードされたＤＮＡ／カチオン化糖複合体につい
てＤＮＡの移動は検出されなかった。アミラーゼが添加された時に、ＤＮＡのか
なりの部分がゲル内に移動した。糖／ＤＮＡ比が小さい複合体については、ＤＮ
Ａは全て回収され、遊離ＤＮＡと同じ位置に移動した。
【００６０】 これらの結果は、ポリマーが生分解性であり、そのためＤＮＡを放出できるこ
とを証明している。さらに、放出後、ＤＮＡの修飾は検出できなかった。一例と
して、スーパーコイル型／リラックス型比の変化は検出されず、これは、粒子形
成間にＤＮＡのニック形成が起こらないことを示している。
【００６１】
【実施例４】ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション研究 Ｉ．材料および方法 〈プラスミドＤＮＡ〉 遺伝子導入研究は、β−ガラクトシダーゼをコードするｐＣＭＶβプラスミド
ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。プラスミドＤＮＡを二重塩化セシ
ウム勾配遠心分離（ＢｉｏＳｅｒｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔ
ｄ，ＵＳＡ）によって精製し、精製水に再懸濁した。ＤＮＡの濃度は４．７ｍｇ
／ｍｌであった（紫外線吸光度（ＯＤ２６０）に基づいて計算した）。エンドト
キシン濃度は２．５ＩＵ／ｍｇであった（Ｌｉｍｕｌｕｓアッセイ（Ｃｈａｒｌ
ｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）によって測定した）。使用に必要とされるま
でＤＮＡ溶液を−２０℃で保存した。ＤＮＡを、食塩水に接した純粋なプラスミ
ドＤＮＡ（裸のＤＮＡ）として投与したか、または生分解性カチオン化糖と共に
配合した。
【００６２】 〈ＤＮＡ／生分解性カチオン化糖複合体〉 生分解性カチオン化糖を実施例１に前記のように合成した。ＤＮＡ／ｇｌｕ２
およびＤＮＡ／ｇｌｕ６複合体を実施例２に前記のように調製した。
【００６３】 〈ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入〉 動物 全ての実験を、８〜９週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａ
ｎｃｅ）（４匹／実験群または対照群）を用いて行った。
【００６４】 筋肉内投与 各動物の大腿四頭筋に、総体積１００μｌで８μｇの裸のＤＮＡまたは配合Ｄ
ＮＡを１回筋肉内注射した。注射は、挿入を２ｍｍに制限するポリエチレンチュ
ーブを取り付けた２７×１／２ゲージ針を用いて行った。
【００６５】 レポーター遺伝子発現の評価 注射の７日後に、各マウスの足から大腿四頭筋を丸ごと採取した。採取直後に
筋肉を液体窒素で凍結し、２．０ｍｌエッペンドルフチューブに入れて−８０℃
で保存した。個々に凍結筋肉を、ドライアイスで冷却した磁器製の乳鉢および乳
棒を用いて手で磨砕することによって粉砕して微粉にし、抽出まで粉末を−８０
℃で同じチューブに入れて保存した。β−ガラクトシダーゼ溶解緩衝液（１００
ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、および５μｇ／
ｍｌロイペプチン）１ｍｌを添加した。後ろ３つの成分は使用直前に添加した。
試料を１５分間ボルテックスし、液体窒素と３７℃水浴を交互に用いて３回凍結
融解し、１３，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。上清を別の１．５ｍｌエッ
ペンドルフチューブに移し、β−ガラクトシダーゼ酵素アッセイ試験まで−８０
℃で保存した。
【００６６】 β−ガラクトシダーゼ基質としてＭＵＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）を用い
たβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイを、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
．５）；１２５ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＤＴＴ；および２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含
む反応緩衝液中で行った。使用直前に、（エタノールに溶解した２０ｍｇ／ｍｌ
スラリーとして調製した）ＭＵＧ基質を１００μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで
添加した。
【００６７】 既知量の精製β−ガラクトシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を対照筋肉抽出上清５
０μｌに（５０μｌ中２００ｐｇ〜２００ｎｇの範囲で）添加することによって
、標準を調製した。１．５ｍｌエッペンドルフチューブ内で完全反応緩衝液２０
０μｌを試料５０μｌに添加することで試料をアッセイし、３７℃で１時間イン
キュベートした。冷２５％トリクロロ酢酸５０μｌを添加することで反応を止め
、氷上で５分間冷却し、室温で２分間の遠心分離によって清澄した。各試料の２
００μｌアリコートをグリシン／炭酸緩衝液２ｍｌに添加し、ボルテックスし、
３６６ｎｍ励起および４４２ｎｍ発光を用いて分光蛍光計で読み取った。
【００６８】 筋肉抽出物のタンパク質濃度を、ｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）
を用いて測定した。試料中のβ−ガラクトシダーゼ酵素濃度を測定し、β−ガラ
クトシダーゼ標準曲線およびタンパク質濃度を用いた標準化後にβ−ガラクトシ
ダーゼｎｇ／総タンパク質ｍｇとして表した。
【００６９】 ＩＩ．結果 結果を図１に示す。カチオン性Ｇｌｕｃｉｄｅｘ２およびＧｌｕｃｉｄｅｘ６
と配合され、筋肉内投与されたＤＮＡは、筋肉において高レベルのβ−ガラクト
シダーゼ発現を可能にした。最も高い発現は、電荷比率２０のＤＮＡ／ｇｌｕ２
および電荷比率２のＤＮＡ／ｇｌｕ６を用いて得られた。また、ｇｌｕ２につい
ては電荷比率をだんだんと増やした時に、発現量の増加が観察された。最も重要
なことには、電荷比率２のＤＮＡ／ｇｌｕ６を用いた発現量は裸のＤＮＡを用い
た発現量より多かった。
【００７０】
【実施例５】免疫学的研究 Ｉ．材料および方法 〈プラスミドＤＮＡ〉 免疫研究を、実施例４に記載のβ−ガラクトシダーゼをコードするｐＣＭＶβ
プラスミドＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて行った。
【００７１】 〈ＤＮＡ／生分解性カチオン化糖配合物〉 生分解性カチオン化糖を実施例１に前記のように合成した。ＤＮＡ／Ｇｌｕｃ
ｉｄｅｘ Ｇ２−ＧＴＭＡおよびＤＮＡ／Ｇｌｕｃｉｄｅｘ Ｇ６−ＧＴＭＡ配
合物を実施例２に前記のように調製した。
【００７２】 〈ＤＮＡ免疫〉 動物 免疫実験を、８〜９週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎ
ｃｅ）（４または５匹／実験群または対照群）を用いて行った。
【００７３】 〈筋肉内投与〉 各動物に、総体積１００μｌで８μｇの裸のＤＮＡまたは配合ＤＮＡ（各大腿
四頭筋に５０μｌ）を３週間間隔で３回または４回筋肉内注射した。注射は、挿
入を２ｍｍに制限するポリエチレンチューブを取り付けた２７×１／２ゲージ針
を用いて行った。
【００７４】 〈血液試料の採取〉 各注射の２週間後に、末梢血を眼窩後穿刺によって採取した。
【００７５】 〈抗体アッセイ〉 血清学的応答を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。Ｍａｘ
ｉｓｏｒｂマイクロタイターウェル（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、ＰＢＳに
溶解した２μｇ／ｍｌの組換えβ−ガラクトシダーゼタンパク質（Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｒａｎｃｅ）５０μｌで４℃で一晩コーティングし
た。ウェルを、ＰＢＳに溶解した３％ＢＳＡで１時間ブロックし、ＰＢＳに溶解
した０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄した。血清を、０．１％ＢＳＡおよび０
．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで希釈した。１ウェルにつき５０μｌの
血清試料を３７℃で２時間インキュベートし、その後、洗浄し、西洋ワサビペル
オキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加した
。１時間のインキュベーションおよび洗浄後、リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５
．０）およびＨ２Ｏ２に溶解したＯ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（Ｏ
ＰＤ）１００μｌを基質として添加した。３０分後に、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４５０μ
ｌを用いて発色を止め、４９０ｎｍ吸光度を測定した。ＳＯＦＴｍａｘ（登録商
標）ＰＲＯソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて抗体
力価を計算し、０．２に等しい吸光度を生じる最終希釈の逆数として表した。
【００７６】 〈細胞性応答の評価〉 ３回目の免疫の７日後に、単一細胞懸濁液をマウスの脾臓から調製した。赤血
球を溶解するために脾細胞をＴｒｉｓ緩衝ＮＨ４Ｃｌで処理し、Ｇｌｕｔａｍａ
ｘ−Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）、５
×１０−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、１ｍＭ
ピルビン酸ナトリウム、および抗生物質を含むＲＰＭＩ １６４０培地（完全培
地）に１０×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【００７７】 〈ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ〉 抗ＩＦＮ−γラット抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、販売Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）をコーティングし、関連または非関連ＣＴＬペプ
チド（２．５μｇ／ｍｌ）１００μｌを含む平底Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ９６ウ
ェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）に、完全培地１００μｌ中
１００万個の脾細胞を、３７℃で２４時間、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下で添
加した。陽性対照は、コンカナバリンＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激された細胞にあ
った。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％で洗浄した後、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ
２０ ０．０５％，ＢＳＡ１％に溶解したモノクローナルビオチン結合ラット抗
体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１００μｌを添加した。３７℃で１時間のインキュ
ベーション後、プレートを洗浄し、ｅｘｔｒＡｖｉｄｉｎｅ−Ａｌｋａｌｉｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ）１００μｌを添加した
。もう１時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、アルカリホスファ
ターゼ基質溶液（ＡＰコンジュゲート基質キット、Ｂｉｏｒａｄ）１００μｌを
添加した。３０分後、反応を止め、双眼ルーペを用いてスポットを計数した。
【００７８】 〈細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ〉 β−ガラクトシダーゼに対する特異的溶解を４時間の５１Ｃｒ遊離アッセイで
評価した。脾細胞を、完全培地中１０×１０６細胞／ｍｌの密度で直立７５ｃｍ２ フラスコ（Ｎｕｎｃ）に入れて、０．１μｇ／ｍｌ特異的ＣＴＬペプチドの存
在下で培養した。合成ペプチドＴＰＨＰＡＲＩＧＬ（Ｔ９Ｌペプチド）およびＩ
ＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬ（Ｉ１２Ｌ）は、それぞれ、β−ガラクトシダーゼおよ
びＨＢｓＡｇの天然にプロセシングされるＨ−２Ｌｄ拘束性ＣＴＬエピトープに
相当する。この２つのペプチドはＮｅｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒａｎｃｅによって合
成された。２４時間後、１０ＵＩ／ｍｌ ＩＬ−２（Ｔｅｂｕ，Ｆｒａｎｃｅ）
を培養物に添加し、５日間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＣＴＬ活性
について評価した。β−ガラクトシダーゼＣＴＬ測定のための特異的標的細胞は
、Ｔ９ＬペプチドでパルスされたＰ８１５であった。Ｉ１２Ｌペプチドでパルス
されたＰ８１５細胞は非特異的標的として用いられた。全ての場合において、Ｐ
８１５の非特異的溶解は、１００：１のエフェクター：標的比で５％未満であっ
た。
【００７９】 ＩＩ．結果 〈抗体応答の分析〉 図２に示すように、ＤＮＡ／カチオン化糖複合体の２回または３回の筋肉内投
与後に、β−ガラクトシダーゼタンパク質に対する抗体が血清中に検出された。
さらに重要なことには、ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ−６ ＧＴＭＡ配合物を注射
したマウスは、同量の遊離ＤＮＡを注射したマウスより高い特異的抗体力価を示
した。
【００８０】 〈細胞性応答の分析〉 ＤＮＡ／カチオン化糖複合体が細胞性免疫応答を誘導する能力を、最初に、新
鮮な脾細胞およびβ−ガラクトシダーゼ抗原の特異的なＭＨＣクラスＩ ＣＴＬ
ペプチド（Ｔ９Ｌ）を用いたＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで研究した（
方法を参照のこと）。図３に示すように、ＤＮＡ／カチオン化糖複合体を３回筋
肉内免疫したマウスから新鮮に単離された脾臓リンパ球を、Ｔ９Ｌペプチドの存
在下で２４時間培養した場合、ＩＦＮ−γ分泌細胞に対応するかなりの数のスポ
ットが計数された。脾細胞を培地のみ、または非関連ＭＨＣクラスＩペプチド（
Ｉ１２Ｌ）とインキュベートした場合にはスポットは見られなかった。このこと
から、この分泌の特異性が証明された。頻度は、ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ−６ ＧＴＭＡ配合物を用いた３回の免疫後、約１５０スポット／１０６細胞であり
、これは遊離ＤＮＡを用いて得られた頻度より３倍高かった。
【００８１】 また、β−ガラクトシダーゼ特異的細胞性応答を、大量培養でβ−ガラクトシ
ダーゼ優性ＭＨＣクラスＩペプチドを用いて５日間ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した後
、標準的な５１Ｃｒ遊離アッセイで研究した。ＤＮＡ／カチオン化糖複合体８μ
ｇを４回筋肉内投与したマウスでは著しいＣＴＬ活性が検出された（図４）。さ
らに重要なことには、ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ−６ ＧＴＭＡ配合物を用いた
４回の免疫後のＣＴＬ活性は、遊離ＤＮＡを用いて得られた活性より高かった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の複合体を使用した、または使用しなかった筋肉におけるβ−ガラクト
シダーゼ発現を示すグラフである。
【図２】 ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ６−ＧＴＭＡを筋肉内投与した後のβ−ガラクトシ
ダーゼに対する抗体の産生を示すグラフである。
【図３】 ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ６−ＧＴＭＡを筋肉内投与した後の細胞性応答（ｅ
ｌｉｓｐｏｔ γ−ＩＦＮ）の誘導を示すグラフである。
【図４】 ＤＮＡ／ｇｌｕｃｉｄｅｘ６−ＧＴＭＡで免疫した後のＣＴＬ応答の誘導を示
すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マリネッテ モイニアー フランス国、ラモンヴィル サンターニュ エフ−31520、アヴェニュー、トロサネ、 36 (72)発明者 イグナシオ デ ミグエル フランス国、プライサンス ドゥ トウチ エフ−31830、ルー パストゥール、５ (72)発明者 オリヴィエール バランド フランス国、ペシャボウ エフ−31320、 アレー デス プラタネス、20 (72)発明者 フィリップ パジョト フランス国、トゥールーズ エフ−31400、 ルー デス 36 ポンツ、66 (72)発明者 ジョセリン ヴァズ サンティアゴ フランス国、ユニオン エフ−31240、 ロウテ デ トゥールーズ、49 (72)発明者 ポール ヴォン ホエゲン ベルギー国、オハイン／ラスネ ビー− 1380、ロウテ デ レニポント 25エー Ｆターム(参考） 4C076 AA29 BB13 BB15 BB16 BB21 BB24 BB27 EE38 4C084 AA13 MA05 MA41 NA13

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 核酸と生分解性カチオン化ポリヒドロキシル化分子を含む粒
    状複合体であって、前記分子が電荷を約１．０ｍｅｑ／ｇまで有する、粒状複合
    体。
  2. 【請求項２】 前記核酸が二本鎖または一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは
    その混合物である、請求項１に記載の複合体。
  3. 【請求項３】 前記核酸が、天然のオリゴヌクレオチドもしくは化学的に改
    変されたオリゴヌクレオチドまたはその誘導体である、請求項１に記載の複合体
    。
  4. 【請求項４】 前記核酸が、天然のポリヌクレオチドもしくは化学的に改変
    されたポリヌクレオチドまたはその誘導体である、請求項１に記載の複合体。
  5. 【請求項５】 前記生分解性カチオン化ポリヒドロキシル化分子が約０．１
    〜約０．８５ｍｅｑ／ｇの電荷を有する、請求項１に記載の複合体。
  6. 【請求項６】 前記ポリヒドロキシル化分子が、カチオン性部分を含む糖で
    ある、請求項１に記載の複合体。
  7. 【請求項７】 前記糖が多糖である、請求項６に記載の複合体。
  8. 【請求項８】 前記糖がオリゴ糖である、請求項６に記載の複合体。
  9. 【請求項９】 前記糖が単糖である、請求項６に記載の複合体。
  10. 【請求項１０】 前記カチオン性部分が、第２級アミノ基もしくは第３級ア
    ミノ基；第４級アンモニウムイオン；またはその組み合わせを含む、請求項６に
    記載の複合体。
  11. 【請求項１１】 第４級アンモニウムイオンがグリシジルトリメチルアンモ
    ニウムである、請求項１０に記載の複合体。
  12. 【請求項１２】 前記カチオン化ポリヒドロキシル化分子が約０．１８ｋＤ
    ａ〜約１０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の複合体。
  13. 【請求項１３】 前記カチオン化ポリヒドロキシル化分子が約０．５ｋＤａ
    〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１２に記載の複合体。
  14. 【請求項１４】 前記複合体が約１００ｎｍ〜約１０μｍのサイズの複合体
    である、請求項１に記載の複合体。
  15. 【請求項１５】 前記複合体が約０．３：１のカチオン化ポリヒドロキシル
    化分子：核酸の電荷比率を有し、全体的に負電荷を帯びている、請求項１に記載
    の複合体。
  16. 【請求項１６】 前記複合体が１：約２０のカチオン化ポリヒドロキシル化
    分子：核酸の電荷比率を有し、全体的に正電荷を帯びている、請求項１に記載の
    複合体。
  17. 【請求項１７】 前記核酸と複合体化しない過剰なカチオン化ポリヒドロキ
    シル化分子をさらに含む、請求項１６に記載の複合体を含む溶液。
  18. 【請求項１８】 核酸分子を細胞にトランスフェクトする時に核酸分子を保
    護する方法であって、前記核酸とカチオン化ポリヒドロキシル化分子を複合体化
    して請求項１に記載の粒状複合体を形成するステップを含む、方法。
  19. 【請求項１９】 前記複合体が約０．３：約２０のカチオン化ポリヒドロキ
    シル化分子：核酸の電荷比率を有する、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ｅｘ ｖｉｖｏで核酸分子を細胞にトランスフェクトする
    方法であって、前記核酸とカチオン化ポリヒドロキシル化分子を複合体化して請
    求項１に記載の粒状複合体を形成するステップと、前記細胞を前記複合体でトラ
    ンスフェクトするステップを含む、方法。
  21. 【請求項２１】 前記複合体が約０．３：約２０のカチオン化ポリヒドロキ
    シル化分子：核酸の電荷比率を有する、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 核酸分子を哺乳動物に投与する方法であって、前記核酸と
    カチオン化ポリヒドロキシル化分子を複合体化して請求項１に記載の粒状複合体
    を形成するステップと、前記複合体を前記哺乳動物に投与するステップを含む、
    方法。
  23. 【請求項２３】 前記複合体が約０．３：約２０のカチオン化ポリヒドロキ
    シル化分子：核酸の電荷比率を有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記複合体の投与が筋肉内である、請求項２２に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】 前記核酸が免疫原性抗原をコードする、請求項２２に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 前記核酸が治療用タンパク質をコードする、請求項２２に
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載の複合体を含む薬学的組成物。
  28. 【請求項２８】 トランスフェクション促進剤をさらに含む、請求項２７に
    記載の薬学的組成物。
  29. 【請求項２９】 前記トランスフェクション促進剤が、脂質、界面活性剤、
    酵素、ペプチド、および酵素阻害剤からなる群より選択される、請求項２８に記
    載の薬学的組成物。
  30. 【請求項３０】 前記トランスフェクション促進剤が、前記核酸と複合体化
    しない遊離カチオン化ポリヒドロキシル化分子を含む、請求項２８に記載の薬学
    的組成物。
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