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JP2003530828A - ヒト多能性幹細胞の増殖および分化のための技術 - Google Patents

ヒト多能性幹細胞の増殖および分化のための技術

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Publication number
JP2003530828A
JP2003530828A JP2001551190A JP2001551190A JP2003530828A JP 2003530828 A JP2003530828 A JP 2003530828A JP 2001551190 A JP2001551190 A JP 2001551190A JP 2001551190 A JP2001551190 A JP 2001551190A JP 2003530828 A JP2003530828 A JP 2003530828A
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JP
Japan
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cells
medium
pps
cell
feeder
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Application number
JP2001551190A
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メリサ， ケー． カーペンター
ウォルター， ディー． ファンク
ジョセフ， ディー． ゴールド
マーガレット， エス． イノクマ
チュンヒュイ シュー
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Geron Corp
Original Assignee
Geron Corp
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Abstract

(57)【要約】 この開示は、フィーダー細胞の非存在下でヒト多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための改善されたシステムを提供する。そのフィーダー細胞の役割は、細胞外マトリックス上のその培養物を支持し、そしてその細胞を馴化培地で培養することによって置き換えられ得る。商業的規模で馴化培地を産生し得る永久的な細胞株が提供される。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質複合体を細胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺伝的に変更する方法もまた見出された。本開示により記載されるシステムは、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究、およびヒト治療における使用のための重要な製品の産生において使用するためのｐＰＳ細胞の大規模増殖を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、胚細胞の細胞生物学の分野に一般的に関与する。より詳細には、本
発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改
変、ｃＤＮＡライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化した細胞の
産生のための使用に関与する。
【０００２】 （関連申請書の参考） 本願は、以下の係属中の米国特許出願（ＵＳＳＮ６０／１７５，５８１，２０
００年１月１１日提出；ＵＳＳＮ６０／２１３，７４０、２０００年６月２２日
提出；ＵＳＳＮ６０／２１３，７３９、２０００年６月２２日提出；ＵＳＳＮ６
０／２１６，３８７、２０００年７月７日提出；ＵＳＳＮ６０／２２０，０６４
、２０００年７月２１日提出；および０９／６８８／０３１、２０００年１０月
１０日提出）に対して優先権を主張する。
【０００３】 米国における手続き上の目的に対して、これらの優先権出願は、本明細書中に
よって、それら全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００４】 （背景） 最近の発見は、幹細胞が、疾患、感染の過程で、または先天性異常のために損
傷した細胞および組織の置換源であり得るという期待を生じた。推定される幹細
胞の種々の型は、それらが分裂する場合に、分化して、心臓、肝臓、または脳の
ような特定の組織の独特の機能を実行し得る細胞へ成熟する。特に重要な開示は
、ほとんどいずれの細胞型へ分化する能力を有すると考えられる、多能性幹細胞
の発生である。
【０００５】 多能性幹細胞の初期の研究は、マウスにおいて実施された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏ
ｎ，Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：１７３，１９９７；およびＰｅｄ
ｅｒｓｅｎ，Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５４３，１９９４に
総説される）。マウス幹細胞は、早期胚細胞および胚組織の両方から単離され得
る。多能性幹細胞の所望される特徴は、それらが、未分化状態におけるインビト
ロでの不明確な増殖を可能にし、正常な核型を保持し、そしてすべての三つの胚
性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の派生物に分化する能力を保持すること
である。
【０００６】 ヒト多能性幹細胞の調製の開発は、多くの技術的な困難を克服する工程を含み
、マウス細胞における研究に比べてほとんど進歩していない。
【０００７】 Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７８０号； Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５）は、初めて霊長類か
ら多能性幹細胞を首尾よく単離し、そして増殖させた。彼らは、それに続いてヒ
ト胚盤胞からヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株を誘導した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２
：１１４，１９９８）。Ｇｅａｒｈａｒｔおよび共同研究者らは、胎児性腺組織
からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８；およ
び米国特許第６，０９０，６２２号）。
【０００８】 ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞の両方が、長い期間探求された以下の多能性胚細
胞の特徴を有することが報告された：それらが、分化することなくインビトロに
おいて長期増殖し得ること、それらが、通常の核質を有すること、そしてそれら
が、多くの異なる細胞型を産生し得るままであること。このことによって、これ
らは、遺伝的な異常、外傷または疾患状態によって損なわれたほとんどすべての
組織の再生のための貯蔵器として作用する、ヒトの治療における使用に関してか
なりの見込みを保有する。
【０００９】 治療のための多能性幹細胞の使用への重要な問題は、多能性幹細胞が、分化を
防ぐためにフィーダー細胞の層の上に伝統的に培養されることである（米国特許
第５，８４３，７８０号；米国特許第６，０９０，６２２号）。培養環境におい
てフィーダー細胞が存在しないとき、ｈＰＳ細胞は、まもなく死ぬか、または約
束される細胞の異種の集団に分化する。白血病阻害因子（ＬＩＦ）は、マウスＰ
Ｓ細胞の分化を阻害するが、これは、ヒトＰＳ細胞の分化の防止において、フィ
ーダー細胞の役割を置き換えるのではない。不幸にも、フィーダー細胞の使用は
、生産コスト、損傷、スケールアップを増加させ、そして多能性幹細胞をフィー
ダー細胞成分から分離させることを必要とする、混合した細胞集団を産生させる
。
【００１０】 別の問題は、幹細胞の各々の患者の処置に必要な特定の型の組織への分化を制
御することである。分化の過程のよりよい理解が、多能性幹細胞の増殖および分
化の間の遺伝子発現を観察することによって獲得されるということが本発明の仮
説である。
【００１１】 国際特許公開ＷＯ９９／２０７４１（Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）は、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
Ｐｒｉｍａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
ｓという表題である。低浸透圧および低エンドトキシンレベルである、実質的に
未分化状態である霊長類由来の始原幹細胞を増殖するための細胞培養培地が、提
供される。基本培地は、フィーダー細胞の基質またはフィーダー細胞マトリック
ス上の霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持するのに有効な血清と組み合せる。
培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、およびヌクレオシドまたはピルビン酸塩の
いずれかである成長因子をさらに含む。
【００１２】 初期ヒト発生についての配列に基づく研究は、胎児の器官および組織から産生
されたライブラリー（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ協会（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇ
ｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／）から供給される胎児ライブラリーの）に焦点が置かれ
た。国際特許公開ＷＯ９８／００５４０（Ｉｎｃｙｔｅ）は、ＴＨＰ−１細胞お
よび膀胱腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された幹細胞抗原の部分配列
を報告する。
【００１３】 未分化の多能性幹細胞の増殖および操作を容易にする新たな技術は、胚性細胞
療法の完全な可能性の理解への主要な業績である。
【００１４】 （発明の要旨） 本開示は、フィーダー細胞の非存在下において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細
胞を培養するための改良された系を提供する。フィーダー細胞の役割は、細胞外
マトリックス上における培養を支持し、そして馴化培地において細胞を培養する
工程によって置き換えられる。商業的スケールで馴化培地を産生し得る永久的な
細胞株が、提供される。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質複合体を用いて細
胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺伝的に変更する方法もまた、発見さ
れた。本開示において記載される系は、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究における
使用の目的に、ｐＰＳ細胞の大量の増殖を可能にし、ヒト治療における使用の目
的に重要な生成物の産生を可能にする。
【００１５】 本質的にフィーダー細胞を含まない増殖中のｐＰＳ細胞を含む組成物が、本開
示において記載される。この組成物は、フィーダー細胞の培養物から培地を収集
することによって産生された馴化培地、および細胞外マトリックス成分によって
コートされた基質もまた含み得る。ｐＰＳ細胞は、未分化状態においてこの増殖
条件下に継代され、そして拡大され得る。
【００１６】 本開示は、培地中において細胞を培養することによって培地を馴化する工程、
および馴化培地を収集する工程を含む、本質的にフィーダー細胞を含まない増殖
環境下において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するために適切な馴化培
地を産生するための方法もまた提供する。培地を馴化するために用いられる細胞
は、非悪性供給源由来であり、そして通常の核型を有するような、大規模な培養
が可能である（６０日またはそれ以上のような）ような一つ以上の所望される特
徴を有し得、線維芽細胞に特徴的な形態的な特徴または細胞マーカーを有し得、
そして不死化される（例えば、テロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的
に改変されることによって）。ヒト胚性幹細胞から適切なヒトフィーダー細胞株
を産生するための方法を記載する 本開示は、フィーダー細胞を含まない培養物においてｐＰＳ細胞が分化するこ
とを引き起こす工程または可能にする工程を含む、分化した細胞集団を産生する
方法を提供する。
【００１７】 本開示はまた、直接分化によって（フィーダー細胞の存在または非存在下にお
いて培養された）ｐＰＳ細胞から分化した細胞を産生するための方法を提供する
。細胞懸濁液が、過増殖、コロニーの形成、胚様体の形成、または他の凝集体の
形成が存在する前に未分化のドナー培養物から調製され、次いで固体表面上へ直
接的にプレートする。表面は、（ポリリシンまたはポリオルニチンのような）ポ
リカチオンを帯び得る。特定の細胞系統への分化はまた、フィーダー細胞のない
培養においてまたはリプレーティング後のいずれかにおいて、分化を阻害する血
清または因子を除去すること、および／または分化を促進する因子を添加するこ
とによって促進され得る。
【００１８】 本開示は、細胞毒性または細胞の調節についての化合物のスクリーニングの方
法もまた提供し、この方法は、化合物に本発明の分化した細胞を接触させる工程
、化合物との接触に起因する、任意の細胞における表現型または代謝の変化を決
定する工程、およびこの変化を細胞毒性あるいは細胞機能または生化学における
他のすべての変化と相関させる工程を含む。
【００１９】 遺伝子およびタンパク質の発現は、ｐＰＳ細胞から得られる異なる細胞集団の
間で比較され得、そして分化の過程において上方制御または下方制御される因子
を同定および特徴付けするために使用され得、そして変質した遺伝子のヌクレオ
チドコピーを産生する。
【００２０】 本開示は、遺伝的に変更された霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生するた
めの方法もまた提供する。一つのバリエーションにおいて、ｐＰＳ細胞は、フィ
ーダー細胞のない培養においてトランスフェクトされる。別のバリエーションに
おいて、ｐＰＳ細胞は、薬剤耐性であり、そして首尾よくトランスフェクトされ
たｐＰＳ細胞の薬剤選択に耐えるフィーダー細胞を含む培養においてトランスフ
ェクトされる。トランスフェクションに用いるベクターは、未分化のｐＰＳ細胞
において転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード
領域をしばしば含む。霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞またはそれから分化した
細胞の集団もまた、提供され、ここで実質的な比率の細胞が、ポリヌクレオチド
を用いて安定にトランスフェクトされているか、またはこのポリヌクレオチドを
遺伝的に受け継いだこのような細胞の子孫である。
【００２１】 本開示は、分化前または後の霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞からのｍＲＮＡ
調製物またはｃＤＮＡライブラリーを産生するための方法もまた提供し、この方
法は、本質的にフィーダー細胞のない、未分化のｐＰＳ細胞の培養物を提供する
工程、必要に応じてｐＰＳ細胞を分化させる工程、そして未分化または分化した
細胞からのｍＲＮＡを単離する工程を含む。これらの技術は、ｃＤＮＡ発現また
はサブトラクションライブラリーの調製に用いられ得る。ｍＲＮＡを、フィーダ
ー細胞のないｐＰＳ培養物から得る場合、ｃＤＮＡライブラリーは、未分化のｐ
ＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞のいずれかにおいて、ｍＲＮＡレ
ベルで発現された少なくとも１，０００の遺伝子を含み得、本質的に他の脊椎動
物のｃＤＮＡを含まない。未分化のｐＰＳ細胞、およびその分化した子孫におい
て発現する遺伝子に対する配列情報は、ｃＤＮＡおよび発現した遺伝子のタンパ
ク質誘導体、ならびにその遺伝子産物に対する特異的な抗体の調製に用いられ得
る。
【００２２】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下に続く記載から明らかである。
【００２３】 （詳細な説明） 本開示は、分化を抑制するためにフィーダー細胞の層を必要とすることなく、
インビトロにおける霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を増殖させるための系を提供
する。
【００２４】 フィーダー細胞の役割は、分化なしに細胞の増殖を支持する培養環境における
特徴によって置き換え得ることが発見された。その特徴の一つは、Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ（登録商標）およびラミニンによって例示される細胞外マトリックスのよう
な、培養表面上の適切な基質である。別の特徴は、馴化培地に例示される、いく
つかの方法において効果的に分化を抑制する因子を含む培養培地の使用である。
ｐＰＳ細胞を支持するように培地を馴化するための細胞は、初代胚性線維芽細胞
、テロメア化した線維芽細胞、および培養されたｐＰＳ細胞から分化し、そして
選択された線維芽様細胞を含む。
【００２５】 例示的な調製において、未分化のｈＥＳコロニーを、フィーダー細胞上のｈＥ
Ｓ培養物から回収し、次いで各９．６ｃｍ2ウエルに約１５コロニーで、馴化培
地中の各Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質の上に播種した。播種の次の日、未
分化のｈＥＳ細胞は、約１００〜２０００個の細胞の小さなコロニーとして可視
であり、そして単一の細胞が、分化しているか、または死んでいるようにみえる
コロニーの中間に存在する。ｈＥＳ細胞が増殖されるにつれて、コロニーは、大
きくそしてコンパクトになり、これは、培養皿の表面領域の大部分を提案する。
コンフルエント近くになると、細胞のほとんどが、未分化細胞の形態的な特徴を
有し、コロニーの間にある分化細胞は、培養物中の細胞の１０％未満に相当した
。
【００２６】 倍化速度は、ほぼ２０〜４０時間程度であり、フィーダー細胞上に増殖される
ｈＥＳ細胞と比較し得る。培地は、毎日換えられ、そして細胞は、６日または７
日ごとに分割および継代された。最初の播種の１９日後、細胞は免疫蛍光法によ
って細胞表面の表現型に関して試験された。９０％以上を超える細胞が、ＳＳＥ
Ａ−４およびＴｒａ−１−６０に関して陽性に染色され；８０％以上を超える細
胞が、Ｔｒａ−１−８１に関して陽性に染色されたが、１５％未満が、ＳＳＥＡ
−１に関して陽性に染色された。このことは、調製物中の細胞の少なくとも約８
０％は、未分化ｈＥＳ細胞として予測される表現型を有したことを示す。
【００２７】 フィーダー細胞が、高品質の馴化培地を産生する能力を失わせることなく、長
期間の培養において不死化および維持され得ることもまた発見された。例えば、
初代マウス胚性線維芽細胞は、これらテロメラーゼ逆転写酵素を発現するように
遺伝的に改変することによって、不死化され得る（実施例８）。培地を馴化する
のに適切なヒト細胞が、インビトロにおいて胚性幹細胞を分化することによって
得られ得ることもまた発見された。ｈＥＳ細胞は、懸濁液中における胚様体の形
成、そして次いで線維芽様細胞の同種の集団が得られるような様式での培養によ
って分化された(実施例１２および１３）。
【００２８】 形質導入されていないｈＥＦ細胞株およびテロメア化されたｈＥＦ細胞株の両
方は、連続細胞培養物中で増殖し、そして馴化培地を産生するために用いられた
。この培地中において増殖されるｈＥＳ細胞の培養は、初代ｍＥＦフィーダー細
胞の層の上に直接的に増殖されたｈＥＳ細胞と区別できない未分化ｈＥＳ細胞の
形態的な特徴を有するコロニーを形成することが発見された（図１４、パネルＡ
）。このことは、培養を続けるために、反復的に初代フィーダー細胞の培養物を
調製する必要性を除去し、一貫して高品質な商業的スケールにおいてｐＰＳ細胞
を産生させることを可能にするという理由で、重要である。
【００２９】 フィーダー細胞を含まない環境においてｐＰＳ細胞を培養することは、多数の
重要な利点を有する。例えば： ・ｐＰＳ細胞およびその誘導体の産生は、商業的産生にまで、より容易に拡大縮
小可能である。培養を支持するために、継続中の基準でフィーダー細胞を産生す
る必要がなく、そして細胞の継代が機械的に行われ得る。 ・細胞の方向付けられた前駆体への分化または最終的に分化した細胞への分化が
、フィーダーを含まない培養物中で促進される。フィーダーを含まない培養物か
ら形成される胚様体は、より一貫した細胞集団を産生する。あるいは、直接的な
分化が、フィーダーを含まない幹細胞を、適切な固相支持体上に直接プレーティ
ングすることによって、行われ得る。条件に依存して、顕著に均一な細胞集団が
、得られ得る。 ・フィーダーを含まずにｐＰＳ細胞を生成し得ること、そして培地を馴化するた
めにヒト細胞を使用することは、規制の調査の展望から魅力的である−ｐＰＳ細
胞は、培養物中に、異種成分および他の細胞由来の癌性起源の成分を含まない。
・薬剤、毒素または可能性のある分化モジュレーターのスクリーニングもまた促
進される。物質が、培養物を支持するために使用されるフィーダー細胞に対する
二次的な効果を伴わずに、培養培地に添加され得る。 ・高い質のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーが、フィーダーを含まないｐＰ
Ｓ細胞培養物を使用して容易に産生され得る。培養物面積１ｃｍ2あたりのｍＲ
ＮＡの収量が、より高い。このライブラリーは、フィーダー細胞からの転写物（
異なる種または異なるヒト遺伝子型のｃＤＮＡ）の混入がなく、そして発現パタ
ーンは、９０％程度の高い未分化ｐＰＳ細胞表現型を反映し得る。発生の間に調
節される遺伝子の全長ｃＤＮＡが富化されたサブトラクションライブラリーもま
た、得られ得る。 ・フィーダー細胞を含まない培養物の遺伝子トランスフェクションは、トランス
フェクションされた細胞の薬物耐性マーカーによる選択を促進し、そしてかなり
より高いレベルの一過性発現を生じる。薬物耐性フィーダー上、またはフィーダ
ーを含まない培養物上のいずれにおいても、ｐＰＳ細胞を分化させることなくｐ
ＰＳ細胞を遺伝的に改変する方法が見出された。フィーダーを含まない系は、ト
ランスフェクションの効率を改善するというさらなる利点を有する。モデル実験
において、フィーダーを含まない培養物中の約１５％の細胞がマーカー遺伝子で
トランスフェクションされ、一方、初代フィーダー層におけるトランスフェクシ
ョン効率は、代表的には、ポジィティブであった初代フィーダー層上でトランス
フェクトされた未分化ｈＥＳ細胞のほんの５％のみであり、このことは、トラン
スフェクション効率が、フィーダーを含まない培養条件を用いて有意に増強され
ることを示す。
【００３０】 本発明において提供される技術は、研究および治療使用のための、多能性幹細
胞の可能性のある使用における重要な進歩を示す。本発明のさらなる進歩が、以
下の節から理解される。
【００３１】 （定義） プロトタイプの「霊長類多能性幹細胞」（ｐＰＳ細胞）は、受精後の任意の時
点の前胚性組織、胚性組織、または胎児組織由来の多能性細胞であり、正常な条
件下で、いくつかの異なる細胞型の子孫を産生し得る特徴を有する。ｐＰＳ細胞
は、当該分野で受け入れられている標準的試験（例えば、適切な宿主内で奇形腫
を形成する能力）に従って、３つの胚層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の各
々の誘導体である子孫を生成し得る。
【００３２】 ｐＰＳ細胞の定義に含まれるものは、Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
８２：１１４５、１９９８）によって記載されるようなヒト胚性幹（ｈＥＳ）細
胞；Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２
：７８４４、１９９５；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３８：
１３３、１９９８）によって記載されるアカゲザルまたはマーモセットの幹細胞
のような他の霊長類の由来の胚性幹細胞；およびＳｈａｍｂｌｏｔｔら（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８）にお
いて記載されるヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞によって例示される種々の型の胚細
胞である。多能性細胞の他の型もまた、この用語に含まれる。胚性組織由来であ
るか、胎児組織由来であるかまたは他の供給源由来であるかにかかわらず、３つ
の生殖層の全ての誘導体である子孫を産生し得る霊長類起源の任意の細胞が含ま
れる。本発明の多くの実施形態について、核型が正常であり、悪性供給源由来で
ないｐＰＳ細胞を使用することが、有利である。
【００３３】 ｐＰＳ細胞培養物は、集団中の幹細胞およびその誘導体のかなりの割合が、そ
れらを胚起源または成体起源の分化した細胞と明らかに区別する、未分化細胞の
形態学的特徴を示す、「未分化」または「実質的に未分化」として記載される。
未分化のｐＰＳ細胞は、当業者によって容易に認識され、そして高い核／細胞質
の比および目立った核小体を有し、顕微鏡視野において２次元で代表的に現れる
。集団内の未分化細胞のコロニーが、分化した隣接細胞によってしばしば囲まれ
ることが理解される。それにもかかわらず、その集団が適切な条件下において培
養または継代される場合、未分化のコロニーが存続し、そして、個々の未分化細
胞は、細胞集団のかなりの割合を構成する。実質的に未分化である培養物は、少
なくとも２０％の未分化ｐＰＳ細胞を含み、そして（未分化である同一の遺伝子
型を有する細胞の百分率に関する）優先性を増加するために、少なくとも４０％
、６０％または８０％を含み得る。本開示において記載される方法を使用して、
実質的に未分化である培養物中に、比較的低い割合（５％または１０％程度の低
さでさえある）の分化したｐＰＳ細胞を含む培養物を生じるか、または継代する
ことが、時として可能である。
【００３４】 本開示において、培養物または細胞集団が「分化することなく」増殖するとい
われる場合は常に、増殖後に、組成物が上記の定義に従って実質的に未分化であ
ることを意味する。分化することなく少なくとも４回の継代（約２０回の倍増）
を通じて増殖する集団は、起源の培養物と同程度のコンフルエンスにおいて評価
した場合、実質的に同じ割合（または、可能性として、より高い割合の未分化細
胞）の未分化細胞を含む。
【００３５】 「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、別の型の細胞と同時培養され、
第二の型の細胞が増殖し得る環境を提供する１つの型の細胞である。フィーダー
細胞は、必要に応じて、支持する細胞と異なる種由来である。例えば、ｐＰＳ細
胞の特定の型が、本開示において以下に記載されるように、マウス胚性線維芽細
胞、不死化マウス胚性線維芽細胞、またはｈＥＳ細胞から分化したヒト線維芽細
胞様細胞の初代培養物によって支持され得る。ｐＰＳ細胞との同時培養において
、フィーダー細胞は、照射または抗有糸分裂薬剤（例えば、マイトマイシンｃ）
での処理によって代表的に不活化され、フィーダー細胞が支持する細胞よりも増
殖することを防ぐ。馴化培地の生成における使用のために、細胞の不活化は任意
であり得、そして部分的に培地産生の機械的な局面に依存する。
【００３６】 ｐＰＳ細胞集団は、ｐＰＳ細胞がｐＰＳの増殖を支持するための新鮮なフィー
ダー細胞が添加されない分割の後に少なくとも１回増殖した場合、フィーダー細
胞を「実質的に含まない」といわれる。フィーダー細胞を含有する以前の培養物
が、新鮮なフィーダーが添加されない培養物についてのｐＰＳの供給源として使
用される場合、継代を生き残るいくつかのフィーダー細胞が存在することが、認
識される。例えば、ｈＥＳ細胞が、ほぼコンフルエンスの約３７５，０００個の
照射された初代胚性線維芽細胞の表面上の９．６ｃｍ2ウェル中に、しばしば培
養される。培養の終了までに、おそらく１５０，０００個のフィーダー細胞が、
なお生存可能であり、そして分割され、そして約１００万〜１５０万の数に増殖
したｈＥＳとともに継代される。１：６分割の後、ｈＥＳ細胞は、一般に増殖を
再開するが、線維芽細胞は増殖せず、そして培養の約６日の終了までに、ほんの
少しの割合のみが生存可能である。この培養物は、フィーダー細胞を本質的に含
まず、組成物は、約５％未満のフィーダー細胞を含む。１％、０．２％、０．０
５％、または０．０１％未満（培養物中の総細胞の％として示す）のフィーダー
細胞を含む組成物が、ますますより好ましい。
【００３７】 本開示において、培養物または細胞集団が、「フィーダーを含まない」といわ
れる場合は常に、上記の定義に従って（明示的に必要とされる場合、さらなる拘
束にのみ供される）、組成物が、フィーダー細胞を本質的に含まないことを意味
する。
【００３８】 「増殖環境」は、目的の細胞がインビトロにおいて増殖する環境である。環境
の特徴としては、細胞が培養される培地、温度、Ｏ2分圧およびＯ2、ならびに存
在する場合、支持する構造（例えば、固体表面上の基板）が挙げられる。
【００３９】 「栄養培地」は、増殖を促進する栄養を含有する、細胞培養のための培地であ
る。栄養培地は、適切な組み合わせにおいて以下の任意のものを含有し得る：等
張生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、抗生物質、血清または血清置換物、および外
来的に添加された因子。「馴化培地」は、培地中に第１の集団の細胞を培養し、
次に培地を回収することによって調製される。次に、馴化培地（細胞によって培
地中に分泌される任意のものとともに）を使用して、第２の集団の細胞の増殖を
支持し得る。
【００４０】 「制限された発生系列細胞」は、胚組織に由来する（代表的には、ｐＰＳ細胞
の分化または部分的分化による）細胞である。これらの細胞は、増殖し得、そし
ていくつかの異なる細胞型に分化し得るが、そのレパートリーの範囲は制限され
ている。例は、血球型について多能性である造血細胞、ならびに類洞内皮細胞、
肝細胞、および可能性のある他の肝細胞について多能性である肝細胞前駆体であ
る。別の例は、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトへと発達するグリア
細胞前駆体、ならびにニューロンへと発達するニューロン前駆体を生成し得る神
経制限細胞である。
【００４１】 用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマー性形態
をいう。含まれるものは、遺伝子および遺伝子フラグメント、ｍＲＮＡ、ｔＲＮ
Ａ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌク
レオチド、プラスミド、ベクター、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸プロー
ブ、ならびにプライマーである。本開示において使用される場合、用語ポリヌク
レオチドとは、互換可能に、二本鎖分子および一本鎖分子をいう。他に特定され
るか、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施
形態は、二本鎖形態、ならびに二本鎖形態を作製することが公知であるかまたは
予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を含む。同一性の程度につい
て、ポリヌクレオチド間で比較がなされる場合、相補的鎖が容易に生成され、比
較されるポリヌクレオチド間での同一性の程度を最大化するセンス鎖またはアン
チセンス鎖が選択されるか、または予測されることが、無条件に理解される。配
列同一性の百分率は、第１に、試験されるポリヌクレオチドを参照対応物と整列
し、次に、明らかな挿入または欠失の存在についてのペナルティーを用いずに、
比較される配列間で共有される残基の数を、試験をする領域の百分率として計数
することによって計算される。
【００４２】 「制御エレメント」または「制御配列」は、ポリヌクレオチドの機能的調節（
例えば、複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、
転写、スプライシング、翻訳、またはポリヌクレオチドの分解）に寄与する分子
の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。転写制御エレメントとしては、
プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。
【００４３】 遺伝子エレメントは、その遺伝子エレメントがその予測された機能に従った様
式において作動することを許容する構造的関係にその遺伝子エレメントがある場
合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターが
コード配列の転写の開始を補助する場合、コード領域に作動可能に連結される。
この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード配列との間に介在配列
が存在し得る。
【００４４】 「クローニングベクター」は、宿主細胞において、ビヒクル中に挿入された配
列の複製を許容するポリヌクレオチドビヒクル（例えば、プラスミド、バクテリ
オファージ、または植物ウイルスもしくは動物ウイルス）である。ｃＤＮＡライ
ブラリーの場合、複製したベクターは、複数の遺伝子から転写された不均一のｍ
ＲＮＡ調製物からコピーされた異種ポリヌクレオチド挿入物を含む。挿入物が、
宿主細胞において、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルにおいて挿入物の発
現を許容する転写調節制御エレメントに作動可能に連結される場合、ビヒクルは
また、「発現ベクター」といわれ得る。
【００４５】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本開示におい
て互換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマー
は、改変されたアミノ酸を含み得、直鎖状であっても分岐していてもよく、そし
て非アミノ酸によって中断され得る。配列同一性の百分率は、第１に、試験され
るポリペプチドを参照対応物とまたはプロトタイプと整列し、次に、挿入または
欠失の存在についてのペナルティーを用いずに、比較される配列間で共有される
残基の数を、試験をする領域の百分率として計数することによってポリペプチド
について計算される。置換がなされる場合、保存的置換（１つのアミノ酸が、類
似の電荷、サイズ、疎水性、または芳香族性を有する別のアミノ酸によって置換
される）が代表的により良好に許容される。所望の配列は、プロトタイプの機能
を保つ：例えば、酵素活性、特異的基質の結合、および標準的な競合的阻害イム
ノアッセイにおいて検出可能なような特異的抗体の結合。
【００４６】 ポリヌクレオチドが、人工的操作の任意の適切な手段によって細胞中に移入さ
れた場合、または細胞が、そのポリヌクレオチドを遺伝によって受け継いだ、初
めに改変された細胞の子孫である場合、その細胞は、「遺伝子改変された」、「
トランスフェクトされた」、または「遺伝子形質転換された」といわれる。ポリ
ヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする転写可能な配列（細胞が、上昇
したレベルのタンパク質を発現するのを可能にする）をしばしば含む。内在的遺
伝子の作用を、機能的に改変するか、または廃止することを生じる任意の手段に
よる遺伝子改変がまた、含まれる。
【００４７】 遺伝子改変は、改変された細胞の子孫が、同一の改変を有する場合、「遺伝性
」といわれる。遺伝子改変が遺伝性であるか否かの決定は、ポリヌクレオチド鋳
型の存在の検出（例えば、ＰＣＲ増幅による）によるか、または現れる遺伝的改
変に依存する表現型の特徴（例えば、遺伝子産物の発現、もしくはその効果）の
検出によって、なされ得る。
【００４８】 遺伝子改変は、少なくとも４回の細胞複製を通して遺伝可能である場合（第７
世代の細胞においてポリヌクレオチド鋳型の存在として検出可能）、「安定」だ
といわれる。表現型の発現（ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、または機能的
レベルにおいて）は、第７世代の細胞における表現型の特徴が、親の遺伝子改変
細胞における表現型の特徴の少なくとも１０％（そしてしばしば少なくとも５０
％）の場合、「安定」だといわれる。安定な発現は、遺伝子改変もまた、安定で
あることを示す。遺伝子改変は、ポリヌクレオチド鋳型が、７回目の細胞分裂に
よって、最初の遺伝子改変された細胞の子孫に存在しない場合、「一過性」だと
いわれる。表現型の発現は、第７世代細胞における表現型の特徴が、最初に遺伝
子改変された細胞における表現型の特徴の５％以下である場合に（鋳型の損失に
起因しようと、またはその鋳型の発現を阻害するある機構のためであろうと）、
「一過性」だといわれる。
【００４９】 「細胞株」は、少なくとも１０回の継代を通じて培養物中で増殖し得る細胞の
集団である。この集団は、表現型において均一であり得るか、またはその集団は
、測定可能に異なる表現型の混合物であり得る。細胞株の特徴は、全体として１
０回の継代の後に本質的に不変である、集団の特徴である。
【００５０】 細胞は、細胞が、細胞中でＴＥＲＴが転写されそして翻訳されるような様式に
おいて、任意の種のテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸を用
いて遺伝子改変される場合、「テロメラーゼ化された」と記載される。この用語
はまた、ＴＥＲＴのコード領域を上昇したレベルで発現する能力を遺伝によって
受け継いだ、最初に遺伝子改変された細胞の子孫に適用される。ＴＥＲＴコード
配列は、代表的には、哺乳動物ＴＥＲＴ遺伝子（以下に記載されるように、ヒト
およびマウスのＴＥＲＴによって例示される）から取り出されるか、または適用
される。
【００５１】 細胞株は、細胞株が以下の性質の少なくとも１つを有する場合、「永久」また
は「不死化」と記載される：１）（例えば、ＴＲＡＰアッセイにおける増加した
テロメラーゼ活性として）検出可能な、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の
上昇した発現について、遺伝子改変されている；２）別の状態では１５回以下の
集団の複製を行い得ない細胞株について、適切な培養条件下で、少なくとも２０
回の集団の複製にまで、その複製能力を伸ばすように遺伝子改変されている；ま
たは３）別の状態では１５回を超えた集団の複製を行い得る細胞株について、代
表的な培養条件下で、細胞株の複製能力を有意に伸ばすように遺伝子改変されて
いる。この定義を満たす細胞として、初めに遺伝子改変された細胞のみではなく
、列挙された判定基準を満たすような細胞の全ての子孫も挙げられることが理解
される。
【００５２】 本開示において使用される場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体の両方をいう。この用語の境界は、意図的に、インタクト
な免疫グロブリン分子のみならず、免疫グロブリン分子のフラグメントおよび誘
導体（例えば、単鎖Ｆｖ構築物）、ならびに当該分野において公知の技術によっ
て調製され得、そして所望の抗原結合特異性を保持する、Ｔ細胞レセプターのよ
うな免疫グロブリンの等価物のフラグメントおよび誘導体を包含する。
【００５３】 （一般的技術） 本発明の実施において有用な一般的技術をさらに精巧にするために、実施者は
、細胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な教科書および総説を参照し得
る。これらには、Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ
．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕ
ｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９
９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
２２５：９００、１９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９３）が含まれる。幹細
胞の分化は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：１７
３、１９９７；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ
．１０：３１、１９９８に概説される。
【００５４】 分子遺伝学および遺伝子操作の方法は、一般に、現在の版のＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇ
ａｉｔ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎ
ｅｙ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａ
ｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙおよびＳｈｏ
ｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三
版（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ
Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｗｕ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載
される。本開示において参照される遺伝子操作のための試薬、クローニングベク
ター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈのような市販業者から入手可能である。
【００５５】 ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの調製およびそれらの分析に関与する一
般的な技術について、当業者は、ＲＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、１９８８）；ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｃ
ｏｗｅｌｌおよびＡｕｓｔｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨｕｎｔおよびＬｉｖｅｓｅｙ編、２０００）；
ならびにＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｅ Ｌａｎｄｅｒ編、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
によって毎年刊行）を利用できる。技術はまた、他の発現ライブラリーの記載か
ら推論され得る。例えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
Ｍｏｕｓｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（米国特許第５，７８９，１５８号）；Ｍｅｔ
ｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃＤＮＡ
Ｌｉｂｒａｒｙ（米国特許第５，６４３，７６１号）；Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖ
ｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＯ９５／２０６８
１、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ａ Ｇｅｎｅ Ｔｒａ
ｐ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃ
ｅｌｌｓ（Ｓｋａｒｎｅｓら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３、１９９２）；
Ｓａｓａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４９：１６７、１９９８；Ａｄｊａｙｅら
、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６：３３７、１９９７；Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１９：７４９、１９９６；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２８８：１６３５、２０００。
【００５６】 抗体を、惹起、精製および改変するために用いられる一般的な技術、ならびに
免疫細胞化学を含む免疫アッセイの設計および実行について、読者は、Ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｒ
およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら編、
Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ ＧｍｂＨ）を参照する。
【００５７】 細胞培養および培地収集における一般技術は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａ
ｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８、１９９７）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄ
ｉａ（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７３、１９９１
）；Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５、１９９１）；およ
びＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌ
ｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２５１、
１９９０）において要点が述べられる。他の興味深い読み物としては、Ｕｎｄｅ
ｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｍｅｄｉａ．（Ｍ．ＭｃＬｕｈａｎ、Ｍｅｎｔｏｒ ＮＹ
、１９６４）およびＴｈｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｉｓ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ（Ｍ
．ＭｃＬｕｈａｎおよびＱ．Ｆｉｏｒｅ、Ｂａｎｔａｍ ＮＹ、１９６７）が挙
げられる。
【００５８】 （多能性幹細胞の供給源） 本発明に従う培養および分化のために適切な供給源細胞としては、妊娠の後に
形成された組織由来の多能性細胞の樹立株が挙げられる。例示的な初代組織供給
源は、胚性組織（例えば、胚盤胞）、または妊娠の間の任意の時間に採取された
胎児組織（代表的には妊娠１０週前であるが、その必要はない）である。非限定
的な例は、霊長類胚性幹（ＥＳ）細胞および胚性生殖（ＥＧ）細胞の樹立株であ
る。そのような細胞の最初の樹立または安定化の間の本開示の技術の使用もまた
意図される。この場合、供給源細胞は、列挙された組織から直接採取された初代
多能性細胞である。
【００５９】 （培地およびフィーダー細胞） ｐＰＳ細胞を単離し、そして増殖するための培地は、得られる細胞が所望の特
徴を有し、そしてさらに増殖し得る限り、任意のいくつかの異なる処方を有し得
る。適切な供給源は、以下のとおりである：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ改変イー
グル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、
Ｇｉｂｃｏ ＃１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ
＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１３２５６−０２９。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％ ＤＭＥＭ（代
表的にはＫＯ ＤＭＥＭ）、２０％ 非熱非働化規定ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、
０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ β
−メルカプトエタノールを用いて作製される。この培地を濾過して、２週間以内
４℃で保存する。血清を含まないＥＳ培地を、８０％ ＫＯ ＤＭＥＭ、２０％ 血清置換物、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および
０．１ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて作製する。全ての血清置換物が
作用するわけではない；効果的な血清置換物は、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０
２８（専売特許の処方；製品は、製造業者より入手可能）である。培地を濾過し
て、２週間以内４℃で保存する。使用直前に、ヒトｂＦＧＦを、最終濃度４ｎｇ
／ｍＬで添加する。
【００６０】 ｐＰＳ細胞は、代表的には、種々の方法においてｐＰＳ細胞を支持する（例え
ば、ｐＰＳ細胞の生存もしくは増殖を促進するかまたは分化を阻害する可溶性因
子の産生）フィーダー細胞の層上で培養する。フィーダー細胞は、代表的には線
維芽細胞型細胞であり、しばしば、胚組織または胎児組織由来である。頻繁に使
用される供給源は、マウス胚である。有用なフィーダー細胞株は、胚性線維芽細
胞を得て、それらをトランスフェクトしてテロメラーゼを発現させ、次にそれら
を継代するかまたは将来の使用のために冷凍することによって得られた。細胞株
をほぼコンフルエントにまでプレーティングし、照射して増殖を防ぎ、ｐＰＳ細
胞培養を支持するために使用する。
【００６１】 １つの例において、ｐＰＳ細胞を、最初に誘導し、そして初代胚性線維芽細胞
上で支持する。マウス胚性線維芽（ｍＥＦ）細胞は、異系交配ＣＦ１マウス（Ｓ
ＡＳＣＯ）または他の適切な株から得られ得る。妊娠１３日目のマウスの腹部を
、７０％エタノールでふき取り、そして脱落膜をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に取り除く。胚を回収し；胎盤、膜、および軟組織を取り除く；そして死
体をＰＢＳで二回洗浄する。次に、これらを、２ｍＬ トリプシン／ＥＤＴＡを
含む新鮮な１０ｃｍの細菌ディッシュに移し、微細に細分化する。５分間３７℃
でのインキュベートの後、トリプシンを、１０％のＦＢＳを含有する５ｍＬのＤ
ＭＥＭで不活化し、そして混合物を１５ｍＬの円錐チューブに移す。砕片を２分
間沈降させ、上清を１０ｍＬの最終容量とし、そして１０ｃｍの組織培養プレー
ト上またはＴ７５フラスコ上にプレーティングする。このフラスコを、攪拌せず
に２４時間インキュベートし、その後、培地を置きかえる。フラスコがコンフル
エントである時に（約２〜３日）、細胞を、新しいフラスコに１：２に分割する
。
【００６２】 フィーダー細胞をｍＥＦ培地（９０％ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５
−０９２）、１０％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃３００７１−０３）、および
２ｍＭ グルタミンを含む）中で増殖させる。ｍＥＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ ＃４３０８２５）において増殖させ、一日おきに細胞をトリプシン
で１：２に分割し、細胞をコンフルエント以下に保つ。フィーダー細胞層を調製
するために、細胞を、増殖を阻害するが、ｈＥＳ細胞を支持する重要な因子の合
成を許容する線量（約４０００ラドのγ線照射）で照射する。６ウェルの培養プ
レート（例えば、Ｆａｌｃｏｎ ＃３０４）を、１ウェルあたり１ｍＬの０．５
％ゼラチンを用いて一晩３７℃でインキュベーションすることによってコートし
、そして１ウェルあたり３７５，０００個の照射されたｍＥＦをプレーティング
する。フィーダー細胞層を、プレーティングの５時間〜４日後に使用する。ｐＰ
Ｓ細胞を播種する直前に、培地を、新鮮なｈＥＳ培地で置換する。
【００６３】 （ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の調製） ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４３，７
８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄ
ｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３頁以降、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ９２：７８４４、１９９５）によって記載されるように
調製し得る。
【００６４】 手短には、ヒト胚盤胞を、ヒトのインビボ着床前胚から得る。あるいは、イン
ビトロで受精した（ＩＶＦ）胚を使用し得るか、または１細胞期のヒト胚を、胚
盤胞段階まで増殖させ得る（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０
６、１９８９）。ヒト胚を、Ｇ１．２培地およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階ま
で培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４、１
９９８）。発生した胚盤胞を、ＥＳ細胞単離のために選択する。透明帯を、プロ
ナーゼ（Ｓｉｇｍａ）への手短な曝露によって胚盤胞から取り除く。内部細胞塊
を、免疫手術（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇｅｒｙ）（胚盤胞を、１：５０希釈のウサ
ギ抗ヒト脾臓細胞抗血清に対して３０分間曝露し、次にＤＭＥＭ中で５分間３回
洗浄し、そして１：５希釈のモルモットの補体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する
（Ｓｏｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：５
０９９、１９７５を参照のこと））によって単離する。ＤＭＥＭでの２回のさら
なる洗浄後、溶解した栄養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）から
、緩やかなピペッティングによって取り除き、そしてＩＣＭをｍＥＦフィーダー
層上にプレーティングする。
【００６５】 ９〜１５日後、内部細胞塊誘導増殖は、１ｍＭ ＥＤＴＡを伴うカルシウムお
よびマグネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露すること
によって、ディスパーゼまたはトリプシンに曝露することによって、またはマイ
クロピペットを用いる機械的解離のいずれかによって、凝集塊に解離され、次い
で、新鮮培地中のｍＥＦ上に再移植される。解離された細胞は、新鮮なＥＳ培地
におけるｍＥＦフィーダー層上に再移植され、そしてコロニー形成について観察
される。未分化な形態を示すコロニーは、個々にマイクロピペットにより選択さ
れ、機械的に凝集塊に解離され、そして再移植される。ＥＳ様形態は、明らかに
高い核対細胞質比および顕著な仁を有する緻密なコロニーとして特徴付けられる
。次いで、生じたＥＳ細胞は、短時間のトリプシン処理、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ＰＢＳ（カルシウムもマグネシウムも伴わず、２ｍＭ ＥＤＴＡを伴う）への
曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ）への曝露またはマ
イクロピペットによる個々のコロニーの選択により１〜２週間毎に慣用的に分割
される。凝集塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適である。
【００６６】 （ヒト胎児生殖（ｈＥＧ）細胞の調製） ヒト胎児生殖細胞は、最後の月経期後、約８〜１１週目に取得されたヒト胎児
物質中に存在する始原生殖細胞から調製され得る。適切な調製方法は、Ｓｈａｍ
ｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７
２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号において記載される。
【００６７】 手短に言うと、生殖隆起を等張緩衝液でリンスし、次いで、０．１ｍＬ ０．
０５％トリプシン／０．５３ｍＭナトリウムＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に置き、
＜１ｍｍ3の厚切りにする。次いで、この組織を１００μＬチップを介してピペ
ッティングし、さらに細胞をばらばらにする。それを３７℃で約５分間インキュ
ベートし、次いで、約３．５ｍＬ ＥＧ増殖培地を添加する。ＥＧ増殖培地は、
ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭ 炭酸
水素ナトリウム；１５％ＥＳ条件付きウシ胎児血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミ
ン（ＢＲＬ）；１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００
Ｕ／ｍＬ ヒト組換え白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；１〜２ｎｇ
／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；お
よび１０μＭフォルスコリン（１０％ ＤＭＳＯ中）である。代替的アプローチ
において、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナーゼ／デオキシリボヌクレ
アーゼを使用して単離される。腸間膜を伴う生殖腺原基または生殖隆起が、胎児
物質から切り出され、この生殖隆起をＰＢＳにてリンスし、次いで、０．１ｍｌ
ＨＣＤ消化溶液（０．０１％ヒアルロニダーゼＶ型、０．００２％デオキシリボ
ヌクレアーゼＩ、０．１％コラゲナーゼＩＶ型、すべてはＥＧ増殖培地において
調製されるＳｉｇｍａ由来である）中に置く。組織をみじん切りにし、そして３
７℃において１時間または一晩インキュベートし、１〜３ｍＬのＥＧ増殖培地中
に再懸濁し、そしてフィーダー層にプレートする。
【００６８】 ９６ウェル組織培養プレートが、ＬＩＦ、ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含
まない改変されたＥＧ増殖培地において３日間培養されたフィーダー細胞のコン
フルエント未満の層とともに調製され、５０００ｒａｄ γ−照射で不活性化さ
れる。適切なフィーダーはＳＴＯ細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５０３
）。約０．２ｍＬの１次生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を各ウエルに添加する。第１
の継代は、ＥＧ増殖培地において７〜１０日後行われ、各ウエルを、照射された
ＳＴＯマウス線維芽細胞を用いて以前に調製された２４ウェル培養皿の１ウェル
に移す。この細胞を、形態学的にＥＧ細胞と一致する細胞が観察されるまで毎日
培地を交換して培養する（代表的には７〜３０日後または１〜４継代後）。
【００６９】 （フィーダー細胞の非存在下におけるｐＰＳ細胞の増殖） ｐＰＳ細胞は、分化を促進することを伴わずに増殖を支持する培養条件の組み
合わせを使用して、培養において連続的に増殖され得る。ｈＥＳ細胞は、フィー
ダー細胞の非存在下においてさえも、分化を伴わずに増殖され得ることが決定さ
れてきた。フィーダーを含まない培養に関して、適合性の培養表面（基質）およ
びフィーダー細胞により提供される影響のいくつかを与える栄養培地を提供する
ことは有益である。
【００７０】 フィーダーを含まないｐＰＳ培養のための基質として特に適切なものは、細胞
外マトリックス成分である（基底膜由来か、または接着分子レセプターリガンド
カップリングの一部を形成する）。市販の調製物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）という名前でＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎより入手可能であり、そし
て通常の、または増殖因子を減少させた（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｅｒ Ｒｅｄ
ｕｃｅｄ）処方物において得られ得る。両方の処方物は、効果的である。Ｍａｔ
ｒｉｇｅｌ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍
細胞由来の可溶性の調製物であり、再構成された基底膜を室温にて形成するゲル
である。
【００７１】 他の細胞外マトリックス成分および成分の混合物は、代替物として適切である
。増殖される細胞型に依存して、細胞外マトリックスは、ラミニン、フィブロネ
クチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸塩など、単独で、また
は種々に組み合わせたものを含む。ラミニンは、脊椎動物におけるすべての基底
膜の主要成分であり、これはインテグリンのヘテロダイマー(例えば、α６β１
およびα６β４（ラミニンに対して特異的である））および他のヘテロダイマー
（他のマトリックスと交叉反応する）と相互作用する。実施例において例示され
る培養条件を使用すると、コラーゲンＩＶは、ｈＥＳ細胞増殖を支持するが、コ
ラーゲンＩは支持しない。本明細書中に記載される実験手順を使用して試験され
得る基質としては、他の細胞外マトリックス成分だけでなく、ポリアミン（例え
ば、ポリオルニチン、ポリリジン）および他の市販の被覆剤が挙げられる。
【００７２】 多能性細胞を、適切な分布ならびに細胞の生存、増殖、および所望の特徴の保
持を促進する培地の存在下において基質上にプレートする。これらの特徴は、接
種分布に対する慎重な注意から利益を得る。この分布の１つの特徴は、プレーテ
ィング密度である。少なくとも、約１５，０００細胞ｃｍ-2のプレーティング密
度は、生存を促進し、かつ分化を制限することが見出されてきた。代表的に、約
９０,０００ｃｍ-2と約１７０,０００ｃｍ-2との間のプレーティング密度が使用
される。
【００７３】 別の特徴は、細胞の分散である。マウス幹細胞増殖は、細胞を単一細胞懸濁液
に分散させることを含む（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７
５：１７３，１９９７ １７７頁にて）。対照的に、霊長類のＰＳ細胞を継代す
ることは、以前は小さなクラスターにおいて、その細胞をともに維持する必要が
あると思われていた。細胞が完全に分散する前に、酵素消化を停止する（例えば
、約５分、コラゲナーゼＩＶを使用する）。次いで、そのプレートをピペットを
用いて、穏やかにはがし、そして、接着細胞の凝集塊（約１０〜２０００細胞の
大きさ）のように懸濁されるまでピペットを用いて細胞を粉砕する。次いで、凝
集塊をさらなる分散を伴わずに直接基質の上にプレートする。
【００７４】 適切な酵素および培地が選択され、そしてプレーティング密度が十分に高い場
合、霊長類のＰＳ細胞は、さらに細かい細胞の懸濁液としてフィーダーを含まな
い培養をする傍ら、継代され得ることが現在発見されている。説明の目的で、フ
ィーダーの非存在下において培養されたコンフルエントなヒト胚性幹細胞は、０
．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）および０．０５３ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの溶液とともに５〜１５分間３７℃にてインキュベートすることによって
プレートから除去される。ピペットを使用して、プレート内の残りの細胞を取り
出し、そしてその細胞を、単一細胞およびいくつかの小さなクラスターを含む懸
濁液に分散されるまでピペットを用いて粉砕する。次いで、この細胞を５０，０
００〜２００，０００細胞／ｃｍ2の密度にてプレートして、生存を促進させ、
かつ分化を制限する。この技術により継代されたＥＳ細胞の表現型は、細胞がコ
ラーゲン消化によりクラスターとして収集される場合に観察されるものと類似し
ている。別の選択肢として、この細胞は、そのプレートがコンフルエントになる
前に、酵素を伴わずに収集され得る。この細胞をＰＢＳ中０．５ｍＭ ＥＤＴＡ
単独の溶液において約５分間インキュベートし、培養容器から洗浄し、次いで、
さらなる分散を伴わずに新しい培地にプレートする。
【００７５】 新鮮なフィーダー細胞の非存在下においてプレートされたｐＰＳ細胞は、栄養
培地において培養されることから利益を得る。一般的に、この培地は、細胞の生
存を増強させる通常成分（等張緩衝液、必須無機質、および血清または血清に代
わる何かのいずれか）を含む。フィーダー細胞により提供されるいくつかのエレ
メントを供給するように馴化された培地が特に有益である。
【００７６】 馴化培地は、血清を含まない培地（例えば、血清の代わりに２０％で追加され
たＫＯ ＤＥＭＥおよび４ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ））
において約５〜６×１０4ｃｍ-2の密度において、照射された１次マウス胚性線
維芽細胞（または別の適切な細胞調製）を培養することにより調製され得る。培
養上清を約１日後に３７℃にて収集する。付着依存性細胞を増殖するためのデバ
イスには、Ｔフラスコ、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）、ガス
透過性バッグ（ｇａｓ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｂａｇ）、ホローファイバーバイ
オリアクター（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、フラット
ベッドバイオリアクター（ｆｌａｔ−ｂｅｄ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、および
パラレルプレートバイオリアクター（ｐａｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ ｂｉｏｒ
ｅａｃｔｏｒ）が挙げられる。この細胞が、３次元マトリクスに移される場合、
この細胞は、連続攪拌タンクバイオリアクターまたはエアリフトバイオリアクタ
ーにおいて培養され得る。
【００７７】 以下の実施例において例示されるように、代表的に、１〜２日間馴化された培
地を使用して、ｐＰＳ細胞培養を１〜２日間支持し、次いで、培地を交換する。
この培地は、馴化された後、直接使用され得、それはそのまま、または抽出物と
して保存され得る（例えば、４℃にて、２、６、もしくは１４日間または−２０
℃にて凍結）。この培地をろ過する際には、注意が払われるべきである。他のフ
ィルターが活性を除去するような場合、いくつかのフィルター（例えば、セルロ
ースアセテート２０μ非タンパク結合膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４３０７６９）が適
切であり得る。初期の研究において、代表的に培地は希釈されずに使用され得る
。希釈の有効性および他の操作が、この培地を用いて７日間以上ｐＰＳ細胞を維
持すること、そしてこの培養物が未分化ｐＰＳ細胞に特有な特徴を維持するか否
かを決定することにより評価され得る。
【００７８】 所望される場合、馴化培地が、ｐＰＳ細胞培養に利益を与えるさらなる増殖因
子ともに使用する前に追加され得る。ｈＥＳのために、増殖因子様ｂＦＧＦまた
はＦＧＦ−４がしばしば使用される。ｈＥＧのために、増殖因子様ｂＦＧＦ、ｇ
ｐ１３０のインデューサー（例えばＬＩＦまたはオンコスタチン−Ｍ）およびお
そらく環状ＡＭＰレベルを上昇させる因子（例えば、フォルスコリン）が増殖培
地に追加され得る。他の型のｐＰＳ細胞は、培地中の他の因子（例えば、幹細胞
因子（Ｓｔｅｅｌ因子、ｃ−ｋｉｔリガンド）またはＩＬ−６）から利益を獲得
し得る。馴化する前にｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４のような増殖因子の両方をこの
培地に添加し、次いで、ｐＰＳ細胞の増殖を支持するためにこの培地を使用する
前に再びｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４のような増殖因子の両方をこの培地に添加す
ることはしばしば有益である。
【００７９】 本明細書中に記載される各条件が、独立して最適化され得、そして特定の条件
の組み合わせが、さらなる試験に対して有効であると証明されることが認識され
るべきである。このような最適化は、慣用的な実験の問題であり、この開示にお
いて提供される本発明の趣旨から逸脱しない。
【００８０】 （馴化培地のために適切な細胞株） マウス線維芽細胞の初代培養に対する代替物として、馴化培地が、他の細胞型
から調製され得る。テロメア化された胚性線維芽細胞株および線維芽細胞の形態
学的特徴を有する分化したｐＰＳ細胞が例示的である。
【００８１】 （馴化培地のための例示的な非ヒト細胞株） 代表的に、フィーダー細胞は、線維芽細胞型の細胞を含む。１次胚細胞または
胎性フィーダー細胞培養は、細胞の混合された集団であり、線維芽細胞ならびに
初期の筋肉細胞および神経細胞の形態を有する細胞を含む。その集団において異
なる細胞は、ｐＰＳ培養を支持する際に異なる役割を果たし得、そしてその培養
の分布および特徴が変化し得る。
【００８２】 より持続性のフィーダー細胞株が、非ヒト種由来（例えば、マウス（先に記載
されたように調製された））の胚性線維芽細胞を使用して本発明に従って培地を
産生するために開発され得る。この細胞は、遺伝的に不死化遺伝子（例えば、テ
ロメラーゼを発現する遺伝子）で改変される。細胞をテロメア化し、そしてテロ
メラーゼ活性を試験するための手順は、この開示において後ほど見出され得る。
【００８３】 さらに、馴化培地のために使用される細胞は、遺伝的に改変され、１つ以上の
さらなる特徴を提供する。例えば、スクリーニングの目的のために、１つ以上の
抗生物質（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシン、またはピューロマイシン
）に対する薬剤耐性遺伝子とともに細胞が提供され得る（実施例８）。細胞は、
マーカー遺伝子（例えば、緑蛍光タンパク質（実施例８）、βガラクトシダーゼ
または免疫単離のためにタグを提供する特定の細胞表面抗原（例えば、短縮型Ｎ
ＧＦレセプター）とともに提供され得る。細胞はまた、ｐＰＳ培養を支持するた
めの培地の効力を提供する因子の生合成および分泌のための遺伝子とともに提供
され得る。ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および本開示において列
挙される他の栄養補給剤が例示的である。
【００８４】 培地を馴化するために使用される細胞株の複製能力を増加させるために、本開
示の他のところで記載されるように細胞株はテロメア化（さもなくば不死化）さ
れ得る。
【００８５】 （馴化培地のための例示的なヒト細胞株） ヒト胚由来細胞から分化した特定の特徴を有する細胞を使用して、未分化ｐＰ
Ｓ細胞の培養を支持し得ることが発見された。ヒト胚細胞由来の特定の線維芽細
胞様細胞（または間葉細胞）は、この特性を有し、そして先に記載されたアッセ
イに従って同定され得る。
【００８６】 適切な細胞を得るための例示的な方法は、ｐＰＳ細胞（例えば、ｈＥＳ細胞）
の培養物を分化させることを含む。特定の表現型を有する分化した細胞は、混合
された分化細胞の集団の中から選択され、そして選択された細胞を用いて培養す
ることにより馴化された培地が、実質的にフィーダー細胞を含まない培養環境下
においてｐＰＳ細胞の増殖を支持するその能力について試験される。
【００８７】 ｐＰＳの分化は、例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養物の過増殖によって、または
胚様体（ＥＢ）を形成させる低い接着特性を有する基質を有する培養容器内でｐ
ＰＳ細胞を培養することによって、最初に凝集体を形成することにより開始され
得る。胚様体は、懸濁培養において作製され得る；未分化ｐＰＳ細胞は、短時間
のコラゲナーゼ消化によって収集され、クラスターに解離され、そして非接着性
細胞培養プレートにプレートされる。その凝集体は数日毎に培地が与えられ、次
いで、適切な期間の後、収集される（代表的に４〜８日間）。次いで、この細胞
は、培地馴化細胞の濃縮を促進する培地において、および／または基質上で培養
される。あるいは、未分化ｐＰＳ細胞の懸濁液を調製し、次いで、培地馴化細胞
への調節された分化を促進する基板上に直接プレーティングすることにより、直
接ｐＰＳ細胞を区別することによって得られ得る。適切な基材は、ポリ陽イオン
性基質（例えば、ポリオルニチン、または細胞外マトリックス）で被膜されたガ
ラスまたはプラスチックのカバースリップを含む。
【００８８】 一旦、分化されると、その集団は、細胞が発現するいずれかのマーカー（例え
ば、免疫標識および蛍光分類によって、磁気ビーズによる分類によって、または
夾雑細胞の免疫特異的溶解によって）に従って培地馴化細胞について濃縮され得
る。
【００８９】 ｈＥＳ細胞から分化した線維芽細胞様細胞は、本発明に従う馴化培地について
特に適切であることが発見された。線維芽細胞様細胞が形態学的基準（特に、結
合組織において見出される線維芽細胞のものと類似する細胞質プロセスを有する
細胞の星状形態または紡錘形態）によって認識され得る。細胞の線維芽細胞性質
のさらなる確認が、マーカーおよびその細胞の分泌産物（例えば、コラーゲンマ
トリクス、コラゲナーゼ、および線維芽細胞増殖因子の種々のアイソタイプ（特
にｂＦＧＦ））によって得られ得る。これらのマーカーは、転写または翻訳レベ
ルにおいて検出される。
【００９０】 次いで、分化したｐＰＳ細胞は、上記で概要を述べられたアッセイに従って試
験され得、分化したｐＰＳ細胞は、培地がフィーダーを含まない培養におけるｐ
ＰＳ細胞増殖を支持するという様式において馴化培地に適切であるか否かを決定
する。
【００９１】 この様式においてｈＥＳから分化し、かつ選択された細胞株は、代表的に、細
胞培養において少なくとも約３０日間複製し得る（実施例１２および１３；図１
２）。いくつかの実施形態において、その細胞は６０日間または１２０日間複製
する（約１０倍増、２５倍増、または５０倍増）。高い複製能力は部分的である
。なぜなら、これらの細胞は、実質的に不死である幹細胞から分化され、そして
一次胚細胞と矛盾のない長さのテロメアを有するためである。これらの細胞は、
しばしば、さらなる適応を伴わずに馴化培地に適切である。所望される場合、そ
の細胞はまた、遺伝的に改変されて、テロメラーゼ逆転写酵素を発現し得るか、
さもなくば、先に記載されるように不死化される。これは、老化を未然に防ぎ、
そして非改変化細胞の複製能力を超えて複製能力を増加させ、これは、この培地
の商業生産を促進し、かつバッチ間の再現性を改善する。
【００９２】 必要に応じて、馴化培地に適した分化したヒトＰＳ細胞はさらに適応され得、
例えば、前節において記載されるように、遺伝的に細胞を改変して、増殖因子様
ｂＦＧＦを発現させるか、もしくはＴＥＲＴを発現させるか、もしくはその細胞
を不死化させることによって適応され得る。
【００９３】 （それを産生するために馴化培地および細胞を試験する工程） 馴化培地は、ｐＰＳ細胞を初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）（証明された
標準）により馴化された培地の代わりにフィーダーを含まない培養系にスワップ
することにより、ｐＰＳ細胞を支持する能力について試験され得る。ｐＰＳ細胞
が、実質的に未分化な状態で増殖する場合、その馴化培地は、フィーダーを含ま
ない培養においてｐＰＳ細胞を支持するものとして特徴づけられ得る。
【００９４】 ｐＰＳ細胞が分化するか否かを決定するための都合良い方法は、そのコロニー
の形態的特徴を理解することである（以下に記載される）。このアッセイ方法に
従って、コンフルエント未満の培養物（代表的に、継代約５日間後）における未
分化ｐＰＳ細胞の割合が、少なくとも、その馴化培地（必要に応じて、さらなる
増殖因子を追加されるか、そうでなければ適切な場合には処理される）における
４回の継代の間に実質的に減少しない場合、馴化培地はｐＰＳ細胞の増殖を支持
し得ると見なされる。
【００９５】 所望される場合、このアッセイの定量的読み出しが得られ、この培地中のｐＰ
Ｓ細胞支持因子の質または濃度を評価し得る。１つの例において、基礎培地が、
種々の期間（例えば、６時間、１２時間、２４時間および４８時間）の間馴化さ
れ、そしてその馴化培地は、連続２４時間の期間の間、フィーダーを含まないｐ
ＰＳ細胞培養物を支持するそれらの能力についてそれぞれ試験される。短い処理
時間という理由のため、短い馴化期間により有効性を与えられた培地が所望され
得る。別の例において、２４時間馴化された基礎培地が、ｐＰＳ培養を支持する
能力について希釈分析により試験される（基礎培地における希釈工程、必要に応
じて他の栄養剤が追加される）。より大きな希釈の後に有効である培地（例えば
、１：１、１：２および１：４の馴化培地：希釈培地）が、保存の容易性のため
に所望され得る。特定の特徴の選択は、この適用に依存する。
【００９６】 細胞株は、適切な時間で基礎培地において細胞を培養することにより、馴化培
地を産生する能力について試験され得、次いで、上記のように、フィーダーを含
まないｐＰＳ細胞培養を支持する能力についてその培地を試験する。馴化培地が
、フィーダーを含まないｐＰＳ培養物を支持しない場合、その馴化の方法は、種
々にパラメーター（例えば、培養時間、使用される基礎培地、細胞密度および培
養後の培地の可能な処理またはさらなる添加剤の追加）において調節され得る。
これらおよび他のパラメーターの調節は、経験的に、および慣用的な実験の問題
として実行され得る。細胞株が、馴化の間の任意の培養パラメーターの慣用的な
最適化後に、フィーダーを含まないｐＰＳ培養を支持する馴化培地を産生する場
合、細胞株はその試験を通過したと見なされる。
【００９７】 所望される場合、馴化培地およびこの培地を産生する細胞は、以下に記載され
るように、それらが支持するｐＰＳ細胞の他の特徴に基づいて、さらに評価され
得る。
【００９８】 （馴化培地のバッチ産生） 本発明の馴化培地は、この培地において細胞を培養することにより産生され、
次いで、その細胞培養物から馴化培地を収集する。
【００９９】 馴化のために使用される細胞は、すでに記載されるように、フィーダーを含ま
ない形態においてｐＰＳ細胞を支持する能力を馴化培地に与える様式において培
地を馴化する能力を有する。馴化のために使用される基礎培地は、任意の異なる
いくつかの製法を有し得、その製法は、使用される細胞の型に部分的に依存する
。その培地は、少なくとも培地の馴化のために使用される細胞株の培養を支持す
ることが可能でなくてはならない。馴化後、その培地はまたｐＰＳの培養を支持
することが都合が良い。しかし、代替物として、この培地は、他の因子を追加さ
れ得るか、さもなくば馴化後、ｐＰＳ細胞の培養について培地を適合するために
処理され得る。
【０１００】 フィーダーを含まない培養においてｐＰＳ細胞を支持するために、適切な基礎
培地が、以下の成分から作製され得る；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ
）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）ダル
ベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１８
；Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％ＤＥＭＥ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、
Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４
０−０５０；βメルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２２；ヒト組換え塩
基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示
的な血清含有ＥＳ培地は、８０％ＤＥＭＥ（代表的にＫＯ ＤＥＭＥ）、２０％
限定されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱非働化していない）、０．１ｍＭ非必須
アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノ
ールとともに作製される。この培地をろ過し、そして４℃にて２週間を超えない
ように保存する。血清を含まないＥＳ培地は、８０％ＫＯ ＤＥＭＥ、２０％血
清置換、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１
ｍＭ β−メルカプトエタノールとともに作製される。すべての血清置換が役に
立つわけではない；有効な血清置換は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２８−０２８（特許
製法；その製造業者から入手可能な製品）である。この培地をろ過し、そして４
℃にて２週間を超えないように保存する。馴化のために使用される細胞を組み合
わせる直前に、ヒトｂＦＧＦが、４ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加され得る。
【０１０１】 次いで、細胞にｐＰＳ細胞を支持する成分を培地に放出させるような環境下に
おいて、この選択培地を馴化のために使用される細胞と組み合わせる。必要に応
じて、この細胞は、照射（例えば、約４，０００ｒａｄ）により、マイトマイシ
ンＣのような化学的失活剤を用いる処置により、または任意の他の有効な方法に
よって、不活性化され得る（すなわち、実質的な複製の不能を与えられる）。ｐ
ＰＳ細胞培養物を支持する際に使用する前に、培地が馴化細胞から分離される場
合、細胞の不活性化は、必ずしも必要ではない。
【０１０２】 この細胞は、ｐＰＳ細胞培養を支持する放出された因子の適切な濃度を可能に
するための十分な時間で培地において培養される。代表的に、２４時間３７℃に
おいて培養することにより馴化された培地は、ｐＰＳ細胞培養物を２４時間支持
する因子の濃度を含む。しかし、培養期間は、より長くまたはより短く調節され
得、経験的に（または必須因子の濃度をアッセイすることにより）適切な期間を
構成するものを決定する。馴化培地のバッチを収集した後、この細胞を使用して
、さらなる培養期間（細胞が、適切な方法において培地を馴化する能力を保持す
る限り、所望される場合と同じくらい多くのサイクルの間）にわたって、さらな
るバッチの培地を馴化し得る。例えば、胚性幹細胞の分化に由来する線維芽細胞
様細胞を使用して、１日周期で１〜２週間にわたって培地を馴化し得る（実施例
１２および１３）。
【０１０３】 培地を馴化するための培養装置の選択は、培地収集の規模および目的に基づい
てなされ得る。初期の研究において、そしてスクリーニングする目的のために、
標準的な培養フラスコまたは複数のウェルプレートにおいて培養培地を産生する
ことは、しばしば都合が良い。初期のスケールアップが、多数の面を有するより
大きな容器においてなされ得る（例えば、Ｎｕｎｃ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒｉ
ｅｓ）。ラージスケール、自動化、またはＧＭＰに従う産生は、より特殊化され
たデバイスの使用を含み得る。
【０１０４】 連続的細胞培養系は、Ｊ．Ｆｕｒｅｙ（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ
２０：１０、２０００年５月１５日）により概説されている。灌流培養は、培養
チャンバーからの培地の除去を含み、そして新鮮な培地を補填する。スピンバス
ケット系において、バスケット様デバイスをドライブシャフトに接続し、そして
培地が交換され得る多孔性スクリーンにより覆われる。外部フィルター灌流系に
おいて、培養液は、中空繊維フィルターモジュールを介して容器から循環され、
そしてその循環を提供するためのループに接続されたポンプを用いて、容器にも
どす。特定の灌流系、ＡＴＦ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ，Ｅｄｉｓｏｎ ＮＪから市販）は、中空繊維ハウジングの一方の末端にあ
る膜ポンプ、バイオリアクターと接続される中空繊維ハウジングのもう一方の末
端から構成される。そのファイバーを介する、交流する接線方向の流れは、低い
剪断層流を産生し、これは高流速、拡張性、および異なるバイオリアクターに対
する適応性を提供する。
【０１０５】 ラージスケール培養系はまた、Ａａｓｔｒｏｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．
，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩから入手可能である。Ａａｓｔｒｏｍ Ｒｅｐｌｉ
ｃｅｌｌTM系は、小さな開始細胞集団からの拡張を提供する（Ｋｏｌｌｅｒら、
Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ．２１：６５３、１００９；Ｋｏｌｌ
ｅｒら、Ｂｌｏｏｄ ８６：１７８４、１９９５）。Ｃｅｌｌｓｔａｓｉｓ（登
録商標）培養技術は、Ｇｅｎｅｓｐａｎ Ｃｏｒｐ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡに
より市販される。細胞は、キャピラリー外空間に存在し、そして中空線維は、培
養環境に新鮮な培地および酸素をもたらす（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ１８（９）、１９９８年５月１日）。任意の他の適切なデバイ
スが、本発明とともに使用され得る。米国特許第４，５０１，８１５号は、分化
細胞を培養するためのデバイスを記載する。米国特許第４，２９６，２０５号は
、細胞培養および連続透析フラスコならびにそれらの用途を記載する。米国特許
第５，９９４，１２９号は、生物学的細胞を維持する際に使用する移動式カセッ
トを記載する。米国特許第５，３６２，６４２号は、細胞培養培地の貯蔵、再構
成、分配、および収集についての閉じ込め系（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｓｙｓ
ｔｅｍ）を記載する。米国特許第６，０２２，７４２号は、培養デバイスおよび
方法を記載する。
【０１０６】 本発明の特定の実施形態は、馴化培地を調製するための適合するデバイスであ
り、このデバイスは、培地を馴化し得る本発明の細胞を含む培養チャンバーおよ
び細胞による馴化の後、培養チャンバーから培地を回収するために必要に応じて
閉鎖し得る排出ポートを有する。そのデバイスはまた、馴化された培地から培養
細胞を分離させるプレート、中空線維、または他の構造の形態において大量移行
ミクロ細孔表面を有し得、これは培地の自由な通過を可能にし、排出ポートへの
通過を提供する。このデバイスはまた、新鮮な培地を導入するか、さらなる細胞
を導入するか、または死細胞および細胞破片を除去するための１つ以上のポート
を有し得る。連続フロー系について、ポンプは、循環を提供するために培地入口
ポートまたは培地排出ポートに接続され得る。
【０１０７】 馴化培地の収集の後、適切である場合、馴化培地はｐＰＳ細胞増殖を支持する
ために直接使用され得る。この培地が、ろ過され、凍結され、さもなくば初めて
新しい技術を使用して処理された場合、小さなバッチを試験して、再構成された
培地においてなおも活性が存在するか否かを決定することは、価値がある。
【０１０８】 ある実施形態において、馴化培地に、ｐＰＳ細胞培養のためになる付加的な増
殖因子を使用前に補充した。ｈＥＳに対して、ｂＦＧＦ様の増殖因子が、しばし
ば用いられる。フィーダー細胞なしの培養においてｈＥＳ細胞を支持する培地の
能力は、培地の馴化の前および後の両方においてｂＦＧＦを加えることによって
利益を得うることが見出された(実施例１１)。ｈＥＧに対して、培養培地に、ｂ
ＦＧＦ様の増殖因子、ＬＩＦ、ＩＬ−６またはオンコスタチン−Ｍのようなｇｐ
１３０のアクチベーター、およびフォルスコリンまたはコレラ毒素のようなおそ
らくは環状ＡＭＰレベルを上昇させる因子を補充し得る、ｐＰＳ細胞の他の型は
、（ｃ−ｋｉｔのリガンドである、Ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒとしても公知の）
幹細胞因子のような培地中の他の因子によって利益を得うる。
【０１０９】 特定の実施形態において、馴化培地が、さらに処理される。例えば、塩析また
は選択的な濾過によって濃縮され得るし、また有効な成分を分離または保管する
ために抽出され得る。次いで培地抽出物は、ｐＰＳ培養物を支持するために、使
用前に新鮮な培養培地によって再構成されるか、またはこれを補充され得る。
【０１１０】 調製後、培地は、上述のように、フィーダー細胞なしの培養においてｐＰＳ細
胞を支持するために用いられ得る。それはまた、他の目的に適切であり、そして
制限なくそのような目的に用いられ得る。例えば、培地は、さらに細胞の増殖を
支持するが、または分化の制限するために、フィーダー細胞の存在下で培養され
たｐＰＳに添加され得る。培地はまた、経験的に決定され得るように、培養前駆
細胞、または終末分化した細胞の他の型の増殖の維持または促進に用いられ得る
。
【０１１１】 （フィーダー細胞非存在下において成長したｐＰＳ細胞の特徴付け） ヒトＥＳ細胞は、未分化の幹細胞の特徴的な形態的な特色を有する。二次元の
標準的な顕微鏡画像において、ｈＥＳ細胞は、その画像の平面、突出した核小体
、およびほとんど識別できない細胞接合部を伴う緻密なコロニー形成において核
／細胞質の高い比を有する。細胞株は、標準的なＧバンド技術（日常的な核型決
定サービスを提供する、オークランドＣＡの細胞遺伝学研究室のような多くの臨
床診断研究室において利用可能な技術）を用いて核型決定され得、そして公開さ
れヒト核型と比較され得る。「正常な核型」を有する細胞（その細胞が正倍数性
であり、その中にすべてのヒト染色体が存在し、そして目立って変質されていな
いことを意味する）を獲得することが所望される。
【０１１２】 ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞はまた、発現する細胞マーカーの特徴付けられ得
る。一般的に、本開示において記述される組織特異的なマーカーは、膜結合型マ
ーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マーカーに対する免疫組織化学、
および培地中に分泌されたマーカーに対する酵素結合イムノアッセイのような、
適切な免疫学的技術を用いて検出され得る。タンパク質マーカーの発現はまた、
マーカー特異的なプライマーを用いた逆転写酵素ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベ
ルで検出され得る。さらなる詳細は、米国特許番号５，８４３，７８０を参照の
こと。
【０１１３】 発生段階特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）は、特定の胚性細胞型に特徴的である
。ＳＳＥＡ−１，ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体は、Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔ
ｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔ
ｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）
より入手可能である。他の有用なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−
１−８１と命名された抗体（Ａｎｄｒｅｗｓら Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ｆｒｏ
ｍ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒｓ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ
ｏｎ、１９８７、前出）を用いて検出可能である。マウスＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ
−１に対する陽性コントロールとして、そしてＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０
およびＴｒａ−１−８１に対する陰性コントロールとして使用され得る。ＳＳＥ
Ａ−４は、ヒト胚性癌（ｈＥＣ）細胞に一貫して存在する。インビトロにおける
ｐＰＳ細胞の分化は、結果としてＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒ
ａ−１−８１の発現の減少ならびにＳＳＥＡ−１の発現の増加を導く。ＳＳＥＡ
−１はまた、ｈＥＧ細胞において見出される。ｐＰＳ細胞はまた、製造者（Ｖｅ
ｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ＣＡ）によって
記載されたように、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定する工程、および次
いでベクターレッドを基質として発色させる工程によって検出され得るアルカリ
フォスファターゼ活性の存在によって特徴付けられ得る。ｈＴＥＲＴおよびＯＣ
Ｔ−４の発現（ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能)ならびにテロメアーゼ活性（Ｔ
ＲＡＰアッセイによって検出可能）はまた、多くの型の未分化のｐＰＳ細胞に特
徴的である（実施例３）。
【０１１４】 増殖したｐＰＳ細胞の所望される他の特色は、三つすべての胚葉（内胚葉組織
、中胚葉組織および外胚葉組織）の細胞へ分化する能力である。ｈＥＳ細胞の多
能性は、約３．０Ｘ１０6の細胞を８〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマウスの後脚筋
へ注入することによって確認し得る。結果生じる腫瘍は、発生８〜１６週目にお
いて４％パラホルムアルデヒドで固定され得、そしてパラフィン包埋後に組織学
的に検査され得る。三つすべての胚葉の組織（例えば、軟骨、平滑筋、または横
門筋（中胚葉)；毛嚢を伴った重層扁平上皮、心室層、中間層、または外套層を
伴う神経管 (外胚葉）；そして、繊毛円柱上皮、および吸収性の腸細胞または粘
液分泌杯細胞によって裏打ちされた繊毛(内胚葉)）を示す奇形腫が、発育する。
ｐＰＳ細胞の多能性は、本開示の下記の手順に従って、特定の細胞株への分化に
関してさらに試験され得る。
【０１１５】 フィーダー細胞非存在下で成長するｈＥＳ細胞の模範的な調製を、実施例１に
下述する。培養１９日において、細胞の８０％より多くが、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒ
ａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１について陽性に染色されたが、細胞の１５
％未満が、ＳＳＥＡ−１について陽性に染色された。
【０１１６】 本開示に記載の特定の細胞集団は、実質的に未分化であり、そして新たなフィ
ーダー細胞を加えることなく多岐の培養間で継代し得る。特定の継代中に、いく
つかの細胞が、分化し得ることが確認された（特に低密度で単一細胞をリプレー
トした場合、または大きなクラスターが形成され得る場合）。しかし、培養物は
、培養期間の間により大きな割合の未分化細胞を代表的には再樹立する。特に目
的であるのは、フィーダー細胞なしの系において少なくとも３ヶ月の間増殖され
得る細胞である。最適なことに、増殖した細胞が、約２０〜４０時間にすぎない
倍化時間を有し得る。
【０１１７】 ｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞の複製能力が増加することが
所望される場合、以下に記載の方法を用いて、それらは不死化またはテロメア化
（分化前または後のどちらかに）され得る。
【０１１８】 （増殖されるｐＰＳ細胞の直接的な分化) 本発明はまた、ｐＰＳ細胞が、中間段階として胚様体を形成せずに、方向付け
られた前駆細胞または十分に分化した細胞へ分化するための新しい系を提供する
。
【０１１９】 胚様体の培養における一般的原理は、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ（Ｎｅ
ｗ Ａｎａｔ．２５７：３２３，１９９９）に報告されている。ｐＰＳ細胞は、
凝集が形成するのを許容する様式においてに培養される。多くの選択肢（例えば
、ドナーｐＰＳ細胞培養の過成長によるか、またはＥＢ形成を許容する低い接着
性質を伴う基質を含む培養容器中でｐＰＳ細胞を培養することによる）が、この
様式のために利用可能である。胚様体はまた、懸濁培養においても形成され得る
。ｐＰＳ細胞は、短いコラゲナーゼ分解によって収集され、クラスターへ解離さ
れ、そして非接着性細胞培養プレートへプレーティングされる。この凝集体は、
２〜３日ごとに播かれ、次いで代表的には４〜８日の、適切な期間の後に収集さ
れる。この細胞は、次いで、特定の系統の細胞の濃縮を促進する培地および／ま
たは基質中で培養され得る。この基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(登録商標）（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、または最
初にマトリックス産生細胞株を培養し、次いでそのマトリックスが容器の表面に
付着し続けるような方法で溶解および洗浄することによって産生されるマトリッ
クスのようなマトリックス構成成分を含み得る。胚様体は、潜在的には内胚葉外
面、そして中胚葉外面および外胚葉内面を有する、異種細胞集団を含む。
【０１２０】 ｐＰＳ細胞が、中間の段階として胚様体または凝集体を形成することなく、方
向付けられた前駆細胞または終末分化細胞へ分化し得ることが、現在までに発見
されている。簡単には、未分化なｐＰＳ細胞の懸濁液が、調製され、次いで分化
を促進する固体表面上にプレートされる。代表的には、ｐＰＳ細胞は、過成長が
許容される場合、コントロールされない様式において分化するので、このｐＰＳ
細胞の培養物は、過密度時においてではなく、十分な密度にまで増殖した場合に
、代表的には回収される。適切な懸濁液は、コラーゲナーゼＩＶとともに培養皿
を約５〜２０分間インキュベートし、次いで皿から細胞をかき集めることによっ
て調製され得る。この細胞は、例えば、ピペット中で粉砕することによって分離
され得る。分化の多くの型について、その細胞が完全には分離していないことが
推奨され、ゆえにｐＰＳの大多数は、約１０〜２００の細胞の凝集塊である。
【０１２１】 この懸濁液は、次いで、方向付けられた前駆細胞への調節された分化を促進す
る基質上にプレートされる。適切な基質は、接着性のガラス表面またはプラスチ
ック表面を含む。例えば、ガラスカバーグラスは、ポリカチオン性基質（ポリリ
シン、ポリオルニチンのようなポリアミン、または他の同種のポリペプチドもし
くは混合されたポリペプチド、または優勢な陽性電荷を伴う他のポリマー）によ
ってコートされ得る。この細胞は、次いで、所望される細胞株への分化を促進す
るのに適応した、適切な栄養性培地中で培養される。
【０１２２】 いくつかの場合において、分化は、この培養培地から血清および血清置換体を
除去することによって促進される。このことは、血清または血清置換体のない培
地に置き換えることによって（例えば、再プレーティング時に、未分化細胞の成
長を促進するかまたは分化を阻害するこの培地の一つ以上の構成成分を除去する
ことによって）達成し得る。例は、特定の増殖因子、マイトジェン、白血球阻害
因子（ＬＩＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および馴化培地中の
他の構成成分を含む。
【０１２３】 いくつかの場合において、分化は、所望される細胞株への分化を促進する培地
構成成分、または所望されない特徴を伴う細胞の成長を阻害する培地構成成分を
加えることによって促進される。例えば、神経系統またはグリア系統へと方向付
けられた細胞を産生するために、この培地は、効果的な組み合わせで、以下に示
す任意の因子または培地成分を含み得る：脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニ
ューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ＮＴ−４、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、毛様
体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レチノイン酸（ＲＡ）
、ソニックヘッジホッグ、ＦＧＦ−８，アスコルビン酸、フォルスコリン、胎仔
ウシ血清（ＦＢＳ）、および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）。
【０１２４】 多能性幹細胞由来の組織細胞を得るための一般的な原理は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ
（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５４３，１９９４）、および米国
特許第６，０９０，６２２号に論評される。神経性前駆体、神経系限定（ｒｅｓ
ｔｒｉｃｔｉｎｇ）の細胞前駆体およびグリア細胞前駆体に関しては、Ｂａｉｎ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００：１２５
２，１９９４；Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：９
２，１９９７；Ｗｏｊｃｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９０：１３０５−１３０；Ｍｕｊｔａｂａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：
１１３，１９９９；および米国特許第５，８５１，８３２号、同第５，９２８，
９４７号、同第５，７６６，９４８号、および同第５，８４９，５５３号を参照
のこと。心筋および心筋細胞に関しては、Ｃｈｅｎら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａｍｉｃ
ｓ １９７：２１７，１９９３およびＷｏｂｕｓら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎ ４８：１７３，１９９１を参照のこと。造血性の前駆体に関しては、Ｂ
ｕｒｋｅｒｔら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：６９８，１９９１およびＢｉｅｓｅｃ
ｋｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２１：７７４，１９９３を参照のこと。米
国特許第５，７７３，２５５号は、グルコース反応性インシュリン分泌膵β細胞
株に関する。米国特許番号第５，７８９，２４６号は、肝細胞前駆細胞に関する
。目的の他の前駆体は、軟骨細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞、繊維芽細胞、
皮膚細胞(例えば、ケラチンノサイト、樹状細胞、毛胞細胞、腎管上皮細胞、平
滑筋細胞および骨格筋細胞）、精巣前駆体、および血管上皮細胞にを含むが、こ
れらに制限されない。
【０１２５】 Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研究者は、成長因子レセプターに結合
するリガンドの存在下においてｐＰＳ細胞または胚様体細胞を培養することが、
神経性前駆細胞の富化を促進することを発見した。この成長環境は、フィブロネ
クチンのような神経細胞支持可能な細胞外マトリックスを含み得る。適切な増殖
因子は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、そしてこれらリガンドに対
するレセプターに対する抗体を含むが、これらに限定されない。レチノイン酸の
ような補因子もまた、含まれ得る。培養された細胞は、次いで、Ａ２Ｂ５のよう
なマーカーを発現するか否かを基準にして必要に応じて分離され得る。適当な環
境下において、Ａ２Ｂ５マーカーの発現が豊富な細胞の集団は、神経細胞（成熟
したニューロンを含む)、およびグリア細胞(星状細胞および稀突起膠細胞を含む
)の両方を産生する能力を有し得る。必要に応じて、例えば、ｃＡＭＰのアクチ
ベータ−を含む培地中での培養によって、この細胞集団は、さらに分化する。目
的のマーカーは、以下を含むが、それに限定されない：ニューロン特異的βチュ
ーブリンＩＩＩまたは微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）；星状細胞に存在す
るグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；稀突起膠細胞特異的ガラクト
セレブロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；未分化
ｈＥＳ細胞に特徴的なＯＣＴ−４；神経前駆体および他の細胞に特徴的なネスチ
ン（Ｎｅｓｔｉｎ）またはムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）；およびにｐＰＳ細胞から
分化した神経性前駆体の集団に見られるＡ２Ｂ５およびＮＣＡＭの両方。
【０１２６】 Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研究者はまた、肝細胞分化薬剤の存在
下におけるｐＰＳ細胞または胚様体細胞の培養が肝細胞様細胞の富化を促進する
ことを発見した。この成長環境は、コラーゲンまたはＭａｔｒｉｇｅｌ(登録商
標)のような肝細胞支持可能な細胞外マトリックスを含み得る。適切な分化薬剤
は、酪酸塩およびそのアナログの種々の異性体（ｎ−酪酸塩によって例証される
）を含む。培養された細胞は、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）様のような
有機溶媒のような肝細胞成熟因子；レチノイン酸のような成熟補因子；またはサ
イトカインもしくはホルモン（例えば、グルココルチコイド、上皮性増殖因子（
ＥＧＦ）、インシュリン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴ
ＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ），ヘパリン、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、インターロイキン（ＩＬ−１およびＩＬ−５）、インシュリン様増殖因子
（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、およびヘパリン結合増殖因子（ＨＢＧＦ−
１））と、必要に応じて同時に、または連続的に培養される。ｐＰＳ細胞から分
化した肝細胞株は、以下に示すマーカーの少なくとも三つを代表的には示す：α
１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）合成、アルブミン合成、アシアロ糖タンパク質
レセプター（ＡＳＧＲ）発現、α−胎児性タンパク質の不在、グリコーゲン貯蔵
の証拠、シトクロムｐ４５０活性の証拠、およびグルコース６リン酸化酵素活性
の証拠。
【０１２７】 ｐＰＳ細胞由来の混合した細胞集団に存在する細胞の型は、特徴的な形態およ
びそれらの発現するマーカーによって認識され得る。骨格筋に関しては：ｍｙｏ
Ｄ、ミオゲニン、およびｍｙｆ−５。内皮細胞に関しては：ＰＥＣＡＭ（血小板
内皮細胞接着分子)、Ｆｌｋ−１、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）
カドヘリン、ＭＥＣＡ−３２、およびＭＥＣ−１４．７。平滑筋に関しては：特
異的ミオシン重鎖。心筋細胞に関しては：ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心性ト
ロポニンＩ、αミオシン重鎖、およびＡＮＦ。膵細胞に関しては：ｐｄｘおよび
インシュリン分泌。造血細胞およびその前駆体に関しては：ＧＡＴＡ−１、ＣＤ
３４、β主要グロブリン、およびβ主要グロブリン様遺伝子βＨ１。
【０１２８】 適切な表面上への直接的なプレーティングによって、またはフィーダー細胞な
しの培養においてｐＰＳ細胞を提供し、そして適切に培地を交換することによっ
て分化するｐＰＳ細胞は、系統制限された細胞または終末分化した細胞の驚くほ
ど同種の集団を産生し得る。用いられる条件に依存して、５０％を十分超えて同
種性を有する細胞集団（７５％、９０％、または９８％同種性と同程度に)は、
識別する技術の使用を有する必要なしでさえ、得られ得る。
【０１２９】 治療目的に関して、分化した細胞集団が、未分化のｐＰＳ細胞を実質的に含ま
ないことが通常所望される。この集団から未分化な幹細胞を除去する一つの方法
は、未分化な細胞において優先的な発現を生じるプロモーターの制御下にエフェ
クター遺伝子を有するベクターでこの細胞を形質転換することである。適切なプ
ロモーターは、ＴＥＲＴプロモーターおよびＯＣＴ−４プロモーターを含む。エ
フェクター遺伝子は、この細胞を直接溶解し得る（例えば、毒素またはアポトー
シスのメディエータをコードする遺伝子）。あるいは、エフェクター遺伝子は、
仔の細胞を抗体またはプロドラッグのような外部の薬剤の毒性効果感受性にし得
る。それが、ガンシクロビルに感受性であるように発現される細胞を生じる単純
ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が、例である。適切なＴＥＲＴプロモ
ーターｔｋ構築物は、ＷＯ９８／１４５９３（Ｍｏｒｉｎら）中に提供される。
【０１３０】 （ｃＤＮＡライブラリー) フィーダー細胞と共に成長したかまたはフィーダー細胞なしの培養物から成長
した未分化なｐＰＳ細胞は、これらの細胞の遺伝子発現パターンを反映するｍＲ
ＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーを調製するのに用いられ得る。ｍ
ＲＮＡおよびｃＤＮＡはまた、分化した細胞から作製し得、そして分化中に上方
制御または下方制御される転写物について濃縮されたサブトラクションライブラ
リーの生成に使用し得る。
【０１３１】 （ｍＲＮＡの単離および増幅されたコピーの生成） ｃＤＮＡライブラリーの調製は、ｐＰＳ細胞またはそれらの分化した子孫から
ｍＲＮＡを単離する工程；このｍＲＮＡのポリヌクレオチドコピーを作製する工
程、および補充され得る形態でポリヌクレオチドコピーを含むライブラリーを産
生する工程を、代表的には含む。代表的には、このポリヌクレオチドコピーは、
ｍＲＮＡテンプレートより逆転写酵素反応によって産生されるｃＤＮＡであるが
、本来のｍＲＮＡ集団の配列を保持する他の任意の型のコピーは、使用され得る
。さらに、異なる供給源(例えば、ｐＰＳおよび分化した細胞)由来のポリヌクレ
オチドコピーは、この二つの集団の間で差示的発現されるコピーが豊富であるラ
イブラリーの産生のために差し引かれる。選択されたポリヌクレオチドコピーは
、クローニングベクター中ヘ代表的に操作されるが、ベクター内、宿主細胞内で
のこのコピーの再生の任意の方法、または化学的な手段は、等価なものとして理
解される。
【０１３２】 例として、フィーダー細胞なしの培養におけるｈＥＳ細胞は、コラゲナーゼを
用いてマトリックスから分離されるか、遠心によって収集されるか、または適切
な溶媒を用いて培養中で直接的に溶解される。総ＲＮＡは、標準の技術の適切な
組み合わせ(例えば、酸フェノール／クロロホルム抽出、ＣｓＣｌを通した遠心
、オリゴｄＴマトリックスへの結合、など；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照の
こと)によってその細胞から調製する。実施例１４に示すように、総ＲＮＡは、
グアニジウムイソチオシアネートの溶液中で細胞を溶解する工程およびＲＮｅａ
ｓｙ(登録商標)スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｃ
Ａ）のような適切なマトリックスに懸濁液中のＲＮＡを結合する工程によって、
収集されたｈＥＳ細胞から単離され得る(米国特許第５，２３４，８０９号）。
総ＲＮＡは、マトリックスから溶出され、次いでポリＡ+ｍＲＮＡが、結合した
ｄＣ10Ｔ30オリゴヌクレオチドを有するＯｌｉｇｏｔｅｘTMビーズへ結合される
ことによって得られる。この結合画分は、低塩緩衝液中に収集され、そしてｃＤ
ＮＡライブラリーを調製するのに用いられ得る。
【０１３３】 種々の方法は、ｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換するために利用可能である。産
生物は、開始ｍＲＮＡ集団をあらわすように設計された一次ライブラリーを含む
：サブトラクションライブラリー（一つの集団において優先的に発現するｍＲＮ
Ａを濃縮するために、二つ以上の異なるｍＲＮＡ集団に共通するｍＲＮＡ種が、
最終ｃＤＮＡ調製物において減少されるライブラリー)；規格化された（ｎｏｒ
ｍａｌｉｚｅｄ）ライブラリ−(独立したｍＲＮＡの相関的存在度が、等しい表
示に平均化されるライブラリー)；および全長偏向（ｂｉａｓｅｄ）ライブラリ
ー（ｃＤＮＡの産生物が、本来のｍＲＮＡのコード配列全体を含むｃＤＮＡを高
頻度に産生するように至適化されるライブラリー）。
【０１３４】 これらの方法における第一の反応は、代表的には、オリゴｄＴプライマーまた
はランダムヘキサマープライマーによってプライムされた温度依存的な逆転写反
応を用いたｍＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡへの任意の変換である。この反応は、商業
的供給業者から容易に入手可能な種類の酵素である、逆転写酵素によって触媒さ
れる。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ(登録商標)（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）が、例であり、これは、天然の酵素の
ＲＮＡｓｅＨ活性が減少し、それによって全長第一鎖ＤＮＡの産生の頻度が増加
する逆転写酵素の改変型である。オリゴｄＴプライマーは、クローニングを容易
にする制限エンドヌクレアーゼ認識配列を５’端に組み込むように、代表的には
改善される。しばしば、一つのヌクレオチド三リン酸のメチル化型が、第一鎖反
応に含まれる。そのため、最終ｃＤＮＡは、最終産物を制限するのに代表的に用
いられる制限エンドヌクレアーゼによる消化から防御される。
【０１３５】 逆転写酵素反応の一本鎖ｃＤＮＡ産物の二本鎖ｃＤＮＡへの変換は、いくつか
の手段によって達成され得る。代表的には、第一鎖ｃＤＮＡは、適切なＤＮＡポ
リメラーゼによる相補的な鎖合成のプライムを許容するように適応する。ＳＭＡ
ＲＴTM ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ
）は、第一鎖産物の末端の末端シトシン残基からの第二鎖合成をプライムする鎖
スイッチオリゴヌクレオチドを利用する。第一鎖ｃＤＮＡ産物を適応させる他の
技術は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いたホモポリマー
尾部の導入、続いて相補的なホモポリマーによる第二鎖プライミング、または適
切なオリゴヌクレオチドの連結、続いて連結したオリゴと相補的なプライマーに
よる第二鎖プライミングを含む。この後者のアプローチを用いて、連結したオリ
ゴヌクレオチドおよびその相補体は、クローニングを容易にする制限エンドヌク
レアーゼ認識配列を含むように設計され得る。
【０１３６】 一つの例において、ＲＮＡｓｅ Ｈの作用が、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に切れ目
を導入するのに用いられ、次いでこの二重鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰｏｌ１の
ようなＤＮＡポリメラーゼのプライミング部位に適切になる。この方法は、有効
であるが、配列情報が、ｃＤＮＡの５’端から失われ得る。５’末端（本来のｍ
ＲＮＡのポリＡ＋部位と逆の末端）の上にあるプライミングＲＮＡは、引き続く
二本鎖ｃＤＮＡのプロセッシングによって失われる。あるいは、５’配列情報が
保存された二本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライマーと第一鎖ｃＤＮＡの
３’端との連合を含む。この連合反応は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（一本鎖オリゴヌ
クレオチドの末端５’リン酸を第一鎖ｃＤＮＡ産物の３’ヒドロキシルに連結し
得る酵素）によって触媒される。用いられたオリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡへ
の連合を許容するために５’末端リン酸を提供し、そして自己鎖状体化を防ぐた
めにアミノ誘導体またはジデオキシ誘導体のような３’ブロッキング基を提供す
るように合成される。このオリゴヌクレオチドはまた、引き続くベクターへのク
ローニングに適切な部位を適合させる制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコード
する。第一鎖産物へのオリゴヌクレオチドの連合に引き続き、第二鎖ｃＤＮＡ合
成は、熱安定性のポリメラーゼのような適切なＤＮＡポリメラーゼ活性を用いて
、連合したオリゴと相補的なオリゴヌクレオチドによってプライミングされる。
配列例：第一鎖ｃＤＮＡ連合オリゴ５’Ｐ−ＡＧＧＴＣ ＧＡＣＧＡ ＧＡＧＡ
Ｇ−３’ＮＨ−Ｘ（配列番号１）、ここではＰ＝リン酸、ＮＨ−Ｘ＝アミンブロ
ッキング基；相補的オリゴ５’ＯＨ−ＣＴＣＴＣ ＴＣＧＴＣ ＧＡＣＣＴ−Ｏ
Ｈ−３’（配列番号２）、ここでは−ＯＨ＝ヒドロキシル基。
【０１３７】 特定の手順が、サンプル中の全長ｃＤＮＡの比率を増加するのに用いられ得る
。この目的に適切なのは、ＲＩＫＥＮ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｊａｐａｎにおい
て開発された技術（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３
０３：１９，１９９９；Ｉｔｏｈら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４６３，１９
９９；国際特許出願ＷＯ９８／２０１２２も参照のこと）である。ｍＲＮＡは、
ビオチンをそのｍＲＮＡの５’末端の７−メチルＧキャップ構造に加えることに
よって適合される。第一鎖ｃＤＮＡの産物は、すでに記載のように達成され、そ
してｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、一本鎖ｍＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅ Ｉで処理される。全長ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって保護され
ないｍＲＮＡは、加水分解され、一方全長ｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、
残存する。このハイブリッドは、５’キャップのビオチンと結合するストレプト
アビジンでコートされたビーズを用いて精製され、そして標準的技術を用いて二
本鎖ｃＤＮＡへ変換される。サンプル中の全長ｃＤＮＡの結果的な比率は、伝統
的方法によって作製されたライブラリーに存在するものよりも、代表的に大いに
高い。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍ
Ｄ）およびＳｅｑｗｒｉｇｈｔ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を含むいく
つかの商業ベンダーが、全長偏向ｃＤＮＡを産生するためのサービスを提供する
。
【０１３８】 サブトラクションライブラリーは、発現レベルが二つのｍＲＮＡ集団の間で異
なる遺伝子の豊富な供給源を提供する。サブトラクションライブラリーを作製す
るための方法は、以下の工程を代表的に含む：ｐＰＳ細胞由来のｍＲＮＡを (例
えば、すでに記載のようにｃＤＮＡ集団を形成することによって) 増幅する工程
；分化した細胞由来のｍＲＮＡを増幅する工程；ｐＰＳ細胞およびその分化した
細胞の両方において発現するｍＲＮＡから増幅したポリヌクレオチドをクロスハ
イブリダイズさせる条件下で二つのプールを一緒にインキュベートする工程；次
いで、クロスハイブリダイズされなかった増幅したポリヌクレオチドを回収する
工程。
【０１３９】 同様の方法において、サブトラクションライブラリーは、ｍＲＮＡ単離物の他
の組み合わせ（例えば、（フィーダー細胞培養から得たｐＰＳ細胞）対（フィー
ダー細胞なしの培養中のｐＰＳ細胞）；（部分的に分化した細胞対終末分化した
細胞）；（または二つ以上の異なる系統の分化した細胞の集団））から作製され
得る。別の例において、（マトリックスもしくは分化を促進するほかの基質上へ
のプレーティングによって、またはＤＭＳＯもしくはレチノイン酸のような薬剤
での処理によって）単層培養において分化したｐＰＳ細胞由来のｃＤＮＡは、そ
れぞれのコロニーの辺縁に形成する分化した細胞の集団を補正するために、フィ
ーダー細胞なしの培養中で成長するｐＰＳ細胞由来のｃＤＮＡから差し引かれる
。サブトラクションライブラリーはまた、未分化なｐＰＳ細胞での発現パターン
に対する、化合物または培養条件の変化の効果を確証するために、作製され得る
。増幅されたｍＲＮＡは、その化合物または条件に曝された細胞から作製され、
そしてコントロール細胞から増幅されたｍＲＮＡを差し引かれる。したがって、
そのライブラリーは、その変化の結果として上方制御または下方制御される転写
産物が濃縮される。
【０１４０】 サブトラクションライブラリーの調製は、以下のように示され得る：二つの独
立したｍＲＮＡプールが調製され、一つはテスター（ｔｅｓｔｅｒ）そして他方
はドライバ（ｄｒｉｖｅｒ）と称する。この例において、これらは適切な形態（
しばしば一本鎖ｃＤＮＡ（一つのプールはセンス方向、他方はアンチセンス方向
））に変換され、次いでハイブリダイゼーションさせるために混合される。両方
のｍＲＮＡ集団に共通の転写産物は、ハイブリッドを形成し、一方、一つのプー
ルにおいてのみ見出される転写産物、または一つのプールにおいて実質的により
高いレベルで発現される転写産物は、ハイブリダイズされずに残存する。次いで
、このハイブリッドが、代表的にはクロマトグラフィーのカラムによる分配によ
ってか、またはストレプトアビジン／ビオチンのような特定の生化学的な系を用
いた回収によって、取り除かれる。テスターｍＲＮＡプールにおいてより高度に
発現する遺伝子がこのとき濃縮されている、残存する一本鎖配列は、適切なベク
ターにクローン化される。サブトラクションライブラリー作製の多くの変化形が
、開発された。規準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を組み込んだ、サブトラ
クションハイブリダイゼーションの特徴を結びつけた方法は、市販されている（
Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ（ＳＳＨ），ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【０１４１】 （組換え発現ライブラリーの調製） これらの技法により作製された二本鎖ｃＤＮＡは、種々のクローニングベクタ
ー中に操作され得る。適切なベクター系は、細菌宿主におけるクローニングのた
めの細菌プラスミドおよびλバクテリオファージを含む。このｃＤＮＡがエンド
ヌクレアーゼ制限された末端とともに生成されるとき、クローニングは、しばし
ば、対応して制限されたベクターＤＮＡとの連結により達成される。配列分析の
ためにプラスミドライブラリーが好適である。なぜなら、個々のクローンが、高
スループット精製およびＰＣＲ増幅プロトコールによって容易にプロセッシング
され得るからである。
【０１４２】 本発明の特定の実施形態では、このクローニングベクターはまた、単離された
プラークが、遺伝子産物を得るために細胞中にトランスフェクトされ得るように
設計された発現ベクターである。従って、増幅された転写物は、転写および翻訳
制御要素の制御下でベクター中に配置される。例えば、プラスミドｐＣＭＶＳｐ
ｏｒｔTM６．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ ＭＤ）は、多重クローニング部位の対向する側面上にＳＰ６およびＴ７
ウイルスＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、クローン化されたｃＤＮＡの
センスまたはアンチセンス鎖の転写を可能にする。同様に、ＣＭＶプロモーター
カセットは、哺乳動物宿主細胞中に導入されるとき、インビボ転写を与える。従
って、このようなベクター中に挿入されたｃＤＮＡは、ｐＰＳ細胞を含む種々の
宿主細胞における発現について試験され得る。このベクターはまた、多重クロー
ニング部位に隣接するλファージ付着配列に特徴を持ち、それらを、Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧａｔｅｗａｙTMベクターに適合するようにする。
このＧａｔｅｗａｙTM系は、λファージの酵素カクテルおよびＥ．ｃｏｌｉ組換
え酵素活性の使用により、クローン化配列のベクター間移動を可能にする配列で
特異的に改変されているベクターを含む。これは、ベクター間で配列を移動する
とき、制限酵素消化を用いる必要性を取り除く。
【０１４３】 特に重要なのは、多能性幹細胞におけるｃＤＮＡの発現について最適化された
ライブラリーである。胚細胞におけるメチル化パターンおよびその他の調節制御
機構は、大部分のその他の真核細胞型の中で活性である、ＣＭＶのようなプロモ
ーターの制御下で遺伝子の転写を抑制し得る。ｐＰＳ細胞中で活性なハウスキー
ピング遺伝子のプロモーターが、人工的に導入されたコード領域の転写を制御す
るために有効であり得ることが発見された。実施例１４に示されるように、適切
なプロモーターを、試験プロモーター配列、グリーン蛍光タンパク質またはβガ
ラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子、および薬物耐性遺伝子を含むレポー
ター構築物を用いて経験的に選択し得る。適切なプロモーターは、分化に失われ
る細胞の比率を実質的に増加することなく、レポーター遺伝子の発現を引き起こ
す特徴を有する。この選択戦略を用い、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉＣのプ
ロモーターが、ｐＰＳ細胞で発現可能なライブラリーの構築に有効であると決定
された。
【０１４４】 （組換え発現ライブラリーの特徴付け） ｃＤＮＡライブラリーをいくつかの規準により特徴付け得る。ｃＤＮＡ長の単
純かつ直接推定は、個々のクローンからのプラスミド調製物を、ｃＤＮＡ挿入物
を放出する制限酵素で消化することによりなされ得る。この消化産物は、アガロ
ースゲルを用いる電気泳動によりサイズ分けされ得、そして中間ｃＤＮＡ挿入物
長が計算され得る。発現ライブラリーの特定の特徴付けは、個々のｃＤＮＡクロ
ーンの５’末端から生成された配列を、公開データベース中に見いだされる配列
と比較することにより達成され得る。本発明のポリヌクレオチド単離物およびク
ローン化挿入物は、当該分野の任意の適切な方法を用いて配列決定され得る。例
として、自動化ＤＮＡシークエンサーを用いて解析されるように蛍光産物を形成
するＰＣＲを基礎にする配列決定方法である。プラスミドＤＮＡおよび配列決定
プライマーを、蛍光により標識されたジデオキシヌクレオチドトリホスフェート
を含むＰＣＲ反応条件下で反応させる。得られる反応産物を、ＡＢＩ ３７７（
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ
ＣＡ）のような、適切なＤＮＡシークエンサー上で分離する。蛍光シグナルが検
出され、生の配列情報に変換され、そして処理される。これらの方法に実質的に
基づくＤＮＡ配列決定サービスが、Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏ
ｕｓｔｏｎ、ＴＸ；およびＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ、ＣＡのような会社から商業的に利用可能である。配列をコードするｍＲＮＡ
のオープンリーディングフレームを得ると、タンパク質遺伝子産物のアミノ酸配
列は、通常、このコード配列を遺伝子コードに従って翻訳することによって、さ
らなる実験なくして決定され得る。
【０１４５】 配列データは、提示される独立遺伝子の数に基づいて、ｃＤＮＡライブラリー
の多様性の一般的な推定を提供する。例えば、ＵＮＩＧＥＮＥコレクション（Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
／ＵｎｉＧｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対してｃＤＮＡ配列を比較するこ
とは、大部分の配列について特有のクラスター同定物の割当を可能にする。評価
されたｃＤＮＡの総数に対して割当られたクラスター同定物の数を比較すること
により、クローン多様性の推定が達成され得る。
【０１４６】 より複雑でないｍＲＮＡ供給源を提示するライブラリーは、より複雑なｍＲＮ
Ａ供給源から作製されたライブラリーに比較して、所定の数のｃＤＮＡで提示さ
れる相対的により少ない独立遺伝子配列を有する。本発明の特定の実施形態では
、ｍＲＮＡ調製物、ｃＤＮＡ調製物、およびクローニングベクター中のライブラ
リーは、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫においてｍＲＮＡレベルで発現され
る、少なくとも１００、１，０００、１０，０００、または５０，０００もの遺
伝子を提示する配列を含む。
【０１４７】 ライブラリーはまた、それらが単一遺伝子型の細胞からの転写物を含むか否か
により特徴付けられ得る。異なるプラークからの粗配列データを、ヒト配列のデ
ータベース、およびこれもまた存在していると疑われる他の種の配列とマッチさ
れる。ライブラリー中の約１％未満の転写物コピーが、それらがｃＤＮＡライブ
ラリーが所望する遺伝子型に由来しなかったことを確立して配列を有する場合、
このライブラリーは、その他の種、脊椎動物、哺乳動物、および同じ種の異なる
遺伝子型のｃＤＮＡが「本質的にない」と呼ばれる。本開示において記載される
無フィーダー培養システムを用いて、外来転写物によるｐＰＳ細胞ライブラリー
の汚染の程度は、フィーダー層上のｐＰＳ細胞の最後の培養からの継代の数に依
存して０．２％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％未満であり得る
。
【０１４８】 ｃＤＮＡからの５’配列はまた、注釈付き完全長ｍＲＮＡ配列のコレクション
と比較して完全長配列を提示するｃＤＮＡの比率を決定し得る。この文脈では、
完全長配列は、コードされるタンパク質の開始メチオニンコドンを含むものとし
て規定され得る。例えば、５’配列の読みは、ＢＬＡＳＴのような適切なサーチ
プログラムを用いてＲＥＦＳＥＱコレクション（ＧｅｎＢａｎｋ）と比較され得
る。ＲＥＦＳＥＱエントリーにマッチさせるこれらｃＤＮＡ配列について、配列
アラインメントの評価は、ｃＤＮＡ配列が、ＲＥＦＳＥＱエントリーによりコー
ドされるタンパク質の開始メチオニンを含むか否かを示し得、そしてそれ故、完
全長ｃＤＮＡの比率が推定され得る。このＲＥＦＳＥＱコレクションは、完全長
ｍＲＮＡの推定されたサイズを示すために注釈付きであるので、この分析は、特
定サイズのｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージをさらに決定す
るために評価され得る。例えば、長さが１ｋｂより大きいｍＲＮＡに対応する完
全長ｃＤＮＡのパーセンテージに対して、長さが１ｋｂより小さいｍＲＮＡに対
応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージを比較することが可能である。
【０１４９】 このような産物が誘導される方法に依存して、対応するｍＲＮＡの全長コード
領域を含むｃＤＮＡの比率は、調製物中のポリヌクレオチドまたはベクターの少
なくとも１５％、３０％、そしてしばしば５０％であり得る。挿入物の中間長さ
は、２本鎖ｃＤＮＡ調製物を取得かつ選択するために用いた方法に依存して、少
なくとも約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、または４ｋｂであり得る。
【０１５０】 （発現ライブラリーからの情報の使用） 一旦、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配
列が決定されると、それは、このような配列を含むポリヌクレオチド、それらが
コードするポリペプチドおよびこのポリペプチドに特異的な抗体の製造に用いら
れ得る。
【０１５１】 ポリヌクレオチドは、研究、診断、または治療適用における任意の適切な目的
のために核酸化学の技法により製造される。ヌクレオチド配列は改変されて、ネ
イティブのコード領域のセグメントを除去し、付加的コード配列を付加し、また
は任意の所望の目的のために変異およびその他の改変を導入し得る。実質的に同
一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメントが、ストリンジェン
トな条件下で、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からの発現ライブラリー中の
ｃＤＮＡに、ヒトゲノム中に含まれるか、またはその他の細胞型で発現されるそ
の他のヌクレオチド配列に優先してハイブリダイズする。約１００塩基対以上の
プローブの結合のための高ストリンジェンシーの代表的条件は、２×ＳＳＣ中６
５℃のハイブリダイゼーション反応、その後の０．１×ＳＳＣにおける繰り返し
洗浄である。特定の実施形態では、製造されたポリヌクレオチドのセグメントは
、本開示で記載されたように得たｃＤＮＡについて決定された配列または配列の
一部に少なくとも約８０％、９０％、９５％、または１００％同一である。例示
の配列と比較された、同一または相同配列中の連続残基の長さは、増加する優先
度の順で、少なくとも約１５、３０、５０、７５、１００、２００または５００
残基であり得る。
【０１５２】 所望の核酸配列に基づき、ポリヌクレオチドは、任意の適切な技法によって製
造され得る。約５０塩基対未満のオリゴヌクレオチドが、商業的サービスによる
か、またはトリエステル法もしくはホスファイト法のような公知の合成方法によ
るかのいずれかにより、化学合成により首尾よく調製される。適切な方法は、モ
ノヌクレオシドホスホルアミダイトカップリングユニット（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔ
ｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．１９：２４４９−２４５２、１９７８：米国特許第４，４
１５，７３２号）を用いる固相合成である。改変された骨格を持つポリヌクレオ
チドは、米国特許第５，５７８，７１８号；同第５，５４１，３０７号；同５，
３７８，８２５号に記載のように調製され得る。ペプチド核酸の調製は、米国特
許第５，５３９，０８２号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号
およびＥＰ出願第９７９１８５４９．２号に記載されている。
【０１５３】 あるいは、ポリヌクレオチドは、所望の配列を持つテンプレートを用いてＰＣ
Ｒ増幅により製造され得る。所望の配列に亘るオリゴヌクレオチドプローブをこ
のテンプレートにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、次いで高温で
融解させ、テンプレートと伸長したオリゴヌクレオチドを解離させる。このサイ
クルを、所望の量の増幅されたポリヌクレオチドが得られるまで繰り返す（米国
特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）。適切なテンプレ
ートは、ｐＰＳ細胞またはその子孫から調製された発現ライブラリー、またはヒ
トにおいて対応する遺伝子が発現される任意の組織からのライブラリーを含む。
大きなポリヌクレオチドの産生スケール量は、所望の配列を適切なクローニング
ベクター中に挿入すること、およびクローンを再生することか、またはこの配列
を適切な宿主細胞中にトランスフェクトすることのいずれかによって首尾よく得
られる。ヌクレオチドクローニングのための技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ（前述）中、および米国特許第５，５５２，５
２４号中に与えられる。ポリヌクレオチドは、供給源に従って適合された、フェ
ノール−クロロホルム抽出、アガロースゲル電気泳動、および当該分野で公知の
その他の技法のような、核酸化学における標準的な技法により精製され得る。
【０１５４】 ｐＰＳ細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの配列データはまた、コード領域に
含まれる配列を含むペプチドを製造するために用いられ得る。アミノ酸配列を改
変して、セグメントを除去もしくは付加するか、または任意の所望の目的のため
に変異およびその他の改変を導入し得る。実質的に同一のポリペプチドまたはポ
リペプチドフラグメントは、ヒトゲノム中に含まれるか、またはその他の細胞型
で発現されるその他のヌクレオチド配列に優先して、ｐＰＳ細胞またはその分化
した子孫からの発現ライブラリーのｃＤＮＡ中にコードされたタンパク質に特異
的な抗体によって認識されるエピトープを共有する。特定の実施形態では、ペプ
チドは、増加する優先度の順で、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ中にコードされるペプ
チドまたはペプチドフラグメントに、６０％、８０％、９０％、９５％または１
００％同一である。プロトタイプのポリペプチドと比較される同一または相同配
列の長さは、全長タンパク質の長さまで、増加する優先度の順に、約７、１０、
１５、２５、５０または１００残基であり得る。
【０１５５】 ポリペプチドおよびそれらの改変体は、任意の適切な技法により製造され得る
。短ポリペプチドは、固相化学合成により調製され得る。固相化学合成の原理は
、Ｄｕｇａｓ ＆ Ｐｅｎｎｅｙ、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ ＮＹ ５４−９２頁（１９８１）、および
米国特許第４，４９３，７９５号に見いだされ得る。自動化固相ペプチド合成は
、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡから
市販されるＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合
成機のようなデバイスを用いて実施され得る。
【０１５６】 より長いポリペプチドは、インビトロ翻訳系における翻訳、または適切な宿主
細胞中の発現により首尾よく製造される。発現ベクターを生成するために、所望
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、転写および翻訳のための制御
要素に作動可能に連結し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物、酵母Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような真核微生物、または昆虫
もしくは哺乳動物細胞のような高等真核生物を含む、適切な宿主細胞中にトラン
スフェクトする。本発明のペプチドを産生するために適切な多くの発現系は、米
国特許第５，５５２，５２４号に記載されている。発現クローニングが、Ｌａｒ
ｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸのような商業的サービス
から利用可能である。産生後、タンパク質は、代表的には、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはＨＰＬＣを包含し得る
、適切な組み合せのタンパク質化学の標準的な方法によって精製される。
【０１５７】 本発明のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドに特異的な
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、発現ライブラリー中のタンパク質
コード領域からのアミノ酸配列を決定すること、および決定された配列を含むタ
ンパク質で動物を免疫すること、またはそれを免疫コンピテント細胞または粒子
と接触させることにより得られ得る。モノクローナル抗体の産生は、Ｈａｒｒｏ
ｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）のような標準的な文献、米国特許第４，４９１，
６３２号、同第４，４７２，５００号および同第４，４４４，８８７号、ならび
にＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ７３Ｂ：３（１９８１）に記
載されている。特異的抗体分子（必要に応じて単鎖可変領域の形態にある）を得
る他の方法は、免疫コンピテント細胞またはウイルス粒子のライブラリーを標的
抗原と接触させること、およびポジティブに選択されたクローンを成長させるこ
とを含む。Ｍａｒｋｓら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３５：７３０、１９
９６、国際特許公開ＷＯ９４／１３８０４、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９０／
０２８０９、およびＭｃＧｕｉｎｅｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．１４：１４４９、１９９６を参照のこと。本開示のｐＰＳを用いてポジティ
ブ選択すること、および（分化した胚細胞のような）より広範に分布した抗原を
持つ細胞または成体由来幹細胞を用いてネガティブに選択することにより、所望
の特異性が得られ得る。
【０１５８】 本発明のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡから得られた配列データ由来のポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、および抗体は、多くの重要な商業的用途を有する。例えば
、ｐＰＳ細胞で発現されるが、分化の間に減少する遺伝子またはタンパク質は、
未分化状態の分子マーカーとして用いられ得る。抗体のような、これらのマーカ
ーに対応する試薬は、免疫アフィニティー単離または補体媒介溶解による分化細
胞の集団から未分化ｐＰＳ細胞を除くために用いられ得る。分化の間に発現レベ
ルが増加する遺伝子またはタンパク質は、同様の様式で、ｐＰＳ細胞由来の特定
の細胞型を精製、濃縮、取り出し、または除去するために用いられ得る。これら
のマーカーは、中胚葉、内胚葉または外胚葉系列で発現される遺伝子またはタン
パク質のような、広範なクラスの細胞分化の指標として供され得るか、または高
度に分化した細胞型の限られたスペクトルの特異的マーカーとして供され得る。
【０１５９】 発現の間にアップレギュレートされる遺伝子はまた、ｐＰＳ細胞の特定の系列
への分化に影響するために有用である得る。例えば、転写因子、増殖因子、レセ
プターおよびシグナル伝達分子をコードする導入遺伝子の未分化ｐＰＳ細胞にお
ける強制発現は、特定細胞系列への分化に影響する能力について試験され得る。
【０１６０】 （多能性幹細胞の遺伝的改変） 本開示はまた、一時的または安定な様式のいずれかで、遺伝子的に改変された
ｐＰＳ細胞を得るための系を提供する。これは多くの目的に所望される。ｐＰＳ
細胞の有望な１つは、研究、診断、および治療目的のための異なる組織型のリザ
ーバーを得る能力である。特定の分化した細胞集団の濃縮を促進するために、分
化に影響するか、または未分化細胞の除去を補助する遺伝子を導入することが可
能であり得る。遺伝子選択の方法は、例えば、米国特許第５，６０２，３０１号
、同第５，７３３，７２７号、および同第６，０１５，６７１号；および国際特
許公開ＷＯ９８／３２８６８、ＷＯ９９／５３０２２、およびＷＯ９９／５５８
４１に記載される。
【０１６１】 特定の実施形態では、本発明は、薬物耐性であるフィーダー細胞の層上にｐＰ
Ｓ細胞の組成物を提供すること、この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチ
ドを移入すること；およびフィーダー細胞が耐性である薬物を用いてこの組成物
中の遺伝的に改変された細胞を選択することによって遺伝的に改変されたｐＰＳ
細胞を得る方法を提供する。特定の実施形態では、このポリヌクレオチドは、未
分化ｐＰＳ細胞でコード領域の転写を促進するプロモーターに作動可能に連結さ
れたタンパク質コード領域を含む。他の実施形態では、このポリヌクレオチドは
、ｐＰＳ細胞を分化させることにより産生される１つ以上の細胞型でコード領域
の転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コード領域を
含む。
【０１６２】 幹細胞を遺伝子的に改変する他の理由は、テロメラーゼの触媒成分（ＴＥＲＴ
）のための発現系を提供することによりそれらを不死化すること、またはそうで
なければ薬物スクリーニングのようなインビトロ使用のためにそれらを遺伝的に
適合させることである。治療適用には、治療遺伝子で細胞を改変するか、または
細胞を意図されたレシピエントと組織適合性にすることが有益であり得る。遺伝
子改変はまた、分化後のソーティングのための細胞を調製するために用いられる
得る。例えば、ｈＥＳ細胞は、ＯＣＴ−４プロモーターまたはｈＴＥＲＴプロモ
ーターのような未分化細胞に特異的なプロモーターの制御下（ＷＯ９８／１４５
９３）で、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（細胞をガンシクロビル感受
性にする）のような薬物感受性遺伝子でトランスフェクトされる。培養物を分化
させた後、残存する未分化細胞を、ガンシクロビルを用いてこの集団から除去し
得る。
【０１６３】 ｐＰＳ細胞を、一時的であるか、または安定かつ細胞が分裂するとき遺伝可能
であるかのいずれかである遺伝子改変を可能にする様式で遺伝子的に改変し得る
ことを発見した。この遺伝子的に改変された細胞は、培養中で未分化多能性形態
で維持され得るか、またはそれは、遺伝子改変をなお保持しながら他の細胞型に
分化され得る。有効な方法は、ｈＥＳ細胞を、初代フィーダー細胞上で増殖する
ときに遺伝子的に改変されることを可能にすることを発見した。ｈＥＳ細胞がト
ランスフェクション前に無フィーダー環境中にプレートされる方法もまた提供さ
れ、これは、多くの重要な利点を提供する。
【０１６４】 細胞中に移入されるポリヌクレオチドは、代表的には、細胞またはその子孫の
表現型を所望の様式に変化させる機能を提供する。例えば、それは、未分化ｈＥ
Ｓ細胞中、または特定系列の分化細胞中の転写を促進するプロモーターの制御下
にあるコード領域を含み得る。それはまた、アンチセンス反応性、三重鎖形成、
またはリボザイム作用のような適切な機構により内因性遺伝子発現に影響し得る
。
【０１６５】 ｈＥＳ細胞中にベクタープラスミドを移入する適切な方法は、米国特許第５，
５７８，４７５号；同第５，６２７，１７５号；同第５，７０５，３０８号；同
第５，７４４，３３５号；同第５，９７６，５６７号；同第６，０２０，２０２
号；および同第６，０５１，４２９号に記載されるような、脂質／ＤＮＡ複合体
を含む。適切な試薬は、膜濾過水中の、ポリカチオン性脂質２，３−ジオレイル
オキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−
１−プロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリフルオロアセテー
ト（ＤＯＳＰＡ）（ケミカルアブストラクツレジストリー名は：Ｎ−［２−（２
，５−ビス（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル（ｏｘｐｅｎ
ｔｙｌ）｝アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（９−オクタデ
セニルオキシ）−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）と中性脂質
ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）
リポソーム処方物である、リポフェクタミンを含む。例示は、処方物Ｌｉｐｏｆ
ｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ ＃１１６６８０１９から入手可能）である。他の試薬は以下を含む：Ｆｕ
ＧＥＮＥTM ６Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．＃１８１４４４３から得られ得る、８０％エタ
ノール中の非リポソーム形態の脂質と他化合物のブレンド）；およびＬｉｐｏＴ
ＡＸＩTMトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、＃２
０４１１０からの脂質処方物）。
【０１６６】 安定な遺伝子改変を持つｈＥＳ細胞を産生するための適切なウイルスベクター
系は、アデノウイルスおよびレトロウイルスを基礎にし、そして市販のウイルス
成分を用いて調製され得る。
【０１６７】 多くの適用には、ｈＥＳ細胞の遺伝子改変は、２つの異なる協議事項への注意
が必要である：十分に高い効率の遺伝子改変を達成すること、および所望されな
い経路に沿ってｈＥＳ細胞の分化を促進しない様式でこの改変を実施することで
ある。種々のトランスフェクションおよび形質導入系のスクリーニング、ならび
に反応タイミングおよび反応条件の最適化は、検出可能な標識をコードする領域
を持つ発現ベクターを用いる実験で首尾よく実施され得る。特に便利な標識は、
ルシフェラーゼ、またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような本質的蛍光
である。この標識はまた、組織病理学で検出され得るか、または酵素反応によっ
て定量化され得る酵素であり得る。例は、アルカリホスファターゼ、およびβガ
ラクトシダーゼを含む。この標識はまた、標識された抗体で染色され、そして例
えば、蛍光活性化細胞計数デバイス中で定量され得る細胞表面タンパク質であり
得る。一旦、有効な系が同定され、そして最適化されると、次いでこの標識のコ
ード領域は、目的の遺伝子で置換され得る。
【０１６８】 遺伝子的に改変された細胞を分化についてモニターするために、細胞は、ＳＳ
ＥＡ−４、ＯＣＴ−４、およびＴＥＲＴのような、ｐＰＳ細胞の特徴であるマー
カーの発現について試験され得る。トランスフェクション効率は、それによって
、未分化表現型を持つ細胞のパーセンテージとして算出され得る。遺伝子的に改
変された細胞の多能性はまた、インビトロ（例えば、胚葉体形成による）または
インビボ（奇形腫形成）のいずれかで分化を誘導すること、および産生された細
胞型を、遺伝子的に改変されないｈＥＳ細胞によって産生されたものと比較する
ことにより確認され得る。
【０１６９】 これらの規準、ならびにＧＦＰ含有プラスミドベクターを用いたトランスフェ
クションおよびＳＳＥＡ−４の表面発現を追跡することにより、ｐＰＳ細胞が再
プレートされ、そしてベクターを添加する前４８時間の間安定化される場合、遺
伝子改変の効率が一般に改善され得ると決定された。ＧＦＰのようなマーカーの
ピーク発現は、約２４時間後に生じる。
【０１７０】 遺伝子改変の効率はまれに１００％であり、そして、通常、首尾よく改変され
た細胞について集団を濃縮することが所望される。線維芽細胞フィーダー細胞上
でｈＥＳ培養が用いられる場合、この効率は未分化細胞の５〜２０％であり得る
。遺伝子的に改変された細胞は、新たな遺伝子型の機能的特徴を利用することに
より濃縮され得る。例えば、ｐＰＳ細胞が、ＧＦＰのような標識で、またはＮＣ
ＡＭのような免疫染色可能な表面マーカーと共にトランスフェクトされる場合、
ｐＰＳ細胞は、懸濁され、蛍光活性化細胞ソーティングにより分離され、そして
再プレートされ得る。読者は、ｐＰＳ細胞の完全な分離が、通常、分化を促進す
ることに注意する。
【０１７１】 遺伝子的に改変された細胞を濃縮する特に有効な方法は、ネオマイシンまたは
ピューロマイシンのような薬物に対する耐性を用いるポジティブ選択である。こ
れを達成するために、細胞は、マーカー遺伝子または目的の遺伝子のためのベク
ター系、および薬物耐性遺伝子を提供するベクター系と同時に接触させることに
より遺伝子的に改変され得る。この混合物中の薬物耐性遺伝子の比率が低い場合
（例えば３：１）、大部分の薬物耐性細胞はまた、目的の遺伝子を含む。あるい
は、この薬物耐性遺伝子を、目的の遺伝子と同じベクター中に構築し得る。トラ
ンスフェクションが生じた後、培養物を対応する薬物で処理し、そして非トラン
スフェクト細胞を取り除く。不運なことに、ｈＥＳ培養中のフィーダー細胞もま
た、通常、この薬物に感受性である。
【０１７２】 この問題を克服するために、本開示はまた、薬物耐性であるフィーダー細胞を
提供する。分化することなくｐＰＳ細胞を増殖させるために適切な環境を提供す
ることが知られる細胞は、薬物耐性遺伝子を導入され、次いでフィーダー細胞と
して作用するそれらの能力について再評価され得る。あるいは、（原発性マウス
線維芽細胞のような）フィーダー細胞は、薬物耐性遺伝子についてトランスジェ
ニックとされた非ヒト哺乳動物から作製され得る。このようなマウスは；例えば
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている。このフィーダ
ー細胞はまた、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、またはＳＶ４０ラージＴ
抗原のための発現系で遺伝子的に改変することによって不死化され得る。
【０１７３】 実施例８は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、およびピューロマイシンに対
する薬物耐性遺伝子を有し、そしてテロメライズ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）され
たＮＨＧ１９０と称される永久フィーダー細胞株を例示する。驚くべきことに、
すべての操作、および遺伝子混乱にかかわらず、細胞はなお、高度に有効なフィ
ーダーであり、分化なしにｈＥＳ細胞の増殖を支持するマトリックス基質および
コファクターを提供する。ＮＨＧ１９０細胞はまた、無フィーダー培養中でｈＥ
Ｓ細胞を支持する馴化培地を作製するために適切である。実施例９は、薬物耐性
遺伝子で遺伝的に改変されたｈＥＳ細胞の長期間選択に、薬物耐性フィーダー細
胞がどのように用いられ得るかを例示する。
【０１７４】 ｐＰＳ細胞は、それらが無フィーダー培養中で増殖される場合に特に遺伝子改
変を受け易いことが発見された（実施例１０に示される）。ＤＮＡ／脂質複合体
を用いる一時的トランスフェクションは６０％程度と高くあり得る。細胞は操作
することが容易であり、そしてベクターに対するシンクとして作用するフィーダ
ー細胞は周囲にない。薬物選択は、薬物耐性フィーダー細胞の利用可能性を必要
としない。トランスフェクション後増殖する未分化ｐＰＳコロニーの数もまた改
善され得る。
【０１７５】 遺伝子改変および薬物選択（薬物耐性フィーダーまたは無フィーダー培養）
後、改変された表現型を示すコロニーを釣り上げ、そしてそれらを別々に培養す
ることが可能である。釣り上げられたコロニーは、２５〜１００細胞の小クラン
プに分散され、そして適切な環境に再プレートされる。このセクションおよび本
開示の他の箇所で概説される戦略のいくつかまたは全部を用いて、少なくとも約
２５％、５０％、７５％、または９０％でさえある未分化細胞が、遺伝子的に改
変されたｐＰＳ細胞の培養を達成することが可能である。
【０１７６】 （テロメル化された多能性幹細胞およびその誘導体） ｐＰＳ細胞、線維芽細胞、または他の細胞型の複製する能力を増加させること
が所望される場合、適切なベクターを用いて（上記に例証するように）、これら
の細胞を遺伝的に変化させることによってそれらはテロメル化（ｔｅｌｏｍｅｒ
ｉｚｅｄ）され得、その結果、これらの細胞はテロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ
）を発現する。特に適切なものは、ヒトテロメラーゼの触媒成分（ｈＴＥＲＴ）
であり、国際特許公開ＷＯ９８／１４５９２において提供される。いくつかの適
用のために、他のＴＥＲＴ配列が使用され得る（マウスＴＥＲＴは、ＷＯ９９／
２７１１３において提供される）。
【０１７７】 代表的には、ベクターは、意図された、分化していない細胞株または分化した
細胞株において転写を促進する異種プロモーターの制御下でＴＥＲＴコード領域
を含む。ＴＥＲＴコード領域の発現を駆動し得る配列には、ウイルスＬＴＲ、エ
ンハンサー、およびプロモーター（例えば、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＭｏＬＶ、Ｃ
ＭＶ、ＭＳＣＶ、ＨＳＶ、ＴＫ）、真核生物プロモーター（例えば、β−アクチ
ン、ユビキチン、ＥＦ１α、およびＰＧＫ）、またはそれらの組み合わせ（例え
ば、β−アクチンプロモーターと組み合わせたＣＭＶエンハンサー）が含まれる
。マーカー遺伝子の発現は、ＴＥＲＴ遺伝子と同じプロモーターによって、別々
の発現カセットとしてか、ポリシストロン性転写物の一部としてか（ここではＴ
ＥＲＴのコード領域およびマーカー遺伝子は、ＩＲＥＳ配列によって分離され、
両方の個々のタンパク質が、単一のプロモーターによって駆動される単一の転写
物から作られることを可能にする）、または同じカセットの一部（ＴＥＲＴおよ
びマーカー遺伝子の両方のコード領域との間の融合物、ＴＥＲＴとマーカー遺伝
子の両方の機能を提供するタンパク質を産生する）としてのいずれかで駆動され
得る。ヒト細胞におけるテロメラーゼのトランスフェクションおよび発現は、Ｂ
ｏｄｎａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３４９、１９９８およびＪｉａｎｇら
、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１１１，１９９９において記載される。
【０１７８】 テロメル化の前後で、テロメラーゼ活性およびｈＴＥＲＴ発現は、標準的な試
薬および方法を使用して決定され得る。例えば、ｐＰＳ細胞は、ＴＲＡＰアッセ
イ（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃ
ｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：４９８，１９９７）を使用して
テロメラーゼについて評価される。以下のアッセイキットは、研究目的で市販さ
れている：ＴＲＡＰｅｚｅ（登録商標）ＸＫテロメラーゼ検出キット（カタログ
番号ｓ７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ ＮＹ）；およ
びＴｅｌｏ ＴＡＧＧＧ テロメラーゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ（カタログ
番号２，０１３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａ
ｐｏｌｉｓ ＩＮ）。ｈＴＥＲＴ発現はまた、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡで
評価され得る。以下のアッセイキットは、研究目的で市販されている：Ｌｉｇｈ
ｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ ｈＴＥＲＴ定量キット（カタログ番号３
，０１２，３４４；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０１７９】 細胞を不死化させる他の方法（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードするＤ
ＮＡを用いて細胞を遺伝的に変化させること（米国特許第５，８６９，２４３号
、国際特許公開ＷＯ９７／３２９７２）、エプスタイン−バーウイルスを用いる
感染、ｍｙｃまたはｒａｓのようなオンコジーンの導入、アデノウイルスＥ１ａ
のようなウイルス複製遺伝子の導入、および、所望の表現型を有する細胞を不死
化された細胞株と融合すること）もまた、意図される。オンコジーン産物および
オンコウイルス産物を用いるトランスフェクションは、細胞が治療目的のために
使用される場合は、より適切ではない。
【０１８０】 （増殖させたｐＰＳ細胞およびその誘導体の他の用途） 本明細書の記載は、大量の多能性細胞がフィーダー細胞の必要性なしで商業的
に産生され得、次いで前駆細胞または最終分化細胞に分化する方法を提供する。
これらの細胞集団は、多くの重要な目的のために使用され得る。
【０１８１】 （特異的抗体の調製） フィーダー細胞なしで維持されるｐＰＳ細胞は、胚マーカー、幹細胞マーカー
、生殖細胞マーカー、およびその細胞で発現され得る他の抗原に特異的である抗
体を調製するために使用され得る。本明細書の開示で記載される細胞は、このよ
うな抗体を惹起する改善された方法を提供する。なぜなら、これらの細胞には、
フィーダー細胞由来の抗原が本質的に夾雑していないからである。ポリクローナ
ル抗体は、免疫原性型の本明細書の開示の細胞を脊椎動物に注入することによっ
て調製され得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生方法は、
上記に提供される。本明細書の開示のｐＰＳを使用してポジティブに選択するこ
と、および、より広範に分布する抗原を有する細胞（例えば、分化した胚細胞）
または成体由来幹細胞を使用してネガティブに選択することによって、所望の特
異性が得られ得る。
【０１８２】 （増殖因子、分化因子、および医薬のスクリーニング） ｐＰＳ細胞は、培養中のｐＰＳ細胞の特徴に影響を与える因子（例えば、低分
子薬物、ペプチド、ポリヌクレオチドなど）または状態（例えば、培養条件また
は操作）をスクリーニングするために使用され得る。この系は、試験化合物によ
るフィーダー細胞の摂動によって引き起こされる二次的な効果によって複雑化さ
れない利点を有する。１つの適用において、増殖に影響を与える物質が試験され
る。馴化培地は、培養から除かれ、そしてより単純な培地（例えば、ＫＯ ＤＭ
ＥＭ）が代用される。次いで、異なるウェルが、馴化培地の成分を置換するため
の候補である可溶性因子の異なるカクテルで処理される。各々の混合物の効力は
、処理された細胞が、満足できる様式、最適には馴化培地と同様に、維持および
増殖されるか否かについて決定される。強力な分化因子または条件は、試験プロ
トコールに従って細胞を処置することによって試験され得、次いで処理した細胞
が、特定の系統の分化した細胞の機能的特性または表現型特性を発現するか否か
を決定する。
【０１８３】 フィーダー細胞を含まないｐＰＳ培養物はまた、薬物探索において薬学的化合
物の試験において使用され得る。候補の薬学的化合物の活性の評価は、一般的に
、本発明の分化した細胞と候補化合物とを組み合わせること、任意の結果の変化
を測定すること、および、次いで、観察された変化を有する化合物の効果を相関
付けることを包含する。スクリーニングは、例えば、化合物が特定の細胞型に薬
理学的な効果を有するように設計されるためにか、または他で効果を有するよう
に設計された化合物は、意図されない副作用を有し得るためにかのいずれかの理
由のためになされ得る。２つ以上の薬物が、可能な薬物−薬物相互作用効果を検
出するために、組み合わせて（同時にまたは連続してのいずれかで、細胞と合わ
せることによって）試験され得る。いくつかの適用において、化合物は、最初に
、潜在的な毒性についてスクリーニングされる（Ｃａｓｔｅｌｌら、３７５−４
１０頁、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。細
胞毒性は、細胞の生存可能性、生存、形態に対する効果、特定のマーカー、レセ
プター、または酵素の発現または放出に対する効果、［3Ｈ］−チミジンまたは
ＢｒｄＵ取り込みによって測定されるＤＮＡ合成または修復に対する効果、また
は分裂中期スプレッドによって決定される姉妹染色分体交換に対する効果によっ
て決定され得る。読者は一般に、標準的な教科書「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５号を参
照する。
【０１８４】 （ゲノム研究） 本明細書の開示において記載される細胞は、前駆細胞に特徴的な転写物および
新規に合成されるタンパク質の発現パターンを同定するために使用され得、そし
て分化の経路を指図する際に、または細胞間の相互作用を促進する際に補助し得
る。目的の細胞集団の発現パターン（例えば、直接的に分化した、または胚様体
もしくは特定の系統の細胞を通して分化したヒトＰＳ細胞）は、コントロール細
胞株（例えば、未分化のｐＰＳ細胞、他の型の前駆細胞、最終分化細胞、または
別の種の分化した細胞（例えば、アカゲザルＰＳ細胞））と比較される。
【０１８５】 タンパク質レベルで発現を比較するための適切な方法には、上記のイムノアッ
セイまたは免疫細胞化学技術が含まれる。転写レベルで発現を比較するための適
切な方法には、ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ法（Ｌｉａｎｇら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：６９６６，１９９２）およびマトリックスアレイ
発現系（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６７，１９９５；Ｅｉｓ
ｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１７９，１９９９；Ｂｒｏ
ｗｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１ 補遺 １：３３，１９９９）が含まれる。
【０１８６】 遺伝子発現の分析におけるマイクロアレイの使用は、Ｆｒｉｔｚら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２８８：３１６，２０００；「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ；「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｇｗｙ
ｎｎｅ ＆ Ｐａｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年８月６日補遺）；Ｐｏｌｌ
ａｃｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ２３：４１，１９９９；Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８，１９９９；インターネッ
トＵＲＬ ｗｗｗ．Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐｓ．ｃｏｍ．における「Ｇｅｎｅ Ｃｈ
ｉｐｓ（ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」，Ｌ．Ｓｈｉによって一般に概説
される。マイクロアレイ分析を実行するためのシステムおよび試薬は、Ａｆｆｙ
ｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ；Ｇｅｎｅ Ｌｏｇｉ
ｃ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ；ＨｙＳｅｑ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖ
ａｌｅ ＣＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙ
ｖａｌｅ ＣＡ；Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ；およびＳｙｎｔ
ｅｎｉ Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ ＣＡ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，
Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡより獲得）のような会社から市販されている。
【０１８７】 固相アレイは、所望の位置でプローブを合成することによって、またはプロー
ブフラグメントをプレ合成し、次いで固相支持体にそれを結合させることによっ
てのいずれかで、特定の部位にプローブを結合させることによって製造される。
種々の固体支持体が使用され得、これらには、ガラス、プラスチック、セラミッ
クス、金属、ゲル、メンブレン、紙、および種々の組成のビーズが含まれる。米
国特許第５，４４５，９３４号は、オンチップ合成の方法を開示し、ここではガ
ラススライドが、光切断性の保護基を含む化学種で誘導体化される。各部位は、
マスクを通しての放射によって連続して脱保護され、次いで光保護基を含むＤＮ
Ａモノマーと反応される。プレ合成されたプローブを固体支持体に結合させるた
めの方法には、吸着、紫外線連結、および共有結合が含まれる。１つの例におい
て、固体支持体は、プローブが結合する活性基（例えば、ヒドロキシル基、カル
ボキシル基、アミン基、アルデヒド基、ヒドラジン基、エポキシド基、ブロモア
セチル基、マレイミド基、またはチオール基）を有するように修飾される（米国
特許第５，４７４，８９５号および同第５，５１４，７８５号）。
【０１８８】 プローブアッセイは、代表的には、ハイブリダイゼーション条件のために適切
な条件下で目的のヌクレオチド配列を含む可能性のある液体によってアレイを接
触させ、次に任意のハイブリッド形成を測定することによって行われる。例えば
、サンプル中のｍＲＮＡまたはＤＮＡは、適切な標識（例えば、蛍光標識Ｃｙ３
またはＣｙ５）に結合されたヌクレオチドの存在下で増幅される。条件は、ハイ
ブリダイゼーションが正確な相補性の一致または種々の程度の相同性で生じるよ
うに適切に調整される。次いで、アレイは洗浄され、そして結合している核酸は
、固相と結合している標識の存在または量を測定することによって決定される。
異なるサンプルは、発現の相対量についてアレイ間で比較され得、必要に応じて
目的の大部分の細胞において発現される遺伝子（例えば、リボソーム遺伝子また
はハウスキーピング遺伝子）を使用してか、または、サンプル中の全ヌクレオチ
ドの比率として標準化される。あるいは、２つ以上の異なる供給源からのサンプ
ルは、異なる標識を有する各供給源から増幅されたポリヌクレオチドを調製する
ことによって同じアレイ上で同時に試験され得る。
【０１８９】 例示的な方法は、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓアレイジェネレ
ーターおよびＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘTM Ｓｃａｎｎｅｒを使用して行われる
。マイクロアレイは、９６または３８４ウェル様式で分析されるマーカー配列を
コードするｃＤＮＡフラグメントを最初に増幅することによって調製される。次
いで、ｃＤＮＡは、スライドあたり５，０００よりも高い密度で、スライドガラ
ス上に直接スポットされる。目的の２つの細胞からのｍＲＮＡ調製物を比較する
ために、１つの調製物は、Ｃｙ３標識されたｃＤＮＡに転換されるが、他方は、
Ｃｙ５標識されたｃＤＮＡに転換される。その２つのｃＤＮＡ調製物は、同時に
マイクロアレイスライドにハイブリダイズされ、次いで、非特異性結合を除去す
るために洗浄される。アレイ上の任意の所定のスポットは、２つのもともとのｍ
ＲＮＡ調製物中の転写物の豊富さに比例して、ｃＤＮＡ産物の各々に結合する。
次いで、そのスライドは、標識の各々に適切な波長でスキャンされ、得られる蛍
光が定量され、そしてその結果は、アレイ上のそれぞれのマーカーについてのｍ
ＲＮＡの相対的な豊富さの指標を与えるように形式付けられる。
【０１９０】 本発明の分化した細胞を特徴付けること、およびその細胞に影響を与えること
における使用のための発現産物を同定することには、第１の細胞型（例えば、多
能性前駆細胞、または特定の経路に沿って分化し得る細胞）におけるＲＮＡ、タ
ンパク質、または他の遺伝子産物の発現レベルを分析すること；次いでコントロ
ール細胞型における同じ産物の発現レベルを分析すること；２つの細胞型間の相
対的な発現レベルを比較すること（代表的には、サンプル中の全タンパク質また
はＲＮＡによって標準化されるか、または両方の細胞型において同様のレベルで
発現されることが予想される別の遺伝子産物（例えば、ハウスキーピング遺伝子
）と比較して）；および、次いで比較した発現レベルに基づいて目的の産物を同
定すること、を包含する。
【０１９１】 産物は、代表的には、コントロールと比較して、本発明の分化したｐＰＳ細胞
において、その相対的発現レベルが、少なくとも約２倍、１０倍、または１００
倍上昇（または抑制）される場合に、目的の産物である。この分析は、必要に応
じて、独立した座標軸上で各々の細胞型における発現レベルをマークすることに
よってコンピューターで補助され得、ここで、各々の座標軸に対するマークの位
置は、それぞれの細胞における発現レベルに従い、次いで、マークの位置に基づ
いて目的の産物を選択する。あるいは、第１の細胞とコントロール細胞との間の
発現の差違は、色のスペクトル上で表され得る（例えば、黄色が等価な発現レベ
ルを表し、赤が増大した発現を表し、そして青が抑制された発現を表す場合）。
次いで、目的の産物は、目的の１つのマーカーの発現を表す色に基づいて、また
は複数のマーカーを表す色のパターンに基づいて選択され得る。
【０１９２】 分化の間の発現レベルの変化を受ける遺伝子およびタンパク質は、多数の目的
のために興味深い。例えば、発現がｐＰＳ細胞中で高く、そして分化の間に減少
する場合、未分化状態の分子マーカーとして使用され得る。これらのマーカーに
対応する試薬（例えば、抗体）が使用されて、例えば、免疫アフィニティー単離
または補体媒介溶解によって、分化された細胞の集団から未分化のｐＰＳ細胞を
除去し得る。発現が分化の間増加する場合に、マーカーは、類似の様式において
、ｐＰＳ細胞由来の特定の細胞型を精製、富化、除去、または排除するために使
用され得る。これらのマーカーは、細胞分化の広範なクラス（例えば、中胚葉、
内胚葉、または外胚葉の系統において発現される遺伝子またはタンパク質）の指
標として働き得るか、または、高度に分化した細胞型のマーカーとして働き得る
。
【０１９３】 発現の間に上方制御される遺伝子はまた、ｐＰＳ細胞の特定の系統への分化に
影響を与えるために有用であり得る。例えば、転写因子、増殖因子、レセプター
、およびシグナル伝達分子をコードするトランスジーンの未分化ｐＰＳ細胞での
強制的な発現は、特定の細胞系統への分化に影響を与える能力について試験され
得る。
【０１９４】 （治療的組成物） 本発明の分化した細胞はまた、その必要のあるヒト患者において組織の再構築
または再生のために使用され得る。その細胞は、意図された組織部位にその細胞
を移植することを可能にし、そして機能的に欠損している領域を再構成または再
生する様式で投与される。
【０１９５】 １つの例において、神経幹細胞は、処置される疾患に従って、中枢神経系の実
質部位またはクモ膜下腔内の部位に直接的に移植される。移植は、１μＬあたり
２５，０００〜５００，０００細胞の密度の単一の細胞懸濁物または小さな凝集
物を使用して行われる（米国特許第５，９６８，８２９号）。神経細胞移植物の
効力は、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４１０，１９９９）によ
って記載されるように、急性的に損傷した脊髄についてのラットモデルにおいて
評価され得る。首尾よい移植は、損傷において２〜５週間後に存在する移植片由
来の細胞（星状細胞、稀突起神経膠細胞、および／またはニューロンに分化した
）および損傷した末端から脊髄に沿っての移動、ならびに歩行（ｇａｔｅ）、協
調（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）、および重量負荷における改善を示す。
【０１９６】 心筋細胞の効力は、処置がない場合、左心室壁組織の５５％が瘢痕組織になる
ことを引き起こす心臓の低温障害についての動物モデルにおいて評価され得る（
Ｌｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６；Ｓａｋａ
ｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９、Ｓａｋａｉ
ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１
９９９）。首尾よい処置は、瘢痕の領域を減少し、瘢痕の拡大を制限し、そして
、収縮期の血圧、拡張期の血圧、そして生じた（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）血圧によ
って決定されるように、心機能を改善する。心臓傷害はまた、左前空間動脈の遠
位の部分において塞栓形成コイルを使用してモデル化され得（Ｗａｔａｎａｂｅ
ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、そして処置の
効力は、組織学および心機能によって評価され得る。本発明において具体化され
る心筋細胞調製物は、心筋を再生するために、そして不十分な心機能を処置する
ために、治療において使用され得る（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷ
Ｏ９９／０３９７３）。
【０１９７】 肝細胞および肝細胞前駆体は、肝障害を修復する能力についての動物モデルに
おいて評価され得る。１つのそのような例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔内注入
によって引き起こされる傷害である（Ｄａｂｅｖａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ
．１４３：１６０６，１９９３）。処置の効力は、肝細胞マーカーについての免
疫組織化学的染色、増殖している組織において小管構造が形成されるか否かの顕
微鏡的決定、および肝細胞特異的タンパク質の合成を回復させる処置の能力によ
って決定され得る。肝細胞は、直接的投与によって、または劇症肝不全の後に被
験体の肝組織がそれ自体を再生する間に一時的に肝機能を提供する生物補助（ｂ
ｉｏａｓｓｉｓｔ）デバイスの一部として、治療において使用され得る。
【０１９８】 ヒトまたは獣医学的治療のために有用である本発明に従って調製される細胞は
、最適には、薬学的組成物中に供給され得、ヒト投与のために十分に滅菌した条
件下で調製される等張性の賦形剤を含む。医薬処方物における一般的な原理につ
いて、読者は、以下を参照する：Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌ
ｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃ
ｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．
Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ
，１９９６；およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃ
ｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００。その組成物は、組織再生、また
は治療的に重要な代謝機能を回復させることにおける細胞の使用について書かれ
た説明書とともにパッケージされ得る。
【０１９９】 以下の実施例は、さらなる例示のために提供され、そして特許請求の範囲に記
載される発明の実施におけるいかなる制限も意味されない。
【０２００】 （実施例） （実施例１：ｈＥＣ細胞のフィーダー細胞を含まない継代） この実験において、初代マウス胚フィーダー細胞上で維持されてきた未分化の
ｈＥＳ細胞を収集し、次いでフィーダー細胞の非存在下で維持した。培養物ウェ
ルを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコートし、細胞を、放射した初代線維芽
細胞の培養物から得られた馴化栄養培地の存在下で培養した。
【０２０１】 （初代マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）からの馴化培地（ＣＭ）の調製） Ｃａ++およびＭｇ++を含まないＰＢＳで一回洗浄すること、および１．５〜２
ｍＬのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間インキュベートするこ
とによって、Ｔ１５０フラスコから線維芽細胞を収集した。線維芽細胞がフラス
コから脱離した後に、それらの細胞をｍＥＦ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）
中で収集した。細胞に、４０００ｒａｄで照射し（１４０ｋＶで５０８秒：Ｔｏ
ｒｒｅｘジェネレーターにおいてシェルフ設定６）、計数し、そしてｍＥＦ培地
中に約５５，０００細胞ｃｍ-2で播種した（５２５，０００細胞／６ウェルプレ
ートの１ウェル）。少なくとも４時間後、６ウェルプレートの９．６ｃｍウェル
当たり３〜４ｍＬを使用して、培地をＥＳ培地を含むＳＲで交換した。馴化培地
を、ｈＥＳ培養物の給餌のために毎日収集した。あるいは、培地を、培養フラス
コ中にプレートしたｍＥＦを使用して調製し、毎日、０．３〜０．４ｍＬｃｍ-2 で培地を交換した。ｈＥＳ培養物に添加する前に、馴化培地を、４ｎｇ／ｍＬの
ヒトｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）で補充した。線維芽細胞培養物を、この系で約１週
間使用した。その後新しく調製した細胞で置き換えた。
【０２０２】 （Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティング：） 増殖因子を減少させたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）または通常のＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｍ
Ａ）を、４℃で融解した．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、冷ＫＯ ＤＭＥＭ
中で１：１０〜１：５００（代表的には、１：３０）に希釈した。０．７５〜１
．０ｍＬの溶液を、各９．６ｃｍ2ウェルに添加し、そして室温で１時間、また
は４℃で少なくとも一晩インキュベートした。コートしたウェルを、冷ＫＯ Ｄ
ＭＥＭで１回洗浄し、その後細胞を添加した。コーティング後２時間以内にプレ
ートを使用するか、または４℃でＤＭＥＭ中に保存し、そして約１週間以内に使
用した。
【０２０３】 （ヒトＥＳ培養物：） 非分化のｈＥＳコロニーを、以下のようにフィーダー細胞上のｈＥＳ培養物か
ら収集した。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ中で、３７℃で
５分間インキュベートした。コロニーを、顕微鏡下で、個々のコロニーを２０μ
Ｌのピペットチップを使用して拾い上げることによってか、またはかき取って馴
化培地（ＣＭ）中で小さなクラスターに解離させることによって収集した。次い
で、これらの細胞を、馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に、各９．６
ｃｍ2ウェルに対して１５コロニーで播種した（１コロニーが約１０，０００細
胞の場合、プレーティング密度は約１５，０００細胞ｃｍ-2）。
【０２０４】 Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の播種後の翌日、ｈＥＳ細胞は、小さなコロ
ニー（約１００〜２，０００細胞）として見えた。そしてコロニー間に、分化し
ているかまたは死滅している細胞に見える細胞が存在した。ｈＥＳ細胞が増殖す
るにつれて、コロニーは、非常に大きくなり、そしてぎっしり詰まるようになり
、このことは培養ディッシュの表面領域の大部分を表す。コロニー中のｈＥＳ細
胞は、高い核対細胞質比を有し、そしてフィーダー細胞上で維持されるｈＥＳ細
胞に類似の顕著な核小体を有した。コンフルエンスにおいて、コロニー間で分化
した細胞は、培養物中の細胞１０％未満を表した。
【０２０５】 播種の６日後、培養物はほぼコンフルエントになった。培養物を、ＫＯ ＤＭ
ＥＭ中で、１ｍＬの約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ溶液とともに、３７
℃で約５分間インキュベートすることによって分割した。このコラゲナーゼ溶液
を吸引し、ウェルあたり２ｍＬのｈＥＳ培地を添加し、そしてｈＥＳ細胞を、ピ
ペットを用いてディッシュからこすり取った。細胞懸濁物を、１５ｍＬコニカル
チューブに移し、６ｍＬの容量までにし、そして、１０〜２０００細胞の小さな
クラスターに細胞を解離させるために穏やかに摩砕した。次いで、この細胞を、
上記のように、ＣＭ中の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上
に再播種した。細胞を、１：３または１：６の比で、およそ９０，０００〜１７
０，０００細胞ｃｍ-2で播種し、各ウェルにおける容量を３ｍＬにした。培地を
毎日交換し、そして１３日目に再度細胞を分割し、そして継代し、そして最初の
播種から１９日目に再度行う。
【０２０６】 最初の播種後１９日目に、細胞を収集し、そして細胞表面マーカーに特異的な
標識された抗体を使用して、免疫蛍光細胞サイトメトリーによって表面マーカー
発現について評価した。この実験からの結果は以下の通りである：
【０２０７】
【表１】 フィーダー細胞の非存在下で維持されるｈＥＳ細胞について、高い割合がＳＳＥ
Ａ−４、Ｔｒａ−１−６０、またはＴｒａ１−８１を発現する。これらの３つの
マーカーは、フィーダー細胞上で維持される未分化のヒトＥＳ細胞上で発現され
る（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）。さらに、ＳＳＥＡ−１の非常に少ない発現
が存在し、これは、未分化のＥＳ細胞上では発現しない（か、または、低いレベ
ルで発現する）糖脂質である。ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ
−１−８１の免疫細胞化学評価は、これらのマーカーの発現が、ＥＳコロニーに
局在し、コロニー間の分化した細胞には局在しないことを示す。
【０２０８】 フィーダー細胞の非存在下で増殖するｈＥＳ細胞はさらに、核型（Ｇ−バンデ
ィング（ｂａｎｄｉｎｇ）によって評価される）、ＯＣＴ−４の発現（ＰＣＲに
よって評価される、未分化のＥＳ細胞に付随するＰＯＵ転写因子ファミリーのメ
ンバー）、奇形腫を形成する能力（約５×１０6細胞でのＳＣＩＤ／ベージュマ
ウスへの注射１〜４ヶ月後）、および凍結保存についての適合性（速度制御フリ
ーザーにおいて、１０％ＤＭＳＯおよび２０〜３０％ ＳＲを補充した標準培地
中）によって特徴付けられ得る。
【０２０９】 ｈＥＳ細胞の培養物を、最初の播種後１４７日間にわたって、増殖能力または
表現型の見かけの変化を伴わずに、フィーダー細胞の非存在下で増殖させた。ｍ
ＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されるヒトＥＳ細胞は
、約３１〜３３時間の倍加時間を有し、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖するｈＥ
Ｓ細胞についての増殖速度に類似する。フィーダー細胞を含まない培養物の６４
時間後のＨ１細胞は、正常な核型を示した。
【０２１０】 （実施例２：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニンは、ｈＥＳ細胞の
フィーダー細胞を含まない増殖を支持する） ｈＥＳ細胞の増殖は、初代マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）を使用して馴化され
た培地中で、異なるマトリックス成分の結果として生じる。
【０２１１】 ｈＥＳ培養物は、最初に、４ｎｇ／ｍＬの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因
子（ｈｂＦＧＦ；Ｇｉｂｃｏ）を補充したＥＳ培地（８０％ノックアウトＤＭＥ
Ｍ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、２０％ノックアウト血
清置換物（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１％ 非必須ア
ミノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭ Ｌ−グル
タミン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で維持されるフィーダー細胞培養物から収集した
。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ中、３７℃での約５〜１０
分間のインキュベーションによって継代した。次いで、コロニーを、顕微鏡下で
ＰｉｐｅｔｍａｎTMを用いて個々のコロニーを除去することによってか、または
掻き取ることによって収集し、続いて馴化培地中で小さなクラスターに穏やかに
解離させ、次いで、マトリックスコートしたプレートに播種する。
【０２１２】 採取したｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ま
たはゼラチンに播種した。播種の翌日、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）にプレー
トした細胞をプレートに付着させ、そしてフィーダー層上のｈＥＳコロニーより
あまり密集しない小さなコロニーを形成させた。次の数日後になると、コロニー
のサイズが大きくなり、そして細胞がより密集した。得られた培養物は、分化し
た細胞に取り囲まれた、非常に密な未分化のコロニーを含んでいた。
【０２１３】 播種の約１週間後には培養物はコンフルエントになり、そして継代し得た。対
照的に、ゼラチンに播種した細胞は、貧弱な生存を示し、そして生存した細胞は
分化したようであった。３つのｈＥＳ細胞株、Ｈ１、Ｈ７およびＨ９を、ｍＥＦ
馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において培養した。培養物を、１０
０日を超えてＥＳ様形態を提示し続けるためのこれらの条件下で維持した。
【０２１４】 Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の主要成分は、ラミニン、コラーゲンＩＶ型お
よびヘパリン硫酸プロテオグリカンである。これらの成分がｈＥＳ細胞培養を支
持する能力を別々に試験した。ラミニン、コラーゲンＩＶ型またはフィブロネク
チン（全てＳｉｇｍａから）を、ＰＢＳ中、それぞれ２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ
／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの終濃度まで希釈した。
【０２１５】 ラミニン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ型上に播種したｈＥＳ細
胞は、未分化ｈＥＳ細胞のコロニーを有したが、フィブロネクチンまたはコラー
ゲンＩＶ型上の培養物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の培
養物ほど多くの未分化コロニーを含んでいなかった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）またはラミニン上の細胞がコンフルエントに達したとき、コロニー内の細胞
は非常に密集した状態になり、フィーダー上で維持された細胞と形態学的に非常
に類似し、そして連続的に継代された。４０日（６回継代）後、Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌ（登録商標）およびラミニン上の細胞は、高い割合の、長期の培養期間中にＥ
Ｓ様形態を提示し続けたコロニーを含んでいた。しかし、フィブロネクチンまた
はコラーゲンＩＶ型上で維持した細胞は、適切なＥＳ形態を提示するコロニーが
より少なかった。コントロールとして、非馴化培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）またはラミニン上で培養した細胞は、よりゆっくりと増殖するようであり
、そして数回の継代の後に分化した形態を示した。
【０２１６】 図１は、フィーダーなしの培養物におけるｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＡ
（左側）は、非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー細胞上で、ｍＥＦ馴化
培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチン、または
コラーゲンＩＶ型上で培養したＨ１株のｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＢは、
実施例１１に記載される種々の型の馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）
上で維持されたＨ９株のｈＥＳ細胞の形態を示す。
【０２１７】 ラミニンは、脊椎動物における全ての基底層の主要成分であり、これは、細胞
膜上のインテグリンヘテロ二量体（例えば、α１β１、α２β１、α３β１、α
６β１、およびα６β４）と相互作用し、そして発生の間の細胞増殖および移動
を媒介する。これらのインテグリンの中でも、α６β１およびα６β４は、ラミ
ニンに特異的であり；他のインテグリンはまた、他のマトリクスと相互作用する
。ラミニンレセプターがｈＥＳ細胞上で発現されるか否か、およびラミニンまた
はＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養しているｈＥＳがラミニンレセプター
の発現を変化させるか否かを、別の実験で試験した。α１、α２、α３、α６、
β１およびβ４を含むインテグリンの発現を、フィーダー上、馴化培地中のＭａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で維持した細胞に対してＦＡＣＳ分
析により試験した。インテグリン発現を分析するために、ラミニン特異的インテ
グリン検査キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．
，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によりインテグリン特異的抗体のパネルで細胞を染
色し、そして以下で記載のようにＦＡＣＳにより分析した。
【０２１８】 図１のパネルＣは、非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー上、またはＭ
ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上、またはｍＥＦ馴化培地（ＣＭ）中のラミニン上
で維持したＨ１ ｈＥＳ細胞において測定したインテグリン発現を示す。
【０２１９】 Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／馴化培地中で維持した細胞およびラミニン／
馴化培地中で維持した細胞を、以下のように低温保存した：細胞を、１０％ＤＭ
ＳＯおよびさらなる１０％ＳＲ（計３０％）を補充した標準ｈＥＳ培地（馴化培
地でない）中で凍結した。細胞を馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上
またはラミニン上で融解した。細胞は、融解後に通常の核型を維持した。
【０２２０】 ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持したヒトＥＳ細胞
は、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖したｈＥＳ細胞の増殖速度と類似して、約３
１〜３３時間の倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）を示した。フィーダー
なし培養物の６４日後のＨ１細胞は、正常な核型を示した。
【０２２１】 （実施例３：フィーダーなしの培養におけるｈＥＳ細胞の表現型マーカー） 未分化ｈＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、
ＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴを発現する。フィーダーなしの条件下で維持された
細胞がこれらのマーカーを維持したか否かを評価するために、細胞を免疫染色、
逆転写酵素ＰＣＲ増幅、およびテロメラーゼ活性に関するアッセイにより評価し
た。
【０２２２】 図２は、ＦＡＣＳ分析によるフィーダーなしの細胞における表面マーカー発現
を示す。パネルＡ：非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー上、ｍＥＦ馴化
培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンおよびコ
ラーゲンＩＶ型上で維持されたＨ１細胞におけるＳＳＥＡ−４の発現。アイソタ
イプコントロールを破線で示す。パネルＢ：異なるマトリクス上で培養したＨ１
細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１
−８１の平均蛍光強度。パネルＣ：異なる細胞株に由来する馴化培地中のＭａｔ
ｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養したＨ９細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ
−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１の平均蛍光強度。
【０２２３】 蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による分析のために、ｈＥＳ細胞を
ＰＢＳ中０．５ｍＭ ＥＤＴＡ中で解離し、そしてＰＢＳ中０．１％ ＢＳＡを
含有する５０μＬ希釈液中、約５×１０5細胞に再懸濁した。表面マーカー発現
を分析するために、細胞を、希釈液中に希釈した一次抗体（ＩｇＧアイソタイプ
コントロール（０．５μｇ／試験）、ＩｇＭアイソタイプコントロール（１：１
０）、ＳＳＥＡ−１（１：１０）、ＳＳＥＡ−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６
０（１：４０）およびＴｒａ−１−８１（１：８０）を含む）中で４℃で３０分
間インキュベートした。希釈液で洗浄した後、細胞を、ＰＥを結合体化したラッ
ト抗マウスκ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，
ＣＡ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、そしてＦ
ＡＣＳＣａｌｉｂｕｒTMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓ
ｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅｌｌＱｕｅｓｔTMソフトウェアを用いて
分析した。
【０２２４】 フィーダー上のｈＥＳ細胞に類似して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミ
ニン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上の細胞は、ＳＳＥＡ−４、Ｔ
ｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を発現した。それらは、ＳＳＥＡ−１（
未分化ｈＥＳ細胞により発現されない糖脂質）をほとんど発現しなかった。
【０２２５】 図３は、組織化学により検出されたマーカー発現を示す。免疫細胞化学による
分析のために、細胞を、ノックアウトＤＭＥＭ中に希釈した一次抗体（ＳＳＥＡ
−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６０（１：４０）およびＴｒａ−１−８１（１
：８０）を含む）とともに３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞
を温めたノックアウトＤＭＥＭで洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒド中で
１５分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清とと
もにＲＴで３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合体化ヤギ抗マウス
抗体（１：１２５）（Ｓｉｇｍａ）とともにＲＴで３０分間インキュベートした
。細胞を洗浄し、ＤＡＰＩで染色し、そしてマウントした。細胞をまたアルカリ
ホスファターゼ（未分化ＥＳ細胞のマーカー）の発現についても試験した。これ
は、細胞をチャンバースライド上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで１５分
間固定し、次いで、ＰＢＳで洗浄することにより行った。次いで、細胞をアルカ
リホスファターゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに遮光して１時間室温でインキュベートし
た。スライドを、マウントする前に１００％エタノール中で２〜５分間リンスし
た。
【０２２６】 結果は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、およびアルカ
リホスファターゼがフィーダー上の細胞についてみられるように、Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ（登録商標）またはラミニン上のｈＥＳコロニーにより発現された（しかし
、コロニー中で分化した細胞によってではない）ことを示す。
【０２２７】 図４は、逆転写酵素ＰＣＲ増幅により検出されるように、フィーダー上および
フィーダーなしのＨ１細胞のＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴ発現を示す。個々の遺
伝子産物の放射活性相対量については、ＱｕａｎｔｕｍＲＮＡTM Ａｌｔｅｒｎ
ａｔｅ １８Ｓ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄプライマー（Ａｍｂｉｏ
ｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ，ＵＳＡ）を、製造業者の指示に従って用いた。簡潔に
は、特定のプライマー対の増幅の線形範囲を決定し、次いで、ａｌｔｅｒｎａｔ
ｅ １８Ｓプライマー：コンペティマー（ｃｏｍｐｅｔｉｍｅｒ）の適切な混合
物と同時増幅させて、同時に生じる線形範囲を有するＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ
反応物にＡｍｐｌｉＴａｑTM（Ｒｏｃｈｅ）を添加する前に、この酵素を、製造
業者の指示に従って、ＴａｑＳｔａｒｔTM抗体（ＰｒｏＭｅｇａ）とともに予め
インキュベートした。放射活性ＰＣＲ反応物を５％非変性ポリアクリルアミドゲ
ルで分析し、乾燥し、そしてホスホイメージスクリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｙｎａｍｉｃｓ）に１時間曝した。スクリーンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎ
ａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８６０でスキャンし、そしてバンド強度をＩｍａｇｅ
ＱｕａｎｔTMソフトウェアを用いて定量した。結果を、ｈＴＥＲＴまたはＯＣＴ
−４バンドに組み込まれた放射活性の割合として表し、１８Ｓバンドに組み込ま
れた放射活性に対して標準化した。
【０２２８】 特定のマーカーについてのプライマーおよび増幅条件は、以下のとおりである
。ＯＣＴ−４：センス（配列番号３）５’ＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧ ＡＡＧＴＧＧ
ＧＴＧＧ ＡＧＧＡＡ−３’；アンチセンス（配列番号４）５’−ＣＴＧＣＡＧ
ＴＧＴＧ ＧＧＴＴＴＣＧＧＧＣ Ａ−３’；ａｌｔｅｒｎａｔｅ １８：コン
ペティマー１：４；１９サイクル（９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒
）、ｈＴＥＲＴ：センス（配列番号５）５’−ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧ ＴＣＴＧ
ＧＡＧＣＡＡ−３’；アンチセンス（配列番号６）５’−ＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧ ＧＡＧＴＣＴＧＧＡ−３’；ａｌｔｅｒｎａｔｅ １８：コンペティマー１：
１２；３４サイクル（９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒）。
【０２２９】 転写因子ＯＣＴ−４は、通常、未分化ｈＥＳ細胞において発現され、そして分
化の際にダウンレギュレートされる。この実験において、馴化培地（ＣＭ）中の
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で２１日間維持された細胞は、
ＯＣＴ−４を発現したのに対し、非馴化通常培地（ＲＭ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ
（登録商標）中で維持された細胞は発現しなかったことが見出された。フィブロ
ネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上で維持された細胞（これは、大きな程度の分
化を示す）は、フィーダー、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の
細胞と比較して、より低レベルのＯＣＴ−４を発現した。
【０２３０】 ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４発現は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および通
常培地を除く培養条件全てにおいてみられた。さらに、細胞をレチノイン酸（Ｒ
Ａ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（これらは、細胞分化を促進する
因子である）に曝した後、ｈＴＥＲＴの発現は顕著に減少した。
【０２３１】 図５は、ＴＲＡＰアッセイにより測定されるテロメラーゼ活性を示す（Ｋｉｍ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：４９８，１９９７）。培養条件全てがｍＥ
Ｆ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンま
たはコラーゲンＩＶ型上で４０日後に陽性のテロメラーゼ活性を示した。
【０２３２】 （実施例４：インビトロおよびインビボ分化） インビトロ分化を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネク
チンまたはコラーゲンＩＶで馴化培地中２６日間維持したＨ１ ｈＥＳ細胞にお
いて誘導した。ｈＥＳ細胞を、約２００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ中で３７℃で
１０分間インキュベートすることによって小塊に解離し、そしてＤＭＥＭ、２０
％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ グルタミン、０．１ｍＭ βメルカプ
トエタノール、および０．１ｍＭ 可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地中で
懸濁培養して、胚様体（ＥＢ）を形成させた。懸濁して４日後、凝集物をポリオ
ルニチンコーティングプレート上に移し、そしてさらに７日間培養した。次いで
、この培養物を収縮する細胞の存在について試験し、そして免疫細胞化学のため
に処理した。
【０２３３】 図６は、これらの細胞の免疫細胞化学分析の結果を示す。染色パターンは、ニ
ューロンおよび心筋細胞系列（それぞれ、βチューブリンＩＩＩおよび心臓トロ
ポニンＩ）の細胞と一致した。分化の約８日後、収縮する領域を全ての培養物で
同定した。α−フェトプロテイン（内胚葉系列のマーカー）についてもまた細胞
を染色した。
【０２３４】 ｈＥＳ細胞を、ＳＣＩＤマウスへの筋肉内注射により奇形種を形成する能力に
ついてもまた試験した。フィーダー上またはフィーダーなしで維持した細胞を採
取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳＣＩＤ／ベージュマウスに筋肉内注射した
（５×１０6細胞／部位）。腫瘍を切除し、そして組織学的分析のために処理し
た。フィーダーなしの培養物に由来するｈＥＳ細胞は腫瘍を生成し、これを切除
し、そして７８〜８４日後に組織学的分析のために処理した。
【０２３５】 図７は、ｍＥＦフィーダー細胞で維持したＨ７細胞（Ａ）またはフィーダーな
し培養物（Ｂ）に由来する奇形種の組織病理を示す。ムチン上皮成分、軟骨およ
び神経組織は、フィーダー上で培養したｈＥＳ細胞に由来する奇形種で観察され
た。嚢胞性上皮構造、おそらく歯科成分、軟骨および腺上皮または神経成分は、
フィーダーなしのｈＥＳ培養物に由来する奇形種において見出された。
【０２３６】 （実施例５：ｈＥＳ細胞の直接分化） 凝集物形成の標準的方法を用いる分化を、本発明の技術と比較した。ここで、
特定の条件下で固体表面に直接プレートすることにより細胞を分化させた。
【０２３７】 凝集物分化技術のために、アカゲザルおよびヒトのＥＳ株の単層培養物をコラ
ゲナーゼＩＶ中で５〜２０分間インキュベートすることにより採取し、そしてこ
れらの細胞をプレートから掻き取った。次いで、これらの細胞を解離し、そして
０．１ｍＭ 可欠アミノ酸、１ｍＭ グルタミン、０．１ｍＭ βメルカプトエ
タノールを補充したＦＢＳ含有培地（２０％ 熱非働化していないＦＢＳ（Ｈｙ
ｃｌｏｎｅ））中、非接着性細胞培養プレートにプレートした。ＥＢに、一日お
きに１ウェル（６ウェルプレート）あたり２ｍｌの培地を添加して供給した。培
地の容積が４ｍｌ／ウェルを超えたときに、ＥＢを採取し、そして新鮮な培地に
再懸濁した。プレートを３７℃のインキュベーター中に入れ、そしていくつかの
場合には、振盪機（ｒｏｃｋｅｒ）を用いて、懸濁物中の凝集物の維持を容易に
した。懸濁して４〜８日後、凝集体が形成され、そしてさらに分化させるために
基板上にプレートした。
【０２３８】 直接分化技術のために、アカゲザルおよびヒトのＥＳ細胞の懸濁物を同様の様
式で調製した。次いで、細胞を約５０〜１００細胞の塊に砕くこと（ｔｒｉｔｕ
ｒａｔｉｏｎ）により解離し、そしてポリオルニチンで処理したガラスのカバー
スリップ上にプレートした。細胞を、血清含有培地中、または分析の７〜１０日
間前に規定された培地で維持した。細胞を、ニューロン、およびグリア線維酸性
タンパク質（ＧＦＡＰ）に特徴的であり、星状細胞に特徴的であるβチューブリ
ンＩＩＩおよびＭＡＰ−２についての免疫反応性により試験した。
【０２３９】 ６つの異なるＥＳ株は、凝集物または直接分化技術のいずれかを用いて、ニュ
ーロンおよび星状細胞についてのマーカーを有する細胞に分化した。アカゲザル
ＥＳ細胞に由来する培養物において、ニューロンを含有した凝集物のパーセンテ
ージは、４９〜９３％であった。ヒトＥＳ細胞に由来する培養物において、ニュ
ーロンを含有した凝集物のパーセンテージは、６０〜８０％であった。ＧＡＢＡ
およびβ−チューブリンについての二重標識により、ニューロンの亜集団が阻害
性神経伝達物質ＧＡＢＡを発現することが示された。星状細胞およびオリゴ樹状
細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）を、それぞれＧＦＡＰ免疫反応性およ
びＧａｌＣ免疫反応性で同定した。従って、ヒトおよびアカゲザルのＥＳ細胞は
、中枢神経系における３つの主要な細胞表現型全てを形成する能力を有する。
【０２４０】 ニューロトロフィン増殖因子ファミリーのいくつかのメンバーの効果を試験し
た。ｈＥＳ細胞を、コラゲナーゼを用いて採取し、解離し、そしてポリオルニチ
ンコーティングしたカバースリップに再播種することにより分化させた。細胞を
、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２＋１０％ＦＢＳ中に一晩入れた。翌日、血清を培地か
ら除去し、そして試験される１０ｎｇ／ｍｌ ヒトｂＦＧＦおよび増殖因子と置
換した。２４時間後、ｂＦＧＦを培地から取り出した。これらの培養物に、一日
おきに補給した。これらを、分化の７日後に固定し、そして分析のために免疫染
色した。ニューロン数をβチューブリンについて陽性の細胞を計数することによ
り評価した。１０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在下で維持
した培養物は、コントロール培養物より約３倍多いニューロンを形成した。ニュ
ーロトロフィン−３（１ｎｇ／ｍｌ）中で維持した培養物は、コントロール培養
物より約２倍を超えるニューロンを形成した。
【０２４１】 心筋形成を評価するために、ＥＢを懸濁培養の４日後、ゼラチンコーティング
プレートまたはチャンバースライドに移した。播種後に表面に接着したＥＢを、
増殖させ、そして異なる型の細胞に分化させた。自律的に収縮する細胞を、分化
８日目に培養物の種々の領域で観察した。そして拍動する領域の数は、約１０日
目まで増加した。いくつかの場合において、ＥＢの７５％超が、収縮領域を有し
た。収縮する細胞は、形態的に、マウスＥＳ細胞由来の拍動する心筋に類似して
いた。これらの培養物において、収縮する領域の１００％が心臓トロポニンＩ（
ｃＴｎＩ）と免疫反応性であるが、最小限の免疫反応性が、拍動しない細胞にお
いて観察された。
【０２４２】 分化したＥＢの培養物を、ｃＴｎＩに対するモノクローナル抗体を用いてウェ
スタンブロット分析に供した。このアッセイは、精製ネイティブヒトｃＴｎＩの
サイズに対応する、強い３１ｋＤａタンパク質シグナルを与えた。これは、収縮
する細胞を含む分化したヒトＥＳ細胞においては検出されたが、未分化ＥＳ細胞
でも分化培養物でも検出されず、収縮する細胞の証拠がなかった。コントロール
として、このブロットは、βアクチン特異的抗体で再プローブし、全てのサンプ
ルにおいて同様の量のタンパク質が存在したことを確認した。
【０２４３】 他の実験において、ＥＢを８〜１６日間培養し、そしてさらに１０日間接着性
培養物として維持した。ＲＮＡを分化したヒトＥＳ細胞から調製し、そして半定
量的なＲＴ−ＰＣＲを行って、内胚葉特異的産物であるα１アンチトリプシン、
ＡＦＰ、およびアルブミンの相対的発現を検出した。低レベルのα１アンチトリ
プシンおよびＡＦＰを、未分化培養物において検出した；同じ培養物においてア
ルブミンはほとんどまたは全く検出されなかった。３つのマーカー全てが、分化
後に有意に高いレベルで検出された。３つの内胚葉マーカー全ての発現は、１６
日目の胚様体よりも８日目の胚様体由来の培養物においてより高かった。
【０２４４】 （実施例６：未分化細胞および分化細胞による発現のマイクロアレイ分析） 異なる遺伝子発現の分析を、未分化Ｈ９培養物由来のｍＲＮＡと、対応するＥ
Ｂ由来のｍＲＮＡとを対比することにより行った。ＥＢを増殖培地中で８日間維
持するか、または増殖培地中で４日間維持し、次いで、０．５μＭ レチノイン
酸で４日間処理した。ＥＢを２日後、４日後または８日後に採取し、そして得ら
れたｍＲＮＡを未分化培養物由来のｍＲＮＡと直接比較した。この分析は、比較
的均質な細胞集団の、分化した細胞型の複雑な混合物への形質転換を追跡し、従
って、読み出しは、遺伝子発現における変化の大きさ、および分化した細胞型に
特異的な発現の変化の場合には、培養物におけるその細胞型の再提示の両方によ
り影響が及ぼされる。これらの実験サンプル約１０，０００ ｃＤＮＡにおいて
使用されるアレイを選択して、特徴付けられたヒト遺伝子の大部分を表した。
【０２４５】 総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙTMミニプレップキットを用いて製
造業者の指示に従ってヒトＥＳ培養物またはそれらの分化した誘導体から採取し
た。２６０ｎｍでの紫外線吸収を測定することによりＲＮＡを定量した。ポリＡ+ ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＯｌｉｇｏｔｅｘTMミニプレップを用いて製造業
者の指示に従って総ＲＮＡ調製物から調製した。最終的なｍＲＮＡ調製物は、Ａ260 測定値により定量し、次いで、ネイティブアガロースゲル上での電気泳動後
に目視検査した。サンプルＲＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５標識ｃＤＮＡプローブ
へ転換するために契約実験室（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ
，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）に送り、このプローブを、引き続きＵＮＩＧＥＭ
１．０アレイにハイブリダイズさせた。
【０２４６】 ハイブリダイズしたアレイの処理後に、蛍光測定値を定量し、そして結果を分
析に返した。プローブ対形成を、Ｃｙ３チャネルの存在下で未分化ＥＳ細胞から
のサンプルを用いて行い、そして分化したＥＳ細胞サンプルは、Ｃｙ５チャネル
の存在下で行った。発現の変化（Ｃｙ３およびＣｙ５チャネルを比較することに
より測定される）は、一般に、差異が少なくとも２．５倍であったか否かを有意
とみなした。
【０２４７】 ｈＥＳ細胞の分化は、多くの遺伝子（公知の機能を有さないＥＳＴを含む）の
活性化および抑制に関与する。興味深いことに、分化の最後の４日間にわたるレ
チノイン酸の懸濁培養物への添加は、遺伝子発現パターンに対して比較的微少な
効果を有した（４ｄ−／４ｄ＋と８ｄとを比較のこと）。
【０２４８】 発現が分化の間に減少される遺伝子は、広範な機能をサンプリングする（メタ
ロチオネイン、増殖因子（例えば、ＦＧＦ９）、分泌型システインリッチタンパ
ク質（例えば、オステオポンチン、ＡＧＦ−ＢＰ５、Ｃｙｒ６１、結合組織増殖
因子）、セレンドナータンパク質ｓｅｌＤなどが挙げられる）。一般に、発現に
おける最も有意な改変は、懸濁培養の４日後に生じ、そして細胞形態の変化の発
生と一致する。興味深いことに、Ｄ−グルコースリン酸の異化に関与する２つの
遺伝子（ＵＤＰ−グルコースホスホリラーゼおよびホスホグルコムターゼ）の発
現は、分化の際に劇的に減少し、このことは、グルコース代謝における潜在的な
改変を示唆する。
【０２４９】 これらの実験において使用したアレイは、ｈＴＥＲＴに対応するｃＤＮＡの特
徴を含んでいない；しかし、ＴＲＦ１についてのｍＲＮＡの発現の顕著な減少が
観察された。ＴＲＦ１は、基本的なテロメア結合因子であり、その発現は、テロ
メアの長さの短縮化と相関している。従って、テロメアの長さの正のレギュレー
ター（ｈＴＥＲＴ）および負のレギュレーター（ＴＲＦ１）の両方の発現は、Ｅ
Ｓ細胞の分化の間に減少した。
【０２５０】 内臓内胚葉および初期の肝臓分化と関連するいくつかの遺伝子は、この分析に
おいて顕著であった。これらの遺伝子は、α−フェトプロテイン、アポリポタン
パク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ調節タンパク質−１、α1−アンチト
リプシンならびにフィブリノーゲンのα、βおよびγ鎖を含む。この誘導は、分
化の２日以内に明白になり、そしてレチノイド処置によって実質的に影響を及ぼ
されない。細胞性レチノイン酸結合タンパク質１および２（ＣＲＡＢＰ Ｉ、Ｉ
Ｉ）の発現の誘導は、レチノイドがＣＲＡＢ Ｉ遺伝子のプロモーターの転写を
特異的に阻害する、提唱された負のフィードバックループと一致して、レチノイ
ド処理培養物においては観察されない。
【０２５１】 ＩＬ−６レセプターｇｐ１３０の発現は、ｈＥＳ培養物において低く、そして
分化の際に誘導される。これらの結果は、ｈＥＳ培養物におけるＬＩＦ応答性の
欠如に関する分子的基礎を提供し（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９９；Ｒｅｕｂｉｎ
ｏｆｆら、２０００）、そしてマウスＥＳ細胞に対して、ヒトＥＳ細胞における
ｇｐ１３０の実質的に異なる役割を示す。ここで、ＬＩＦシグナル伝達は、未分
化状態の維持を直接的に意味する。
【０２５２】 他の分化誘導性遺伝子としては、タンパク質ホモログであるプレイオトロフィ
ンおよびミッドカインが挙げられる。これらの分泌サイトカインは、ニューロン
細胞型および肝臓細胞型のマイトジェンとして、または全身的な脈管形成因子と
しての役割が提唱された（Ｏｗａｄａら、１９９９；Ｓａｔｏら、１９９９）。
このようにして、ＥＳ細胞分化において類似の役割が果たされ得る。ＤＮＡ結合
タンパク質（例えば、ホメオボックスｂ５タンパク質およびｍｅｉｓ１）の誘導
は、分化プロセスにおいて転写調節因子の中心的な役割を反映するようである。
【０２５３】 （実施例７：初代ｍＥＦフィーダー層上で維持されたｈＥＳ細胞の遺伝子改変
） この実施例は、既に記載したように、初代ｍＥＦ上で増殖させたｈＥＳ細胞へ
遺伝子改変を導入するための条件を提供する。トランスフェクトする前に、ｈＥ
Ｓ細胞をコラゲナーゼ（約２００ユニット／ｍＬ）を用いてフィーダー層からは
ずし、１８ｍｌの最終容量で懸濁し、そしてゼラチンおよび初代ｍＥＦフィーダ
ー細胞で予めコーティングした６ウェルプレート中、３ｍｌ／ウェルでプレート
した。
【０２５４】 次いで、再プレートした細胞を異なるトランスフェクション系で試験した。こ
れらのトランスフェクション系としては以下が挙げられる：Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣａＰＯ4およびＤＥＡＥ試薬）、Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ＃２００２８５；ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ Ｍｉｒｕ
ｓ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ｃａｔ＃ ＭＩＲ ２３１０；ポリブレン（Ｓｉｇｍａ
）；ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ）；ＳｕｐｅｒｆｅｃｔTM（Ｑｉａｇｅｎ）
；ＥｆｆｅｃｔｅｎｅTM（Ｑｉａｇｅｎ）；ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｐｏｆｅｃ
ｔａｍｉｎｅ ２０００TMとは異なる）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）；ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎTM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＤＭＲ
ＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；およびＢｉｏＲａｄTM Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いたエレクトロポレーション。
【０２５５】 使用した条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ
Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ＃１１６６８０１９，特許係属中
）およびＦｕＧＥＮＥTM（Ｆｕｇｅｎｔ Ｌ．Ｌ．Ｃ．の登録商標；脂質および
他の成分の専売ブレンド（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｂｌｅｎｄ）であり、Ｒｏ
ｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｃａｔ＃１ ８１４ ４４３から購入した）の両方が、良好なトランスフェクション効率を生じた。
この効率は、これらの試薬を、再プレートした後、約４８時間にわたり再プレー
としたｈＥＳ細胞と接触させた場合、概して最良であった。
【０２５６】 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMを用いるトランスフェクションを、
以下のように行った：プラスミドＤＮＡ（３〜５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１、Ｃｌ
ｏｎＴｅｃｈ ｃａｔ．＃６０８４−１）を水で１００μｌの最終容量に希釈し
た。予備実験において、５〜３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM （Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃１１６６８−０１９）をＯｐｔｉＭＥＭTM（Ｇｉｂｃ
ｏ，ｃａｔ＃１１−５８−０２１）で１００μｌの最終容量まで希釈した。次い
で、ＤＮＡ溶液をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM溶液にゆっくりと添
加し、そして穏やかに混合した。この混合物を、８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTM を補充する前に、室温で２０〜３０分間インキュベートした。細胞を３ｍｌの予
め温めておいたＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そしてウェルあたり（９．６ｃｍ2
）、０．５〜１ｍｌのＤＮＡ／脂質混合溶液中、３７℃で４時間インキュベート
した。いくつかの実験においては、４ｍｌのｍＥＦ馴化培地を添加する前に、４
時間で複合体を取り出した；他では、十分なｍＥＦ馴化培地を、３．５ｍｌの最
終容量に達するまでウェルに添加し、そしてこの混合物を細胞上に一晩放置した
。他の実験では、ＤＮＡ：脂質混合物を、３．５ｍｌの最終容量になるように、
十分なｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩
インキュベートした。
【０２５７】 ＦｕＧＥＮＥTMを用いるトランスフェクションを、以下の通りに行った。各ウ
ェルを、ＦｕＧＥＮＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ
．）を用いて、製造業者の指示書に記載されるようにＦｕＧＥＮＥTM試薬のＤＮ
Ａに対する比を３：２として、１０μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。Ｏｐ
ｔｉＭＥＭTM無血清培地をトランスフェクションに用いた。「古いプロトコル」
では、ＦｕＧＥＮＥTM−ＤＮＡ複合体の添加の４時間後、２．５ｍＬの標準的な
ｈＥＳ培地を、各トランスフェクトしたウェルに添加した。改定されたプロトコ
ル（「３：２Ｌ」）では、トランスフェクトしたウェルには、標準的なｈＥＳ培
地を供給しなかった。トランスフェクションの２４時間後、ＧＦＰ−発現を、フ
ローサイトメトリーによって評価した。
【０２５８】 トランスフェクションの４８時間前に、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦ
フィーダー層で上記のようにコーティングした６ウェルプレートに播種した。ｈ
ＥＳ細胞を、ＦｕＧＥＮＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、蛍光顕微鏡またはフ
ローサイトメトリーの下で目視によってＧＦＰ発現について評価した。図１に示
す実験では、３つの方法（標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMプ
ロトコル、標準的なＦｕＧＥＮＥTMプロトコル、およびＤＮＡ／脂質混合物を細
胞とともに一晩放置する改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコル）を比較した。この結果
は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMは高い百分率のＧＦＰ発現細胞を
一貫して生じたが、改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコルは、より高い平均蛍光強度を
有するＧＦＰ発現細胞を生じたことを実証した。
【０２５９】 アデノウイルスベクターを用いる一過性の形質導入を以下の通りに行った。ベ
クターＡｄ５ＣＭＶ５−ＧＦＰ（本明細書ではＡｄ５ＧＦＰと呼ぶ）は、ＣＭＶ
プロモーターの制御下のグリーン蛍光タンパク質コード領域を含む。このベクタ
ーを、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＤＶ
００３０から購入した。形質導入の７２時間前に、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよ
びｍＥＦフィーダー層で上記の通りにコーティングした２４ウェルプレートに播
種した。形質導入前に、３ウェルのｈＥＳ細胞を、０．０５％トリプシン／５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７°で用いて剥離させ、５００μＬの標準的な
ｍＥＦ増殖培地に再懸濁し、そして血球計算板（７５，０００個のｍＥＦフィー
ダー細胞を、各ウェルから差し引いた）で計数して、トランスフェクション前の
細胞数を樹立した。アデノウイルスのストックを、使用直前に氷上で融解した。
【０２６０】 Ａｄ５ＧＦＰを用いた感染については、増殖培地を、ｈＥＳ細胞を含むウェル
から吸引し、そして１ｍＬのｈＥＳ培地＋９μＬのＡｄ５ ＧＦＰストックで置
き換えた（４０のＭＯＩ）。２時間後、ウイルス含有培地を、１ウェルあたり１
ｍＬのｈＥＳ培地で置き換えた。各形質導入したウェルに、１ｍＬの新鮮ｈＥＳ
培地を２４時間毎に再度供給した。ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリーによっ
て評価した。代表的な実験からの結果は、発現が、形質導入の２４時間後に最も
高いが、少なくとも８日間は低レベルで維持されたことを示した（より後の時点
では、ｈＥＳ細胞の過剰増殖に起因して大量の分化が引き起こされた）。
【０２６１】 図８は、フィーダー層にプレートし、そしてアデノウイルスベクターＡｄ５Ｇ
ＦＰ（３０のＭＯＩ）またはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４（４０のＭＯ
Ｉ、実施例９）のいずれかに４８時間後に感染させたｈＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析
を示す。それぞれ２４時間後または４８時間後、細胞を回収し、幹細胞マーカー
ＳＳＥＡ−４に対する抗体を用いて染色し、そしてＧＦＰ発現についてフローサ
イトメトリーによって評価した。上のパネルは、偽感染培養物におけるバックグ
ラウンド蛍光およびＳＳＥＡ−４ポジティブ染色を示す。下のパネルは、ＧＦＰ
の発現から生じるグリーン蛍光のレベルを示す。
【０２６２】 （実施例８：不死化フィーダー細胞の調製） 初代マウス胚性線維芽細胞（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，前出）を、遺伝子を変更し
てヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）を発現することによって不死化し
得る。この線維芽細胞（ｍＥＦ）を、ＭｏＬＶ ＬＴＲによって駆動されるｈＴ
ＥＲＴコード配列およびＳＶ４０初期プロモーターによって駆動されるピューロ
マイシン耐性遺伝子を含むレトロウイルス構築物ｐＢＡＢＥ ｐｕｒｏ ｈＴＥ
ＲＴに感染させる。初代ｍＥＦの単離株を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎ
ｅ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、および９０％ 高グルコース
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む増殖培地中で培養する。ｍＥＦを、３日
毎に１：２の比で分ける。
【０２６３】 このように４回分けた後、５×１０5ｍＥＦを、１００ｍＭディッシュにプレ
ートする。翌日、細胞を、増殖培地を、５ｍＬのレトロウイルスストック（１×
１０6ｐｆｕ／ｍＬ）および４μｇ／ｍＬポリブレンを含む混合物と交換するこ
とによって感染させ、そして３７℃でインキュベートする。８時間後、さらに５
ｍＬのレトロウイルス／ポリブレン混合物を添加し、そして細胞を３７℃にてイ
ンキュベートする。
【０２６４】 翌日、レトロウイルス／ポリブレン混合物を取り出し、そして新鮮な増殖培地
と置き換える。４時間後、ｍＥｆを、０．５％トリプシン／５００ｍＭ ＥＤＴ
Ａ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてプレートから取り出し、そして２５ｍＬの増
殖培地／フラスコにおいて２本のＴ１５０フラスコ中に再度プレートする。翌日
、この培地を、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した増殖培地で置き換
ええる。
【０２６５】 細胞を、１週間に１回、１：４の比で８週間にわたって分け、そしてピューロ
マイシン含有培地中で維持する。８週間後、細胞をトリプシン処理し、そして１
５０ｍｍプレートあたり２，０００細胞の密度で再度プレートする。個々のコロ
ニーを、２６日後にクローングシリンダーを用いて単離し、増殖させ、そしてテ
ロメラーゼ活性についてスクリーニングする。
【０２６６】 （マウスフィーダー細胞株ＮＨ１９０） 霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養のための馴化培地に適切である、永続
的なマウス細胞株を樹立した。ＮＨＧ１９０株は、三重薬物耐性であり、グリー
ン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する、テロメラーゼを用いて不死化されたマ
ウス胚線維芽細胞株である。
【０２６７】 ２つのマウス株を、抗生物質ネオマイシンまたはハイグロマイシンに対する耐
性についての導入遺伝子を有するＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａ
ｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した。Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから
のＣ５７ＢＬ／６Ｊ ＴｇＮ（ｐＰＧＫｎｅｏｂｐＡ）３ＥｍｓマウスおよびＣ
５７ＢＬ／６Ｊ−ＴｇＮ（ｐＰＷＬ５１２ｈｙｇ）１Ｅｍｓマウスを交雑した。
ネオマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性の両方である胚を、受胎後１３．
５日で、フィーダー層のためにマウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）を調製するため
の標準的なプロトコル（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，７１−１１２頁、Ｔｅｒ
ａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｌｉｎｅｓ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９８７）に従って切開した。誘導されたｍＥＦ細胞を、凍結保存した。
【０２６８】 ｍＥＦを、２０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、８０％ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む増殖
培地中で融解した。この細胞を４継代の間１：２の分割比を用いて増殖させた。
約７５％コンフルエンスに達した２本のフラスコに、エレクトロポレーションの
４時間前に新鮮な培地を供給した。０．５％トリプシン／５００ｍＭ ＥＤＴＡ
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を有する細胞をフラスコから取り出し、室温で４００×
ｇにて５分間によってペレット化し、そして４×１０6細胞／ｍＬの濃度で増殖
培地中に再懸濁した。
【０２６９】 細胞懸濁物を、２つの５００μＬアリコートにわけ、そして２つの０．４ｃｍ
のギャップエレクトロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移した。１つ
のキュベットには５μｇのコントロールプラスミド（ｐＢＳ２１２；ＳＶ４０初
期エンハンサー／プロモーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子
）を入れる；他方のものには、５μｇのｐＧＲＮ１９０を入れた。ｐＧＲＮ１９
０は、ＭＰＳＶプロモーターによって駆動されるマウステロメラーゼ逆転写酵素
（ｍＴＥＲＴ）コード領域＋ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーターによって
駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子を含む。細胞およびＤＮＡを、手動で混
合し、そしてＢｉｏＲａｄキャパシタンスエキステンダーを３００Ｖ、９６０μ
Ｆに設定して、ＢｉｏＲａｄ ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いてエレクトロポレ
ーションした。
【０２７０】 細胞の各アリコートを、２５ｍＬの増殖培地を含む個々の１５０ｃｍのプレー
トに移した。このプレート上の培地を、翌日交換し、そしてその次の日、増殖培
地を、増殖培地＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンによって置換した。このプ
レート上の培地を、エレクトロポレーション後２９日目になるまで４８時間毎に
新鮮なピューロマイシン含有培地に交換した。この時点で、ピューロマイシン耐
性細胞の大きな個々のコロニーは、ｐＢＳ２１２をエレクトロポレーションした
プレートおよびｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたプレートの両方に
おいて明らかであった。コントロールプレートからの１０個のコロニーおよびｐ
ＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションしたプレートからの１２個のコロニーを
、クローニングシリンダーを用いて単離し、そして各コロニーを、４８ウェルプ
レートの１ウェルに移した（１コロニーあたり１ウェル）。
【０２７１】 １週間後、４８ウェルプレート中でコンフルエンスに達するまで増殖させた、
全ての生存コロニー（３つのコントロールのコロニー、１個のｐＧＲＮ１９０を
エレクトロポレーションしたコロニー）を、２４ウェルプレートのウェルに個々
に移した。６日後、増殖し続けた唯一のコロニーは、ｐＧＲＮ１９０をエレクト
ロポレーションしたプレートに由来し、そして続いてＮＨ１９０と命名した。こ
の細胞を、増殖培地＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンにおいて維持した。Ｔ
ＲＡＰアッセイ（Ｋｉｍら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５
９５，１９９７）によるテロメラーゼ活性についての分析は、ＮＨ１９０細胞が
、機能的なテロメラーゼ活性を発現することを実証した。
【０２７２】 混合した培養集団およびインビボにおける細胞のモニタリングを促進するため
に、ＮＨ１９０細胞を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を付与するレ
トロウイルス構築物にさらに感染させた。プラスミドｐＥＧＦＰ−１由来の増強
されたＧＦＰ配列は、ＣｌｏｎＴｅｃｈから入手可能なＬｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏ
ｒｓTM蛍光タンパク質ベクターの一つである。これは、増強されたＧＦＰコード
領域を含み、制限ヌクレアーゼ切断部位を変更する変化を伴っており、そしてコ
ードされたタンパク質の励起波長および発光波長がシフトする。ＥＧＦＰ−１配
列は、ベクターｐＭＳＣＶ．ｎｅｏ、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号Ｋ１０６２
−１中にクローニングされた。ＮＨ１９０細胞に、操作されたベクターで形質導
入し、そしてＧＦＰポジティブ細胞を、ＦＡＣＳソーティングによって分離した
。ＧＦＰ発現細胞株を、ＮＨＧ１９０と命名した。これらの細胞を、３ヶ月を超
えて培養で保有した。
【０２７３】 （実施例９：薬物耐性ＮＨＧ１９０フィーダー細胞株上で維持されたｈＥＳ細
胞の遺伝的変化） 実施例８に記載されたＮＨＧ１９０細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋２０％
ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）および５ｍＭグルタミン中で培養した。細胞を
３日毎に１：１０に分けた。サブコンフルエントな培養物を、トリプシンを用い
て剥離させ、１０ｍＬ培地中に懸濁し、そしてＴｏｒｒｅｘ １５０Ｄ Ｘ線ジ
ェネレーターを用いて３５００ラドの累積線量で照射した。照射した細胞を、４
００×ｇにて５分間ペレット化し、そしてＮＨＧ１９０培地または標準的なｈＥ
Ｓ培地のいずれかに１ｍＬあたり１．２５×１０5細胞で再懸濁した。
【０２７４】 ｈＥＳ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびＮＨＧ１９０フィーダー
細胞で予めコーティングした６ウェルプレートに再度プレートすることによりト
ランスフェクトした。播種の４８時間後、ｈＥＳ細胞を、製造業者のプロトコル
に従ってＯｐｔｉＭＥＭTM無血清培地中でＦｕＧＥＮＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ）を
用いて１ウェルあたり１０μｇＤＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡは、ｎｅ
ｏrを駆動するＰＧＫプロモーターを含むプラスミドであった。４時間後、３ｍ
ＬのＮＨＧ１９０馴化培地を、各トランスフェクトしたウェルに添加した。細胞
に、毎日３ｍＬの馴化培地を再度供給した。トランスフェクションの４８時間後
、細胞に、２００μｇ／ｍＬの添加されたジェネティシン（Ｓｉｇｍａ）を含む
ＮＨＧ１９０馴化培地を重層し、これをその後、毎日交換した。選択の３日後、
さらなる照射したＮＨＧ１９０フィーダー細胞を添加した（ｈＥＳ培地中、１．
２５×１０5細胞／ウェル）。２４時間後、培地を、２００μｇ／ｍＬジェネテ
ィシンを含有するＮＨＧ１９０馴化培地で再度置き換え、毎日置き換えた。
【０２７５】 個々のコロニーを単離し、そして別の回の選択を通して増殖させた。さらに５
日後、個々のコロニーは、顕微鏡によって同定され、そしてこのディッシュの外
側にマークした。培地を除去し、そしてコラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ）で置
換した。個々のコロニーを、ｐ２０ピペットのチップを用いて拾い、そして２ｍ
Ｌ ＮＨＧ１９０馴化培地（ジェネティシンなし）を含む個々のチューブに移し
た。この懸濁物を、ばらばらのコロニーになるように５回磨砕し、そして各チュ
ーブの内容物を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞（１．８７５×１０5 細胞／ウェル）でコーティングした１２ウェルプレートのウェルに移した。細
胞に、２４時間後に２ｍＬの新鮮な馴化培地を供給した。播種の２日後、細胞に
、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含む２ｍＬの馴化培地を重層し、毎日５日
間置換した。各ウェルが５０〜７５％コンフルエントとなったら、細胞を、コラ
ゲナーゼを用いて剥離し、６ｍＬ馴化培地に移し、そして１０〜１２回磨砕した
。３ｍＬの細胞懸濁物を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞（３．７５
×１０5細胞／ウェル）でコーティングした６ウェルプレートの２つのウェルの
各々に添加した；細胞に、２４時間の時点で３ｍＬの馴化培地を再度供給した。
次いで、細胞を、ジェネティシンを含む３ｍＬの馴化培地を用いて５日間選択し
、そして前のように１：６に分けた。
【０２７６】 レトロウイルスを用いる安定な形質導入を、以下の通りに行った。ＧＲＮ３５
４と命名されたレトロウイルスベクターを、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．にて、Ｃｌ
ｏｎＴｅｃｈ（カタログ番号Ｋ１０６２−１）から購入したＰＭＳＣＶｎｅｏベ
クターを用いて構築した。ｅＧＦＰコーディング領域を、ＭＳＣＶ ＬＴＲの下
流に挿入した。ＬＴＲはＧＦＰの発現を駆動し、そしてこのベクターはまた、マ
ウスＰＧＫプロモーターによって駆動されるｎｅｏr遺伝子を含む。プレートを
、０．５％ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダー細胞（２４ウェルプレートに
ついて１ｍＬのＮＨＧ１９０培地中で７．５×１０4；６ウェルプレートについ
て３ｍＬの培地中で３．７５×１０5）でコーティングした。ｈＥＳ株Ｈ７を、
２４ウェルに調製したプレートに、ｈＥＳ培地（１ｍＬ／ウェル）中に播種した
。４８時間後、ｈＥＳ細胞の３つのウェルを、０．０５％トリプシン／５ｍＭ
ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で用いて剥離させ、５００μＬ ＮＨＧ１９０
培地中に再懸濁させ、そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３５４の
ストックを、使用の直前に氷上で溶解した。増殖培地をウェルから吸引し、そし
て４００μＬのｈＥＳ培地＋８μＬのレトロウイルス（１０のＭＯＩ）および４
μＬの８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置き換えた。２時間後、１
ウェルあたり８００μＬのｈＥＳ培地を添加した。各形質導入されたウェルに、
２４時間毎に１ｍＬの新鮮なｈＥＳ培地を再度供給した。
【０２７７】 形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有する１ｍ
ＬのｈＥＳ培地で置き換えた。ジェネティシン選択の３日後、細胞を、コラゲナ
ーゼを用いて剥離し、磨砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地に再懸濁し、ゼラチンおよび
ＮＨＧ１９０フィーダーでコーティングした６ウェルプレートの１ウェルに再度
播種し、そして２４時間後にｈＥＳ培地を再度供給した。次いで、この培地を、
ジェネティシンを含有するｈＥＳ培地で再度置き換え、そして２４時間毎に再度
供給した。未分化コロニーは、この選択を生き延び、そして３ヶ月を超えて維持
された。ＦＡＣＳ分析は、５０〜６５％の選択された細胞が、たとえ低レベルで
あってもＧＦＰを発現することを示した。この細胞の核型は正常であった。
【０２７８】 次いで細胞を、懸濁培養に移して、胚様体を形成させ、４日間分化させ、次い
で２０％ ＦＢＳ培地中に１週間プレートした。大量の分化が生じた後、この培
養物を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして蛍光顕微鏡のために調製し
た。多くの分化した細胞は、トランスフェクトされた未分化のｈＥＳ細胞株より
も高レベルのＧＦＰを発現した。このことは、分化した細胞型におけるＭＥＳＶ
−ＬＴＲの分化活性化と一貫している。
【０２７９】 （実施例１０：フィーダーフリー培養物におけるｈＥＳ細胞のトランスフェク
ション） 馴化培地中でラミニン上でフィーダーフリー培養物中で維持したｈＥＳ細胞を
、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を
保有するプラスミドでトランスフェクトすることにより、遺伝的に改変した。
【０２８０】 ｍＥＦ馴化培地を、先に記載の通りに調製した。ｍＥＦに照射し、そして約５
．７×１０4細胞ｃｍ-2で播種した。少なくとも１６時間後、この培地を、４ｎ
ｇ／ｍＬになるように添加したｈｂＦＧＦを含むｈＥＳ培地と交換した。馴化培
地を、ｈＥＳ培養物の供給のために毎日収集した。ｈＥＳ培養物への添加の前に
、この培地に、さらに４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを補充した。安定なトランスフ
ェクタントの選択が必要な場合、ｍＥＦ馴化培地に、２００μｇ／ｍＬのジェネ
ティシン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５０１３）を補充した。
【０２８１】 ｍＥＦフィーダー層上で維持したＨ９ ｈＥＳ細胞を、３７℃にて１０分間の
約２００単位／ｍＬのコラゲナーゼＩＶとのインキュベーションにより培養物か
ら収集した。細胞を解離し、そして通常ｈＥＳ培地またはｍＥＦ馴化培地中に再
懸濁した。次いで、通常培地中の細胞を、ｍＥＦフィーダー層上に再度播種し そしてｍＥＦ馴化培地中の細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン
上にプレートした。全ての培養物についての播種密度は、約４×１０4細胞／ｃ
ｍ2であった。フィーダー層上の細胞を通常培地中で維持し、一方、マトリック
ス上の細胞をｍＥＦ馴化培地中で、トランスフェクションの前に１日間または２
日間維持した。馴化培地を、２４時間毎に置き換えた。
【０２８２】 ｈＥＳ細胞培養物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMで上記のよう
にトランスフェクトした。ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を以下の通りに行った。ｈ
ＥＳ細胞を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて収集し、そして約１×１
０6細胞／試験で再懸濁した。細胞を、ＰＢＳおよび２％ ＦＢＳ、０．１％ア
ジ化ナトリウムおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液中で洗浄した。ＳＳＥＡ
−４染色を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ Ｂａｎｋｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ，Ｉｏｗａ Ｃｉｔ
ｙ）から入手した抗体を１：１５希釈で用いて同じ緩衝液中で行った。アイソタ
イプ適合コントロールを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，ＵＳＡ）から
入手した。細胞を、１００μｌの最終容量において抗体とともに４℃にて３０分
間インキュベートし、洗浄し、そしてＰＥと結合体化したラット抗マウスκ鎖抗
体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに４
℃にて３０分間インキュベートした。サンプルを、先の通りに洗浄し、そしてＧ
ＦＰおよびＳＳＥＡ−４発現についてＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒTMフローサイトメ
ーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅ
ｌｌＱｕｅｓｔTMソフトフェアを用いて分析した。
【０２８３】 ｍＥＦ馴化培地中のラミニン上で維持したＨ９株のｈＥＳ細胞を、プレーティ
ング後２４時間または４８時間に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦ
Ｐを保有するプラスミドでトランスフェクトした。最初の実験は、５μｇのプラ
スミドおよび１２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMの混合物を用
いた。細胞に１ｍＬのＤＮＡ／脂質複合体を入れ、そして３７℃にて４時間イン
キュベートした後、３ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加し、次いでトランスフェクシ
ョンの２４時間後にＧＦＰ発現についてモニタリングした。
【０２８４】 図９は、この実験の結果を示す。パネルＡ：ラミニン上で維持したＨ９細胞の
形態。パネルＢ：Ａに示されたのと同じコロニー中で観察されたＧＦＰポジティ
ブ細胞。パネルＣ：ＳＳＥＡ−４高集団（未分化細胞）におけるＧＦＰポジティ
ブ細胞の％のＦＡＣＳ分析。細胞を、播種の２４（バー１および２）または４８
時間（バー３および４）にトランスフェクトし、そしてトランスフェクションの
２４時間（バー１および３）または４８時間（バー２および４）後に分析した。
明るい緑色の細胞が、トランスフェクションの２４時間後に、ラミニン上の未分
化ＥＳコロニーの密な領域において観察された（パネルＡおよびＢ）。最初の播
種後４８時間でのトランスフェクションは、最大効率を与えた：細胞の３８％が
、トランスフェクション後２４時間でのＦＡＣＳ分析により決定したところ、Ｇ
ＦＰポジティブであった（パネルＣ）。
【０２８５】 次の実験は、ｍＥＦフィーダー上で維持した細胞と、ｍＥＦ馴化培地中でＭａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニンでコーティングしたプレート上で維持
したＨ９細胞とのトランスフェクション効率を比較した。通常培地中で維持した
フィーダー層上の細胞を、コントロールとして用いた。フィーダー上の細胞と、
フィーダーのない細胞との間の形態学的差異は、播種後１日または２日で観察さ
れた。フィーダー上のコロニーは、フィーダー層なしで維持した細胞よりも密で
あった；フィーダーのない培養物中の個々のｈＥＳ細胞は、それほど密でなく、
そしてより平らであった。ラミニン上の細胞とＭａｔｒｉｇｅｌ上の細胞との間
で細胞にもコロニーの形態にも有意な差異は存在しなかった。これらの細胞を、
播種後２日目に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＧＦＰを発現するプラ
スミドでトランスフェクトした。このトランスフェクションの２４時間後、細胞
を、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現について調べた。
【０２８６】 細胞を、ｍＥＦフィーダー上で通常培地中で（ｍＥＦ／ＲＭ）、ラミニン上で
ｍＥＦによって馴化された培地中で（ラミニン／ＣＭ）、またはＭａｔｒｉｇｅ
ｌ（登録商標）上で馴化培地中で（Ｍａｔｒｉｇｅｌ／ＣＭ）維持した。図１０
（Ａ）に示すように、明るい緑色細胞が、フィーダーを含まない培養物の未分化
のｈＥＳコロニー中に観察された。対照的に、極わずかな緑色細胞が、フィーダ
ー上のコロニーにおいて観察された。ＦＡＣＳ分析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）上の１６％の細胞およびラミニン上の１４％の細胞がＳＳＥＡ−４高集団
中でＧＦＰポジティブであり、一方、フィーダー上の細胞のほんの５％がポジテ
ィブであることを示した。これらの結果は、トランスフェクション効率が、フィ
ーダーのない条件を用いることによって有意に増加したことを示す。
【０２８７】 次の実験は、１）ＤＮＡ：脂質の比；２）ｍＥＦ馴化培地の添加の４時間前の
細胞へのＤＮＡ／脂質複合体の添加 対 ｍＥＦ馴化培地の存在下での細胞への
複合体の添加；および３）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM 対 Ｆｕ
ＧＥＮＥTMの使用の効果を評価した。
【０２８８】 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMを用いるトランスフェクションは、
上記に記載される。ＦｕＧＥＮＥTMでのトランスフェクションを、以下の通りに
行った。プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃ
ｈカタログ番号６０８４−１）を水中で希釈して、１００μｌの最終容量とした
。先行実験において、５〜３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、十分なＯｐｔｉＭＥＭTM に添加して、１００μＬの最終容量を達成した。次いで、ＤＮＡ溶液を、Ｆｕ
ＧＥＮＥTM溶液にゆっくりと添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を８
００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMを補充する前に室温で３０分間インキュベートした
。細胞を、３ｍＬの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして１ｍＬのＤＮ
Ａ／脂質混合溶液中で３７℃にて４時間インキュベートした。いくつかの実験で
は、４時間で、ウェルにさらに２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を入れた；他の実験では
、ＤＮＡ／脂質混合物を、２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そし
て細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０２８９】 結果を図１０（Ｂ）に示す。最大効率は、以下の条件下で得られた：バー１＝
５μｇのプラスミド＋１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMの混
合物、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物
を添加し、そしてこの細胞をこの混合物中で一晩インキュベートする。バー２お
よび３＝１０μｇのプラスミド＋１５μｌのＦｕＧＥＮＥTMの混合物、そして細
胞を１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物中で４時間インキュベートし、その後、２．５
ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加する。Ｌ＝Ｌｉｐｏｆｅａｔａｍｉｎｅ２０００TM ；Ｆ＝ＦｕＧＥＮＥTM。
【０２９０】 別のシリーズの実験では、ｈＥＳ細胞を、（コラゲナーゼの代わりに）滅菌Ｐ
ＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡの溶液を用いてフィーダーのない培養物中でマト
リックスから剥離した後にトランスフェクトした。細胞を、個々の細胞が丸くな
り始めるまでは３７℃にて５分間インキュベートした。次いで、ＥＤＴＡ溶液を
除去し、そして約１ｍＬの馴化培地を、ウェルにピペットで入れ、細胞を剥離し
た。次いで、得られる細胞クラスターを、１：３または１：６の分割比で、フィ
ーダーのない新たな培養物中で再度プレートした。これらの条件下で、これらの
細胞を播種後２４時間でリポフェクションした場合、最大の一過性のトランスフ
ェクション効率が達成された。
【０２９１】 フィーダーのないｈＥＳ細胞が安定な遺伝的改変を受けるか否かを調べるため
に、ＭａｔｒｉｇｅｌTM（登録商標）上で維持したＨ１ ｈＥＳ細胞を、ＥＦ１
ａプロモーターによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼを保有する７．５μｇ
のプラスミドと、ネオホスホトランスフェラーゼ遺伝子を駆動するＰＧＫプロモ
ーターを保有する２．５μｇのプラスミドとの混合物で同時トランスフェクトし
た。この細胞を、ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上へのプレ
ート後４８時間でトランスフェクトした。１０μｇのプラスミド＋１５μｌのＦ
ｕＧＥＮＥTMを、１ｍＬにおいて細胞とともに４時間インキュベートし、その後
、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を添加した。４８時間後、培地を、２００μｇ／
ｍＬジェネティシンを補充したｍＥＦ馴化培地に交換した。培養物を、このジェ
ネティシンを含有する培地中で、毎日培地を交換しながら２１日間を越えて維持
した。全ての偽トランスフェクション培養物（すなわち、プラスミドではなく水
と混合したＦｕＧＥＮＥTMを入れた培養物）は、４８〜７２時間以内に死んだ。
薬物耐性コロニーが、ＦｕＧＥＮＥTMおよびプラスミドの両方でトランスフェク
トしたウェルにおいて、１０5個の元々トランスフェクトした細胞に対して約１
の頻度で生じた。このコロニーを、ジェネティシン含有ｍＥＦ馴化培地中で維持
し、そして増殖させた。
【０２９２】 （実施例１１：フィーダーを含まない培養物についての馴化培地の別の供給源
） いくつかの細胞株からの馴化培地を、フィーダーのない培養物においてｈＥＳ
細胞の増殖を支持するそれらの能力について試験した。初代マウス胚性線維芽細
胞（ｍＥＦ）およびＮＨＧ１９０テロメラーゼ化ｍＥＦ株の単離は、既に記載さ
れている。ＳＴＯは、ＡＴＣＣから入手可能な形質転換されたマウス線維芽細胞
株である。ＢＪ ５ｔａは、テロメラーゼ化されたヒト包皮線維芽細胞細胞株で
ある。ｈＴＥＲＴ−ＲＰＥは、テロメラーゼ化したヒト網膜上皮細胞株である。
【０２９３】 細胞を増殖させるために用いた培地は以下の通りであった。１．ｍＥＦ培地：
９０％ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１０％
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱非働化）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および２ｍＭ Ｌ−
グルタミン。２．ＳＴＯ培地：０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補充したｍＥＦ培地
。３．ＢＪ ５ｔａ培地：９０％ ＤＭＥＭおよび１０％ Ｃｏｓｍｉｃ仔ウシ
血清（熱非働化していない）。４．ＮＨＧ１９０培地：さらに１０％ ＦＢＳを
補充したｍＥＦ培地。５．ＲＰＥ培地：９０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ Ｆ
ＢＳ（熱非働化していない）、１０ｍＬ Ｌ−グルタミンおよび３．４８ｇ／Ｌ
炭酸水素ナトリウム。６．分化培地：８０％ノックアウトダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカ
プトエタノールおよび１％ 非必須アミノ酸、２０％ＦＢＳを補充した。
【０２９４】 馴化培地を調製するために、それぞれの細胞株を、Ｃａ++／Ｍｇ++を含まない
ＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間インキ
ュベートし、そしてｍＥＦ培地中に懸濁することにより収集した。細胞を約４０
００ラド（１４０ｋＶで約５０８秒間；Ｔｏｒｒｅｘジェネレーター、ＥＧ＆Ｇ Ａｓｔｒｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．，Ｌｏｎｇ Ｂｅ
ａｃｈ ＣＡにおける棚の設定６）で照射した。次いで、これらを計数し、そし
てｍＥＦについては約５５，０００細胞／ｃｍ2で、ＮＨＧ１９０細胞について
は約３８，０００／ｃｍ2で、ＳＴＯ細胞については約９５，０００／ｃｍ2で、
ＢＪ ５ｔａ細胞については約８０，０００／ｃｍ2で、ＲＰＥ細胞については
約９０，０００／ｃｍ2で播種した。少なくとも４時間後、培地を、４ｎｇ／ｍ
Ｌ ｂＦＧＦを含有するＥＳ培地に交換した。馴化培地を、その後毎日収集し、
そしてｈＥＳ培養物への供給のために用いた。ｈＥＳ培養物への添加の前に、各
馴化培地に、４ｎｇ/ｍＬのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ；Ｇｉ
ｂｃｏ）を補充した。
【０２９５】 図１、パネルＢ（右側）は、非馴化の、通常培地（ＲＭ）と比較して、ｍＥＦ
、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯおよびＢＪ ５ｔａ細胞により馴化された培地中、Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されたＨ９株のｈＥＳ細胞の形態を示す。Ｒ
ＰＥ馴化培地中の細胞は、培養の最初の週のうちに分化した。他の馴化培地中の
細胞はすべて、適切なＥＳ形態を備えたｈＥＳコロニーを有していた。形態、培
養の集密度、および非分化細胞に対する分化細胞の比率に基づき、馴化培地は、
以下のように優先度が減少する順にランク付けされる：始原ｍＥＦ、ＮＨＧ１９
０、ＳＴＯ、およびＢＪ５ｔａ。
【０２９６】 始原ｍＥＦからの馴化培地中で維持された細胞と同様に、ＮＨＧ１９０、ＳＴ
ＯおよびＢＪ５ｔａを含む他の細胞株により馴化された培地中のＭａｔｒｉｇｅ
ｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、ＦＡＣＳ分析により分析したとき、
高レベルでＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を、しかし
低レベルのＳＳＥＡ−１を発現した（図２Ｃ）。ｍＥＦ馴化培地またはＮＨＧ１
９０馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、３
つの胚葉細胞型に分化し得た。この分化した培養の免疫細胞化学的分析は、ニュ
ーロンに一致するβチューブリンＩＩＩ（外胚葉系統）、心筋細胞に一致する心
臓トロポニンＩ（中胚葉系統）、および内胚葉系統の細胞に一致するαフェトプ
ロテインについて陽性の染色を示した。
【０２９７】 実施例１〜３では、ｍＥＦで調整する前に、そして次いでこの馴化培地を集め
そしてｈＥＳ細胞を養うために用いるときに再び、培地に、４ｎｇ／ｍＬのｈｂ
ＦＧＦを添加することによって培地を調製した。ｈｂＦＧＦの培地への両方の添
加が、ＥＳ細胞を未分化状態に維持するために必要である否かを決定するために
、ｈｂＦＧＦの一方または両方の添加をなくした実験を実施した。
【０２９８】 ｈｂＦＧＦの第２が添加ないの馴化培地中で維持された培養は、初期継代では
健常には見えず、そして培養２９日後に分化したように見えた。ｈｂＦＧＦの第
１の添加がない馴化培地中で維持された細胞は、大部分が分化した形態を示した
が、培養２７日後により小さい未分化コロニーをなお形成した。ｈｂＦＧＦのい
ずれの添加も行わない馴化培地中に維持された細胞は、１８日後完全に分化した
。対照的に、ｂＦＧＦの両方の添加を行って調製した馴化培地中で培養した細胞
は、長期間培養で健常かつ未分化であるように見えた。従って、フィーダー細胞
で培養する前後の両方でｂＦＧＦを添加することにより馴化培地を調製すること
は、次のフィーダーのない（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）培養におけるｈＥＳ細胞
の分化を防ぐ助けとなる。
【０２９９】 馴化培地の貯蔵は以下のように試験した：回分培地は、上記のようにｍＥＦ細
胞培養中で１−２日調整することにより調製し、そしてシールされた培養フラス
コ中４℃で貯蔵した。フィーダーのないｈＥＳ細胞培養を、貯蔵培地を毎日交換
して維持した。未分化幹細胞の特徴的な形態特徴は、新鮮馴化培地中に維持され
たｈＥＳ細胞に匹敵して、少なくとも７日間後にもなお存在した。
【０３００】 白血病阻害因子（ＬＩＦ）が、フィーダーのないｈＥＳ細胞を維持することに
おいて馴化培地を置換し得るか否かを決定するために、Ｈ１およびＨ９株の細胞
を、ＬＩＦを最終濃度１５００、１，０００、または５００Ｕ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ
ｓｙｓｔｅｍｓからの組換えＬＩＦ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２５０−Ｌ）で含むＥＳ
培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養した。細胞は、陽性コントロー
ルとしてのｍＥＦ馴化培地、および陰性コントロールとしての非馴化ＥＳ培地と
同時に培養した。１週間後、ＬＩＦを含むかまたは含まない、いずれの培地にお
ける培養も、大きな程度の分化を示したが、ｍＥＦ馴化培地中に維持された培養
は、未分化コロニーを主に含んでいた。これらのデータは、ＬＩＦがフィーダー
細胞の不在下では未分化状態にあるｈＥＳ細胞を維持しないことを示す。 （実施例１２：Ｈ９幹細胞株からのヒト胚線維芽細胞様細胞によって調整された
培地） 細胞は、線維芽細胞および間葉細胞の形態的規準を有するｈＥＳ細胞に由来し
た。それらは、フィーダーのない培養でｈＥＳ細胞を支持し得る。
【０３０１】 Ｈ９ ｈＥＳ細胞株を本開示の別の箇所に記載のように得た。胚様体を形成す
るため、ｈＥＳ細胞を、３７℃１０分間の約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ
とのインキュベーションの後回収し、そして分化培地中小クラスターに解離させ
、そして非接着性細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で培養し、懸濁液中に凝
集体を形成した。約２×１０6細胞を各ウェル（９．６ｃｍ2）中に接種した。懸
濁液中で２日後、凝集体をゼラチン被覆プレート中に写した。それらは、プレー
トに付着し、そして異なる形態を有する細胞に分化し続けた。線維芽細胞様細胞
は、さらに１１日後、分化細胞の混合集団中１００〜１０００細胞のクラスター
で観察された。
【０３０２】 線維芽細胞様細胞を単離するため、培養を約２００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ
中３分間３７℃でインキュベートした。線維芽細胞様細胞のクラスターを、顕微
鏡下でＰｉｐｅｔｍａｎTMで取り出し、そして分化培地を含むチューブに直接移
すか、またはコラゲナーゼ溶液中に放出し、そして次に集めた。細胞を遠心分離
し、分化培地中に再懸濁し、そして６ウェルプレートの１つのウェル上にプレー
トした。細胞を増殖させ、そして連続的に継代した．第３回目の継代で、培養を
ｍＥＦ培地にスイッチした。すべての手順で、細胞は、２−３日毎に養われた。
【０３０３】 線維芽細胞様細胞中にテロメラーゼを導入するために、これらは、以下のよう
に、レトロウイルスを発現するｈＴＥＲＴに感染させた。細胞を、感染の１日前
に、８．６×１０4細胞／ウェル（９．６ｃｍ2）で６ウェルプレート上に接種し
、ｍＥＦ培地に交換される８時間前に、４μｇ／ｍＬポリブレンを補填したウイ
ルス含有培地とともにインキュベートした。異なるウェルを、ｐＢＡＢＥ−ｈＴ
ＥＲＴまたはｐＢＡＢＥベクターコントロールで感染した。ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥ
ＲＴは、ｈＴＥＲＴコード配列（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは除去、そしてＡ
ＴＧ開始コドンから−１〜−５の位置にあるＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部
位）を、市販のｐＢＡＢＥ．ｐｕｒｏのＥｃｏＲＩ部位中に、ｈＴＥＲＴコード
領域を５’ＬＴＲと同じ配向に配置してクローニングすることにより構築した（
Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅら、Ｈｕ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．９：４０３、２０００）。細胞
をさらに６日培養し、そして最終濃度１．６μｇ／ｍＬのピューロマイシン中で
さらに８日間選択した。次いで細胞を回収し、そしてｍＥＦ培地中に再接種した
。
【０３０４】 細胞を増殖させ、そして５０日間線維芽細胞様形態を提示し続けた。細胞を、
感染後２０日に、ＴＲＡＰアッセイのために集めた。細胞は、０日から２７日ま
でｍＥＦ培地中に維持され、そして２８日から４３日まで分化培地にスイッチし
た。細胞を選択後に各継代ごとに計数し、そしてその集団の倍化を計算した。
【０３０５】 テロメラーゼ化細胞株およびコントロール細胞株（コントロールレトロウイル
スで非形質導入または形質導入）の両方は、５０日の培養の間約７または８倍化
する培養で増殖した。ｈＴＥＲＴ発現カセットで形質導入した細胞は、ＴＲＡＰ
アッセイで陽性のテロメラーゼ活性を示したが、コントロール細胞は、任意の活
性を示さなかった。ｈＴＥＲＴ−ｈＥＦ細胞は、コントロール細胞の増殖速度と
同様の増殖速度で連続的に継代した。
【０３０６】 馴化培地を調製するために、ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞を、Ｃａ++／Ｍ
ｇ++を含まないＰＢＳで１回洗浄し、そして１．５−２ｍＬトリプシン／ＥＤＴ
Ａ（Ｇｉｂｃｏ）中で２分間インキュベートすることにより回収した。この細胞
をプレートから脱離させた後、それらをｍＥＦ培地に集めた。それらを４０００
ｒａｄで照射し、カウントしそして約３．７−５×１０5細胞／ウェルで接種し
た。少なくとも１６時間後、培地を、ｈＥＳ培地＋４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで交
換した（４ｎｇ／ｍＬの外から添加したヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を含む上
記の血清補充培地）。６ウェルプレートのウェルあたり３〜４ｍＬを用いた。
【０３０７】 馴化培地をｈＥＳ培養を養うために毎日集めた。ｈＥＳ培養への添加の前に、
馴化培地を４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）で補填した。ｈＴＥＲＴ−
ｈＥＦ培養を、この系で１−２週の間用いた。
【０３０８】 この培地のｈＥＳ細胞増殖を支持する能力を、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株に対して試
験した。ｈＥＦ馴化培地により支持されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上のフ
ィーダーのない培養中に再プレートしたｈＥＳ細胞の培養（パネルＣ＆Ｆ）は、
未分化ｈＥＳ細胞の形態特徴を持つコロニーを形成した。この培養は、始原ｍＥ
Ｆフィーダー細胞の層上に直接、または始原ｍＥＦにより調整された培地中Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で増殖したｈＥＳ細胞から識別不能に見えた。ｈＥ
Ｓ細胞の健常コロニーは、サイズが増加し、そして未分化胚性幹細胞の特徴的な
特色を有していた。２〜３のコロニーは、所定の程度の分化を示したが、分化の
程度は、各々の培養条件の下で同様であった。
【０３０９】 接種後７日で、培養はほぼ集密になり、そして１：３または１：４の比、約１
３０，０００〜１７０，００細胞ｃｍ-2で分裂した。細胞を、３０日にわたって
この条件下で、ｈＥＳ細胞の形態的特徴を提示しながら維持した。
【０３１０】 （実施例１３：Ｈ１株からのｈＥＦにより調整された培地） 第２のヒト胚線維芽細胞（ｈＥＦ）様細胞株を、Ｈ１と称する、異なるｈＥＳ
細胞株から発生させた。胚様体が以前のように形成され、そして４日後，懸濁液
で、培養を、さらなる９日間のためにゼラチン被覆プレート上にプレートした。
【０３１１】 この実施例では、線維芽細胞をピペットにより選択するよりむしろ、バルク培
養から発生させた。培養は、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ型におい
て、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を回収し、解離し、遠心分離し
、分化培地中に再懸濁し、そして６ウェルプレート中にプレートした。増殖細胞
をｈＥＦ培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％熱不活化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミ
ノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタミン）中で継代し、そして２−３日毎に養った
。２継代の後、この細胞集団は、線維芽細胞の形態的特徴を備え均一であるよう
に見えた。このｈＥＦ細胞株をＨＥＦ１と称した。
【０３１２】 亜集団を、実施例１２中のように、レトロウイルステロメラーゼ発現ベクター
（ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴ）、またはベクターコントロールで形質転換した。
【０３１３】 図１１（パネルＡ）は、ＨＥＦ１細胞株の形態を示す。パネルＢ（下）は、Ｔ
ＲＡＰアッセイで測定したときのテロメラーゼ活性を示す。ｈＴＥＲＴ発現カセ
ットで形質転換した細胞は、形質導入後２０または６５日で陽性のテロメラーゼ
活性を示した。非形質導入細胞株、またはベクターコントロールで形質導入した
細胞は、テロメラーゼ活性を示さなかった。
【０３１４】 図１２は、ｈＴＥＲＴ形質導入ＨＥＦ１細胞、およびベクターコントロールで
形質導入された細胞の増殖曲線を示す。両方の株は、コントロール細胞が分裂す
ることを停止した（多分それらはヘーフリック限度に到達したためである）３８
日の時点まで、ほぼ２日毎に倍化した。ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞は、６
０日の時点（３０倍化）を越えて一致した増殖速度で増殖を継続した。
【０３１５】 図１３は、細胞老化の既知のバイオマーカーである（Ｄｉｍｉｔｒｉら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９３６３、１９９５）、老
化関連βガラクトシダーゼに対する染色後の、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコ
ントロール細胞の顕微鏡写真である。チャンバースライド上で増殖した細胞を、
ＰＢＳ中の０．２％のグルタルアルデヒド中で２分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、
そして４０ｍＭのクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０中の、１ｍｇ／ｍＬの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）、５
ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭのＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6、１５０ｍＭのＮａＣｌ、
２ｍＬのＭｇＣｌ2で一晩インキュベートした。ＨＥＦ１コントロール細胞は、
βガラクトシダーゼについて強く染色され、その一方、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞
は、染色されなかった。合わせた結果は、ｈＴＥＲＴの発現が、ＨＥＦ１細胞の
寿命特徴を延長することを示す。
【０３１６】 培地は、６０００ｒａｄで照射したＨＥＦ１細胞を用いて実施例１２における
ように調整し、そして約４．１〜５．５×１０4細胞ｃｍ-2で接種した。この培
地を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基体上で培養したＨ９ ｈＥＳ細胞株の増
殖を支持するその能力について試験した。
【０３１７】 図１４は、マウス胚線維芽細胞によるか、またはＨＥＦ１細胞株のいずれかに
より調整した培地中に継代した後のｈＥＳ細胞のコロニーを示す。ｈＥＳ細胞は
、４継代の間、ＨＥＦ１馴化培地を用いて維持され、未分化ＥＳ細胞の形態を提
示し続けた。このｈＥＳ細胞は、ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４の発現を維持する
ことが見出された。パネルＢに示されるように、それらもまた、未分化ｈＥＳ細
胞の特徴である、ＴＲＡＰアッセイで測定されたとき、テロメラーゼ活性を示し
続けた。
【０３１８】 （実施例１４：ｃＤＮＡライブラリー） ポリＡ＋ｍＲＮＡを、以下のように、未分化および分化ｐＰＳ細胞から単離し
た。
【０３１９】 ヒト胚性幹細胞を、本開示の他の箇所で記載されたように、フィーダー細胞上
からか、またはフィーダーのない環境中のいずれかで増殖した培養から得た．ｃ
ＤＮＡライブラリーは両方から得た。フィーダーのない培養を用いることは、マ
ウスＲＮＡを汚染することのないライブラリーを生成する利点を有し、そしてｍ
ＲＮＡ単離のために多数の細胞を産生するためにより容易に大規模化され得る。
【０３２０】 総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙTMプロトコールおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を用い、製造業者の指示書に従ってｈＥＳ細胞から単離された。簡単
に述べれば、細胞を、グアニジニウムイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）の溶液を
用いて培養皿中で直接溶解し、そして得られる抽出物を、ＲＮＡは結合するが夾
雑物およびゲノムＤＮＡは結合しない条件下で、ＲＮｅａｓｙTMマトリックスに
結合させた。このマトリックスを、製造業者により供給される定められた緩衝液
で洗浄した後、総ＲＮＡを水で溶出し、そして２６０ｎｍにおける吸光度により
定量した。
【０３２１】 次いで、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、総ＲＮＡ調製物から、ＯｌｉｇｏｔｅｘTMプロ
トコールおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより精製
した。簡単に述べれば、共有結合したｄＣ10Ｔ30オリゴヌクレオチドを含むビー
ズマトリックスを総ＲＮＡと混合し、ｍＲＮＡのポリＡ＋テイルと、ｄＣ10Ｔ30 結合ビーズとの間の相互作用を可能にした。規定した洗浄溶液を用いた洗浄の後
、結合したｍＲＮＡを、低塩緩衝液中に放出し、そして収率を２６０ｎｍにおけ
る吸光度により定量した。ゲル電気泳動で、ポリＡ＋ｍＲＮＡの全体の純度を確
認した。
【０３２２】 ｃＤＮＡ合成は、標準的なプロトコール（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM Ｌａｍ
ｂｄａ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ、ＭＤ）を用いて達成された。１μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡを、オリゴｄＴ−
ＮｏｔＩプライマー／アダプターおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ逆転写酵
素を用いて一本鎖ｃＤＮＡに変換した。［32Ｐ］ｄＣＴＰをこの反応中に含め、
第１鎖変換効率の計算を可能にした。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡリガー
ゼおよびＲＮａｓｅＨの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡに
変換した（すべての酵素はＥ．ｃｏｌｉ起源）。この二本鎖ｃＤＮＡを、Ｓａｌ
Ｉアダプターと連結し、次いでゲル排除クロマトグラフィーにより分析した。カ
ラムフラクションの各々の一部分を、ゲル電気泳動により分析し、そして２ｋｂ
ｐまたはそれより大きい推定中間サイズをもつｃＤＮＡを含むフラクションをプ
ールした。次いで、サイズ選択されたｃＤＮＡプールを、ＮｏｔＩエンドヌクレ
アーゼで制限し，そしてＮｏｔＩ／ＳａｌＩ制限ｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と連結した。連結産物を用いて、Ｕｌｔｒ
ａＭａｘTMコンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
を形質転換し、それを次いでアンピシリンを含む培地プレート上にプレートした
。代表的には、これらの方法により生成されたライブラリーは、個々のコロニー
からのプラスミド調製物のＰＣＲにより判定したとき、−１．２ｋｂｐの中間ｃ
ＤＮＡ挿入サイズをもつ、５×１０6以上の独立クローンから構成されていた。
【０３２３】 ｃＤＮＡライブラリーはまた、胚様体（ＥＢ）細胞から調製され、これは、ｈ
ＥＳ細胞から分化した細胞の混合集団を含む。ＥＢを調製するために、ｈＥＳ細
胞の単層培養を、約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶと、約５−２０分３７℃
でインキュベートすることにより回収した。このｈＥＳ細胞を、クラスターに解
離し、そして８０％ＫＯ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２０％非加熱不活化ＦＢＳ
（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ グルタミン、および
０．１ｍＭβメルカプトエタノールを含む、分化培地中、非接着細胞培養プレー
ト（Ｃｏｓｔａｒ）中にプレートした。
【０３２４】 次いで、このＥＢを、９．６ｃｍ2ウェルあたり２ｍＬの培地中１：２の比率
で接種した。このＥＢは、一日おきに、ウェルあたり２ｍＬの培地を４ｍＬ／ウ
ェルまで添加すること、次いで集められそして２ｍＬの新鮮培地中に再懸濁する
ことにより養われた。総ＲＮＡは、懸濁培養中約２−８日後に調製された。ある
いは、ＥＢは、懸濁培養中に約４日間維持され、次いでゼラチン被覆プレート上
にプレートし、そしてさらに７日間培養した。これは、多様な細胞集団の形成を
もたらし、そしておそらくはより高い細胞密度のためにＲＮＡの収率を向上させ
る。約２０〜５００×１０6細胞からの総ＲＮＡの収率は、約２５〜２５００μ
ｇであった。
【０３２５】 （ｈＥＳ細胞における発現のためのプロモーターの選択） 種々のプロモーターを、未分化ｈＥＳ細胞における安定な長期間遺伝子発現を
駆動するそれらの能力について試験した。構築物は、レトロウイルス形質導入に
よるか、またはＦｕＧＥＮＥTM媒介リポフェクションによるかのいずれかで導入
した。
【０３２６】 ６ウェルプレートにプレートされたｈＥＳ細胞は、フィーダー層から、コラゲ
ナーゼ（約２００単位／ｍＬ）を３７℃で７−１０分間用いて取り出した。コロ
ニーが脱離はじめるとき、各ウェルからのコラゲナーゼを吸引し、そして２ｍＬ
の標準ｈＥＳ培地／ウェルで置換した。ｈＥＳ細胞を、単一ウェルの表面を５ｍ
Ｌピペットで掻き取ることにより取り出し、そして５０ｍＬのコニカルチューブ
に移した。さらなるｈＥＳ培地を添加して最終容量を１０ｍＬにした。細胞懸濁
液を、１０ｍＬピペットで１０−１２回摩砕し、そしてさらなる８ｍＬの標準ｈ
ＥＳ培地を添加した。３ｍＬの細胞懸濁液を、上記のようにゼラチンおよびｍＥ
Ｆフィーダー層で予備被覆された６ウェルプレートの各ウェルに添加した（すな
わち、６ウェルプレートの１ウェルが新たなプレートの６ウェルを接種するに十
分であった）。
【０３２７】 レトロウイルスを用いる形質導入は、以下のように行った。ＧＲＮ３５４と称
するレトロウイルスベクターは、ＣｌｏｎＴｅｃｈから購入したＰＭＳＣＶｎｅ
ｏベクター（カタログ番号Ｋ１０６２−１）を用いてＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．で
構築された。ｅＧＦＰコード領域は、ＭＳＣＶ ＬＴＲから下流に挿入された。
このＬＴＲは、ＧＦＰの発現を駆動し、そしてこのベクターはまた、マウスＰＧ
Ｋプロモーターにより駆動されるｎｅｏr遺伝子を含む。
【０３２８】 プレートは、０．５％ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダー細胞（２４ウェ
ルプレートについて１ｍＬ ＮＨＧ１９０培地中７．５×１０4；６ウェルプレ
ートについて３ｍＬ培地中３．７５×１０5）で被覆した。ｈＥＳ株Ｈ７を、ｈ
ＥＳ培地中に、２４ウェル調製プレート上に接種した（１ｍＬ／ウェル）。４８
時間後、３ウェルのｈＥＳ細胞を、３７℃で０．０５％トリプシン／５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた脱離させ、５００μＬのＮＨＧ１９０培地中に再
懸濁し、そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３５４のストックを使
用の直前に氷上で融解した。増殖培地をウェルから吸引し、そして４００μＬ
ｈＥＳ培地プラス８μＬのレトロウイルス（ＭＯＩ １０）および４μＬの８ｍ
ｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置換した。２時間後、８００μＬのｈ
ＥＳ培地をウェルあたり添加した。形質導入したウェルの各々に、１ｍＬの新鮮
ｈＥＳ培地を２４時間毎に再供給した。
【０３２９】 形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／ｍＬゲネチシンを含む１ｍＬのｈＥ
Ｓ培地で置換した。ゲネチシン選択の３日後、細胞をコラゲナーゼで脱離させ、
摩砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地中に再懸濁し、ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィー
ダーで被覆した６ウェルプレートの１つのウェル中に再接種し、そして２４時間
後、ｈＥＳ培地を再供給した。次いで培地を、ゲネシチンを含むｈＥＳ培地で再
び置換し、そして２４時間毎に再供給した。
【０３３０】 ＦｕＧＥＮＥTM６（Ｒｏｃｈｅ）を用いるリポフェクチンを、製造業者の指示
書に従って構築した。このプラスミドＤＮＡ（５−１０μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ１
、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６０８４−１）を水中に最終容量１００μｌま
で希釈した。パイロット実験では、５−３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、十分なＯ
ｐｔｉＭＥＭTM溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１−５８−０２１）に添加し、
１００μＬの最終容量を達成した。次いで、このＤＮＡ溶液をＦｕＧＥＮＥTM溶
液にゆっくり添加し、そして穏やかに混合した。この混合物を、８００μｌのＯ
ｐｔｉＭＥＭTMで補填する前に、３０分間室温でインキュベートした。
【０３３１】 トランスフェクションの４８時間前、ｈＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフ
ィダー層で被覆した６ウェルプレート上に接種した。細胞を、３ｍＬの余熱した
ＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして３７℃で４時間ＤＮＡ／脂質混合物中でイン
キュベートした。いくつかの実験では、４時間後、ウェルに、さらなる２ｍＬの
ｍＥＦ馴化培地を入れた；他には、ＤＮＡ／脂質混合物を、２ｍＬのｍＥＦ馴化
培地を含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩インキュベートし
た。
【０３３２】 次の実験では、ｈＥＳ細胞のフィーダーのない培養を、ＦｕＧＥＮＥTMを用い
てトランスフェクトした。これらの実験では、未分化ｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ馴化
培地プラス付加的な４ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標
）被覆６ウェルプレート上に接種した（約１．５×１０4細胞ｃｍ-2の代表的密
度）。プレーティングの４８時間後、細胞を、すでに記載したように、ＦｕＧＥ
ＮＥTMでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、
ｍＥＦ馴化培地プラス４ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦおよび２００μＧ／ｍＬゲネチ
シンを再供給した。次いで、細胞に、日毎のベースで２００μＧ／ｍＬゲネシチ
ンを含む培地を再供給した。
【０３３３】 代表的実験の結果を表２に要約する。
【０３３４】
【表２】 これらの規準により、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉＣプロモーターは、未
分化ｈＥＳ細胞におけるｃＤＮＡクローンの安定な長期間発現に適切である。
【０３３５】 本明細書で提供される組成物および手順は、以下の請求項で具現化される本発
明の思想から逸脱することなく当業者によって効果的に改変され得ることが認識
される。
【０３３６】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、フィーダー細胞のない培養におけるｈＥＳ細胞の形態を示す顕微鏡写
真のハーフトーン製版である。パネルＡ（左側）は、通例の培養培地（ｍＥＦ／
ＲＭ）中においてフィーダー細胞上に培養されたｈＥＳ細胞の形態、あるいはｍ
ＥＦ馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネ
クチン、またはコラーゲンＩＶ上に培養されたｈＥＳ細胞の形態を示す。パネル
Ｂ（右側）は、馴化されていない通例の培地（ＲＭ）と比較された、ｍＥＦ細胞
、ＮＨＧ１９０細胞、ＳＴＯ細胞およびＢＪ５Ｔａ細胞によって馴化された培地
中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に維持されたｈＥＳ細胞の形態を示
す。通例の培地におけるｈＥＳ細胞は、培養の最初の週の間に分化した。特定の
型の馴化培地中におけるｈＥＳ細胞は、未分化の細胞に関して適切な形態を持っ
たコロニーを含んだ。パネルＣは、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ））中においてフ
ィーダー細胞上に維持されたｈＥＳ細胞、あるいはｍＥＦ馴化培地中においてＭ
ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上またはラミニン上に維持されたｈＥＳ細胞におい
て測定されたインテグリン発現を示す棒グラフである。インテグリン構成成分α
６およびβ１は、ｈＥＳ細胞の細胞外マトリックスへの接着における役割を演じ
得る。
【図２】 図２は、ＦＡＣＳ解析によるフィーダー細胞なしの細胞における表面マーカー
発現を示す。パネルＡは、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中においてフィーダー細
胞上に増殖されたｈＥＳ細胞、または馴化培地を用いて細胞外マトリックス上に
増殖されたｈＥＳ細胞によって発現された糖タンパク質ＳＳＥＡ−４の発現を示
すＦＡＣＳスキャンプロフィールである。パネルＢは、異なるマトリックス上で
培養されたｈＥＳ細胞に関する表面マーカーの蛍光強度を示す棒グラフである。
パネルＣは、異なる細胞株由来の馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）上に培養されたｈＥＳ細胞に関する表面マーカーの蛍光強度を示す棒グラフ
である。
【図３】 図３は、初期フィーダー細胞（ｍＥＦ）によって増殖された細胞、あるいは馴
化培地中において細胞外マトリックスＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミ
ニン上に増殖された細胞に対する免疫組織化学によって検出されたマーカー発現
を示す顕微鏡写真のハーフトーン製版である。フィーダー細胞のない培養物にお
いて増殖されたｈＥＳ細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞上に増殖されたｈＥ
Ｓ細胞に類似する表現型のマーカーを有する。
【図４】 図４は、通例の培地（ＲＭ）または馴化培地（ＣＭ）とともに、フィーダー細
胞（ｍＥＦ）あるいは細胞外マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）また
はラミニン）とともに培養されたｈＥＳ細胞におけるＯＣＴ−４およびｈＴＥＲ
Ｔ発現の解析を提供する。上のパネルは、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルで
のＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴの発現を示すゲルのコピーである。下のパネルは
、１８ｓスタンダードに対するＯＣＴ−４またはｈＴＥＲＴの比率として表され
た、異なる基質上に増殖する細胞に対する発現のレベルを比較する棒グラフであ
る。馴化培地中において、ラミニンおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に生
育されたｈＥＳ細胞は、フィーダー細胞層上に増殖されたｈＥＳ細胞のパターン
と類似した発現パターンを有する。
【図５】 図５は、ＴＲＡＰアッセイによって培養されたｈＥＳ細胞において測定された
テロメラーゼ活性を示す、ゲルのハーフトーン製版である。すべての培養条件は
、フィーダー細胞なしの培養物において４０日間後に、陽性のテロメラーゼ活性
を示した。
【図６】 図６は、胚様体形成を通しての分化を可能にされた、培養されたｈＥＳ細胞に
おいて実施された免疫組織化学のハーフトーン製版である。ｈＥＳが、フィーダ
ー細胞上または細胞外マトリックス上において培養されたかどうかに関わらず、
染色パターンは、異なる細胞型への分化の能力と一致する。染色パターンは、神
経および心筋細胞系統（βチュブリンＩＩＩおよび心臓のトロポニンＩ）の細胞
をそれぞれ示す。内胚葉系統のマーカー、αフェトプロテインに対して染色した
細胞もまた存在する。
【図７】 図７は、異なる細胞系統へ分化する能力の別の指標として、ｈＥＳ細胞由来の
テラトーマの組織病理学のハーフトーン製版である。パネルＡ（上列）は、ｍＥ
Ｆフィーダー細胞上で増殖されるｈＥＳ由来のテラトーマにおける異なる細胞の
数を示す。パネルＢ（下列）は、フィーダー細胞なしの培養において増殖される
ｈＥＳ由来のテラトーマにおける異なる細胞を示す。
【図８】 図８は、ＧＦＰ発現および未分化細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４に関する
、形質導入されたｈＥＳ細胞のＦＡＣＳプロフィールである。ｈＥＳ細胞は、フ
ィーダー細胞層上にプレートされ、両方ともＧＦＰ発現カセットを含むアデノウ
イルスベクターＡｄ５ＧＦＰまたはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４のいず
れかを用いて、４８時間後に感染された。細胞は、回収され、ＳＳＥＡ−４に対
する抗体を用いて染色され、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現をアッセ
イした。上のパネルは、偽感染培養物におけるバックグラウンド蛍光およびＳＳ
ＥＡ−４陽性染色を示す。下のパネルは、ＧＦＰの発現から生じる緑色の蛍光の
レベルを示す。
【図９】 図９は、ｈＥＳが、リポフェクションによってフィーダー細胞なしの培養物中
で遺伝的に変更された実験の結果を示す。パネルＡは、ＧＦＰ発現のためにトラ
ンスフェクトされた後の、ラミニン上のｈＥＳ細胞の形態を示す明視野顕微鏡写
真のハーフトーンである。パネルＢは、同一コロニーにおけるＧＦＰ発現を示す
蛍光顕微鏡写真のハーフトーンである。パネルＣは、種々の条件下におけるＧＦ
Ｐ発現細胞の割合を示す棒グラフである。
【図１０】 図１０は、ＳＳＥＡ−４陽性細胞集団（未分化ＥＳ細胞）におけるＧＦＰ陽性
細胞の割合を示す棒グラフである。パネルＡ：明るい緑色の細胞が、フィーダー
細胞なしの培養の未分化ｈＥＳコロニーにおいて観察された。対照的に、緑色の
細胞は、フィーダー上で増殖されたｈＦＳ細胞のコロニーにおいて、ほとんど見
出されなかった。ＦＡＣＳ解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の細胞の１
６％およびラミニン上の細胞の１４％が、ＳＳＥＡ−４陽性（未分化）細胞集団
においてＧＦＰ陽性であり、一方、フィーダー細胞上の細胞のたった５％が、陽
性であったことを示し、これは、トランスフェクション効率が、フィーダーを含
まない条件を使用することによって有意に増加されることを示唆する。パネルＢ
は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００TM（Ｌ）またはＦｕＧＥＮＥTM（Ｆ）
の異なる条件を用いたＧＦＰレポータープラスミドのトランスフェクション効率
を示す。
【図１１】 図１１は、フィーダー細胞なしの培養において、ｈＥＳ細胞を支持する馴化培
地を産生し得るヒト細胞株の特徴を示す。パネルＡは、ＨＥＦ１細胞株が線維芽
細胞の形態的な特徴を有することを示す、位相差顕微鏡写真のコピーである。パ
ネルＢ（下）は、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のレトロウイルスベク
ターで形質転換されたＨＥＦ１細胞が、テロメラーゼ活性を獲得したことを示す
ＴＲＡＰアッセイの結果のコピーである。
【図１２】 図１２は、ｈＴＥＲＴを形質導入されたＨＥＦ１細胞、およびベクターコント
ロールで形質転換された細胞の増殖を示すグラフである。両株は、最初、二日ご
とに約一度倍加した。しかし、コントロール細胞は、３８日目において増殖を停
止し、一方ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞は、一貫した増殖速度で６０日以上
増殖し続けた。
【図１３】 図１３は、細胞の老化について既知の生物マーカーである、老化に関連したβ
ガラクトシダーゼに対する染色の後の、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコントロ
ール細胞の顕微鏡写真である。ｈＴＥＲＴでのトランスフェクションは、細胞株
の寿命を伸長し、そして老化を妨げる。
【図１４】 図１４は、馴化培地への継代の後のｈＥＳ細胞のコロニーを示す。パネルＡは
、初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）によって、またはヒト線維芽細胞様細胞
株ＨＥＦ１によって馴化された培地中に維持されたｈＥＳ細胞の培養物中の未分
化のコロニーを示す、明視野顕微鏡写真のコピーである。パネルＢ（右）は、Ｈ
ＥＦ１馴化培地を用いて維持されたｈＥＳ細胞が、未分化細胞のテロメラーゼ活
性の特徴を示すことを示した、ＴＲＡＰの結果のコピーである。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／２１３，７３９ (32)優先日 平成12年６月22日(2000．6．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１６，３８７ (32)優先日 平成12年７月７日(2000．7．7) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２２０，０６４ (32)優先日 平成12年７月21日(2000．7．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／６８８，０３１ (32)優先日 平成12年10月10日(2000．10．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ゴールド ジョセフ， ディー． アメリカ合衆国 カリフォルニア， サン フランシスコ (72)発明者 イノクマ マーガレット， エス． アメリカ合衆国 カリフルニア サン ノ ゼ (72)発明者 シュー チュンヒュイ アメリカ合衆国 カリフォルニア， クー パーチーノ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 CA12 DA02 EA04 GA11 HA12 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 CD21 4B065 AA91X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA30 BB23 BB34 BB40 BC11 BC41 BD14 CA24

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フィーダー細胞を本質的に含まない増殖環境において、霊長
    類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための細
    胞株。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の細胞株であって、１つ以上の以下の特性を
    有する細胞株： ｉ）正倍数体である； ｉｉ）不死化マウス細胞株である； ｉｉｉ）ヒト細胞株である； ｉｖ）線維芽細胞株である； ｖ）少なくとも６０日間培養中で増殖し得る、または ｖｉ）テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を上昇したレベルで発現するよう
    に遺伝的に変更されている。
  3. 【請求項３】 ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の培養物を、線維芽様細胞を含む
    分化した細胞の集団へと分化させ、次いで、線維芽様細胞を該培養物から選択す
    ることによって得られたヒト細胞株であって、ここで、該線維芽様細胞の培養物
    から培地を収集することによって産生された馴化培地が、フィーダー細胞を本質
    的に含まない培養環境においてｐＰＳ細胞の増殖を支持する、ヒト細胞株。
  4. 【請求項４】 霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を、本質的にフィーダー細胞
    を含まない増殖環境において培養するために適切な馴化培地を産生するための方
    法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞を該培地中で培養する工程を
    包含する、方法。
  5. 【請求項５】 本質的にフィーダー細胞を含まない増殖環境において霊長類
    多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養することを支持するための馴化培地であって、請
    求項４に記載の方法に従って産生される、馴化培地。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の馴化培地で培養されたフィーダー細胞を本
    質的に含まない、未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含有する、組成物。
  7. 【請求項７】 未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から
    分化した細胞を産生するための方法であって、固相表面上の該ドナー培養物由来
    の細胞の懸濁液を、それらが胚様体を形成せずに分化するように、再播種する工
    程；および／または該細胞が培養される培地を分化を促進するように変更する工
    程を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 少なくとも１つの以下の特徴を有する、請求項７に記載の方
    法： ｉ）前記固相表面が、ポリカチオンを保有する； ｉｉ）前記細胞が、再播種後に培養される培地からの分化を阻害する、血清、
    血清置換物、または因子を取り除くことによって、分化が促進される；または ｉｉｉ）該細胞が再播種後に培養される培地において分化を促進する因子を添
    加することによって、分化が促進される。
  9. 【請求項９】 請求項７または８に記載の方法によって産生される、分化細
    胞集団。
  10. 【請求項１０】 遺伝的に改変された霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生
    する方法であって、 ａ）本質的にフィーダー細胞を含まないｐＰＳ細胞の組成物を提供する工程； ｂ）該組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオチドを移入する工程；および、
    次いで、必要に応じて、 ｃ）該ポリヌクレオチドで遺伝的に改変されている細胞を選択する工程、 を包含する、方法。
  11. 【請求項１１】 霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団であって、未分化の
    ｐＰＳ細胞の少なくとも２５％が、ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクト
    されているか、または該ポリヌクレオチドを遺伝している細胞の子孫である、霊
    長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団。
  12. 【請求項１２】 分化前または後の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞から、ｍ
    ＲＮＡ調製物、ｃＤＮＡ発現ライブラリー、またはｃＤＮＡサブトラクションラ
    イブラリーを産生する方法であって、本質的にフィーダー細胞を含まない未分化
    のｐＰＳ細胞の培養物を提供する工程、必要に応じて該ｐＰＳ細胞を分化させる
    工程、およびｍＲＮＡを該未分化または分化した細胞から単離する工程、を包含
    する、方法。
  13. 【請求項１３】 未分化のｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化した細胞
    のいずれかにおいてｍＲＮＡレベルで発現された少なくとも１，０００遺伝子の
    ｃＤＮＡライブラリーであって、本質的に他の脊椎動物のｃＤＮＡを含まない、
    ｃＤＮＡライブラリー。
  14. 【請求項１４】 未分化または分化したｐＰＳ細胞において発現されたｍＲ
    ＮＡの（またはｍＲＮＡによってコードされる）配列を含むポリヌクレオチドま
    たはポリペプチドを産生するための方法であって、請求項１２に従って得られる
    ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを配列決定する工程、および該配列を含有するポリヌク
    レオチドまたはポリペプチドを製造する工程を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１、２、３、５、６、９、１１、または１３のいず
    れかに記載の組成物であって、前記ｐＰＳ細胞が、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞で
    ある、組成物。
  16. 【請求項１６】 前記ポリカチオンが、ポリリジンまたはポリオルニチンで
    ある、請求項８に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記分化を促進する因子が、脳由来神経栄養性因子（ＢＤ
    ＮＦ）またはニュートロフィン−３（ＮＴ−３）である、請求項８または１６に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 請求項４、７、８、１０、１２、１４、１６、または１７
    のいずれかに記載の方法であって、前記ｐＰＳ細胞が、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細
    胞である、方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085426A1 (ja) * 2004-03-04 2005-09-15 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 無フィ−ダ−分化用培地及び霊長類動物胚性幹細胞からの無フィ−ダ−分化方法
JP2007529227A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 ジェロン・コーポレーション 再生医学に適した高純度心筋細胞調製物を作製するための方法
JP2007306922A (ja) * 2006-05-16 2007-11-29 Becton Dickinson & Co 細胞培養用の細胞外マトリックスコーティングされた表面
JP2008500065A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ウィセル リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド 胚性幹細胞のフィーダー非依存性長期培養
JP2008543338A (ja) * 2005-06-22 2008-12-04 ジェロン・コーポレーション 心筋細胞系列細胞への霊長類多能性幹細胞の分化
WO2013077423A1 (ja) * 2011-11-25 2013-05-30 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養方法

Families Citing this family (374)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7413904B2 (en) 1998-10-23 2008-08-19 Geron Corporation Human embryonic stem cells having genetic modifications
US20050042749A1 (en) 2001-05-16 2005-02-24 Carpenter Melissa K. Dopaminergic neurons and proliferation-competent precursor cells for treating Parkinson's disease
US7455983B2 (en) 2000-01-11 2008-11-25 Geron Corporation Medium for growing human embryonic stem cells
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) * 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
WO2001088104A2 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
US7250294B2 (en) 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
CA2411914C (en) * 2000-06-20 2012-08-21 Es Cell International Pte Ltd Method of controlling differentiation of embryonic stem (es) cells by culturing es cells in the presence of bmp-2 pathway antagonists
AU2001293586A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Vincent Tropepe Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
EP2204452A1 (en) * 2000-11-23 2010-07-07 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara Virus variant
US6921665B2 (en) * 2000-11-27 2005-07-26 Roslin Institute (Edinburgh) Selective antibody targeting of undifferentiated stem cells
US6576464B2 (en) 2000-11-27 2003-06-10 Geron Corporation Methods for providing differentiated stem cells
EP1366148A2 (en) * 2001-01-24 2003-12-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & HUMAN SERVICES Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
DE10108412B4 (de) * 2001-02-21 2006-03-09 Cevec Pharmaceuticals Gmbh Pigmentepithelzelle des Auges, ihre Herstellung und Verwendung in der Therapie einer Augen- oder Nervenerkrankung
US7126039B2 (en) 2001-03-21 2006-10-24 Geron Corporation Animal tissue with carbohydrate antigens compatible for human transplantation
US20030211605A1 (en) * 2001-05-01 2003-11-13 Lee Sang-Hun Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells
FR2825370A1 (fr) * 2001-05-31 2002-12-06 Inst Nat Sante Rech Med Keratinocytes obtenus a partir de cellules souches embryonnaires de mammiferes
CN101029302B (zh) * 2001-06-21 2011-03-30 杰龙公司 用于治疗帕金森病的多巴胺能神经元和具有增殖能力的前体细胞
CN101696397B (zh) 2001-07-06 2015-07-08 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 来自人胚胎干细胞的间充质细胞和成骨细胞
US7732199B2 (en) 2001-07-12 2010-06-08 Geron Corporation Process for making transplantable cardiomyocytes from human embryonic stem cells
JP2004535199A (ja) * 2001-07-12 2004-11-25 ジェロン コーポレイション ヒト多能性幹細胞から産生される心筋細胞系譜の細胞
WO2003008535A2 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Technion Research And Development Foundation Ltd. Methods of generating human cardiac cells and tissues and uses thereof
AU2002317039B2 (en) * 2001-07-24 2007-10-04 Es Cell International Pte Ltd Methods of inducing differentiation of stem cells
CA2456981C (en) * 2001-08-06 2012-02-28 Bresagen, Inc. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
SG172471A1 (en) * 2001-08-23 2011-07-28 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Isolation of inner cell mass for the establishment of human embryonic stem cell (hesc) lines
MXPA04001725A (es) 2001-08-24 2005-04-11 Advanced Cell Tech Inc ANáLISIS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGENTES INDUCTORES DE DIFERENCIACION Y PRODUCCION DE CELULAS DIFERENCIADAS PARA TERAPIA CELULAR.
GB2396623B (en) * 2001-09-28 2006-04-05 Es Cell Int Pte Ltd Methods of derivation and propagation of undifferentiated human embryonic stem (hes) cells on feeder-free matrices and human feeder layers
US7588937B2 (en) 2001-10-03 2009-09-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells
US8153424B2 (en) 2001-10-03 2012-04-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of neural stem cells, motor neurons and dopamine neurons from primate embryonic stem cells
US6887706B2 (en) 2001-10-03 2005-05-03 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of in vitro differentiation of transplantable neural precursor cells from primate embryonic stem cells
US6645763B2 (en) * 2001-10-12 2003-11-11 Naoya Kobayashi Immortalized bone marrow mesenchymal stem cell
JP4317337B2 (ja) * 2001-10-16 2009-08-19 株式会社リプロセル 細胞株継代用酵素溶液、および、それを用いた霊長類胚性幹細胞の培養増殖方法
CA2468171C (en) * 2001-11-15 2015-10-06 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
AU2002366602B2 (en) 2001-12-07 2008-07-03 Asterias Biotherapeutics, Inc. Chondrocyte precursors derived from human embryonic stem cells
CA2470539C (en) 2001-12-07 2011-10-04 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
CN102008503B (zh) * 2001-12-07 2018-10-09 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 人胚胎干细胞衍生的造血细胞
US7799324B2 (en) 2001-12-07 2010-09-21 Geron Corporation Using undifferentiated embryonic stem cells to control the immune system
US7939059B2 (en) * 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
CN100526455C (zh) 2001-12-21 2009-08-12 斯路姆-X股份有限公司 用于体外分离和培养具有种系传递能力的胚胎干细胞(es)细胞系的组合物
US20030134422A1 (en) * 2002-01-16 2003-07-17 Sayre Chauncey Bigelow Stem cell maturation for all tissue lines
US20050090004A1 (en) * 2003-01-16 2005-04-28 Sayre Chauncey B. Stem cell maturation for all tissue lines
US20050170506A1 (en) * 2002-01-16 2005-08-04 Primegen Biotech Llc Therapeutic reprogramming, hybrid stem cells and maturation
EP1471140A4 (en) * 2002-01-31 2005-02-16 Asahi Techno Glass Cosporation LIQUID FOR FROZEN STORAGE OF PRIMATE EMBRYONIC STEM CELLS AND FREEZING STORAGE METHOD
WO2003104439A2 (en) * 2002-03-12 2003-12-18 Surface Logix, Inc. Assay device that analyzes the absorption, metabolism, permeability and/or toxicity of a candidate compound
GB0206309D0 (en) * 2002-03-16 2002-05-01 Axordia Ltd Isolated cells
AU2003239159A1 (en) * 2002-04-19 2003-11-03 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Placental derived stem cells and uses thereof
US20040161419A1 (en) * 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
US7763466B2 (en) 2002-05-17 2010-07-27 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Mesoderm and definitive endoderm cell populations
CA2488429C (en) 2002-06-05 2013-05-07 Benjamin Eithan Reubinoff Generation of neural stem cells from undifferentiated human embryonic stem cells
US7285415B2 (en) * 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
US20050101014A1 (en) * 2002-07-11 2005-05-12 Keirstead Hans S. Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
GB0217981D0 (en) * 2002-08-02 2002-09-11 Univ Durham Method for preparation, purification and differentiation of neurospheres from mammalian stem cells
UA85543C2 (ru) * 2002-09-05 2009-02-10 Бавариан Нордик А/С Способ культивирования первичных клеток и амплификации вирусов в условиях безсывороточной среды, композиция и ее применение, и способ лечения или вакцинации животных
GB0222846D0 (en) 2002-10-03 2002-11-06 Choo Yen Cell culture
US7267981B2 (en) 2002-10-07 2007-09-11 Technion Research & Development Foundation Ltd. Human foreskin fibroblasts for culturing ES cells
US20050265983A1 (en) * 2002-11-17 2005-12-01 Eldad Melamed Methods, nucleic acid constructs and cells for treating neurodegenerative disorders
DK2457999T3 (en) 2002-12-16 2019-02-11 Technion Res & Dev Foundation CULTIVATION MEDIUM FOR PLURIPOTENT STEM CELLS
AU2003256803B2 (en) * 2003-01-24 2009-09-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
US7695752B2 (en) * 2003-01-24 2010-04-13 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target activated microtransfer
KR100763477B1 (ko) 2003-03-12 2007-10-04 리라이언스 라이프 사이언시스 프라이빗. 리미티드 사람 배아 줄기세포로부터 최종적으로 분화된 도파민작용성 뉴런의 유도
US20030224411A1 (en) * 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
US7153650B2 (en) 2003-03-13 2006-12-26 Geron Corporation Marker system for preparing and characterizing high-quality human embryonic stem cells
WO2004085631A2 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Mount Sinai Hospital Canine embryonic stem cells
EP1484390A1 (en) * 2003-06-02 2004-12-08 Blutspendedienst des Bayerischen Roten Kreuzes Methods of preparing peripheral stem cells from leukocyte reduction filters
US20050032208A1 (en) * 2003-06-18 2005-02-10 Oh Steve Kah Weng Materials and methods to produce stem cells
US20050233448A1 (en) * 2003-06-18 2005-10-20 Oh Steve K W Materials and methods to produce stem cells
CA2525847C (en) * 2003-06-20 2018-09-18 Axiogenesis Ag Tissue modeling in embryonic stem (es) cell system
WO2005007838A1 (ja) 2003-06-27 2005-01-27 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha 細胞分化抑制剤、これを用いた細胞培養方法、培養液及び培養された細胞株
US7820439B2 (en) 2003-09-03 2010-10-26 Reliance Life Sciences Pvt Ltd. In vitro generation of GABAergic neurons from pluripotent stem cells
US20050106554A1 (en) * 2003-11-19 2005-05-19 Palecek Sean P. Cryopreservation of pluripotent stem cells
US20080220520A1 (en) * 2003-11-19 2008-09-11 Palecek Sean P Cryopreservation of human embryonic stem cells in microwells
JP2007516706A (ja) * 2003-12-01 2007-06-28 バーテックス　ファーマシューティカルズ　インコーポレイテッド 胎児肝臓細胞を含む組成物およびｈｃｖ感染で有用な方法
TWI280280B (en) * 2003-12-09 2007-05-01 Ind Tech Res Inst Culture system and method for expansion and undifferentiated growth of human embryonic stem cells
CN100376670C (zh) * 2003-12-10 2008-03-26 财团法人工业技术研究院 人类胚干细胞的培养系统及其培养方法
US20060030042A1 (en) * 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
AU2013200203B2 (en) * 2003-12-23 2014-11-20 Viacyte, Inc. Definitive endoderm
CN112813019A (zh) * 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
US20050266554A1 (en) * 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) * 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US8647873B2 (en) 2004-04-27 2014-02-11 Viacyte, Inc. PDX1 expressing endoderm
US7541185B2 (en) * 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
DK1709159T3 (da) 2003-12-23 2019-07-29 Viacyte Inc Definitiv endoderm
US7985585B2 (en) 2004-07-09 2011-07-26 Viacyte, Inc. Preprimitive streak and mesendoderm cells
WO2007059007A2 (en) 2005-11-14 2007-05-24 Cythera, Inc. Markers of definitive endoderm
US7923245B2 (en) * 2003-12-26 2011-04-12 Miho Furue Medium for ES culturing
WO2005065354A2 (en) * 2003-12-31 2005-07-21 The Burnham Institute Defined media for pluripotent stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
KR101258292B1 (ko) * 2004-01-23 2013-04-25 어드밴스드 셀 테크놀로지, 인코포레이티드 망막 변성 질환 치료를 위한 개선된 양식
US7816137B2 (en) 2004-01-30 2010-10-19 Lifecord Inc. Method for isolating and culturing multipotent progenitor cells from umbilical cord blood
WO2005080551A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
US7829332B2 (en) * 2004-02-13 2010-11-09 Cornell Research Foundation, Inc. Purines are self-renewal signals for neural stem cells, and purine receptor antagonists promote neuronal and glial differentiation therefrom
WO2005080598A1 (ja) * 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
US8206981B2 (en) 2004-03-05 2012-06-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow
CN1934245B (zh) * 2004-03-23 2012-07-04 第一三共株式会社 多能干细胞的增殖方法
US7452718B2 (en) 2004-03-26 2008-11-18 Geron Corporation Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human embryonic stem cells
EP1740945B1 (en) 2004-04-07 2018-09-19 Ncardia AG Non-invasive, in vitro functional tissue assay systems
EP2377922B1 (en) * 2004-04-27 2020-04-08 Viacyte, Inc. PDX1 expressing endoderm
ES2770067T3 (es) 2004-05-11 2020-06-30 Ncardia Ag Descubrimiento de fármacos basado en células diferenciadas in vitro
JP2008501356A (ja) 2004-06-09 2008-01-24 ザ・ユニバーシティ・コート・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・エディンバラ 神経幹細胞
US20050277124A1 (en) * 2004-06-10 2005-12-15 White Steven M Cardiac conduction system cells and uses thereof
US20080038820A1 (en) * 2004-06-22 2008-02-14 Rudy-Reil Diane E Induction of pluripotent stem cells into mesodermal lineages
AU2005271944B2 (en) 2004-07-09 2012-02-16 Viacyte, Inc. Preprimitive streak and mesendoderm cells
JPWO2006006722A1 (ja) * 2004-07-13 2008-05-01 武田薬品工業株式会社 細胞機能の調節方法
WO2006017370A2 (en) 2004-07-13 2006-02-16 Geron Corporation Medium for growing human embryonic stem cells
US20070196918A1 (en) * 2004-07-15 2007-08-23 Sayre Chauncey B Reprogramming of adult human testicular stem cells to pluripotent germ-line stem cells
US20070020759A1 (en) * 2004-07-15 2007-01-25 Primegen Biotech Llc Therapeutic reprogramming of germ line stem cells
US20060188491A1 (en) * 2004-07-15 2006-08-24 Primegen Biotech, Llc Use of nuclear material to therapeutically reprogram differentiated cells
JP5102030B2 (ja) * 2004-08-13 2012-12-19 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド ヒト胚性幹細胞における自己再生および分化のための組成物および方法
US20070280989A1 (en) * 2004-09-21 2007-12-06 Nvr Labs Ltd Compositions and Methods for Stem Cell Expansion and Differentiation
US7893315B2 (en) 2004-11-04 2011-02-22 Advanced Cell Technology, Inc. Derivation of embryonic stem cells and embryo-derived cells
EP1812554A4 (en) 2004-11-04 2008-10-08 Advanced Cell Tech Inc DERIVATION OF EMBRYONAL STEM CELLS
JP2006149329A (ja) * 2004-12-01 2006-06-15 Univ Of Tokyo 繊毛上皮細胞調製方法
FR2878860A1 (fr) * 2004-12-08 2006-06-09 Vivalis Sa Lignees de cellules souches humaines derivees de cellules es et utilisations pour la production de vaccins et de proteines recombinantes
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
EP1841857A1 (en) * 2004-12-30 2007-10-10 Stemlifeline, Inc. Methods and compositions relating to embryonic stem cell lines
WO2006073966A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-13 Stemlifeline, Inc. Methods and systems relating to embryonic stem cell lines
US20060166305A1 (en) * 2005-01-27 2006-07-27 Genetix Limited Animal cell confluence detection method and apparatus
CN1298843C (zh) * 2005-02-07 2007-02-07 十堰市太和医院 不依赖饲养细胞的人胚干细胞培养基
US20090029461A1 (en) * 2005-02-23 2009-01-29 Agency For Science Technology And Research Immortalised Feeder Cells
US20060228662A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Lokar Robert R Low profile self-ligating bracket assembly and method of use
WO2006110806A2 (en) * 2005-04-12 2006-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Multipotent adult stem cells
US7449356B2 (en) * 2005-04-25 2008-11-11 Analog Devices, Inc. Process of forming a microphone using support member
US20060263880A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Oakland University Protein factors supporting undifferentiated growth of human embryonic stem cells
AU2006202209B2 (en) * 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
EP1885845A2 (en) 2005-06-01 2008-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of forming dendritic cells from embryonic stem cells
US8034613B2 (en) 2005-06-01 2011-10-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Multipotent lymphohematopoietic progenitor cells
CA2613889A1 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Centocor, Inc. A cellular therapy for ocular degeneration
EP1893747B1 (en) 2005-06-16 2014-09-03 Ramot at Tel Aviv University Ltd. Isolated cells and populations comprising same for the treatment of cns diseases
US20060286666A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-21 Kang Ji Y Methods and apparatuses for culturing stem cell using biomaterial shell
WO2007002664A2 (en) * 2005-06-22 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Propagation of undifferentiated embryonic stem cells in hyaluronic acid hydrogel
EP3599277A1 (en) 2005-06-22 2020-01-29 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
US20070042491A1 (en) * 2005-08-18 2007-02-22 Karp Jeffrey M Amplification of cell populations from embryonic stem cells
EP3354723B1 (en) 2005-08-29 2023-12-13 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
US20100129906A1 (en) * 2005-10-07 2010-05-27 Cellartis Ab Method for Obtaining Xeno-Free Hbs Cell line
EP1957636B1 (en) 2005-10-27 2018-07-04 Viacyte, Inc. Pdx1-expressing dorsal and ventral foregut endoderm
US7413900B2 (en) * 2005-10-31 2008-08-19 President And Fellows Of Harvard College Immortalized fibroblasts
US20070116680A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-24 Rensselaer Polytechnic Institute Stem cells within gel microenvironments
GB0526664D0 (en) * 2005-11-30 2006-02-08 Plasticell Ltd Method
US20100021434A1 (en) * 2005-12-08 2010-01-28 Ramot At Tel Aviv University Ltd. Isolated Oligodendrocyte-Like Cells and Populations Comprising Same for the Treatment of CNS Diseases
US8129187B2 (en) 2005-12-13 2012-03-06 Kyoto University Somatic cell reprogramming by retroviral vectors encoding Oct3/4. Klf4, c-Myc and Sox2
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
EP2206778B1 (en) 2005-12-13 2018-08-01 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
ITNA20060017A1 (it) * 2006-02-20 2007-08-21 Aquino Riccardo D Tecnica di prelievo e selezione di un una popolazione di cellule staminali di tipo embrionale da tessuti follicolari peridentari di uomo adulto.
AU2007220759A1 (en) 2006-02-23 2007-09-07 Viacyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
SG10201405380QA (en) 2006-03-02 2014-10-30 Cythera Inc Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US11254916B2 (en) 2006-03-02 2022-02-22 Viacyte, Inc. Methods of making and using PDX1-positive pancreatic endoderm cells
US7695965B2 (en) * 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
MX347303B (es) 2006-03-07 2017-04-21 Shroff Geeta Composiciones que comprenden celulas madre embrionarias humanas y sus derivados, metodos de uso y metodos de preparacion.
AU2007228982B2 (en) * 2006-03-17 2013-11-07 Cellartis Ab Culture system and method for propagation of human blastocyst-derived stem cells
US7989204B2 (en) * 2006-04-28 2011-08-02 Viacyte, Inc. Hepatocyte lineage cells
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
WO2007146106A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-21 Cryo- Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of maternal placental cells
US20080050814A1 (en) * 2006-06-05 2008-02-28 Cryo-Cell International, Inc. Procurement, isolation and cryopreservation of fetal placental cells
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
US20080003676A1 (en) * 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
EP2046946B8 (en) * 2006-06-26 2017-01-25 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell culture
US20080166804A1 (en) * 2006-07-14 2008-07-10 Shamblott Michael J Compostions and methods for growing human embryonic stem cells
DK2733203T3 (en) 2006-08-02 2019-02-04 Technion Res & Dev Foundation PROCEDURES FOR EXPANSION OF EMBRYONAL STEM CELLS IN A SUSPENSION CULTURE
US20100323442A1 (en) * 2006-10-17 2010-12-23 Emmanuel Edward Baetge Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
RU2341270C2 (ru) * 2006-12-28 2008-12-20 Александр Сергеевич Ботин Композиция для стимулирования роста и регенерации клеток, а также способы ее получения
EP2457996B1 (en) * 2007-01-03 2016-08-31 NeoStem Oncology, LLC Stem cell growth media and methods of making and using same
WO2008091680A2 (en) 2007-01-25 2008-07-31 The General Hospital Corporation Methods for controlling stem cell differentiation
CN103627671A (zh) * 2007-01-30 2014-03-12 佐治亚大学研究基金会 产生中内胚层细胞及多能游走细胞的方法与细胞群及用途
US8796021B2 (en) 2007-02-23 2014-08-05 Advanced Cell Technology, Inc. Blastomere culture to produce mammalian embryonic stem cells
CA2684242C (en) * 2007-03-23 2019-11-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
EP2155860B1 (en) 2007-05-03 2014-08-27 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Multipotent stem cells and uses thereof
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
US9213999B2 (en) 2007-06-15 2015-12-15 Kyoto University Providing iPSCs to a customer
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
JP2010532172A (ja) 2007-07-01 2010-10-07 ライフスキャン・インコーポレイテッド 単細胞の分化万能性幹細胞の培養
KR101555824B1 (ko) 2007-07-18 2015-09-25 라이프스캔, 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
RU2010107181A (ru) * 2007-07-31 2011-09-20 Лайфскен, Инк. (Us) Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием питающих клеток человека
EP2028268A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-25 Université Libre De Bruxelles Generation of neuronal cells from pluripotent stem cells
US8283160B2 (en) 2007-09-11 2012-10-09 Frey Ii William H Methods, pharmaceutical compositions and articles of manufacture for administering therapeutic cells to the animal central nervous system
US7695963B2 (en) 2007-09-24 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods for increasing definitive endoderm production
IL292561A (en) 2007-10-12 2022-06-01 Astellas Inst For Regenerative Medicine Improved methods of rpe cell production and rpe cell preparations
RU2473684C2 (ru) 2007-11-27 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
US8372643B2 (en) 2007-12-06 2013-02-12 Agency For Science, Technology And Research Method for extracellular matrix mediated differentiation and proliferation of stem cells
US9683232B2 (en) 2007-12-10 2017-06-20 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
KR101532442B1 (ko) 2007-12-10 2015-06-29 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 효율적인 핵 초기화 방법
KR101809863B1 (ko) 2008-01-30 2017-12-15 아스테리아스 바이오세라퓨틱스, 인크. 줄기 세포 유래 심근세포 배양용 합성 표면
US8513009B2 (en) * 2008-01-30 2013-08-20 Geron Corporation Synthetic surfaces for culturing stem cell derived oligodendrocyte progenitor cells
KR20170001727A (ko) 2008-02-21 2017-01-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
US20100087002A1 (en) * 2008-02-21 2010-04-08 Benjamin Fryer Methods, Surface Modified Plates and Compositions for Cell Attachment, Cultivation and Detachment
EP3293255A1 (en) 2008-03-27 2018-03-14 Asterias Biotherapeutics, Inc. Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
KR101661940B1 (ko) 2008-05-02 2016-10-04 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 핵 초기화 방법
AU2009246047A1 (en) 2008-05-13 2009-11-19 The University Of Queensland Method of inducing proliferation and/or differentiation of neural precursor cells by introducing prolactin or Wnt3a to activate latent neural precursor cells
DK2620493T3 (da) 2008-05-28 2019-07-01 Univ Ramot Mesenkymale stamceller til behandling af CNS-sygdomme
WO2009154466A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 Universiteit Twente Self-assembling tissue modules
KR101651661B1 (ko) * 2008-06-30 2016-08-26 얀센 바이오테크 인코포레이티드 만능 줄기 세포의 분화
US20110305672A1 (en) 2008-07-25 2011-12-15 University Of Georgia Research Foundation, Inc. COMPOSITIONS FOR MESODERM DERIVED ISL1+ MULTIPOTENT CELLS (IMPs), EPICARDIAL PROGENITOR CELLS (EPCs) AND MULTIPOTENT CD56C CELLS (C56Cs) AND METHODS OF PRODUCING AND USING SAME
EP2318520B1 (en) 2008-07-25 2017-10-11 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions for mesoderm derived isl1+ multipotent cells (imps), epicardial progenitor cells (epcs) and multipotent cxcr4+cd56+ cells (c56cs) and methods of use
US20100028307A1 (en) * 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
KR101798474B1 (ko) 2008-10-31 2017-11-16 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화
CA2742268C (en) 2008-10-31 2020-02-18 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
US8895300B2 (en) 2008-11-04 2014-11-25 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
US8956867B2 (en) * 2008-11-07 2015-02-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for culturing stem cells
ES2667493T3 (es) 2008-11-14 2018-05-11 Viacyte, Inc. Encapsulación de células pancreáticas derivadas de células madre humanas pluripotentes
CN107267442A (zh) 2008-11-20 2017-10-20 詹森生物科技公司 微载体上的多能干细胞培养
CA2744227C (en) 2008-11-20 2018-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
US20100173024A1 (en) * 2008-12-01 2010-07-08 LifeSpan Extension, LLC Methods and compositions for altering health, wellbeing, and lifespan
US20100143313A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-10 The General Hospital Corporation Homogeneous differentiation of hepatocyte-like cells from embryonic stem cells
CN102325878A (zh) 2008-12-23 2012-01-18 斯特姆塞尔思加利福尼亚有限公司 少突胶质前体细胞的靶向细胞群及制备与使用方法
US8507274B2 (en) 2009-02-06 2013-08-13 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of definitive endoderm
US8642334B2 (en) 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
EP2233566A1 (en) 2009-03-17 2010-09-29 Vrije Universiteit Brussel Generation of pancreatic progenitor cells
GB0906424D0 (en) 2009-04-09 2009-05-20 Antoxis Ltd Use of compounds for differentiation of cells
US9109245B2 (en) 2009-04-22 2015-08-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
EP2421957B1 (en) * 2009-04-22 2020-11-18 Viacyte, Inc. Cell compositions derived from dedifferentiated reprogrammed cells
AU2010266016B2 (en) * 2009-06-25 2016-05-26 Asterias Biotherapeutics, Inc. Differentiated pluripotent stem cell progeny depleted of extraneous phenotypes
GB0911060D0 (en) 2009-06-26 2009-08-12 Ge Healthcare Uk Ltd Methods for predicting the toxicity of a chemical
PL2451941T3 (pl) * 2009-07-09 2018-10-31 Janssen Biotech, Inc Komórki pochodzące z tkanki sercowej
JP6219568B2 (ja) 2009-07-20 2017-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化
AR077766A1 (es) 2009-07-20 2011-09-21 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas
WO2011011302A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US11261425B2 (en) 2009-08-12 2022-03-01 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
JP5761816B2 (ja) 2009-08-12 2015-08-12 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から神経前駆細胞への分化誘導法
CA2777552C (en) 2009-10-19 2019-05-21 Cellular Dynamics International, Inc. Cardiomyocyte production
SG10201500674YA (en) 2009-10-29 2015-04-29 Janssen Biotech Inc Pluripotent stem cells
US9018010B2 (en) 2009-11-12 2015-04-28 Technion Research & Development Foundation Limited Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
KR102073730B1 (ko) 2009-11-17 2020-02-05 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 인간 ｒｐｅ 세포의 생산 방법 및 인간 ｒｐｅ 세포의 제약 제제
US8790889B2 (en) 2009-12-21 2014-07-29 The University Of Queensland Neuronal stimulation
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
SG181822A1 (en) 2009-12-23 2012-08-30 Centocor Ortho Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
US8558913B2 (en) * 2010-02-08 2013-10-15 Apple Inc. Capture condition selection from brightness and motion
AU2011223900A1 (en) 2010-03-01 2012-09-13 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
JP5777115B2 (ja) * 2010-03-18 2015-09-09 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化誘導法
JP5860805B2 (ja) * 2010-03-23 2016-02-16 オリンパス株式会社 幹細胞の分化状態をモニタリングする方法
CN102933704A (zh) 2010-04-08 2013-02-13 爱丁堡大学管理处 软骨祖细胞、用于细胞衍生的方案和其用途
EP3072961A1 (en) 2010-04-16 2016-09-28 Children's Medical Center Corporation Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
WO2011140231A1 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 Caridianbct, Inc. Method of reseeding adherent cells grown in a hollow fiber bioreactor system
BR112012028855A2 (pt) 2010-05-12 2015-09-22 Janssen Biotech Inc diferenciação das células-tronco embrionárias humanas
WO2011143400A2 (en) 2010-05-13 2011-11-17 The Regents Of The University Of California Method and composition for inducing human pluripotent stem cells
US8513015B2 (en) 2010-06-11 2013-08-20 Corning Incorporated Laminin-entactin complex and cell culture article and methods thereof
AU2011267849B2 (en) 2010-06-15 2015-02-05 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Generation of induced pluripotent stem cells from small volumes of peripheral blood
KR101861171B1 (ko) 2010-06-18 2018-05-31 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 투석된 혈청이 있는 심근세포 배지
AU2011279250B2 (en) 2010-07-12 2014-12-04 California Institute Of Technology Biocompatible substrate for facilitating interconnections between stem cells and target tissues and methods for implanting same
DK2596119T3 (da) 2010-07-23 2021-07-26 Astellas Inst For Regenerative Medicine Fremgangsmåder til påvisning af sjældne subpopulationer af celler og stærkt oprensede sammensætninger af celler
CN103052707A (zh) 2010-07-30 2013-04-17 剑桥实业有限公司 人类多能细胞的皮层生成
KR20190027969A (ko) 2010-08-12 2019-03-15 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 전구 세포를 이용한 당뇨병의 치료
PH12013500367A1 (en) 2010-08-31 2013-04-01 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
WO2012030540A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
PL2611910T3 (pl) 2010-08-31 2018-06-29 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
CA2812194C (en) 2010-09-17 2022-12-13 President And Fellows Of Harvard College Functional genomics assay for characterizing pluripotent stem cell utility and safety
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
US9181529B2 (en) 2010-10-19 2015-11-10 Cellular Dynamics International, Inc. Titration of differentiation medium components
WO2012081029A1 (en) * 2010-12-15 2012-06-21 Kadimastem Ltd. Insulin producing cells derived from pluripotent stem cells
WO2012115619A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Viacyte, Inc. Loading system for an encapsulation device
EP2691512B1 (en) 2011-03-29 2019-05-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Enriched populations of cardiomyocyte lineage cells from pluripotent stem cells
JP6185907B2 (ja) 2011-03-30 2017-08-23 セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッド 神経分化のための多能性幹細胞の予備刺激
WO2012148397A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Aquero Company, Llc Lysine-based polymer coagulants for use in clarification of process waters
US8877489B2 (en) 2011-12-05 2014-11-04 California Institute Of Technology Ultrathin parylene-C semipermeable membranes for biomedical applications
US10478206B2 (en) 2011-04-29 2019-11-19 University Of Southern California Instruments and methods for the implantation of cell-seeded substrates
DE102011103739A1 (de) * 2011-05-31 2012-12-06 Dr. Johannes Heidenhain Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Maßbandmontage
WO2013010965A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Universite Libre De Bruxelles Generation of mesodermal cells from pluripotent stem cells
EP3693455A1 (en) 2011-11-04 2020-08-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
US9248013B2 (en) 2011-12-05 2016-02-02 California Institute Of Technology 3-Dimensional parylene scaffold cage
WO2013096839A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Somagenics, Inc. Methods of constructing small rna libraries and their use for expression profiling of target rnas
EP2794857A4 (en) 2011-12-22 2015-07-08 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS IN SINGLE INSULIN POSITIVE CELLS
US9828583B2 (en) 2012-01-13 2017-11-28 The General Hospital Corporation Isolated human lung progenitor cells and uses thereof
US20150064273A1 (en) 2012-02-13 2015-03-05 Gamida-Cell Ltd. Mesenchymal Stem Cells Conditioned Medium and Methods of Generating and Using the Same
HK1206058A1 (en) 2012-03-07 2015-12-31 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
KR20160027217A (ko) 2012-05-23 2016-03-09 에프. 호프만-라 로슈 아게 내배엽 및 간세포를 수득하고 사용하는 조성물 및 방법
ES3028090T3 (en) 2012-05-25 2025-06-18 Univ California Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
EP3450544A1 (en) * 2012-06-08 2019-03-06 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endodrine cells
JP2014082956A (ja) 2012-10-19 2014-05-12 Somar Corp 細胞培養基材、およびそれを用いた細胞培養方法並びに多能性幹細胞の分化誘導方法
AU2013248265B2 (en) * 2012-11-08 2018-11-01 Viacyte, Inc. Scalable primate pluripotent stem cell aggregate suspension culture and differentiation thereof
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
RU2687379C2 (ru) 2012-12-31 2019-05-13 Янссен Байотек, Инк. Суспендирование и кластеризация плюрипотентных клеток человека с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
RU2684215C2 (ru) 2012-12-31 2019-04-04 Янссен Байотек, Инк. Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток
EP2938724B1 (en) 2012-12-31 2020-10-28 Janssen Biotech, Inc. Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells
CN103087916B (zh) * 2013-01-17 2014-04-16 黑龙江省重生生物科技有限公司 一种涂覆有Matrigel的细胞培养板及其制备方法和应用
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
JP2016520291A (ja) 2013-03-14 2016-07-14 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ｉｎｖｉｔｒｏでの内側神経節隆起前駆細胞の作製
CA2910394A1 (en) 2013-04-26 2014-10-30 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
CN105473134B (zh) 2013-06-05 2021-04-27 再生疗法有限公司 用于哺乳动物物种中诱导性组织再生的组合物和方法
EP3008168B1 (en) 2013-06-11 2020-02-19 President and Fellows of Harvard College Sc- cells and compositions and methods for generating the same
WO2015069736A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 The Mclean Hospital Corporation METHODS FOR EFFICIENT GENERATION OF GABAergic INTERNEURONS FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
CN105992816B (zh) 2013-11-16 2018-04-17 泰尔茂比司特公司 生物反应器中的细胞扩增
AU2014350051A1 (en) 2013-11-18 2016-07-07 Crispr Therapeutics Ag CRISPR-Cas system materials and methods
WO2015089277A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
US11078462B2 (en) 2014-02-18 2021-08-03 ReCyte Therapeutics, Inc. Perivascular stromal cells from primate pluripotent stem cells
CN106232800B (zh) 2014-03-25 2020-07-03 泰尔茂比司特公司 介质的被动替代
US11051900B2 (en) 2014-04-16 2021-07-06 Viacyte, Inc. Tools and instruments for use with implantable encapsulation devices
WO2015175307A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Janssen Biotech, Inc. Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
US10240127B2 (en) 2014-07-03 2019-03-26 ReCyte Therapeutics, Inc. Exosomes from clonal progenitor cells
EP3174975B1 (en) 2014-07-31 2020-09-16 Université d'Aix-Marseille Method for generating neuronal and muscular cells
WO2016028880A1 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Cellular Dynamics International, Inc. Neural networks formed from cells derived from pluripotent stem cells
EP3184643B1 (en) * 2014-08-20 2020-02-19 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation Method for determining state of differentiation of stem cells, and novel differentiation marker used therefor
WO2016036754A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for rna-directed target dna modification
CN106715676A (zh) 2014-09-26 2017-05-24 泰尔茂比司特公司 按计划供养
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
US10190096B2 (en) 2014-12-18 2019-01-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for generating stem cell-derived β cells and uses thereof
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
AU2016339053A1 (en) 2015-09-24 2018-04-12 Crispr Therapeutics Ag Novel family of RNA-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications
EP3359647A1 (en) 2015-10-08 2018-08-15 Neurona Therapeutics Inc. Neural precursor cell populations and uses thereof
CN108463548B (zh) 2015-10-30 2023-04-18 加利福尼亚大学董事会 由干细胞产生t细胞的方法及使用所述t细胞的免疫治疗方法
CN115433707A (zh) 2015-12-07 2022-12-06 再生疗法有限公司 用于重新衍生不同的多能干细胞衍生的褐色脂肪细胞的方法
US11014957B2 (en) * 2015-12-21 2021-05-25 Realseq Biosciences, Inc. Methods of library construction for polynucleotide sequencing
WO2017147536A1 (en) 2016-02-24 2017-08-31 The Rockefeller University Embryonic cell-based therapeutic candidate screening systems, models for huntington's disease and uses thereof
CN116121189A (zh) 2016-03-30 2023-05-16 阿斯特利亚斯生物治疗股份公司 少突胶质细胞祖细胞组合物
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
IL263224B2 (en) 2016-05-25 2024-03-01 Inst Nat Sante Rech Med Use of a HISTONE DEACETYLASE inhibitor and a population of activation-free pluripotent cells for cancer treatment
EP3464565A4 (en) 2016-05-25 2020-01-01 Terumo BCT, Inc. CELL EXPANSION
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US20190330603A1 (en) 2016-06-17 2019-10-31 Genesis Technologies Limited Crispr-cas system, materials and methods
CN114058599A (zh) * 2016-07-25 2022-02-18 瑞普利金公司 交替切向流快速收获
EP3522936A4 (en) 2016-10-10 2020-06-24 The National Institute for Biotechnology in the Negev, Ltd. Non-cytotoxic modified cells and use thereof
US10828330B2 (en) 2017-02-22 2020-11-10 IO Bioscience, Inc. Nucleic acid constructs comprising gene editing multi-sites and uses thereof
US12234441B2 (en) 2017-03-31 2025-02-25 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
EP3707256A1 (en) 2017-11-09 2020-09-16 CRISPR Therapeutics AG Self-inactivating (sin) crispr/cas or crispr/cpf1 systems and uses thereof
AU2018370029B2 (en) 2017-11-15 2024-11-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Islet cell manufacturing compositions and methods of use
JP7408036B2 (ja) 2017-11-24 2024-01-05 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ガンを処置するための方法及び組成物
KR102121042B1 (ko) * 2017-12-06 2020-06-09 이정복 조류의 에그로부터 분리한 세포인 배반엽 전분화능세포, 신경줄기세포, 배아섬유아세포 컨디션드 배지를 유효성분으로 하는 세포 증식, 피부재생 및 주름 개선용 배지 조성물
AU2018386301A1 (en) 2017-12-14 2020-06-18 Bayer Healthcare Llc Novel RNA-programmable endonuclease systems and their use in genome editing and other applications
MA52074A (fr) 2018-03-19 2021-01-27 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations
EP3784232A4 (en) * 2018-04-23 2022-01-05 AgeX Therapeutics, Inc. IMPROVED METHODS FOR INDUCING TISSUE REGENERATION AND SENOLYSIS IN Mammalian Cells
EP3572512A1 (en) 2018-05-24 2019-11-27 B.R.A.I.N. Ag A method for engineering a protein
EP3833383A1 (en) 2018-08-06 2021-06-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for treating cancers
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
EP3887513A2 (en) 2018-11-28 2021-10-06 CRISPR Therapeutics AG Optimized mrna encoding cas9 for use in lnps
EP3876953A4 (en) * 2018-12-11 2022-10-19 ERBI Biosystems, Inc. PROCESS FOR MANUFACTURING CELL-BASED PRODUCTS USING SMALL VOLUME PERFUSION PROCESSES
CN109628404B (zh) * 2018-12-18 2020-04-28 浙江大学 猪皮下脂肪前体细胞永生化细胞系的构建方法及用途
CN120060141A (zh) 2019-01-23 2025-05-30 阿斯特里亚斯生物疗法股份有限公司 来自人多能干细胞的背源性少突胶质祖细胞
CN116732004A (zh) 2019-03-07 2023-09-12 加利福尼亚大学董事会 CRISPR-Cas效应子多肽和其使用方法
WO2020209959A1 (en) 2019-03-08 2020-10-15 Crispr Therapeutics Ag Nucleobase-editing fusion protein systems, compositions, and uses thereof
MA55297A (fr) 2019-03-12 2022-01-19 Bayer Healthcare Llc Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable haute fidélité et leurs utilisations
US20210047649A1 (en) 2019-05-08 2021-02-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Crispr/cas all-in-two vector systems for treatment of dmd
EP4386081A3 (en) 2019-05-21 2024-10-16 President and Fellows of Harvard College Endocrine differentiation-inducing molecule
JP2022539169A (ja) 2019-06-25 2022-09-07 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ベータ細胞の分化の向上
WO2021030424A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Semma Therapeutics, Inc. Pancreatic differentiation
WO2021041316A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Sana Biotechnology, Inc. Cd24 expressing cells and uses thereof
JP2023520997A (ja) 2020-03-25 2023-05-23 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 神経学的障害及び神経学的病態の処置のための低免疫原性神経細胞
WO2021250058A2 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Bayer Aktiengesellschaft CRISPR-Cas12a DIRECTED RANDOM MUTAGENESIS AGENTS AND METHODS
KR20230074718A (ko) 2020-08-13 2023-05-31 사나 바이오테크놀로지, 인크. 저면역원성 세포로 감작된 환자를 치료하는 방법 및 관련 방법 및 조성물
CN114250195A (zh) 2020-09-24 2022-03-29 中国科学院动物研究所 活化态多能干细胞及其制备方法和应用
CN112275337B (zh) * 2020-10-29 2022-03-18 上海荧辉医疗器械有限公司 一种微流控芯片及细胞筛选装置和方法
US12043823B2 (en) 2021-03-23 2024-07-23 Terumo Bct, Inc. Cell capture and expansion
CN112921000B (zh) * 2021-03-24 2023-01-24 华中农业大学 一种构建胶质瘤体外3d培养和分析体系的方法及应用
EP4314246A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Liver organoid manufacturing methods, liver organoids obtained with the same, and uses thereof
CA3216537A1 (en) 2021-04-11 2022-10-20 President And Fellows Of Harvard College Cardiomyocytes and compositions and methods for producing the same
JPWO2022230919A1 (ja) * 2021-04-28 2022-11-03
BR112023024434A2 (pt) 2021-05-27 2024-02-20 Sana Biotechnology Inc Células hipoimunogênicas que compreendem hla-e ou hla-g geneticamente modificadas
EP4101928A1 (en) 2021-06-11 2022-12-14 Bayer AG Type v rna programmable endonuclease systems
JP2024526062A (ja) 2021-06-11 2024-07-17 バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト Ｖ型ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系
WO2023287827A2 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Sana Biotechnology, Inc. Altered expression of y chromosome-linked antigens in hypoimmunogenic cells
JP2024534771A (ja) 2021-08-11 2024-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 補体媒介性炎症反応を低減するための同種異系細胞療法のための遺伝子改変細胞
AU2022325955A1 (en) 2021-08-11 2024-02-08 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy to reduce instant blood mediated inflammatory reactions
JP2024532772A (ja) 2021-08-11 2024-09-10 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 低免疫原性細胞における遺伝子発現を変化させるための誘導性システム
US20240358761A1 (en) 2021-08-11 2024-10-31 Sana Biotechnology, Inc. Genetically modified cells for allogeneic cell therapy
EP4144841A1 (en) 2021-09-07 2023-03-08 Bayer AG Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof
AU2022344320A1 (en) 2021-09-10 2024-03-07 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Compositions of induced pluripotent stem cell-derived cells and methods of use thereof
AU2022371442A1 (en) 2021-10-21 2024-04-18 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Hypoimmune cells
CA3235390A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Deepika Rajesh Dopaminergic neurons comprising mutations and methods of use thereof
WO2023077140A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived pancreatic islet differentiation
EP4453191A1 (en) 2021-12-23 2024-10-30 Bayer Aktiengesellschaft Novel small type v rna programmable endonuclease systems
US12209689B2 (en) 2022-02-28 2025-01-28 Terumo Kabushiki Kaisha Multiple-tube pinch valve assembly
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
EP4536818A1 (en) 2022-06-10 2025-04-16 Bayer Aktiengesellschaft Novel small type v rna programmable endonuclease systems
WO2025054202A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Sana Biotechnology, Inc. Method of screening a sample comprising a transgene with a unique barcode
WO2025126208A1 (en) 2023-12-12 2025-06-19 Accellta Ltd. Media for maintaining, differentiating, or both, pluripotent stem cells

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4491632A (en) 1979-10-22 1985-01-01 The Massachusetts General Hospital Process for producing antibodies to hepatitis virus and cell lines therefor
US4501815A (en) 1979-10-29 1985-02-26 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Article for culturing differentiated cells
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4296205A (en) 1980-02-22 1981-10-20 Verma Dharmvir S Cell culture and continuous dialysis flask and method
EP0043718B1 (en) 1980-07-07 1984-11-28 National Research Development Corporation Improvements in or relating to cell lines
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4423145A (en) 1981-05-07 1983-12-27 Stampfer Martha R Enhanced growth medium and method for culturing human mammary epithelial cells
US4493795A (en) 1983-10-17 1985-01-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Synthetic peptide sequences useful in biological and pharmaceutical applications and methods of manufacture
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4829000A (en) * 1985-08-30 1989-05-09 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Reconstituted basement membrane complex with biological activity
US5104795A (en) 1985-11-13 1992-04-14 Zoma Corporation Shortened phosphoglycerate kinase promoter
GB2197915B (en) 1986-11-19 1990-11-14 Rolls Royce Plc Improvements in or relating to fluid bearings
US6022742A (en) 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
WO1990001541A1 (en) 1988-08-04 1990-02-22 Amrad Corporation Limited In vitro propagation of embryonic stem cells
CA1340288C (en) 1988-09-02 1998-12-29 Robert Charles Ladner Generation and selection of novel binding proteins
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5411883A (en) * 1989-12-26 1995-05-02 Somatix Therapy Corporation Proliferated neuron progenitor cell product and process
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5635387A (en) * 1990-04-23 1997-06-03 Cellpro, Inc. Methods and device for culturing human hematopoietic cells and their precursors
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
AU9115891A (en) 1990-11-14 1992-06-11 Siska Diagnostics, Inc. Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
US5766855A (en) 1991-05-24 1998-06-16 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity and sequence specificity
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
ATE239072T1 (de) 1991-06-18 2003-05-15 Arnold I Caplan Menschliche mesenchym-stammzellen aus dem mark und monoklonale antikörper spezifisch gegen diese zellen
AU2228592A (en) 1991-06-24 1993-01-25 Pacific Biomedical Research, Inc. Hormone-secreting cells maintained in long-term culture
ATE240389T1 (de) 1991-07-08 2003-05-15 Neurospheres Holdings Ltd Auf wachstumsfaktoren reagierende neurale vorläuferzellen, die in vitro vermehrt werden können.
US5851832A (en) 1991-07-08 1998-12-22 Neurospheres, Ltd. In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny
US5981165A (en) 1991-07-08 1999-11-09 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro induction of dopaminergic cells
JPH07501206A (ja) 1991-08-07 1995-02-09 イェシバ・ユニバーシティ 前駆肝細胞の増殖
US5168065A (en) * 1991-11-27 1992-12-01 The Babcock & Wilcox Company Forced oxidation monitoring and control system
US5332672A (en) 1991-12-02 1994-07-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prevention of ES cell differentiation by ciliary neurotrophic factor
WO1994000470A1 (en) 1992-06-30 1994-01-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology DEVELOPMENTAL EMBRYONIC MOUSE cDNA LIBRARIES
US6114114A (en) 1992-07-17 2000-09-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Comparative gene transcript analysis
US5840484A (en) 1992-07-17 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Comparative gene transcript analysis
US5693482A (en) 1992-07-27 1997-12-02 California Institute Of Technology Neural chest stem cell assay
US5849553A (en) 1992-07-27 1998-12-15 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
AU4995193A (en) 1992-08-04 1994-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells
AU6136394A (en) 1992-10-06 1994-04-26 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Long-term proliferation of primordial germ cells
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
JPH09502421A (ja) 1992-12-02 1997-03-11 シエル・インターナシヨナル・リサーチ・マートシヤツピイ・ベー・ブイ アゾキシシアノベンゼン誘導体
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
US5766948A (en) 1993-01-06 1998-06-16 The Regents Of The University Of California Method for production of neuroblasts
US5362642A (en) 1993-02-10 1994-11-08 Hyclone Laboratories Methods and containment system for storing, reconstituting, dispensing and harvesting cell culture media
GB9308271D0 (en) 1993-04-21 1993-06-02 Univ Edinburgh Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5405772A (en) 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US5578475A (en) 1993-07-12 1996-11-26 Life Technologies, Inc. Composition and methods for transfecting eukaryotic cells
US6686198B1 (en) * 1993-10-14 2004-02-03 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5643761A (en) 1993-10-27 1997-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for generating a subtracted cDNA library and uses of the generated library
US5602301A (en) 1993-11-16 1997-02-11 Indiana University Foundation Non-human mammal having a graft and methods of delivering protein to myocardial tissue
US6015671A (en) 1995-06-07 2000-01-18 Indiana University Foundation Myocardial grafts and cellular compositions
US5534404A (en) 1993-12-10 1996-07-09 Cytotherapeutics, Inc. Glucose responsive insulin secreting β-cell lines and method for producing same
US5639618A (en) 1994-05-13 1997-06-17 Plurion, Inc. Method of isolating a lineage specific stem cell in vitro
US5583016A (en) 1994-07-07 1996-12-10 Geron Corporation Mammalian telomerase
US5914268A (en) 1994-11-21 1999-06-22 National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
US5874301A (en) 1994-11-21 1999-02-23 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Embryonic cell populations and methods to isolate such populations
JPH10510702A (ja) 1994-12-09 1998-10-20 モスカ，ジョセフ，ディー． ヒトおよび非ヒト霊長類の多能性幹、前駆および成熟骨髄細胞の維持、増殖および分化のための系
US5843780A (en) * 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5552524A (en) 1995-01-31 1996-09-03 Eli Lilly And Company Anti-obesity proteins
US5919449A (en) 1995-05-30 1999-07-06 Diacrin, Inc. Porcine cardiomyocytes and their use in treatment of insufficient cardiac function
US6051429A (en) 1995-06-07 2000-04-18 Life Technologies, Inc. Peptide-enhanced cationic lipid transfections
AU723163B2 (en) 1995-06-07 2000-08-17 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6238908B1 (en) 1995-06-07 2001-05-29 Aastrom Biosciences, Inc. Apparatus and method for maintaining and growth biological cells
US5968506A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Geron Corporation Purified telomerase
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
US5961165A (en) 1995-09-27 1999-10-05 Nissan Motor Co., Ltd. Outer door handle structure for vehicular door
US5922597A (en) 1995-11-14 1999-07-13 Regents Of The University Of Minnesota Ex vivo culture of stem cells
GB9807935D0 (en) 1998-04-14 1998-06-10 Univ Edinburgh Lineage specific cells and progenitor cells
FR2744133A1 (fr) 1996-01-30 1997-08-01 Imedex Procede de culture de cellules a potentiel angiogenique pour induire la morphogenese vasculaire desdites cellules, modeles in vitro de morphogenese vasculaire ainsi obtenus, et leurs applications notamment au criblage de drogues
CA2246712A1 (en) 1996-02-16 1997-08-21 The University Of Edinburgh Cytokine expressed by dia/lif-deficient embryonic stem cells for the inhibition of differentiation
US5869243A (en) 1996-03-05 1999-02-09 Rhode Island Hospital Immortalized hepatocytes
US5753506A (en) 1996-05-23 1998-05-19 Cns Stem Cell Technology, Inc. Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals
WO1997047734A1 (en) 1996-06-14 1997-12-18 The Regents Of The University Of California In vitro derivation and culture of primate pluripotent stem cells and therapeutic uses thereof
US5856136A (en) 1996-07-03 1999-01-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human stem cell antigens
US5705308A (en) 1996-09-30 1998-01-06 Eastman Kodak Company Infrared-sensitive, negative-working diazonaphthoquinone imaging composition and element
DE69739497D1 (de) 1996-10-01 2009-08-27 Geron Corp Menschlische Telomerase katalytische Untereinheit
JP3441899B2 (ja) 1996-11-01 2003-09-02 理化学研究所 完全長ｃＤＮＡライブラリーの作成方法
WO1998030678A1 (en) * 1997-01-07 1998-07-16 Steindler Dennis A Isolated mammalian neural stem cells, methods of making such cells, and methods of using such cells
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
GB9701492D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Univ Edinburgh Transfection of embryonic stem cells
US6331406B1 (en) 1997-03-31 2001-12-18 The John Hopkins University School Of Medicine Human enbryonic germ cell and methods of use
US6090622A (en) 1997-03-31 2000-07-18 The Johns Hopkins School Of Medicine Human embryonic pluripotent germ cells
US6332672B1 (en) * 1997-04-30 2001-12-25 Seiko Epson Corporation Ink jet recording head including a cap member sealing piezoelectric vibrators
US6361996B1 (en) 1997-05-07 2002-03-26 University Of Utah Research Foundation Neuroepithelial stem cells and glial-restricted intermediate precursors
DE19727962A1 (de) 1997-07-02 1999-01-14 Juergen Hescheler Fluoreszierende Proteine als zelltypspezifische Reporter
JP4371179B2 (ja) 1997-07-04 2009-11-25 ユニバーシティー オブ ユタ リサーチ ファンデーション 系列限定ニューロン前駆体
US6235527B1 (en) 1997-11-29 2001-05-22 University Of Utah Research Foundation Lineage restricted glial precursors from the central nervous system
ATE307195T1 (de) 1997-07-14 2005-11-15 Osiris Therapeutics Inc Herzmuskelregenerierung unter verwendung mesenchymaler stammzellen
US7144997B2 (en) 1997-07-24 2006-12-05 Curis, Inc. Vertebrate embryonic patterning-inducing proteins, compositions and uses related therto
AU9200298A (en) 1997-08-22 1999-03-16 Yale University A process to study changes in gene expression in stem cells
US5968829A (en) 1997-09-05 1999-10-19 Cytotherapeutics, Inc. Human CNS neural stem cells
WO1999020741A1 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
WO1999027113A1 (en) 1997-11-26 1999-06-03 Geron Corporation Mouse telomerase reverse transcriptase
WO1999042122A1 (en) 1998-02-19 1999-08-26 University Of Southern California Method of promoting embryonic stem cell proliferation
JP2002504362A (ja) 1998-02-27 2002-02-12 メディカル・カレッジ・オブ・ハンプトン・ローズ 移植治療のための前駆胚幹細胞からの細胞および組織の誘導体
WO1999053021A1 (en) 1998-04-09 1999-10-21 Bresagen Limited Cell differentiation/proliferation and maintenance factor and uses thereof
GB9809178D0 (en) 1998-04-29 1998-07-01 Univ Edinburgh Nuclear reprogramming of somatic cells
US5958767A (en) 1998-08-14 1999-09-28 The Children's Medical Center Corp. Engraftable human neural stem cells
AU755849B2 (en) 1998-09-22 2002-12-19 Neuralstem Biopharmaceuticals, Ltd. Stable neural stem cell lines
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6087168A (en) 1999-01-20 2000-07-11 Cedars Sinai Medical Center Conversion of non-neuronal cells into neurons: transdifferentiation of epidermal cells
EP1144671B1 (en) 1999-02-12 2007-11-07 StemCells, Inc. Enriched central nervous system cell populations
US6238922B1 (en) 1999-02-26 2001-05-29 Stemcells, Inc. Use of collagenase in the preparation of neural stem cell cultures
CA2366929A1 (en) 1999-03-17 2000-09-21 The University Of Tennessee Research Corporation Making and using microclonal uncloned cdna libraries
US6372494B1 (en) 1999-05-14 2002-04-16 Advanced Tissue Sciences, Inc. Methods of making conditioned cell culture medium compositions
IL147179A0 (en) 1999-06-30 2002-08-14 Advanced Cell Tech Inc Cytoplasmic transfer to de-differentiate recipient cells
WO2001046384A2 (en) 1999-12-23 2001-06-28 Cornell Research Foundation, Inc. A method for isolating and purifying multipotential neural progenitor cells and multipotential neural progenitor cells
US20050042749A1 (en) 2001-05-16 2005-02-24 Carpenter Melissa K. Dopaminergic neurons and proliferation-competent precursor cells for treating Parkinson's disease
US6602711B1 (en) 2000-02-21 2003-08-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of making embryoid bodies from primate embryonic stem cells
EP1263932A4 (en) 2000-03-14 2004-06-23 Es Cell Int Pte Ltd EMBRYONIC CELLS AND NEURONAL STEM CELLS DERIVED THEREFROM
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
AU2001259323A1 (en) 2000-05-01 2001-11-12 Sang-Hun Lee Derivation of midbrain dopaminergic neurons from embryonic stem cells
US8273570B2 (en) 2000-05-16 2012-09-25 Riken Process of inducing differentiation of embryonic cell to cell expressing neural surface marker using OP9 or PA6 cells
US7250294B2 (en) * 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
WO2001088104A2 (en) * 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
CA2411914C (en) 2000-06-20 2012-08-21 Es Cell International Pte Ltd Method of controlling differentiation of embryonic stem (es) cells by culturing es cells in the presence of bmp-2 pathway antagonists
JP3660601B2 (ja) 2001-03-30 2005-06-15 独立行政法人科学技術振興機構 胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法
WO2002086106A1 (en) 2001-04-23 2002-10-31 Nsgene A/S Method and culture medium for producing neural cells expressing tyrosine hydroxylase
US20030113910A1 (en) 2001-12-18 2003-06-19 Mike Levanduski Pluripotent stem cells derived without the use of embryos or fetal tissue
CA2488429C (en) 2002-06-05 2013-05-07 Benjamin Eithan Reubinoff Generation of neural stem cells from undifferentiated human embryonic stem cells
US7285415B2 (en) 2002-07-11 2007-10-23 The Regents Of The University Of California Oligodendrocytes derived from human embryonic stem cells for remyelination and treatment of spinal cord injury
CA2589343A1 (en) * 2004-12-01 2006-06-08 Stem Cell Therapeutics Corporation Platelet-derived growth factor-responsive neural precursor cells and progeny thereof

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005085426A1 (ja) * 2004-03-04 2005-09-15 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. 無フィ−ダ−分化用培地及び霊長類動物胚性幹細胞からの無フィ−ダ−分化方法
JP2007529227A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 ジェロン・コーポレーション 再生医学に適した高純度心筋細胞調製物を作製するための方法
JP2008500065A (ja) * 2004-05-21 2008-01-10 ウィセル リサーチ インスティテュート インコーポレイテッド 胚性幹細胞のフィーダー非依存性長期培養
JP2012228263A (ja) * 2004-05-21 2012-11-22 Wicell Research Inst Inc 胚性幹細胞のフィーダー非依存性長期培養
JP2008543338A (ja) * 2005-06-22 2008-12-04 ジェロン・コーポレーション 心筋細胞系列細胞への霊長類多能性幹細胞の分化
JP2007306922A (ja) * 2006-05-16 2007-11-29 Becton Dickinson & Co 細胞培養用の細胞外マトリックスコーティングされた表面
WO2013077423A1 (ja) * 2011-11-25 2013-05-30 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養方法
JPWO2013077423A1 (ja) * 2011-11-25 2015-04-27 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞の培養方法

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