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JP2003526330A - ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αスプライス改変体 - Google Patents

ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αスプライス改変体

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Publication number
JP2003526330A
JP2003526330A JP2000601161A JP2000601161A JP2003526330A JP 2003526330 A JP2003526330 A JP 2003526330A JP 2000601161 A JP2000601161 A JP 2000601161A JP 2000601161 A JP2000601161 A JP 2000601161A JP 2003526330 A JP2003526330 A JP 2003526330A
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JP
Japan
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neutrokine
polypeptide
amino acid
seq
sequence
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Application number
JP2000601161A
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クレイグ エイ． ローゼン，
ジアン ニ，
レインハード エブナー，
グオ−リアン ユ，
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Human Genome Sciences Inc
Original Assignee
Human Genome Sciences Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＴＮＦタンパク質ファミリーのメンバーである新規のニュートロカイン−αタンパク質およびニュートロカイン−αＳＶタンパク質に関する。詳細には、細胞外ドメインの可溶性形態を含む、ヒトニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。これらのポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびそれらを生成する組換え方法として提供される。本発明はさらに、ニュートロカイン−α活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。また、免疫系関連障害を検出するための診断方法、および免疫系関連障害を処置するための治療方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規のサイトカイン（これは、ニュートロカインαタンパク質（「
ニュートロカインα」）と称されている）に関する。さらに、ニュートロカイン
αの見かけのスプライシング改変体が同定され、ニュートロカインαＳＶと名付
けられた。特定の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαポリペプチ
ドおよびニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする核酸を提供する。さ
らなる実施形態において、ニュートロカインαポリペプチドおよびニュートロカ
インαＳＶポリペプチドはまた、ベクター、宿主細胞、およびこれを産生する組
換え方法として提供される。
【０００２】 （関連技術） ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）および（ＴＮＦ−β、またはリンホトキシン
）は、ポリペプチドメディエーターの幅広いクラスの関連メンバーであり、この
クラスはインターフェロン、インターロイキン、および増殖因子を含み、総称し
てサイトカインと呼ばれる（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．およびＣｅｒａｍｉ，Ａ．Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：６２５−６５５（１９８９））。サ
イトカインレセプターの配列分析は、以下の膜タンパク質のいくつかのサブファ
ミリーを定義する：（１）Ｉｇスーパーファミリー、（２）ヘマトポエチン（サ
イトカインレセプタースーパーファミリー）、および（３）腫瘍壊死因子（ＴＮ
Ｆ）／神経成長因子（ＮＧＦ）レセプタースーパーファミリー（ＴＮＦスーパー
ファミリーの概説については、ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ，Ｂｌｏｏｄ８５（
１２）：３３７８−３４０４（１９９５）、ならびにＡｇｇａｒｗａｌおよびＮ
ａｔａｒａｊａｎ，Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．，７（２）：９３−
１２４（１９９６）を参照のこと）。ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミ
リーは、少なくとも１０の異なったタンパク質を含む。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗ
ｅｒ、前出。これらのレセプターのリガンドは同定され、そして少なくとも２つ
のサイトカインスーパーファミリーに属する。ＧｒｕｓｓおよびＤｏｗｅｒ、前
出。
【０００３】 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの混合物）は、もともとその抗腫
瘍活性の結果として発見されたが、現在は、いくつかの形質転換細胞株のアポト
ーシス、細胞の活性化および細胞増殖の媒介を含む、ならびにまた免疫調節およ
び炎症における重要な役割を果たすような、多数の生物学的活性が可能な多面的
なサイトカインとして認識されている。
【０００４】 今日まで、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの既知のメンバーには、ＴＮＦ
−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、ＬＴ−β、ＯＸ４０Ｌ、Ｆａｓリガ
ンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、および４−ＩＢＢＬが含まれる。
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのリガンドは、酸性の、細胞外ドメインにお
いて約２０％の配列相同性（１２％〜３６％の範囲）を有するＴＮＦ様分子であ
り、そして三量体／多量体複合体である生物学的活性形態を有する膜結合形態と
して主に存在する。ＴＮＦリガンドスーパーファミリーの溶解性形態は、これま
でＴＮＦ、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンドについて同定されているのみであり
（一般的な概説として、Ｇｒｕｓｓ，Ｈ．およびＤｏｗｅｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｌｏ
ｏｄ， ８５（１２）：３３７８−３４０４（１９９５）を参照のこと、これは
、本明細書中でその全体が参考として援用される）。これらのタンパク質は、細
胞増殖、活性化および分化の調節（細胞生存またはアポトーシスもしくは細胞傷
害性による細胞死の制御を含む）に関与する（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：４０７（１９９４）、およびＳｍｉｔ
ｈ，Ｃ．Ａ．，Ｃｅｌｌ ７５：９５９（１９９４））。
【０００５】 腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα；カケクチンとも称される；本明細書中以下「Ｔ
ＮＦ」）は、１７ｋＤタンパク質サブユニットの可溶性ホモ三量体としてエンド
トキシンまたは他の刺激の応答して単球およびマクロファージによって主に分泌
される（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：６９５１
−６９５４（１９８７））。ＴＮＦの膜結合２６ｋＤ前駆体形態もまた記載され
ている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ５３：４５−５３（１９８８）
）。
【０００６】 蓄積した証拠は、ＴＮＦが多面的な生物学的活性を有する調節性サイトカイン
であることを示す。これらの活性には以下が含まれる：リポタンパク質リパーゼ
合成（「カケクチン」活性）の阻害（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３１６：５５２（１９８５））、多形核白血球の活性化（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，
Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：４２２０（１９８６）；Ｐｅｒｕｓ
ｓｉａ，Ｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：７６５（１９８７））、細胞増殖
の阻害または細胞増殖の刺激（Ｖｉｌｃｅｋ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６３：６３２（１９８６）；Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｂ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３０：９４３（１９８５）；Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３８：２９１３（１９８７））、特定の形質転換細胞型における細胞傷害
性活性（Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．Ｂ．ら、前出；Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ
．ら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４４：８３（１９８４））、抗ウイルス活性（Ｋｏｈ
ａｓｅ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ ４５：６５９（１９８６）；Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｈ．Ｗ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８１９（１９８６））、骨再吸収刺激（Ｂｅｒｔ
ｏｌｉｎｉ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：５１６（１９８６）；Ｓａｋ
ｌａｔｖａｌａ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５４７（１９８６））、コラゲ
ナーゼおよびプロスタグランジンＥ２産生の刺激（Ｄａｙｅｒ，Ｊ．−Ｍ．ら、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６２：２１６３（１９８５））；および免疫調節作用（
Ｔ細胞（Ｙｏｋｏｔａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５３１（１９８
８））、Ｂ細胞（Ｋｅｈｒｌ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：７８
６（１９８７））、単球（Ｐｈｉｌｉｐ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：８６
（１９８６））、胸腺細胞（Ｒａｎｇｅｓ，Ｇ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１６７：１４７２（１９８８））の活性化、ならびに主要組織適合性複合体（Ｍ
ＨＣ）クラスＩおよびクラスＩＩ分子の細胞表面発現の刺激（Ｃｏｌｌｉｎｓ，
Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：４４６（１９
８６）；Ｐｕｊｏｌ−Ｂｏｒｒｅｌ，Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３０４（
１９８７））を含む）。
【０００７】 ＴＮＦは、以下のような組織傷害を生じるそのプロ炎症性作用について示され
ている：血管内皮細胞における凝血促進活性の誘導（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：１６８０（１９８６））、好中球およびリンパ球
の増強した接着（Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：３３
１９（１９８７））、ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞か
らの血小板活性化因子の放出の刺激（Ｃａｍｕｓｓｉ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１６６：１３９０（１９８７））。
【０００８】 最近の証拠は、ＴＮＦを、多くの感染（Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｔｏｄａｙ ９：２８（１９８８））、免疫障害、腫瘍性症状（例えば、い
くつかの悪性を伴う悪液性における）（Ｏｌｉｆｆ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ ５０：
５５５（１９８７））の病因、ならびに自己免疫症状および移植片対宿主症状（
Ｐｉｇｕｅｔ，Ｐ．−Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８
７））に関連づける。ガンおよび感染症状とのＴＮＦの関連は、しばしば宿主異
化状態に相関する。ガン患者の主な問題は体重の減少であり、通常食欲不振と関
連する。生じる大規模な衰弱は、「悪液質」として知られる（Ｋｅｒｎ，Ｋ．Ａ
．ら、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｅｎｔｅｒ．Ｎｕｔｒ．１２：２８６−２９８（１９
８８））。悪液質は、進行性の体重減少、食欲不振、および悪性増殖の応答にお
ける体重の持続性衰退を含む。従って、悪液性状態は顕著な死亡率と関連し、そ
して多数のガン死亡率の原因である。多数の研究が、ＴＮＦが、ガン、感染症状
、および他の異化状態における悪液質の重要なメディエーターであることを示唆
している。
【０００９】 ＴＮＦは、発熱、倦怠感、摂食障害、および悪液質を含む、グラム陰性敗血症
およびエンドトキシン性ショック（Ｍｉｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕ
ｒｇ．７６：６７０−６７１（１９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｓ
ｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ，４６３−４６６頁（１９
８９）；Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｓ．Ｑ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｃｌｉｎ．５：２
７−４７（１９８９））の病理生理学的結果における中心的役割を果たすと考え
られている。エンドトキシンは、強力な単球／マクロファージアクチベーターで
あり、これは、ＴＮＦの産生および分泌（Ｋｏｒｎｂｌｕｔｈ，Ｓ．Ｋ．ら、Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２５８５−２５９１（１９８６））、ならびに他の
サイトカインを刺激する。ＴＮＦは、エンドトキシンの多くの生物学的効果を模
倣し得るので、エンドトキシン関連病の臨床的徴候に応答可能な中心的メディエ
ーターであると結論付けられた。ＴＮＦおよび他の単球誘導性サイトカインは、
エンドトキシンに対する代謝性応答および神経ホルモン性応答を媒介する（Ｍｉ
ｃｈｉｅ，Ｈ．Ｒ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：１４８１−１４８６
（１９８８））。ヒトボランティアへのエンドトキシンの投与は、発熱、頻脈、
代謝速度の上昇、およびストレスホルモン放出を含むインフルエンザ様症状を伴
う急病を生じる（Ｒｅｖｈａｕｇ，Ａ．ら、Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：１６
２−１７０（１９８８））。循環性ＴＮＦの上昇したレベルはまた、グラム陰性
敗血症に罹患した患者において見い出されている（Ｗａａｇｅ，Ａ．ら、Ｌａｎ
ｃｅｔ １：３５５−３５７（１９８７）；Ｈａｍｍｅｒｌｅ，Ａ．Ｆ．ら、Ｓ
ｅｃｏｎｄ Ｖｉｅｎｎａ Ｓｈｏｃｋ Ｆｏｒｕｍ ７１５−７１８頁、（１
９８９）；Ｄｅｂｅｔｓ，Ｊ．Ｍ．Ｈ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１７
：４８９−４９７（１９８９）；Ｃａｌａｎｄｒａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．
Ｄｉｓ．１６１：９８２−９８７（１９９０））。
【００１０】 ＴＮＦの中和に指向される受動的免疫治療は、上記のようにこれらの病理状態
における増大したＴＮＦ産生および上昇したＴＮＦレベルに基づく、グラム陰性
敗血症および内毒素血症における有益な効果を有し得る。カケクチン（後にＴＮ
Ｆと同一であることが見い出された）として特徴付けられた「モジュレーター」
物質に対する抗体は、Ｃｅｒａｍｉらによって開示された（欧州特許公開０，２
１２，４８９、１９８７年３月４日）。このような抗体は、診断的免疫アッセイ
において、および細菌性感染におけるショックの治療において有用であるといわ
れた。Ｒｕｂｉｎら（欧州特許公開０，２１８，８６８、１９８７年４月２２日
）は、ヒトＴＮＦに対するモニクローナル抗体、このような抗体を分泌するハイ
ブリドーマ、このような抗体を産生する方法、ならびにＴＮＦの免疫アッセイに
おけるこのような抗体の使用を開示した。Ｙｏｎｅら（欧州特許公開０，２８８
，０８８、１９８８年１０月２６日）は、抗ＴＮＦ抗体（ｍＡｂを含む）および
症状の免疫アッセイ診断における（特に川崎病の症状および細菌感染）それらの
有用性を開示した。川崎病の症状を有する患者の体液（小児急性熱病粘膜皮膚リ
ンパ節症候群；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ａｌｌｅｒｇｙ １６：１７８（１９
６７）；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｓｈｏｎｉｃａ（Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）２
６：９３５（１９８５））は、症状の進行に関連して上昇したＴＮＦレベルを有
するといわれた（Ｙｏｎｅら、前出）。
【００１１】 他の研究者はインビトロでの活性を中和した組換えヒトＴＮＦに特異的なｍＡ
ｂを記載した（Ｌｉａｎｇ，Ｃ−Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３７；８４７−８５４（１９８６）；Ｍｅａｇｅｒ，Ａ．ら
、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３０５−３１１（１９８７）；Ｆｅｎｄｌｙら、Ｈ
ｙｂｒｉｄｏｍａ ６：３５９−３６９（１９８７）；Ｂｒｉｎｇｍａｎ，Ｔ
Ｓら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ６：４８９−５０７（１９８７）；Ｈｉｒａｉ，Ｍ
．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．９６：５７−６２（１９８７）；Ｍｏｌ
ｌｅｒ，Ａ．ら（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ２：１６２−１６９（１９９０）））。こ
れらのｍＡｂのいくつかは、ヒトＴＮＦのエピトープをマッピングし、酵素免疫
アッセイを開発する（Ｆｅｎｄｌｙら、前出；Ｈｉｒａｌら、前出；Ｍｏｌｌｅ
ｒら、前出）ため、および組換えＴＮＦの精製において補助する（Ｂｒｉｎｇｍ
ａｎら、前出）ために使用された。しかし、これらの研究は、免疫原性、特異性
の欠除、および／または薬学的適合性に起因して、ヒトにおけるインビボ診断的
使用または治療的使用のために使用され得る抗体を中和するＴＮＦを産生するた
めの基礎を提供しない。
【００１２】 中和抗血清またはＴＮＦに対するｍＡｂは、ヒト以外の哺乳動物において、有
害な生理学的変化を排除し、そして実験的な内毒症および菌血症における致死的
チャレンジ後の死を予防することが示されている。この効果は、例えば、げっ歯
類致死率アッセイにおいて、および霊長類病理学モデル系において実証されてい
る（Ｍａｔｈｉｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：１９
２５−１９３７（１９８８）；Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２
９：８６９−８７１（１９８５）；Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ
３３０：６６２−６６４（１９８７）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：３１１−３１８（１９８８）；Ｓｉｌｖａ，Ａ．Ｔ．
ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：４２１−４２７（１９９０）Ｏｐａｌ
，Ｓ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６１：１１４８−１１５２（１９
９０）；Ｈｉｎｓｈａｗ，Ｌ．Ｂ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｓｈｏｃｋ ６０：２７９−
２９２（１９９０））。
【００１３】 今日までに、ヒトにおける抗ＴＮＦ ｍＡｂ治療の経験は限られているが、有
用な治療結果が示されている（例えば、関節炎および敗血症）。例えば、Ｅｌｌ
ｉｏｔｔ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｃｌｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ
． ９：６３３−５２（１９９５）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６６：２７２−８（１９９５）；ｖａｎ ｄｅ
ｒ Ｐｏｌｌ，Ｔ．ら、Ｓｈｏｃｋ ３：１−１２（１９９５）；Ｗｈｅｒｒｙ
ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．２１：Ｓ４３６−４０（１９９３）；Ｔｒａ
ｃｅｙ Ｋ．Ｊ．ら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２１：Ｓ４１５−２２（１
９９３）を参照のこと。
【００１４】 哺乳動物の発生は、細胞の増殖および分化の両方ならびにアポトーシスの間に
おこるプログラムされた細胞死に依存する（Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａｃｈｉｅｖ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．１３：１８（１９８８））。アポトーシ
スは、自己抗原を認識する免疫胸腺細胞の破壊において重要な役割を担う。この
正常な除去プロセスの失敗は、自己免疫疾患における役割を果たし得る（Ｇａｍ
ｍｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：１９３（１９９１））。
【００１５】 Ｉｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））は、アポトーシスを媒介
し、そしてＴ細胞のクローン性欠失に関与する、細胞表面抗原、Ｆａｓ／ＣＤ２
３を記載する。Ｆａｓは、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球に加えて、成体マウス
における活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球において、ならびに胸腺、肝臓、心臓、
および肺ならびに卵巣において、発現される（Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａ
ｇａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２））。モノクローナ
ルＡｂがＦａｓに架橋される実験において、アポトーシスは誘導される（Ｙｏｎ
ｅｈａｒａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１７４７（１９８９）；Ｔｒａｕ
ｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：３０１（１９８９））。さらに、Ｆａｓへの
モノクローナルＡｂの結合は特定の条件下でＴ細胞に対して刺激性である例があ
る（Ａｌｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２２３１（１９９３）
）。
【００１６】 Ｆａｓ抗原は、４５Ｋｄの相対分子量の細胞表面タンパク質である。Ｆａｓの
ヒトおよびマウス両方の遺伝子は、Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａらによ
ってクローン化されている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１２７４（１９９２
）およびＩｔｏｈら（Ｃｅｌｌ ６６：２３３（１９９１））。これらの遺伝子
によってコードされるタンパク質は、神経成長因子／腫瘍壊死因子レセプタース
ーパーファミリー（２つのＴＮＦレセプター、低親和性神経成長因子レセプター
、ならびにＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、およびＯＸ４０を含む）に構造的相
同性を有する両方の膜貫通タンパク質である。
【００１７】 最近、Ｆａｓリガンドが記載されている（Ｓｕｄａら、Ｃｅｌｌ ７５：１１
６９（１９９３））。このアミノ酸配列は、ＦａｓリガンドがＴＮＦファミリー
に属するＩＩ型膜貫通タンパク質であることを示す。従って、Ｆａｓリガンドポ
リペプチドは、３つの主要ドメインを含む：疎水性膜貫通ドメインによって結合
された、アミノ末端での短い細胞内ドメインおよびカルボキシ末端での長い細胞
外ドメイン。Ｆａｓリガンドは脾臓細胞および胸腺細胞において発現され、Ｔ細
胞媒介性細胞傷害性と一致する。精製Ｆａｓリガンドは４０ｋＤの分子量を有す
る。
【００１８】 最近では、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用がＴ細胞の活性化後のアポトーシ
スに必要とされることが示されている（Ｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４４
（１９９５）；Ｂｒｕｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３７３：４４１（１９９５）
）。Ｔ細胞の活性化は、細胞表面上の両タンパク質を誘導する。リガンドとレセ
プター間の続く相互作用は、細胞のアポトーシスを生じる。これは、正常な免疫
応答の間の、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド相互作用によって誘導されるアポトーシス
への可能な調節的役割を支持する。
【００１９】 従って、病理学的状態に関与するＴＮＦに類似したサイトカインを提供する必
要がある。このような新規のサイトカインは、ＴＮＦ様サイトカインに関連した
障害の診断および治療のためにこれらのＴＮＦ様サイトカインを結合する新規の
抗体または他のアンタゴニストを作成するために使用され得る。
【００２０】 （発明の要旨） 本発明の１つの実施形態に従って、ニュートロカインαポリペプチドの新規な
細胞外ドメインおよびニュートロカインαＳＶポリペプチドの新規な細胞外ドメ
イン、ならびにそれらの生物学的に活性なかつ診断的または治療的に有用なフラ
グメント、アナログ、および誘導体が提供される。
【００２１】 本発明の別の実施形態に従って、ヒトのニュートロカインαまたはニュートロ
カインαＳＶ（ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにそれらの
アナログおよび生物学的に活性なかつ診断的または治療的に有用なフラグメント
、および誘導体を含む）をコードする単離された核酸分子が提供される。
【００２２】 本発明は、ＴＮＦおよび関連サイトカインに構造的に類似し、そして類似の生
物学的効果および活性を有するサイトカインおよび見かけのスプライシング改変
体をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された
核酸分子を提供する。このサイトカインは、ニュートロカインαと命名され、そ
して本発明は、少なくとも図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるアミノ酸
配列（配列番号２）または１９９６年１０月２２日に寄託されＡＴＣＣ番号９７
７６８を割り当てられたｃＤＮＡクローン（ＨＮＥＤＵ１５）によってコードさ
れるアミノ酸配列の一部を含むニュートロカインαポリペプチドを含む。寄託さ
れたニュートロカインαクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列
（これは、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に示される）は、Ｎ末端メチオニ
ン、約４６アミノ酸残基の推定細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ド
メイン、約２１３アミノ酸の推定細胞外ドメイン、および約３１ｋＤａの完全タ
ンパク質についての推定分子量を含む２８５アミノ酸残基の完全ポリペプチドを
コードするオープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ型膜貫通タンパク質
について、ニュートロカインαの可溶型は、膜貫通ドメインから切断された細胞
外ドメインのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュートロカ
インαポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した
細胞外ドメイン）を含む。
【００２３】 ニュートロカインαの見かけのスプライシング改変体は、ニュートロカインα
ＳＶと名付けられ、そして本発明は、表５Ａおよび表５Ｂ（配列番号１９）にお
けるアミノ酸配列の少なくとも一部、または１９９８年１２月１０日に寄託され
ＡＴＣＣ番号２０３５１８を割り当てられたｃＤＮＡクローン（ＨＤＰＭＣ５２
）によってコードされるアミノ酸配列を含むか、またはさもなくばそれらの配列
からなるニュートロカインαＳＶポリペプチドを含む。寄託されたニュートロカ
インαＳＶクローンの配列決定により決定されたヌクレオチド配列（これは、図
５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１８）に示される）は、Ｎ末端メチオニン、約４６
アミノ酸残基の推定細胞内ドメイン、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン、約
１９４アミノ酸の推定細胞外ドメイン、および約２９ｋＤａの完全タンパク質に
ついての推定分子量を含む２６６アミノ酸残基の完全ポリペプチドをコードする
オープンリーディングフレームを含む。他のＩＩ型膜貫通タンパク質について、
ニュートロカインＳＶαの可溶型は、膜貫通ドメインから切断された細胞外ドメ
インのすべてまたは一部、および膜貫通ドメインを欠く完全ニュートロカインα
ＳＶポリペプチドを含むポリペプチド（すなわち、細胞内ドメインに結合した細
胞外ドメイン）を含む。
【００２４】 従って、本発明の１つの実施形態は、以下からなる群から選択されるヌクレオ
チド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離され
た核酸分子を提供する：（ａ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、
またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローン
によりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する全長ニュートロカインα
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｂ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列
番号２）におけるか、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含ま
れるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５
位を有するニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインをコードする
ヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαの機能的活性（例えば、生物学的
活性）を有する（ｂ）のポリペプチドのフラグメントをコードするヌクレオチド
配列；（ｄ）ニュートロカインαの細胞内ドメインを含むポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、または
ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンにより
コードされるとおりの約１〜約４６のアミノ酸残基を構成すると推定される）；
（ｅ）ニュートロカインαの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、またはＡＴＣ
Ｃ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
されるとおりの約４７〜約７２のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｆ
）細胞外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニ
ュートロカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｇ）上
記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけるヌクレオチ
ド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２５】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）または（ｇ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なく
とも８０％、８５％、または９０％同一の、およびより好ましくは、少なくとも
９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
、（ｆ）または（ｇ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハ
イブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、
あるいはこれらのヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。ハイブリダ
イズするこのポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下ではハイブリダイズしない。
【００２６】 本発明の別の実施形態は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはそれらからなる単離された核酸分子
を提供する：（ａ）図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）におけるか、またはＡ
ＴＣＣ寄託番号２０３５１８として１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣ
Ｃ寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミノ酸
配列を有する全長ニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列；（ｂ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、または１９９８
年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡ
クローンによりコードされるとおりのアミノ酸配列７３位〜２８５位のアミノ酸
配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメインをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｃ）ニュートロカインαＳＶの細胞内ドメインを含
むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号
１９）におけるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ番号２
０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの約１〜約４
６のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｄ）ニュートロカインαＳＶの
膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（図５Ａおよ
び図５Ｂ（配列番号１９）におけるか、または１９９８年１２月１０日に寄託さ
れたＡＴＣＣ番号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる
とおりの約４７〜約７２のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｅ）細胞
外ドメインおよび細胞内ドメイン有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュート
ロカインαＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｆ）上記
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のい
ずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００２７】 本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、または（ｆ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して、少なくとも８
０％、８５％、または９０％同一の、およびより好ましくは、少なくとも９５％
、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリ
ヌクレオチド、あるいは上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、また
は（ｆ）におけるポリヌクレオチドに対してストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれ
らのヌクレオチドからなる単離された核酸分子を含む。ハイブリダイズするこの
ポリヌクレオチドは、Ａ残基またはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有す
るポリヌクレオチドに対してはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下ではハイブリダイズしない。
【００２８】 １つの実施形態において、ニュートロカインαの見かけのスプライシング改変
体は、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）に示されるか、または１９９８年１
２月１０日に寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８を付与されたｃＤ
ＮＡクローンＨＤＰＭＣ５２によりコードされるＧｌｙ−１４２〜Ｌｅｕ−２６
６のアミノ酸配列の少なくとも一部を含むか、あるいはそれらからなる。
【００２９】 さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、上記の（ａ）、（ｂ）、（
ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｆ）または（ｇ）におけるアミノ酸配列を有
するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチ
ドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか
、あるいはそれからなる。本発明のさらなる核酸の実施形態は、単離された核酸
分子に関し、その核酸分子は、ニュートロカインαポリペプチドまたはニュート
ロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含
むか、またはそれからなり、そのポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸付
加、置換、および／または欠失であるが、５０を超えないアミノ酸付加、置換、
および／または欠失、なおより好ましくは、４０を超えないアミノ酸付加、置換
、および／または欠失、なおさらに好ましくは、３０を超えないアミノ酸付加、
置換、および／または欠失、ならびになおさらにより好ましくは、２０を超えな
いアミノ酸付加、置換、および／または欠失を含む、アミノ酸配列を有する。当
然、増加する優先度の順番に、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしく
は１、または１−１００、１−５０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０
、もしくは１−５を超えないアミノ酸付加、置換、および／または欠失を含むア
ミノ酸配列を有することは、ニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロ
カインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドについ
て、非常に好ましい。保存性置換が好ましい。
【００３０】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製するための方法ならびに組換え技術によりニュートロカインαポリペプチ
ドの産生のためにこれらを使用する方法に関する。
【００３１】 本発明のさらなる実施形態に従って、組換え技術によってこのようなポリペプ
チドを産生するためのプロセスが提供され、このプロセスは、上記ポリペプチド
の発現および上記ポリペプチドの引き続く回収を促進する条件下で、組換え原核
生物宿主細胞および／または組換え真核生物宿主細胞を培養する工程を包含し、
これらの宿主細胞は、本発明のニュートロカインαまたはニュートロカインαＳ
Ｖの核酸配列を含む。
【００３２】 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、ある
いはそれらからなる単離されたニュートロカインαポリペプチドを提供する：（
ａ）図１Ａおよび図１Ｂ（すなわち、配列番号２の１−２８５位）に示されるか
、またはＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡプラ
スミドによりコードされるとおりの完全アミノ酸配列を有する完全長ニュートロ
カインαポリペプチドのアミノ酸配列；（ｂ）Ｎ末端メチオニン以外の配列番号
２に示される完全アミノ酸配列を有する全長ニュートロフィンαポリペプチドの
アミノ酸配列（すなわち、配列番号２の２位〜２８５位）；（ｃ）ニュートロカ
インαの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有する（ｂ）のポリペプチドの
フラグメント；（ｄ）図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、ＡＴＣＣ
寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコー
ドされるとおりの７３位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインα
ポリペプチドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｅ）図１Ａおよび図１Ｂ
（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロ
カインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ニュートロカイン
α細胞内ドメインのアミノ酸配列（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における
か、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミド
によってコードされるとおりのおよそ１位〜およそ４６位のアミノ酸残基を構成
すると推定される）；（ｇ）ニュートロカインα膜貫通ドメインのアミノ酸配列
（図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）におけるか、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８
を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラスミドによってコードされるとおりのお
よそ４７位〜およそ７２位のアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｈ）細
胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有するが膜貫通ドメインを欠く可溶性ニュ
ートロカインαポリペプチドのアミノ酸配列、ここで、これらのドメインの各々
は上記で定義される；および（ｉ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、
（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）のペプチドのフラグメント。本発明のポリペプチ
ドはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、
または（ｈ）に記載されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一、より好
ましくは少なくとも８５％または９０％同一、およびなおより好ましくは、９５
％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポ
リペプチド、ならびに上記の配列に対して少なくとも８０％、８５％、または９
０％の類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ
）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、または（ｈ）に記載さ
れるアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部
分のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。本
発明のニュートロカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を
有するポリペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくと
も７、少なくとも８、および好ましくは、少なくとも９、少なくとも１０、少な
くとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１
５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少な
くとも５０、およびより好ましくは、少なくとも約３０アミノ酸〜約５０のアミ
ノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプ
チドの全体のアミノ酸配列までの任意の長さでありそしてそれを含むエピトープ
保有ペプチドもまた、本発明において含まれる。
【００３３】 本発明の高度に好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）にお
ける１３４位〜２８５位のアミノ酸を有するニュートロカインαポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％
同一、およびより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、また
は１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あ
るいは、そのポリペプチドからなる、核酸分子に関する。本発明の好ましい実施
形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミ
ノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ド配列に対して、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関す
る。本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）にお
ける１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９６％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレ
オチドからなる核酸分子に関する。
【００３４】 さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２
）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％同一で
あるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリ
ヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形
態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位のアミノ
酸配列を有するニュートロカインαポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列に対して、少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含むか、あるいは、そのポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する
。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号２
）における１３４位〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカインαポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９９％同一で
あるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは、そのポリ
ヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【００３５】 本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合した上記のポリヌクレオチド
配列を含む。これらのポリヌクレオチドおよび核酸分子によってコードされるポ
リペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００３６】 本発明はさらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、ある
いはそれらからなる単離されたニュートロカインαＳＶポリペプチドを提供する
：（ａ）図５Ａおよび図５Ｂ（すなわち、配列番号１９の１位〜２６６位）に示
されるか、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３
５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるとおりの完全アミ
ノ酸配列を有する完全長ニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｂ）Ｎ末端メチオニン以外の配列番号１９に示される完全アミノ酸配列を有す
る完全長ニュートロフィンαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列
番号１９の２位〜２６６位）；（ｃ）図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）の７
３位〜２６６位のアミノ酸配列、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡ
ＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによりコードさ
れるとおりのアミノ酸配列を有するニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定
細胞外ドメインのアミノ酸配列；（ｄ）ニュートロカインαＳＶの細胞内ドメイ
ンのアミノ酸配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）のおよそ１位〜およそ
４６位のアミノ酸配列、または１９９８年１２月１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄
託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされると
おりのアミノ酸残基を構成すると推定される）；（ｅ）ニュートロカインαＳＶ
ポリペプチドの膜貫通ドメインのアミノ酸配列（図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号
１９）のおよそ４７位〜およそ７２位のアミノ酸残基、または１９９８年１２月
１０日に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８において含まれるｃＤＮＡク
ローンによってコードされるとおりのアミノ酸残基を構成すると推定される）；
（ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが膜貫通ドメインを欠く可溶
性ニュートロカインαＳＶポリペプチドのアミノ酸配列、ここで、これらのドメ
インの各々は上記で定義される；および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
、（ｅ）、または（ｆ）のペプチドのフラグメント。本発明のポリペプチドはま
た、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）または（ｇ）に記
載されるポリペプチドに対して少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくと
も８５％または９０％同一、およびなおより好ましくは、９５％、９６％、９７
％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、なら
びに上記の配列に対して少なくとも８０％、８５％、または９０％の類似性、お
よびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列を有するポ
リペプチドを含む。本発明のさらなる実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ
）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）に記載されるアミノ酸配列を有する
ニュートロカインαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を含
むか、あるいはそれらからなるポリペプチドに関する。本発明のニュートロカイ
ンαＳＶポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するペプチドま
たはポリペプチドは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも
７、少なくとも８、および好ましくは、少なくとも９、少なくとも１０、少なく
とも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５
、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なく
とも５０、およびより好ましくは、少なくとも約３０アミノ酸〜約５０のアミノ
酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含むが、上記の本発明のポリペプチ
ドの全体のアミノ酸配列までの任意の長さでありそしてそれを含むエピトープ保
有ペプチドもまた、本発明において含まれる。
【００３７】 本発明の特定の非限定的な実施形態は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ
）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載されるアミノ酸配列を
有するニュートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプ
チドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。他の
実施形態において、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）
、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）に記載されるアミノ酸配列を有するニュ
ートロカインαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドに特異
的に（すなわち、独特に）結合する単離された抗体を提供する。
【００３８】 本発明はさらに、本明細書中上記のようなアミノ酸配列を有するニュートロカ
インαポリペプチドまたはニュートロカインαＳＶポリペプチドに特異的に（す
なわち、独特に）結合する抗体を単離するための方法を提供する。このような抗
体は、以下に記載するように診断的および治療的に有用である。
【００３９】 本発明はまた、可溶性のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶポリペプチド（特に、ヒトのニュートロカインαポリペプチ
ドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド）ならびに／あるいは抗
ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体を含む薬
学的組成物を提供し、これらは、例えば、腫瘍の転移、細菌、ウイルス、および
他の寄生体による感染、免疫欠損、炎症性疾患、リンパ節症、自己免疫疾患、対
宿主性移植片病を処置、予防、予後判定、および／または診断するために、末梢
耐性を刺激するために、いくつかの形質転換した細胞株を破壊するために、細胞
の活性化、生存、および増殖を媒介するために、免疫調節および炎症性応答を媒
介するために、および免疫応答を増強または阻害するために、使用され得る。
【００４０】 特定の実施形態において、本発明の可溶性ニュートロカインαポリペプチドお
よび／または可溶性ニュートロカインαＳＶポリペプチド、あるいはそのアゴニ
ストが、免疫欠損（重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ常染色体
、アデノシンデアミナーゼ欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症
（ＸＬＡ）、ブルートン病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖小児性低ガ
ンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成人発症無ガンマグロブ
リン血症、遅発性発症無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低
ガンマグロブリン血症、新生児期の一過性低ガンマグロブリン血症、特定されて
いない低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全
（ＣＶＩＤ）（後天的）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過
剰のＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫不全、過剰のＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖免疫不全、選択
的ＩｇＡ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＧ欠損を伴うかまたは伴わない）、
正常なもしくは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖
欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全
、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全、新生児好中球減少
、重症先天性白血球減少症、免疫欠損を伴う胸腺リンパ形成不全症−無形成症ま
たは形成異常症、毛細血管拡張性運動失調、短四肢小人症、Ｘ連鎖リンパ増殖症
候群（ＸＬＰ）ネゼロフ症候群と組み合わせたＩｇＧを伴う免疫欠損、プリンヌ
クレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ欠損（不全リンパ
球症候群）および重得な複合型免疫欠損）または免疫欠損に関連する状態。
【００４１】 特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫不全を処置
、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４２】 特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもしくは
ポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン
血症を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。
【００４３】 別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもし
くはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合型免疫不全（
ＳＣＩＤ）を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される
。
【００４４】 別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもし
くはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット−オール
ドリッチ症候群を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与さ
れる。
【００４５】 別の特定の実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチドもし
くはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰のＩｇＭを伴うＸ
連鎖Ｉｇ不全を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与され
る。
【００４６】 別の実施形態において、ニュートロカインαアンタゴニストおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体）は
、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性
血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新生児血小板減少、自
己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳
脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば
、ＩｇＡ腎造影法）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼結膜炎、多発性内分
泌腺症、紫斑（ヘーノホ−シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティッフマ
ン症候群、自己免疫肺炎、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、お
よび自己免疫炎症性眼、自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋
本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、
（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性、自
己免疫性溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、抗コラーゲン抗体を伴う強
皮症、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アジソン病、
不妊症、一次性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症のような糸球体腎炎、水疱性類天疱
瘡、シェーグレン病、糖尿病、およびアドレナリン作用性薬物耐性（喘息または
嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）、慢性活性肝炎、原発
性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後、心臓切開症候群、
じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシー、および他の炎症性、肉
芽腫性、変性性、および萎縮性の障害を含む）または自己免疫疾患と関連する状
態を処置、予防、予後判定、および／または診断するために投与される。特定の
好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および／もしく
は抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニストを使用し
て、慢性関節リウマチが処置、予防、予後判定、および／または診断される。別
の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカインα抗体および
／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他のアンタゴニスト
を使用して、全身性エリテマトーデスが処置、予防、予後判定、および／または
診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ニュートロカイ
ンα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体ならびに／または他の
アンタゴニストを使用して、特発性血小板減少性紫斑病が処置、予防、予後判定
、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、本発明の
抗ニュートロカインα抗体および／もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体なら
びに／または他のアンタゴニストを使用して、ＩｇＡ腎症が処置、予防、予後判
定、および／または診断される。別の特定の好ましい実施形態において、抗ニュ
ートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体を使用して、
上記に引用した疾患および障害と関連する自己免疫疾患および障害および／また
は状態が、処置、予防、予後判定、および／または診断される。
【００４７】 本発明はさらに、細胞にインビトロで、細胞にエキソビボで、および細胞にイ
ンビボで、あるいは多細胞生物に投与するための、ニュートロカインαポリヌク
レオチドもしくはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチド、ニュートロカイン
αポリペプチドもしくはニュートロカインαポリペプチド、および／または抗ニ
ュートロカインα抗体もしくは抗ニュートロカインαＳＶ抗体を含有する組成物
を提供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置のため
に、宿主生物中でニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカ
インαＳＶポリペプチドの発現のために、ニュートロカインαポリヌクレオチド
および／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドを含む。最も好ましい
実施形態において、本発明の組成物は、免疫不全および／または免疫不全に関連
する状態の処置のために、宿主生物中でニュートロカインαポリペプチドおよび
／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの発現のために、ニュートロカイ
ンαポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチド
を含む。この点において、ニュートロカインα遺伝子またはニュートロカインα
ＳＶ遺伝子の異常な内因性活性に関連する機能不全の処置のためのヒト患者にお
ける発現（例えば、Ｂ細胞の数を増大させることまたはＢ細胞の寿命を増加させ
ることによって正常なＢ細胞機能を増強させるための発現）が特に好ましい。
【００４８】 本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに
よって誘導される細胞応答を増強または阻害し得る化合物を同定するためのスク
リーニング方法を提供する。この方法は、ニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶを発現する細胞と候補化合物とを接触させる工程、細胞応
答をアッセイする工程、および標準細胞応答に対する細胞応答を比較する工程を
包含し、接触が候補化合物の非存在下で行われた場合に標準がアッセイされる；
それによって、標準よりも高い増加した細胞応答は、その化合物がアゴニストで
あることを示し、そして標準よりも減少した細胞応答は、その化合物がアンタゴ
ニストであることを示す。
【００４９】 別の実施形態において、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュー
トロカインαＳＶレセプターを同定するための方法、ならびにこのようなレセプ
ターを使用するアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッ
セイが提供される。このアッセイは、候補化合物が、ニュートロカインαレセプ
ターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターに結合するニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶに対して有する効果を決定する工
程を含む。特に、この方法は、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶレセプターを、本発明のニュートロカインαポリペプチド
および／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドならびに候補化合物と接触
させる工程、およびニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカ
インαＳＶレセプターに結合するニュートロカインαポリペプチドおよび／また
はニュートロカインαＳＶポリペプチドが、候補化合物の存在によって増加した
かまたは減少したかを決定する。アンタゴニストは、敗血症性ショック、炎症、
大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸収、慢性関節
リウマチ、悪液質（るいそうまたは栄養失調）、免疫系機能、リンパ腫、および
自己免疫障害（例えば、慢性関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス）を予
防するために使用され得る。
【００５０】 本発明者らは、ニュートロカインαが単球系列の細胞においてのみならず、腎
臓、肺、末梢白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、
胃癌、平滑筋、マクロファージ、および臍帯血組織の細胞においてもまた発現す
ることを見出した。本発明者らはさらに、ニュートロカインαＳＶが、一次樹状
細胞においてのみ高度に発現されるらしいことを見出した。これらの組織および
細胞の多数の障害について、例えば、腫瘍および腫瘍転移、細菌、ウイルスおよ
び他の寄生体の感染、免疫不全（例えば、慢性変動性免疫不全）、敗血症性ショ
ック、炎症、大脳マラリア、ＨＩＶウイルスの活性化、移植片宿主拒絶、骨再吸
収、慢性関節リウマチ、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチおよび全身性
エリテマトーデス）、および悪液質（るいそうまたは栄養失調）。有意に高いか
または低いニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子
発現のレベルは、「標準」のニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶの遺伝子発現のレベル（すなわち、そのような障害を有さない個体由来
の組織または体液におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン
αＳＶの発現レベル）と比較して、そのような障害を有する個体から採られた特
定の組織（例えば、骨髄）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、または
髄液）において検出され得ると考えられている。従って、本発明は、障害の診断
の間に有用である診断方法を提供し、その方法は：（ａ）個体の細胞または体液
におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発
現のレベルをアッセイする工程；（ｂ）そのニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルを、標準のニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルと比較する工程、そ
れによって標準の発現レベルと比較した、アッセイされたニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現のレベルにおける増加または
減少が、障害の指標である。
【００５１】 本発明のさらなる実施形態は、体内のニュートロカインαおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶの上昇した活性レベルまたは構成的レベルを必要とする個体
を処置するための方法であって、治療有効量の、本発明の単離されたニュートロ
カインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドある
いはそのアゴニストを含む組成物をそのような個体に投与する工程を包含する方
法に関する。
【００５２】 本発明のなおさらなる実施形態は、体内のニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶの活性レベルの減少を必要とする個体を処置するための
方法であって、治療有効量の、ニュートロカインαアンタゴニストおよび／また
はニュートロカインαＳＶアンタゴニストを含む組成物をそのような個体に投与
する工程を包含する方法に関する。本発明における使用のための好ましいアンタ
ゴニストは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの特異
的抗体である。
【００５３】 （詳細な説明） 本発明は、ｃＤＮＡクローンを配列決定することによって決定された、図１Ａ
および１Ｂ（配列番号２）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−
αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供
する。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列は、１９９
６年１０月２２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉ
ａ ２０１１０−２２０９に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を割り当て
られた、ＨＮＥＤＵ１５クローンの配列決定によって得られた。寄託されたクロ
ーンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に含まれる。
【００５４】 本発明はまた、ｃＤＮＡクローンを配列決定することにより決定された、図５
Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるアミノ酸配列を有するニュートロカイ
ン−αＳＶをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する
。図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチド配列は、１９９８
年１２月１０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され、そして
ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を割り当てられた、ＨＤＰＭＣ５２クローンを配
列決定することにより得られた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＳＫ（−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）
に含まれる。
【００５５】 本発明のニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶタンパク質は
、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴβ、Ｆａｓリガンド、ＡＰＲＩＬ、およびＬＴ
αのヒトｍＲＮＡの翻訳産物と配列相同性を共有している（図２Ａ、２Ｂ、およ
び７Ａを参照のこと）。上記のように、ＴＮＦαは、細胞傷害性、壊死、アポト
ーシス、同時刺激、増殖、リンパ節形成、免疫グロブリンクラススイッチ、分化
、抗ウイルス活性、ならびに接着分子および他のサイトカインおよび増殖因子の
調節において役割を果たす重要なサイトカインであると考えられる。
【００５６】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ
からのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定される
ＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記
のように決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって予測された。従って、この自動化
アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知
のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかの誤りを
含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮ
Ａ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％の同
一、より代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％の同一であ
る。実際の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他の
アプローチによってより正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のよう
に、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入ま
たは欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、そ
の結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は
、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるＤＮＡ分子によって実際
にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
【００５７】 核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分
子またはポリヌクレオチドについてはデオキシリボヌクレオチドの配列が、そし
てＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについてはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ
およびＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシリボヌクレオチド配列に
おける各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリ
ジン（Ｕ）によって置き換えられる）が意図される。
【００５８】 本明細書中で提供される情報（例えば、図１Ａおよび１Ｂのヌクレオチド配列
）を用いて、ニュートロカイン−αポリペプチドをコードする本発明の核酸分子
は、標準的なクローニングおよびスクリーニング手順（例えば、出発物質として
ｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングするための手順）を用いて得られ得る
。本発明の例として、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）において記載される核酸
分子は、好中球由来のｃＤＮＡライブラリー中で発見された。ニュートロカイン
α ｃＤＮＡの一部に対応する発現された配列タグもまた、腎臓、肺、末梢白血
球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃癌、胃の筋肉、
マクロファージ、および臍帯血組織において見出された。さらに図５Ａおよび５
Ｂで提供されるヌクレオチド情報を用いて、ニュートロカイン−αＳＶポリペプ
チドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニングおよびスクリーニ
ング手順（例えば、出発物質としてｍＲＮＡを用いてｃＤＮＡをクローニングす
るための手順）を用いて得られ得る。本発明の例として、図５Ａおよび５Ｂ（配
列番号１８）において記載される核酸分子は、初代樹状細胞由来のｃＤＮＡライ
ブラリー中で発見された。
【００５９】 ＡＴＣＣ受託番号９７７６８として寄託されたニュートロカイン−αプラスミ
ドＨＮＥＤＵ１５は、約２８５アミノ酸残基（約４６アミノ酸の推定細胞内ドメ
イン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸残基）、
約２６アミノ酸の膜貫通ドメイン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ４７
〜ほぼ７２の下線を付したアミノ酸残基）、約２１３アミノ酸の推定細胞外ドメ
イン（図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のほぼ７３〜ほぼ２８５のアミノ酸残基
））のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み；そして約
３１ｋＤａの推定分子量である。図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニ
ュートロカイン−αポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号３３９７６４と
してアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約２０％類似しそして約１０％同一であ
る。
【００６０】 ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８として寄託されたニュートロカイン−αＳＶプ
ラスミドＨＤＰＭＣ５２は、約２６６アミノ酸残基（約４６アミノ酸の推定細胞
内ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のほぼ１〜ほぼ４６のアミノ酸
残基）、約２６アミノ酸の推定膜貫通ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１
９）のほぼ４７〜ほぼ７２の下線を付したアミノ酸残基）、約１９４アミノ酸の
推定細胞外ドメイン（図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のほぼ７３〜ほぼ２６
６のアミノ酸残基））のタンパク質をコードする推定オープンリーディングフレ
ームを含み；そして約２９ｋＤａの推定分子量である。図５Ａおよび５Ｂ（配列
番号１９）に示されるニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、ＧｅｎＢａｎ
ｋに登録番号３３９７６４としてアクセスされ得るヒトＴＮＦ−αと約３３．９
％類似しそして約２２．０％同一である。
【００６１】 当業者が理解するように、上記で議論した配列決定の誤りの可能性に起因して
、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる実際の完全なニュートロカイン−α
ポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（それぞれ
、約２８５のアミノ酸および約２６６アミノ酸を含む）は、いくらかより小さい
かもしれない。特に、決定されたニュートロカイン−αおよびニュートロカイン
−αＳＶのコード配列は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）のヌクレオチド２１
０〜２１２位で、ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）のヌクレオチド６
４〜６６位でオープンリーディングフレームの翻訳のための選択的な開始コドン
として役立ち得る共通の第２のメチオニンコドンを含む。より一般的には、実際
のオープンリーディングフレームは、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）ならびに
図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるＮ末端からの第１または第２のメ
チオニンコドンのいずれかから予測される、±２０アミノ酸の範囲、より可能性
が高いのは±１０アミノ酸の範囲のどこかに存在し得る。本明細書中に記載され
るポリペプチドドメインがコンピューター分析により予測され、従って、種々の
機能的ドメインを同定するために使用される分析的基準に依存して、ニュートロ
カインαポリペプチドおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ド
メイン、細胞内ドメイン、および膜貫通ドメインの正確な「アドレス」は、僅か
に異なり得ることがさらに理解される。例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２
）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の、ニュートロカインαおよびニ
ュートロカイン−αニュートロカイン−αＳＶの細胞外ドメインの正確な位置は
、ドメインを規定するために使用した基準に依存して、僅かに変化し得る（例え
ば、アドレスは、約１〜約２０残基、より可能性が高いのは約１〜約５残基「シ
フト」し得る）。この場合、膜貫通ドメインの末端、および細胞外ドメインの開
始部は、図３および６ならびに表Ｉに示されるように、上記の位置における疎水
性アミノ酸配列の同定に基づいて予測された。いずれにしても、以下でさらに考
察されるように、本発明はさらに、完全なポリペプチドのＮ末端および／または
Ｃ末端から種々の残基が欠失されたポリペプチド（ニュートロカインαおよびニ
ュートロカイン−αＳＶのポリペプチドの可溶型の細胞外ドメインを構築する、
本明細書中に記載の細胞外ドメインのＮ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失する
ポリペプチドを含む）を提供する。
【００６２】 示されるように、本発明の核酸分子およびポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態
（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングによって得
られるか、または合成的に生成されるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であ
り得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ
は、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コ
ード鎖（アンチセンス鎖ともいわれる）であり得る。
【００６３】 「単離された」核酸分子によって、天然の環境から取り出された核酸分子（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ
分子は、本発明の目的のために単離されることが意図される。単離されたＤＮＡ
分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、ま
たは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単離され
たＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲＮＡ転
写物を含む。しかし、細胞または細胞溶解物から単離されるかまたは取り出され
たライブラリー（例えば、クローンおよびライブラリーの他のメンバーを含む均
質な溶液の形態で）からも染色体からも単離されていないライブラリー（ゲノム
ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローンに含まれ
る核酸（例えば、核型のような「染色体スプレッド（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓ
ｐｒｅａｄ）」）は、本発明の目的では「単離されて」いない。本明細書中でさ
らに議論されるように、本発明に従って単離された核酸分子は、天然で、組換え
的に、または合成的に生成され得る。
【００６４】 本発明の単離された核酸分子は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示される
ヌクレオチド配列の１４７〜１４９位に開始コドンを有するオープンリーディン
グフレーム（ＯＲＦ）を含む、あるいはこれからなるＤＮＡ分子を含む。さらに
、本発明の単離された核酸分子は、上記の配列と実質的に異なるが、遺伝暗号の
縮重に起因してなおニュートロカインαタンパク質をコードする配列を含む、あ
るいはこれからなるＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において
周知である。従って、上記の縮重改変体を生成することは、当業者にとって慣用
的である。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有
するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有する
ニュートロカインαポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはそれからな
る単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、ＡＴＣＣ受託
番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポ
リペプチドの細胞外ドメインあるいは成熟ポリペプチド配列または可溶性ポリペ
プチド配列のをコードする配列を含むか、あるいはそれからなる。
【００６５】 本発明の単離される核酸分子はまた、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示
されるヌクレオチド配列の１〜３位に開始コドンを有するオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子を含む。さらに、本発明の単離された核酸
分子は、上記の配列と実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重に起因してなおニュー
トロカインαＳＶポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはこれからなる
ＤＮＡ分子を含む。もちろん、遺伝暗号は当該分野において周知である。従って
、上記の縮重改変体を生成することは、当業者にとって慣用的である。別の実施
形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに
含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカイン
αＳＶポリペプチドをコードする配列を含む、あるいはそれからなる単離された
核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、ＡＴＣＣ受託番号２０３５
１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡによってコードされるポリペプチド
の細胞外ドメインまたは成熟可溶性ポリペプチド配列をコードする配列を含むか
、あるいはそれからなる。
【００６６】 本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）において示されるヌクレオ
チド配列もしくはＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるニ
ュートロカインα ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または上記の配列の１つに相
補的な配列を有する核酸分子を含むか、あるいはこれらからなる単離された核酸
分子を提供する。さらに、本発明は、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示さ
れるヌクレオチド配列もしくはＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミ
ドに含まれるニュートロカイン−αＳＶ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、または
上記の配列の１つに相補的な配列を有する核酸分子を含むか、あるいはこれらか
らなる単離された核酸分子を提供する。そのような単離される分子、特にＤＮＡ
分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピン
グのため、および例えばノーザンブロット分析またはウェスタンブロット分析に
よるヒト組織中のニュートロカインαおよびニュートロカイン−αＳＶの発現を
検出するためのプローブとしての（を含むが、これらに限定されない）使用を有
する。
【００６７】 １つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号２２に示される
配列を含むか、あるいはこれからなる。配列番号２２として提供される配列を、
ＧｅｎＢａｎｋから得られるいくつかの重複マウスＥＳＴ配列（ＡＩ１８２４７
２、ＡＡ４２２７４９、ＡＡ２５４０４７、およびＡＩ１２２４８５）から構築
した。ＥＳＴ配列を整列させて、配列番号２２として提供されるニュートロカイ
ン−α様ポリヌクレオチド配列を作製した。配列番号２２の翻訳から得られたア
ミノ酸配列は、配列番号２３として提供される。配列番号２２および配列番号２
３として提供される配列のフラグメント、改変体および誘導体はまた、本発明に
より包含される。
【００６８】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２７に示され
る配列ならびに／または配列番号２８に開示されるアミノ酸配列をコードする配
列、それらのフラグメント、改変体および誘導体を含むか、あるいはこれらから
なる。これらのポリヌクレオチド配列はまた、本発明により包含される。例えば
、本発明の特定の実施形態は、配列番号２８のアミノ酸６８〜２１９に対して少
なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、
または９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むか、あるいは
これらからなるポリヌクレオチドに関する。配列番号２７の翻訳から得られるア
ミノ酸配列は、配列番号２８として提供される。配列番号２８のアミノ酸配列な
らびに配列番号２８として提供される配列のフラグメント、改変体、および誘導
体を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドはまた、本発明により包含され
る。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号２８のアミノ酸６８〜２１９
に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含むか、あるいはこれら
からなるポリペプチドに関する。配列番号２７として提供される配列を有する核
酸分子を、２つの縮重プライマーを用いてシアノモロガスサル（ｃｙａｎｏｍｏ
ｌｏｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（例えば、Ｍａｃａｃａ ｉｒｕｓ）ＰＢＭＣか
らＲＴ−ＰＣＲにより得た。簡潔には、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能
）を用いることにより、製造業者のプロトコルに従って、シアノモロガスサルＰ
ＢＭＣから調製した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーとともに
標準的な方法を用いて、シアノモロガスサルＰＢＭＣ調製物から合成した。ニュ
ートロカインα特異的プライマーを、マウスニュートロカインαとヒトニュート
ロカインα分子（それぞれ、配列番号２２および１）との間の保存領域に基づい
て設計した。次いで、シアノモロガスサルニュートロカインα核酸分子を、以下
の２つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせてｃＤＮＡテンプレー
トを用いてＰＣＲにより生成した。
【００６９】
【化１】 縮重プライマー（配列番号３５および３６）の配列において、「Ｉ」は、デオキ
シイノシンまたはジデオキシイノシンを示す。
【００７０】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２９に示され
る配列ならびに／または配列番号３０に開示されるアミノ酸配列をコードする配
列、それらのフラグメント、改変体、および誘導体を含むか、あるいはこれらか
らなる。これらのポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。例えば、
本発明の特定の実施形態は、配列番号３０のアミノ酸６８〜２１９に対して少な
くとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、ま
たは９９％同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含むか、あるいはこ
れらからなるポリヌクレオチドに関する。配列番号２９の翻訳から得られるアミ
ノ酸配列は、配列番号３０に提供される。配列番号３０のアミノ酸配列ならびに
配列番号２９および配列番号３０として提供される配列のフラグメント、改変体
、および誘導体を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドはまた、本発明に
より包含される。例えば、本発明の特定の実施形態は、配列番号３０のアミノ酸
６８〜２１９に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９
６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチド配列を含むか、あ
るいはこれらからなるポリペプチドに関する。配列番号２９として提供される配
列を有する核酸分子を、２つの縮重プライマーを用いてアカゲザルＰＢＭＣから
ＲＴ−ＰＣＲにより得た。簡潔には、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手可能）
を用いることにより、製造業者のプロトコルに従って、アカゲザルＰＢＭＣから
調製した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴプライマーとともに標準的な方
法を用いて、アカゲザルＰＢＭＣ調製物から合成した。ニュートロカインα特異
的プライマーを、マウスニュートロカインαとヒトニュートロカインα分子（そ
れぞれ、配列番号２２および１）との間の保存領域に基づいて設計した。次いで
、アカゲザルニュートロカインα核酸分子を、以下の２つの縮重オリゴヌクレオ
チドプライマーと組み合わせてｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲにより生成
した。
【００７１】
【化２】 縮重プライマー（配列番号３５および３６）の配列において、「Ｉ」は、デオキ
シイノシンまたはジデオキシイノシンを示す。
【００７２】 本発明はまた、以下の関連するｃＤＮＡクローン：ＨＳＯＡＤ５５（配列番号
７）、ＨＳＬＡＨ８４（配列番号８）、およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）か
ら決定された配列番号１および配列番号１８の広範な部分に関するヌクレオチド
配列を有する核酸分子を提供する。
【００７３】 本発明はさらに、本明細書中に記載のヌクレオチド配列の部分をコードする核
酸分子、ならびに本明細書中に記載の単離された核酸分子のフラグメントに関す
る。１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の部分を示すヌクレオチド
配列（配列番号１の１〜１００１位のヌクレオチドからなる）を示すヌクレオチ
ド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は
、配列番号１８の１〜７９８位からなる配列番号１８の部分を示すヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００７４】 本発明はさらに、本明細書中に記載の核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）
のフラグメントに関する。例えば、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラス
ミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列を有する核酸分子のフラグメントに
よって、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡに
よりコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号１
のヌクレオチド配列、配列番号２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌク
レオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃ
ＤＮＡによりコードされるポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配
列番号１８のヌクレオチド配列、配列番号２０のポリペプチド配列をコードする
ヌクレオチド配列、またはそれらに対する相補鎖は、少なくとも約１５ｎｔ、お
よびより好ましくは少なくとも約２０ｎｔまたは少なくとも２５ｎｔ、なおより
好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０
、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、
４００、４５０、または５００ｎｔの長さであるフラグメントを意図される。こ
れらのフラグメントは、本明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプ
ライマーを含むが、これらに限定されない多くの用途を有する。もちろん、ＡＴ
ＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド
配列、配列番号１のヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有する
プラスミドに含まれるｃＤＮＡのヌクレオチド配列、および配列番号１８ヌクレ
オチド配列の、全てではないかもしれないが、大部分に対応するフラグメントの
ような本発明に従うより大きいフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔの
長さの配列）もまた、有用である。本発明の好ましい核酸フラグメントは、それ
ぞれ、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１
９）に同定され、そして以下により詳細に記載されるようなニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのエピトープ保持部分を
含むか、またはこれらからなるポリペプチドをコードする核酸分子を含む。これ
らのポリヌクレオチドフラグメントによりコードされるポリペプチドはまた、本
発明により含まれる。
【００７５】 例えば、配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２２のヌクレオチド配列
、配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２９のヌクレオチド配列、配列番
号２３のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号２８のポリ
ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号３０のポリペプチド配列
をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相補鎖を有する核酸分子のフラ
グメントによってもまた、少なくとも約１５ｎｔ、およびより好ましくは少なく
とも約２０ｎｔまたは少なくとも２５ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３
０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも４０、５０、１００、１５０、
２００、２５０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、または５
００ｎｔの長さであるフラグメントを意図される。これらのフラグメントは、本
明細書中で議論されるように、診断プローブおよびプライマーを含むが、これら
に限定されない多くの用途を有する。もちろん、配列番号２１のヌクレオチド配
列、配列番号２２のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列、配列
番号２９のヌクレオチド配列、配列番号２３のポリペプチド配列をコードするヌ
クレオチド配列、配列番号２８のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配
列、配列番号３０のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列またはそれ
らの相補鎖の、全てではないかもしれないが、大部分に対応するフラグメントの
ような本発明に従うより大きいフラグメント（例えば、５０１〜１５００ｎｔの
長さのフラグメント）もまた、有用である。これらのポリヌクレオチドフラグメ
ントによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００７６】 本発明のニュートロカインαポリヌクレオチドフラグメントの代表例としては
、例えば、配列番号１のほぼヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜１
４６、１４７〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３
５１〜４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６
００、６００〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８
００〜８５０、８５１〜９００、９０１〜９５０、９５１〜１０００、１００１
〜１０５０、および／または１０５１〜１０８２、またはそれらに対する相補鎖
、またはＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡの
配列を含むか、あるいはこれらからなるフラグメントが挙げられる。この文脈で
「ほぼ（約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端または両末端で
いくつかの（５、４、３、２、または１）ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さ
い範囲を含む。
【００７７】 本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドの代表例としては、例えば
、配列番号１８のほぼヌクレオチド１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、
１５１〜２００、２０１〜２５０、２５１〜３００、３０１〜３５０、３５１〜
４００、４０１〜４５０、４５１〜５００、５０１〜５５０、５５１〜６００、
６００〜６５０、６５１〜７００、７０１〜７５０、７５１〜８００、８００〜
８５０および／または８５１〜９００、またはそれらに対する相補鎖、またはＡ
ＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡの配列を含
むか、あるいはこれらからなるフラグメントが挙げられる。この文脈で「ほぼ（
約）」は、特に記載された範囲、およびいずれかの末端または両末端でいくつか
の（５、４、３、２、または１）ヌクレオチドだけ大きいかまたは小さい範囲を
含む。
【００７８】 特定の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１
の以下のヌクレオチド残基：
【００７９】
【化３】 を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８０】 特定の他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番
号１８の以下のヌクレオチド残基：
【００８１】
【化４】 を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８２】 特定のさらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配
列番号１の以下のヌクレオチド残基：
【００８３】
【化５】 を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８４】 さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号
１の以下のヌクレオチド残基：
【００８５】
【化６】 を含むか、あるいはこれらからなる。
【００８６】 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、ニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶの機能的活性を示すポリペプチドをコー
ドする。「機能的活性」を示すポリペプチドによって、全長および／または分泌
型のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポ
リペプチドと関連する１つ以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプチドを意
味される。このような機能的活性としては、生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖
、生存、分化、および／または活性化を刺激する能力）、抗原性［抗ニュートロ
カインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体に結合する能力（ま
たはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド
と結合について競合する能力）］、免疫原性（ニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、本
発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチ
ドとマルチマーを形成する能力、ならびにニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶのポリペプチドについてのレセプターもしくはリガンドに
結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】 特定のさらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは
、ニュートロカイン−αの推定細胞内ドメイン（配列番号２のアミノ酸１〜４６
）、推定膜貫通ドメイン（配列番号２のアミノ酸４７〜７２）、推定細胞外ドメ
イン（配列番号２のアミノ酸７３〜２８５）、または推定ＴＮＦα保存ドメイン
（配列番号２のアミノ酸１９１〜２８４）を含むか、あるいはこれらからなるポ
リペプチドをコードする。さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチ
ドフラグメントは、上記のドメインの１、２、３または４つ全ての任意の組み合
わせを含むか、これらからなるポリペプチドをコードする。これらのポリヌクレ
オチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により包含される。
【００８８】 さらなる特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは
、ニュートロカイン−αＳＶの推定細胞内ドメイン（配列番号１９のアミノ酸１
〜４６）、推定膜貫通ドメイン（配列番号１９のアミノ酸４７〜７２）、推定細
胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸７３〜２６６）、または推定ＴＮＦα保
存ドメイン（配列番号１９のアミノ酸１７２〜２６５）を含むか、あるいはこれ
らからなるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、本発明のポ
リヌクレオチドフラグメントは、上記のドメインの１、２、３または４つ全ての
任意の組み合わせを含むか、これらからなるポリペプチドをコードする。これら
のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、本発明により包含され
る。
【００８９】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号
２の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３、Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１、Ｉｌ
ｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０、Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８、Ｖａｌ−１９
９〜Ａｌａ−２４８、およびＧｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５から選択されるア
ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。
さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わ
せをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含され
る。
【００９０】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号
１９の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３、Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１、Ｇ
ｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９、Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９、およびＧｌ
ｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌク
レオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の
２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされ
るポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９１】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号
２３の残基Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６、Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４、Ｇ
ｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５、Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４、Ｇｌｙ−１
８５〜Ｇｌｎ−２２４、Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２、およびＧｌｙ−２７
３〜Ｌｅｕ−３０９から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド
を含むか、あるいはこれらからなる。さらに、これらのアミノ酸配列の２、３、
４、または５つ以上の任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドもまた、
本発明により包含される。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペ
プチドもまた、本発明により包含される。
【００９２】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号
２８の残基Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７、Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５、Ｉｌｅ−
７６〜Ｌｙｓ−９４、Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２、Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ
−１８２、およびＧｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９から選択されるアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、こ
れらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオ
チドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９３】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、配列番号
３０の残基Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７、Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５、Ｉｌｅ−
７６〜Ｌｙｓ−９４、Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２、Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ
−１８２、およびＧｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９から選択されるアミノ酸配列
をコードするポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。さらに、こ
れらのアミノ酸配列の２、３、４、または５つ以上の任意の組み合わせをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。これらのポリヌクレオ
チドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明により包含される。
【００９４】 別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２１に示され
る配列を含むか、あるいはこれからなる。配列番号２１として示される配列は、
配列番号２として示されるニュートロカインαポリペプチドの残基Ａｌａ−１３
４〜Ｌｅｕ−２８５に結合した最初のメチオニン残基からなるポリペプチドをコ
ードする。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドはまた、
本発明により包含される。
【００９５】 さらなる好ましい特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配
列番号２１の以下；
【００９６】
【化７】 のヌクレオチド残基を含むか、あるいはこれらから構成される。これらのポリヌ
クレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に含まれる。
【００９７】 従って、本発明の特定の実施形態は、図７Ａに開示され、かつ実施例６に記載
されるβプリーツシート領域Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、または
Ｈのアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成されるポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図７Ａに開示
され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ−Ｈの１、２、３、４
、５、６、７、８、９、または１０全ての任意の組み合わせを含むか、あるいは
これらから構成されるニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドに関する。本発明のさらなる好ましい実施形態は、図７Ａに開示され、
かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨのニュートロカイン−αアミノ酸配列を含むか、あるいは
これらから構成されるポリペプチドに関する。本発明のさらなる実施形態は、図
７Ａに開示され、かつ実施例６に記載されるβプリーツシート領域Ａ−Ｈの１、
２、３、４、５、６、７、８、９、または１０全ての任意の組み合わせを含むか
、あるいはこれらから構成されるニュートロカイン−αポリペプチドに関する。
【００９８】 特定の他の好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番
号２１のヌクレオチド残基３４−５７、１１８−１２３、１３３−１４、１５１
−１５９、１７５−２１６、２３２−２５５、２８０−３１５、３２８−３５７
、３７０−３９３、および／または４３０−４５６を含むか、あるいはこれらか
ら構成される。これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは
また、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド
フラグメントは、図７Ａに示される推定βプリーツシート領域に対応する。特定
の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、上記のβプリーツシート領
域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０をコードするポリヌクレ
オチド配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９
％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される。
本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融合される上記のポリヌクレオチド
配列を含む。これらのポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
はまた、本発明によって含まれる。別の実施形態において、本発明は、上記の本
発明のβプリーツシートポリヌクレオチドの１、２、３、４、５、６、７、８、
９、または１０に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において
、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。
本明細書中で使用される場合、熟語「ストリンジェントな条件」の意味は、以下
に記載される。
【００９９】 さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号
１のヌクレオチド残基５７６−５９９、６６０−６６５、６７５−６８３、６９
３−７０１、７１７−７５８、７７４−８０３、８２２−８５７、８７０−８９
９、９１２−９３５、および／または９７２−９９８を含むか、あるいはこれら
から構成される。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされる
ポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよ
びポリペプチドフラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート
領域に対応する。
【０１００】 さらなる好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号
１８のヌクレオチド残基４５７−４６２、４７２−４８０、４９０−４９８、５
１４−５５５、５７１−６００、６１９−６５４、６６７−６９６、６９９−７
３２、および／または７６９−７９５を含むか、あるいはこれらから構成される
。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるポリペプチドは
また、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチド
フラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート領域に対応する
。
【０１０１】 さらになお好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番
号２２のヌクレオチド残基１２４−１２９、１３９−１４７、１５７−１６５、
１８１−２２２、２３８−２６７、２８６−３２１、３３４−３６３、３７６−
３９９、および／または４３６−４６２を含むか、あるいはこれらから構成され
る。これらのポリヌクレオチドフラグメントによってコードされるポリペプチド
はまた、本発明によって含まれる。これらのポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドフラグメントは、図７Ａにおいて示される推定βプリーツシート領域に対応す
る。ポリペプチドは、本発明によって含まれるこれらの領域の１、２、３、４、
５、６、７、８、９、１０または全ての任意の組み合わせのアミノ酸配列を含む
か、あるいはこれらから構成される。
【０１０２】 いくつかのイントロン／エキソン結合の相対位置を、マウスゲノムＤＮＡの配
列分析に基づいて、マウスニュートロカイン−α（配列番号２２および配列番号
２３）について決定した。マウスニュートロカイン−αゲノムクローン（仮に「
Ｅｘｏｎ２」と称する）の５’末端からみかけ上第２のエキソンは、配列番号２
３に示される配列のＴｙｒ−１８７〜Ｇｌｎ−２２２からなる。マウスニュート
ロカイン−αゲノミッククローン（仮に「Ｅｘｏｎ３」と称する）の５’末端か
らみかけ上第３のエキソンは、配列番号２３に示される配列のＶａｌ−２２３〜
Ｇｌｙ−２７３を含む。
【０１０３】 従って、一つの実施形態において、本発明は、配列番号２３の残基Ｔｙｒ−１
８７〜Ｇｌｎ−２２２のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記の
マウスニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と
少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または
９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成され
る、核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリペプチド配列に融合される上記
ポリヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチド
および／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０４】 別の実施形態において、本発明は、配列番号２３の残基Ｖａｌ−２２３〜Ｇｌ
ｙ−２７３のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、ポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のマウスニ
ュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくと
も８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同
一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸
分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリ
ヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよ
び／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０５】 さらに、対応するイントロン／エキソン結合の相対位置を、マウスおよびヒト
のニュートロカイン−αポリペプチドの配列のアラインメントに基づいてヒトニ
ュートロカイン−α（配列番号１および配列番号２）について決定した。ヒトニ
ュートロカイン−α（また仮に「Ｅｘｏｎ２」と称する）の５’末端からみかけ
上第２のエキソンは、配列番号２に示される配列のＴｙｒ−１６３〜Ｇｌｎ−１
９８からなる。ヒトニュートロカイン−α（また仮に「Ｅｘｏｎ３」と称する）
の５’末端からみかけ上第３のエキソンは、配列番号２に示される配列のＶａｌ
−１９９〜Ｇｌｙ−２４９からなる。
【０１０６】 従って、一つの実施形態において、本発明は、配列番号２の残基Ｔｙｒ−１６
３〜Ｇｌｎ−１９８のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記の
ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なく
とも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核
酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポ
リヌクレオチド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドお
よび／またはポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０７】 別の実施形態において、本発明は、配列番号２の残基Ｖａｌ−１９９〜Ｇｌｙ
−２４９のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれらから構成される、ポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記のニュートロ
カイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％
、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である
ポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらから構成される、核酸分子に関
する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融合される上記ポリヌクレオ
チド配列を含む。これらの核酸によってコードされるポリペプチドおよび／また
はポリヌクレオチド配列はまた、本発明によって含まれる。
【０１０８】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
、ならびにフラグメント、改変体誘導体、ならびにそれらのアナログの機能活性
は、本明細書中に記載され、かつ当該分野において周知である種々の方法によっ
て、アッセイされ得る。
【０１０９】 例えば、一つの実施形態において、ここで、抗ニュートロカイン−α抗体およ
び／または抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体との結合またはＢ細胞上のニュート
ロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプターと
の結合について、全長ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶポリペプチドと結合または競合する能力についてアッセイす
る場合、当該分野において公知の種々の免疫アッセイが使用され得る。これらの
アッセイとしては、放射線免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫アッセイ法
）、「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫放射測定アッセイ、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば、コロイド状の金、
酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈降反応、
凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッ
セイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ
などのような技術を使用する、競合的および非競合的アッセイ系が挙げられるが
、これらに限定されない。一つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の
標識を検出することによって、検出される。別の実施形態において、一次抗体は
、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。
さらなる実施形態において、二次抗体が標識される。免疫アッセイにおける結合
を検出するための多くの手段が当該分野において公知であり、そして本発明の範
囲内である。
【０１１０】 別の実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイ
ン−αＳＶリガンドが同定されるか、または本発明のポリペプチドフラグメント
、改変体また誘導体の多量体化する能力が評価される場合、結合が、例えば、当
該分野において周知の手段（例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー
、タンパク質アフィニティークロマトグラフフィー、およびアフィニティーブロ
ッティング）によって、アッセイされ得る。一般的に、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ，Ｅら
、１９９５、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３を参照のこと。
別の実施形態において、基質とのニュートロカイン−αおよび／またはニュート
ロカイン−αＳＶ結合の生理学的相関（シグナル伝達）が、アッセイされ得る。
【０１１１】 さらに、本明細書中に記載されるアッセイ（例えば、実施例６および７を参照
のこと）および当該分野において公知の別のアッセイが、ニュートロカイン−α
および／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびにフラグメント、
改変体誘導体およびそのアナログがニュートロカイン−αおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶ関連生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖、分化および／また
は活性化を刺激すること、あるいは阻害すること（ニュートロカイン−αおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶアンタゴニストの場合）ならびに／またはイ
ンビトロもしくはインビボでのＢ細胞生存を延長すること）の能力を測定するた
めに慣用的に適用され得る。
【０１１２】 他の方法が、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内である。
【０１１３】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン
−αおよびニュートロカイン−αＳＶの機能的属性を含むか、あるいはそれらか
ら構成されるポリペプチドをコードする。この点における本発明の好ましい実施
形態は、ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの
αへリックスおよびαへリックス形成領域（「α領域」）、β−シートおよびβ
−シート形成領域（「β−領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン−
領域」）コイルおよびコイル形成領域（「コイル−領域」）、親水性領域、疎水
性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域および高
度抗原性指標領域を含むか、あるいはこれらから構成されるフラグメントを含む
。
【０１１４】 図７Ａにおいて開示されるニュートロカイン−αの一つ以上のβプリーツシー
ト領域が、二量体化のためおよびニュートロカイン−αとそのリガンドとの間の
相互作用のためにもまた重要であると考えられている。
【０１１５】 この点に関する特定の好ましい領域は、図３（表１）において示される。図３
において示されるデータおよび表１において示されるデータは、配列番号２のア
ミノ酸配列が、ＤＮＡ*ＳＴＡＲコンピュータアルゴリズムのデフォルトパラメ
ータを使用して分析される場合に得られる同じ結果の、異なる形式を単に示す。
【０１１６】 図３および表１に示される上記の好ましい領域としては、図１Ａおよび１Ｂに
おいて示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上述の型の領域が挙げら
れるが、これらに限定されない。図３および表１に示されるように、そのような
好ましい領域としては、高い抗原性指標のＧａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎα−領
域、β−領域、ターン−領域、およびコイル−領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎα
−領域、β−領域およびコイル−領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性領
域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇα両親媒性領域およびβ両親媒性領域
、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ可撓性領域、Ｅｍｉｎｉ表面形成領域ならびに
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ領域が挙げられる。この点に関して非常に好ましいポ
リヌクレオチドは、いくつかの構造的特徴（例えば、上記に示されるいくつか（
例えば、１、２、３または４）の特徴）を組み合わせるニュートロカイン−αお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶの領域を含むか、あるいはこれらから構
成されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチド
によってコードされるポリペプチドはまた、本発明によって含まれる。
【０１１７】 さらに、表Ｉの欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶに示されるデータを
慣用的に使用して、抗原性について高度な潜在能力を示すニュートロカイン−α
の領域を決定し得る（表Ｉの欄ＶＩＩＩは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅに従
う親水性を示し；表Ｉの欄ＩＸは、Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓに従う疎水性を示し；
表Ｉの欄ＸＩＩＩは、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆに従う抗原性指標を示し；そし
て表Ｉの欄ＸＩＶは、Ｅｍｉｎｉに従う表面確率を示す）。高い抗原性の領域は
、免疫応答の開始のプロセスにおける抗原認識が生じ得る環境において、ポリペ
プチドの表面上におそらく曝露されるポリペプチドの領域を示す値を選択するこ
とによって、欄ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩおよび／またはＩＶにおいて示される
データから決定される。図６に示されるデータはまた、デフォルトパラメータを
示すＤＮＡ*ＳＴＡＲのモジュールおよびアルゴリズムを使用して、図６（配列
番号１９）に開示されるアミノ酸配列を単に試験することによって、類似の表形
式で慣用的に示され得る。上記のように、図６に示されるアミノ酸配列を使用し
てもまた、抗原性についての高度な潜在能力を示す（図（図６におけるように）
として示されても、または表（表１におけるように）として示されても）ニュー
トロカイン−αの領域を決定し得る。
【０１１８】
【表１】 本発明のさらに好ましい核酸フラグメントとしては、ニュートロカイン−αの
一つ以上のエピトープ保有部分をコードする配列を含むか、あるいはそれらから
構成される核酸分子が挙げられる。特に、本発明のそのような核酸フラグメント
としては、配列番号２のアミノ酸配列のおよそＰｈｅ−１１５〜およそＬｅｕ−
１４７、およそＩｌｅ−１５０〜およそＴｙｒ−１６３、およそＳｅｒ−１７１
〜およそＰｈｅ−１９４、およそＧｌｕ−２２３〜およそＴｙｒ−２４６、およ
びおよそＳｅｒ−２７１〜およそＰｈｅ−２７８から選択されるポリペプチドを
コードする配列を含むか、あるいはそれらから構成される核酸分子が挙げられる
。この文脈において、「およそ（約）」とは、特に列挙された範囲ならびにアミ
ノ末端およびカルボキシ末端のいずれかまたは両方の、いくつかの、少数の、５
、４、３、２または１アミノ酸残基だけ大きいかまたは小さい範囲を意味する。
これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含
まれる。ニュートロカイン−αの抗原性エピトープを保有するポリペプチドフラ
グメントは、図３に示されるように、上記のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指
標の分析を使用して、当業者によって、容易に決定され得る。ニュートロカイン
−αの他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法が、以下に詳細
に記載される。
【０１１９】 本発明のさらなる好ましい核酸フラグメントとしては、ニュートロカイン−α
ＳＶの一つ以上のエピトープ保有部分をコードする配列を含むか、あるいはそれ
から構成される核酸分子が挙げられる。特に、本発明のそのような核酸フラグメ
ントは、配列番号１９のアミノ酸配列のおよそＰｒｏ−３２〜およそＬｅｕ−４
７、およそＧｌｕ−１１６〜およそＳｅｒ−１４３、およそＰｈｅ−１５３〜お
よそＴｙｒ−１７３、およそＰｒｏ−２１８〜およそＴｙｒ−２２７、およそＳ
ｅｒ−２５２〜およそＴｙｒ−２５８、およそＡｌａ−２３２〜およそＧｌｎ−
２４１；、およそＩｌｅ−２４４〜およそＡｌａ−２４９；および、およそＳｅ
ｒ−２５２〜およそＶａｌ−２５７から選択されるポリペプチドをコードする配
列を含むか、あるいはそれらから構成される核酸分子が挙げられる。この文脈に
おいて、「およそ（約）」とは、特に列挙された範囲ならびにアミノ末端および
カルボキシ末端のいずれかまたは両方の、いくつかの、少数の、５、４、３、２
または１アミノ酸残基だけ大きいかまたは小さい範囲を意味する。これらの核酸
分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。ニュ
ートロカイン−αの抗原性エピトープを保有するポリペプチドフラグメントは、
上記のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指標の分析を使用して、当業者によって
、容易に決定され得る。ニュートロカイン−αＳＶの他のそのようなエピトープ
保有部分を決定するための方法が、以下に詳細に記載される。
【０１２０】 特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、１００，０００ｋｂ
、５０，０００ｋｂ、１０，０００ｋｂ、１，０００ｋｂ、５００ｋｂ、４００
ｋｂ、３５０ｋｂ、３００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１７５ｋｂ、１５０
ｋｂ、１２５ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２
５ｋｂ、２０ｋｂ、１５ｋｂ、１０ｋｂ、７．５ｋｂ、または５ｋｂ長未満であ
る。
【０１２１】 さらなる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン
−αコード配列の少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくと
も１００、または少なくとも２５０、少なくとも５００、または少なくとも１０
００の連続するヌクレオチドを含むが、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）または
図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示される５’または３’コード配列に隣接
するゲノムＤＮＡの１０００ｋｂ、５００ｋｂ、２５０ｋｂ、２００ｋｂ、１５
０ｋｂ、１００ｋｂ、７５ｋｂ、５０ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、２０ｋｂ、１
５ｋｂ、１０ｋｂ、または５ｋｂ以下からなる。さらなる実施形態において、本
発明のポリヌクレオチドは、ニュートロカイン−αコード配列の少なくとも１５
、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００、または少なくとも２５
０、少なくとも５００、または少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含
むが、任意のニュートロカイン−αイントロンの全てまたは一部を含まない。別
の実施形態において、ニュートロカイン−αコード配列を含む核酸は、ゲノム隣
接遺伝子（すなわち、ゲノムにおけるニュートロカイン−α遺伝子に対して５’
または３’）のコード配列を含まない。別の実施形態において、本発明のポリヌ
クレオチドは、１０００、５００、２５０、１００、５０、２５、２０、１５、
１０、５、４、３、２、または１より多くのゲノム隣接遺伝子のコード配列を含
まない。
【０１２２】 別の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるように、上記の本
発明の核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部に、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるコード
配列および／または非コード配列と相補的な配列、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８
を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの配列、図５Ａおよび５Ｂ（配列番
号１８）に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列、Ａ
ＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの配列
、配列番号２１に示されるコード配列および／または非コード配列（すなわち、
転写された、翻訳された）と相補的な配列、配列番号２２に示されるコード配列
および／または非コード配列と相補的な配列、配列番号２７に示されるコード配
列および／または非コード配列と相補的な配列、配列番号２９またはこれらの配
列のフラグメント（例えば、オープンリーディングフレームまたはそのフラグメ
ント）に示されるコード配列および／または非コード配列と相補的な配列を提供
する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％ホルムア
ミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）
、５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デ
キストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で
４２℃にて一晩インキュベーションし、続いて約６５℃において０．１×ＳＳＣ
でそのフィルターを洗浄することを意図される。
【０１２３】 ポリヌクレオチドの「部分」とハイブリダイズするポリヌクレオチドによって
、少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、およびより好ましくは少なくとも約
２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、およびさらにより好ま
しくは約３０〜７０（例えば、４０、５０、または６０）ヌクレオチド、および
さらにより好ましくは、約３０〜７０または８０〜１５０の任意の整数の範囲の
ヌクレオチド、または、参照ポリヌクレオチドの全長とハイブリダイズするポリ
ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。これらは、上記
および以下に詳細に記載されるような診断プローブおよびプライマーを含むが限
定されない用途を有する。「少なくとも２０ヌクレオチド長」のポリヌクレオチ
ドの一部によって、例えば、参照ポリヌクレオチド（例えば、寄託されたｃＤＮ
Ａの一つまたは両方の配列、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるヌクレ
オチド配列の相補鎖、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるヌクレオチ
ド配列の相補鎖、配列番号２１に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、配列番号
２２に示されるヌクレオチド配列の相補鎖、配列番号２７に示されるヌクレオチ
ド配列の相補鎖および／または配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の相補
鎖）のヌクレオチド配列のいずれかの末端または両末端において、いくつか（す
なわち、５、４、３、２、１、または０）のアミノ酸だけ大きいかまたは小さい
、特に列挙された範囲を含むことが意図される。もちろん、ポリＡ配列（例えば
、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示されるニュートロカイン−αｃＤＮＡ３
’末端ポリ（Ａ）トラクト（ｔｒａｃｔ）、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）
に示されるニュートロカイン−αＳＶｃＤＮＡ３’末端ポリ（Ａ）トラクトまた
は配列番号２２に示されるニュートロカイン−αＳＶｃＤＮＡポリ（Ａ）トラク
ト）あるいはＴ（またはＵ）残基の相補ストレッチにのみハイブリダイズするポ
リヌクレオチドは、本発明の核酸の一部とハイブリダイズさせるために使用され
る本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオ
チドは、ポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補鎖（例えば、特に、プライマーと
してオリゴｄＴを使用して生成された任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任
意の核酸分子とハイブリダイズするためである。
【０１２４】 示されたように、ニュートロカイン−αポリペプチドまたはニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドをコードする本発明の核酸分子としては、ポリペプチドの
それぞれの細胞外ドメインのアミノ酸配列を単独でコードするポリヌクレオチド
；およびそれぞれのポリペプチドの細胞外ドメインについてのコード配列ならび
にさらなる配列（例えば細胞内ドメイン配列および膜貫通ドメイン配列、または
プレタンパク質配列、もしくはプロタンパク質配列もしくはプレプロタンパク質
配列）；前述のさらなるコード配列を有するか、または有さない、ポリペプチド
のそれぞれの細胞外ドメインのコード配列が挙げられ得るが、これらに限定され
ない。
【０１２５】 さらなる非コード配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシン
グ、およびポリアデニル化シグナルを含む）において役割（例えば、リボソーム
結合およびｍＲＮＡの安定性）を果たす転写された非翻訳配列のようなイントロ
ンおよび非コード５’および３’配列が挙げられるが、これらに限定されない）
；さらなるアミノ酸（例えば、さらなる機能性を提供するアミノ酸）をコードす
るさらなるコード配列と共に上記のタンパク質配列がまた、本発明の核酸によっ
てコードされる。
【０１２６】 従って、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合ポリ
ペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列）と融合され得る。本発明
のこの実施形態の特定の好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、
ヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１
）において提供されるタグ）であり、中でも、これらの多くは商業的に入手可能
である。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：
８２１−８２４（１９８９）に記載されるように、例えば、ヘキサ−ヒスチジン
は、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ
赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する、精製のための有用な
別のペプチドであり、これは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４）によって記載されている。以下に議論されるように、他のそのような融合
タンパク質としては、Ｎ末端またはＣ末端でＦｃと融合されたニュートロカイン
−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドが挙げられる。
【０１２７】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、その改変体は、配列番号
２のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの部分
、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、例えば、天然の対立遺伝子改
変体として天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」によって、生物体の染色体
上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の中の一つが意図され
る。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）。天然に存在しない改変体は、当該分野で公知
の変異誘発技術を使用して作製され得、それらの技術としては、オリゴヌクレオ
チド媒介変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位定方向変異誘
発（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４３３１
（１９８６）；およびＺｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：
６４８７（１９８２）を参照のこと）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓ
ら、Ｇｅｎｅ ３４：３１５（１９８５）を参照のこと）、制限選択変異誘発（
例えば、Ｗｅｌｌら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ
ＳｅｒＡ ３１７：４１５（１９８６）を参照のこと）が挙げられるが、これら
に限定されない。
【０１２８】 そのような改変体としては、ヌクレオチド置換、欠失または付加によって産生
される改変体が挙げられる。置換、欠失または付加は、一つ以上のヌクレオチド
を含み得る。この改変体は、コード領域、非コード領域または両方において変更
され得る。コード領域における変更は、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠
失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいのは、サイレントな置換、
付加および欠失であり、これらはニュートロカイン−αおよび／またはニュート
ロカイン−αＳＶポリペプチドまたはそれら部分の特性ならびに活性を変更しな
い。この点において特に好ましいのは、保存的置換である。
【０１２９】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を含むが
、５０個より少ない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは４０個より少な
い保存的アミノ酸置換、またさらにより好ましくは３０個より少ない保存的アミ
ノ酸置換、およびなおまたさらに好ましくは２０個より少ない保存的アミノ酸置
換、１０〜２０個の保存的アミノ酸置換、５〜１０個の保存的アミノ酸置換、１
〜５個の保存的アミノ酸置換、３〜５個の保存的アミノ酸置換、１〜３個の保存
的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αおよび／ま
たはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（例えば、本明細書中に記載される
、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
フラグメント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離され
た核酸分子に関する。もちろん、優先度が増加する順において、ニュートロカイ
ン−αおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドが、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個より
も少ない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい
。
【０１３０】 さらなる実施形態は、以下：（ａ）図１Ａおよび１Ｂの完全アミノ酸配列を有
するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわ
ち、配列番号２の１位〜２８５位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２
の完全アミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列（すなわち、配列番号２の２位〜２８５位）；（ｃ）ニュートロ
カイン−α機能活性（例えば、抗原性活性または生物学的活性）を有する（ｂ）
のポリペプチドのフラグメント；（ｄ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の７３
位〜２８５位にてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドの推
定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号２）の１３４位〜２８５位にてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−
αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ登録番号９７７
６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミ
ノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；（ｇ）ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡに
よってコードされるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドの
細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列；および（ｈ）上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）におけるヌクレオ
チド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリ
ヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％または９０％同一、およびより好まし
くは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるヌ
クレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成さ
れる単離された核酸分子を含む。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列と融
合された上記のポリヌクレオチド配列を含む。これらのポリヌクレオチドおよび
核酸分子によってコードされるポリペプチドもまた、本発明によって含まれる。
【０１３１】 本発明の非常に好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）におけ
る１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９
０％同一、およびより好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本発明の好ましい
実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位にお
いてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチド配列と、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポ
リヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。本
発明のさらに好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１
３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９５％同一であるヌクレ
オチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される
核酸分子に関する。本発明のさらに好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュート
ロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９
６％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは
これらから構成される核酸分子に関する。
【０１３２】 さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）
における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−
αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％
であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらか
ら構成される核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図
１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位〜２８５位においてアミノ酸配
列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配
列に対して、少なくとも９８％であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分子に関する。さらに、本発明
のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における１３４位
〜２８５位においてアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこれらから構成される核酸分
子に関する。
【０１３３】 本発明のさらなる実施形態は、少なくとも一つの保存的アミノ酸置換を含むが
、５０個より少ない保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは４０個より少な
い保存的アミノ酸置換、またさらにより好ましくは３０個より少ない保存的アミ
ノ酸置換、およびなおまたさらに好ましくは２０個より少ない保存的アミノ酸置
換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（例え
ば、本明細書中に記載される、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドフラグメ
ント）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分
子に関する。もちろん、優先度が増加する順において、ニュートロカイン−αポ
リペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、７〜１０、５〜１
０、３〜７、３〜５、２〜５、１〜５、１〜３、１０、９、８、７、６、５、４
、３、２または１個よりも少ない保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有す
ることが非常に好ましい。
【０１３４】 さらなる実施形態は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し
て少なくとも８０％、８５％、または９０％同一、そしてより好ましくは少なく
とも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドを含むかあるいはそれらからなる単離された核酸分子を
含む：（ａ）図５Ａおよび５Ｂの完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１９
の１〜２６６位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて、配列番号１９の完全なア
ミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列（すなわち、配列番号２の２〜２６６位）；（ｃ）図５Ａおよび５Ｂ
の７３〜２８５位のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドの推定細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列（配列番号１９）；（ｄ
）ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡクローン
によってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０３５１
８を有する寄託物中に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸
配列を有するニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメインをコード
するヌクレオチド配列；および（ｆ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
または（ｅ）におけるヌクレオチド配列のいずれかに対して相補的なヌクレオチ
ド配列。
【０１３５】 さらに、本発明は、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから
決定されるヌクレオチド配列およびヌクレオチド７９７〜１０８２、８１０〜１
０８２、および３４６〜５４２からのヌクレオチド配列を除いた、図１Ａおよび
１Ｂ（配列番号１）のヌクレオチド１〜ヌクレオチド１０８２の配列中の少なく
とも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個
連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少な
くとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任
意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含
むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好まし
くは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列
を除いた、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）の配列中の少なくとも約１０個連
続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌクレ
オチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４０個
のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に対し
て少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むか、あるいは
それらからなるポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙
された４つのｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列
番号２１の配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続し
たヌクレオチド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌク
レオチド、好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約
５０個のヌクレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも
９５％同一である配列を含むか、あるいはそれらからなるポリヌクレオチドを含
む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡクローンから決
定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２２の配列中の少なくとも約１０
個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５個連続したヌ
クレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも約４
０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの任意の部分に
対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を含むポリヌク
レオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つのｃＤＮＡク
ローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２７の配列中の少な
くとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオチド、約２５
個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、好ましくは少
なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌクレオチドの
任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である配列を
含むポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、好ましくは上記に列挙された４つ
のｃＤＮＡクローンから決定されるヌクレオチド配列を除いた、配列番号２９の
配列中の少なくとも約１０個連続したヌクレオチド、約２０個連続したヌクレオ
チド、約２５個連続したヌクレオチド、または約３０個連続したヌクレオチド、
好ましくは少なくとも約４０個のヌクレオチド、または少なくとも約５０個のヌ
クレオチドの任意の部分に対して少なくとも９０％または少なくとも９５％同一
である配列を含むポリヌクレオチドを含む。この文脈において「約（おおよそ）
」は、特に記載された範囲、いずれかの極値または両方の極値で、数個（すなわ
ち、５、４、３、２、または１個）のアミノ酸だけより大きいかまたはより小さ
な値を含む。
【０１３６】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペプチ
ドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば、少なくとも９５％「同一」な
ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が
、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペプチ
ドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの
ミスマッチを含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列
が、参照配列に対して同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチ
ド配列に対して少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドを得るために、その参照配列のヌクレオチドの５％までが、欠失され得るか
または別のヌクレオチドで置換され得、あるいは、その参照配列中の総ヌクレオ
チドの５％までの数のヌクレオチドが、その参照配列に挿入され得る。参照配列
のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において
、またはこれらの末端位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で
個々に、もしくは参照配列内の１以上の連続した群においての、いずれかで散在
して生じ得る。参照（照会（ｑｕｅｒｙ））配列は、それぞれ、図１Ａおよび１
Ｂ（配列番号１）ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１８）に示されるような
ニュートロカイン−αもしくはニュートロカイン−αＳＶ、あるいは例えば、配
列番号２１、２２、２７、もしくは２８として示されるニュートロカイン−αポ
リヌクレオチドのような任意のニュートロカイン−αをコードするヌクレオチド
配列全体、または本明細書中に記載されるような任意のニュートロカイン−αも
しくはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドフラグメントであり得る。
【０１３７】 実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１Ａおよび１Ｂに示さ
れるヌクレオチド配列もしくは図５Ａおよび５Ｂに示されるヌクレオチド配列、
または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に対して、あるいは例え
ば、配列番号２１、２２、２７、もしくは２８として示されるニュートロカイン
−αポリヌクレオチドのような任意のニュートロカイン−αポリヌクレオチド、
またはそれらのフラグメントに対して、少なくとも８０％同一、８５％同一、９
０％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同
一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージ
ョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍ
ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを
使用して従来通りに決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間で相同性の
最も高いセグメントを見出すために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄ
ｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−
４８９、１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用する。特定の配列が本発
明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定するために
、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する場合、当然の
ことながら、同一性のパーセンテージが参照ヌクレオチド配列の全長にわたって
計算され、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の５％までの相同性における
ギャップが許容されるようにパラメーターを設定する。
【０１３８】 特定の実施形態では、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との間の
同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇおよび共同研究者
（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアル
ゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される
。配列整列において、照会配列および対象配列は、両方ともにＤＮＡ配列である
。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較され得る。この全体的な配
列整列の結果は、同一性パーセントで表される。同一性パーセントを算定するた
めにＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは
：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐ
ｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚ
ａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、
Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さ（いずれか
より短い方）である。この実施形態に従って、同一性パーセントを計算する場合
に、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’および３’の短縮を考慮しないと
いう事実を考慮するために、対象配列が、５’または３’欠失のために（内部欠
失が理由ではなく）、照会配列より短い場合、手動の補正が結果に対してなされ
る。照会配列に対して、５’末端または３’末端で短縮化された対象配列につい
て、同一性パーセントは、照会配列の総塩基のパーセントとして、一致／整列さ
れない対象配列の５’および３’である照会配列の塩基の数を計算することによ
って補正される。ヌクレオチドが一致／整列されるか否かの決定は、ＦＡＳＴＤ
Ｂ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、特定のパラ
メーターを用いて上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって算定された同一性パー
セントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この補
正されたスコアが、本実施形態の目的に使用されるものである。ＦＡＳＴＤＢ整
列によって示される場合、照会配列と一致／整列されいていない、対象配列の５
’および３’塩基の外側の塩基のみが、同一性パーセントのスコアを手動で調整
する目的で算定される。例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決
定するために１００塩基の照会配列に整列される。欠失は、対象配列の５’末端
で生じ、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基で一致／整列
を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（一致していない５’および
３’末端での塩基の数／照会配列の塩基の総数）を表し、そのため１０％は、Ｆ
ＡＳＴＤＢプログラムによって算定される同一性パーセントのスコアから差し引
かれる。残りの９０塩基が完全に一致する場合は、最終的な同一性パーセントは
９０％である。別の例では、９０塩基の対象配列が、１００塩基の照会配列と比
較される。この場合、欠失は、内部欠失であり、その結果、照会と一致／整列し
ない対象配列の５’または３’の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢに
よって算定される同一性パーセントは手動で補正されない。再び、照会配列と一
致／整列しない対象配列の５’および３’の塩基のみが手動で補正される。他の
手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【０１３９】 本願は、本明細書中に開示される核酸配列（すなわち、ポリヌクレオチド）（
例えば、図１Ａおよび図１Ｂ（配列番号１）に開示された核酸配列、または寄託
されたｃＤＮＡの核酸配列）に対して、それらがニュートロカイン−αおよび／
またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有す
るポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％
同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％
同一、または９９％同一である核酸分子に関する。さらに、本願は、図５Ａおよ
び図５Ｂ（配列番号１８）に示された核酸配列に対して、あるいは寄託されたｃ
ＤＮＡの核酸配列に対して、それらがニュートロカイン−αＳＶ活性を有するポ
リペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８０％同一、８５％同一
、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一
、または９９％同一である核酸分子に関する。さらに、本願は、配列番号２１、
２２、２７、または２８に示された核酸配列に対して、それらがニュートロカイ
ン−α活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わらず、少なくとも８
０％同一、８５％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９
７％同一、９８％同一、または９９％同一である核酸分子に関する。これは、特
定の核酸分子がニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
活性を有するポリペプチドをコードしない場合ですら、当業者はこの核酸分子を
使用する方法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして）をなお知っているからである。ニュートロ
カイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ活性を有するポリペプチド
をコードしない本発明の核酸分子の使用としては、特に、（１）ｃＤＮＡライブ
ラリー中のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ遺伝
子またはその対立遺伝子改変体を単離すること；（２）Ｖｅｒｍａら（Ｈｕｍａ
ｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ．（１９８８
））に記載されるような、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイ
ン−αＳＶ遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレ
ッド（ｓｐｒｅａｄ）に対するインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、
「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織におけるニュートロカイン−αおよび／また
はニュートロカイン−αＳＶのｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット
分析が挙げられる。
【０１４０】 しかし、実際に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチド
をコードする、本明細書中に開示される核酸配列（例えば、図１Ａおよび図１Ｂ
（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列、および寄託されたｃＤＮＡの核酸
配列、またはそれらのフラグメント）に対して少なくとも８０％同一、８５％同
一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同
一、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。また、実際に、
ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの
機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする、図５
Ａおよび図５Ｂ（配列番号１８）に示された核酸配列に対して、あるいは寄託さ
れたｃＤＮＡの核酸配列に対して少なくとも８０％同一、８５％同一、９０％同
一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９
９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。また、実際に、ニュートロカ
イン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（
例えば、生物学的活性）を有するポリペプチドをコードする、配列番号２１、２
２、２７、または２８に示された核酸配列に対して少なくとも８０％同一、８５
％同一、９０％同一、９２％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８
％同一、または９９％同一である配列を有する核酸分子が好ましい。
【０１４１】 「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（
例えば、生物学的活性）および「ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能
的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）とは、特定の機能アッ
セイ（例えば、免疫学的または生物学的アッセイ）で測定した場合、本発明のニ
ュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメ
インまたは全長の活性と類似の（しかし、必ずしも同一である必要はない）活性
を示すポリペプチドを意図する。例えば、ニュートロカイン−αおよび／または
ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性は、本明細書中に記載され
るポリペプチド配列が、完全なニュートロカイン−αおよび／またはニュートロ
カイン−αＳＶあるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶの細胞外ドメインとマルチマー（例えば、ホモダイマーおよびホモトリ
マー）を形成する能力、そしてニュートロカイン−αおよび／またはニュートロ
カイン−αＳＶのリガンドに結合する能力によって測定され得る。ニュートロカ
イン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性は
また、本発明のポリペプチドが、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、ま
たは活性化を誘導する能力および／またはＢ細胞生存を延長する能力を決定する
ことによって測定され得る。これらの機能的アッセイは、本明細書中に記載され
る技術（例えば、実施例６を参照のこと）、および当該分野において公知の他の
技術を使用して、慣用的に実施され得る。さらに、本発明のニュートロカイン−
αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、細胞増殖、細胞傷害性、細
胞生存、および細胞死を調節する。特定の細胞に対するタンパク質の影響を測定
するためのインビトロ細胞増殖、細胞傷害性、細胞生存、および細胞死のアッセ
イは、細胞複製および／または細胞死を検出するための当該分野において周知か
つ通常利用可能な試薬を使用することによって実施され得る。例えば、ＴＮＦ関
連タンパク質の活性についての多数のこのようなアッセイが、本開示における種
々の参考文献において記載されている。簡潔には、このようなアッセイの例とし
ては、ヒトまたは動物（例えば、マウス）の細胞を収集する工程、および（１）
ニュートロカイン−αタンパク質（または、候補ポリペプチド）を含有するトラ
ンスフェクトされた宿主細胞上清、または（２）トランスフェクトされていない
宿主細胞上清コントロールと混合する工程、そして特定期間のインキュベーショ
ン後に細胞の数または生存率に対する影響を測定する工程を包含する。この型の
アッセイにおいて測定され得るような、このような細胞の増殖および／または生
存の調節活性は、腫瘍、腫瘍転移、感染、自己免疫疾患、炎症、および他の炎症
関連疾患を処置するために有用である。
【０１４２】 ニュートロカイン−αは、上記のアッセイにおいて、用量依存様式において細
胞の増殖および分化を調節する。従って、「ニュートロカイン−αポリペプチド
の機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）は、用量依存様
式において、上記のアッセイにおいて任意の同じ細胞調節（特に、免疫調節）活
性も示すポリペプチドを含むことが好ましい。用量依存的活性の程度は、ニュー
トロカイン−αポリペプチドの活性の程度と同一である必要はないが、好ましく
は、「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」
は、ニュートロカイン−αポリペプチドと比較して、所定の活性において実質的
に類似した用量依存性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照ニュートロ
カイン−αポリペプチドと比較して、より大きな活性を示すか、または約１／２
５以上、そして好ましくは約１／１０以上の活性を示す）。
【０１４３】 特定の好ましい実施形態では、「ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的
活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学的活性）および「ニュートロカイ
ン−αＳＶポリペプチドの機能的活性を有するポリペプチド」（例えば、生物学
的活性）は、図８Ａ、８Ｂ、９Ａ、９Ｂ、１０、１１、１２Ａ、および１２Ｂな
らびに実施例６に記載される、任意の同じＢ細胞（または、他の細胞型）の調節
（特に、免疫調節）活性も示すポリペプチドが挙げられる。
【０１４４】 ＴＮＦファミリーの他のメンバーのように、ニュートロカイン−αは、例えば
、単球、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）、および好中球を含む白血球に対する活性
を示す。この理由のために、ニュートロカイン−αは、これらの細胞型の増殖、
分化、および動員を指示する際に活性である。このような活性は、免疫増強また
は抑制、骨髄保護、幹細胞動員、急性および慢性の炎症の制御、ならびに白血病
の処置に有用である。このような活性を測定するためのアッセイは、当該分野で
公知である。例えば、Ｐｅｔｅｒｓら，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ １７：２７３
（１９９６）；Ｙｏｕｎｇら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１１１１（１９
９５）；Ｃａｕｘら，Ｎａｔｕｒｅ ３９０：２５８（１９９２）；およびＳａ
ｎｔｉａｇｏ−Ｓｈｗａｒｚら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７８：
７（１９９５）を参照のこと。
【０１４５】 当然のことながら、遺伝コードの縮重に起因して、ＡＴＣＣ受託番号９７７６
８で寄託したｃＤＮＡクローンに含まれる核酸配列または図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号１）に示される核酸配列、あるいはそれらのフラグメントに対して、少な
くとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％また
は９９％同一である配列を有する多数の核酸分子が「ニュートロカイン−αポリ
ペプチドの機能的活性を有する」ポリペプチド（例えば、生物学的活性）をコー
ドすることを、当業者は直ちに認識する。ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８で寄託
したｃＤＮＡクローンに含まれる核酸配列または図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１
８）に示される核酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数の
核酸分子が「ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの機能的活性を有する」ポ
リペプチド（例えば、生物学的活性）をコードすることもまた、当業者は直ちに
認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体は全て同じポリペプチ
ドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを実施しなくとも当業者に
明らかである。縮重改変体でない核酸分子についても、妥当な数のものがまたニ
ュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質活性を
有するポリペプチドをコードすることは、当該分野においてさらに認識される。
これは、以下にさらに記述するように、タンパク質の機能を顕著にもたらすよう
であるか、またはもたらさないようであるか（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を
第二の脂肪族アミノ酸で置換すること）のいずれかのアミノ酸置換を当業者らは
十分に承知しているからである。
【０１４６】 同様に、配列番号２のＶ−１４２〜Ｋ−１６０の領域のすべてのまたはいくつ
かの部分を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ニュートロカイ
ン−αまたはニュートロカイン−αＳＶのポリヌクレオチドのいずれかの発現を
検出および／または変更することに関して有益な診断的および治療的ポリヌクレ
オチドである可能性がある。さらに、配列番号１９に示されるニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドのアミノ酸残基Ｔ−１４１とＧ−１４２の結合部にわたる
ポリヌクレオチド（その間に、ニュートロカイン−αのＶ−１４２〜Ｋ−１６０
のアミノ酸配列が、明らかに挿入される）もまた、診断的および治療的の両方で
有用である可能性がある。このようなＴ−１４１／Ｇ−１４２にわたるポリヌク
レオチドは、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドとよりもニュートロカイン
−αＳＶポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションするより高い可能性を示す
。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるこのようなニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドの部分的非制限的非排他的なリストは、以下から選択され
るアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるポリペプチドが挙げられる：
配列番号１９の
【０１４７】
【化８】 これらのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明に
よって包含される。
【０１４８】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明はまた、本発明の単離されたＤＮＡ分子を含むベクター、この組換えベ
クターで遺伝子操作された宿主細胞、さもなくば本発明のポリペプチドを産生す
るように操作された宿主細胞、および組み換え技術または合成技術による、ニュ
ートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドあるい
はそれらのフラグメントの産生に関する。
【０１４９】 １つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、クロ
ーニングベクターまたは発現ベクター）に連結される。ベクターは、例えば、フ
ァージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイル
スベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複
製欠損であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的に補完的な宿主細胞に
おいてのみ生じる。ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカ
ーを含有するベクターに連結され得る。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カ
ルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクシ
ョン、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形
質導入、感染または他の方法が挙げられるが、これらに限定されない当該分野に
おいて公知の技術よってもたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究
室マニュアルに記載されている（例えば、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【０１５０】 一般に、組換え発現ベクターは、複製起点および宿主細胞の形質転換を可能と
する選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子）および下流の構造配列の転写を指示す
る高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。そのようなプロモーターは、特
に解糖酵素（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ））、α因子、
酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに
由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列、そして好まし
くは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外培地への分泌を指示し得る
リーダー配列と適切な相においてアセンブルされる。必要に応じて、異種配列は
、所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチド（例えば、発現された組換え産物の安
定化または簡略化された精製）を含む融合タンパク質をコードし得る。
【０１５１】 １つの実施形態では、本発明のＤＮＡは、適切な異種調節エレメント（例えば
、プロモーターまたはエンハンサー）（例えば、いくつか名前を挙げると、ファ
ージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔ
ａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならび
にレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）と作動可能に連結される。他の適切な
プロモーターは、当業者に公知である。
【０１５２】 示されたように、この発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マ
ーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジ
ヒドロ葉酸レダクターゼ耐性、Ｇ４１８耐性、またはネオマイシン耐性、ならび
にＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養については、テトラサイクリン耐性
遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる
。適切な宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ
受託番号２０１１７８）））；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２
細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；ならびに植物細
胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記した宿主細胞についての適切な
培養培地および培養条件は、当該分野で公知である。
【０１５３】 宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細
胞）、または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、または宿主
細胞は、原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。挿入された遺伝子配列
の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプ
ロセスする宿主株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定のイ
ンデューサーの存在下で上昇され得る；従って、遺伝子操作されたポリペプチド
の発現は制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、特徴的かつ特異的な、タン
パク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび改変（例えば、リン酸化、切断）
の機構を有する。発現される外来タンパク質の所望の変更およびプロセシングを
保証するために、適切な細胞株が選択され得る。宿主細胞における発現のために
適切なベクターおよびプロモーターの選択は、周知手順であり、そして発現ベク
ター構築、宿主内へのベクターの導入、および宿主における発現のために必須の
技術は、当該分野の慣用的技術である。
【０１５４】 細菌での使用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造Ｄ
ＮＡ配列を、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終結シグナルと共に、機能的な
プロモーターを有する作動可能な読みとり相に挿入することにより構築される。
ベクターは、ベクターの維持を確実にし、そして所望により宿主内での増幅を提
供するために１つ以上の表現型選択マーカー、および複製起点を含有する。形質
転換のために適切な原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象に用いられ得る。
代表的な、しかし限定しない例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、
周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝的エ
レメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起
点を含有し得る。そのような市販のベクターは、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗ
ｅｄｅｎ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ
， ＷＩ， ＵＳＡ）を包含する。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分は、適切
なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。とりわけ細菌
における使用に好ましいベクターとしては、ｐＨＥ４−５（ＡＴＣＣ受託番号２
０９３１１；およびその改変体）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９
（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）から入手可能）；ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇ
ｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ
１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；
ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０
、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）が挙げられる。酵母系での使
用に好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅ
ｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、
ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩ
Ｃ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
から全て入手可能である）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい真
核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ
１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、
ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）があ
る。他の適切なベクターは、当業者に容易に明らかである。
【０１５５】 適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後に、選択さ
れたプロモーターは、適切な手段（例えば、温度変化または化学誘導）により誘
導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は代表的に、遠心分離によ
り収集され、物理的手段または化学的手段により破壊され、そして得られた粗抽
出物は、さらなる精製のために保持される。
【０１５６】 タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、
超音波処理、機械的破壊、または細胞溶剤の使用を含む任意の従来の方法（この
ような方法は、当業者に周知である）により破壊され得る。
【０１５７】 １つの実施形態において、酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを使用して、
真核生物系においてニュートロカイン−αタンパク質を発現させる。Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、メチオトローフ酵母であり、その唯一の炭素源として
メタノールを代謝し得る。メタノール代謝経路における主な工程は、Ｏ2を使用
するホルムアルデヒドへのメタノールの酸化である。この反応は、酵素アルコー
ルオキシダーゼにより触媒される。それの唯一の炭素源としてメタノールを代謝
するために、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、Ｏ2に対するアルコールオキ
シダーゼの比較的低い親和性に一部起因して、アルコールオキシダーゼを高レベ
ルで産生しなければならない。従って、主な炭素源としてメタノールに依存する
増殖培地において、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子（ＡＯＸ１）のうちの
１つのプロモーター領域は非常に活性型である。メタノールの存在下で、ＡＯＸ
１遺伝子から産生されるアルコールオキシダーゼは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓにおいて全可溶性タンパク質の約３０％までを構成する。Ｅｌｌｉｓ，Ｓ
．Ｂら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏ
ｕｔｚ，Ｐ．Ｊら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｓｃｈｏｐ
ｐ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３８５９−７６（１９
８７）を参照のこと。従って、例えば、全てまたは一部のＡＯＸ１調節配列の転
写調節下で、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポ
リヌクレオチドのような異種コード配列は、メタノール存在下で生育されたＰｉ
ｃｈｉａ酵母中において例外的に高レベルで発現される。
【０１５８】 １つの例において、本明細書中に記載されたように、プラスミドベクターｐＰ
ＩＣ９Ｋを使用して、Ｐｉｃｈｉａ酵母系（「Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｄ．Ｒ．
ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ．Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，
Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８に本質的に記載されたような）において本発明の
ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードす
るＤＮＡを発現する。この発現ベクターは、マルチクローニング部位の上流に位
置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌
シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモー
ターの効果により本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳ
Ｖタンパク質の発現および分泌を可能にする。
【０１５９】 多くの他の酵母ベクターが、当業者が容易に理解するように、提案された発現
構築物が転写、翻訳、分泌（所望の場合）などについての適切に配置されたシグ
ナル（必要な場合インフレームＡＵＧを含む）を提供する限りは、ｐＰＩＣ９Ｋ
の代わりに使用され得、そのようなベクターは、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１
、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰ
Ｚα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩ
Ｃ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５である。
【０１６０】 １つの実施形態において、例えば、本発明のニュートロカイン−αまたはニュ
ートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドのような異種コード配列の高レベル発現
は、発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺαのような）に本発明
の異種ポリヌクレオチドをクローニングすること、ならびにメタノール非存在下
での酵母培養物を増殖することにより達成され得る。
【０１６１】 高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベク
ターにエンハンサー配列を挿入することにより増加する。エンハンサーは、ＤＮ
Ａのシス作用エレメントであり、これはプロモーターに対して作用して、その転
写を増加する、通常、約１０〜３００ｂｐである。例としては、複製起点の１０
０〜２７０塩基対後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロ
モーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデ
ノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【０１６２】 種々の動物細胞培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために使用され得
る。哺乳動物発現系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（Ｃｅｌｌ ２３：１７５（
１９８１））により記載されたサル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株および適合性
ベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬ
ａおよびＢＨＫ細胞株）が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適
切なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた必要な任意のリボソーム結合
部位、ポリアデニル化部位、スプライシングドナー部位およびスプライシングア
クセプター部位、転写終結配列ならびに５’に隣接する非転写配列を含む。ＳＶ
４０スプライシング部位、およびポリアデニル化部位から誘導されたＤＮＡ配列
を使用して、必要な非転写遺伝子エレメントを提供し得る。
【０１６３】 特定の実施形態では、ニュートロカイン−αの細胞外ドメイン（例えば、アミ
ノ酸残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ−２８５）の一部を発現するように設計された
構築物が好ましい。当業者は、このような発現構築物を生成するためのポリヌク
レオチドプライマーを設計するために、それぞれ配列番号１および配列番号２、
またはそれぞれ配列番号１８および配列番号１９として提供されるポリヌクレオ
チド配列およびポリペプチド配列を使用し得る。
【０１６４】 別の実施形態では、ニュートロカイン−αの推定細胞外ドメイン全体（すなわ
ち、アミノ酸残基Ｇｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５）を発現するように設計された
構築物が好ましい。当業者は、このような発現構築物を生成するためのポリヌク
レオチドプライマーを設計するために、それぞれ配列番号１および配列番号２、
またはそれぞれ配列番号１８および配列番号１９として提供されるポリヌクレオ
チド配列およびポリペプチド配列を使用し得る。
【０１６５】 本明細書において議論されるベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに
加えて、本発明はまた、脊椎動物起源（特に、哺乳動物起源）の一次宿主細胞、
二次宿主細胞、および不死化宿主細胞を包含する。これらの宿主細胞は、内因性
の遺伝物質（例えば、ニュートロカイン−αコード配列）を欠失または置換する
ように操作されており、そして／または本発明のニュートロカイン−αポリヌク
レオチドと作動可能に連結された遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列
）を含むように操作されており、そして内因性ニュートロカイン−αポリヌクレ
オチドを活性化、改変、および／または増幅する。例えば、当該分野で公知の技
術が、相同組換えを介して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／また
はエンハンサー）および内因性ニュートロカイン−αポリヌクレオチド配列を作
動可能に連結するために使用され得る（例えば、１９９７年６月２４日に発行さ
れた米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際
公開第ＷＯ ９６／２９４１１号；１９９４年８月４日に公開された国際公開第
ＷＯ ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒ
ａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照のこと。これ
ら各々の開示は、それら全体が参考として援用される）。
【０１６６】 下記の宿主細胞は、従来の様式において使用されて、組換え配列によりコード
される遺伝子産物を産生し得る。あるいは、無細胞翻訳系もまた、使用して、本
発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを使用する本発明のポリペプチドを産生し得る
。
【０１６７】 本発明のポリペプチドは、改変された形態（例えば、融合タンパク質（（異な
るタンパク質の）異種タンパク質配列へのペプチド結合を介して連結されたポリ
ペプチドを含む））で発現または合成され得、そして分泌シグナルのみならず、
さらなる異種機能領域をも含み得る。このような融合タンパク質は、当該分野に
おいて公知の方法によって、適切な読み取り枠において、本発明のポリヌクレオ
チドおよび所望のアミノ酸配列をコードする所望の核酸配列を互いに連結させる
工程、および当該分野において公知の方法によって、この融合タンパク質産物を
発現させる工程により作製され得る。あるいは、このような融合タンパク質は、
例えば、ペプチド合成装置を使用することにより、タンパク質合成技術によって
作製され得る。従って、例えば、さらなるアミノ酸（特に、荷電アミノ酸）の領
域が、精製の間または引き続く取り扱いおよび保存の間の宿主細胞における安定
性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また
、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリペプチドに付加され得る。この
ような領域は、ポリペプチドの最終的な精製の前に除去され得る。特に、分泌ま
たは排泄を生じさせるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするた
めにポリペプチドにペプチド部分を付加することは、当該分野で精通しかつ慣用
的な技術である。
【０１６８】 １つの実施形態において、本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュ
ートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、グラム陰
性細菌においてこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増加するため
にｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合され得る。米国特許第５，５
７６，１９５号および同第５，８４６，８１８号を参照のこと、これらの内容は
、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０１６９】 好ましい融合タンパク質は、タンパク質の安定化および精製に有用な免疫グロ
ブリン由来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−Ｏ ４６４ ５３３（カナダ
国対応出願２０４５８６９）は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免
疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む、融合タンパク質を開示する。
多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十
分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−
Ａ ０２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、
記載される有利な様式で発現、検出、および精製された後に、Ｆｃ部分が欠失さ
れ得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用の障
害であると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使
用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のようなヒト
タンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能力スクリ
ーニングアッセイの目的のためにＦｃ部分と融合されている。Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ
ｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１
９９５）およびＫ．Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９
４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと。
【０１７０】 本発明のポリペプチドは、自然に精製された産物、化学的合成手順の産物、な
らびに、例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動
物細胞を含む、原核生物宿主または真核生物宿主から組換え技術によって産生さ
れた産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に依存して、本発明の
ポリペプチドは、グリコシル化されてもまたはグリコシル化されていなくてもよ
い。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介プロセスの結果として、い
くつかの場合において、最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。
【０１７１】 本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の技術を用いて化学合成され得る（
例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅ
ｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．ら、１９
８４、Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１を参照のこと）。例えば、本発明
の完全ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのフ
ラグメントに対応するペプチドは、ペプチド合成装置の使用により合成され得る
。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログが、置
換または付加としてこのニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶ
ポリヌクレオチド配列に導入され得る。非古典的アミノ酸としては、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：通常のアミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ
酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａ
ｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ，２−アミノイソ酪酸、３−
アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロ
リン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグ
リシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β
−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ａｍ
ｉｎｏ ａｃｉｄ）（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎ
ａ−メチルアミノ酸）、および一般のアミノ酸アナログ。さらにアミノ酸はＤ（
右旋性）であってもまたはＬ（左旋性）であってよい。
【０１７２】 本発明は、翻訳の間または翻訳後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リ
ン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解
切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの結合などによって示差的に改変さ
れたニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む
。多数の化学的改変のうちのいずれをも、以下を含むがこれらに限定されない公
知の技術によって実施され得る：臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パ
パイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的切断；アセチル化、
ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；など。
【０１７３】 本発明によって含まれるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、以下などが挙
げられる：Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシン
グ）、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ結合型もしくはＯ結合型の糖鎖の化
学修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付
加もしくは欠失。このポリペプチドはまた、検出可能な標識（例えば、酵素標識
、蛍光標識、同位体標識または親和性標識）を用いて改変して、このタンパク質
の検出および単離を可能にし得る。さらに、本発明のポリペプチドは、ヨウ素化
により改変され得る。
【０１７４】 １つの実施形態において、本発明のニュートロカイン−αまたはニュートロカ
イン−αＳＶポリペプチドはまた、ビオチンを使用して標識化し得る。他の関連
した実施形態において、本発明のビオチン標識化ニュートロカイン−αおよび／
またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、例えば、イメージング試薬（
ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として、または１つ以上のニュートロカイン−α
レセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶもしくは他のコレセプター
分子またはコリガンド分子を同定する手段として、使用され得る。
【０１７５】 本発明によってまた、さらなる利点（例えば、このポリペプチドの溶解度、安
定性およびインビボまたはインビトロでの循環時間の増加、または免疫原性の減
少）を提供し得る、ニュートロカイン−αまたはニュートロカイン−αＳＶの化
学修飾誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと）。
誘導体化のための化学部分は、水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコー
ル、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチル
セルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなど）から選択され得る。こ
のポリペプチドは、この分子内のランダムな位置でか、またはこの分子内の所定
の位置で改変され得、そして１、２、３以上の結合した化学部分を含み得る。
【０１７６】 このポリマーは、任意の分子量のポリマーであり得、そして分枝状であっても
非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールに関しては、好ましい分子量
は、取り扱いおよび製造の容易さのために、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
（用語「約（およそ）」は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつか
の分子は示した分子量よりも重く、いくつかは示した分子量よりも軽いことを示
す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望される持続放出の時間、（
存在する場合には）生物学的活性に対する効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程
度または抗原性の欠如、および治療タンパク質またはアナログに対するポリエチ
レングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズが用いられ得る。例
えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２
０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５
００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９００
０、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１
２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４
，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，
０００、１７，５００、１８，０００、１８、５００、１９，０００、１９，５
００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，００
０、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００
、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、
または１００，０００ｋＤａの平均分子量を有し得る。
【０１７７】 上記のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造を有し得る。分枝ポリエ
チレングリコールは、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒ
ｇｏら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：５９−７２
（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；およびＣａｌｉｃｅｔｉら
、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：６３８−６４６（１９９９）（これら
の各々の開示が、本明細書中で参考として援用される）において記載される。
【０１７８】 ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、このタンパク質の
機能的ドメインまたは抗原性ドメインに対する効果を考慮してこのタンパク質に
結合されるべきである。当業者に利用可能な多数の結合方法が存在する（例えば
、本明細書中に参考として援用される、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（Ｇ−ＣＳＦ
にＰＥＧを結合する）、Ｍａｌｉｋら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０２
８−１０３５（１９９２）（塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）
を用いたＧＭ−ＣＳＦのペグ化を報告する）もまた参照のこと）。例えば、ポリ
エチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離のアミノ基またはカルボキシル
基）を介してアミノ酸残基により共有結合され得る。反応性基は、活性化ポリエ
チレングリコール分子が結合し得る基である。遊離のアミノ基を有するアミノ酸
残基としては、例えば、リジン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ得る；
遊離のカルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グ
ルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられ得る。スルフヒドリル残基
もまた、ポリエチレングリコール分子を結合するための反応性基として用いられ
得る。治療目的のために好ましいのは、アミノ基での結合、例えば、Ｎ末端また
はリジン基での結合である。
【０１７９】 上記で示唆されるように、ポリエチレングリコールは、任意の多くのアミノ酸
残基への連結を介して、タンパク質に結合され得る。例えば、ポリエチレングリ
コールは、リジン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残
基、またはシステイン残基への共有結合を介して、タンパク質に連結され得る。
１つ以上の反応化学が使用されて、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、
リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）また
はタンパク質の１より多い型のアミノ酸残基（例えば、リジン、ヒスチジン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン、およびそれらの組み合わせ）
にポリエチレングリコールを結合させ得る。
【０１８０】 Ｎ末端で化学修飾されたタンパク質が特に所望され得る。ポリエチレングリコ
ールを例示として用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分
枝などによって）、反応混合物中でのタンパク質（または、ポリペプチド）分子
に対するポリエチレングリコール分子の比、行われるべきペグ化反応の型、およ
び選択されたＮ末端ペグ化タンパク質の獲得方法が選択され得る。Ｎ末端ペグ化
調製物の獲得方法（すなわち、必要な場合、この部分を他のモノペグ化部分から
分離すること）は、ペグ化タンパク質分子の集団からの、Ｎ末端ペグ化物質の精
製により行われ得る。Ｎ末端修飾で化学修飾された選り抜きのタンパク質は、特
定のタンパク質における誘導体化に利用可能な異なる型の第１級アミノ基（リジ
ン対Ｎ末端）の示差的反応性を利用する還元的アルキル化によって達成され得る
。適切な反応条件下では、カルボニル基含有ポリマーを用いた、Ｎ末端でのタン
パク質の実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０１８１】 上記で示されたように、本発明のタンパク質のペグ化は、かなり多数の手段に
よって達成され得る。例えば、ポリエチレングリコールは、直接的または介在リ
ンカーによってのいずれかで、タンパク質に結合され得る。タンパク質にポリエ
チレングリコールを結合させるためのリンカーレス（ｌｉｎｋｅｒｌｅｓｓ）系
は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉ
ｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅ
ｒｎ．Ｊ．ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ．６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４
，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８
；およびＷＯ９８／３２４６６（これらの各々の開示は、本明細書中で参考とし
て援用される）に記載される。
【０１８２】 介在するリンカーを伴わずに、タンパク質のアミノ酸残基に直接的にポリエチ
レングリコールを結合させる１つの系は、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）
ＭＰＥＧ（これは、塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＣｌＳＯ 2 ＣＨ2ＣＦ3）を使用して、一メトキシ（ｍｏｎｍｅｔｈｏｘｙ）ポリエチレン
グリコール（ＭＰＥＧ）を改変することによって生成される）を使用する。トレ
シル化ＭＰＥＧとのタンパク質の反応に際して、ポリエチレングリコールは、タ
ンパク質のアミン基に直接結合される。従って、本発明は、本発明のタンパク質
と２，２，２−トリフルオロエタン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｅｏｔｈａｎｅ）スルホ
ニル（ｓｕｌｐｈｏｎｙｌ）基を有するポリエチレングリコール分子とを反応さ
せることによって生成されるタンパク質−ポリエチレングリコール結合体を含む
。
【０１８３】 ポリエチレングリコールはまた、多くの異なる介在リンカーを使用して、タン
パク質に結合され得る。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（この開示全
体が、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質にポリエチレングリ
コールを結合させるためのウレタンリンカーを開示する。ポリエチレングリコー
ルが、リンカーによってタンパク質に結合されるタンパク質−ポリエチレングリ
コール結合体はまた、ＭＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート（ｓｕｃｃｉｎ
ｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、１，１'−カルボニルジイミダゾールで活
性化されたＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−トリクロロフェニルカルボネート
（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｅｎｙｌｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＭＰＥＧ−ｐ−ニトロ
フェノールカルボネート、および種々のＭＰＥＧ−スクシネート誘導体のような
化合物とのタンパク質の反応によって生成され得る。さらなる多くのポリエチレ
ングリコール誘導体およびタンパク質にポリエチレングリコールを結合させるた
めの反応化学が、ＷＯ９８／３２４６６（この開示全体が、本明細書中で参考と
して援用される）に記載される。本明細書中に示される反応化学を使用して生成
されるペグ化タンパク質産物は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１８４】 本発明の各タンパク質に結合されたポリエチレングリコール部分の数（すなわ
ち、置換の程度）もまた、変動し得る。例えば、本発明のペグ化タンパク質は、
平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２
０またはそれより多いポリエチレングリコール分子を連結し得る。同様に、平均
の置換の程度は、タンパク質１分子あたり１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５
〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜
１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、または
１８〜２０ポリエチレングリコール部分のような範囲内である。置換の程度を決
定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ．Ｄ
ｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ．９：２４９−３０４（１９９２）において考
察される。
【０１８５】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
は、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈澱、酸抽出、アニオン交換クロマ
トグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマト
グラフィーが挙げられるが、これらに限定されない公知の方法によって、回収お
よび精製され得る。最も好ましくは、精製のために、高性能液体クロマトグラフ
ィー（「ＨＰＬＣ」）が使用される。
【０１８６】 （ニュートロカイン-αポリペプチド） 本発明のニュートロカイン-αポリペプチドおよび/またはニュートロカイン−
αＳＶポリペプチドは、モノマーまたはマルチマー（すなわち、ダイマー、トリ
マー、テトラマーおよびより高度のマルチマー）であり得る。従って、本発明は
、モノマーおよびマルチマーの本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよ
び／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、それらの調製およびそれら
を含む組成物（好ましくは治療薬）に関する。特定の実施形態では、本発明のポ
リペプチドは、モノマー、ダイマー、トリマーまたはテトラマーである。さらな
る実施形態では、本発明のマルチマーは、少なくともダイマー、少なくともトリ
マー、または少なくともテトラマーである。
【０１８７】 本発明によって含まれるマルチマーは、ホモマーまたはヘテロマーであり得る
。本明細書中で用いられる場合、用語ホモマーは、本発明のニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（本明細
書中に記載されるニュートロカイン−αフラグメントおよび／またはニュートロ
カイン−αＳＶフラグメント、改変体および融合タンパク質を含む）のみを含む
マルチマーをいう。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有す
るニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
ポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは、同一のア
ミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュート
ロカイン−αＳＶポリペプチドのみを含むマルチマーである。別の特定の実施形
態では、本発明のホモマーは、異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含むマ
ルチマーである。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ホモダイマー（
例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプ
チドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む）またはホモ
トリマー（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む）
である。好ましい実施形態において、本発明のマルチマーは、ホモトリマーであ
る。さらなる実施形態では、本発明のホモマー性マルチマーは、少なくともホモ
ダイマー、少なくともホモトリマーまたは少なくともホモテトラマーである。
【０１８８】 本明細書中で用いられる場合、用語ヘテロマーとは、本発明のニュートロカイ
ン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドに加
えて異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド）を含むマ
ルチマーをいう。特定の実施形態では、本発明のマルチマーは、ヘテロダイマー
、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーである。さらなる実施形態では、本発
明のヘテロマー性マルチマーは、少なくともヘテロダイマー、少なくともヘテロ
トリマーまたは少なくともヘテロテトラマーである。さらなる非限定的な実施形
態では、本発明のヘテロマーは、ＣＤ４０リガンドポリペプチド配列、あるいは
その生物学的に活性なフラグメントまたは改変体を含む。
【０１８９】 本発明のマルチマーは、疎水結合、親水結合、イオン結合および／もしくは共
有結合的な結合の結果であり得、ならびに／または例えば、リポソーム形成によ
って間接連結され得る。従って、１つの実施形態では、本発明のマルチマー（例
えば、ホモダイマーまたはホモトリマー）は、本発明のポリペプチドが溶液中で
互いに接触する場合に形成される。別の実施形態では、本発明のへテロマルチマ
ー（例えば、ヘテロトリマーまたはヘテロテトラマーなど）は、本発明のポリペ
プチドが、溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク
質における異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触した場合に形成さ
れる。他の実施形態では、本発明のマルチマーは、本発明のニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドとの、お
よび／または本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶポリペプチド間での共有結合によって形成される。このよう
な共有結合は、ポリペプチド配列（例えば、配列番号２または配列番号１９に記
載されるかまたは本発明に関連して寄託されたクローンによってコードされるポ
リペプチドに含まれる、ポリペプチド配列）中に含まれる１以上のアミノ酸残基
を含み得る。１例では、この共有結合は、ネイティブ（すなわち、天然に存在す
る）ポリペプチドにおいて相互作用するポリペプチド配列内に存在するシステイ
ン残基間での架橋である。別の例では、この共有結合は、化学的操作または組換
え操作の結果である。あるいは、このような共有結合は、ニュートロカイン−α
および／またはニュートロカイン−αＳＶの融合タンパク質中の異種ポリペプチ
ド配列において含まれる１以上のアミノ酸残基を含み得る。１例では、共有結合
は、本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある（例えば、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の例では、この共有結合は、（本明
細書中に記載されるような）本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュ
ートロカイン−αＳＶの融合タンパク質に含まれる異種配列間にある。別の特定
の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合したマルチマーを形
成し得る別のＴＮＦファミリーリガンド／レセプターメンバー（例えば、オステ
オプロテゲリン（ｏｓｅｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）など）由来の異種ポリペ
プチド配列間にある（例えば、国際公開第ＷＯ ９８／４９３０５号（この内容
はその全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形
態では、本発明の融合タンパク質の共有結合は、ＣＤ４０Ｌ由来の異種ポリペプ
チド配列間、またはその可溶性フラグメントにある。別の実施形態では、２以上
の本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドは、合成リンカーを通して連結される（例えば、ペプチド
、糖類または可溶性ポリマーリンカー）。例としては、米国特許第５，０７３，
６２７号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるペプチドリンカー
が挙げられる。ペプチドリンカーによって隔てられた本発明の複数のニュートロ
カイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
を含むタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。
【０１９０】 本発明のマルチマーニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパ
ーポリペプチド配列またはイソロイシンジッパー配列に融合したされた本発明の
ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポ
リペプチドの使用を含む。ロイシンジッパードメインまたはイソロイシンジッパ
ードメインは、そのドメインが見出されるタンパク質のマルチマー形成を促進す
るポリペプチドである。ロイシンジッパーは元々、いくつかのＤＮＡ結合タンパ
ク質において同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１
７５９、（１９８８））、そしてそれ以来、種々の異なるタンパク質において見
出されている。公知のロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーの中には、
ダイマー形成またはトリマー形成をする、天然に存在するペプチドおよびその誘
導体がある。可溶性マルチマーのニュートロカイン−αタンパク質および／また
はニュートロカイン−αＳＶタンパク質を生成するために適切なロイシンジッパ
ードメインの例は、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ出願ＷＯ ９４／
１０３０８に記載されるロイシンジッパードメインである。溶液中でダイマー形
成またはトリマー形成をするペプチドに融合したされた可溶性ニュートロカイン
−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを含む
組換え融合タンパク質は、適切な宿主細胞中で発現され、そして得られる可溶性
マルチマーのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは
、当該分野で公知の技術を用いて培養上清から回収される。
【０１９１】 タンパク質のＴＮＦファミリーの特定のメンバーは、トリマー形態で存在する
と考えられる（ＢｅｕｔｌｅｒおよびＨｕｆｆｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：
６６７、１９４４；Ｂａｎｎｅｒら、Ｃｅｌｌ ７３：４３１、１９９３）。ト
リマーのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、増
強された生物学的活性という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分
は、トリマーを優先的に形成する部分である。１例は、本明細書中に参考として
援用されるＨｏｐｐｅら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１，（１９
９４））および米国特許出願第０８／４４６，９２２号に記載される通りの肺サ
ーファクタントプロテインＤ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーである。天
然に存在するトリマータンパク質由来の他のペプチドは、トリマーニュートロカ
イン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの調製において用いられ得る
。
【０１９２】 別の例では、本発明のタンパク質は、本発明のＦｌａｇ（登録商標）ニュート
ロカイン−α融合タンパク質またはＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−α
ＳＶ融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列間の相互
作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明のタンパク質は、本発明
のＦｌａｇ（登録商標）ニュートロカイン−α融合タンパク質またはＦｌａｇ（
登録商標）ニュートロカイン−αＳＶ融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチ
ド配列と抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体との間の相互作用によって会合する。
【０１９３】 本発明のマルチマーは、当該分野で公知の化学技術を用いて生成され得る。例
えば、本発明のマルチマーに含まれることが所望されるポリペプチドは、当該分
野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋
され得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第
５，４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のマルチマーは、当該分
野で公知の技術を用いて生成されて、マルチマーに含まれることが所望されるポ
リペプチドの配列内に存在するシステイン残基間の１以上の分子間架橋を形成し
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。さらに、本発明のポリペプチドは、ポリペプ
チドのＣ末端またはＮ末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣用的
に改変され得、そして当該分野で公知の技術が、１以上のこれらの改変されたポ
リペプチドを含むマルチマーを生成するために適用され得る（例えば、本明細書
中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照
のこと）。さらに、当該分野で公知の技術は、本発明のマルチマーに含まれるこ
とが所望されるポリペプチド成分を含むリポソームを生成するために適用され得
る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，４
７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９４】 あるいは、本発明のマルチマーは、当該分野で公知の遺伝子操作技術を用いて
生成され得る。１つの実施形態では、本発明のマルチマーに含まれるポリペプチ
ドは、本明細書中に記載の融合タンパク質技術または当該分野で公知の他の技術
を用いて組換え的に産生される（例えば、本明細書中にその全体が参考として援
用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。特定の実施形態に
おいて、本発明のホモダイマーをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、逆方向で、本来のＣ末端からＮ
末端（リーダー配列を欠く）へと、リンカーポリペプチドをコードする配列に連
結し、次いで、さらに、ポリペプチドの翻訳産物をコードする合成ポリヌクレオ
チドに連結することにより生成される（例えば、本明細書中にその全体が参考と
して援用される、米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）。別の実施形
態では、本明細書中に記載される組換え技術または当該分野で公知の他の技術は
、本発明の組換えポリペプチドを生成するために適用される。この組換えペプチ
ドは、膜貫通ドメイン含み、そして膜再構成技術によりリポソームへ取り込まれ
得る（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第５，
４７８，９２５号を参照のこと）。
【０１９５】 １つの実施形態において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８に含まれる
ｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列または図１Ａおよび１Ｂ中の
アミノ酸配列（配列番号２）を有する、単離されたニュートロカイン−αポリペ
プチド、あるいは上記のポリペプチドの一部（すなわち、フラグメント）を含む
ポリペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０
３５１８に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列または図
５Ａおよび５Ｂ中のアミノ酸配列（配列番号１９）を有する、単離されたニュー
トロカイン−αＳＶポリペプチド、あるいは上記のポリペプチドの一部（すなわ
ち、フラグメント）を含むポリペプチドを提供する。
【０１９６】 本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または
以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ
酸配列、ＡＴＣＣ受託番号９７７６８を有するプラスミドに含まれるｃＤＮＡよ
りコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローンに含まれるヌクレオ
チド配列、または図１Ａ−Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）の相補
鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）
ハイブリダイズする核酸によコードされるアミノ酸配列。
【０１９７】 さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか
、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号１９に含ま
れるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８を有するプラスミドに含まれ
るｃＤＮＡよりコードされるアミノ酸配列、あるいは寄託されたクローンに含ま
れるヌクレオチド配列、または図５Ａ−Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番
号１８）の相補鎖に、（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェ
ントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０１９８】 さらに、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか
、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２１に示さ
れるヌクレオチド配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ス
トリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ
酸配列。
【０１９９】 本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含むか、ま
たは以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２３に含まれる
アミノ酸配列、あるいは配列番号２２に示されるヌクレオチド配列の相補鎖に（
例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブ
リダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２００】 さらに、本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含
むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２８に
含まれるアミノ酸配列、あるいは配列番号２７に示されるヌクレオチド配列の相
補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で
）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２０１】 さらに、本発明のポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸配列を含
むか、または以下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号３０に
含まれるアミノ酸配列、あるいは配列番号２９に示されるヌクレオチド配列の相
補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で
）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。
【０２０２】 本発明ポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸配列を含むか、または以
下のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む：配列番号２に含まれるアミノ酸
配列、寄託されたクローンに含まれるｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
、あるいは寄託されたクローンに含まれるヌクレオチド配列、または図１Ａおよ
び１Ｂに示されるヌクレオチド配列（配列番号１）、あるいはそれらに相補的な
鎖に、（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな条件下で
）ハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列。タンパク質フラグ
メントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」であり得るか、あるい
はより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分または領域を（最も好
ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ得る。本発明のポリペ
プチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下のおおよそのアミノ酸
残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基からなる、フラグメントを
含む：配列番号２の１〜５０、５１〜１００、１０１〜１５０、１５１〜２００
、２０１〜２５０、および/または２５１〜２８５。さらに、ポリペプチドフラ
グメントは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９
０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００ア
ミノ酸長であり得る。
【０２０３】 特定の実施形態において、本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミ
ノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：図１Ａおよび１Ｂ（配
列番号２）に示される１〜４６、３１〜４４、４７〜７２、７３〜２８５、７３
〜８３、９４〜１０２、１４８〜１５２、１６６〜１８１、１８５〜２０９、２
１０〜２２１、２２６〜２３７、２４４〜２４９、２５３〜２６５、および/ま
たは２７７〜２８４。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもま
た、本発明に含まれる。
【０２０４】 ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド配列に見出されない１９のアミノ酸残
基挿入物（すなわち、図１Ａおよび１Ｂおよび配列番号２に示される配列のＶａ
ｌ１４２〜Ｌｙｓ−１６０のアミノ酸残基）を含む、本発明のニュートロカイン
−αポリペプチドに標的化された変異は、ニュートロカイン−αポリペプチドの
観察された生物学的活性に影響し得ることが当業者に理解される。より詳細には
、変異のために標的化され得る、ニュートロカイン−αポリペプチド配列のこの
ような残基の、部分的な、非制限的かつ非限定的リストは、配列番号２に示され
るニュートロカイン−αポリペプチド配列の以下のアミノ酸残基含む：Ｖ−１４
２；Ｔ−１４３；Ｑ−１４４；Ｄ−１４５；Ｃ−１４６；Ｌ−１４７；Ｑ−１４
８；Ｌ−１４９；Ｉ−１５０；Ａ−１５１；Ｄ−１５２；Ｓ−１５３；Ｅ−１５
４；Ｔ−１５５；Ｐ−１５６；Ｔ−１５７；Ｉ−１５８；Ｑ−１５９；およびＫ
−１６０。配列番号２のＶ−１４２〜Ｋ−１６０の領域の１つ以上の変異を有す
る、ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図さ
れる。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発
明に含まれる。
【０２０５】 ポリペプチドフラグメントは、「自立構造（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）」
であり得るか、あるいはより大きなポリぺプチド内（このフラグメントが、部分
または領域を（最も好ましくは単一の連続した領域として）形成する）に含まれ
得る。本発明のポリペプチドフラグメントの代表的な例としては、例えば、以下
のおおよそのアミノ酸残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基から
なる、フラグメントを含む：配列番号２に開示されるアミノ酸配列の１〜１５、
１６〜３０、３１〜４６、４７〜５５、５６〜７２、７３〜１０４、１０５〜１
６３、１６３〜１８８、１８６〜２１０、および２１０〜２８４。本発明のポリ
ペプチドフラグメントのさらなる代表的な例としては、例えば、以下のおおよそ
のアミノ酸残基を含むか、または以下のおおよそのアミノ酸残基からなる、フラ
グメントを含む：配列番号１９に開示されるアミノ酸配列の１〜１４３、１〜１
５０、４７〜１４３、４７〜１５０、７３〜１４３、７３〜１５０、１００〜１
５０、１４０〜１４５、１４２〜１４８、１４０〜１５０、１４０〜２００、１
４０〜２２５、および１４０〜２６６。さらに、ポリペプチドフラグメントは、
少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、
１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５または２００アミノ酸長であ
り得る。この文脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲、ア
ミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより数個
（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範囲を
意味する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明
に含まれる。
【０２０６】 さらに好ましい実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチド
フラグメントを含み：ニュートロカイン−αの予想される細胞内ドメイン（配列
番号２のアミノ酸残基１〜４６）、ニュートロカイン−αの予想される膜貫通ド
メイン（配列番号２のアミノ酸残基４７〜７２）、ニュートロカイン−αの予想
される細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５）、ニュートロ
カイン−αの予想されるＴＮＦ保存ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基１９４
〜２８４）、かつ以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：ニュ
ートロカイン−αの予想される細胞外ドメインに融合したした予想される細胞内
ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５に融合したしたアミノ酸残基
１〜４６）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発
明に含まれる。
【０２０７】 さらになお好ましい実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリペプ
チドフラグメントを含み：ニュートロカイン−αＳＶの予想される細胞内ドメイ
ン（配列番号１９のアミノ酸残基１〜４６）、ニュートロカイン−αＳＶの予想
される膜貫通ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基４７〜７２）、ニュートロ
カイン−αＳＶの予想される細胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３
〜２６６）、ニュートロカイン−αＳＶの予想されるＴＮＦ保存ドメイン（配列
番号１９のアミノ酸残基１７２〜２６５）、かつ以下を含むか、または以下から
なるポリペプチドを含む：ニュートロカイン−αＳＶの予想される細胞外ドメイ
ンに融合したした予想される細胞内ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３
〜２６６に融合したしたアミノ酸残基１〜４６）。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２０８】 本発明の特定のさらなる実施形態は、以下を含むか、または以下からなるポリ
ペプチドフラグメントを含む：図７Ａにおいて同定される予想されるβプリーツ
シート領域。本発明のポリペプチドフラグメントは、以下のアミノ酸残基を含む
か、または以下のアミノ酸残基からなる：配列番号２のＧｌｎ−１４４〜Ａｌａ
−１５１、Ｐｈｅ−１７２〜Ｌｙｓ−１７３、Ａｌａ−１７７〜Ｇｌｕ−１７９
、Ａｓｎ−１８３〜Ｉｌｅ−１８５、Ｇｌｙ−１９１〜Ｌｙｓ−２０４、Ｈｉｓ
−２１０〜Ｖａｌ−２１９、Ｌｅｕ−２２６〜Ｐｒｏ−２３７、Ａｓｎ−２４２
〜Ａｌａ−２５１、Ｇｌｙ−２５６〜Ｉｌｅ−２６３および／またはＶａｌ−２
７６〜Ｌｅｕ−２８４。別の非限定的実施形態では、本発明のこれらのポリペプ
チドフラグメントはまた、以下のアミノ酸残基を含むか、または以下のアミノ酸
残基からなる：配列番号１９のＰｈｅ−１５３〜Ｌｙｓ−１５４、Ａｌａ−１５
８〜Ｇｌｕ−１６０、Ａｓｎ−１６４〜Ｉｌｅ−１６６、Ｇｌｙ−１７２〜Ｌｙ
ｓ１８５、Ｈｉｓ−１９１〜Ｖａｌ−２００、Ｌｅｕ−２０７〜Ｐｒｏ−２１８
、Ａｓｎ−２２３〜Ａｌａ−２３２、Ｇｌｙ−２３７〜Ｉｌｅ−２４４および／
またはＶａｌ−２５７〜Ｌｅｕ−２６５；ならびに配列番号２３のＰｈｅ−４２
〜Ｌｙｓ４３、Ａｌａ−４７〜Ｇｌｕ−４９、Ａｓｎ−５３〜Ｉｌｅ−５５、Ｇ
ｌｙ−６１〜Ｐｒｏ−７４、Ｈｉｓ−８０〜Ｖａｌ−８９、Ｌｅｕ−９６〜Ｐｒ
ｏ−１０７、Ａｓｎ−１１２〜Ａｌａ−１２１、Ｇｌｙ−１２６〜Ｉｌｅ−１３
３および／またはＡｓｐ−１４６〜Ｌｅｕ−１５４。さらなる非限定的実施形態
では、本発明のこれらのポリペプチドフラグメントはまた、以下のアミノ酸残基
を含むか、または以下のアミノ酸残基からなる：配列番号２８のＧｌｎ−７８〜
Ａｌａ８５；Ｐｈｅ−１０６〜Ｌｙｓ−１０７、Ａｌａ−１１１〜Ｇｌｕ−１１
３、Ａｓｎ−１１７〜Ｉｌｅ−１１９、Ｇｌｙ−１２５〜Ｌｙｓ−１３８、Ｈｉ
ｓ−１４４〜Ｖａｌ−１５３、Ｌｅｕ−１６０〜Ｐｒｏ−１７１、Ａｓｎ−１７
６〜Ａｌａ−１８５、Ｇｌｙ−１９０〜Ｉｌｅ−１９７および／またはＶａｌ−
２１０〜Ｌｅｕ−２１８；および配列番号３０のＧｌｎ−７８〜Ａｌａ８５；Ｐ
ｈｅ−１０６〜Ｌｙｓ−１０７、Ａｌａ−１１１〜Ｇｌｕ−１１３、Ａｓｎ−１
１７〜Ｉｌｅ−１１９、Ｇｌｙ−１２５〜Ｌｙｓ−１３８、Ｈｉｓ−１４４〜Ｖ
ａｌ−１５３、Ｌｅｕ−１６０〜Ｐｒｏ−１７１、Ａｓｎ−１７６〜Ａｌａ−１
８５、Ｇｌｙ−１９０〜Ｉｌｅ−１９７および／またはＶａｌ−２１０〜Ｌｅｕ
−２１８。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明
に含まれる。
【０２０９】 本発明のアミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる
、本発明のポリペプチドの部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、
以下を含む：配列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ
−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に
融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｖａｌ−１９９〜Ａ
ｌａ ２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］；配列番号２の
［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｉｌｅ１４２〜Ｌｙｓ−１６０］
に融合した［Ｇｌｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｖａｌ−１９９〜
Ａｌａ−２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］；または配列
番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ
−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌｙ
−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］。
他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメントを含み得る（
例えば、配列番号２の［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｖａｌ
−１９９〜Ａｌａ−２４８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］に
融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］）。他の組み合わせはまた、本明
細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、および／または本発
明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配
列番号２の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈ
ｒ−１４１］に融合した［Ｉｌｅ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０］に融合した［Ｇｌ
ｙ−１６１〜Ｇｌｎ−１９８］に融合した［Ｇｌｙ−２５０〜Ｌｅｕ−２８５］
に融合したＦＬＡＧタグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明に含まれる。
【０２１０】 アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明
のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、
以下を含む：配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅ
ｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９］
に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜
Ｌｅｕ−２６６］；配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した
［Ｇｌｙ１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２
９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］；または配列番号１９の［
Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］
に融合した［Ｇｌｙ１４２〜Ｇｌｎ−１７９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌ
ｅｕ−２６６］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチドフラグメ
ントを含み得る（例えば、配列番号１９の［Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］
に融合した［Ｖａｌ−１８０〜Ａｌａ−２２９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜
Ｌｅｕ−２６６］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７９］）。他の組み
合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメント、
および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを含
み得る（例えば、配列番号１９の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１１３］に融合した［
Ｌｅｕ−１１４〜Ｔｈｒ−１４１］に融合した［Ｇｌｙ−１４２〜Ｇｌｎ−１７
９］に融合した［Ｇｌｙ−２３０〜Ｌｅｕ−２６６］に融合したＦＬＡＧタグ）
。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれ
る。
【０２１１】 アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明
のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、
以下を含む：配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｌｅ
ｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］
に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜
Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］；配列番号２
３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１
６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１
８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合
した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３０９］；または配列番号２３の［Ｍｅｔ−１
〜Ｌｙｓ−１０６］に融合した［Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した
［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７〜Ｌｙｓ−１
８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した［Ｇｌｙ−２
７３〜Ｌｅｕ−３０９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポリペプチド
フラグメントを含み得る（例えば、配列番号２３の［Ｍｅｔ−１〜Ｌｙｓ−１０
６］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ２２４］に融合した［Ｉｌｅ−１６７
〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した
［Ｌｅｕ−１０７〜Ｔｈｒ−１３４］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３
０９］）。他の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプ
チドフラグメント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチ
ドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２３のＭｅｔ−１〜Ｌｙｓ１０６
］に融合した［Ｇｌｕ−１３５〜Ａｓｎ−１６５］に融合した［Ｉｌｅ−１６７
〜Ｌｙｓ−１８４］に融合した［Ｇｌｙ−１８５〜Ｇｌｎ−２２４］に融合した
［Ｖａｌ−２２５〜Ａｌａ−２７２］に融合した［Ｇｌｙ−２７３〜Ｌｅｕ−３
０９］に融合したＦＬＡＧタグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１２】 アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明
のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、
以下を含む：配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ
−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した
［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８
２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］；配列番号２８の［Ｔｙｒ
−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］に融合した［Ｉ
ｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］；
または配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｉｌｅ−７６
〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［
Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポ
リペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号２８の［Ｔｙｒ−１〜Ｌ
ｙｓ−４７］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］に融合した［Ｖａ
ｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］）。他
の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメ
ント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメン
トを含み得る（例えば、配列番号２８の［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合
した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３
２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合したＦｃレセプター
タグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に
含まれる。
【０２１３】 アミノ酸配列の組み合わせを含むか、またはこの組み合わせからなる、本発明
のポリペプチドのさらなる部分的な、非制限的かつ例示的なリストは、例えば、
以下を含む：配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ
−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した
［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８
２］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］；配列番号３０の［Ｔｙｒ
−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］に融合した［Ｉ
ｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］；
または配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌｙｓ−４７］に融合した［Ｉｌｅ−７６
〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［
Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］。他の組み合わせは、上記以外の規則的なポ
リペプチドフラグメントを含み得る（例えば、配列番号３０の［Ｔｙｒ−１〜Ｌ
ｙｓ−４７］に融合した［Ｇｌｙ−１８３〜Ａｌａ−２１９］に融合した［Ｖａ
ｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合した［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ７５］）。他
の組み合わせはまた、本明細書中に記載されるような異種ポリペプチドフラグメ
ント、および／または本発明の他のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメン
トを含み得る（例えば、配列番号３０の［Ｌｅｕ−４８〜Ｔｈｒ−７５］に融合
した［Ｉｌｅ−７６〜Ｌｙｓ−９４］に融合した［Ｇｌｙ−９５〜Ｇｌｎ−１３
２］に融合した［Ｖａｌ−１３３〜Ａｌａ−１８２］に融合したＦｃレセプター
タグ）。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に
含まれる。
【０２１４】 本発明のさらなる実施形態は、例えば、以下の本発明のポリペプチドの機能的
領域を含むか、または以下の本発明のポリペプチドの機能的領域からなる、ニュ
ートロカイン−αポリペプチドフラグメントおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶポリペプチドフラグメントを含む：図３および６および表Ｉおよび本明細
書中に記載される、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα−領域、β−領域、ター
ン領域、およびコイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα−領域、β−領域、お
よびターン領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域
、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα−両親媒性領域およびβ−両親媒性領域、Ｋａｒｐｌ
ｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域ならびに高い抗原
性指標のＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの領域。好ましい実施形態では、本発明のポ
リペプチドフラグメントは、抗原性である。表ＩのＶＩＩＩ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩ
Ｉ欄、およびＸＩＶ欄に示されるデータは、高い程度の抗原性について能力を示
す、ニュートロカイン−αの領域を、慣用的に決定するために用いられ得る。高
い抗原性の領域は、ポリペプチドの領域を示す値を選択することにより、ＶＩＩ
Ｉ欄、ＩＸ欄、ＸＩＩＩ欄、およびＩＶ欄に示されるデータから決定される。こ
のポリペプチドの領域は、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスで生じ得る環境
において、ポリペプチドの表面に暴露されるようである。本発明の非常に好まし
いポリヌクレオチドの中に、いくつかの構造的特徴（例えば、上記の特徴のいく
つか（例えば、１、２、３または４））と組み合わされるニュートロカイン−α
および／またはニュートロカイン−αＳＶの領域を含むフラグメントがある。こ
れらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０２１５】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部
分を含むか、このエピトープ保有部分からなる、ポリペプチドを提供する。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。こ
のポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗
原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原で
ある場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、
抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得
る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数
よりも少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと。
【０２１６】 抗原性エピトープを保有するポリペプチド（すなわち、抗体が結合し得るタン
パク質分子の領域を含む）の選択に関して、タンパク質配列の一部を模倣する比
較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を慣
用的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，
Ｊ．Ｇ．，Ｓｈｉｎｎｉｃｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．およびＬｅａｒｎｅ
ｒ，Ｒ．Ａ．（１９８３）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅａｃｔ ｗ
ｉｔｈ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６」を参照のこと。タンパク質−反応
性血清を誘発し得るペプチドは、タンパク質の一次配列に頻繁に存在し、そして
単純な化学的法則のセットにより特徴付けられ得、そしてインタクトなタンパク
質（すなわち、免疫原性エピトープ）の免疫ドミナント領域にも、アミノ末端ま
たはカルボキシル末端にも、制限されない。本発明の抗原性エピトープ保有ペプ
チドおよびポリペプチドは、それゆえ、本発明のポリペプチドに特異的に結合す
るモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。例えば、Ｗｉｌｓ
ｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８４）の７７７を参照のこと。
【０２１７】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは、少なくとも４、少なくとも
５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは、少なくとも８、少なくとも
９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少な
くとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３
０、少なくとも４０、少なくとも５０、そして最も好ましくは約１５〜約３０ア
ミノ酸の配列を含む。免疫原性エピトープまたは抗原性エピトープを含む好まし
いポリペプチドは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４
５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１
００のアミノ酸の長さである。さらなる非限定的な好ましい抗原性エピトープは
、本明細書中に開示される抗原性エピトープ、およびその部分を含む。
【０２１８】 ニュートロカイン−α特異的抗体および／またはニュートロカイン−αＳＶ特
異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまたペプチドの非
限定的な例としては以下が挙げられる：図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｐ
ｈｅ１１５〜約Ｌｅｕ１４７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸
残基からなるポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｉｌｅ１５０
〜約Ｔｙｒ１６３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からな
るポリペプチド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｓｅｒ１７１〜約Ｐｈｅ
１９４のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプ
チド；図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｇｌｕ２２３〜約Ｔｙｒ２４７のア
ミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド；なら
びに図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の約Ｓｅｒ２７１〜約Ｌｅｕ２７８のアミ
ノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペプチド。この文
脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲、アミノ末端および
カルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより数個（５、４、３、
２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範囲を意味する。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。こ
れらのポリペプチドフラグメントは、上記の図３および表Ｉに示されるようなＪ
ａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によってニュートロカインαポリペプ
チドの抗原性エピトープを保有することが決定された。
【０２１９】 ニュートロカイン−α特異的抗体および／またはニュートロカイン−αＳＶ特
異的抗体を産生するために使用され得る、抗原性ポリペプチドまたペプチドの非
限定的な例としては以下が挙げられる：図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約
Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ
酸残基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｇｌｕ−
１１６〜約Ｓｅｒ−１４３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残
基からなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｐｈｅ−１５
３〜約Ｔｙｒ−１７３のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基か
らなるポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｐｒｏ−２１８〜
約Ｔｙｒ−２２７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からな
るポリペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ａｌａ−２３２〜約Ｇ
ｌｎ−２４１のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポ
リペプチド；図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ
−２４９のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポリペ
プチド；ならびに図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）の約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖ
ａｌ−２５７のアミノ酸残基を含有するか、またはこのアミノ酸残基からなるポ
リペプチド。この文脈において、「おおよそ（約）」とは、特に記載された範囲
、アミノ末端およびカルボキシ末端のいずれかもしくは両方において、これより
数個（５、４、３、２、または１）のアミノ酸だけ大きい範囲かまたは小さな範
囲を意味する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本
発明に含まれる。これらのポリペプチドフラグメントは、上記の図６およびＤＮ
Ａ＊ＳＴＡＲコンピュータープログラムＰｒｏｔｅａｎコンポーネントにより生
成された図６に示されるデータの表の表示（上に示す）に示されるような、Ｊａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性指数の分析によってニュートロカインαＳＶポリペ
プチドの抗原性エピトープを保有することが決定された。
【０２２０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の簡便な手段に
よって産生され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．（１９８５）Ｇｅｎ
ｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓ
ｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ：ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄ
ｕａｌ ａｍｉｎｏｓ ａｃｉｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５；この「複数ペプチド合成（ＳＭＰＳ）」プ
ロセスは、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１
号にさらに記載されている。
【０２２１】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、当該分野に周知の方
法によって抗体を誘導するための使用を含むが、これに限定されない。例えば、
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢ
ｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４
（１９８５）を参照のこと。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわ
ち、抗体応答を誘発するタンパク質の部分）は、タンパク質全体が免疫原である
場合、当該分野で公知の方法に従って同定される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、前
出、を参照のこと。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎ（１９９０）の米国特許第５，１
９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位）に相補的で
あるエピトープの位相幾何学的等価物（すなわち、「ミモトープ」）であるモノ
マー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一般的な方法を
記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎ（１９８９）の米国特許第４，４３３
，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガ
ンドの位相幾何学的等価物であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記
載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉ
ｘｔｕｒｅｓにおけるＨｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９６）の米国特許第
５，４８０，９７１号は、線状Ｃ１−Ｃ７−アルキル過アルキル化（ｐｅｒａｌ
ｋｙｌａｔｅｄ）オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライ
ブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アルキル
化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよ
びライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペ
プチドの非ペプチドアナログはまた、これらの方法により慣用的に作製され得る
。
【０２２２】 本発明は、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：配列番号
２のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいはＡＴＣＣ受託番
号９７７６８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド
配列のエピトープ、あるいは配列番号１の配列またはＡＴＣＣ受託番号９７７６
８に含まれるｃＤＮＡ配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような
、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコ
ードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明は、さらに、以下を含むか、
または以下からなるポリヌクレオチドを含む：本発明のポリペプチド配列のエピ
トープをコードする配列（例えば、配列番号１に開示される配列）、本発明のエ
ピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌクレオチド配列、
および相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、ストリンジェントな
条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０２２３】 本発明はまた、以下を含むか、または以下からなるポリペプチドを含む：配列
番号１９のアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープ、あるいはＡＴＣＣ
受託番号２０３５１８に含まれるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチド配列のエピトープ、あるいは配列番号１８の配列またはＡＴＣＣ受託番
号２０３５１８に含まれるｃＤＮＡ配列の相補鎖に（例えば、本明細書中に記載
されるような、ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオ
チドによりコードされるポリペプチド配列のエピトープ。本発明は、さらに、以
下を含むか、または以下からなるポリヌクレオチドを含む：本発明のポリペプチ
ド配列のエピトープをコードする配列（例えば、配列番号１８に開示される配列
）、本発明のエピトープをコードするポリヌクレオチド配列の相補鎖のポリヌク
レオチド配列、および相補鎖に（例えば、本明細書中に記載されるような、スト
リンジェントな条件下で）ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。
【０２２４】 本明細書中で用いられる場合、用語「エピトープ」とは、動物（好ましくは哺
乳動物、最も好ましくはヒト）において抗原性活性または免疫原性活性を有する
ポリペプチドの部分をいう。好ましい実施形態において、本発明はエピトープを
含むポリペプチド、ならびにこのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性エピトープ」は、当該分野の任
意方法により（例えば、上記の抗体を生成するための方法により）決定される場
合、動物において抗体応答を誘発するタンパク質の部分をいう。（例えば、Ｇｅ
ｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８
〜４００２（１９８３）を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「
抗原性エピトープ」は、当該分野で周知の任意の方法（例えば、本明細書中に記
載のイムノアッセイによる）によって決定される場合、抗体がその抗原に免疫特
異的に結合し得る、タンパク質の一部として定義される。免疫特異的結合は、非
特異的結合を除外するが、他の抗原との交叉反応は除外する必要はない。抗原性
エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【０２２５】 エピトープとして機能するフラグメントは、任意の従来の方法によって産生さ
れ得る（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。さらに、米国特
許第４，６３１，２１１号に記載される）。
【０２２６】 本発明においては、抗原性エピトープは、好ましくは、少なくとも４、少なく
とも５、少なくとも６、少なくとも７アミノ酸配列を含み、より好ましくは、少
なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２
、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なく
とも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０アミノ酸配列を含
み、そして最も好ましくは約１５と約３０との間のアミノ酸配列を含む。免疫原
性または抗原性エピトープを含有する好ましいポリペプチドは、少なくとも１０
、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０
、７５、８０、８５、９０、９５または１００アミノ酸残基の長さである。さら
に、本明細書中で開示される抗原性エピトープおよびその一部を含む非排他的に
好ましい抗原性エピトープは、好ましい。抗原性エピトープは、有用である（例
えば、エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む、抗体を惹起す
るため）。好ましい抗原性エピトープは、本明細書中で開示される抗原性エピト
ープ、および２、３、４、５以上のこれらの抗原性エピトープの任意の組合わせ
を含む。抗原性エピトープは、イムノアッセイにおいて、標的分子として使用さ
れ得る。（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９８
４）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９
８３）を参照のこと）。
【０２２７】 同様に、免疫原性エピトープを使用して、例えば、当該分野で周知の方法に従
う抗体を誘導し得る。（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、前出；Ｗｉｌｓｏｎら
，前出；Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：
９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３
４７−２３５４（１９８５）を参照のこと）。好ましい免疫原性エピトープは、
本明細書中に開示される免疫原性エピトープ、およびこれらの免疫原性エピトー
プの１、２、３、４、５以上の任意の組み合わせを含む。１つ以上の免疫原性エ
ピトープを含むポリペプチドは、キャリアタンパク質（例えば、アルブミン）と
ともに動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に抗体応答を誘発するために提示
され得るか、このポリペプチドが十分に長い場合（少なくとも約２５アミノ酸）
、このポリペプチドは、キャリアなしで動物系に提示され得る。しかし、８〜１
０程度の少なさのアミノ酸を含む免疫原性エピトープは、少なくとも変性ポリペ
プチド中の直鎖状エピトープに結合し得る抗体を惹起するには十分であることが
示されている（例えば、ウェスタンブロッティングにおいて）。
【０２２８】 本発明のエピトープ保有ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って抗体
を誘導するために使用され得る。これらの周知の方法としては、インビボ免疫、
インビトロ免疫、およびファージディスプレイ法が挙げられるが、それらに限定
されない。例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，前出；Ｗｉｌｓｏｎら，前出；およ
びＢｉｔｔｌｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９
８５）を参照のこと。インビボ免疫を使用する場合、動物を遊離ペプチドを用い
て免疫し得る；しかし、抗ペプチド抗体力価は、高分子キャリア（例えば、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にペプチド
を結合させることによりブーストされ得る。例えば、システイン残基を含むペプ
チドは、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）のようなリンカーを用いてキャリアに結合され得る。その一方、他のペプチ
ドは、より一般的な結合剤（例えば、グルタルアルデヒド）を用いてキャリアに
結合され得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離のペプチド
またはキャリア結合ペプチドのいずれかを用いて、例えば、エマルジョン（約１
００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびフロイントアジュバント、
あるいは免疫応答を刺激するための当該分野で公知の他のアジュバントを含む）
の腹腔内注射および／または皮内注射により免疫される。いくつかのブースター
注射が、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するために、例えば、約２週間の間
隔で、必要とされ得る。この力価は、例えば、固体表面に吸着した遊離のペプチ
ドを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る。免疫した動物由来の血清中
の抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択（例えば、当該分野で周知の
方法に従う固体支持体上のペプチドの吸着および選択された抗体の溶出による）
により上昇し得る。
【０２２９】 当業者に理解されるように、そして上記で考察されるように、免疫原性エピト
ープまたは抗原性エピトープを含む本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド
配列に融合され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ
Ａ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常ドメインまたはそれらの部分（ＣＨ１、Ｃ
Ｈ２、ＣＨ３、それらの任意の組み合わせ、およびそれらの部分）と融合し得、
これがキメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、精製を容易に
し得、そしてインビボにおいて半減期を増加させ得る。これは、ヒトＣＤ４ポリ
ペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物の免疫グロブリンの重鎖または
軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を示した。例えば、
ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４
〜８６（１９８８）を参照のこと。上皮性関門を横切って免疫系への、抗原の増
強された送達は、ＦｃＲｎ結合パートナー（例えば、ＩｇＧフラグメントまたは
Ｆｃフラグメント（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９６／２２０２４およびＷＯ ９
９／０４８１３を参照のこと）に結合体化した抗原（例えば、インスリン）につ
いて実証されている。ＩｇＧ部分に起因してジスルフィド架橋二量体構造を有す
るＩｇＧ融合タンパク質はまた、単量体ポリペプチドまたはそれらのフラグメン
ト単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効果的であり得る。例え
ば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：３９５８〜
３９６４（１９９５）を参照のこと。上記のエピトープをコードする核酸はまた
、エピトープタグ（例えば、血球凝集素（「ＨＡ」）タグまたはフラッグタグ（
ｆｌａｇ ｔａｇ））として目的の遺伝子と組換えられ、発現されたポリペプチ
ドの検出および精製を補助し得る。例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔらによって記載
された系は、ヒト細胞株において発現される非変性融合タンパク質の前精製を可
能にする（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８９７２−８９７）。この系において、目的の遺伝子は
、遺伝子の読み取り枠が、６つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグと翻訳
的に融合されるように、ワクシニア組換えプラスミド中でサブクローンされる。
このタグは、融合タンパク質に対する膜結合ドメインとして働く。組換えワクシ
ニアウイルスに感染した細胞由来の抽出物は、Ｎｉ2+ニトリロ三酢酸酸性アガロ
ースカラムに充填され、そしてヒスチジンタグ化したタンパク質は、イミダゾー
ル含有緩衝液を用いて選択的に溶出され得る。
【０２３０】 別の実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／また
はニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびにそのエピトープ保有フラグメ
ントは、異種抗原（例えば、ポリペプチド、糖質、リン脂質、または核酸）と融
合される。特定の実施形態では、異種抗原は免疫原である。
【０２３１】 より特定の実施形態では、異種抗原は、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質または
そのフラグメントである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明に含まれる。
【０２３２】 別の実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／また
はニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、ならびにそのエピトープ保有部分は
、別のＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド配列（あるいはその生
物学的に活性なフラグメントまたは改変体）と融合される。特定の実施形態では
、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列と融合される。好ましい
実施形態では、ＣＤ４０Ｌポリペプチド配列は、可溶性である。
【０２３３】 遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、
および／またはコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」とい
われる）の技術は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶの活性を調節するために用いられ得、それによりニュートロカイン−αおよ
び／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストおよびアンタゴニストを有効
に生成し得る。一般には、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，
２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５
，８３７，４５８号、ならびにＰａｔｔｅｎ，Ｐ．Ａ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−３３（１９９７）；Ｈａｒａｙａ
ｍａ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２（１９９
８）；Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５−
７６（１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ，Ｒ
．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３（１９９８）（こ
れらの特許および刊行物の各々が参考として援用される）を参照のこと。１つの
実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶのポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドの改変は、ＤＮＡシャッフ
リングにより達成され得る。ＤＮＡシャッフリングは、相同組換えまたは部位特
異的組換えによる、所望のニュートロカイン−α分子および／またはニュートロ
カイン−αＳＶ分子への２つ以上のＤＮＡセグメントのアセンブリを含む。別の
実施形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶのポリヌクオチドおよび対応するポリペプチドは、組換え前に、誤りがちの
（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ、ランダムなヌクレオチド挿入または他の方
法により、ランダムな変異誘発に供されることによって改変され得る。別の実施
形態において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フ
ラグメントなどは、１つ以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、区切り（
ｓｅｃｔｉｏｎ）、部分、ドメイン、フラグメントなどと組み換えられ得る。好
ましい実施形態において、異種分子は、例えば、以下である：ＴＮＦ−α、リン
ホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、ＬＴ−β（複合ヘテロ
トリマーＬＴ−α２−βにおいて見出される）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７
Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−
γ（国際公開番号ＷＯ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７
／３３８９９）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１）、エンド
カイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開番号ＷＯ９８／０７８８０）、ＯＰ
Ｇ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに可溶性形態のＦａｓ、
ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開番号ＷＯ９
６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開番号ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国
際公開番号ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９
３）、ＴＲ６（国際公開番号ＷＯ９８／３０６９４）、ＴＲ７（国際公開番号Ｗ
Ｏ９８／４１６２９）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開番号ＷＯ９８／５６８９
２）、ＴＲ１０（国際公開番号ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開
番号ＷＯ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ＣＡＤ、およびｖ−ＦＬＩＰ。
さらなる実施形態では、異種分子は、ＴＮＦファミリーの任意のメンバーである
。
【０２３４】 好ましい実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／
またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（その生物学的に活性なフラグメ
ントまたは改変体を含む）は、可溶性ＣＤ４０Ｌポリペプチド、またはその生物
学的に活性なフラグメントまたは改変体と融合される。
【０２３５】 ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチドの特徴を改善または改変するために、タンパク質工学が用いられ得る。
当業者に公知の組換えＤＮＡ技術が用いられ、新規な変異タンパク質または「１
つもしくは複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含むムテインまたは融合タンパク
質を作製し得る。このような改変ポリペプチドは、例えば、増強された活性また
は増大した安定性を示し得る。さらに、それらは、少なくとも特定の精製条件お
よび貯蔵条件下で、対応する天然のポリペプチドよりも、高い収率で精製され得
、そしてより良好な溶解度を示す。例えば、多数のタンパク質（分泌タンパク質
の細胞外ドメインまたは成熟形態を含む）について、１個以上のアミノ酸が、生
物学的機能の実質的な損失を伴わずにＮ末端またはＣ末端から欠失され得ること
が当該分野で公知である。例えば、Ｒｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
８：２９８４−２９８８（１９９３）は、３、８、または２７個のアミノ末端ア
ミノ酸残基が失われたとしてもヘパリン結合活性を有する改変されたＫＧＦタン
パク質を報告した。
【０２３６】 この場合、本発明のタンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバー
であるので、図１および１Ｂ（配列番号２）の１９１位のＧｌｙ（Ｇ）残基まで
のＮ末端アミノ酸の欠失は、いくらかの生物学的活性（例えば、リンパ球（例え
ば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活性化、ならびに適切な標的細胞に対
する細胞障害を刺激する能力）を保持し得る。Ｇｌｙ（Ｇ）残基を含むさらなる
Ｎ末端欠失を有するポリペプチドは、生物学的活性を保持するとは考えられない
。なぜなら、この残基は、ＴＮＦ関連ポリペプチドにおいて、生物学的活性に必
要とされる保存されたドメインの始まりであることが公知であるからである。し
かし、タンパク質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１
つ以上の生物学的機能の喪失の改変をもたらしたとしても、他の機能的活性は依
然として保持され得る。従って、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインを認
識する抗体、を誘導するかおよび／または結合する短縮化タンパク質の能力は、
一般に、タンパク質の完全なまたは細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基が
Ｎ末端から除去される場合、保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く
特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書
中に記載の慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に
決定され得る。
【０２３７】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュー
トロカインαのアミノ酸配列のアミノ末端からアミノ末端からのＧｌｙ１９１残
基までの１個以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、配列番号２の残
基ｎ1〜２８５のアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを
提供し、ここで、ｎ1は、配列番号２におけるアミノ酸配列の２〜１９０のアミ
ノ酸残基のアミノ酸位置の範囲の整数である。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。より詳細には、本発明は
、配列番号２の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あ
るいはこれからなるポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを提供する
：
【０２３８】
【化９】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明に包含される
。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも
、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９
９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレ
オチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配
列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および
／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドはまた、上記の
アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのよ
うなアミノ酸配列からなるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２３９】 さらに、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドの推定細胞外ドメインは
、それ自体生物学的活性を惹起し得るので、このポリペプチドの推定細胞外領域
（配列番号２のＧｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５の位置にわたる）由来のＮ末端ア
ミノ酸残基およびＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活性（例え
ば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または活
性化の刺激、ならびに細胞複製の調整または標的細胞活性の調整）を保持し得る
。しかし、ニュートロカインαポリペプチドの推定細胞外ドメインのＮ末端から
の１つ以上のアミノ酸の欠失が、ポリペプチドの１つ以上の生物学的機能の喪失
を改変するとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得る。従って、短
縮化ポリペプチドが、このポリペプチドの完全なまたは成熟のまたは細胞外ドメ
インを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、一般に、このポリペ
プチドの完全なまたは成熟のまたは細胞外ドメインの大部分よりも少ない残基が
Ｎ末端から除去される場合に保持される。完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠
く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書
中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣用的な方法により容
易に決定され得る。
【０２４０】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαのアミノ
酸配列のアミノ末端から２８０位のグリシン残基までの１個以上の残基を欠失す
るポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。特に、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基ｎ2〜２８５の
アミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供する。ここで
、ｎ2は、配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８０のアミノ酸位置の範囲の整数
である。そして７３は、ニュートロカイン−αポリペプチドの推定細胞外ドメイ
ン（配列番号２に開示）のＮ末端からの最初の残基の位置である。これらのポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。より
詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２の以下の残基からな
る群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはそのアミノ酸配列からなる
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２４１】
【化１０】 これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明により包含さ
れる。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なく
とも、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％また
は９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌ
クレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチ
ド配列に融合した上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列お
よび／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドはまた、上
記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６
％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこ
のようなアミノ酸配列からなるポリペプチド、およびこのようなポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２４２】 本発明の非常に好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３
４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％同一であ
り、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％
または１００％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか
、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。本発明の好
ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のア
ミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチド配列に、少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌク
レオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関
する。
【０２４３】 本発明のより好ましい実施形態では、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３
４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドか
らなる核酸分子に関する。本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ
（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン
−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９６％同一
であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのよう
なポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さらに、本発明の好ましい実施
形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列
を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列
に、少なくとも９７％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを
含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。さら
に、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）の１３
４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配
列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいはこのようなポリヌクレオチドか
らなる核酸分子に関する。さらに、本発明のより好ましい実施形態は、図１Ａお
よび１Ｂ（配列番号２）の１３４〜２８５位置のアミノ酸配列を有するニュート
ロカイン−αポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも９
９％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むか、あるいは
このようなポリヌクレオチドからなる核酸分子に関する。
【０２４４】 特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶの、以下のＮ末端欠失ポリペプチドのうちの１つを含むか、あるいはこ
のようなポリペプチドからなるポリペプチドが好ましい：配列番号２のアミノ酸
残基Ａｌａ−７１〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ａｌａ−８１〜Ｌｅｕ−２８
５、アミノ酸残基Ｌｅｕ−１１２〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ａｌａ−１３
４〜Ｌｅｕ−２８５、アミノ酸残基Ｌｅｕ−１４７〜Ｌｅｕ−２８５、およびア
ミノ酸残基Ｇｌｙ−１６１〜Ｌｅｕ−２８５。これらのポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドはまた、本発明により包含される。
【０２４５】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個
のアミノ酸残基を欠失させることにより、１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅ
ｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））
。本タンパク質は、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーであるので、２８
４位のロイシンまでのＣ末端アミノ酸の欠失は、全てではなくても大部分の生物
学的活性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化お
よび／または活性化を刺激する能力、ならびに細胞複製の調整）を保持すると考
えられる。約１０個までのさらなるＣ末端残基（すなわち、２７４位のグリシン
残基まで）の欠失を有するポリペプチドはまた、いくらかの活性（例えば、レセ
プター結合）を保持し得るが、このようなポリペプチドは、配列番号２のほぼＬ
ｅｕ−２８４に伸びる保存されたＴＮＦドメインの部分を欠く。しかし、タンパ
ク質のＣ末端の１つ以上のアミノ酸の欠失が、タンパク質の１つ以上の生物学的
機能の喪失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性は依然として保持され得
る。従って、短縮化タンパク質が完全なまたは成熟タンパク質を認識する抗体を
誘導および／または結合する能力は、一般に、完全なまたは成熟タンパク質の大
多数よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全なタンパ
ク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持す
るか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の
慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２４６】 従って、本発明はさらに、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュー
トロカインαポリペプチドのアミノ酸配列のカルボキシ末端から２７４位のグリ
シン残基（Ｇｌｙ−２７４）までの１個以上を欠失するポリペプチド、およびこ
のようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本
発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基１〜ｍ1のアミノ酸残基を含むか、あ
るいはこれからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｍ1は、配列番号２の２７
４〜２８４の範囲のアミノ酸位の範囲の任意の整数である。これらのポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドはまた本発明によって包含される。より詳細に
は、本発明は、配列番号２の残基１〜２７４、１〜２７５、１〜２７６、１〜２
７７、１〜２７８、１〜２７９、１〜２８０、１〜２８１、１〜２８２、１〜２
８３、および１〜２８４の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか
、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ドもまた本発明に包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペ
プチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、ある
いはこのようなポリヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた
、異種ポリヌクレオチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含す
る。これらの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリ
ペプチドも、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むかま
たはこのようなアミノ酸からなるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される
。
【０２４７】 また、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を
含むか、あるいはこれからなるポリペプチドが提供され、これは、一般に、配列
番号２の残基ｎ1〜ｍ1を有し得、ここでｎ1およびｍ1は上記のような整数である
として記載され得る。また、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８に含まれる寄託された
ｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なニュートロカインαアミノ酸配列の
一部分を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列も含まれる。ここでこの部分は、寄託されたプラスミド中のｃＤＮＡクロー
ンによりコードされる完全なアミノ酸配列のアミノ末端からの１〜１９０アミノ
酸またはＣ末端からの１〜１１アミノ酸（またはこれらのＮ末端欠失およびＣ末
端欠失の任意の組合せ）を排除する。上記の全ての欠失ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドが本発明により包含される。
【０２４８】 同様に、配列番号２の７９位のロイシン残基までの、ニュートロカインαの推
定細胞外ドメインのＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活性（例
えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／または
活性化の刺激、ならびに細胞複製の調整または標的細胞活性の調整）を保持し得
る。配列番号２のＬｅｕ−７９を含むさらなるＣ末端欠失を有するポリペプチド
は、生物学的活性を保持するとは予期されない。
【０２４９】 しかし、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、ポリペプ
チドの１つ以上の生物学的機能の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依
然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドがこのポリペプチドの完全
な、成熟の、または細胞外形態を認識する抗体を誘導および／または結合する能
力は、一般に、このポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態の大部分
よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。推定細胞外ドメイ
ンのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持する
か否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公知の他の慣
用的な方法により容易に決定され得る。
【０２５０】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαポリペプ
チドの推定細胞外ドメインのアミノ酸配列のカルボキシ末端からの１個以上の残
基より、配列番号２の７９位のロイシン残基まで１つ以上の残基を欠失するポリ
ペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。詳細には、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の残基７３〜ｍ2のアミ
ノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるポリペプチドを提供し、ここで、ｍ2
は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸残基７９〜２８５のアミノ酸位の範囲
の任意の整数である。そして残基７８は、ニュートロカイン−αポリペプチド（
配列番号２に開示される）の推定細胞外ドメインのＣ末端の最初の残基の位置で
ある。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた本発明
に包含される。より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号２
の以下の残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのよ
うなアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供す
る：
【０２５１】
【化１１】 。これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドもまた、本発明に
包含される。本発明はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に
少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％
または９９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポ
リヌクレオチド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレ
オチド配列に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸
および／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記
のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％
、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むかまたはこのよう
なアミノ酸からなるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドがそうであるように、本発明により包含される。
【０２５２】 また、ニュートロカイン−αの推定細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボ
キシ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を含むポリペプチドが提供され、こ
れは、一般に、配列番号２の残基ｎ2〜ｍ2を有し得、ここでｎ2およびｍ2は上記
のような整数であるとして記載され得る。
【０２５３】 別の実施形態において、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれ
るｃＤＮＡプラスミドによりコードされるニュートロカインαアミノ酸配列の細
胞外ドメインの一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含
まれる。ここでこの部分は、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含ま
れるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインの全
体のうち、ＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡプラ
スミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ末端からの１
〜約２０６アミノ酸、またはＡＴＣＣ登録番号９７７６８を有する寄託物に含ま
れるｃＤＮＡプラスミドによりコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメインのカ
ルボキシ末端からの１〜約２０６アミノ酸、または上記のアミノ末端欠失および
カルボキシ末端欠失の任意の組合せを排除する。
【０２５４】 前述のように、ポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、こ
のポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変
するとしても、他の機能または生物学的活性は依然として保持され得る。従って
、短縮化ニュートロカイン−αムテインがこのポリペプチドの全長の、または成
熟形態、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能
力は、一般に、このポリペプチドの全長の、または成熟の、または細胞外ドメイ
ンの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合に保持される。完全な
ポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性
を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で公
知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。多数のＮ末端アミノ酸残基欠
失を有するニュートロカインαムテインが、いくつかの機能的活性（例えば、生
物学的活性または免疫学的活性）を保持し得るようである。実際、６つ程度の少
ないニュートロカインαアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免疫
応答を惹起し得る。
【０２５５】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるニュートロカインαの推定全
長アミノ酸配列のアミノ末端からの１個以上の残基より、配列番号２に示される
配列の２８０位のグリシン残基までの残基を欠失するポリペプチド、およびこの
ようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発
明は、配列番号２に示される配列のうちアミノ酸配列の残基ｎ3−２８５を含む
ポリペプチドを提供し、ここで、ｎ3は、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸
残基１〜２８０のアミノ酸位のアミノ酸の範囲の整数である。
【０２５６】 より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択される
アミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２５７】
【化１２】 。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオ
チド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列
に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸および／ま
たはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸
配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、ならびにこのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明によ
り包含される。
【０２５８】 また上記のように、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、
このタンパク質の１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変
するとしても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ニュ
ートロカインαムテインがこのポリペプチドの完全な形態、もしくは成熟の形態
、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合する能力は、
一般に、このポリペプチドの完全な形態、もしくは成熟形態、または細胞外ドメ
インの大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保持される。完全
なポリペプチドのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活
性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分野で
公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。多数のＣ末端アミノ酸残基
欠失を有するニュートロカインαムテインが、いくつかの機能的活性（例えば、
生物学的活性または免疫学的活性）を保持し得るようである。実際、６つ程度の
少ないニュートロカインαアミノ酸残基から構成されるペプチドは、しばしば免
疫応答を惹起し得る。
【０２５９】 従って、本発明はさらに、別の実施形態において、配列番号２に示されるニュ
ートロカインαのアミノ酸配列のカルボキシ末端から６位のグルタミン酸残基ま
で１つ以上の残基を欠失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号２の残基
１〜ｍ3のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ3は、配列番号
２のアミノ酸配列のアミノ酸残基６〜２８４のアミノ酸位の範囲の整数である。
【０２６０】 より詳細には、本発明は、配列番号２の以下の残基からなる群より選択される
アミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２６１】
【化１３】 本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュート
ロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも８
０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％
同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこれらのポリヌクレオチド
配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列に融
合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および／ま
たはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミノ酸
配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、ならびにこのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本発明によ
り包含される。
【０２６２】 本発明はまた、ニュートロカインαポリペプチドのアミノ末端およびカルボキ
シ末端の両方から１個以上のアミノ酸欠失を含むポリペプチドを提供し、これは
、一般に、配列番号２の残基ｎ3〜ｍ3を有し得、ここでｎ3およびｍ3は上記で定
義したような整数であるとして記載され得る。
【０２６３】 さらに、本発明のニュートロカインαＳＶポリペプチドの推定細胞外ドメイン
は、それ自体機能的活性（例えば、生物学的活性）を惹起し得るので、配列番号
１９のＧｌｎ−７３〜Ｌｅｕ２６６位でのポリペプチドの推定細胞外領域からの
Ｎ末端アミノ酸残基およびＣ末端アミノ酸残基の欠失は、いくつかの生物学的活
性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／
または活性化の刺激、細胞複製の調整、標的細胞活性の調整、ならびに／あるい
は免疫原性）を保持し得る。しかし、ニュートロカインαＳＶポリペプチドの推
定細胞外ドメインのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このポリペプチ
ドの１つ以上の機能的活性の喪失を改変するとしても、他の機能的活性は依然と
して保持され得る。従って、短縮化ポリペプチドがこのポリペプチドの完全な、
または成熟の、または細胞外ドメインを認識する抗体を誘導および／または結合
する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な、または成熟の、または細胞外
ドメインの大部分よりも少ない残基がＮ末端から除去される場合に保持される。
完全なポリペプチドのＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学
的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法および当該分
野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２６４】 従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカインαＳＶの
アミノ酸配列のアミノより、２６１位のグリシン残基までの１つ以上の残基を欠
失するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。詳細には、本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列の残基ｎ4
〜２６６のアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｎ4は、配列番
号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基７３〜２６１のアミノ酸位のアミノ酸位の
範囲の整数である。そして２６１は、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチド（
配列番号１９に示される）の推定細胞外ドメインのＮ末端の最初の残基の位置で
ある。
【０２６５】 より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１９の以下の残
基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２６６】
【化１４】 。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオ
チド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列
に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および
／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミ
ノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本
発明により包含される。
【０２６７】 同様に、ニュートロカインαＳＶの推定細胞外ドメインのＣ末端アミノ酸残基
より、配列番号１９の７９位のロイシン残基までの欠失は、いくつかの機能的活
性（例えば、リガンド結合、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化および／
または活性化の刺激、細胞複製の調整、標的細胞活性の調整、ならびに／あるい
は免疫原性）を保持し得る。配列番号１９のＬｅｕ−７９を含むさらなるＣ末端
欠失を有するポリペプチドは、生物学的活性を保持するとは期待されない。
【０２６８】 しかし、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、このポリ
ペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の喪失を改変すると
しても、他の機能的活性は依然として保持され得る。従って、短縮化ポリペプチ
ドがこのポリペプチドの完全な、成熟の、または細胞外形態を認識する抗体を誘
導および／または結合する能力は、一般に、このポリペプチドの完全な、成熟の
、または細胞外形態の大部分よりも少ない残基がＣ末端から除去される場合に保
持される。推定細胞外ドメインのＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのよ
うな免疫学的活性を保持するか否かは、本明細書中に記載される慣用的な方法お
よび当該分野で公知の他の慣用的な方法により容易に決定され得る。
【０２６９】 従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカインαＳＶの
の推定細胞外ドメインのアミノ酸配列のＣ末端より、配列番号１９の７９位のロ
イシン残基までの１つ以上の残基を有するポリペプチド、およびこのようなポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列
番号１９のアミノ酸配列の残基７３〜ｍ4のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を提供し、ここで、ｍ4は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基７９〜
２６６のアミノ酸位の範囲の任意の整数である。
【０２７０】 より詳細には、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１９の以下の残
基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこのようなアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する：
【０２７１】
【化１５】 。本出願はまた、上記のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に少なくとも
８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９
％同一であるポリヌクレオチド配列を含むか、あるいはこのようなポリヌクレオ
チド配列からなる核酸分子に関する。本発明はまた、異種ポリヌクレオチド配列
に融合された上記のポリヌクレオチド配列を包含する。これらの核酸配列および
／またはポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドも、上記のアミ
ノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、ならびに
このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがそうであるように、本
発明により包含される。
【０２７２】 本発明はまた、ニュートロカイン−αＳＶの推定細胞外ドメインのアミノ末端
およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチド
を提供し、これは配列番号１９の残基ｎ4〜ｍ4を有するものとして一般的に記載
され得る。ここで、ｎ5およびｍ5は、上記に定義された整数である。
【０２７３】 別の実施形態において、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の細胞外ドメ
インの一部分からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＡＴＣＣ
登録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコー
ドされ、ここで、この部分は、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託物に
含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメイン
のアミノ末端から、１〜およそ２６０アミノ酸を排除するか、またはＡＴＣＣ登
録番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
されるアミノ酸配列の細胞外ドメインのカルボキシ末端から、１〜およそ１８７
アミノ酸を排除するか、あるいは、ＡＴＣＣ登録番号２０３５１８を有する寄託
物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列の細胞外ドメ
イン全体の、上記アミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の任意の組み合わせ
を排除する。
【０２７４】 上述のように、ポリペプチドのＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そ
のポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の改変または
損失を生じるとしても、他の機能的活性はなお保持され得る。従って、このポリ
ペプチドの全長形態または成熟形態、あるいは細胞外ドメインを認識する抗体を
誘導する短縮化されたニュートロカイン−αＳＶムテインの能力、および／また
はその抗体に結合する能力は、そのポリペプチドの全長または成熟ドメイン、あ
るいは細胞外ドメインの残基の大部分より少ない残基がＮ末端から除去された場
合には、一般に保持される。完全なタンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペ
プチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載され
る慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によって、容易に決定さ
れ得る。多数のＮ末端アミノ酸残基が欠失されたニュートロカイン−αＳＶムテ
インが、機能的（例えば、免疫学的）活性を保持し得ることはなさそうではない
。実際６つ程度の少ないニュートロカイン−αＳＶアミノ酸残基からなるペプチ
ドが、免疫応答をしばしば誘発し得る。
【０２７５】 従って、本発明はさらに、配列番号１９に示されるニュートロカイン−αＳＶ
の推定全長アミノ酸配列のアミノ末端から、配列番号１９の２６１位のグリシン
残基までの１つ以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびこのようなポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。詳細には、本発明は、配列番
号１９に示された残基ｎ5〜２６６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し
、ここで、ｎ5は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２６１のア
ミノ酸位置の範囲の整数である。
【０２７６】 より詳細には、本発明はまた、配列番号１９の以下の残基；
【０２７７】
【化１６】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記ニュー
トロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、
９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオ
チド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、
異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これ
らの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチ
ド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２７８】 上述のように、ポリペプチドのＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が、そ
のポリペプチドの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）の改変または
損失を生じるとしても、他の機能的活性はなお保持され得る。従って、このポリ
ペプチドの完全形態または成熟形態、あるいは細胞外ドメインを認識する抗体を
誘導する短縮化されたニュートロカイン−αＳＶムテインの能力、および／また
はその抗体に結合する能力は、そのポリペプチドの完全形態または成熟形態、あ
るいは細胞外ドメインの残基の大部分より少ない残基がＣ末端から除去された場
合には、一般に保持される。完全なタンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペ
プチドが、このような免疫原性活性を保持するか否かは、本明細書中に記載され
る慣用的な方法および当該分野において公知の別の方法によって、容易に決定さ
れ得る。多数のＣ末端アミノ酸残基が欠失されたニュートロカイン−αＳＶムテ
インが、機能的（例えば、免疫学的）活性を保持し得ることはなさそうではない
。実際６つ程度の少ないニュートロカイン−αＳＶアミノ酸残基からなるペプチ
ドが、免疫応答をしばしば誘発し得る。
【０２７９】 従って、本発明は、別の実施形態において、配列番号１９に示されるニュート
ロカイン−αＳＶのアミノ酸配列のカルボキシ末端から、６位のグルタミン酸残
基までの１つ以上の残基が欠失されたポリペプチド、およびこのようなポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。詳細には、本発明は、配
列番号１９に示された残基１〜ｍ5のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し
、ここで、ｍ5は、配列番号１９のアミノ酸配列のアミノ酸残基６〜２６５のア
ミノ酸位置の範囲の整数である。
【０２８０】 より詳細には、本発明はまた、配列番号１９の以下の残基；
【０２８１】
【化１７】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、上記ニュー
トロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、
９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオ
チド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、
異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これ
らの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチ
ド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２８２】 本発明はまた、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ末端およびカ
ルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ酸が欠失されたポリペプチドを提供し
、これは配列番号１９の残基ｎ5〜ｍ5を有するものとして一般的に記載され得る
。ここで、ｎ5およびｍ5は、上記に定義された整数である。
【０２８３】 さらなる実施形態において、本発明は、配列番号２の残基１３４〜ｍ6のアミ
ノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここで、ｍ6は、配列番号２のアミノ酸
残基の位置に対応する、１４０〜２８５の整数である。例えば、本発明は、配列
番号２の以下の残基；
【０２８４】
【化１８】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなるポリ
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本出願はまた、上記ニュー
トロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、
９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるポリヌクレオ
チド配列を含むか、または、それらからなる核酸分子に関する。本発明はまた、
異種ポリヌクレオチド配列と融合した上記のポリヌクレオチド配列を含む。これ
らの核酸および／またはポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチ
ド、同様に、上記のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％
、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２８５】 本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号２の以下の
残基：
【０２８６】
【化１９】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好
ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上
の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして
例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングする
ために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一で
あるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する
。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上
記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２８７】 本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号１９の以下
の残基：
【０２８８】
【化２０】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好
ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上
の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして
例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングする
ために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一で
あるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する
。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上
記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２８９】 本発明のさらなる好ましいポリペプチドフラグメントは、配列番号３８の以下
の残基：
【０２９０】
【化２１】 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、または、それらからなる。好
ましくは、これらのポリペプチドフラグメントは、本発明のニュートロカイン−
αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの１以上
の機能的活性（例えば、生物学的活性、抗原性および免疫原性）を有し、そして
例えば、さらに以下に記載されるように、抗体を作製またはスクリーニングする
ために使用され得る。本発明はまた、上記のアミノ酸配列と少なくとも８０％、
８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一で
あるアミノ酸配列配列を含むか、または、それらからなるポリペプチドに関する
。本発明はまた、本明細書中に記載されるような異種アミノ酸配列と融合した上
記アミノ酸配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも
また、本発明に含まれる。
【０２９１】 ニュートロカイン−αポリペプチドおよびニュートロカイン−αＳＶポリペプ
チドのいくつかのアミノ酸配列が、そのポリペプチドの構造または機能に有意に
影響することなく変化され得ることが、当業者に認識される。配列におけるこの
ような差異が意図される場合、活性を決定するポリペプチド上の重要な領域が存
在することを覚えておくべきである。
【０２９２】 従って、本発明は、ニュートロカイン−αポリペプチドの機能的活性（例えば
、生物学的活性）を示すか、または本明細書中に記載されるポリペプチドフラグ
メントのようなニュートロカイン−αポリペプチドの領域を含む、ニュートロカ
イン−αポリペプチドのバリエーションを含む。本発明はまた、ニュートロカイ
ン−αＳＶポリペプチドの機能的活性（例えば、生物学的活性）を示すか、また
は本明細書中に記載されるポリペプチドフラグメントのようなニュートロカイン
−αポリペプチドの領域を含む、ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのバリ
エーションを含む。このような変異体は、当該分野において公知の一般的な規定
に従って活性に対してほとんど影響を有さないように選択された、欠失、挿入、
逆位、反復、および置換を含む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換
の作製方法に関する手引きは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉ
ｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：
Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０））によって提
供される。この手引きにおいて、筆者らは、変化に対するアミノ酸の寛容性を研
究するための、２つの主なアプローチがあることを示している。第一の方法は、
進化のプロセスに依存し、ここでは、変異が自然選択によって受容されるか、ま
たは拒絶されるかのいずれかである。第二のアプローチは、クローン化した遺伝
子の特定の部位でアミノ酸変化を導入するための遺伝子操作、および機能性を維
持する配列を同定するための選択またはスクリーニングを使用する。
【０２９３】 その筆者らが述べているように、これらの研究により、タンパク質が驚くほど
にアミノ酸置換に対して寛容性を示すことが明らかにされた。この著者らはさら
に、どのアミノ酸変化が、そのタンパク質の特定の位置で許容されるようである
かを示す。例えば、多くの埋没されたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが
、表面側鎖の特徴は一般的に保存されない。このような表現型的にサイレンと名
置換は、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、前出、および本明細書中に引用される参考文
献に記載される。保存的アミノ酸置換として代表的にみなされるのは、脂肪族ア
ミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）間の互いの置換；ヒド
ロキシル残基（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）の交換；酸性残基（例えば、Ａｓ
ｐまたはＧｌｕ）の交換；アミド残基（例えば、ＡｓｎまたはＧｌｎ）間の置換
、塩基性残基（例えば、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の交換；ならびに芳香族残基（例
えば、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐ）間の置換である。
【０２９４】 従って、図１ＡおよびＢ（配列番号２）のポリペプチドのフラグメント、誘導
体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る：（ｉ）
１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基（好ま
しくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような置換アミノ酸
残基は遺伝コードによってコードされるものであってもなくてもよい、または（
ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプ
チドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物のような別の
化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、または（ｉ
ｖ）さらなるアミノ酸が、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列あ
るいは分泌配列またはポリペプチド細胞外ドメインもしくはプロタンパク質配列
の精製のために使用される配列のような、ポリペプチドの細胞外ドメインに融合
されるもの。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の
教示から、当業者の範囲内にあるとみなされる。
【０２９５】 さらに、図５Ａおよび図５Ｂ（配列番号１９）のポリペプチドのフラグメント
、誘導体またはアナログ、あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポ
リペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、以下のものであり得る：
（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基もしくは非保存アミノ酸残基
（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換されるものであり、このような置換ア
ミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであってもなくてもよい、ま
たは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポ
リペプチドの細胞外ドメインが、ポリペプチドの半減期を増加する化合物のよう
な別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、また
は（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、別のＴＮＦリガンドファミリーメンバー（例え
ば、ＣＤ４０リガンド）の可溶性の生物学的に活性なフラグメント、ＩｇＧ Ｆ
ｃ融合領域ペプチドまたはリーダー配列あるいは分泌配列またはポリペプチド細
胞外ドメインもしくはプロタンパク質配列の精製のために使用される配列のよう
な、ポリペプチドの細胞外ドメインに融合されるもの。このようなフラグメント
、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあるとみ
なされる。
【０２９６】 従って、本発明の、ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶポリペプチドは、天然の変異または人為的操作のいずれか由
来の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示されるように
、変化は、好ましくは、タンパク質の折りたたみまたは活性に有意に影響しない
保存的アミノ酸置換のような、あまり重要でない性質の変化である（表ＩＩを参
照のこと）
【０２９７】
【表２】 本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの保存的
アミノ酸置換を含むが、５０を超えない保存的アミノ酸置換、さらにより好まし
くは、４０を超えない保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは、３０を超えな
い保存的アミノ酸置換、そしてなおさらにより好ましくは、２０を超えない保存
的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αポリペプチ
ドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドのアミノ酸配列を含む
か、あるいは、それらからなる。もちろん、好ましくさの増大の順では、少なく
とも１つの保存的アミノ酸置換を含むが、１０、９、８、７、６、５、４、３、
２または１を超えない保存的アミノ酸置換を含む、ニュートロカイン−αポリペ
プチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸を有することが、ペプチドまたはポリペプ
チドに高度に好ましい。
【０２９８】 例えば、ニュートロカイン−α（Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−ａｌｐｈａ）のアミ
ノ酸レベルでの部位特異的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換す
ることにより行われ得る。配列番号２において提供されるニュートロカイン−α
アミノ酸配列の好ましい保存的置換変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｅで置換され
たＤ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５；Ｄで置換されたＥ６；ＨまたはＫで置換され
たＲ７；Ｄで置換されたＥ８；Ｎで置換されたＱ９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＳ１０；ＨまたはＫで置換されたＲ１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換さ
れたＴ１３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４；Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６；ＨまたはＲで置換されたＫ１７；Ｈ
またはＲで置換されたＫ１８；ＨまたはＫで置換されたＲ１９；Ｄで置換された
Ｅ２０；Ｄで置換されたＥ２１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換された
Ｍ２２；ＨまたはＲで置換されたＫ２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＬ２４；ＨまたはＲで置換されたＫ２５；Ｄで置換されたＥ２６；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍまた
はＶで置換されたＳ２９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０
；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ３１；ＨまたはＫで置換され
たＲ３３；ＨまたはＲで置換されたＫ３４；Ｄで置換されたＥ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＳ３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３９；Ｈま
たはＫで置換されたＲ４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４
１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４２；ＨまたはＲで置換さ
れたＫ４３；Ｅで置換されたＤ４４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＧ４５；ＨまたはＲで置換されたＫ４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＬ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＡ５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５
１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、ＭまたはＶで置換されたＬ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＬ５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＬ５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ５８；Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＴ６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６３；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＳ６５；ＷまたはＹで置換されたＦ６６；ＦまたはＷで置
換されたＹ６７；Ｎで置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置
換されたＶ６９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７０；Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ７２；Ｎで置換されたＱ７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＧ７４；Ｅで置換されたＤ７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＬ７９；ＨまたはＫで置換されたＲ８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８１；Ｄで置換されたＥ８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８３；Ｎで置換されたＱ８４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ８５；ＫまたはＲで置換されたＨ８６；Ｋまた
はＲで置換されたＨ８７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８８
；Ｄで置換されたＥ８９；ＨまたはＲで置換されたＫ９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、ＭまたはＶで置換されたＬ９１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＡ９３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＧ９６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９７；Ｈまた
はＲで置換されたＫ９９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０
０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０２；Ｄで置換されたＥ１０３；Ｄで置換され
たＥ１０４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０５；Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔまたは
Ｍで置換されたＶ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０
９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ１１２；ＨまたはＲで置換されたＫ１１３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＩ１１４；ＷまたはＹで置換されたＦ１１５；Ｄで置換され
たＥ１１６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１９；Ａ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２１；Ｄで置換されたＥ１２２；Ａ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＳ１２６；Ｎで置換されたＱ１２７；Ｑで置換されたＮ
１２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２９；ＨまたはＫで
置換されたＲ１３０；Ｑで置換されたＮ１３１；ＨまたはＲで置換されたＫ１３
２；ＨまたはＫで置換されたＲ１３３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＡ１３４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１３５；Ｎで
置換されたＱ１３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１３７；
Ｄで置換されたＥ１３９；Ｄで置換されたＥ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍま
たはＶで置換されたＴ１４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ
１４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４３；Ｎで置換され
たＱ１４４；Ｅで置換されたＤ１４５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ１４７；Ｎで置換されたＱ１４８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＬ１４９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１５０；
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５１；Ｅで置換されたＤ１５
２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５３；Ｄで置換されたＥ
１５４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１５７；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＩ１５８；Ｎで置換されたＱ１５９；ＨまたはＲで置換されたＫ１６
０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１６２；ＦまたはＷで置換されたＹ１６３；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１６４；ＷまたはＹで置換されたＦ
１６５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１６６；ＦまたはＹで
置換されたＷ１６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６９；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＳ１７１；ＷまたはＹで置換されたＦ１７２；Ｈまたは
Ｒで置換されたＫ１７３；ＨまたはＫで置換されたＲ１７４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＳ１７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１７７；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１７８；Ｄで置換されたＥ１７９；
Ｄで置換されたＥ１８０；ＨまたはＲで置換されたＫ１８１；Ｄで置換されたＥ
１８２；Ｑで置換されたＮ１８３；ＨまたはＲで置換されたＫ１８４；Ａ、Ｇ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ１８６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１８
７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８８；Ｄで置換されたＥ１８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１９０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＧ１９１；ＦまたはＷで置換されたＹ１９２；ＷまたはＹで置換され
たＦ１９３；ＷまたはＹで置換されたＦ１９４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＩ１９５；ＦまたはＷで置換されたＹ１９６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９７；Ｎで置換されたＱ１９８；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＬ２００；ＦまたはＷで置換されたＹ２０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
ＭまたはＶで置換されたＴ２０２；Ｅで置換されたＤ２０３；ＨまたはＲで置換
されたＫ２０４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０５；Ｆま
たはＷで置換されたＹ２０６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ
２０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２０８；Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２０９；ＫまたはＲで置換されたＨ２１０；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２１１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＩ２１２；Ｎで置換されたＱ２１３；ＨまたはＫで置換
されたＲ２１４；ＨまたはＲで置換されたＫ２１５；ＨまたはＲで置換されたＫ
２１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１７；ＫまたはＲで
置換されたＨ２１８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１９；
ＷまたはＹで置換されたＦ２２０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＧ２２１；Ｅで置換されたＤ２２２；Ｄで置換されたＥ２２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＳ２２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２６；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
ＭまたはＶで置換されたＴ２２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＬ２２９；ＷまたはＹで置換されたＦ２３０；ＨまたはＫで置換されたＲ２３
１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２３３；Ｎで置換されたＱ
２３４；Ｑで置換されたＮ２３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換され
たＭ２３６；Ｄで置換されたＥ２３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換
されたＴ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４０；Ｑで
置換されたＮ２４２；Ｑで置換されたＮ２４３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＳ２４４；ＦまたはＷで置換されたＹ２４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２４７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＡ２４８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２４９；Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＡ２５１；ＨまたはＲで置換されたＫ２５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５３；Ｄで置換されたＥ２５４；Ｄで置換
されたＥ２５５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２５６；Ｅで
置換されたＤ２５７；Ｄで置換されたＥ２５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ２５９；Ｎで置換されたＱ２６０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＬ２６１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ
２６２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２６３；ＨまたはＫで
置換されたＲ２６５；Ｄで置換されたＥ２６６；Ｑで置換されたＮ２６７；Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６８；Ｎで置換されたＱ２６９；
Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２７０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＳ２７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＬ２７２；Ｅで置換されたＤ２７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＧ２７４；Ｅで置換されたＤ２７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで
置換されたＶ２７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２７７；
ＷまたはＹで置換されたＦ２７８；ＷまたはＹで置換されたＦ２７９；Ａ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＡ２８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８
２；ＨまたはＲで置換されたＫ２８３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ２８４；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＬ２８５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明
によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニ
ュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性およ
び／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶
解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得
られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは
、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカ
イン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または
物理的特性を有する。
【０２９９】 別の実施形態では、ニュートロカイン−αＳＶのアミノ酸レベルでの部位特異
的変化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することによって行われ得
る。配列番号１９に提供されるニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の好まし
い保存的置換変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔまたは
Ｖで置換されたＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｅで置換されたＤ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換
されたＴ５；Ｄで置換されたＥ６；ＨまたはＫで置換されたＲ７；Ｄで置換され
たＥ８；Ｎで置換されたＱ９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ
１０；ＨまたはＫで置換されたＲ１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ１２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１３；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＬ１６；ＨまたはＲで置換されたＫ１７；ＨまたはＲで置換された
Ｋ１８；ＨまたはＫで置換されたＲ１９；Ｄで置換されたＥ２０；Ｄで置換され
たＥ２１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２２；ＨまたはＲで
置換されたＫ２３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２４；Ｈま
たはＲで置換されたＫ２５；Ｄで置換されたＥ２６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔま
たはＭで置換されたＶ２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２
９；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、ＭまたはＶで置換されたＬ３１；ＨまたはＫで置換されたＲ３３；ＨまたはＲ
で置換されたＫ３４；Ｄで置換されたＥ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＳ３６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ３８；Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ３９；ＨまたはＫで置換されたＲ
４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４２；ＨまたはＲで置換されたＫ４３；Ｅで置換
されたＤ４４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４５；Ｈまたは
Ｒで置換されたＫ４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４７；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＡ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ
５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＬ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＬ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５７；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまた
はＶで置換されたＬ６１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６２
；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
ＴまたはＭで置換されたＶ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ｓ６５；ＷまたはＹで置換されたＦ６６；ＦまたはＷで置換されたＹ６７；Ｎで
置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６９；Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまた
はＶで置換されたＡ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７２
；Ｎで置換されたＱ７３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ７４
；Ｅで置換されたＤ７５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７６
；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＳ７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ｌ７９；ＨまたはＫで置換されたＲ８０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＡ８１；Ｄで置換されたＥ８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＬ８３；Ｎで置換されたＱ８４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＧ８５；ＫまたはＲで置換されたＨ８６；ＫまたはＲで置換されたＨ８
７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ８８；Ｄで置換されたＥ８
９；ＨまたはＲで置換されたＫ９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＬ９１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９３；Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＡ９５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ９６；Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９７；ＨまたはＲで置換されたＫ９
９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１００；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１０１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ１０２；Ｄで置換されたＥ１０３；Ｄで置換されたＥ１０４；Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１０５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＡ１０７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１０
８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＧ１１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１１２；Ｈま
たはＲで置換されたＫ１１３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ
１１４；ＷまたはＹで置換されたＦ１１５；Ｄで置換されたＥ１１６；Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＧ１２１；Ｄで置換されたＥ１２２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＧ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＳ１２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＳ１２６；Ｎで置換されたＱ１２７；Ｑで置換されたＮ１２８；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１２９；ＨまたはＫで置換されたＲ１３０；
Ｑで置換されたＮ１３１；ＨまたはＲで置換されたＫ１３２；ＨまたはＫで置換
されたＲ１３３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３４；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１３５；Ｎで置換されたＱ１３６；
Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１３７；Ｄで置換されたＥ１３
９；Ｄで置換されたＥ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ
１４１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１４２；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４３；ＦまたはＷで置換されたＹ１４４；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１４５；ＷまたはＹで置換され
たＦ１４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１４７；Ｆまたは
Ｙで置換されたＷ１４９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５
０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５２；ＷまたはＹで置換されたＦ１５３；Ｈま
たはＲで置換されたＫ１５４；ＨまたはＫで置換されたＲ１５５；Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＳ１５７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５８；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１５９；Ｄで置換されたＥ１６
０；Ｄで置換されたＥ１６１；ＨまたはＲで置換されたＫ１６２；Ｄで置換され
たＥ１６３；Ｑで置換されたＮ１６４；ＨまたはＲで置換されたＫ１６５；Ａ、
Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１６６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＬ１６７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ
１６８；ＨまたはＲで置換されたＫ１６９；Ｄで置換されたＥ１７０；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１７１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＧ１７２；ＦまたはＷで置換されたＹ１７３；ＷまたはＹで置換
されたＦ１７４；ＷまたはＹで置換されたＦ１７５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＩ１７６；ＦまたはＷで置換されたＹ１７７；Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１７８；Ｎで置換されたＱ１７９；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１８０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ１８１；ＦまたはＷで置換されたＹ１８２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１８３；Ｅで置換されたＤ１８４；ＨまたはＲで
置換されたＫ１８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１８６；
ＦまたはＷで置換されたＹ１８７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＡ１８８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１８９；Ａ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９０；ＫまたはＲで置換されたＨ１９
１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１９２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１９３；Ｎで置換されたＱ１９４；ＨまたはＫで
置換されたＲ１９５；ＨまたはＲで置換されたＫ１９６；ＨまたはＲで置換され
たＫ１９７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９８；Ｋまたは
Ｒで置換されたＨ１９９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２０
０；ＷまたはＹで置換されたＦ２０１；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＧ２０２；Ｅで置換されたＤ２０３；Ｄで置換されたＥ２０４；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＳ２０６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０
７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２０９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ２１０；ＷまたはＹで置換されたＦ２１１；ＨまたはＫで置換されたＲ
２１２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２１４；Ｎで置換され
たＱ２１５；Ｑで置換されたＮ２１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換
されたＭ２１７；Ｄで置換されたＥ２１９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで
置換されたＴ２２０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２１；
Ｑで置換されたＮ２２３；Ｑで置換されたＮ２２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＳ２２５；ＦまたはＷで置換されたＹ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２８；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＡ２２９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２３０；
Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２３１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＡ２３２；ＨまたはＲで置換されたＫ２３３；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２３４；Ｄで置換されたＥ２３５；Ｄで
置換されたＥ２３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２３７；
Ｅで置換されたＤ２３８；Ｄで置換されたＥ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＬ２４０；Ｎで置換されたＱ２４１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＬ２４２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＡ２４３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２４４；Ｈまたは
Ｋで置換されたＲ２４６；Ｄで置換されたＥ２４７；Ｑで置換されたＮ２４８；
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２４９；Ｎで置換されたＱ２５
０；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ２５３；Ｅで置換されたＤ２５４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＧ２５５；Ｅで置換されたＤ２５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔまたは
Ｍで置換されたＶ２５７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２５
８；ＷまたはＹで置換されたＦ２５９；ＷまたはＹで置換されたＦ２６０；Ａ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２６１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＡ２６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ
２６３；ＨまたはＲで置換されたＫ２６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＬ２６５；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＬ２６６。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本
発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は
、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性
および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性および／また
は溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明
の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好まし
くは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少したニュート
ロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／ま
たは物理的特性を有する。
【０３００】 別の実施形態では、ニュートロカイン−αのアミノ酸レベルでの部位特異的変
化は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することにより行われ得る。配
列番号２３に提供されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の好ましい保存的置
換変異としては、以下が挙げられる：ＨまたはＫで置換されたＲ１；Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置
換されたＶ３；Ｅで置換されたＤ４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＬ５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＡ１０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１３；Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５；ＨまたはＫで置換されたＲ１７；Ｋ
またはＲで置換されたＨ１８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ
１９；Ｎで置換されたＱ２０；ＫまたはＲで置換されたＨ２１；Ｅで置換された
Ｄ２２；Ｅで置換されたＤ２３；Ｑで置換されたＮ２４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＧ２５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換された
Ｍ２６；Ｑで置換されたＮ２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ｌ２８；ＨまたはＫで置換されたＲ２９；Ｑで置換されたＮ３０；ＨまたはＫで
置換されたＲ３１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ３２；Ｆま
たはＷで置換されたＹ３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ３
４；ＷまたはＹで置換されたＦ３５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換さ
れたＶ３６；ＦまたはＹで置換されたＷ３８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＬ３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４０；Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ４１；ＷまたはＹで置換されたＦ
４２；ＨまたはＲで置換されたＫ４３；ＨまたはＫで置換されたＲ４４；Ａ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４５；Ｑで置換されたＮ４６；Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ４７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ４８；Ｄで置換されたＥ４９；Ｄで置換されたＥ５０；Ｈまた
はＲで置換されたＫ５１；Ｄで置換されたＥ５２；Ｑで置換されたＮ５３；Ｈま
たはＲで置換されたＫ５４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ５
５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、ＴまたはＭで置換されたＶ５７；ＨまたはＫで置換されたＲ５８；Ｎで置換さ
れたＱ５９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６０；Ａ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ６１；ＦまたはＷで置換されたＹ６２；Ｗ
またはＹで置換されたＦ６３；ＷまたはＹで置換されたＦ６４；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ６５；ＦまたはＷで置換されたＹ６６；Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６７；Ｎで置換されたＱ６８；Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ７０；ＦまたはＷで置換されたＹ７１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
ＭまたはＶで置換されたＴ７２；Ｅで置換されたＤ７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＩ７５；ＷまたはＹで置換されたＦ７６；Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置
換されたＭ７８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ７９；Ｋまた
はＲで置換されたＨ８０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ８１
；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ８２；Ｎで置換されたＱ８３
；ＨまたはＫで置換されたＲ８４；ＨまたはＲで置換されたＫ８５；ＨまたはＲ
で置換されたＫ８６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ８７；Ｋ
またはＲで置換されたＨ８８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ
８９；ＷまたはＹで置換されたＦ９０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＧ９１；Ｅで置換されたＤ９２；Ｄで置換されたＥ９３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＳ９５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９６；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ９７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶ
で置換されたＴ９８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ９９；Ｗ
またはＹで置換されたＦ１００；ＨまたはＫで置換されたＲ１０１；Ａ、Ｇ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１０３；Ｎで置換されたＱ１０４；Ｑで置
換されたＮ１０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１０６；Ｈ
またはＲで置換されたＫ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換された
Ｔ１０９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１１０；Ｑで置換さ
れたＮ１１２；Ｑで置換されたＮ１１３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＳ１１４；ＦまたはＷで置換されたＹ１１６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＳ１１７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ａ１１８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１１９；Ａ、Ｇ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１２０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＡ１２１；ＨまたはＫで置換されたＲ１２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、ＭまたはＶで置換されたＬ１２３；Ｄで置換されたＥ１２４；Ｄで置換された
Ｅ１２５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２６；Ｅで置換さ
れたＤ１２７；Ｄで置換されたＥ１２８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置
換されたＩ１２９；Ｎで置換されたＱ１３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＬ１３１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３２
；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１３３；ＨまたはＫで置換さ
れたＲ１３５；Ｄで置換されたＥ１３６；Ｑで置換されたＮ１３７；Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１３８；Ｎで置換されたＱ１３９；Ａ、Ｇ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍまた
はＶで置換されたＳ１４１；ＨまたはＫで置換されたＲ１４２；Ｑで置換された
Ｎ１４３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１４４；Ｅで置換さ
れたＤ１４５；Ｅで置換されたＤ１４６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置
換されたＴ１４７；ＷまたはＹで置換されたＦ１４８；ＷまたはＹで置換された
Ｆ１４９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５０；Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＬ１５２；ＨまたはＲで置換されたＫ１５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ
、ＭまたはＶで置換されたＬ１５４；および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＬ１５５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドもまた本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−
αタンパク質は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳ
Ｖの機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定
性および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好ま
しくは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュ
ートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有す
る。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニ
ュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減
少したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的
活性および／または物理的特性を有する。
【０３０１】 別の実施形態では、ニュートロカイン−αアミノ酸レベルでの部位特異的変化
は、特定のアミノ酸を保存的置換によって置換することにより行われ得る。配列
番号３８に提供されるニュートロカイン−αアミノ酸配列の好ましい保存的置換
変異としては、以下が挙げられる：Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換され
たＭ１；Ｅで置換されたＤ２；Ｄで置換されたＥ３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＳ４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５；
ＨまたはＲで置換されたＫ６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ
７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＬ１３；ＷまたはＹで置換されたＦ１５；Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７；Ｄで置換されたＥ１８；ＨまたはＲで
置換されたＫ１９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２０；Ｄで
置換されたＥ２１；Ｅで置換されたＤ２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで
置換されたＭ２３；ＨまたはＲで置換されたＫ２４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔま
たはＭで置換されたＶ２５；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２
６；ＦまたはＷで置換されたＹ２７；Ｅで置換されたＤ２８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換さ
れたＴ３１；Ｎで置換されたＱ３３；ＨまたはＲで置換されたＫ３４；Ｄで置換
されたＥ３５；Ｄで置換されたＥ３６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＧ３７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ３８；Ｆまたは
Ｙで置換されたＷ３９；ＷまたはＹで置換されたＦ４０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＧ４１；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ｉ４２；ＨまたはＫで置換されたＲ４４；Ｅで置換されたＤ４５；Ａ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ４６；ＨまたはＫで置換されたＲ４７；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ４８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまた
はＶで置換されたＬ４９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５０
；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ５１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
ＭまたはＶで置換されたＴ５２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換された
Ｌ５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ
、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＡ５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５７；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ５８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶ
で置換されたＳ５９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６０；Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６１；ＷまたはＹで置換されたＦ
６２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ６３；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換さ
れたＭ６５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ６６；Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ６７；ＦまたはＷで置換されたＹ６８；Ｎ
で置換されたＱ６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７０；Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＡ７２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７
３；Ｎで置換されたＱ７４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ７
５；Ｅで置換されたＤ７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ７
７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ７８；Ｑで置換されたＮ７
９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８０；ＨまたはＫで置換さ
れたＲ８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ８２；Ｄで置換さ
れたＥ８３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ８４；Ｎで置換さ
れたＱ８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ８６；ＦまたはＷ
で置換されたＹ８７；ＨまたはＫで置換されたＲ８８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
またはＶで置換されたＧ８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ
９０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ９２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換さ
れたＡ９４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９５；Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９６；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＧ９７；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ９８；Ｄで
置換されたＥ１００；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０１；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＡ１０３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＧ１０４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１０５；Ｈまたは
Ｒで置換されたＫ１０６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０
７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１０８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１０９；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換
されたＡ１１１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１１２；Ｈま
たはＫで置換されたＲ１１４；ＫまたはＲで置換されたＨ１１６；Ｑで置換され
たＮ１１７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１８；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１１９；ＨまたはＫで置換されたＲ１２
０；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１２１；ＫまたはＲで置換
されたＨ１２２；ＨまたはＫで置換されたＲ１２３；Ｑで置換されたＮ１２４；
ＨまたはＫで置換されたＲ１２５；ＨまたはＫで置換されたＲ１２６；Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１２７；ＷまたはＹで置換されたＦ１２
８；Ｎで置換されたＱ１２９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ
１３０；Ｄで置換されたＥ１３２；Ｄで置換されたＥ１３３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１３４；Ｄで置換されたＥ１３５；Ｎで置換され
たＱ１３６；Ｅで置換されたＤ１３７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換
されたＶ１３８；Ｅで置換されたＤ１３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＬ１４０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１４１；
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１４２；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＡ１４５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＬ１４８；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１５０；Ｈまたは
Ｋで置換されたＲ１５２；ＫまたはＲで置換されたＨ１５３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１５４；Ｎで置換されたＱ１５５；ＫまたはＲで
置換されたＨ１５６；Ｅで置換されたＤ１５７；Ｅで置換されたＤ１５８；Ｑで
置換されたＮ１５９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１６０；
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ１６１；Ｑで置換されたＮ１６
２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ１６３；ＨまたはＫで置換
されたＲ１６４；Ｑで置換されたＮ１６５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＩ１６６；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ１６７；
Ｎで置換されたＱ１６８；Ｅで置換されたＤ１６９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＬ１７１；Ｎで置換されたＱ１７２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＬ１７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＩ１７４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１７５；Ｅで置換
されたＤ１７６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ１７７；Ｅで
置換されたＤ１７８；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ１７９；
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ１８１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＬ１８２；Ｄで置換されたＥ１８３；Ｄで置換されたＥ
１８４；ＨまたはＲで置換されたＫ１８５；Ｄで置換されたＥ１８６；Ｑで置換
されたＮ１８７；ＨまたはＲで置換されたＫ１８８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＩ１８９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ
１９０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ１９１；ＨまたはＫで
置換されたＲ１９２；Ｎで置換されたＱ１９３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＴ１９４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ１９
５；ＦまたはＷで置換されたＹ１９６；ＷまたはＹで置換されたＦ１９７；Ｗま
たはＹで置換されたＦ１９８；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ
１９９；ＦまたはＷで置換されたＹ２００；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＳ２０１；Ｎで置換されたＱ２０２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔまたは
Ｍで置換されたＶ２０３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２０
４；ＦまたはＷで置換されたＹ２０５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換
されたＴ２０６；Ｅで置換されたＤ２０７；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＩ２０９；ＷまたはＹで置換されたＦ２１０；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
ＭまたはＶで置換されたＡ２１１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＶで置換され
たＭ２１２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２１３；Ｋまたは
Ｒで置換されたＨ２１４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２１
５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２１６；Ｎで置換されたＱ
２１７；ＨまたはＫで置換されたＲ２１８；ＨまたはＲで置換されたＫ２１９；
ＨまたはＲで置換されたＫ２２０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換され
たＶ２２１；ＫまたはＲで置換されたＨ２２２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔまたは
Ｍで置換されたＶ２２３；ＷまたはＹで置換されたＦ２２４；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＧ２２５；Ｅで置換されたＤ２２６；Ｄで置換され
たＥ２２７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２２８；Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２２９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍまたは
Ｖで置換されたＬ２３０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＴまたはＭで置換されたＶ２３
１；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２３２；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、
Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２３３；ＷまたはＹで置換されたＦ２３４；Ｈま
たはＫで置換されたＲ２３５；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ
２３７；Ｎで置換されたＱ２３８；Ｑで置換されたＮ２３９；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、ＴまたはＶで置換されたＭ２４０；ＨまたはＲで置換されたＫ２４２；Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２４３；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＬ２４４；Ｑで置換されたＮ２４６；Ｑで置換されたＮ２４
７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２４８；ＦまたはＷで置換
されたＹ２５０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２５１；Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２５２；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＧ２５３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ
２５４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２５５；ＨまたはＫで
置換されたＲ２５６；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２５７；
Ｄで置換されたＥ２５８；Ｄで置換されたＥ２５９；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＧ２６０；Ｅで置換されたＤ２６１；Ｄで置換されたＥ２６
２；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＩ２６３；Ｎで置換されたＱ
２６４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２６５；Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ２６６；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで
置換されたＩ２６７；ＨまたはＫで置換されたＲ２６９；Ｄで置換されたＥ２７
０；Ｑで置換されたＮ２７１；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ
２７２；Ｎで置換されたＱ２７３；Ａ、Ｇ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換され
たＩ２７４；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＳ２７５；Ｈまたは
Ｋで置換されたＲ２７６；Ｑで置換されたＮ２７７；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＧ２７８；Ｅで置換されたＤ２７９；Ｅで置換されたＤ２８
０；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、ＭまたはＶで置換されたＴ２８１；ＷまたはＹで置換
されたＦ２８２；ＷまたはＹで置換されたＦ２８３；Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍま
たはＶで置換されたＧ２８４；Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＡ
２８５；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８６；ＨまたはＲで
置換されたＫ２８７；Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８８；
および／あるいはＡ、Ｇ、Ｉ、Ｓ、Ｔ、ＭまたはＶで置換されたＬ２８９。これ
らのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明によって包含され
る。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質は、ニュートロカイン−
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的
特性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）につい
て慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質
は、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュ
ートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られ
るニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は
、１より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／
またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有す
る。
【０３０２】 本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリ
ペプチド中の機能に必須であるアミノ酸は、当該分野で公知の方法（例えば、部
位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ
およびＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）
））によって同定され得る。後者の手順は、単一のアラニン変異をこの分子中の
あらゆる残基に導入する。次いで、得られる変異体分子は、例えば、増殖、分化
および／または活性化のような機能的活性（例えば、リガンド結合およびリンパ
球（例えば、Ｂ細胞）を刺激する能力）について試験される。
【０３０３】 特に興味深いのは、非常に望ましい改善された特徴（例えば、凝集が少ないこ
と）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電アミノ酸または中性アミノ酸で
の荷電アミノ酸の置換である。凝集は、活性を減少させ得るだけでなく、薬学的
処方物を調製する場合に問題があり得る。なぜなら、凝集物は免疫原性であり得
るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：
３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８
３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａ
ｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３
７７（１９９３）。
【０３０４】 別の実施形態では、本発明は、配列番号２に提供されるアミノ酸配列の非保存
的置換を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。例えば、配列番号
２に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の非保存的置換としては、
以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＭ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ６；Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＲ７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＥ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１１；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１２；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換
されたＣ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＬ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＫ１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９；Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＥ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２５；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＥ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３２；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＲ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＫ３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３７
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ３９；Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＲ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＳ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＳ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＫ４３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４６；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４７；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４８；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ５９；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙまた
はＰで置換されたＣ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＬ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＴ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＶ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＶ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＳ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、ＰまたはＣで置換されたＦ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ６８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６９；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７０；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７１；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７２；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＱ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＧ７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＬ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＡ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＳ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８２；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＱ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＧ８５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＨ８６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８９；Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＫ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＬ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＧ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＡ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＧ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＡ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９９；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１００；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１０１；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１０２；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＥ１０３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１０６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０７
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１０８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１０９
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１０
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１１１
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１１２
；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＫ１１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＩ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１１５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１１６；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣ
で置換されたＰ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１
２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１
２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＥ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＧ１２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１
２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＮ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＳ１２９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１３１
；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＫ１３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１３６；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１３７；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣ
で置換されたＰ１３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１３９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１４０；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４１；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１４２；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４３；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＱ１４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ１４６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１４７
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＱ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＬ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＩ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＡ１５１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ１５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１５４
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１５５
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
またはＣで置換されたＰ１５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＴ１５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＩ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１５９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６０
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１６１
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１６２
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣ
で置換されたＹ１６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＴ１６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１６７；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置
換されたＷ１６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＬ１６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＬ１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＳ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１７３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１
７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１
７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１
７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１
７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１
７８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＥ１７９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１８０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８１
；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＥ１８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１８３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１８４；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１８５；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１８６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１８７；Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＫ１８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された
Ｆ１９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ
またはＣで置換されたＦ１９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＩ１９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１９８
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１９９
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２００
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣ
で置換されたＹ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＴ２０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２０３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２０４；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２０５；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換さ
れたＹ２０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＡ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＭ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＧ２０９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＨ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＬ２１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＩ２１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２１３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２
１４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＫ２１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ２１８；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２１９；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換さ
れたＦ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＧ２２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２２２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された
Ｆ２３０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＲ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された
Ｑ２３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＮ２３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＭ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２３７；Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＥ２３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＴ２３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＬ２４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２４２；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＮ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＳ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ２４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ２４６；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２４７；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２４８；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２４９；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２５０；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２５１；Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＫ２５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＬ２５３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２５６；Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＤ２５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置
換されたＰ２６４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２６５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＮ２６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＡ２６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２７２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＤ２７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＶ２７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＴ２７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、ＰまたはＣで置換されたＦ２７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２８２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２８３
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２８４
；および／あるいはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＬ２８５。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた
本発明によって包含される。本発明の得られるニュートロカイン−αタンパク質
は、本明細書を通して記載され、そして当該分野で公知のニュートロカイン−α
および／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特
性（例えば、増強または低減された安定性および／または溶解度など）について
慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本発明の得られるタンパク質は
、増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好ましくは、本発明の得られる
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質は、１
より多くの増加したおよび／または減少したニュートロカイン−αおよび／また
はニュートロカイン−αＳＶの機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０５】 さらなる実施形態では、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、上記
のように（保存的または非保存的のいずれかで）置換されたアミノ酸で置換され
た、１より多くのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、
１５、２０、３０および５０）を含むか、あるいはこれらのアミノ酸からなる。
【０３０６】 本発明の別の実施形態では、配列番号１９に提供されるニュートロカイン−α
ＳＶタンパク質配列の非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ
２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＤ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＳ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＴ５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＱ９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＳ１０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＴ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＳ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１７；
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＫ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された
Ｅ２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ
２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＫ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＬ２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置
換されたＣ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＶ２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＳ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＩ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された
Ｌ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ３４；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＥ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＳ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ３９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４３；
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＤ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＧ４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＡ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＡ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
またはＣで置換されたＴ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換されたＬ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＬ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣ
で置換されたＡ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＬ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＬ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＳ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換されたＣ６０；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ６１；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ６６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣ
で置換されたＹ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ７４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ７
５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７６
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ７７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ７８；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ７９；Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＲ８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れたＡ８１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換されたＬ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ８５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ８６；Ｄ
、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置
換されたＨ８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＡ８８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ８９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ９１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ
９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９
３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９４
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９５；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ９６；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ９７；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙまたは
Ｃで置換されたＰ９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１０３；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＥ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＡ１０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１１２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１１３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１１４；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換され
たＦ１１５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１１７；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで
置換されたＰ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＡ１１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１２２；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１２３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＮ１２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＳ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＳ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１２８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１２９；
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＲ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ１３１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１３２；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＲ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＡ１３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＶ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１３８；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＥ１３９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ
１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ
１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＷ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１５
３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＫ１５４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ１５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１５９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１６０；Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＥ１６１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ１６３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＮ１６４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１６８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１６９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ
１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ
１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ
１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐま
たはＣで置換されたＹ１７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ１７５；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１７６；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換
されたＹ１７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
されたＧ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ１７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ１８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ１８３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＤ１８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＫ１８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＴ１８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＹ１８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ１８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ１８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ１９０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＨ１９１；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ１９２；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ１９３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＱ１９４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ１９５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ１９６；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＫ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換され
たＶ１９８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＨ１９９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＶ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＧ２０２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２０
３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＥ２０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＳ２０６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＶ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＴ２０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２１１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２１２；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙまたは
Ｐで置換されたＣ２１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換されたＩ２１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２１６；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＭ２１７；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙま
たはＣで置換されたＰ２１８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２２１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ
２２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＮ２２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＰで置換され
たＣ２２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
ＰまたはＣで置換されたＹ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＳ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＡ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＧ２３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＩ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
ＰまたはＣで置換されたＡ２３２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３
５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＥ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＧ２３７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＥ２３
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２４
０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＱ２４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＬ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＡ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＩ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、ＹまたはＣで置換されたＰ２４５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＲ２４
６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＥ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＮ２４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＡ２４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＱ２５
０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＩ２５
１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＳ２５
２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２５
３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＤ２５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐま
たはＣで置換されたＧ２５５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＤ２５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＶ２５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＴ２５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換されたＦ２５９；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで
置換されたＦ２６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＧ２６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＡ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで
置換されたＬ２６３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＫ２６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６５；および／あるいはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換されたＬ２６６。これらのポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。本発明の得ら
れるニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書を通して記載され、そして当
該分野で公知のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
の機能的活性および／または物理的特性（例えば、増強または低減された安定性
および／または溶解度など）について慣用的にスクリーニングされ得る。好まし
くは、本発明の得られるタンパク質は、増加したおよび／または減少したニュー
トロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する
。より好ましくは、本発明の得られるニュートロカイン−αおよび／またはニュ
ートロカイン−αＳＶタンパク質は、１より多くの増加したおよび／または減少
したニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活
性および／または物理的特性を有する。
【０３０７】 さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αは、上記のような
置換アミノ酸（保存的かまたは非保存的のいずれか）で置換された１つより多く
のアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０
個、１５個、２０個、３０個および５０個）を含むかまたはこれらからなる。
【０３０８】 例えば、配列番号２３に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の好
ましい非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ１；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｖ２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ３；Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ｄ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ｌ５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ｓ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ａ７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ａ１０；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣで置換された、Ｐ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｌ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換
された、Ｐ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換
された、Ｇ１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１６；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ１７；Ｄ、Ｅ
、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れた、Ｈ１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れた、Ｓ１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｑ２０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｈ２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された
、Ｄ２２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換された、Ｄ２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｎ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｇ２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｍ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れた、Ｎ２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換さ
れた、Ｌ２８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、ＰまたはＣで置換された、Ｒ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｎ３０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｒ
３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｔ
３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐまた
はＣで置換された、Ｙ３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまた
はＣで置換された、Ｔ３４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｖ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ３
７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐまたは
Ｃで置換された、Ｗ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換された、Ｌ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換された、Ｌ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐまたは
Ｃで置換された、Ｓ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ４２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ＰまたはＣで置換された、Ｋ４３；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｒ４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ｇ４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ４８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ４９；
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｅ５０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ５１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ５２
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換された、Ｎ５３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ５７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ
５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｑ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、
Ｆ６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｆ６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｉ６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｑ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
た、Ｖ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｌ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ７２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ７３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ
で置換された、Ｐ７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ｉ７５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ７９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ８０
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ８
１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ
８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｑ８３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ８
５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｋ８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換された、Ｖ８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ９０
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ９
１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｄ９２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ９７；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ９８；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ９９；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｆ１００；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１０
２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ
１０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１０５；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ１０６；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、また
はＣで置換された、Ｐ１０７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置
換された、Ｐ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１
３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ
１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ１１６；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１７；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１１
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ
１２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ａ１２１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１２３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１２４；Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｅ１２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｇ１２６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１２７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｅ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｉ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換さ
れた、Ｐ１３４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１３５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３６；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｎ１３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ａ１３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１４１；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｒ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１４
５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｄ１４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｆ１４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｇ１５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ａ１５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｌ１５２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１５４；ならびに／またはＤ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１５５。
これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含
される。生じる本発明のニュートロカイン−αタンパク質は、本明細書中を通し
て記載されかつ当該分野で公知の、ニュートロカイン−αおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶの、機能的活性および／または物理的特性（例えば、安定性
および／または可溶性の、増強または減少）について慣用的にスクリーニングさ
れ得る。好ましくは、本発明の生じたタンパク質は、増加および／または減少し
た、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活
性を有する。より好ましくは、生じた本発明のニュートロカイン−αおよび／ま
たはニュートロカイン−αＳＶのタンパク質は、１つより多くの増大および／ま
たは減少した、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
の、機能的活性および／または物理的特性を有する。
【０３０９】 さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、
上記のような置換アミノ酸（保存的または非保存的のいずれか）で置換された、
１つより多くのアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個
、９個、１０個、１５個、２０個、３０個および５０個）を含むかまたはこれら
からなる。
【０３１０】 例えば、配列番号３８に提供されるニュートロカイン−αタンパク質配列の好
ましい非保存的置換としては、以下が挙げられる：Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ
、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２；Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ｅ３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ｓ４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ａ５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ
、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＣで置換された、Ｐ１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換
された、Ｃ１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｌ１３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ
、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１５；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、ま
たはＰで置換された、Ｃ１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｓ１７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ
１９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、
Ｇ２０；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２３；Ｄ、Ｅ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
た、Ｋ２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｖ２５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ｇ２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ２７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２８；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣ
で置換された、Ｐ２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ｉ３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｔ３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ
、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｑ３３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｋ３４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ３５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
た、Ｅ３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｇ３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換
された、Ａ３８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｗ３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ
、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ４２；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰ
で置換された、Ｃ４３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ４４；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ４５；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ４６；
Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｒ４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、または
Ｃで置換された、Ｌ４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｌ４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換された、Ａ５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ａ５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｔ５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ
、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ
、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ５６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ
、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ
、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、ＰまたはＣで置換された、Ｆ６２；Ｄ
、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ６３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ６４
；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ６
５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ
６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、
Ｌ６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｙ６８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ
、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｑ７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで
置換された、Ａ７５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ
、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ
、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ７
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ
８０；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換された、Ｒ８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｍ８２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換され
た、Ｑ８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｓ８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ
、Ｐ、またはＣで置換された、Ｙ８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ８８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ
、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ８９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ
、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９１；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ９２；Ｄ、Ｅ
、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、または
Ｃで置換された、Ｐ９３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ａ９４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、ま
たはＣで置換された、Ａ９５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ａ９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ
、またはＣで置換された、Ｇ９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ａ９８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ
、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ９９；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｅ１００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｌ１０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｔ１０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ａ１０３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１０４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ１０５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１０６；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１０７；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１０８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１０
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１
３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｒ１１４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１１５；Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｈ１１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１１７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１１９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２０；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１２
１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｈ１２２；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ
１２４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｒ１２５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１２６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｆ１２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１３
１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｅ１３２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１３４；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｅ１３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１３６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１３
７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ
１３８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１４１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ
１４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４
６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１４９；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１５
０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１５１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１５２；Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｈ１５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｓ１５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１５５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ１５６；Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｄ１５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１５８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ
１５９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｇ１６０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｍ１６１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１６３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１６４；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｎ１６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｉ１６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１６８；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｄ１６９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ１７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１７１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｑ１７２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｌ１７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｉ１７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ａ１７５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ１７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ１７７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｄ１７８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｔ１７９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ１８０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ１８１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ１８２；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｅ１８３；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ１８４；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１８５；Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｅ１８６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ１８７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ１８８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１８
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ
１９０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｖ１９１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ１９２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ１９３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ１９４；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ１９５；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｙ１９６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１９７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ１９８；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ１９
９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｙ２００；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｓ２０１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２０２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２０３；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２０４；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｙ２０５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｔ２０６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２０７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された
、Ｐ２０８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｉ２０９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２１０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２１１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２１２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２１３；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ２１
４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ
２１５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｉ２１６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２１７；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２１８；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｋ２１９；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｋ２２０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２２１；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、
Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｈ２２２；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｖ２２３；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｆ２２４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｇ２２５；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２２６；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｅ２２７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｌ２２８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｓ２２９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｌ２３０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｖ２３１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｔ２３２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２３３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２３４；Ｄ、Ｅ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｒ２３５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ２３６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２３７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｑ２３
８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｎ２３９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｍ２４０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２４１；Ｄ、
Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｋ２４２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｔ２４３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｌ２４４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２４５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｎ２４６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２４７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２４８；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、
Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＰで置換された、Ｃ
２４９；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｙ２５０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｓ２５１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２５２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２５３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、
Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２５４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２５５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、
Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２５
６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ
２５７；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２５８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、
Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２５９；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２６０；Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｄ２６１；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、
Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２６２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｉ２６３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｑ２６４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｌ２６５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ａ２６６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｉ２６７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、
Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＣで置換された、Ｐ２６８；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、
Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ
２６９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、
Ｐ、またはＣで置換された、Ｅ２７０；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｎ２７１；Ｄ、Ｅ、
Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２７２；Ｄ、
Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣ
で置換された、Ｑ２７３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｉ２７４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、
またはＣで置換された、Ｓ２７５；Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｒ２７６；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された
、Ｎ２７７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｇ２７８；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、
Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２７９；Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｄ２８０；
Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｔ２８
１；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、また
はＣで置換された、Ｆ２８２；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、
Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｆ２８３；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、
Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｇ２８４；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、
Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ａ２８５；Ｄ、Ｅ、Ｈ、
Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２８６；Ｄ、Ｅ、
Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｖ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置換さ
れた、Ｋ２８７；Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、またはＣで置
換された、Ｌ２８８；ならびに／またはＤ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｆ、Ｗ、
Ｙ、Ｐ、またはＣで置換された、Ｌ２８９。これらのポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。本発明の生じたニュートロ
カイン−αタンパク質は、本明細書全体にわたって記載されかつ当該分野で公知
である、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの、機
能的活性および／または物理的特性（例えば、安定性および／または溶解性の、
増強または減少）について、慣用的にスクリーニングされ得る。好ましくは、本
発明の生じたタンパク質は、増強および／または減少した、ニュートロカイン−
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの機能的活性を有する。より好まし
くは、本発明の生じるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶタンパク質は、１つより多くの、増強または減少した、ニュートロカイン
−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの、機能的活性および／または物
理的特性を有する。
【０３１１】 さらなる実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドは、
上記のような置換アミノ酸（保存的または非保存的のいずれか）で置換された、
１つより多くのアミノ酸（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個
、９個、１０個、１５個、２０個、３０個および５０個）を、含むかまたはそれ
らからなる。
【０３１２】 アミノ酸の置換はまた、細胞表面レセプターへのリガンドの結合の選択性を変
化し得る。例えば、Ｏｓｔａｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３６１：２６６〜２６８（
１９９３）は、２つの既知の型のＴＮＦレセプターのうちの１つのみへのＴＮＦ
−αの選択的結合を生じる特定の変異を記載する。ニュートロカイン−αおよび
ニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦポリペプチドファミリーのメンバーである
ので、ＴＮＦ−α中の変異に類似する変異は、ニュートロカイン−αおよび／ま
たはニュートロカイン−αＳＶ中で類似の効果を有するようである。
【０３１３】 リガンド−レセプター結合に重要な部位はまた、構造解析（例えば、結晶化、
核磁気共鳴または光親和性標識（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４
：８９９〜９０４（１９９２）およびｄｅ Ｖｏｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５
：３０６〜３１２（１９９２））により決定され得る。
【０３１４】 ニュートロカイン−αは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーである
ので、ニュートロカイン−αの機能的活性（例えば、生物学的活性）を完全に除
去するのではなく調節するためには、変異は、ＴＮＦ保存ドメインのアミノ酸を
コードする配列（すなわち、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）のＧｌｙ−１９１
〜Ｌｅｕ−２８４位）内に、より好ましくはそのＴＮＦファミリー（例えば、Ｔ
ＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンド）（例えば、図２Ａ〜
Ｂを参照のこと）のうちの全て、ほとんどまたはいくつかのメンバーには保存さ
れていない、この領域内の残基に作製される。このような保存アミノ酸が関連す
るＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカイン−α中に特定の変異を
作製することによって、そのニュートロカイン−αムテインは、アンタゴニスト
として作用し、これにより、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）の増殖、分化
、および／または活性化を阻害する、活性を保有する。従って、本発明のポリペ
プチドは、ニュートロカイン−α変異体を含む。このようなニュートロカイン−
α変異体は、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）に示されるニュートロカイン−α
アミノ酸配列の全長（または好ましくは細胞外ドメイン）の、フラグメント、改
変体または誘導体を、含むかまたはこれらからなる。上記のニュートロカイン−
α変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３１５】 ニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦ関連タンパク質ファミリーのメンバーで
あるので、ニュートロカイン−αＳＶの機能的活性（例えば、生物学的活性）を
完全に除去するのではなく調節するためには、変異は、ＴＮＦ保存ドメインのア
ミノ酸をコードする配列（すなわち、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）のＧｌ
ｙ−１７２〜Ｌｅｕ−２６５位）内に、より好ましくはそのＴＮＦファミリー（
例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、およびＦａｓリガンド）（例えば
、図２Ａ〜Ｂを参照のこと）のうちの全て、ほとんどまたはいくつかのメンバー
には保存されていない、この領域内の残基に作製される。このような保存アミノ
酸が関連するＴＮＦ中に代表的に見出される位置でニュートロカイン−αＳＶ中
に特定の変異を作製することによって、そのニュートロカイン−αＳＶムテイン
は、アンタゴニストとして作用し、これにより、例えば、リンパ球（例えば、Ｂ
細胞）の増殖、分化、および／または活性化を阻害する、活性を保有する。従っ
て、本発明のポリペプチドは、ニュートロカイン−αＳＶ変異体を含む。このよ
うなニュートロカイン−αＳＶ変異体は、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に
示されるニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の全長（または好ましくは細胞
外ドメイン）の、フラグメント、改変体または誘導体を、含むかまたはこれらか
らなる。上記のニュートロカイン−αＳＶ変異体をコードするポリヌクレオチド
もまた、本発明により包含される。
【０３１６】 さらに、このニュートロカインαＳＶポリペプチド配列にて見出されない１９
個のアミノ酸残基の挿入（すなわち、図１Ａおよび１Ｂならびに配列番号２に示
される配列のアミノ酸残基Ｖａｌ−１４２〜Ｌｙｓ−１６０）を含む、本発明の
ニュートロカイン−αポリペプチドの領域を標的とする変異が、このニュートロ
カイン−αポリペプチドの観察される機能的活性（例えば、生物学的活性）に影
響し得ることは、当業者に認識される。より詳細には、変異のために標的とされ
得るニュートロカイン−αポリペプチド配列のこのような残基の、部分的で、限
定的でなくかつ排他的でもない列挙としては、配列番号２において示されるニュ
ートロカイン−αポリペプチド配列の以下のアミノ酸残基が挙げられる：Ｖ−１
４２；Ｔ−１４３；Ｑ−１４４；Ｄ−１４５；Ｃ−１４６；Ｌ−１４７；Ｑ−１
４８；Ｌ−１４９；Ｉ−１５０；Ａ−１５１；Ｄ−１５２；Ｓ−１５３；Ｅ−１
５４；Ｔ−１５５；Ｐ−１５６；Ｔ−１５７；Ｉ−１５８；Ｑ−１５９；および
Ｋ−１６０。
【０３１７】 当業者に公知の組換えＤＮＡ技術（例えば、前出のＤＮＡシャッフリングを参
照のこと）が、新規な変異体タンパク質またはムテイン（単一または複数の、ア
ミノ酸置換、欠失、付加、または融合タンパク質を含む）を作製するために使用
され得る。このような改変ポリペプチドは、例えば、増強した活性または増加し
た安定性を示し得る。さらに、これらは、対応する天然のポリペプチドよりも、
少なくとも特定の精製条件および貯蔵条件下で、高い収量で精製され得、かつ良
好な可溶性を示し得る。
【０３１８】 従って、本発明はまた、選択された宿主中での発現、スケールアップなどによ
り良く適するニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポ
リペプチドを生成するために欠失、付加または置換された１つ以上のアミノ酸残
基を有する、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの
誘導体およびアナログも包含する。例えば、システイン残基が、ジスルフィド架
橋を除去するために、欠失され得るかまたは別のアミノ酸で置換され得る；Ｎ結
合グリコシル化部位が、例えば、Ｎ結合部位を過剰糖化することが公知である酵
母宿主からより容易に回収かつ精製される、異種産物の発現を達成するために、
変更または除去され得る。この目的のために、本発明のニュートロカイン−αお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド中のグリコシル化認識配列
のうちのいずれか１つ以上での第１のアミノ酸位置または第３のアミノ酸位置の
うちの１つまたは両方での種々のアミノ酸置換、ならびに／あるいは任意の１つ
以上のこのような認識配列の第２の位置でのアミノ酸欠失は、その改変トリペプ
チド配列でのそのニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳ
Ｖのグリコシル化を示す（例えば、Ｍｉｙａｊｉｍｏら、ＥＭＢＯ Ｊ ５（６
）：１１９３〜１１９７を参照のこと）。
【０３１９】 さらに、本発明のポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基（例えば、アルギニ
ン残基およびリジン残基）が、例えば、フューリンまたはケキシンのようなプロ
テアーゼによる望まれないプロセシングを排除するために、欠失され得るか、ま
たは別の残基で置換され得る。このような変異の１つの可能な結果は、本発明の
ニュートロカイン−αポリペプチドが切断されず、そして細胞表面から遊離され
ないことである。
【０３２０】 特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列の
Ｌｙｓ−１３２および／またはＡｒｇ−１３３は、ニュートロカイン−αを発現
する細胞からの可溶性形態のニュートロカインαの遊離を妨害または低減するた
めに、別のアミノ酸残基へと変異されるか、またはともに欠失される。より特定
の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＬｙｓ
−１３２は、Ａｌａ−１３２へと変異される。別の排他的でない特定の実施形態
において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列のＡｒｇ−１３３は
、Ａｌａ−１３３へと変異される。これらの変異したタンパク質、および／また
はこれらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、操作された細胞の表面
上に保持されるニュートロカイン−αポリペプチドを発現する細胞を操作するた
めに、例えば、エキソビボ治療または遺伝子治療のような用途を有する。
【０３２１】 特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列の
Ｃｙｓ−１４６は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現され
る場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー化を
妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか、
またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−１４６は、セリン
アミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドもまた、本発明により包含される。
【０３２２】 別の特定の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配
列のＣｙｓ−２３２は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現
される場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー
化を妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異される
か、またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−２３２は、セ
リンアミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドもまた、本発明により包含される。
【０３２３】 なお別の実施形態において、配列番号２に示されるニュートロカイン−α配列
のＣｙｓ−２４５は、発現系（特に、実施例１に記載されるような）にて発現さ
れる場合に、例えば、変異体ニュートロカイン−αポリペプチドのオリゴマー化
を妨害または低減するのを補助するために、別のアミノ酸残基へと変異されるか
、またはともに欠失される。特定の実施形態において、Ｃｙｓ−２４５は、セリ
ンアミノ酸残基で置換される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドもまた、本発明により包含される。
【０３２４】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、そして好ましく
は実質的に精製されている。ニュートロカイン−αポリペプチドおよび／または
ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの組換え産生型は、ＳｍｉｔｈおよびＪ
ｏｈｎｓｏｎ，Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８）に記載されるような一
工程の方法によって実質的に精製され得る。
【０３２５】 本発明のポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む、寄託さ
れたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号９７７６８）によってコードされる完全なポリ
ペプチド；寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟可溶性ポリペプチド；こ
のタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた細胞外ドメイン；
図１Ａおよび１Ｂの完全なポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１〜２８５）；
図１Ａおよび１Ｂの成熟可溶性ポリペプチド（配列番号２のアミノ酸１３４〜２
８５）；細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた図１Ａおよび１Ｂの細胞
外ドメイン（配列番号２のアミノ酸残基７３〜２８５）；ならびに上記のポリペ
プチドと少なくとも８０％、８５％、９０％の類似性、より好ましくは少なくと
も９５％の類似性、そしてなおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８
％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。
【０３２６】 本発明のポリペプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２０３
５１８）によってコードされるポリペプチドの細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン
、および細胞外ドメインを含む、寄託されたｃＤＮＡによってコードされる完全
なポリペプチド；この寄託されたｃＤＮＡによりコードされる成熟可溶性ポリペ
プチド；このタンパク質の細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた細胞外
ドメイン；図５Ａおよび５Ｂの完全なポリペプチド（配列番号１９のアミノ酸残
基１〜２６６）；細胞内ドメインおよび膜貫通ドメインを引いた図５Ａおよび５
Ｂの細胞外ドメイン（配列番号１９のアミノ酸残基７３〜２６６）；ならびに上
記のポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％の類似性、より好ましく
は少なくとも９５％の類似性、そしてなおより好ましくは少なくとも９６％、９
７％、９８％、または９９％の類似性を有するポリペプチドを含む。これらのポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２７】 本発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号９
７７６８）によってコードされるポリペプチドまたは図１Ａおよび１Ｂ（配列番
号２）のポリペプチドと、少なくとも８０％または少なくとも８５％同一、より
好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少なくと
も９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、そし
てまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０アミノ
酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。これらのポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドもまた、本発明に包含される。
【０３２８】 本発明のさらなるポリペプチドは、寄託されたｃＤＮＡ（ＡＴＣＣ受託番号２
０３５１８）によってコードされるポリペプチドまたは図５Ａおよび５Ｂ（配列
番号１９）のポリペプチドと、少なくとも８０％または少なくとも８５％同一、
より好ましくは少なくとも９０％または９５％同一、さらにより好ましくは少な
くとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドを含み、
そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも５０ア
ミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。これらのポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドもまた、本発明により包含される。
【０３２９】 ２つのポリペプチドについての「類似性％」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログ
ラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａ
ｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３
７１１）および類似性を決定するためのデフォールト設定を用いてその２つのポ
リペプチドのアミノ酸配列を比較することによって生じる、類似性の値が意図さ
れる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅ
ｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１
９８１））の局所的相同性アルゴリズムを、２つの配列間の類似性の最適のセグ
メントを見出すために使用する。
【０３３０】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
の参照アミノ酸配列に少なくとも、例えば、９５％「同一な」アミノ酸配列を有
するポリペプチドにより、そのポリペプチド配列がニュートロカイン−αおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの参照アミノ酸配列の各１００
アミノ酸毎に５つまでのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチ
ドのアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参
照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
得るために、その参照配列において５％までのアミノ酸残基が、欠失され得るか
、もしくは別のアミノ酸で置換され得るか、またはその参照配列における総アミ
ノ酸残基の５％までの数のアミノ酸が、その参照配列に挿入され得る。これらの
参照配列の改変は、その参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ
末端位置でかまたはそれらの末端位置の間のいずこかで、その参照配列の残基間
で個々にかもしくはその参照配列内で１つ以上の連続したグループとしてのいず
れかで分散して、起こり得る。
【０３３１】 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、図１Ａおよび１Ｂ（配列番
号２）に示されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＮＥＤＵ１５（
ＡＴＣＣ受託番号９７７６８）によりコードされるアミノ酸配列もしくはそのフ
ラグメント、または例えば、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）に示されるアミ
ノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＤＰＭＣ５２（ＡＴＣＣ受託番号２０
３５１８）によりコードされるアミノ酸配列もしくは例えばそのフラグメントと
、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、また
は９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ
８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇ
ｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような公知の
コンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の配列が、例
えば、本発明の参照配列と９５％同一であるかどうかを決定するために、Ｂｅｓ
ｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然
、同一性のパーセンテージがその参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、
そしてその参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相同性におけるギャッ
プが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０３３２】 特定の実施形態において、参照（照会）配列（本発明の配列）と対象配列との
間の同一性（全体的配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．
Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリズムに基
づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤ
Ｂアミノ酸整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｐ
ＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏ
ｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ
Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ
＝配列の長さ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔ
ｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さ
（どちらかより短い方）である。この実施形態によると、その対象配列が、Ｎ末
端またはＣ末端欠失により（内部の欠失のためではなく）照会配列よりも短い場
合、このＦＡＳＴＤＢプログラムが、全体的な同一性パーセントを算定する場合
に、その対象配列のＮ末端切断およびＣ末端切断を考慮しないという事実を考慮
するために、手動の補正が結果に対してなされる。Ｎ末端およびＣ末端で短縮さ
れている対象配列について、照会配列に対して、同一性パーセントは、対応する
対象残基と一致／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端である照会配列の
残基の数をその照会配列の総塩基のパーセントとして計算することによって補正
される。残基が一致／整列されているか否かは、そのＦＡＳＴＤＢ配列整列の結
果によって決定される。次いで、このパーセントが、上記のＦＡＳＴＤＢプログ
ラムによって特定のパラメーターを使用して計算された同一性パーセントから差
し引かれ、最終的な同一性パーセントのスコアに到達する。この最終的な同一性
パーセントのスコアが、本発明の目的で使用されるものである。照会配列と一致
／整列していない対象配列のＮ末端およびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセ
ントのスコアを手動で調整する目的のために考慮される。すなわち、対象配列の
最も遠いＮ末端およびＣ末端残基の外側の照会残基の位置のみである。例えば、
９０アミノ酸残基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００残基
の照会配列と整列される。欠失が対象配列のＮ末端で生じ、そしてそれゆえＦＡ
ＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０残基の一致／整列を示さない。１０個の不
対合残基は、その配列の１０％（一致していないＮ末端およびＣ末端の残基の数
／照会配列中の残基の総数）を表し、その結果ＦＡＳＴＤＢプログラムによって
計算される同一性パーセントのスコアから１０％が差し引かれる。残りの９０残
基が完全に一致した場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例に
おいて、９０残基の対象配列が、１００残基の照会配列と比較される。この場合
、欠失は、内部欠失であり、そのため照会配列と一致／整列しない対象配列のＮ
末端またはＣ末端の残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定さ
れる同一性パーセントは、手動で補正されない。再び、ＦＡＳＴＤＢ整列におい
て示される、照会配列と一致／整列しない対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側
の残基位置のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のた
めにはなされない。
【０３３３】 本発明のポリペプチドは、当業者に周知の方法を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルまたは分子ふるいゲル濾過カラムにおいて分子量マーカーとしての使用を含む
が、これらに限定されない用途を有する。さらに、下記に詳細に記載するように
、本発明のポリペプチドはまた、下記のようにニュートロカインαおよび／また
はニュートロカイン−αＳＶタンパク質の発現を検出するためのアッセイにおい
て有用であるか、またはニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶの機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして
有用である、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を惹起するための使
用を含むがこれらに限定されない、用途を有する。本発明のポリペプチドはまた
、本明細書中に記載のような治療用途も有する。さらに、このようなポリペプチ
ドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるニュートロカイン
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶの結合タンパク質を「捕獲する」た
めの酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。この酵母ツーハイブ
リッドシステムは、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４
５−２４６（１９８９）に記載されている。
【０３３４】 （導入遺伝子および「ノックアウト」） 本発明のポリペプチドはまた、トランスジェニック動物中で発現され得る。任
意の種（マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミクロピッ
グ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、および非ヒト霊長類（例えば
、ヒヒ、サル、およびチンパンジー）を含むがこれらに限定されない）が、トラ
ンスジェニック動物を作製するために使用され得る。特定の実施形態において、
本明細書中に記載されるかさもなくば当該分野公知の技術が、遺伝子治療プロト
コルの一部として、ヒトにおいて本発明のポリペプチドを発現するために使用さ
れる。
【０３３５】 当該分野で公知の任意の技術が、導入遺伝子（すなわち、本発明のポリヌクレ
オチド）を動物に導入して、トランスジェニック動物の創始系統を作製するため
に使用され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐ
ａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４
０：６９１−６９８（１９９４）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（ＮＹ）１１：１２６３−１２７０（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐ
ｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））；生殖系列へのレトロウ
イルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２（１９８５））、胚盤
胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子移入；胚性幹細胞における遺伝子標的
化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））；細
胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ、１９８３、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；遺伝子銃を用いた（例えば、
Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照のこと）
本発明のポリヌクレオチドの導入；胚性多能性幹細胞への核酸構築物の導入およ
び胚盤胞へのこの幹細胞の再移入；ならびに精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒ
ａｎｏら、Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９））；などを含むがこれ
らに限定されない。このような技術の総説については、本明細書中にその全体が
参考として援用される、Ｇｏｒｄｏｎ、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ
ｓ」、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１１５：１７１−２２９（１９８９）を
参照のこと。また、米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、Ｐ
ｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎａｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａ
ｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉ
ら、Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｏｎｔ
ａｉｎｉｎｇ Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉ
ｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ Ｓａ
ｍｅ）；米国特許第４，８７３，８６６号（Ｌｅｄｅｒら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ａｎｉｍａｌｓ）；ならびに米国特許第４，８７３，
１９１号（Ｗａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｚｙｇｏｔｅｓ）（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に
援用される）を参照のこと。
【０３３６】 当該分野で公知の任意の技術が、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジ
ェニッククローンを作製するために使用され得、そのような技術は、例えば、徐
核した卵母細胞への、休止期に誘導された培養した、胚性（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
）細胞由来の核、胎児細胞由来の核または成体細胞由来の核の、核移入である（
Ｃａｍｐｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４〜６６（１９９６）；Ｗｉｌｍ
ｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３（１９９７））。
【０３３７】 本発明は、その全ての細胞に導入遺伝子を有するトランスジェニック動物、な
らびにいくつかの細胞（しかしその全ての細胞ではない）に導入遺伝子を有する
動物（すなわち、モザイクまたはキメラ動物）を提供する。導入遺伝子は、１つ
の導入遺伝子としてまたはコンカテマー（例えば、頭−頭タンデム型または頭−
尾タンデム型）のような複数のコピーとして組み込まれ得る。この導入遺伝子は
また、例えば、Ｌａｓｋｏらの教示（Ｌａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））に従って特定
の細胞型に選択的に導入され得、そして活性化され得る。このような細胞型特異
的活性化に必要とされる調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれ
らは当業者に明らかである。ポリヌクレオチド導入遺伝子が、内在性遺伝子の染
色体部位に組み込まれることが所望される場合、遺伝子の標的化が好ましい。手
短に言えば、このような技術が利用される場合、内在性遺伝子に対して相同ない
くつかのヌクレオチド配列を含むベクターが、染色体配列との相同な組換えを介
して内在性遺伝子のヌクレオチド配列に組み込まれ、そのヌクレオチド配列の機
能を破壊することを目的として設計される。導入遺伝子はまた、特定の細胞型に
選択的に導入され得、従って、例えば、Ｇｕら（Ｇｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従って、導入された細胞型において
のみ内在性遺伝子が不活化される。そのような細胞型特異的不活化に必要とされ
る調節配列は、目的の特定の細胞型に依存し、そしてそれらは当業者に明らかで
ある。本発明のポリペプチドのトランスジェニック動物における、遍在または組
織特異的な様式での発現に加えて、種々の他の手段によってこのポリペプチドの
発現を調節する（例えば、発生的または化学的に調節された発現）構築物を作製
することはまた、当業者に慣用である。
【０３３８】 一旦トランスジェニック動物が作製されると、その組換え遺伝子の発現は、標
準的な技術を利用してアッセイされ得る。最初のスクリーニングは、サザンブロ
ット分析またはＰＣＲ技術によって達成されて、導入遺伝子の組み込みが起きた
ことを動物組織の分析により確認し得る。トランスジェニック動物の組織におけ
る導入遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルはまた、動物から得た組織サンプルのノーザ
ンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、逆転写酵素ＰＣＲ
（ｒｔ−ＰＣＲ）；およびＴａｑＭａｎ ＰＣＲを含むがこれらに限定されない
技術を用いて評価され得る。トランスジェニック遺伝子発現組織のサンプルはま
た、導入遺伝子産物に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学
的に評価され得る。
【０３３９】 一旦、創始動物が生成されると、それらは、交配され、同系交配され、異系交
配されるかまたは交雑されて、特定の動物のコロニーを生成し得る。そのような
交配戦略の例は、以下を含むがこれらに限定されない：別の系統を樹立するため
の１つより多くの組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相
加的発現効果によって、より高いレベルで導入遺伝子を発現する複合トランスジ
ェニックを生成するための別々の系統の同系交配；発現の増強およびＤＮＡ分析
による動物のスクリーニングの必要性の排除の両方のための、所定の組み込み部
位に対してホモ接合性の動物を生成するヘテロ接合性トランスジェニック動物の
交雑；複合ヘテロ接合性またはホモ接合性系統を生成するための別々のホモ接合
系統の交雑；目的の実験モデルに適切な異なるバックグラウンド上に導入遺伝子
を配置するための交配；ならびに、異なる導入遺伝子またはノックアウト変異を
保有する他の動物へのトランスジェニック動物の交配。
【０３４０】 本発明のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物は、Ｎｅｕｔｒｏｋ
ｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶポリペプチドの生物学
的機能の詳述、異常なＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅｕｔｒｏｋ
ｉｎｅ−αＳＶ発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこのよ
うな状態および／または障害の改善に有効な化合物についてのスクリーニングに
有用な動物モデル系を含むがこれらに限定されない用途を有する。
【０３４１】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリペプチドを発現するために
遺伝子操作される細胞、あるいは本発明のポリペプチドを発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）を、インビボで患者に投与する。こ
のような細胞は、患者（すなわち、ヒトを含む動物）またはＭＨＣ適合性ドナー
から入手され得、そして線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球）、脂
肪細胞、筋細胞、内皮細胞などを含み得るが、それらに限定されない。この細胞
を、例えば、形質導入（ウイルスベクターおよび好ましくは細胞ゲノム中に導入
遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトランスフェクション手順（プ
ラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロポレーション、リポソー
ムなどの使用を含むが、これらに限定されない）によって、細胞中に本発明のポ
リペプチドのコード配列を導入するために、あるいはこのコード配列および／ま
たは本発明のポリペプチドに結合している内因性の調節配列を破壊するために、
組換えＤＮＡ技術を使用してインビトロで遺伝子操作する。本発明のポリペプチ
ドのコード配列を強力な構成的プロモーターもしくは誘導性プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置し、本発明のポリペプチドの発現お
よび好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好ましく
は分泌する操作した細胞を、例えば、循環中において、または腹腔内で患者中へ
全身的に導入し得る。
【０３４２】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る）；遺
伝子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号ならびにＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と。これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０３４３】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞をカプセル性の形態で導入し得、この形態は、構成成分
と即時の細胞外環境との交換を可能にしつつ、導入細胞が宿主免疫系によって認
識されることを可能にしない。
【０３４４】 （抗体） さらに、本発明のポリペプチドは、（特異的な抗体抗原結合をアッセイするた
めの当該分野で周知のイムノアッセイによって決定されるような）本発明の、ポ
リペプチド、ポリペプチドフラグメント、または配列番号２および／もしくは配
列番号１９の改変体、および／またはエピトープに免疫特異的に結合する抗体お
よびＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体は、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキ
メラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ
発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ
）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいず
れかのエピトープ結合フラグメントを含むが、限定されない。本明細書中で使用
される場合、用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロリン分子の
免疫学的に活性な部分、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を
含む分子をいう。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意の
型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、任意
のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１および
ＩｇＡ２）または任意のサブクラスであり得る。免疫グロブリンは、重鎖および
軽鎖の両方を有し得る。ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇ
Ｙ重鎖のアレイは、κ型またはλ型の軽鎖と対であり得る。
【０３４５】 最も好ましくは、この抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり
、これには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃ
Ｆｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）ならびにＶＬまたはＶ
Ｈドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない
。単鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域を単独で、または以下
の全体もしくは部分と組み合わせて含み得る：ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、Ｃ
Ｈ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン。また、可変領域とヒンジ領域、ＣＨ１ドメ
イン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせもまた含む抗
原結合フラグメントがまた本発明に含まれる。本発明の抗体は、鳥類および哺乳
動物を含む任意の動物起点由来であり得る。好ましくは、この抗体は、ヒト、ネ
ズミ（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウスおよびウサギ）、ロバ、シップウサギ（
ｓｈｉｐ ｒａｂｂｉｔ）、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ
である。本明細書中で使用される場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンの
アミノ酸配列を有する抗体を含み、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーまた
は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、そして内
因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離さた抗体（下に記載のように、そ
して例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８
号において記載のような）を含む。
【０３４６】 本発明の抗体は、一重特異的、二重特異的、三重特異的またはより多くの多重
特異性の抗体であり得る。多重特異的な抗体は、本発明のポリペプチドの異なる
エピトープに対して特異的であり得るか、または本発明のポリペプチドおよび異
種のエピトープ（例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持体物質）、の両方
に特異的であり得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；同ＷＯ ９
２／０８８０２；同ＷＯ ９１／００３６０；同ＷＯ ９２／０５７９３；Ｔｕ
ｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４
，４７４，８９３号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号、
同第５，５７３，９２０号、同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
【０３４７】 本発明の抗体は、これらが認識または特異的に結合する、本発明のポリペプチ
ドのエピトープまたは部分に関して記載または特定化され得る。このエピトープ
またはポリペプチドの部分は、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置によって、連続
するアミノ酸残基におけるサイズによって本明細書中に記載されるように、また
は表および図に列挙されるように、特定化され得る。本発明の任意のエピトープ
またはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、排除され得る。従って、本
発明は、本発明のポリペプチドを特異的に結合し、そして本発明のポリペプチド
の排除を可能にする抗体を含む。
【０３４８】 特定の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列のＰｈ
ｅ−１１５〜Ｌｅｕ−１４７、Ｉｌｅ−１５０〜Ｔｙｒ−１６３、Ｓｅｒ−１７
１〜Ｐｈｅ−１９４、Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６、およびＳｅｒ−２７１
〜Ｐｈｅ−２７８を含むポリペプチドに結合する。別の特定の実施形態において
、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列のＰｈｅ−１１５〜Ｌｅｕ−１４
７、Ｉｌｅ−１５０〜Ｔｙｒ−１６３、Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４、Ｇｌ
ｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６、およびＳｅｒ−２７１〜Ｐｈｅ−２７８からなる
ポリペプチドに結合する。好ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番
号２のＧｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−２４６を含むポリペプチドに結合する。別の好
ましい実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２のＧｌｕ−２２３〜Ｔｙ
ｒ−２４６からなるポリペプチドに結合する。より好ましい実施形態において、
本発明の抗体は、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ａｓｎ−２４２からなるポリペ
プチドに結合する。さらに好ましい非排他的な実施形態において、本発明の抗体
は、特定の結合を介して本発明のＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αおよび／またはＮｅ
ｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶポリペプチドの１つ以上の生物学的活性を阻害する。
より好ましい実施形態において、本発明の抗体は、Ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αお
よび／またはＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αＳＶ媒介Ｂ細胞増殖を阻害する。
【０３４９】 本発明の抗体はまた、その交差反応性について記載または特定化され得る。本
発明のポリペプチドの任意の他のアナログ、オルソログまたはホモログを結合し
ない抗体が、含まれる。本発明のポリペプチドに対して少なくとも９５％、少な
くとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少な
くとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％および
少なくとも５０％の同一性（当該分野で公知の方法および本明細書中に記載され
る方法を用いて計算されるように）を有するポリペプチドを結合する抗体もまた
、本発明に含まれる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトタンパク
質の、マウスホモログ、ラットホモログおよび／またはウサギホモログならびに
対応するそれらのエピトープと交差反応する。本発明のポリペプチドに対して９
５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６
５％未満、６０％未満、５５％未満および５０％未満の同一性（当該分野で公知
の方法および本明細書中に記載される方法を用いて計算されるように）を有する
ポリペプチドを結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。特定の実施形態にお
いて、上記の交差反応性は、本明細書中に開示された、任意の単一特異的な抗原
性または免疫原性ポリペプチド、あるいは２、３、４、５以上の特異的抗原性お
よび／または免疫原生ポリペプチドの組み合わせに関する。さらに、ハイブリダ
イゼーション条件下（本明細書中で記載されるような）で本発明のポリヌクレオ
チドにハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを
結合する抗体が、本発明に含まれる。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチ
ドに対するそれらの結合親和性について記載または特定化され得る。好ましい結
合親和性としては、５×１０-5Ｍ未満、１０-5Ｍ未満、５×１０-6Ｍ未満、１０ -6 Ｍ未満、５×１０-7Ｍ未満、１０-7Ｍ未満、５×１０-8Ｍ未満、１０-8Ｍ未満
、５×１０-9Ｍ未満、１０-9Ｍ未満、５×１０-10Ｍ未満、１０-10Ｍ未満、５×
１０-11Ｍ未満、１０-11Ｍ未満、５×１０-12Ｍ未満、１０-12Ｍ未満、５×１０ -13 Ｍ未満、１０-13Ｍ未満、５×１０-14Ｍ未満、１０-14Ｍ未満、５×１０-15
Ｍ未満または１０-15Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する親和性が挙げられ
る。
【０３５０】 本発明はまた、競合性結合を決定するための当該分野で公知の任意の方法（例
えば、本明細書中で記載されるイムノアッセイ）によって決定されるような、本
発明のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ま
しい実施形態において、この抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少
なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少
なくとも６０％、または少なくとも５０％、エピトープへの結合を競合的に阻害
する。
【０３５１】 本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用し得る。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとのレセプター／リ
ガンド相互作用を部分的または完全にのいずれかで破壊する抗体を含む。好まし
くは、本発明の抗体は、本明細書中で開示された抗原性エピトープ、またはその
部分を結合する。本発明は、レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の
両方の特徴を有する。本発明はまた、リガンド結合を妨害しないがレセプター活
性化を妨害するレセプター特異的抗体の特徴を有する。レセプター活性化（すな
わち、シグナル伝達）は、本明細書中に記載の技術、そうでなければ、当該分野
で公知の技術により決定され得る。例えば、レセプター活性化は、レセプターの
リン酸化（例えば、チロシンまたはセリン／トレオニン）、または免疫沈降それ
に続くウェスタンブロット分析（例えば、上記のような）によってその基質を検
出することにより、決定され得る。特定の実施形態において、この抗体の非存在
下で、リガンド活性またはレセプター活性を、その活性の少なくとも９５％、少
なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少
なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％阻害する抗体が提
供される。
【０３５２】 本発明はまた、リガンド結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプタ
ー特異的抗体、ならびにレセプターリガンド複合体を認識し、そして好ましくは
、結合していないレセプターまたは結合していないリガンドを特異的に認識しな
い抗体の特徴を有する。同様に、本発明は、リガンドと結合し、そしてレセプタ
ーへのリガンドの結合を妨げる中和抗体、およびリガントと結合し、それにより
レセプター活性化を妨げるが、リガンドがレセプターを結合することを妨げない
抗体を含む。さらに、本発明は、レセプターを活性化する抗体を含む。これらの
抗体は、レセプターアゴニストとして作用し得、すなわち、例えば、レセプター
の二量化を誘発することによってリガンド媒介レセプター活性化の生物学的活性
化の全てまたはサブセットのいずれかを増強するかまたは活性化し得る。この抗
体は、本明細書中に開示される本発明のペプチドの特異的生物学的活性を含む生
物学的活性についてのアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストとして特
定化され得る。上記抗体アゴニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され
得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９
７号；Ｄｅｎｇら、Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）
；Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１
９９８）；Ｈａｒｒｏｐら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１
７９４（１９９８）；Ｚｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２０
９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０（７）：
３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．１１１
（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）；Ｌｉａｕｔ
ａｒｄら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒ
ｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０
１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６
２（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−
１１６７（１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１
４−２０（１９９６）（これらは全て、その全体が参考として本明細書中に援用
される）を参照のこと。
【０３５３】 本発明の抗体は、例えば、これらに限定されないが、本発明のポリペプチドを
精製し、検出し、そして標的化するために使用され得る。これらは、インビトロ
およびインビボの両方での診断方法および治療方法を含む。例えば、この抗体は
、生物学的サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的におよび定
量的に測定するためのイムノアッセイにおける使用を有す。例えば、Ｈａｒｌｏ
ｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第
２版，１９８８）（本明細書中でその全体が参照として援用される）を参照のこ
と。
【０３５４】 以下にさらに詳細に議論されるように、本発明の抗体は、単独または他の化合
物との組み合わせのいずれかで使用され得る。この抗体はさらに、ポリペプチド
または他の化合物へＮ末端でもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的に融
合され得るか、または化学的に結合（共有結合および非共有結合を含む）され得
る。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子およ
び異種ポリペプチド、薬剤、放射性核種、または毒素のようなエフェクター分子
へ組換え的に融合または結合され得る。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０８４９
５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９
９５号；および欧州特許第３９６，３８７号を参照のこと。
【０３５５】 本発明の抗体は、改変された（すなわち、共有結合性付着（ｃｏｖａｌｅｎｔ
ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）が、抗体が抗イディオタイプ応答を産生するのを妨げ
ないような、抗体に対する任意の型の分子の共有結合性付着による）誘導体を含
む。例えば、制限されないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチ
ル化、ぺグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏ
ｎ）、アミド化、既知の保護基／ブロック基（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）
による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質
への連結などによって改変された抗体が挙げられる。多数の任意の化学的改変が
、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝的合成など
を含むが、これらに制限されない公知の技術によって実行され得る。さらに、誘
導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０３５６】 本発明の抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって産生され得る。
目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によっ
て産生され得る。例えば、本発明のポリペプチドが種々の宿主動物（ウサギ、マ
ウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない）に投与されて、抗原に対して
特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導し得る。種々のアジュバン
トが、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加させるために使用され得、そして
フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル（
ｍｉｎｅｒａｌ ｇｅｌ）、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニック
（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、
キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カ
ルメット−ゲラン杆菌）およびｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ
のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。こ
のようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０３５７】 モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレ
イ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々
の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知
の以下に挙げられるハイブリドーマ技術を使用して産生され得、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
，第２版、１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６
８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．１９８１）（上記の参考文献は、その全体が
参考として援用される）に教示される。本明細書中で使用される場合、用語「モ
ノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術を通して生成された抗体に限定さ
れない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、または
ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、そしてそれが生
成される方法に由来する抗体ではない。
【０３５８】 「モノクローナル抗体」は、２つのタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）
を含み得るかまたはこれらからなり得る。
【０３５９】 ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法
は、当該分野で慣用的かつ周知であり、そして実施例に詳細に議論される（例え
ば、実施例９）。非限定的な実施例において、マウスは、本発明のポリペプチド
またはそのようなペプチドを発現する細胞を用いて免疫され得る。一旦免疫応用
が検出される（例えば、抗原に特異的な抗体がマウスの血清中に検出される）と
、マウスの脾臓を収集しそして脾細胞を単離する。次に、その脾細胞を周知の技
術によって任意の適切な骨髄腫細胞（例えば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞株Ｓ
Ｐ２０由来の細胞）に融合させる。ハイブリドーマを限界希釈によって選択およ
びクローン化する。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに
結合し得る抗体を分泌する細胞について、当該分野で公知の方法によってアッセ
イする。一般的に高いレベルの抗体を含む腹水（ａｓｃｉｔｅｓ ｆｌｕｉｄ）
が、陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫させることによって、産
生され得る。
【０３６０】 従って、本発明は、モノクローナル抗体および本発明の抗体を分泌するハイブ
リドーマ細胞を培養する工程を包含する方法によって産生される抗体を、生成す
る方法を提供し、ここで、好ましくは、このハイブリドーマは、骨髄腫細胞と本
発明の抗原で免疫したマウスから単離された脾細胞とを融合させ、次いで本発明
のポリペプチドと結合し得る抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、
融合物から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される
。
【０３６１】 特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成さ
れ得る。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、（Ｆａ
ｂフラグメントを生成するために）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２フラグメン
トを産生するために）ペプシンのような酵素を使用して、免疫グロブリン分子の
タンパク質分解切断によって産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可
変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０３６２】 例えば、本発明の抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ
方法を用いて産生され得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメ
インは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表
面に提示される。特定の実施形態において、そのようなファージは、レパートリ
ー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）またはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば
、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用さ
れ得る。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を
用いて選択または同定され得る（例えば、標識した抗原あるいは固体表面または
ビーズに結合または捕捉された抗原を使用する）。これらの方法において用いら
れるファージは、代表的には、ファージ遺伝子ＩＩＩタンパク質またはファージ
遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合されたＦａｂ、Ｆｖまた
はジスルフィド安定化されたＦｖの抗体ドメインを有するファージから発現され
たｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む糸状ファージ（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ
ｐｈａｇｅ）である。本発明の抗体を作製するために用いられ得るファージデ
ィスプレイ方法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Ｂｒｉｎｋ
ｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９
５）；Ａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１
８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ １８７
９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ
９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３
７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３
６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；ならびに米国特許第５
，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；
同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５
３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７
，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，
６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号および同第５，９６９，１０８号
（これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０３６３】 上記参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体をコ
ードする領域は、ヒト抗体を含む抗体の全体または任意の他の所望の抗原結合フ
ラグメントを生成するために単離されかつ用いられ得、そして例えば、以下に詳
細が記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を
含む任意の所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’および
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え的に産生するための技術はまた、当該分野
で公知の方法を用いて使用され得、このような方法は、以下に開示される：ＰＣ
Ｔ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；およびＳａｗａｉら、ＡＪＲ
Ｉ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１０４１−１０４３（１９９８）（これらの参考文献は、その全体が参
考として援用される）。
【０３６４】 単鎖のＦｖｓおよび抗体を産生するために用いられ得る技術の例としては、米
国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９
９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；および
Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に
記載される技術が挙げられる。ヒトにおける抗体のインビボの使用およびインビ
トロ検出アッセイを含むいくつかの用途のために、キメラ抗体、ヒト化抗体また
はヒト抗体の使用が好ましくあり得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が、
異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領
域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体）である。キメラ抗体を産生
するための方法は、当該分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、（１９８９）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７
，７１５号；同第４，８１６，５６７号；および同第４，８１６３９７号を参照
のこと（これらはそれらの全体が、参考として本明細書中に援用される）。ヒト
化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫
グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望された抗原に結合する非
ヒト種抗体由来の抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレ
ームワーク残基（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｓｉｄｕｅ）は、抗原結合を変化さ
せるため（好ましくは改善させるために）ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基と置
換される。これらフレームワークの置換は、当該分野で周知の方法によって同定
され、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲお
よびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における
異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較による。（例えば、Ｑｕｅ
ｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照のこと（これらはそれらの全体が参考と
して本明細書中に援用される）。）抗体は、以下を含む当該分野で公知の種々の
技術を用いてヒト化され得る：例えば、ＣＤＲ−移植（欧州特許第２３９，４０
０号；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；
同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング（
ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（
欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９
１）； Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７
（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ ９１：９
６９−９７３（１９９４））、およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓ
ｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【０３６５】 完全なヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に所望される。ヒト抗体
は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上記のファー
ジディスプレイ法を含む当該分野で公知の種々の方法により作製され得る。米国
特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ
公開ＷＯ ９８／４６６４５、ＷＯ ９８／５０４３３、ＷＯ ９８／２４８９
３、ＷＯ ９８／１６６５４、ＷＯ ９６／３４０９６、ＷＯ ９６／３３７３
５、およびＷＯ ９１／１０７４１；（これらの各々はその全体が参考として本
明細書中に援用される）もまた参照のこと。
【０３６６】 ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンの発現は出来ないが、ヒト免疫
グロブリン遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを用いて産生され得る
。例えば、ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子およびヒト軽鎖免疫グロブリン遺伝子
の複合体は、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入され得
る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｒｅｇｉｏｎ）は、ヒト重鎖遺伝子およびヒト軽鎖遺伝子に加えて、マウスの
胚性幹細胞に導入され得る。マウス重鎖免疫グロブリン遺伝子およびマウス軽鎖
免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入と別々
にまたは同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性の欠失は、内
因性抗体の産生を妨げる。改変された胚性幹細胞を拡張させ、そしてキメラマウ
スを産生するために胚盤胞中に微量注入する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗
体を発現するホモ接合性の子孫を産生するために繁殖させる。トランスジェニッ
クマウスを、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全体または部分
）を用いて通常の様式で免疫する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いた免疫したトランスジェニックマウスから得られ得る
。トランスジェニックマウスに保持されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ
細胞分化の間に再編成し、そしてその後、クラススイッチングおよび体細胞変異
を受ける。従って、そのような技術の使用によって、治療的に有用なＩｇＧ抗体
、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体およびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体を産
生するためのこの技術の概要については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、
Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと
。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術のならびに
そのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば
、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９６／３４０
９６；ＷＯ９６／３３７３５；欧州特許第０ ５９８ ８７７；米国特許第５，
４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同
第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６
号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９１６，
７７１号；および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらはその全体が
本明細書中に参考として援用される）。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の
ような企業は、上記の技術に類似した技術を用いて選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することに従事し得る。
【０３６７】 選択されたエピトープを完全に認識するヒト抗体を、「ガイドされた（ｇｕｉ
ｄｅｄ）選択」といわれる技術を用いて産生し得る。このアプローチにおいて、
選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）は、同じエピトー
プを完全に認識するヒト抗体の選択を導くために使用される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ
ら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０３６８】 さらに、本発明のポリペプチドに対する抗体は、当業者に周知の技術を用いて
本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために順
々に利用され得る。（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ
Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこ
と。）例えば、結合し、そしてポリペプチドの多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ）および／またはリガンドに対する本発明のポリペプチドの結合を競
合的に阻害する抗体が、ポリペプチドの多量体化ドメインおよび／または結合ド
メインを「模倣する」抗イディオタイプを産生するために使用され得、そして結
果としてポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、そして中和する。
このような抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂフラグ
メントの中和は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療的レジメンに使用
され得る。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチド
に結合するためおよび／またはそのリガンド／レセプターに結合するために使用
され得、そしてそれによってその生物学的活性がブロックされる。
【０３６９】 （抗体をコードするポリヌクレオチド） 本発明はさらに、本発明の抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオ
チド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ストリンジェント
な、またはより低いストリジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で（例え
ば、上記に定義されるような）抗体（好ましくは、本発明のポリペプチドと特異
的に結合する、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドに
結合する抗体）をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号１９のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態に
おいて、この抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異
的に結合する。別の好ましい実施形態において、この抗体は、配列番号２８のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する。別の好ましい実施形態に
おいて、この抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異
的に結合する。
【０３７０】 ポリヌクレオチドが、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得、そして
そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。例えば、抗体のヌクレ
オチド配列が知られている場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドは、化
学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅ
ｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載されるよ
うな）、これは、簡単にいうと、以下の工程を包含する：この抗体をコードする
配列の部分を含むオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリ
ゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、次いでＰＣＲによる連結されたオリ
ゴヌクレオチドの増幅。
【０３７１】 あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源からの核酸か
ら生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手不可能だが
、その抗体分子の配列が既知である場合、その免疫グロブリンをコードする核酸
は、化学的に合成され得るか、あるいは適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡラ
イブラリー、または抗体を発現する任意の組織もしくは細胞（例えば、本発明の
抗体の発現のために選択されたハイブリドーマ細胞）から生成されたｃＤＮＡラ
イブラリー、またはそれから単離された核酸（好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ））か
ら、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクロー
ンを同定するために、配列の３’末端および５’末端にハイブリダイズ可能な合
成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的
なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得られ得る。Ｐ
ＣＲによって生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野で周知の任意の方
法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０３７２】 一旦、抗体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、
抗体のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で周知の
方法（例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲなど（例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ
およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，ＮＹに記載の技術を参照のこと。これらは両方がその全体において本明細書に
参考として援用される。））を用いて操作され、例えば、アミノ酸の置換、欠失
、および／または挿入を作製するように異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成
し得る。
【０３７３】 特定の実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインのアミノ酸
配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列の同定のために、当該分野において周
知の方法によって（例えば、配列超可変性の領域を決定するために、他の重鎖、
および軽鎖の可変領域を既知のアミノ酸配列と比較することによって）調べられ
得る。慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて、１つ以上のＣＤＲが、前述のように
フレームワーク領域内に（例えば、非ヒト抗体をヒト化するために、ヒトフレー
ムワーク領域中に）挿入され得る。このフレームワーク領域は天然に存在し得る
か、またはコンセンサスフレームワーク領域であり得、そして好ましくはヒトフ
レームワーク領域であり得る（例えば、列挙したヒトフレームワーク領域につい
ては、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１
９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組み
合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドに特異的
に結合する抗体をコードする。好ましくは、上記に議論されるように、１つ以上
のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内で作製され得、そして好ましくは、そ
のアミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、このような方
法は、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合が欠如した抗体分子を生成するように、
鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域のシステイン残基のアミノ
酸置換または欠失を作製するために使用され得る。ポリヌクレオチドへの他の変
更は、本発明によって、および当該分野の技術において包含される。
【０３７４】 さらに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的
活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングさせることによって、「
キメラ抗体」を産生するために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅ
ｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））が使用され得る
。上記のように、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であ
り、このような分子は、マウスｍＡｂおよびヒト免疫グロブリンの定常領域由来
の可変領域を有する（例えば、ヒト化抗体）。
【０３７５】 あるいは、単鎖抗体の産生に関する記載された技術（米国特許第４，９４６，
７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈ
ｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７
９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４
−５４（１９８９））が、単鎖抗体の産生に適応され得る。単鎖抗体は、Ｆｖ領
域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントがアミノ酸架橋を介して連結され
れることによって形成され、単鎖ポリペプチドを生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける
機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリのための技術もまた、使用され得る（Ｓｋ
ｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３７６】 （抗体を産生する方法） 本発明の抗体は、抗体を合成するための当該分野で公知の任意の方法によって
、特に、化学合成によって、または、好ましくは、組換え発現技術によって産生
され得る。
【０３７７】 本発明の抗体、またはそのフラグメント、誘導体もしくはアナログ（例えば、
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、そ
の抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とす
る。一旦、本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはそれらの
部分（好ましくは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポ
リヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該分野で
周知の技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生成され得る。従って、抗体をコ
ードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドの発現によってタンパク
質を調製するための方法は、本明細書に記載される。当業者に周知の方法は、抗
体をコードする配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを
含有する発現ベクターの構築のために使用され得る。これらの方法には、例えば
、インビトロの組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボの遺伝子組換えが
挙げられる。従って、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、本発明
の抗体分子、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ド
メインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
このようなベクターは、抗体分子の定常領域（例えば、ＰＣＴ公開 ＷＯ８６／
０５８０７；ＰＣＴ公開 ＷＯ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２
，４６４号を参照のこと）をコードするヌクレオチド配列を含み得、そしてこの
抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖の全体の発現のためにこのようなベクタ
ーにクローニングされ得る。
【０３７８】 この発現ベクターは、従来技術によって宿主細胞へと移入され、そしてこのト
ランスフェクトされた細胞は、次いで、本発明の抗体を産生するために、従来技
術によって培養される。従って、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結
された、本発明の抗体、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、または本発明の単鎖抗
体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現につ
いての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクター
は、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞
中に同時発現され得る。
【０３７９】 種々の宿主発現ベクター系は、本発明の抗体分子を発現させるために利用され
得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、かつ続いて精製
され得るビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドをコードする配列で形
質転換またはトランスフェクトされる場合に、インサイチュで本発明の抗体分子
を発現し得る細胞を表わす。これらには、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：抗体をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラス
ミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体をコードす
る配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含む組換えウイ
ルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換え
ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タ
バコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または抗体をコードする
配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転
換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（
例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルスに由来する
プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス
７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例
えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）。好ましくは、Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、そしてより好ましくは、特に、組
換え抗体分子全体の発現のために真核生物細胞が、組換え抗体分子の発現のため
に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要最初期遺伝子プロ
モーターエレメントのようなベクターと組み合わされた、チャイニーズハムスタ
ーの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞が、抗体のための効果的な発現系
である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋ
ｅｔｔら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０３８０】 細菌系において、多くの発現ベクターが、抗体分子の発現を意図する使用に依
存して有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が産生される
場合、抗体分子の薬学的組成物の生成のために、容易に精製される融合タンパク
質産物の高レベルの発現を指向するベクターが所望され得る。このようなベクタ
ーには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体をコードする配列が
ｌａｃＺをコードする領域と共にベクターにインフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）
で個別に連結され得、その結果、融合タンパク質が産生されるＥ．ｃｏｌｉ発現
ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８
３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ
＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１
９８９））など。ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオンＳ−トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来性ポリペプチドを発現させるため
に使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶
解した細胞から、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および
結合、それに続く遊離グルタチオン存在化での溶出によって容易に精製され得る
。このｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を
含むように設計され、その結果、このクローニングされた標的遺伝子産物は、Ｇ
ＳＴ部分から放出され得る。
【０３８１】 昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体
病ウィルス（ＡｃＮＰＶ）は、異種遺伝子を発現するためのベクターとして使用
される。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に
おいて増殖する。抗体をコードする配列は、このウィルスの非必須の領域（例え
ばポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ得、そしてＡｃＮＰＶプロモ
ーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０３８２】 哺乳動物宿主細胞においては、多数のウィルスに基づく発現系が利用され得る
。アデノウィルスが発現ベクターとして使用される場合においては、目的の抗体
をコードする配列は、アデノウィルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロ
モーターおよび３つの部分に分かれるリーダー配列、に連結され得る。次いで、
このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによって、アデノウ
ィルスゲノムに挿入され得る。ウィルスのゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１ま
たはＥ３領域）における挿入は、生存可能で、感染した宿主において抗体分子を
発現する能力のある組換えウィルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１
９８４）を参照のこと）。特異的開始シグナルはまた、挿入された抗体をコード
する配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ
開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、この開始コドンは、挿入部分全
体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列のリーディングフレーム（
ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と相が同じでなければならない。これらの外因性
翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源、天然および合成の両方であ
り得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネータ
ー、などの含有によって高められ得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４（１９８７）を参照のこと）。
【０３８３】 さらに、宿主細胞系統は、選択され得、これは挿入配列の発現を調節し、また
は、所望される特異的な様式で遺伝子産物を改変し、そしてプロセシングする。
タンパク質産物のこのような改変（例えばグリコシル化）およびプロセシング（
例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要であり得る。異なる宿主細胞は
、タンパク質および遺伝子産物の、翻訳後プロセシングおよび改変のための、特
徴的で特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タ
ンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。こ
の目的のために、遺伝子産物の、第一の転写、グリコシル化、およびリン酸化の
正確なプロセシングのための細胞機構を有する、真核生物宿主細胞が、使用され
得る。このような哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして特に、例えば、ＢＴ４８
３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄのような乳癌細胞株、な
らびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔのような正常な乳腺細
胞株を含むが、これらに限定されない。
【０３８４】 組換えタンパク質の長期間の高収率産生、安定発現が好ましい。例えば、安定
に抗体分子を発現する細胞株が操作され得る。ウィルスの複製起点を含む発現ベ
クターを使用するよりも、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プ
ロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、
など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換され得
る。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作された細胞は、１〜２日間富化培地で増殖
させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選
択可能マーカーは、選択したものに耐性を与え、そして細胞が、プラスミドをそ
の染色体内に安定に組み込み、そして増殖して、細胞増殖巣を形成し、これを今
度はクローニングし得、細胞株に拡張され得ることを可能にする。この方法は、
抗体分子を発現する細胞株を操作するために、有利に使用され得る。このような
操作された細胞株は、直接的または間接的に抗体分子と相互作用する化合物のス
クリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０３８５】 多数の選択系が使用され得、この選択系は、単純ヘルペスウィルスチミジンキ
ナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサン
チン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓ
ｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２
０２（１９９２））、およびアデニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌ
ｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））の遺伝子を含むが限定されず
、これらの遺伝子は、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれ
ぞれ使用され得る。また、代謝拮抗物質耐性は、以下の遺伝子の選択の根拠とし
て使用され得る：ｄｈｆｒ、これはメトトレキサートに対する耐性を与える（Ｗ
ｉｇｌｅｒら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０
）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：
１５２７（１９８１））；ｇｐｔ、これはミコフェノール酸にに対する耐性を与
える（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−
４１８に対する耐性を与える（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４
８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（
１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔ
ｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；およびＭｏｒｇａｎ ａｎｄ
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７
（１９９３）；１９９３年５月、ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１
５）；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンにに対する耐性を与える（
Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技
術の分野で周知の方法は、所望の組換えクローンを選択するために、慣用的に適
用され得、そしてこのような方法は、以下に記載されている：例えば、Ａｕｓｕ
ｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ
、ＮＹ（１９９０）；ならびに１２章および１３章、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編
）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−
Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）（これらは
その全体が本明細書中に参考として援用される）。
【０３８６】 抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大され得る（総説として、
ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅ
ｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ
ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３
．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこ
と）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主
細胞の培養物に存在するインヒビターのレベルの増加によって、マーカー遺伝子
のコピーの数が増加する。増副領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産
生もまた増加する（Ｃｒｏｕｓｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７
（１９８３））。
【０３８７】 宿主細胞は、本発明の二つの発現ベクター（重鎖由来のポリペプチドをコード
する第一のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第二のベクター
）で、同時トランスフェクトされ得る。この二つのベクターは、重鎖および軽鎖
のポリペプチドの等しい発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含み得
る。あるいは、単一のベクターが使用され得、これは重鎖および軽鎖両方のポリ
ペプチドをコードし、そして発現することができる。このような状況において、
過剰の毒性の遊離重鎖を避けるために、重鎖の前に軽鎖が配置されるべきである
（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅ
ｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８
０））。重鎖および軽鎖のためのコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含
み得る。
【０３８８】 一旦、本発明の抗体分子が、動物、化学合成、または組換え発現によって産生
されると、この抗体分子は、免疫グロブリン分子の精製に関する当該分野で公知
の任意の方法によって（例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティー（特に、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａの後の特異的抗原
へのアフィニティーによる）クロマトグラフィー、およびサイジング（ｓｉｚｉ
ｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度によって、または
タンパク質の精製に関する他の任意の標準的な技術によって）精製され得る。さ
らに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を容易にするために、本明
細書に記載されるか、またはそうでなければ当該分野で公知の異種ポリペプチド
配列と融合され得る。
【０３８９】 本発明は、融合タンパク質を生成するために、本発明のポリペプチド（または
それらの一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０
、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００個のアミノ酸）に組換え的に融
合されたか、あるいは化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）
された抗体を含む。この融合は、必ずしも直接的である必要はないが、リンカー
配列を通して起こり得る。この抗体は、本発明のポリペプチド（またはそれらの
一部、好ましくは、ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、
６０、７０、８０、９０もしくは１００個のアミノ酸）以外の抗原に特異的であ
り得る。例えば、本発明のポリペプチドを、特定の細胞表面レセプターに特異的
な抗体に融合させるかまたは結合させることによって、抗体は、インビトロまた
はインビボのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型に標的化するため
に使用され得る。本発明のポリペプチドに融合されたかまたは結合された抗体は
また、当該分野で公知の方法を使用してインビトロイムノアッセイおよび精製方
法にて使用され得る。例えば、Ｈａｒｂｏｒら、前出およびＰＣＴ公開ＷＯ ９
３／２１２３２；ＥＰ ４３９，０９５；Ｎａｒａｍｕｒａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ
．Ｌｅｔｔ．３９：９１−９９（１９９４）；米国特許第５，４７４，９８１号
；Ｇｉｌｌｉｅｓら、ＰＮＡＳ ８９：１４２８−１４３２（１９９２）；Ｆｅ
ｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：２４４６−２４５２（１９９１）（これ
らは、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。
【０３９０】 本発明はさらに、可変領域以外の抗体のドメインに融合されたかまたは結合さ
れた本発明のポリペプチドから構成される組成物を含む。例えば、本発明のポリ
ペプチドを、抗体のＦｃ領域、あるいはその一部に融合または結合され得る。本
発明のポリペプチドに融合された抗体部分は、定常領域、ヒンジ領域、ＣＨ１ド
メイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、あるいはそれらのドメイン全
体または部分の任意の組合せを含み得る。このポリペプチドはまた、上記の抗体
部分に融合または結合され、多量体を形成し得る。例えば、本発明のポリペプチ
ドに融合されたＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形
成し得る。より高次な多量体形態は、このポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの
部分に融合することにより作製され得る。本発明のポリペプチドを抗体部分に融
合または結合するための方法は、当該分野において公知である。例えば、米国特
許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４
６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２
，９４６号；ＥＰ ３０７，４３４；ＥＰ ３６７，１６６；ＰＣＴ公開ＷＯ
９６／０４３８８；ＷＯ ９１／０６５７０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９
９１）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０−５６００（１
９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：１１３３７−１１３４１（１９９２）（上記の参考文献は、それらの全体
が参考として援用される）を参照のこと。
【０３９１】 上記で議論されたように、配列番号２のポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記の抗体部分に融合または結
合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増加するか、または当該分野
で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用される。さらに、配列番号
２に対応するポリペプチドは、精製を容易にするために、上記の抗体部分に融合
または結合され得る。また上記で議論されるように、配列番号１９のポリペプチ
ド、ポリペプチドフラグメント、または改変体に対応するポリペプチドは、上記
の抗体部分に融合または結合され得、このポリペプチドのインビボの半減期を増
加するか、または当該分野で公知の方法を使用するイムノアッセイにおいて使用
される。さらに、配列番号１９に対応するポリペプチドは、上記抗体部分に融合
または結合され、精製を容易にし得る。１つの報告された実施例は、ヒトＣＤ４
ポリペプチドの第１の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もし
くは軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質を記載する。（
ＥＰ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４
−８６（１９８８））。ジスルフィド連結した二量体構造（ＩｇＧに起因する）
を有する抗体に融合または結合された本発明のポリペプチドはまた、単量体分泌
タンパク質またはタンパク質フラグメント単独よりも、他の分子との結合および
中和においてより効率的であり得る。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．２７０：３９５８−３９６４（１９９５））。多くの場合において
、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断において有利であり、従って、
例えば、改良された薬物動態学的な特性を生じ得る。（ＥＰ Ａ ２３２，２６
２）。あるいは、融合タンパク質が発現、検出、および精製された後のＦｃ部分
の欠損は、所望される。例えば、この融合タンパク質が免疫化のための抗原とし
て使用される場合、このＦｃ部分は、治療および診断を妨げ得る。薬物の発見に
おいて、例えば、ヒトタンパク質（例えばｈＩＬ−５）は、ｈＩＬ−５のアンタ
ゴニストを同定するための高スループットスクリーニングアッセイの目的のため
に、Ｆｃ部分と融合された。（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照のこと
。） さらに、本発明の抗体またはそれらのフラグメントは、精製を容易にするペプ
チドのような、マーカー配列と融合され得る。好ましい実施形態において、この
マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．
，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１
１）において提供されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、それ
らの多くは市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されるように
、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用
な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピト
ープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９
８４））および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９２】 本発明はさらに、診断剤または治療剤に結合される抗体またはそのフラグメン
トを含む。この抗体は、例えば、臨床試験の手順の一部（例えば、所定の治療レ
ジメンの有効性を決定するための）として、腫瘍の発生または進行をモニターす
るために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質にカップリング
することによって容易にされ得る。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠
分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽子射出断層
撮影法を使用する陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられ
る。この検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用いて、抗体（または、そ
れらのフラグメント）に直接的にか、または中間体（例えば、当該分野で公知の
リンカーなど）を介して間接的にかのいずれかで、カップリングまたは結合され
得る。本発明に従う診断剤として使用するための抗体に結合され得る金属イオン
については、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵
素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラ
クトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子
群複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが
挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フル
オレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフル
オレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質
の例には、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ル
シフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例には、 125 Ｉ、131Ｉ、111Ｉｎまたは99Ｔｃが挙げられる。
【０３９３】 さらに、抗体またはそのフラグメントは、治療用部分（例えば細胞毒（例えば
細胞増殖抑制性もしくは細胞殺傷性の薬剤））、治療剤または放射性金属イオン
（例えば、α−放射体（例えば213Ｂｉ））に結合され得る。細胞毒または細胞
毒性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例としては、パクリタキセ
ル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジ
ウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉ
ｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウ
ノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ａｎｔｈ
ｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイ
シンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テト
ラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびに
そのアナログまたはホモログ、が挙げられる。治療剤は、代謝拮抗物質（例えば
、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、
５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメチン（
ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシ
ル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、
シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジ
ブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ
−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリ
ン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）
、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマ
イシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）
（ＡＭＣ））、ならびに有糸分裂阻害剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラ
スチン）、を含むが、それらに限定されない。
【０３９４】 本発明の結合体は、所与の生物学的応答を改変するために使用され得、治療剤
または薬物部分は、慣用の化学的治療剤に限定されると解釈されない。例えば、
薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリぺプチドであり
得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えばアブリン、リシン
Ａ、シュードモナス外毒素、またはジフテリアトキシン）；タンパク質（例えば
、腫瘍壊死因子、ａ−インターフェロン、β−インターフェロン、神経発育因子
、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲン賦活剤、アポトーシス薬（例えば、
ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開第ＷＯ９７／３３８９９号を参
照のこと）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開第ＷＯ９７／３４９１１号を参照のこと）
、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５
６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開第ＷＯ９９／２３１０５号
））、血栓症薬もしくは抗脈管形成薬（例えば、アンジオスタチンもしくはエン
ドスタチン）；または生物学的応答改変剤（例えばリンホカイン、インターロイ
キン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インター
ロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖
因子）、が挙げられ得る。
【０３９５】 抗体はまた、固体支持体に付着させられ得、この固体支持体は、標的抗原の免
疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラ
ス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ルまたはポリプロピレン、が挙げられるがそれらに限定されない。
【０３９６】 このような治療部分を抗体に結合する技術は、周知である、例えば、Ａｒｎｏ
ｎら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ
」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔ
ｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ
．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕ
ｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第二版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−
５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ、「Ａ
ｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ
Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」、Ｍｏｎｏｃｌｏ
ｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌ
ｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．
４７５−５０６（１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ
Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ
ｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌ
ｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９
８５）、およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘ
ｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８
（１９８２）を参照のこと。
【０３９７】 あるいは、抗体は、Ｓｅｇａｌにより米国特許第４，６７６，９８０号（その
全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、第二の抗体に
結合され得、抗体ヘテロ結合体を形成する。
【０３９８】 単独または細胞毒因子および／もしくはサイトカインと組合せて投与される抗
体（その抗体に結合する治療部分を有するまたは有さない）は、治療として使用
され得る。
【０３９９】 （免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）） 本発明の抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型決定のために利
用され得る。本発明の遺伝子の翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、またよ
り詳細には、特定の型の細胞の分化および／または成熟の種々の段階で、差次的
に発現される細胞マーカーとして有用であり得る。特異的なエピトープまたはエ
ピトープの組み合わせに対するモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞
の集団のスクリーニングを可能にする。種々の技術は、マーカーを発現する細胞
の集団をスクリーニングするためのモノクローナル抗体を使用して利用され得、
そして種々の技術としては、抗体でコートされた磁気的ビーズを使用する磁気的
分離、固体マトリックス（すなわちプレート）に付着された抗体を用いる「パニ
ング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、およびフローサイトメトリ（例えば、米国特許第５
，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４
９（１９９９）を参照のこと）、が挙げられる。
【０４００】 これらの技術は、細胞（例えば血液学的悪性疾患で見出され得るような細胞（
すなわち急性白血病患者における微小残存病変（ＭＲＤ））、および対宿主性移
植変病（ＧＶＨＤ）を防ぐための移植における「非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）」
細胞）の特定の集団のスクリーニングを可能にする。あるいは、これらの技術は
、ヒト臍帯血中に見出され得るような、増殖および／または分化を受ける能力の
ある造血幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能にする。
【０４０１】 （抗体結合アッセイ） 本発明の抗体は、免疫特異的結合について、当該分野で公知の任意の方法によ
ってアッセイされ得る。使用され得る免疫アッセイは、競合的および非競合的ア
ッセイ系を含むがこれに限定されない。このアッセイ系は以下のような技術を使
用する、少し例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩ
ＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降
アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ
、補体結合アッセイ、免疫放射分析アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ
免疫アッセイ。このようなアッセイは、当該分野で、慣習的および周知である（
例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏ
ｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。これはその全体が
本明細書中で参考として援用される）。典型的な免疫アッセイは、以下に簡単に
記載される（しかし限定として意図されない）。
【０４０２】 免疫沈降プロトコルは、一般に、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０
．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１％Ｔｒａ
ｓｙｌｏｌ）のような、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ
インヒビター（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナト
リウム）を補充した溶解緩衝液中で、細胞の集団を溶解する工程、目的の抗体を
細胞溶解物に添加する工程、４℃である時間（例えば１〜４時間）インキュベー
トする工程、プロテインＡおよび／またはプロテインＧのセファロースビーズを
細胞溶解物に添加する工程、約１時間以上、４℃でインキュベートする工程、ビ
ーズを溶解緩衝液で洗浄する工程およびビーズをＳＤＳ／サンプル緩衝液中に再
懸濁する工程、を包含する。目的の抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、例
えば、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。当業者は、抗原に対する
抗体の結合を増加し、そしてバックグラウンドを減少する（例えば、セファロー
スビーズとともに細胞溶解物を予め洗浄する）ように改変され得るパラメータに
関して、よく知っている。免役沈降プロトコルに関するさらなる考察については
、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅ
ｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１０．１６．１）を参照のこと。
【０４０３】 ウェスタンブロット分析は一般的に、タンパク質サンプルを調製する工程、タ
ンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲルでの電気泳動（例えば抗原の分子量
によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質サンプルをポリアクリ
ルアミドゲルからメンブレン（例えばニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロ
ン）へ移す工程、ブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡまたは無脂肪ミルク
を含むＰＢＳ）中でメンブレンをブロッキングする工程、メンブレンを洗浄緩衝
液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄する工程、ブロッキング緩衝液
で希釈された１次抗体（目的の抗体）を用いてメンブレンをブロッキングする工
程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、ブロッキング緩衝液で希釈され
た、酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファタ
ーゼ）または放射性分子（例えば32Ｐまたは125Ｉ）に結合した２次抗体（これ
は１次抗体（例えば抗ヒト抗体）を認識する）でメンブレンをブロッキングする
工程、洗浄緩衝液中でメンブレンを洗浄する工程、および抗原の存在を検出する
工程、を包含する。当業者は、検出されるシグナルを増加し、そしてバックグラ
ンドノイズを減少するように改変され得るパラメータをよく知っている。ウェス
タンブロットプロトコルに関するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂ
ｅｌら（編）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１０．８．１）を参照のこと。
【０４０４】 ＥＬＩＳＡは、抗原を調製する工程、９６ウェルマイクロタイタープレートの
ウェルをその抗原でコーティングする工程、酵素基質（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼまたはアルカリホスフォターゼ）のような検出可能な化合物に結合
した目的の抗体をそのウェルに添加し、そして一定時間インキュベートする工程
、および抗原の存在を検出する工程を含む。ＥＬＩＳＡにおいて、目的の抗体は
、検出可能な化合物に結合している必要はない；その代わり、検出可能な化合物
に結合した第二の抗体（目的の抗体を認識する）がウェルに添加され得る。さら
に、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングさ
れ得る。この場合、検出可能な化合物に結合した第二の抗体が、コーティングさ
れたウェルへの目的の抗原の添加に続いて、添加され得る。当業者は、検出され
るシグナルを増加させるように改変され得るパラメータ、および当該分野におい
て公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションに関して、認め得る。ＥＬＩＳＡに関
するさらなる考察については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４，Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１１．２．１を参照のこと。
【０４０５】 抗体の抗原に対する結合親和性および抗体−抗原相互作用のオフレート（ｏｆ
ｆ−ｒａｔｅ）が、競合結合アッセイにより決定され得る。競合結合アッセイの
一つの例は、ラジオイムノアッセイであり、ラジオイムノアッセイは、標識した
抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）と、漸増量の非標識抗原の存在下での目的の抗
体とのインキュベーション、および標識した抗原に結合した抗体の検出を含む。
目的の抗体の、特定の抗原に対する親和性、および結合オフレートは、スキャッ
チャードプロット分析によるデータから決定され得る。第二の抗体との競合はま
た、ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。この場合、抗原は、漸増量の
非標識第二抗体の存在下で、標識した化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）に結合
した目的の抗体とともにインキュベートされる。
【０４０６】 （治療用途） 本発明はさらに、抗体を基礎とした治療に関し、この治療は、本発明の抗体を
、１つ以上の開示された疾患、障害、または状態を処置するために、動物、好ま
しくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトの患者に投与する工程を含む。本発
明の治療化合物としては、本発明の抗体（本明細書中に記載するような、それら
のフラグメント、アナログおよび誘導体を含む）ならびに本発明の抗体をコード
する核酸（本明細書中に記載するような、それらのフラグメント、アナログおよ
び誘導体ならびに抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるがこれらに限定さ
れない。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活
性に関連した疾患、障害または状態（本明細書中に記載する任意の１つ以上の疾
患、障害、または状態（例えば、このような疾患または障害と関連した自己免疫
疾患、障害、または状態であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
自己免疫溶血性貧血、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少症紫斑病
、自己免疫性血球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー
性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例
えば、ＩｇＡ腎症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎、結膜炎、多発性内分
泌腺症、紫斑病（例えば、Ｈｅｎｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑病）、ライ
ター病、スティッフマン症候群、自己免疫肺炎症、ギヤン‐バレー症候群、イン
シュリン依存糖尿病、および自己免疫炎症眼球、自己免疫甲状腺炎、甲状腺機能
低下不全症（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリテマトーデス、グッドパス
チャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば、（ａ）グレーヴズ病、（
ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性）、自己免疫溶血性貧血、自
己免疫特発性血小板減少性紫斑病、リウマチ様動脈炎、抗コラーゲン抗体を有す
るｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ、混合結合組織病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧
血、特発性アディソン病、不妊症、原発性糸球体腎炎のような糸球体腎炎、およ
びＩｇＡ腎症、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、糖尿病、およびアドレナ
リン薬物耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナリン薬物耐性）、慢性活
動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後
、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、ぜん息、炎症性筋障害、およ
び他の炎症性障害、肉芽腫性障害、変性障害、および萎縮性障害）を含むがこれ
らに限定されない）を処置、阻害または予防するために使用され得る。
【０４０７】 特定の実施形態において、本発明の抗体は、慢性関節リウマチを処置、抑制、
予後判定、診断または予防するために使用される。
【０４０８】 別の特定の実施形態において、本発明の抗体は、全身性エリテマトーデスを処
置、抑制、予後判定、診断または予防するために使用される。
【０４０９】 本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患、障害
または状態の処置および／または予防は、それらの疾患、障害または状態に関連
した症状を緩和する工程を含むがこれに限定されない。本発明の抗体はまた、そ
れらの表面上のＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αを発現する細胞および／またはそれら
の表面に結合されたＮｅｕｔｒｏｋｉｎｅ−αを有する細胞を標的化および殺傷
するために使用され得る。本発明の抗体は、当該分野で公知であるか、または本
明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
【０４１０】 本発明の抗体が治療的に使用され得る方法の１つの要約は、身体内で局所的に
または全身的に、あるいは（例えば、補体（ＣＤＣ）により、またはエフェクタ
ー細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような）抗体の直接的細胞傷害性により、
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させることを含む。これら
のアプローチのいくつかは、より詳細に以下に記載される。本明細書中で提供さ
れる教示を与えられれば、当業者は、過度の実験なしに、診断上の目的、モニタ
リングの目的あるいは治療上の目的のために、本発明の抗体を使用する方法がわ
かる。
【０４１１】 本発明の抗体は、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活
性を増加させるために役立つ、他のモノクローナル抗体またはキメラ抗体、ある
いはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ
−７など）と組み合わせて有利に利用され得る。
【０４１２】 本発明の抗体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療
法、ホルモン治療、免疫治療、抗腫瘍剤、抗生物質、および免疫グロブリン）と
の組み合わせで投与され得る。一般的に、（抗体の場合には）患者の種と同じ種
である種起源または種反応性の生成物の投与が好ましい。従って、好ましい実施
形態においては、ヒトの抗体、フラグメント誘導体、アナログ、または核酸が、
治療または予防のために、ヒトの患者に投与される。
【０４１３】 本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（それらのフラグメントを含む
）に関するイムノアッセイ、およびそれらに関連した障害の治療の両方のために
、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する、高親和性および／ま
たは強力な、インビボでの阻害抗体および／または中和抗体、それらのフラグメ
ント、またはその領域を使用することが好ましい。このような抗体、フラグメン
ト、または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド
（それらのフラグメントを含む）に対して親和性を有する。好ましい結合親和性
としては、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、
１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ
、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１
０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０- 15 Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０４１４】 （遺伝子治療） 特定の実施形態において、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含
む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾
患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与され
る。遺伝子治療とは、発現したか、または発現可能な核酸の、被験体への投与に
より行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコ
ードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０４１５】 当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法は、本発明に従って使用
され得る。例示的な方法が以下に記載される。
【０４１６】 遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；Ｗｕおよ
びＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓ
ｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３
−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．
Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ
ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。使用され得
る、組換えＤＮＡ技術分野において一般的に公知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；お
よびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０４１７】 好ましい局面において、化合物は抗体をコードする核酸配列を含有し、上記核
酸配列は、適切な宿主において、抗体、またはそのフラグメントもしくはキメラ
タンパク質、あるいはその重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部であ
る。特に、このような核酸配列は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモ
ーターを有し、上記プロモーターは誘導性であるかまたは構成性であり、そして
必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態においては、抗体をコード
する配列および任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位での相同組換えを
促進する領域に隣接した核酸分子が使用され、それにより抗体をコードする核酸
の染色体内の発現を提供する（ＫｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９
）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）
）。特定の実施形態において、発現した抗体分子は単鎖抗体であるか；あるいは
この核酸配列は、この抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列またはその
フラグメントを含む。
【０４１８】 核酸の患者への送達は、直接的（この場合、患者は核酸または核酸保有ベクタ
ーに直接的に曝される）か、または間接的（この場合、細胞は最初にインビトロ
で核酸で形質転換され、次いで患者に移植される）のいずれかであり得る。これ
らの２つのアプローチは、インビボ遺伝子治療として、またはエキソビボ遺伝子
治療としてそれぞれ公知である。
【０４１９】 特定の実施形態において、核酸配列はインビボで直接的に投与され、そこで核
酸配列は発現されて、コードされた産物を産生する。これは、当該分野で公知の
多数の方法などのいずれかにより（例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの
一部として構築し、そしてそれを細胞内になるように投与することにより（例え
ば、欠損性または弱毒化したレトロウイルスまたは他のウイルスベクター（米国
特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）を用いた感染により）、あるいは、
裸のＤＮＡの直接注射により、あるいは、微粒子ボンバードメント（例えば、遺
伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、あるいは脂質もし
くは細胞表面のレセプターでコーティングするか、または薬剤をトランスフェク
トすることにより、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセル中へのカプ
セル化により、あるいは、それらを核に進入することが公知であるペプチドと結
合させて投与することにより、レセプター媒介のエンドサイトーシスを受けるリ
ガンドとそれを結合させて投与することにより（例えば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照のこと）
（レセプターを特異的に発現する細胞型を標的にするために用いられ得る）達成
され得る。別の実施形態において、核酸−リガンド複合体が形成され得、ここで
、このリガンドはエンドソームを破壊するフソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ
）ウイルス性ペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避するようにする。さ
らに別の実施形態において、核酸は、特異的なレセプターを標的とすることによ
り、細胞特異的な取り込みおよび発現についてインビボで標的とされ得る（例え
ば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０６１８０号；同第ＷＯ９２／２２６３５号；同第
ＷＯ９２／２０３１６号；同第ＷＯ９３／１４１８８号、同第ＷＯ９３／２０２
２１号を参照のこと）。あるいは、核酸は、細胞内に導入され得、そして相同組
換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ中に組み込まれ得る（Ｋｏｌｌｅｒお
よびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６
：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒａら，Ｎａｔｕｒｅ ３４
２：４３５−４３８（１９８９））。
【０４２０】 特定の実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含むウイルス
ベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（Ｍｉ
ｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）
を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルス性ゲノムの正確
なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの正確な組込みのために必要な構成要
素を含む。遺伝子治療において使用される抗体をコードする核酸配列は、一つ以
上のベクター中にクローン化され、これは、患者内への遺伝子の送達を容易にす
る。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら，Ｂｉｏ
ｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）（これは、幹細胞を化学療法
に対してより耐性にするために、ｍｄｒＩ遺伝子を造血性幹細胞に送達するため
の、レトロウイルスベクターの使用を記載する）に見出され得る。遺伝子治療に
おけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、以下である。
：Ｃｌｏｗｅｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９
９４）；Ｋｉｅｍら，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓ
ａｌｍｏｎｓおよびＧｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
４：１２９−１４１（１９９３）；ならびにＧｒｏｓｓｍａｎおよびＷｉｌｓ
ｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３
：１１０−１１４（１９９３）。
【０４２１】 アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得る他のウイルスベクターで
ある。アデノウイルスは、特に、気道上皮へ遺伝子を送達するための魅力的なビ
ヒクルである。アデノウイルスは、自然に気道上皮に感染し、そこで軽い疾患を
起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮
細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利
点を有する。ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ
ｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９
９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を示す。
Ｂｏｕｔら，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４
）は、アカゲザルの気道上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクター
の使用を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏ
ｓｅｎｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔ
ｒａｎｇｅｌｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９
９３）；ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号；およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に見出され得る。好ましい実
施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０４２２】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はまた、遺伝子治療における使用について提案
されてきた（Ｗａｌｓｈら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２
０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。
【０４２３】 遺伝子治療への別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクショ
ン、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような
方法により、組織培養中の細胞へ遺伝子を移入する工程を含む。通常、移入の方
法は、選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、細胞は、移入された遺伝子
を取り込みそして発現している細胞を単離するために選沢下に置かれる。それら
の細胞は次いで、患者に送達される。
【０４２４】 この実施形態においては、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に、核酸が
細胞に導入される。このような導入は、当該分野において公知の任意の方法によ
り実施され得、それらの方法としては以下が挙げられるがこれらに限定されない
：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション
、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターでの感染
、細胞融合、染色体媒介の遺伝子移入、マイクロセル（ｍｉｃｒｏｃｅｌｌ）媒
介の遺伝子移入、スフェロプラスト融合など。外来遺伝子の細胞への導入につい
ては、当該分野において多数の技術が公知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒお
よびＢｅｈｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８（１９９３
）；Ｃｏｈｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９
９３）；Ｃｌｉｎｅ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２ｍ（１９８
５）を参照のこと）、そしてレシピエント細胞の必要な発生的および生理学的機
能が破壊されない場合、本発明に従って使用され得る。この技術は、核酸の細胞
への安定した移入を提供するはずであり、その結果、核酸は、細胞により発現可
能であり、そして好ましくは、遺伝性であり、そしてその細胞の子孫により発現
可能である。
【０４２５】 得られた組換え細胞は、当該分野において公知の様々な方法により、患者へ送
達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または造血前駆細胞）は、好まし
くは、静脈内に投与される。使用が考えられる細胞の量は、所望の効果、患者の
状態などに依存し、そして当業者により決定され得る。
【０４２６】 遺伝子治療の目的のために核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の入手可能
な細胞型を包含し、そして以下を含むがそれらに限定されない：上皮細胞、内皮
細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；種
々の幹細胞または前駆細胞、特に、造血幹細胞または造血前駆細胞（例えば、骨
髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られるような細胞）。
【０４２７】 好ましい実施形態において、遺伝子治療に使用される細胞は、患者に対して自
己である。
【０４２８】 遺伝子治療において組換え細胞が使用される実施形態において、抗体をコード
する核酸配列は、細胞またはそれらの子孫により核酸配列が発現可能であるよう
に細胞に導入され、次いで組換え細胞は、治療的効果のためにインビボで投与さ
れる。特定の実施形態において、幹細胞または前駆細胞が用いられる。インビト
ロで単離され得、そしてインビトロで保存され得る任意の幹細胞および／または
前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、Ｐ
ＣＴ公開第ＷＯ９４／０８５９８号：ＳｔｅｍｐｌｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｃｅｌｌ ７１：９７３−９８５（１９９２）；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，Ｍｅｔｈ
．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９（１９８０）；ならびにＰｉｔｔｅｌｋｏ
ｗおよびＳｃｏｔｔ，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１（１９
８６）を参照のこと）。
【０４２９】 特定の実施形態において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、コード領域
に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含有し、その結果、核酸の発現は
、適切な転写誘導因子の存在または非存在を制御することにより制御可能である
。
【０４３０】 （治療活性または予防活性の実証） 本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にイン
ビトロで、次いでインビボで、所望の治療活性または予防活性について試験され
る。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証す
るためのインビトロアッセイとしては、細胞株または患者組織サンプルに対する
化合物の効果が挙げられる。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物
または組成物の効果は、当業者に公知である技術（ロゼット形成アッセイおよび
細胞溶解アッセイが挙げられるがこれらに限定されない）を利用して決定され得
る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるかどうかを決定するために
用いられ得るインビトロアッセイとしては、インビトロ細胞培養アッセイが挙げ
られ、このアッセイでは、患者組織サンプルが培養において増殖され、そして化
合物に曝されるか、そうでなければ化合物が投与され、そして、組織サンプルに
対するそのような化合物の効果が観察される。
【０４３１】 （治療的／予防的な投与および組成物） 本発明は、被験体への有効量の本発明の化合物または薬学的組成物、好ましく
は本発明の抗体の投与による処置、阻害および予防の方法を提供する。好ましい
実施形態において、化合物は実質的に精製される（例えば、その効果を制限する
かまたは望ましくない副作用を生じる物質は実質的にない）。被験体は好ましく
は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられるがそれら
に限定されない動物であり、そして好ましくは哺乳動物であり、そして最も好ま
しくはヒトである。
【０４３２】 化合物が核酸または免疫グロブリンを含む場合に使用され得る処方物および投
与方法は、上記に記載され；さらなる適切な処方物および投与経路は、本明細書
中で以下に記載されたものの中から選択され得る。
【０４３３】 種々の送達系が公知であり、そして本発明の化合物を投与するために用いられ
得る（例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中でのカプセル化、この
化合物の発現が可能な組み換え細胞、レセプター媒介エンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（
１９８７）を参照のこと）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての
核酸の構築など）。導入方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻
腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるがそれらに限定されない。化合物ま
たは組成物は、任意の好都合な経路により（例えば、注入またはボーラス注射に
より、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など
）を通しての吸収により）投与され得、そして他の生物学的に活性な薬剤と一緒
に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、本発明の薬
学的化合物または組成物を、任意の適切な経路（脳室内注射および鞘内注射を包
含する；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバのようなリザーバに取り
付けられた脳室内カテーテルにより容易にされ得る）により中枢神経系に導入す
ることが望まれ得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアゾール化
剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【０４３４】 特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物を、処置の必要
な領域に局所的に投与することが望まれ得る；これは、制限する目的ではないが
、例えば、手術中の局部注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯との組み合
わせて）により、注射により、カテーテルにより、坐剤により、またはインプラ
ント（このインプラントは、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のよう
な膜または繊維を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料である）によ
り達成され得る。好ましくは、抗体を含む本発明のタンパク質を投与する場合、
タンパク質が吸収されない材料を使用するために注意が払われなければならない
。
【０４３５】 別の実施形態において、化合物または組成物は、小胞、特に、リポソーム中へ
送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（
１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌ
ｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，３５３〜３６５頁（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，
同書３１７〜３２７頁を参照のこと；広く同書を参照のこと）。
【０４３６】 さらに別の実施形態において、化合物または組成物は制御された放出システム
中で送達され得る。１つの実施形態において、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇ
ｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅ
ｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８
：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：
５７４（１９８９）を参照のこと）。別の実施形態において、高分子材料が用い
られ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編），ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌ
ｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ
Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌ
ｌ（編），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰ
ｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３
５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（
１９８９）もまた参照のこと）。さらに別の実施形態において、制御された放出
システムは、治療標的、即ち、脳の近くに置かれ得、従って、全身用量の一部の
みを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，（前出），第２巻，
１１５〜１３８頁（１９８４）を参照のこと）。
【０４３７】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０４３８】 本発明の化合物がタンパク質をコードする核酸である、具体的な実施形態にお
いて、その核酸は、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして
それが細胞内になるように投与することにより（例えば、レトロウイルスベクタ
ーの使用により（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）、または直接
注射により、または微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓ
ｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用により、または脂質もしくは細胞表面レセプター
もしくはトランスフェクト剤でコーティングすることにより、または核に入るこ
とが公知であるホメオボックス様ペプチドと結合させて投与すること（例えば、
Ｊｏｌｉｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８
６４−１８６８（１９９１）を参照のこと）などにより、そのコードされたタン
パク質の発現を促進するようにインビボで投与され得る。あるいは、核酸は、細
胞内に導入され得、そして、発現のために相同組換えにより宿主細胞ＤＮＡ内に
組み込まれ得る。
【０４３９】 本発明はまた、薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の
化合物、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。具体的な実施形態において
、用語「薬学的に受容可能な」とは、動物における、そしてさらに特にヒトにお
ける使用のために、連邦規制当局もしくは米国政府により認められたか、または
米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。
用語「キャリア」とは、治療剤とともに投与される、希釈剤、アジュバンド、賦
形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的なキャリアは、水および油（石
油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油（例えば、ピーナッツ油、大
豆油、鉱油、ゴマ油など）を含む）のような滅菌した液体であり得る。水は、薬
学的組成物が静脈内に投与される場合に、好ましいキャリアである。生理食塩水
溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液はまた、特に注射可
能な溶液のために、液体キャリアとして使用され得る。適切な薬学的賦形剤とし
ては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ
、フラワー、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン
酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレ
ン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物はまた、所望される
ならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの
組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出処方
物などの形態を取り得る。この組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリドの
ようなキャリアとともに、坐剤として処方され得る。経口処方物は、薬学的等級
のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリ
ンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準キャリアを含み
得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎ
ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載され
る。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で
、適切な量のキャリアとともに含んで、患者への適切な投与のための形態を提供
する。処方物は、投与形態に適するべきである。
【０４４０】 好ましい実施形態において、組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投
与のために採用された薬学的組成物として、処方される。代表的には、静脈内投
与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は
また、可溶化剤および注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部
麻酔を含み得る。一般的には、成分は、別々にかまたは単一投薬形態で一緒に混
合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋（ｓ
ａｃｈｅｔｔｅ）のような密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない
濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物
は、滅菌した薬学的等級の水または生理食塩水を含む注入ボトルに分配され得る
。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、
注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０４４１】 本発明の化合物は、中性のまたは塩の形態として処方され得る。薬学的に受容
可能な塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するもの
のようなアニオンとともに形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモ
ニウム、カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、
２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するもののよ
うなカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
【０４４２】 この処置（本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性と関連する
疾患または障害の抑制および予防）において効果的である本発明の化合物の量は
、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロアッセイは、必要
に応じて、使用して最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。処方において
使用されるべき正確な用量はまた、投与の経路、および疾患または障害の重篤さ
に依存し、そして開業医の判断および各患者の状況に従って決定されるべきであ
る。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線
から外插され得る。
【０４４３】 抗体に関して、患者に投与される投薬量は、代表的に、患者の体重１ｋｇあた
り０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患
者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間であり、より好ましくは、患
者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリ
ペプチドへの免疫応答に起因して、他種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期
を有する。従って、ヒト抗体の低い投薬量および頻度の低い投与は、しばしば可
能である。さらに、本発明の抗体の投与の投薬量および頻度は、改変（例えば、
脂溶化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような）による抗体の取り込みおよび組織浸
透（例えば、脳への）を増強することにより減少され得る。
【０４４４】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の一つ以上の成分で満たされている一つ
以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生
物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関により規定される形
式における通告は、このような容器に、必要に応じて伴ない得る。この通告は、
ヒトの投与のための製造、使用または販売のこの機関による認可を反映する。
【０４４５】 （診断および画像化） 目的のポリペプチドに特異的に結合する標識化抗体、ならびにその誘導体およ
びそのアナログは、診断目的のために使用されて、本発明のポリペプチドの異常
な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出、診断また
はモニターし得る。本発明は、目的のポリペプチドの異常な発現の検出について
提供し、これは、（ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用し
て、個体の細胞または体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、
および（ｂ）この遺伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工
程、を包含し、これによって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイさ
れたポリペプチド遺伝子発現レベルの増加または減少が、異常な発現を示す。
【０４４６】 本発明は、障害を診断するための診断アッセイを提供し、このアッセイは、（
ａ）目的のポリペプチドに特異的な１つ以上の抗体を使用して、個体の細胞また
は体液中の目的のポリペプチドの発現をアッセイする工程、および（ｂ）この遺
伝子発現レベルと標準的な遺伝子発現のレベルを比較する工程、を包含し、これ
によって、その標準的な発現レベルと比較されるアッセイされたポリペプチド遺
伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す。癌に関して、個体由来
の生検組織における比較的高い量の転写物の存在は、疾患の発生のための素因を
示し得るか、または実際の臨床症状の出現前に疾患を検出するための手段を提供
し得る。この型のより決定的な診断は、保健専門家に予防手段を使用させること
、または早期の積極的な処置を可能にし得、これにより、癌の発生またはさらな
る進行を予防する。
【０４４７】 本発明の抗体を使用して、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を使用し
て生物学的サンプル中のタンパク質レベルをアッセイし得る（例えば、Ｊａｌｋ
ａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；
Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（
１９８７）を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な、抗
体に基づく他の方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合イムノソルベ
ント検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定法（ＲＩＡ））が挙げられる。適
切な抗体アッセイ標識は、当該分野において公知であり、そして酵素標識（例え
ば、グルコースオキシダーゼ）；放射性同位体（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ
、123Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジ
ウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ
、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム
（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、 135 Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47
Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ル
ミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）、
ならびにビオチンが挙げられる。
【０４４８】 当該分野で公知の技術は、本発明の抗体を標識するために適用され得る。この
ような技術として、二官能性の結合化剤の使用が挙げられるが、これらに限定さ
れない（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号
；同第５，６９６，２３９号；同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９
３１号；同第５，４８９，４２５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２
８，１３９号；同第５，３４２，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４
，９９４，５６０号；および同第５，８０８，００３号（これらは、本明細書に
おいて、全体を通して参考として援用される）を参照のこと）。
【０４４９】 本発明の１つの実施形態は、動物（好ましくは哺乳動物であり、そして最も好
ましくはヒト）における目的のポリペプチドの異常な発現に関連する、疾患また
は障害の検出および診断である。１つの実施形態において、診断は、以下：（ａ
）被験体に、目的のポリペプチドに特異的に結合する、有効量の標識分子を投与
（例えば、非経口、皮下、または腹腔内）する工程；（ｂ）この投与に続いて、
このポリペプチドが発現する被験体の部位において、標識分子が優先的に濃縮す
ることを可能とする時間間隔（および結合していない標識分子がバックグラウン
ドレベルまで除去されること）を待つ工程；（ｃ）バックグラウンドレベルを決
定する工程；および（ｄ）被験体において標識分子を検出する工程であって、そ
の結果、バックグラウンドレベルより上の標識分子の検出が、この被験体が目的
のポリペプチドの異常な発現に関連する特定の疾患または障害を有することを示
す、工程を包含する。バックグラウンドレベルは、検出した標識分子の量を、特
定の系に関して先に決定した標準値と比較することを含む、種々の方法によって
、決定され得る。本明細書中に記載されるように、本発明の特定の実施形態は、
本発明の抗体を使用して、Ｂ細胞株の細胞または単球株の細胞の濃縮を定量また
は定性することに関する。
【０４５０】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、免疫欠損を有
する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形態において、本
発明の抗体を使用して、分類不能型免疫不全疾患（ＣＶＩＤ）またはこの疾患の
サブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別の実
施形態において、本発明の抗体を使用して、血清（ｓｅｒｉｕｍ）免疫グロブリ
ン産生の欠損、再発性の感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けら
れる障害を、診断、予後判定、処置または予防する。
【０４５１】 また本明細書中に記載されるように、本発明の抗体を使用して、自己免疫疾患
または障害を有する個体を、処置、診断、または予後判定し得る。特定の実施形
態において、本発明の抗体を使用して、全身性エリテマトーデス、またはこの疾
患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定する。別
の特定の実施形態において、本発明の抗体を使用して、慢性関節リウマチ、また
はこの疾患のサブセットを有する個体を、処置、診断、および／または予後判定
する。
【０４５２】 被験体の大きさおよび使用される画像化システムは、診断画像を作成するため
に必要とされる画像化部分の品質を決定することが、当該分野において理解され
る。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体に対して、注入される放射能の量
は、通常、99ｍＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範囲である。次いで、標識され
た抗体または抗体フラグメントは、優先的に、特定のタンパク質を含む細胞の位
置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍ
ｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏ
ｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、Ｓ．Ｗ．ＢｕｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒ
ｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））
に記載される。
【０４５３】 いくつかの変化（使用される標識の型および投与の様式を含む）に依存して、
標識分子が優先的に被験体のある部位において濃縮されることを可能にし、かつ
結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで排除されるための、投与
に続く時間間隔は、６〜４８時間または６〜２４時間または６〜１２時間である
。別の実施形態において、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間または５〜１０
日間である。
【０４５４】 １つの実施形態において、疾患または障害のモニタリングは、その疾患または
疾患を診断するための方法を、例えば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６
ヶ月後、最初の診断の１年後などに、繰り返すことによって、実施される。
【０４５５】 標識分子の存在は、当該分野において公知の方法を使用して、インビボ操作に
ついて、患者において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の型に依
存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定し得る。本発
明の診断方法において使用され得る方法およびデバイスとしては、コンピュータ
連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放射撮像断層（ＰＥＴ）の
ような全身走査、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、および超音波検査が挙げられるが
、これらに限定されない。
【０４５６】 特定の実施形態において、分子は放射性同位体で標識され、そして放射応答性
の外科用器具を使用して、患者において検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国
特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態において、分子は蛍光化合物で標
識され、そして蛍光応答性の走査機器を使用して、患者において検出される。別
の実施形態において、分子は陽電子放射材料で標識され、そして陽電子放射断層
撮像法を使用して、患者において検出される。なお別の実施形態において、分子
は常磁性標識で標識され、そして磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）を使用して患者にお
いて検出される。
【０４５７】 （キット） 本発明は、上記の方法において使用され得るキットを提供する。１つの実施形
態において、キットは、１つ以上の容器において、本発明の抗体、好ましくは精
製した抗体を備える。特定の実施形態において、本発明のキットは、エピトープ
を含む実質的に単離されたポリペプチドを備える。このエピトープは、キット中
に含まれる抗体と特異的に免疫反応する。好ましくは、本発明のキットは、目的
のポリペプチドと反応しないコントロール抗体をさらに備える。別の特定の実施
形態において、本発明のキットは、本発明のポリペプチドの同一および／または
異なる配列または領域を認識する、２つ以上の抗体（モノクローナルおよび／ま
たはポリクローナル）を備える。別の特定の実施形態において、本発明のキット
は、目的のポリペプチドへの抗体の結合を検出するための手段を備える（例えば
、この抗体は、検出可能な基質（例えば、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物
もしくは発光化合物）に結合体化され得るか、または一次抗体を認識する二次抗
体が、検出可能な基質と結合体化され得る）。
【０４５８】 本発明の別の特定の局面において、キットは、増殖性および／または癌性のポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清のスクリー
ニングに使用するための診断キットである。このようなキットは、目的のポリペ
プチドと反応しないコントロール抗体を備え得る。このようなキットは、エピト
ープを含む実質的に単離されたポリペプチド抗原を備え得る。このエピトープは
、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応する。さらに、
このようなキットは、抗原に対する上記の抗体の結合を検出するための手段を備
える（例えば、抗体は、蛍光化合物（例えば、フローサイトメトリーにより検出
され得るフルオレセインまはたローダミン）と結合体化され得る）。特定の実施
形態において、キットは、組換え的に産生されたポリペプチド抗原または化学的
に合成されたポリペプチド抗原を備え得る。キットのポリペプチド抗原はまた、
固体支持体に付着され得る。
【０４５９】 より特定の実施形態において、上記のキットの検出手段は、上記のポリペプチ
ド抗原が付着する固体支持体を備える。このようなキットはまた、非付着レポー
ター標識化抗ヒト抗体を備え得る。この実施形態において、ポリペプチド抗原へ
の抗体の結合は、上記のレポーター標識化抗体の結合によって検出され得る。
【０４６０】 さらなる実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含有する血
清をスクリーニングする際に使用するための診断用キットを含む。この診断用キ
ットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である
実質的に単離された抗体、およびこの抗体に対するポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド抗原の結合を検出する手段を含む。１つの実施形態では、この抗体は、
固体支持体に付着される。特定の実施形態では、この抗体は、モノクローナル抗
体であり得る。キットの検出手段は、第二の標識化されたモノクローナル抗体を
含み得る。あるいは、またはさらに、この検出手段は、標識化された競合抗原を
含み得る。
【０４６１】 １つの診断形態において、試験血清は、本発明の方法により得られる表面結合
抗原を有する固相試薬と反応される。試薬への特異的抗原抗体の結合および洗浄
による非結合血清成分の除去後、この試薬は、固体支持体上の結合された抗抗原
抗体の量に比例してレポーターを試薬に結合するように、レポーター標識抗ヒト
抗体と反応される。試薬は、再度、非結合標識抗体を除去するために洗浄され、
そして、試薬と会合したレポーターの量が決定される。代表的には、このレポー
ターは、適切な比蛍光（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）基質または比色基質（Ｓｉ
ｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の存在下で固相をインキュベートすることに
より検出される酵素である。
【０４６２】 上記アッセイにおける固体表面試薬は、固体支持材料（例えば、ポリマー性ビ
ーズ、ディップスティック、９６ウェルプレート、またはフィルター材料）にタ
ンパク質材料を付着するための公知の技術によって調製される。これらの付着方
法は、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または固体支持体上の化
学反応基（例えば、活性型カルボキシル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド
基）へのタンパク質（代表的には、遊離アミン基を介する）の共有結合を包含す
る。あるいは、ストレプトアビジンコーティングプレートは、ビオチン化抗原と
併用して使用され得る。
【０４６３】 従って、本発明は、本診断方法を実施するためのアッセイ系またはキットを提
供する。このキットは、一般に、表面結合された組換え抗原を有する支持体、お
よび表面結合抗抗原抗体を検出するためのレポーター標識抗ヒト抗体を含む。
【０４６４】 本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストと
して作用する抗体に関する。例えば、本発明は、部分的にまたは完全にのいずれ
かで、本発明のポリペプチドとのレセプター／リガンド相互作用を破壊する、抗
体を含む。レセプター特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。
リガンドの結合を妨げないが、レセプター活性化を妨げるレセプター特異的抗体
が含まれる。レセプター活性化（すなわち、信号伝達）は、本明細書中に記載さ
れるかまたは他の当該分野において公知の技術によって、決定され得る。また、
リガンドの結合およびレセプター活性化の両方を妨げるレセプター特異的抗体が
含まれる。同様に、リガンドに結合し、そしてリガンドのレセプターへの結合を
妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによってレセプター活性化を
妨げるが、リガンドがレセプターを結合することは妨げない抗体が含まれる。さ
らに、レセプターを活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンドによ
り媒介されるレセプター活性化によって影響を受ける生物学的活性のすべてまた
は一部のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。これらの抗体は、本明
細書中に開示される特定の活性を含む生物学的活性に対するアゴニストまたはア
ンタゴニストとして特定化され得る。さらに、ニュートロカインαまたはニュー
トロカインαＳＶがニュートロカインαレセプターに結合するか否かにかかわら
ず、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに結合する抗体
が含まれる。これらの抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶの、これらの抗体の存在下でのニュートロカインαレセプターへの結
合に応答する、細胞増殖の増加に反映されるように、ニュートロカインαおよび
／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストとして作用する。上記の抗体アゴ
ニストは、当該分野で公知の方法を用いて作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Ｄｅｎｇ，Ｂ．ら、Ｂ
ｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）；Ｈａ
ｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（４）：１７８６−１７９
４（１９９８）；Ｚｈｕ，Ｚ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５８（１５）：３２
０９−３２１４（１９９８）；Ｙｏｏｎ，Ｐ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）；Ｐｒａｔ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｓｃｉ．１１１（Ｐｔ２）：２３７−２４７（１９９８）；Ｐｉｔａｒｄ，
Ｖ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０
（１９９７）；Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｄｅ ９（４）：２
３３−２４１（１９９７）；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）；Ｔａｒｙｍａｎ
，Ｒ．Ｅ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）；Ｍｕ
ｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（
１９９８）；Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−
２０（１９９６）（上記の文献はすべて、その全体が本明細書において参考とし
て援用される）を参照のこと。
【０４６５】 少なくとも１４のモノクローナル抗体が、ニュートロカインαに対して生成さ
れた。これらのモノクローナル抗体は、以下のように指定される：１２Ｄ６、２
Ｅ５、９Ｂ６、１Ｂ８、５Ｆ４、９Ａ５、１０Ｇ１２、１１Ｇ１２、１６Ｂ４、
３Ｄ４、１６Ｃ９、１３Ｄ５、１５Ｃ１０、および１２Ｃ５。これらの抗体の予
備分析は、各々が、ウェスタンブロット分析において、およびニュートロカイン
αタンパク質がＥＬＩＳＡプレートに結合する場合に、ニュートロカインαタン
パク質に結合することを示す。しかし、抗体１２Ｄ６、２Ｅ５、９Ｂ６、１Ｂ８
、５Ｆ４、９Ａ５、１０Ｇ１２、１１Ｇ１２、および１６Ｂ４のさらなる分析は
、１２Ｄ６、９Ｂ６、２Ｅ５、１０Ｇ１２、９Ａ５、および１１Ｇ１２と指定さ
れる抗体のみが、ニュートロカインαの膜結合形態を結合することを示す。従っ
て、ニュートロカインαに対して生成するモノクローナル抗体のサブセットは、
ニュートロカインαの膜結合形態のみを結合する（すなわち、このサブセットは
、配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５に対応するニュートロカインαの可溶性
形態を結合しない）ことが決定されており、このことは、本明細書中に記載する
ように、単球および樹状細胞上での発現に主として制限される。
【０４６６】 抗体９Ｂ６は、ニュートロカインαの膜結合形態に特異的に結合するが、ニュ
ートロカインαの可溶性形態は結合しないことが見出された。
【０４６７】 抗体９Ｂ６のエピトープマッピングは、この抗体が、配列番号２の約Ｓｅｒ−
１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結
合することを示した。より具体的には、エピトープマッピングは、抗体９Ｂ６が
、配列番号２のアミノ酸残基Ｌｙｓ−１７３〜Ｌｙｓ−１８８を含むペプチドに
特異的に結合することを示した。
【０４６８】 対照的に、抗体１６Ｃ９および１５Ｃ１０は、ニュートロカインαの可溶性形
態（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）を結合し、そしてニュートロカイン
αにより媒介されるＢ細胞の増殖を阻害することが見出された。例えば、実施例
１０を参照のこと。１５Ｃ１０抗体はまた、ニュートロカインαのそのレセプタ
ーに対する結合を阻害することが見出された。抗体１５Ｃ１０のエピトープマッ
ピングは、この抗体が、配列番号２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のア
ミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合することを示した。より具体
的には、エピトープマッピングは、抗体１５Ｃ１０が、配列番号２のアミノ酸残
基Ｖａｌ−２２７〜Ａｓｎ−２４２を含むペプチドに特異的に結合することを示
した。抗体１５Ｃ１０はまた、配列番号２のアミノ酸残基Ｐｈｅ−２３０〜Ｃｙ
ｓ−２４５を含むペプチドに特異的に結合する。
【０４６９】 上述のように、抗ニュートロカインαモノクローナル抗体が、調製された。９
Ｂ６および１５Ｃ１０と呼ばれる抗体を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣに
寄託され、そしてそれぞれ寄託番号ＰＴＡ−１１５８およびＰＴＡ−１１５９を
登録された。１つの実施形態において、本発明の抗体は、登録番号ＰＴＡ−１１
５８またはＰＴＡ−１１５９のもとで寄託されたハイブリドーマ細胞株によって
分泌される１つ以上の抗体と同じ１つ以上の生物学的特徴を有する。「生物学的
特徴」によって、抗体のインビトロまたはインビボでの活性または特性（例えば
、ニュートロカインα（例えば、配列番号２のポリペプチド、ニュートロカイン
αの成熟形態、ニュートロカインαの膜結合形態、ニュートロカインαの可溶性
形態（配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）およびニュートロカインαの抗原
領域および／またはエピトープ領域）に結合する能力、ニュートロカインα／ニ
ュートロカインαレセプター結合を実質的にブロックする能力、またはニュート
ロカインαにより媒介される生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖および免疫グロ
ブリン産生の刺激）をブロックする能力）を意味する。必要に応じて、本発明の
抗体は、本明細書中で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに
結合する。このようなエピトープ結合は、当該分野において公知のアッセイを使
用して、慣用的に決定され得る。
【０４７０】 従って、１つの実施形態において、本発明は、ニュートロカインαの膜結合形
態を特異的に結合してニュートロカインαの可溶性形態には結合しない、抗体を
提供する。これらの抗体は、ニュートロカインαの膜結合形態を発現する単球系
列を同定および／または単離するための診断プローブが挙げられるがこれに限定
されない用途を有する。例えば、ニュートロカインαの膜結合形態の発現は、活
性化単球において上昇し、従って、本発明に含まれる抗体を使用して、活性化単
球のレベルを検出および／または定量し得る。さらに、ニュートロカインαの膜
結合形態のみを結合する抗体を使用して、腫瘍性細胞、新生物発生前細胞、およ
び／またはニュートロカインαの膜結合形態を発現する他の細胞（例えば、単球
および樹状細胞）に対する毒素を標的化し得る。
【０４７１】 別の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαの可溶性形態（
配列番号２のアミノ酸１３４〜２８５）のみを特異的に結合する。これらの抗体
が有する用途としては、生物学的サンプルにおける可溶性のニュートロカインα
をアッセイするための診断プローブ、およびニュートロカインαレセプター（例
えば、Ｂ細胞）を発現する細胞に対する毒素を標的化する治療剤、および／また
はインビトロもしくはインビボでニュートロカインαにより媒介される生物学的
活性（例えば、Ｂ細胞増殖および／または免疫グロブリン産生の刺激）を減少ま
たはブロックするような用途が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７２】 本発明はまた、膜結合形態および可溶性形態の両方のニュートロカインαを特
異的に結合する抗体を提供する。
【０４７３】 上述のように、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインα
ＳＶレセプターを、インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を、阻害
または減少させる抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインα
レセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビトロで
結合する能力を、阻害または減少する。別の非排他的な特定の実施形態において
、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
が、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセ
プターを、インビボで結合する能力を阻害または減少する。このような阻害は、
本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術を使用して、
アッセイされ得る。
【０４７４】 本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶに
特異的に結合するが、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳ
Ｖが、ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレ
セプターに、インビトロおよび／またはインビボで結合する能力を阻害しない、
抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロカインαレセプターおよび
／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、インビトロで結合する能力を、
阻害または減少しない。別の非排他的な特定の実施形態において、本発明の抗体
は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶが、ニュートロ
カインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターを、イン
ビボで結合する能力を、阻害または減少しない。
【０４７５】 上述のように、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶにより媒介される生物学的活性を、インビトロおよび／またはインビボ
で阻害または減少する抗体を含む。特定の実施形態において、本発明の抗体は、
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介されるＢ
細胞増殖を、インビトロで阻害または減少する。このような阻害は、本明細書中
に記載されるかまたは他の当該分野において公知の、Ｂ細胞増殖アッセイを慣用
的に改変することによって、アッセイされ得る。別の非排他的な特定の実施形態
において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶにより媒介されるＢ細胞増殖を、インビボで阻害または減少する。特定
の実施形態において、本発明の抗体は、１５Ｃ１０またはそのヒト化形態である
。別の好ましい特定の実施形態において、この抗体は、１６Ｃ９またはそのヒト
化形態である。従って、本発明の特定の実施形態において、１６Ｃ９抗体および
／または１５Ｃ１０抗体、あるいはそのヒト化形態を使用して、可溶性ニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶおよび／またはそのアゴニス
トおよび／またはアンタゴニストを結合し、これによってＢ細胞増殖を阻害する
（部分的にかまたは完全にのいずれか）。
【０４７６】 あるいは、本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶに特異的に結合するが、ニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶにより媒介される生物学的活性（例えば、Ｂ細胞増殖の刺激）を、
インビトロおよび／またはインビボで阻害または減少しない、抗体を含む。特定
の実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカインαおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性を、インビトロで阻害または
減少しない。別の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、ニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより媒介される生物学的活性を
、インビボで阻害または減少しない。特定の実施形態において、本発明の抗体は
、９Ｂ６またはそのヒト化形態である。
【０４７７】 上述のように、本発明は、インビトロおよび／またはインビボで、本明細書中
で特に参照される抗体の少なくとも１つと同じエピトープに特異的に結合する抗
体を含む。
【０４７８】 特定の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２の約Ｓ
ｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異
的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、イン
ビボで、配列番号２の約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基に含
まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態におい
て、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２のＬｙｓ−１７３〜Ｌｙｓ−１
８８のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非
排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２のＬｙｓ
−１７３〜Ｌｙｓ−１８８のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結
合する。
【０４７９】 さらなる特定の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号
２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配
列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体
は、インビボで、配列番号２の約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸
残基に含まれるアミノ酸配列を特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形
態において、本発明の抗体は、インビトロで、配列番号２のＶａｌ−２２７〜Ａ
ｓｎ−２４２のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の
特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２
のＶａｌ−２２７〜Ａｓｎ−２４２のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列を特
異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態において、本発明の抗体は、イ
ンビトロで、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ｃｙｓ−２４５のアミノ酸残基に含
まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。別の特定の非排他的な実施形態におい
て、本発明の抗体は、インビボで、配列番号２のＰｈｅ−２３０〜Ｃｙｓ−２４
５のアミノ酸残基に含まれるアミノ酸配列に特異的に結合する。
【０４８０】 本発明はまた、ＰＴＡ−１１５９として寄託されたハイブリドーマにより産生
される９Ｂ６モノクローナル抗体の、本発明のポリペプチド、好ましくは配列番
号２のポリペプチド、より好ましくは配列番号２の残基Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ
−１９４のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合を、競合的に阻害す
る抗体を提供する。競合的な阻害は、当該分野において公知の任意の方法によっ
て、例えば、本明細書中に記載の競合的結合アッセイを使用して、決定され得る
。好ましい実施形態において、この抗体は、９Ｂ６モノクローナル抗体の、配列
番号２への結合を、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、
少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、
少なくとも５０％、競合的に阻害するか、またはより好ましくは、このポリペプ
チドは、配列番号２の残基Ｓｅｒ−１７１〜Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸配列を有
する。
【０４８１】 本発明はまた、ＰＴＡ−１１５８として寄託されたハイブリドーマにより産生
される１５Ｃ１０モノクローナル抗体の、本発明のポリペプチド、好ましくは配
列番号２のポリペプチド、より好ましくは配列番号２の残基Ｇｌｕ−２２３〜Ｔ
ｙｒ−２４６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する結合を、競合的に阻
害する抗体を提供する。好ましい実施形態において、この抗体は、１５Ｃ１０モ
ノクローナル抗体の、配列番号２への結合を、少なくとも９５％、少なくとも９
０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７
０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、競合的に阻害するか、またはより
好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２の残基Ｇｌｕ−２２３〜Ｔｙｒ−
２４６のアミノ酸配列を有する。
【０４８２】 本発明のさらなる実施形態は、９Ｂ６抗体およびこの抗体を発現するハイブリ
ドーマ細胞株に関する。抗体９Ｂ６を発現するハイブリドーマ細胞株は、２００
０年１月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１５９
を登録された。好ましい実施形態において、抗体９Ｂ６は、ヒト化される。
【０４８３】 本発明のさらなる実施形態は、１５Ｃ１０抗体およびこの抗体を発現するハイ
ブリドーマ細胞株に関する。抗体１５Ｃ１０を発現するハイブリドーマ細胞株は
、２０００年１月７日にＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−
１１５８を登録された。好ましい実施形態において、抗体１５Ｃ１０は、ヒト化
される。
【０４８４】 特定の実施形態において、上記の特定の抗体は、本明細書中に記載されるかま
たは他の当該分野において公知の技術を使用してヒト化され、次いで本明細書中
に記載されるような治療薬として使用される。
【０４８５】 別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかが、可溶性形態で
使用される。
【０４８６】 別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかが、毒素または標
識と結合体化される（上述のように）。このような結合体化抗体は、特定の細胞
の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用される。
好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、表面でニュートロカイ
ンαレセプターを発現するＢ細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実
施形態において、このような結合体化抗体は、表面でニュートロカインαレセプ
ターを発現するＢ細胞を定量するために使用される。
【０４８７】 別の特定の実施形態において、上に列挙した抗体のいずれかは、毒素または標
識と結合体化される（上述のように）。このような結合体化抗体は、特定の細胞
の集団を殺傷するため、または特定の細胞の集団を定量するために使用される。
好ましい実施形態において、このような結合体化抗体は、ニュートロカインαの
膜結合形態を発現する単核細胞を殺傷するために使用される。別の好ましい実施
形態において、このような結合体化抗体は、ニュートロカインαの膜結合形態を
発現する単核細胞を定量するために使用される。
【０４８８】 本発明の抗体はまた、治療薬および／または予防薬としての用途を有する。こ
れらとしては、ニュートロカインαの膜結合形態を細胞表面で発現する、単核細
胞を活性化するか、または単核細胞をブロックするか、そして／または単核細胞
系列を殺傷する際（例えば、骨髄性白血病、単球に基づく白血病およびリンパ腫
、単球増加、単球減少、慢性関節リウマチ、ならびに活性化単核細胞に関連する
他の疾患または状態を、処置、予防、および／または診断するため）のものが挙
げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の抗体は
、補体を結合する。他の特定の実施形態において、本明細書中にさらに記載され
るように、本発明の抗体（またはそのフラグメント）は、異種ポリペプチドまた
は核酸（例えば、内因性細胞傷害性エフェクター系に結合してこれを活性化する
化合物、および放射性同位体；ならびに細胞傷害性プロドラッグのような、毒素
）と会合する。
【０４８９】 別の実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、ここで、
これらはニュートロカインαおよび／またはそのムテインを認識または結合する
が、ニュートロカインαＳＶおよび／またはそのムテインを認識または結合しな
い。関連する実施形態において、１つ以上のモノクローナル抗体が産生され、こ
こでこれらは、ニュートロカインαＳＶおよび／またはそのムテインを認識また
は結合するが、ニュートロカインαおよび／またはそのムテインを認識または結
合しない。
【０４９０】 上記で議論されるように、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドは、次に、当業者に周知の技術を使用して、ニュ
ートロカインαを「模倣する」抗イデオタイプ抗体を生成するために利用される
（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ、ＦＡＳＥＢ Ｊ．７（５）：４
３７−４４４（１９８９）、ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照のこと）。例えば、ニ
ュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを結合し、そしてニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの多量体化および／また
はリガンドへの結合を相補的に阻害する抗体を使用して、ニュートロカインαＴ
ＮＦの多量化および／または結合ドメイン、ならびにつづいて、ニュートロカイ
ンαもしくはニュートロカインαＳＶおよび／またはそのリガンドの結合および
中和を「模倣する」抗イデオタイプを作製し得る。抗イデオタイプまたはこのよ
うな抗イデオタイプのＦａｂフラグメントのこのような中和は、ニュートロカイ
ンαリガンドを中和するための治療レジメンにおいて使用され得る。例えば、こ
のような抗イデオタイプ抗体を使用して、ニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶを結合し得るか、またはニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのレセプターをＢ細胞系統の細胞表面上で結合し得、
これによってニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶにより
媒介されるＢ細胞の活性化、増殖、および／または分化をブロックし得る。
【０４９１】 （免疫系関連障害の診断） ニュートロカインαは、腎臓、肺、末梢生白血球、骨髄、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ
細胞リンパ腫、活性化Ｔ細胞、胃ガン、平滑筋、マクロファージ、および臍帯血
液組織、ならびに特に、単球系列の細胞において、発現される。さらに、ニュー
トロカインαは、一次樹状細胞において発現される。さらに、ニュートロカイン
αは、以下の非造血腫瘍細胞株の細胞表面において、発現される。結腸癌ＨＣＴ
１１６（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２４７）およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ登録
番号ＨＴＢ−３８）、結腸腺癌Ｃａｃｏ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−３７）
、ＣＯＬＯ ２０１（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２２４）、およびＷｉＤｒ（Ａ
ＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１８）；胸腺癌 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ登
録番号ＨＴＢ−２６）；膀胱鱗状癌ＳＣａＢＥＲ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−３
）；膀胱癌ＨＴ−１１９７（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１４７３）；腎臓癌Ａ−
４９８（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４４）、Ｃａｋｉ−１（ＡＴＣＣ登録番号Ｈ
ＴＢ−４６）、およびＣａｋｉ−２（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＧ−４７）；肝臓、
ウィルムス腫ＳＫ−ＮＥＰ−１（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−４８）；ならびに副
膵癌Ｈｓ ７６６Ｔ（ＡＴＣＣ登録番号ＨＴＢ−１３４）、ＭＩＡ ＰａＣａ−
２（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１４２０）、およびＳＵ．８６．８６（ＡＴＣＣ
登録番号ＣＲＬ−１８３７）。多数の免疫系関連障害については、「標準的な」
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子発現レベル（
すなわち、障害を有していない個体からの組織または体液におけるニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶの発現レベル）と比較して、実質
的に変化した（増加または減少）レベルのニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶ遺伝子発現が、免疫系組織または他の細胞もしくは体液（
例えば、血清、血漿、尿、関節液、または髄液）において検出され得る。従って
、本発明は、障害の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体
由来の免疫系組織または他の細胞もしくは体液において、ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドをコードする遺伝子の発現レ
ベルを測定すること、ならびにこの測定した遺伝子発現レベルを、標準的なニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子発現レベルと比較
することを包含し、これによって、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加また
は減少が、免疫系障害または正常な活性化、増殖、分化、および／もしくは死を
指標する。
【０４９２】 特に、免疫系の細胞または組織の癌を有する哺乳動物における、特定の組織は
、「標準」レベルと比較した場合に、有意に増加または減少したレベルのニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドならびにニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶをコードするｍＲＮＡを
発現すると、考えられる。さらに、増加または減少したレベルのニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶは、癌を有さない同じ種の哺乳動物
由来の血清と比較した場合に、このような癌を有する哺乳動物由来の特定の体液
（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）または細胞もしくは組織において、検
出され得ると考えられる。
【０４９３】 例えば、本明細書中に開示されるように、ニュートロカインαは、単核細胞系
列の細胞において高度に発現される。従って、本発明のポリヌクレオチド（例え
ば、ニュートロカインα ｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶ ｍ
ＲＮＡの全てまたは一部に対して相補的なポリヌクレオチド配列）、ならびに本
発明のポリペプチドに対して指向される抗体（および抗体フラグメント）を使用
して、細胞表面においてニュートロカインαを発現する単核細胞の系列（例えば
、単球性白血病細胞）を定性またはその濃度を定量し得る。これらの抗体は、さ
らに、ニュートロカインα遺伝子発現のレベルの異常、あるいはニュートロカイ
ンαおよび／もしくはニュートロカインαＳＶの構造および／または一次的な、
組織の、細胞の、または非細胞の位置の異常を検出する際に、診断的な適用を有
する。これらの診断アッセイは、インビボまたはインビトロで（例えば、血液サ
ンプル、生検組織または検死組織において）実施され得る。
【０４９４】 さらに、本明細書中に開示されるように、ニュートロカインαレセプターは、
主として、Ｂ細胞系列の細胞において発現される。従って、本発明のニュートロ
カインαポリペプチド（標識ニュートロカインαおよびニュートロカインα融合
タンパク質を含む）、ならびに本発明のポリペプチドに対する抗ニュートロカイ
ンα抗体（抗ニュートロカインα抗体フラグメントを含む）を使用して、細胞表
面でニュートロカインαレセプターを発現するＢ細胞系列の細胞（例えば、Ｂ細
胞関連白血病またはリンパ腫）を定性またはその濃度を定量し得る。これらのニ
ュートロカインαポリペプチドおよび抗体は、さらに、ニュートロカインαレセ
プター遺伝子発現のレベルの異常、あるいはニュートロカインαレセプターおよ
び／もしくはニュートロカインαに関連するシグナル伝達経路の診断活性／欠損
の、構造および／または一次的な、組織の、細胞の、または非細胞の位置の異常
を検出する際に、診断的な適用を有する。これらの診断アッセイは、インビボま
たはインビトロで（例えば、血液サンプルまたは生検組織において）、本明細書
中に記載されるかまたは他の当該分野において公知の技術を使用して、実施され
得る。
【０４９５】 １つの実施形態において、本発明の、ニュートロカインαおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴ
ニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカイン
αＳＶ抗体）を、免疫欠損を有する個体を処置、予防、診断、または予後判定す
るために、使用し得る。
【０４９６】 本発明の、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュー
トロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、
処置、予防、診断、および／または予後判定し得る免疫欠損としては、以下から
選択される１つ以上の免疫欠損が挙げられるが、それに限定されない：重症複合
免疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ
欠損（ＡＤＡ欠損）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂｒｕｔｏｎ
病、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖乳児無ガンマグロブリン血症、後天
性無ガンマグロブリン血症、成体発生無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマ
グロブリン血症、異常ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、一過性
乳児低ガンマグロブリン血症、特定されない低ガンマグロブリン血症、無ガンマ
グロブリン血症、分類不能型免疫不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−
オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖免疫欠損、過剰Ｉｇ
Ｍを伴う非Ｘ連鎖免疫欠損、選択的ＩｇＭ欠損、ＩｇＧサブクラス欠損（ＩｇＡ
欠損を伴うかまたは伴わない）、正常なまたは上昇したＩｇを伴う抗体欠損、胸
腺腫を伴う免疫欠損、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損、Ｂ細胞リンパ増殖障害（ＢＬＰ
Ｄ）、選択的ＩｇＭ免疫欠損、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、網様
発育不全、新生児好中球減少、重篤な先天性白血球減少、胸腺リンパ形成不全（
免疫欠損を伴う発育不全または形成異常）、毛細血管拡張性運動失調、短四肢小
人症、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）、ネゼロフ症候群（Ｉｇを伴う複合型
免疫欠損）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラス
ＩＩ欠損（不全リンパ球症候群）および重症複合型免疫不全。
【０４９７】 本実施形態に従って、免疫不全を有する個体は、免疫不全を有さない個体と比
較した場合に、異常に低レベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶを発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野におい
て公知の任意の手段を提供して、本発明のニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出し（例えば、
本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチ
ドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロカイン
αおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダイゼー
ションもしくはＰＣＲ検出）、そして生物学的サンプル中の、本発明のニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ、ポリヌクレオチドおよび／
またはポリペプチドの発現プロフィールを決定し得る。
【０４９８】 免疫不全に罹患している人物の生物学的サンプルは、免疫不全を有さない個体
において観察されるもの比較した場合に、ニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶの低レベルの発現により、特徴付けられる。従って、本発
明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオ
チドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストまたはア
ンタゴニストは、本発明の方法に従って、免疫不全の診断および／または予後判
定において使用され得る。例えば、免疫不全に罹患していると疑われる人物（「
被験体」）から得た生物学的サンプルは、本発明のニュートロカインαおよび／
またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
の相対的な発現レベルに関して、分析され得る。次いで、本発明の１つ以上のこ
れらの分子の発現レベルが、免疫不全を罹患しないことが既知である人物におけ
る発現と同一の本発明の分子の発現レベルと比較される。ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／また
はポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニ
ストの発現レベルの、被験体およびコントロールから得たサンプル間の有意な差
異は、その被験体が免疫不全に罹患していることを示唆する。
【０４９９】 別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（
例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗
体）を使用して、分類不能型免疫不全（「ＣＶＩＤ」；「後天性無ガンマグロブ
リン血症」および「後天性低ガンマグロブリン血症」としても公知）またはこの
疾患のサブセットを有する個体を処置、診断、および／または予後判定する。本
実施形態に従って、ＣＶＩＤを有する個体またはＣＶＩＤを有する個体のサブセ
ットは、ＣＶＩＤを有さない個体と比較した場合に、異常なレベルのニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαレセプターを、Ｂ細胞および／また
は単核細胞上で発現する。本明細書中に記載されるかまたは他の当該分野におい
て公知の任意の手段を適用して、本発明のニュートロカインαポリヌクレオチド
またはポリペプチドおよび／またはニュートロカインαレセプターポリペプチド
（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
ポリペプチドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブ
リダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）を検出し得、そしてニュートロカインα
、および／または本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、および／またはニュートロカインαレセプターポリペプチドの、少
なくともＢ細胞またはその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルと比較し
た場合の、少なくとも単核細胞またはいくらかのその成分（例えば、ＲＮＡ）を
含有するサンプル中での発現プロフィールの差異を決定し得る。少なくとも単核
細胞またはいくらかのその成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルが、ニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドの発現を反映することが決定され、そして少なくともＢ細胞または
その成分（例えば、ＲＮＡ）を含有するサンプルが、正常レベル未満のニュート
ロカインαレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現を反映すること
が決定される場合には、このサンプルは、ＣＶＩＤ（すなわち、「後天性無ガン
マグロブリン血症」または「後天性低ガンマグロブリン血症」）の発生に相関付
けられ得る。
【０５００】 ＣＶＩＤに罹患している人物のサブセットは、ＣＶＩＤを有さない個体におい
て得られるものと比較した場合の、末梢または循環Ｂ細胞における、ニュートロ
カインαおよびニュートロカインαレセプター（「ＮＡＲ」）の両方の高レベル
の発現によって、特徴付けられる。対照的に、ＣＶＩＤを罹患しない人物は、代
表的に、末梢または循環Ｂ細胞における低レベルのニュートロカインα発現およ
び高レベルのＮＡＲ発現によって、特徴付けられる。従って、ニュートロカイン
α、ニュートロカインαＳＶポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチド
、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはその
アゴニストもしくはアンタゴニストを、本発明の方法に従って、ＣＶＩＤのこの
サブセットの差示的診断において、使用し得る。例えば、ＣＶＩＤに罹患してい
ると疑われる人物（「被験体」）から得た末梢Ｂ細胞を含むサンプルは、本発明
のニュートロカインα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲポリヌ
クレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベルに関して、分析さ
れ得る。次いで、１つ以上のこれらの本発明の分子の発現レベルが、ＣＶＩＤを
罹患していないことが基地である人物（「コントロール」）において発現される
ものと同じ本発明の分子の発現レベルと比較される。本発明のニュートロカイン
αおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド
、および／またはＮＡＲポリペプチドおよび／またはＮＡＲポリペプチド、なら
びに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの、
被験体およびコントロールから得たサンプル間での有意な差異は、この被験体が
ＣＶＩＤのこのサブセットを罹患していることが示唆される。
【０５０１】 特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたは
アンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗ニュー
トロカインαＳＶ抗体）を使用して、欠損した血清免疫グロブリン産生、再発性
感染、および／または免疫系機能不全により特徴付けられる疾患を、診断、予後
判定、処置、または予防する。さらに、ニュートロカインα、および／またはニ
ュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチド、またはそのアゴニ
ストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または
抗ニュートロカインαＳＶ抗体）を使用して、関節、骨、皮膚、および／または
耳下腺の感染、血行性の感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症網膜炎、および
／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書中に開示されるもの）、炎
症性疾患、および悪性疾患、ならびに／またはこれらの炎症、疾患、障害および
／または悪性疾患に関連する任意の疾患または障害または状態（ＣＶＩＤ、他の
初期免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、静脈洞炎、中耳炎、結膜
炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重篤な帯状疱疹）、および／また
はニューモシスティスカリニが挙げられるが、これらに限定されない）を、診断
、予後判定、処置、または予防する。
【０５０２】 別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例え
ば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体）
を使用して、自己免疫疾患または障害を有する個体を、処置、診断、または予後
判定する。
【０５０３】 本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌク
レオチドまたはポリペプチドまたはニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン
α抗体および／または抗ニュートロカインα抗体）を使用して、処置、診断、ま
たは予後判定され得る自己免疫疾患または障害としては、以下のうちの１つ以上
が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性新
生児血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血球減少症、溶血性貧
血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性
軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡネフロパシー）、多発
性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑（例えば、Ｈｅｎ
ｌｏｃｈ−Ｓｃｏｅｎｌｅｉｎ紫斑）、ライター病、スティッフマン症候群、自
己免疫性肺炎症、ギヤン−バレー症候群、インスリン依存性真性糖尿病、および
自己免疫炎症目、自己免疫性甲状腺炎（すなわち、橋本甲状腺炎）、全身性エリ
テマトーデス、グッドパスチャー症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫（例えば
、（ａ）グレーヴズ病、（ｂ）重症筋無力症、および（ｃ）インスリン抵抗性）
、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ
、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、混合結合組織
病、多発性筋炎／皮膚筋炎、悪性貧血、突発性アディソン病、不妊症、糸球体腎
炎（例えば、一次糸球体腎炎およびＩｇＡネフロパシー）、水疱性類天疱瘡、シ
ェーグレン症候群、真性糖尿病、およびアドレナリン作用性薬物耐性（喘息また
は嚢胞性線維症を伴うアドレナリン作用性薬物耐性を含む）、慢性活性肝炎、原
発性胆汁性肝硬変、他の内分泌腺不全、白斑、脈管炎、ＭＩ後（ｐｏｓｔ−ＭＩ
）、心臓切開症候群、じんま疹、アトピー性皮膚炎、喘息、炎症性ミオパシー、
ならびに他の炎症性障害、顆粒性障害、変性障害、および萎縮性障害。
【０５０４】 本実施形態に従って、自己免疫疾患または障害を有する個体は、自己免疫疾患
または障害を有さない個体と比較した場合に、異常に高レベルのニュートロカイ
ンα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲを発現する。本明細書中
に記載されるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を適用して、ニュ
ートロカインα、および／または本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド、および／またはＮＡＲポリペプチドを検出し得（例え
ば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペ
プチドの、ＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、ならびに本発明のニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドのハイブリダ
イゼーションもしくはＰＣＲ検出）、そしてニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチ
ド、および／またはＮＡＲポリペプチドの、生物学的サンプルにおける発現プロ
フィールを決定し得る。
【０５０５】 自己免疫疾患または障害に罹患している人物の生物学的サンプルは、自己免疫
疾患または障害を有さない個体において観察されるものと比較した場合に、ニュ
ートロカインα、ニュートロカインαＳＶ、および／またはＮＡＲの高レベルの
発現によって、特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／
またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、
および／またはそのアゴニストもしくはアンタゴニストを、本発明の方法に従っ
て、自己免疫疾患または障害の診断および／または予後判定において使用し得る
。例えば、自己免疫疾患または障害に罹患していることが疑われる人物（「被験
体」）から得られる生物学的サンプルは、ニュートロカインα、および／または
本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
および／またはＮＡＲポリペプチドの相対的な発現レベルに関して分析され得る
。次いで、本発明の１つ以上のこれらの分子の発現レベルが、自己免疫疾患また
は障害に罹患していないことが既知である人物において発現されるものと比較さ
れる。ニュートロカインα、および／またはニュートロカインαＳＶ、本発明の
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、および／またはそのアゴニスト
および／またはアンタゴニスト、および／またはＮＡＲポリペプチドの、被験体
およびコントロールから得られるサンプル間の発現レベルの有意な差異は、この
被験体が自己免疫疾患または障害に罹患していることを示唆する。
【０５０６】 別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチドあるいはニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストまたはアンタゴニスト（
例えば、抗ニュートロカインα抗体および／または抗ニュートロカインαＳＶ抗
体）を使用して、全身性エリテマトーデスまたはこの疾患のサブセットを有する
個体を、処置、診断、または予後判定する。この実施形態によれば、全身性エリ
テマトーデスを有する個体または全身性エリテマトーデスを有する個体のサブセ
ットは、全身性エリテマトーデスを有さない個体または全身性エリテマトーデス
のサブセットを有さない個体と比較した場合に、異常に高レベルのニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する。本明細書中に記載さ
れるかまたは他の当該分野において公知の任意の手段を提供して、本発明のニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドを検出し（例えば、本発明のニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶポリペプチドのＦＡＣＳ分析もしくはＥＬＩＳＡ検出、な
らびに本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションもしくはＰＣＲ検出）、そして生物学的
サンプル中の、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインα
ＳＶ、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現プロフィールを決定
し得る。
【０５０７】 全身性エリテマトーデスに罹患している人物の生物学的サンプルは、全身性エ
リテマトーデスを有さない個体において観察されるもの比較した場合に、ニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの低レベルの発現により、
特徴付けられる。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あ
るいはそのアゴニストまたはアンタゴニストは、本発明の方法に従って、全身性
エリテマトーデスの診断および／または予後判定において使用され得る。例えば
、全身性エリテマトーデスに罹患していると疑われる人物（「被験体」）から得
た生物学的サンプルは、ニュートロカインα、ならびに／あるいは本発明のニュ
ートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な
発現レベルに関して、分析され得る。次いで、本発明の１つ以上のこれらの分子
の発現レベルが、全身性エリテマトーデスを罹患しないことが既知である人物に
おける発現と同一の本発明の分子の発現レベルと比較される。ニュートロカイン
α、および／またはニュートロカインαＳＶ、本発明のポリヌクレオチドおよび
／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストおよび／またはアン
タゴニストの発現レベルの、被験体およびコントロールから得たサンプル間の有
意な差異は、その被験体が全身性エリテマトーデスに罹患していることを示唆す
る。
【０５０８】 さらに、全身性エリテマトーデス、またはこの疾患のサブセットの重症度と本
発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレ
オチド（ＲＮＡ）および／またはポリペプチドの濃度との間に直接の相関がある
。従って、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
のポリヌクレオチド、（ＲＮＡ）、ポリペプチドおよび／またはアゴニストもし
くはアンタゴニストは、全身性エリテマトーデスまたは全身性エリテマトーデス
のサブセットの重症度の予後の判断において、本発明の方法に従って使用され得
る。例えば、全身性エリテマトーデスに罹患していると疑われる人（「被験体」
）から得られた生物学的サンプルを、本発明のニュートロカインα、および／ま
たはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの
相対的な発現レベルについて分析し得る。次いで、本発明のこれらの分子の１つ
以上の発現レベルが、この疾患の重症度における範囲を表すことが既知の人のパ
ネルにおいて発現されるのと同じ本発明の発現レベルと比較される。この方法に
従って、パネルの特徴付けられたメンバーとの発現レベルの一致は、疾患の重症
度を示す。
【０５０９】 別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチドあるいはニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト
（例えば、抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶ抗体
）は、慢性関節リウマチまたはこの疾患のサブセットを有する個体を処置、診断
、または予後の判断をするために使用される。本実施形態に従って、慢性関節リ
ウマチを有する個体または慢性関節リウマチを有する個体のサブセットが、慢性
関節リウマチまたは慢性関節リウマチのこのサブセットを有さない個体と比較し
た場合、異常に高いレベルのニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶを発現する。本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野
で公知の任意の手段が適用され得、本発明のニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを検出（例えば
、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペ
プチドのＦＡＣＳ分析またはＥＬＩＳＡ検出ならびに本発明のニュートロカイン
αおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションまたはＰＣＲ検出）し、そして生物学的サンプル中の本発明のニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオドおよび／ま
たはポリペプチドの発現プロフィールを決定する。
【０５１０】 慢性関節リウマチに罹患した人の生物学的サンプルは、慢性関節リウマチを有
さない個体で観測されるレベルと比較した場合、ニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶの高い発現レベルによって特徴付けられる。従って
、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌ
クレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／あるいはそのアゴニストま
たはアンタゴニストは、慢性関節リウマチまたは慢性関節リウマチのサブセット
の診断および／または予後において本発明の方法に従って使用され得る。例えば
、慢性関節リウマチに罹患していると疑われる人（「被験体」）から得られた生
物学的サンプルを、本発明のニュートロカインα、および／またはニュートロカ
インαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの相対的な発現レベ
ルについて分析し得る。次いで、本発明のこれらの分子の１つ以上の発現レベル
が、慢性関節リウマチに罹患していないことが既知の人において発現されるのと
同じ本発明の分子の発現レベルと比較される。被験体およびコントロールから得
られたサンプル間の、本発明のニュートロカインα、および／またはニュートロ
カインαＳＶのポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド、ならびに／ある
いはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの発現レベルの有意な違いは
、その被験体が、慢性関節リウマチまたはそのサブセットに罹患していることを
示唆する。
【０５１１】 従って、本発明は、免疫系の癌、ならびに免疫不全および／または自己免疫疾
患を含む免疫系障害の診断の間に有用な診断方法を提供し、この方法は、個体か
らの免疫系組織または他の細胞あるいは体液中のニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶのポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを
測定する工程、ならびに測定された遺伝子発現レベルと標準的なニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶの遺伝子発現レベルとを比較する工
程を包含し、これによって、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加または減少
が、免疫系の障害を示す。
【０５１２】 腫瘍の診断、自己免疫不全の診断、および／または自己免疫疾患の診断を含む
が、これらには限定されない免疫系の障害の診断が、すでに従来の方法に従って
なされている場合、本発明は、予後のインジケーターとして有用であり、これに
よって、高められたかまたは抑制されたニュートロカインαおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶの遺伝子発現を示す患者が、標準的なレベルに近いレベルで
遺伝子を発現する患者に対してより悪い臨床的結果を経験する。
【０５１３】 ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドを
コードする遺伝子の発現レベルを分析または決定することによって、ニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドのレベルあるい
は第１の生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶのポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、直接的（例えば、
完全なタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルを決定または推定することによっ
て）、または相対的（例えば、第２の生物学的サンプル中のニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルを比較することによって）のいずれかで定性的または定量的に測定または推
定することが意図される。好ましくは、第１の生物学的サンプル中のニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍ
ＲＮＡレベルを測定または推定し、そして標準的なニュートロカインαおよび／
またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを比
較する。標準は、障害を有さない個体から得られた第２の生物学的サンプルから
とられるか、または免疫系の障害を有さない個体の集団からの平均レベルによっ
て決定される。当該分野で明らかなように、一旦、標準的なニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルが既知となると、比較のための標準として繰り返し使用され得る。
【０５１４】 「生物学的サンプル」によって、個体、体液、細胞株、組織培養物、あるいは
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドまた
はｍＲＮＡを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意図される
。示されるように、生物学的サンプルとしては、ニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの遊離した細胞外ドメインを含む体
液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、および髄液）、免疫系組織、およびニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶあるいはニュートロカイン
αのレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターの完全なま
たは遊離した細胞外ドメインを発現することが見出された他の組織供給源が挙げ
られる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知で
ある。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含む場合、組織生検が好ましい供給源であ
る。
【０５１５】 本発明の化合物は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の免疫系関連障
害の診断、予後の判断または処置に有用である。このような障害としては、腫瘍
（例えば、Ｂ細胞および単核細胞の白血病およびリンパ種）、ならびに腫瘍転移
、細菌、ウイルスおよび他の寄生生物による感染、免疫不全症、炎症性疾患、リ
ンパ節腫脹、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス、シェーグレン症候群、混合結合組織病、および炎症性筋障害）ならびに対宿
主性移植片疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５１６】 全細胞ＲＮＡが、任意の適切な技術（例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよび
Ｓａｃｃｈｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９（１９８７
）に記載されている一工程のグアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）−チオ
シアネート−フェノール−クロロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単
離され得る。次いで、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳ
ＶのペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッ
セイされる。これらは、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写
（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣ
Ｒ）を含む。
【０５１７】 生物学的サンプル中のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインα
ＳＶのポリペプチドレベルのアッセイは、抗体に基づく技術を用いて起こり得る
。例えば、組織におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインα
ＳＶのポリペプチドの発現は、古典的な免疫組織学的方法で研究され得る（Ｊａ
ｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１
９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０
８７−３０９６（１９８７））。ニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶのポリペプチドの遺伝子発現を検出するための有用な他の抗体に基
づく方法としては、イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ
ＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））が挙げられる。適切な抗体ア
ッセイの標識は、当該分野において公知であり、そしてグルコースオキシダーゼ
のような酵素標識、ならびに放射性同位元素（例えば、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、 123 Ｉ、121Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジ
ウム（115mＩｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ
、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム
（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、 153 Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47
Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）；発光標識（例えば、ル
ミノール）；ならびに蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）な
らびにビオチン）が挙げられる。
【０５１８】 当該分野で公知の技術が、本発明の抗体を標識するために適用され得る。この
ような技術としては、二官能性結合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，
０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；同第５，６
５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２５号；同第
５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２，６０４号
；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同第５，８０
８，００３号を参照のこと；これら各々の内容は、本明細書によって参考として
その全体が援用される）が挙げられるが、これに限定されない。
【０５１９】 分析される組織または細胞型としては、一般的に、ニュートロカインα遺伝子
を発現することが既知かまたは疑われる組織または細胞型（例えば、単核細胞系
統の細胞）、あるいはニュートロカインαレセプター遺伝子を発現することが既
知かまたは疑われる細胞または組織（例えば、Ｂ細胞系統の細胞および脾臓）が
挙げられる。本明細書中で使用されるタンパク質の単離方法は、例えば、Ｈａｒ
ｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，１９８８，
「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（これは、本明細書
中においてその全体で参考として援用される）に記載されるものであり得る。単
離された細胞は、細胞培養物または患者由来であり得る。培養物から採取された
細胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療技術の一部として使用され得る細胞の評
価において、あるいはニュートロカインα遺伝子またはニュートロカインαレセ
プター遺伝子の発現に対する化合物の効果を試験するために必要な工程であり得
る。
【０５２０】 例えば、本明細書中に記載されるような抗体、または抗体のフラグメントが、
ニュートロカインα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグメ
ントの存在を定量的または定性的に検出するために使用され得る。例えば、これ
は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光計検出に接続される蛍光標
識された抗体を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。
【０５２１】 本発明の抗体（またはそのフラグメント）またはニュートロカインαのポリペ
プチドまたはポリペプチドは、さらに、ニュートロカインα遺伝子産物もしくは
保存的改変体またはそのペプチドフラグメントのインサイチュで検出のために、
あるいはニュートロカインαレセプターに結合するニュートロカインαについて
インサイチュで検出するために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡または非免疫学的ア
ッセイとして組織学的に使用され得る。インサイチュ検出は、患者から組織学的
試料を取り出し、そしてそこに本発明の標識された抗体またはニュートロカイン
αポリペプチドを適用することによって達成され得る。抗体（またはフラグメン
ト）またはニュートロカインαポリペプチドは、好ましくは、標識された抗体（
またはフラグメント）を生物学的サンプルに重ねることによって適用される。こ
のような手順の使用によって、ニュートロカインα遺伝子産物、または保存的改
変体またはペプチドフラグメントの存在、またはニュートロカインαポリペプチ
ドの結合のみだけではなく、試験された組織におけるその分布をも決定し得る。
本発明を使用して、当業者は、任意の広範な種々の組織学的方法（例えば、染色
手順）がこのようなインサイチュ検出を達成するために改変され得ることを容易
に認知する。
【０５２２】 ニュートロカインα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグ
メントのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、代表的に、ニュートロカイ
ンα遺伝子産物または保存的改変体またはそのペプチドフラグメントを同定し得
る検出可能に標識された抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物学的流体、組
織抽出物、新鮮に収集された細胞、または細胞培養物中でインキュベートされた
細胞の溶解物）をインキュベートする工程、および結合された抗体を当該分野で
周知の任意の多くの技術によって検出する工程を包含する。
【０５２３】 ニュートロカインαレセプター遺伝子産物または保存的改変体あるいはそのペ
プチドフラグメントのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、代表的に、ニ
ュートロカインαレセプター遺伝子産物または保存的改変体あるいはそのペプチ
ドフラグメントを同定し得る検出可能かまたは標識されたニュートロカインαポ
リペプチドの存在下で、サンプル（例えば、生物学的流体、組織抽出物、新鮮に
収集された細胞、または細胞培養物中でインキュベートされた細胞の溶解物）を
インキュベートする工程、および結合されたニュートロカインαポリペプチドを
当該分野で周知の任意の多くの技術によって検出する工程を包含する。
【０５２４】 生物学的サンプルは、固相支持体またはキャリア（例えばニトロセルロース）
、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化し得る他の固体支持
体に接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体は、適切な緩衝液で
洗浄され得、続いて検出可能に標識された抗ニュートロカインα抗体または検出
可能なニュートロカインαポリペプチドで処理される。次いで、固相支持体は、
結合していない抗体またはポリペプチドを除くために、緩衝液で２回洗浄され得
る。必要に応じて、抗体は、続いて標識される。次いで、固体支持体上に結合さ
れた標識の量が従来の手段によって検出され得る。
【０５２５】 「固相支持体またはキャリア」によって、抗原または抗体を結合し得る任意の
支持体を意図する。周知の支持体またはキャリアには、ガラス、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然お
よび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩、および磁鉄鉱が挙げられ
る。キャリアの性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性であるかまたは
不溶性のいずれかであり得る。支持体材料は、結合された分子が抗原または抗体
に結合し得る限り、実質的に任意の可能な構造的形状を有し得る。従って、支持
体の形状は、球形（ビーズのような）、または円筒形（試験管の内側表面または
棒の外側表面のような）であり得る。あるいは、表面は、シート、試験ストリッ
プなどのように平坦であり得る。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが挙
げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適切なキャリ
アを知っているか、または慣用的な実験の使用によってこれを確認し得る。
【０５２６】 所与の多くの抗ニュートロカインα抗体またはニュートロカインαポリペプチ
ドの結合活性は、周知の方法に従って決定され得る。当業者は、慣用的な実験を
使用することによって、各決定のために、操作条件および最適のアッセイ条件を
決定し得る。
【０５２７】 個体から得られる生物学的サンプルにおけるニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのポリペプチドレベルまたはポリヌクレオチドレベル
をアッセイすることに加えて、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶのポリペプチドまたはポリヌクレオチドはまた、イメージングによっ
てインビボで検出され得る。例えば、本発明の１つの実施形態において、ニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドならびに／
あるいは抗ニュートロカインα抗体は、Ｂ細胞リンパ種をイメージングするため
に使用される。別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶのポリペプチドならびに／あるいは抗ニュートロカ
インα抗体および／またはニュートロカインαポリヌクレオチド（例えば、ニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのｍＲＮＡの全てまたは
一部に相補的なポリヌクレオチド）が、リンパ種（例えば、単核細胞およびＢ細
胞リンパ種）をイメージングするために使用される。
【０５２８】 ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドの
インビボイメージングのための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線ラジオグラフ
ィー、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴ走査またはＥＳＲによって検出可能なものが挙げ
られる。Ｘ線ラジオグラフィーについては、適切な標識は、検出可能な放射線を
放射するが、被験体に対して明白には有害ではないバリウムまたはセシウムのよ
うな放射性同位体を含む。ＮＭＲおよびＥＳＲに適切なマーカーには、重水素の
ような検出可能な特徴的なスピンを有するものが含まれ、これは、関連したハイ
ブリドーマのための栄養素を標識することにより抗体に取り込まれ得る。インビ
ボイメージングが、ヒトにおける診断のためにニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのポリペプチドの増加したレベルを検出するために使
用される場合、ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用する
ことが好適であり得る。このような抗体は、本明細書中に記載される技術または
そうでなければ当該分野で公知の技術を使用して産生され得る。例えば、キメラ
抗体を産生するための方法は、当該分野で公知である。（総説については、Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、Ｂｉ
ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特
許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ １７１４９６；Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＷＯ ８６０１
５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、ＷＯ ８７０２６７１；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、
Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１４：２６８（１９８５）を参照のこと）。
【０５２９】 さらに、存在が検出され得る任意のニュートロカインαポリペプチドが、投与
され得る。例えば、放射線不透過性または他の適切な化合物で標識されたニュー
トロカインαポリペプチドは、標識化抗体について上で議論したように、インビ
ボで投与され、そして可視化され得る。さらに、このようなニュートロカインα
ポリペプチドは、インビボ診断手順のために利用され得る。
【０５３０】 放射性同位体（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ、（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、 121 Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（11 5m Ｉｎ、113mＩｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、およびテクネチウム（99Ｔｃ、99mＴ
ｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐ
ｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ
、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、18 6 Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、97Ｒｕ）、放射線不透過物質、または核磁
気共鳴によって検出可能な物質のような、適切な検出可能なイメージング部分で
標識された、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリ
ペプチドに特異的な抗体または抗体フラグメントが、免疫系障害について試験す
るために、哺乳動物に（例えば、非経口的に、皮下的に、または腹腔内に）導入
される。被験体の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断的イメ
ージングを生成するために必要とされるイメージング部分の量を決定することが
、当該分野で理解される。放射性同位体部分の場合には、ヒト被験体について、
注射される放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの99mＴｃの範囲であ
る。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、ニュートロカインαタ
ンパク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積される。インビボ腫瘍イメージングは
、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉ
ｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈ
ｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ」（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒの第１３章、
Ｓ．Ｗ．ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載される。
【０５３１】 抗体に関して、抗ニュートロカインα抗体が検出可能に標識され得る方法の１
つは、これを酵素に連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）におけ
る連結産物を使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ （ＥＬＩＳＡ）
」，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７，Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ；Ｖｏｌｌｅｒら， Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ
，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；
Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（編），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ
．ら，（編），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ
Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ）。抗体に結合する酵素は、適切な基質、好ましくは
、発色性基質と、例えば、分光測光的手段、蛍光測定的手段、または視覚的手段
によって検出可能な化学的部分を生成するような様式で反応する。抗体を検出可
能に標識するために使用され得る酵素には、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ
球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロ
ゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレ
アーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラ
ーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない
。さらに、この検出は、酵素に対する発色性基質を使用する比色法によって達成
され得る。検出はまた、同様に調製された標準との比較における基質の酵素反応
の程度についての視覚的比較によって達成され得る。
【０５３２】 検出はまた、任意の種々の他のイムノアッセイを使用して達成され得る。例え
ば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することによって、ラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）の使用によってニュートロカインαを検出し得る（例えば、
Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ
Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９８６年３月を参照のこと；これは、本明細
書中で参考として援用される）。放射性同位体は、γ線計数器、シンチレーショ
ン計数管、またはオートラジオグラフィーを含むが、これらに限定されない手段
によって検出され得る。
【０５３３】 蛍光化合物で抗体を標識することがまた可能である。次いで蛍光標識された抗
体を適切な波長の光に曝露する場合、その存在が、蛍光に起因して検出され得る
。蛍光標識化合物に最も一般的に使用される化合物は、フルオレセインイソチオ
シアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシア
ニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、オプトアルデヒド（ｏｐｈｔａｌｄ
ｅｈｙｄｅ）およびフルオレサミンである。
【０５３４】 抗体はまた、152Ｅｕまたはランタン系列の他のもののような蛍光放射金属を
使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペン
タ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キ
レート化基を使用して抗体に接着され得る。
【０５３５】 抗体はまた、化学発光化合物に結合することによって検出可能に標識され得る
。次いで、化学発光タグ化抗体の存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存
在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、
ルミノール、イソルミノール（ｉｓｏｌｕｍｉｎｏｌ）、セロマティックアクリ
ジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｅｓｔｅｒ
）、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルがある。
【０５３６】 同様に、生物発光化合物が、本発明の抗体を標識するために使用され得る。生
物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学的システムに
おいて見出されるタイプの化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光
の存在を検出することによって決定される。標識の目的のために重要な生物発光
化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられるが、こ
れらには限定されない。
【０５３７】 （免疫系関連障害の処置） 上記のように、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびに抗ニュートロカインα抗体は、
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の異常に高い
かまたは低い発現に関与する状態の診断に有用である。ニュートロカインαおよ
び／またはニュートロカインαＳＶが発現される細胞および組織、ならびにニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶによって調節される活性
が与えられると、標準または「正常」レベルと比較して、個体における実質的に
変化（増大または減少）したレベルのニュートロカインαおよび／またはニュー
トロカインαＳＶの発現は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶが発現され、そして/あるいは活性である身体系に関連する病理学的状
態を生じることが直ちに明白である。
【０５３８】 本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペ
プチドはＴＮＦファミリーのメンバーであるので、それぞれのタンパク質の細胞
外ドメインが、タンパク質分解性の切断によってニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶを発現する細胞から可溶性形態で放出され得、それ
ゆえ、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチ
ド（特に可溶性形態のそれぞれの細胞外ドメイン）が、個体の細胞、組織または
身体に外来性供給源から添加される場合、このポリペプチドは、その個体の標的
細胞のいずれかにおいてその調節活性を発揮することもまた当業者に理解される
。また、このＩＩ型膜貫通タンパク質を発現する細胞は、個体の細胞、組織また
は身体に添加され得、それによって、添加された細胞はニュートロカインαおよ
び／またはニュートロカインαＳＶのレセプターを発現する細胞に結合し、それ
によってニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現する
細胞は、レセプター保有標的細胞において作用（例えば、増殖または細胞傷害性
）を引き起こし得る。
【０５３９】 １つの実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物（例
えば、異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグに会合するニュ
ートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは
抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体を含む組
成物）を標的細胞（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶのレセプターを発現するＢ細胞、あるいはニュートロカインαおよび／
またはニュートロカインαＳＶの細胞表面結合形態を発現する単核細胞）に送達
する方法を提供する。本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニュ
ートロカインαＳＶの抗体は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン性相互
作用および／または共有結合的な相互作用を介して、異種ポリペプチド、異種核
酸、毒素、またはプロドラッグと会合され得る。
【０５４０】 １つの実施形態において、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合する
本発明のポリペプチド（例えば、ニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニュートロカインαおよび／または抗ニ
ュートロカインαＳＶの抗体）を投与することによって、細胞に本発明の組成物
の特異的な送達のための方法を提供する。１つの例において、本発明は、標的細
胞への治療的タンパク質を送達するための方法を提供する。別の例では、本発明
は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（
例えば、細胞のゲノムへと組み込まれ得るか、またはエピソームにより複製され
得、そして転写され得るＤＮＡ）を標的細胞に送達する方法を提供する。
【０５４１】 別の実施形態において、本発明は、本発明のポリペプチド（例えば、ニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいは抗ニ
ュートロカインαおよび／または抗ニュートロカインαＳＶの抗体）を、毒素ま
たは細胞傷害性プロドラッグと共同して投与することによる、細胞の特異的破壊
（例えば、腫瘍細胞の破壊）のための方法を提供する。
【０５４２】 特定の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶのポリペプチドを、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共
同して投与することによる、Ｂ細胞系統（例えば、Ｂ細胞関連白血病またはリン
パ腫）の細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０５４３】 別の特定の実施形態において、本発明は、抗ニュートロカインαおよび／また
は抗ニュートロカインαＳＶの抗体を、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共
同して投与することによる、単球系統（例えば、単球白血病またはリンパ腫）の
細胞の特異的破壊のための方法を提供する。
【０５４４】 「毒素」により、内因性細胞傷害性エフェクター系を結合および活性化させる
化合物、放射性同位体、ホロ毒素（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）、改変毒素、毒素の触
媒サブユニット、細胞毒（細胞障害性因子）、あるいは、細胞死を引き起こす規
定された条件下にある細胞表面内またはその表面上に通常は存在しない任意の分
子または酵素を意味する。本発明の方法に従って使用され得る毒素としては、当
該分野で公知の放射性同位体、化合物（例えば、固有のもしくは誘導された内因
性細胞傷害性エフェクター系を結合する抗体（またはその補体固定含有部分））
、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼ（ＲＮＡｓｅ）、α毒素
、リシン、アブリン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポ
リン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、ゲロニン（ｇｅｌ
ｏｎｉｎ）、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシン（ｓａｒｃ
ｉｎ）およびコレラ毒素が挙げられるが、これらに限定されない。「毒素」はま
た、細胞分裂抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療薬または放射性金属イオン（例え
ば、α−エミッター（例えば、213Ｂｉ））もしくは他の放射性同位体（例えば
、103Ｐｄ、133Ｘｅ、131Ｉ、68Ｇｅ、57Ｃｏ、65Ｚｎ、85Ｓｒ、32Ｐ、35Ｓ、9 0 Ｙ、153Ｓｍ、153Ｇｄ、169Ｙｂ、51Ｃｒ、54Ｍｎ、75Ｓｅ、113Ｓｎ、90イッ
トリウム、117スズ、186レニウム、166ホルミウム、および188レニウム）；発光
標識（例えば、ルミノール）；および蛍光標識（例えば、フルオレセインおよび
ローダミン）、ならびにビオチンを含む。
【０５４５】 当該分野において公知の技術は、本発明の抗体を標識化するために適用され得
る。このような技術としては、二官能性結合化剤の使用（例えば、米国特許第５
，７５６，０６５号；同第５，７１４，６３１号；同第５，６９６，２３９号；
同第５，６５２，３６１号；同第５，５０５，９３１号；同第５，４８９，４２
５号；同第５，４３５，９９０号；同第５，４２８，１３９号；同第５，３４２
，６０４号；同第５，２７４，１１９号；同第４，９９４，５６０号；および同
第５，８０８，００３号を参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書によっ
て参考としてその全体が援用される）が挙げられるが、これに限定されない。細
胞毒または細胞傷害性薬剤は、細胞に対して有害な任意の薬剤を含む。例として
は、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｏｌ）、サイトカラシンＢ、グラミシジ
ンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド（
ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキ
ソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒ
ｏｘｙ ａｎｔｈｒａｃｉｎ ｄｉｏｎｅ）、ミトザントロン、ミトラマイシン
、アクチノマイシンＤ，１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プ
ロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン
、ならびにそのアナログもしくはホモログ、が挙げられる。治療剤には、代謝拮
抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン
、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃ
ｉｌ ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、
チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（Ｂ
ＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈ
ｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシ
ン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジ
クロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（
例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗
生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシ
ン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）（Ａ
ＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン
）、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０５４６】 「細胞傷害性プロドラッグ」により、細胞に通常存在する酵素により細胞傷害
性化合物へと変換される非毒性化合物を意味する。本発明の方法に従って使用さ
れ得る細胞傷害性プロドラッグには、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタ
ミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのホスフェート（ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ）誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシ
ンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４７】 個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活
性の標準または正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、
免疫系の障害）は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
のポリペプチド（可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞
の形態）あるいはアゴニストの投与によって処置され得ることが理解される。従
って、本発明はまた、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳ
Ｖの活性の増大したレベルを必要とする個体の処置の方法を提供する。この方法
は、このような個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶの活性レベルを増大するのに効果的な量の本発明の単離されたニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドあるいはその
アゴニストを含有する薬学組成物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０５４８】 個体におけるニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活
性の標準または正常なレベルにおける減少によって引き起こされる状態（特に、
免疫系の障害）は、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
のポリペプチド（可溶性細胞外ドメインまたは完全なタンパク質を発現する細胞
の形態）あるいはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体）の投与
によって処置され得ることが理解される。従って、本発明はまた、ニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性の減少したレベルを必要と
する個体の処置の方法を提供する。この方法は、このような個体におけるニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性レベルを減少するの
に効果的な量の本発明の単離されたニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶのポリペプチドあるいはそのアンタゴニストを含有する薬学組成
物をそのような個体に投与する工程を包含する。
【０５４９】 本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌ
クレオチドもしくはポリペプチドあるいはニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶのアゴニストは、感染因子の処置に用いられ得る。例えば
、免疫応答を上昇させることによって、特にＢ細胞の増殖および分化を増加させ
ることによって、感染性疾患が処置され得る。免疫応答は、既存の免疫応答を上
昇させるか、または新たな免疫応答を開始させるかのいずれかにより上昇され得
る。あるいは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのアゴニストはまた、必ずしも免疫応答を誘発するこ
となく、感染因子を直接阻害し得る。
【０５５０】 ウイルスは、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのアゴニストにより処置され得る疾患または症状を引
き起こし得る感染因子の一例である。ウイルスの例としては、以下のＤＮＡウイ
ルスおよびＲＮＡウイルスならびにウイルス科が挙げられるがこれらに限定され
ない：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイル
ス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシ
ウイルス科、シルコウイルス科、コロナウイルス科、デング熱、ＥＢＶ、ＨＩＶ
、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例え
ば、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（Ｍ
ｏｎｏｎｅｇａｖｉｒｕｓ）（例えば、パラミクソウイルス科、モルビリウイル
ス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ
、インフルエンザＢ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポ
ーバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科
（例えば、痘瘡または痘疹）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レト
ロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、およびトガ
ウイルス科（例えば、ルビウイルス属）。これらの科内に入るウイルスは、以下
を含むがこれらに限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：関節炎
、細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｌｉｔｉｓ）、呼吸性シンシチウムウイルス
、脳炎、眼性感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型
、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチン出血熱（
Ｊｕｎｉｎ）、チンクグニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、黄
熱病、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫
、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、
ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚病（例えば、カポージ、いぼ）、および
ウイルス血症。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポ
リヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶのアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて、これ
らの症状または疾患のいずれかが処置、予防、診断および／または検出され得る
。特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプ
チド、またはアゴニストは、以下の処置、予防、および／または診断に使用され
る：髄膜炎、デング熱、ＥＢＶおよび／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。さら
なる特定の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペ
プチドまたはアゴニストは、１以上の他の市販の肝炎ワクチンに非応答性の患者
を処置するために使用される。さらなる特定の実施形態において、ニュートロカ
インαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはアゴニストは、ＡＩＤＳを処
置、予防および／または診断するために使用される。さらなる特定の実施形態に
おいて、ニュートロカインαならびに／あるいはニュートロカインαＳＶおよび
／またはニュートロカインαレセプターのポリヌクレオチド、ポリペプチド、ア
ゴニストおよび／またはアンタゴニストは、クリプトスポリジウム症を有する患
者を処置、予防、および／または診断するために使用される。
【０５５１】 同様に、疾患または症状を引き起こし得、かつニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいは
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのアゴニストまたは
アンタゴニストによって処置され得る細菌性因子または真菌性因子は、以下のグ
ラム陰性細菌および細菌科ならびにグラム陽性細菌および細菌科、ならびに真菌
を含むがこれらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ（例えば、Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｏｒｃａｒｄ
ｉａ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（例えば、Ａｎｔｈｒａｘ、Ｃｌｏｓｔｒ
ｉｄｉｕｍ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（例えば、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒ
ｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ、Ｃａ
ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔ
ｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、
Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒ
ｒｈａｇｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｋｌ
ｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ
ｙｐｈｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｓｅｒｒａｔｉ
ａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃ
ｔｅｒ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌｏｓｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔ
ｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃ
ｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｖｉ
ｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ａｃｉｎ
ｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｍｅｎｉｇｏｃｏｃｃａｌ）、Ｍｅ
ｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａの
感染症（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）（例えば、Ａ
ｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈｅａｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈｅａｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｔｙｐｅ Ｂ）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）
、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉ
ａｃｅａｅ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃａｌ、Ｍｅｎｉｎｇｉｏｃｏｃｃａｌ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌお
よびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅおよびＢ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）。これらの細菌また
は真菌の科は、以下を含むがこれらに限定されない疾患または症状を引き起こし
得る：菌血症、心内膜炎、眼性感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、
日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳに関連した感染症）、爪周囲炎、プロテーゼ関
連感染症、ライター病、気道感染症（例えば、百日咳または蓄膿症）、敗血症、
ライム病、ネコ引っ掻き病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、腸チフス、肺炎、淋
病、髄膜炎（例えば、髄膜炎Ａ型およびＢ型）、クラミジア、梅毒、ジフテリア
、ハンセン病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹
、リウマチ熱、猩紅熱、性感染病、皮膚病（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌症（ｄｅ
ｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ））、毒血症、尿路感染症、創傷感染症。ニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
のアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらの症状または疾患のいずれ
かを処置、予防、診断および／または検出し得る。特定の実施形態において、ニ
ュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはそのアゴニストは
、以下を処置、予防および／または診断するために使用される：破傷風、ジフテ
リア、ボツリヌス中毒、および／または髄膜炎Ｂ型。
【０５５２】 さらに、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶのアゴニストにより処置され得る、寄生生物性因子が引き
起こす疾患または症状としては以下のファミリーまたはクラスが挙げられるがこ
れらに限定されない：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポ
リジウム症、二核アメーバ症（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）、交疫、外部
寄生生物（Ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｉｃ）、ジアルジア鞭毛虫病、蠕虫病、リー
シュマニア症、タイレリア症、トキソプラスマ症、トリパノソーマ症、およびト
リコモナス症（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、ならびに胞子虫症（Ｓｐｏｒｏｚｏ
ａｎ）（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｒａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ
ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅおよびＰｌ
ａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）。これらの寄生生物は、以下を含むがこれらに
限定されない種々の疾患または症状を引き起こし得る：疥癬、ツツガムシ病、眼
性感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝臓疾患、肺疾患、
日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソ
プラスマ症。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリ
ヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはニュートロカインαおよび／または
ニュートロカインαＳＶのアゴニストまたはアンタゴニストを用いて、これらの
症状または疾患のいずれかを処置、予防、診断および／または検出し得る。特定
の実施形態において、ニュートロカインαのポリヌクレオチド、ポリペプチド、
あるいはそのアゴニストは、マラリアの処置、予防、および／または診断のため
に使用される。
【０５５３】 別の実施形態において、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに／あるいはそ
のアゴニストおよび／またはアンタゴニストは、内耳感染（例えば、中耳炎）、
ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび他の病原性
生物の感染によって特徴付けられる他の感染を処置、予防、および／または診断
するために使用される。
【０５５４】 特定の実施形態において、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまた
はアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗ニュ
ートロカインαＳＶ抗体）は、欠乏した血清免疫グロブリン産生、再発性感染、
および／または免疫系機能不全によって特徴付けられる障害を処置またはは予防
するために使用される。さらに、ニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶのポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニスト
またはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカインα抗体、および／または抗
ニュートロカインαＳＶ抗体）は、関節、骨、皮膚、および／または耳下腺の感
染、血液媒介性感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血症性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ
ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本
明細書中に開示されるもの）、炎症性障害、および悪性疾患、ならびに／あるい
はこれらの感染、疾患、障害および／または悪性疾患に関連する任意の疾患また
は障害または状態（ＣＶＩＤ、他の第一次免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発
性気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例え
ば、重症帯状疱疹）、およびまたはニューモシスチスカリニ（ｐｈｅｕｍｏｃｙ
ｓｔｉｓ ｃａｒｎｉｉ）を含むが、これらに限定されない）を処置または予防
するために使用され得る。
【０５５５】 本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタゴニスト
は、以下に関連する疾患または障害または状態の１つ以上を診断、予後の判断、
処置、または予防するために使用され得る：第１次免疫不全、免疫媒介血小板減
少症、川崎病、骨髄移植（例えば、成人または子供における最近の骨髄移植）、
慢性Ｂ細胞リンパ性白血病、ＨＩＶ感染（例えば、成人性または小児のＨＩＶ感
染）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、および輸血後紫斑病。
【０５５６】 さらに、本発明のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ
のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、あるいはそのアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、以下に関連する疾患、障害または状態の１つ以上を診断、予後の判
断、処置、または予防するために使用され得る：ギャン−バレー症候群、貧血症
（例えば、パルボウイルスＢ１９関連貧血症、感染（例えば、再発性感染）の高
い危険にある安定多発性骨髄腫（ｓｔａｂｌｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏ
ｍａ）を有する患者、自己免疫溶血性貧血（例えば、温型（ｗａｒｍ−ｔｙｐｅ
）自己免疫溶血性貧血）、血小板減少症（例えば、新生児血小板減少症）および
免疫媒介好中球減少症）、移植（例えば、サイトメガロウイルス（ｃｙｔａｍｅ
ｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）−陽性器官のＣＭＶ−陰性レシピエント）、低
ガンマグロブリン血症（例えば、感染または罹患の危険因子を有する低ガンマグ
ロブリン血症新生児）、癲癇（例えば、難治性癲癇）、全身性血管炎症候群（ｓ
ｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症（
例えば、重症筋無力症における代償不全）、皮膚筋炎、および多発性筋炎）。
【０５５７】 本発明のさらに好ましい実施形態は、以下の用途におけるニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチド、ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチド、ならびにその機能的
アゴニストの使用を含むが、これらに限定されない： １つ以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）の量の増加
を産生するための免疫系をブーストするための、より高い親和性抗体の産生（例
えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ）を誘導するための、そして／また
は免疫応答を増加させるための、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハム
スター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラク
ダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒト（
最も好ましくはヒト）への投与。特定の非限定的実施形態では、本発明のニュー
トロカインαポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＧの量の増
加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。別の特定の非限定
的な実施形態において、本発明のニュートロカインαポリペプチド、および／ま
たはそのアゴニストは、ＩｇＡの量の増加を産生するための免疫系をブーストす
るために投与される。別の特定の非限定的な実施形態において、本発明のニュー
トロカインαポリペプチド、および／またはそのアゴニストは、ＩｇＭの量の増
加を産生するための免疫系をブーストするために投与される。
【０５５８】 機能性内因性抗体分子を産生し得るか、またはそうでなければ弱められた内因
性免疫系を有し得るが、別の動物から再構成されたかまたは部分的に再構成され
た免疫系によってヒト免疫グロブリン分子を産生し得る動物（上記に列挙された
動物を含むが、これらに限定されず、またトランスジェニック動物を含む）への
投与（例えば、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／２４８９８３、ＷＯ／９６３４０
９６、ＷＯ／９６３３７３５、およびＷＯ／９１１０７４１を参照のこと）。
【０５５９】 特定の抗原に対する免疫応答性を高めるワクチンアジュバント。特定の実施形
態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドである。別の特定の
実施形態において、ワクチンアジュバントは、本明細書中に記載されたニュート
ロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレオチドである（
すなわち、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌ
クレオチドが遺伝子ワクチンアジュバントである）。本明細書中に議論されるよ
うに、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリヌクレ
オチドは、リポソーム送達、組換えベクター送達、裸のＤＮＡの注入、および遺
伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）送達を含むが、これらには限定されない、当該分野
で公知の技術を使用して投与され得る。
【０５６０】 腫瘍特異的免疫応答を高めるためのアジュバント。
【０５６１】 抗ウイルス免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバントとして本発明
の組成物を使用して高められ得る抗ウイルス免疫応答は、本明細書中に記載され
るかまたはそうでなければ当該分野で公知のウイルスおよびウイルス関連疾患ま
たは症状を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の組成
物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対する免疫
応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング
熱、ＥＢＶ、および肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）。別の特定の実施形態では、本発
明の組成物は、以下からなる群から選択されるウイルス、疾患、または症状に対
する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される：ＨＩＶ／ＡＩＤＳ
、ＲＳウイルス、デング熱、ロタウイルス、インフルエンザＡ型、インフルエン
ザＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、アルゼン
チン出血熱（Ｊｕｎｉｎ）、チングニヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバ
レー熱、単純ヘルペス、および黄熱病。別の特定の実施形態では、本発明の組成
物は、ＨＩＶ ｇｐ１２０抗原に対する免疫応答を高めるためのアジュバントと
して使用される。
【０５６２】 抗細菌免疫応答または抗真菌免疫応答を高めるためのアジュバント。アジュバ
ントとして本発明の組成物を使用して高められ得る抗細菌免疫応答または抗真菌
免疫応答は、本明細書中に記載されるかまたはそうでなければ当該分野で公知の
細菌または真菌および細菌関連疾患または症状あるいは真菌関連疾患または症状
を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選択
される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジュ
バントとして使用される：破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および髄膜炎
Ｂ型。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、以下からなる群から選
択される細菌または真菌、疾患または症状に対する免疫応答を高めるためのアジ
ュバントとして使用される：Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏ
ｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄ
ｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂ群ｓｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉ
ｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、およびＰｌａｓ
ｍｏｄｉｕｍ（マラリア）。
【０５６３】 抗寄生生物免疫応答を高めるためのアジュバント。。アジュバントとして本発
明の組成物を使用して高められ得る抗寄生生物免疫応答は、本明細書中に記載さ
れるかまたはそうでなければ当該分野で公知の寄生生物および寄生生物関連疾患
または症状を含む。特定の実施形態において、本発明の組成物は、寄生生物に対
する免疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。別の特定の実施形
態において、本発明の組成物は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（マラリア）に対する免
疫応答を高めるためのアジュバントとして使用される。
【０５６４】 病原体に対するＢ細胞応答の刺激剤として。
【０５６５】 免疫抑制治療を受ける前に個体の免疫状態を高める試薬として。
【０５６６】 より高い親和性の抗体を誘導するための試薬として。
【０５６７】 血清免疫グロブリン濃度を増加するための試薬として。
【０５６８】 免疫無防備状態の個体の回復を促進するための試薬として。
【０５６９】 老齢の集団間の免疫応答性をブーストするための試薬として。
【０５７０】 骨髄移植および／または他の移植の前、その間、またはその後の免疫系エンハ
ンサーとして（例えば、同種器官移植または異種器官移植）。移植に関して本発
明の組成物は、移植の前に、移植と同時に、そして／または移植の後に投与され
得る。特定の実施形態において、本発明の組成物は、移植の後、Ｔ細胞集団の回
復の開始の前に投与される。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植
の後、Ｔ細胞集団の回復の開始の後で、しかしＢ細胞集団の完全な回復の前に最
初に投与される。
【０５７１】 例えば、部分的または完全な脾摘出を受けている個体のようなＢ細胞免疫不全
個体間の免疫応答性をブーストするための試薬として。本発明のニュートロカイ
ンαおよび／またはニュートロカインαＳＶのポリペプチドまたはポリヌクレオ
チド、あるいはそのアゴニストを投与することにより寛解または処置され得るＢ
細胞免疫不全には、以下が挙げられるが、これらには限定されない：重症複合免
疫不全（ＳＣＩＤ）−Ｘ連鎖性、ＳＣＩＤ−常染色体、アデノシンデアミナーゼ
不全（ＡＤＡ不全）Ｘ連鎖性無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、ブルートン疾
患（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、先天性無ガンマグロブリン血症、Ｘ
連鎖性乳児無ガンマグロブリン血症、後天性無ガンマグロブリン血症、成体発症
性無ガンマグロブリン血症、遅発性無ガンマグロブリン血症、異常ガンマグロブ
リン血症、低ガンマグロブリン血症、乳児の一過性低ガンマグロブリン血症、特
定されない低ガンマグロブリン血症、無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫
不全（ＣＶＩＤ）（後天性）、ヴィスコット−オールドリッチ症候群（ＷＡＳ）
、過剰ＩｇＭを伴うＸ連鎖性免疫不全、過剰ＩｇＭを伴う非Ｘ連鎖性免疫不全、
選択的ＩｇＡ不全、ＩｇＧサブクラス不全（ＩｇＡ不全を伴うまたは伴わない）
、正常または増大したＩｇを伴う抗体不全、胸腺腫を伴う免疫不全、Ｉｇ重鎖欠
失、κ鎖不全、Ｂ細胞リンパ球増殖性障害（ＢＬＰＤ）、選択的ＩｇＭ免疫不全
、劣性無ガンマグロブリン血症（スイス型）、細網発育不全（ｒｅｔｉｃｕｌａ
ｒ ｄｙｓｇｅｎｅｓｉｓ）、新生児好中球減少症、重症先天性白血球減少症、
免疫不全を伴う胸腺リンパ形成不全症−形成不全または異形成、毛細管拡張性運
動失調、短肢小人症（ｓｈｏｒｔ ｌｉｍｂｅｄ ｄｗａｒｆｉｓｍ）、Ｘ連鎖
性リンパ球増殖性症候群（ＸＬＰ）、Ｉｇを伴うネゼロフ症候群複合免疫不全、
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ不全（ＰＮＰ）、ＭＨＣクラスＩＩ不全（不
全リンパ球症候群）および重症複合免疫不全。
【０５７２】 Ｂ細胞機能の後天的欠損を有する個体の間で免疫応答性をブーストするための
因子として。本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオ
チドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレ
オチドあるいはそれらのアゴニストを投与することによって改善または処置され
得る、Ｂ細胞機能の後天的欠損を生じる状態としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、およびＢ細胞慢性リン
パ性白血病（ＣＬＬ）。
【０５７３】 一時的な免疫不全を有する個体の間で免疫応答性をブーストするための因子と
して。本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド
あるいはそれらのアゴニストを投与することによって改善または処置され得る、
一時的な免疫不全を生じる状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定さ
れない：ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連
する状態、感染性単核細胞症からの回復、またはストレスに関連する状態、麻疹
からの回復、輸血からの回復、手術からの回復。
【０５７４】 単球、樹状細胞および／またはＢ細胞による抗原提示の制御因子として。１つ
の実施形態においては、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶポリペプチド（可溶性形態、膜結合形態、または膜貫通形態）またはポ
リヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで抗原提示を増強するかまたは抗
原提示をアンタゴナイズする。さらに、関連する実施形態においては、抗原提示
のこの増強またはアンタゴナイズは、抗腫瘍処置において、または免疫系を調節
するために有用であり得る。
【０５７５】 粘膜免疫応答のメディエーターとして。単球によるニュートロカイン−αの発
現およびこの因子へのＢ細胞の応答性は、Ｂ細胞と単球またはそれらの分化型の
子孫との間のシグナル交換に関与し得ることを示唆する。この活性は、多くの点
で、Ｂ細胞とＴ細胞との間のＣＤ４０−ＣＤ１５４シグナル伝達に類似する。従
って、ニュートロカイン−αは、環境病原体に対する、Ｔ細胞と無関係の免疫応
答の重要な制御因子である。特に、粘膜部位に関連し、そしてヒトにおける多く
の生得的免疫に関与する、非従来型のＢ細胞集団（ＣＤ５＋）は、ニュートロカ
イン−αに応答し、それによって個体の防護的免疫状態を増強し得る。
【０５７６】 ＴＨ１細胞応答の反対としての体液性応答（すなわち、ＴＨ２）の発生に対す
る、個体の免疫系を指向する因子として。
【０５７７】 腫瘍増殖を誘導し、それによって抗腫瘍薬剤により感受性にするための手段と
して。例えば、多発性骨髄腫は、ゆっくり分裂する疾患であり、従って実質的に
すべての抗腫瘍レジメンに対して抵抗性である。これらの細胞が、より迅速に増
殖することを強いられるならば、それらの感受性プロフィールは変化するようで
ある。
【０５７８】 細胞増殖の特定の活性化因子またはインヒビターが付着し得る、Ｂ細胞特異的
結合タンパク質として。この結果は、このような活性化因子またはインヒビター
の、正常なＢ細胞集団、疾患したＢ細胞集団、または腫瘍性Ｂ細胞集団への活性
に集中する。
【０５７９】 その特異性によって、Ｂ系統細胞を検出する手段として。この適用は、検出手
段を与えるために、タンパク質をビオチンまたは他の薬剤（例えば、本明細書中
に記載されるような）で標識することを必要とし得る。
【０５８０】 病理（例えば、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球性障害および／または分類不能型免疫
不全）におけるＢ細胞産生の刺激因子として。
【０５８１】 Ｂ細胞を細胞型の異種混合物から単離するための機能を有するＢ細胞選択デバ
イスの一部として。ニュートロカイン−αは、次にＢ細胞が特異的に結合する固
体支持体に結合し得る。非結合細胞は洗い流され、結合細胞は続けて溶出される
。この選択の非限定的使用は、腫瘍細胞を、例えば、骨髄または末梢血から移植
の前に一掃することを可能にする。
【０５８２】 手術、外傷または遺伝子欠損の後のリンパ組織の生成および／または再生のた
めの治療として。
【０５８３】 ＳＣＩＤ患者の間で観察されるような免疫不全を生じる、遺伝的に受け継がれ
た障害のための、遺伝子に基づく治療として。
【０５８４】 ニュートロカイン−α媒介応答を阻害または増強する抗体の産生のための抗原
として。
【０５８５】 単球（例えば、Ｌｅｓｈｍａｎｉａ）をもたらす寄生虫症を防御するために、
単球／マクロファージを活性化する手段として。
【０５８６】 移植の前の骨髄サンプルの前処理として。このような処理は、Ｂ細胞提示を増
加させ、従って回復を促進する。
【０５８７】 ニュートロカイン−αによって誘発される、分泌サイトカインを調節する手段
として。
【０５８８】 本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは
ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはア
ゴニストを使用して、インビボまたはインビトロでＩｇＥ濃度を調節し得る。
【０５８９】 さらに、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチ
ドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオ
チド、あるいはそれらのアゴニストを使用して、ＩｇＥ媒介アレルギー反応を処
置、予防および／または診断し得る。このようなアレルギー反応としては、喘息
、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５９０】 特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもし
くはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドも
しくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、選択的ＩｇＡ欠損を
処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９１】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、毛細管拡張性運
動疾患を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９２】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、分類不能型免疫
不全を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９３】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、Ｘ連鎖無ガンマ
グロブリン血症を処置、予防、診断、および／または改善するために投与される
。
【０５９４】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、重症複合型免疫
不全（ＳＣＩＤ）を処置、予防、診断、および／または改善するために投与され
る。
【０５９５】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、ヴィスコット−
オールドリッチ症候群を処置、予防、診断、および／または改善するために投与
される。
【０５９６】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、過剰ＩｇＭを伴
うＸ連鎖Ｉｇ欠損を処置、予防、診断、および／または改善するために投与され
る。
【０５９７】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニス
ト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）は、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性
白血病、白血病、組織球性白血病、単球性白血病（例えば、急性単球性白血病）
、白血病性細網症、Ｓｈｉｌｌｉｎｇ型単球性白血病、ならびに／あるいは単球
および／または単球細胞および／または組織から誘導される他の白血病を処置、
予防、診断、および／または改善するために投与される。
【０５９８】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、例えば、結核と
共に見られるような単球性類白血病反応を処置、予防、診断、および／または改
善するために投与される。
【０５９９】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチド
もしくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチ
ドもしくはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアゴニストは、単球性白血球増
加症、単球性白血球減少症、単球減少症、および／または単球増加症を処置、予
防、診断、および／または改善するために投与される。
【０６００】 別の特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいは抗ニュートロカイン−α抗体
および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用して、原発性
Ｂリンパ球障害および／もしくは疾患、ならびに／またはそれに付随する状態を
処置、予防、検出および／または診断する。１つの実施形態においては、このよ
うな原発性Ｂリンパ球障害、疾患および／または状態は、体液性免疫の完全な欠
失または部分的な欠失によって特徴付けられる。体液性免疫の完全な欠失または
部分的な欠失によって特徴付けられ、そして本発明の組成物を用いて予防、処置
、検出および／または診断され得る、原発性Ｂリンパ球障害、疾患、および／ま
たはそれに付随する状態としては、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、
重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）、および選択的ＩｇＡ欠損が挙げられるが、こ
れらに限定されない。
【０６０１】 好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドも
しくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
もしくはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／ま
たはアンタゴニストを使用して、身体の任意の１以上の種々の粘膜に影響する疾
患もしくは障害または身体の任意の１以上の種々の粘膜に関連する状態を処置、
予防、および／または診断する。このような疾患または障害としては、例えば、
以下が挙げられるが、これらに限定されない：粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、
粘膜破壊、粘膜性結腸炎、粘膜性リーシュマニア症（例えば、アメリカリーシュ
マニア症、皮膚フランベシア、鼻咽頭リーシュマニア症、および新世界リーシュ
マニア症）、粘膜皮膚リンパ節症候群（例えば、川崎病）、小腸粘膜炎、粘膜性
類表皮癌、粘膜性類上皮腫、粘膜上皮形成異常、ムコイド腺癌、ムコイド変性、
ミクソイド変性；粘膜腫変性；粘膜腫症、ムコイド中膜変性（例えば、嚢胞性中
膜壊死）、ムコリピドーシス（例えば、ムコリピドーシスＩ、ムコリピドーシス
ＩＩ、ムコリピドーシスＩＩＩ、ムコリピドーシスＩＶを含む）、粘液溶解障害
、粘液性膜性腸炎、小腸粘膜炎、ムコ多糖体沈着症（例えば、Ｉ型ムコ多糖体沈
着症（すなわち、ハーラー症候群）、ＩＳ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、シャ
イエ症候群またはＶ型ムコ多糖体沈着症）、ＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち
、ハンター症候群）、ＩＩＩ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、サンフィリポ症候
群）、ＩＶ型ムコ多糖体沈着症（すなわち、モルキオ症候群）、ＶＩ型ムコ多糖
体沈着症（すなわち、マロトー−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖体沈着症（
すなわち、βグルクロニダーゼ欠損に起因するムコ多糖体沈着症）、およびムコ
スルファチドーシス）、ムコ多糖尿、粘液膿性結膜炎、膿様粘液、ムコール症（
すなわち、接合真菌症、粘膜病（すなわち、ウシウイルス性下痢）、粘液性大腸
炎（例えば、粘液性結腸炎および粘膜性大腸炎）、ならびにムコビシドーシス（
例えば、嚢胞性線維症、膵嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、
膵臓の線維嚢胞病、ムコビシドーシス、および粘液過剰症）。非常に好ましい実
施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌ
クレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリ
ヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストを使用して、粘膜炎（特に化学療法に関連するような）を処置、予防、お
よび／または診断する。
【０６０２】 好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドも
しくはポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド
もしくはポリヌクレオチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／ま
たはアンタゴニストを使用して、静脈洞炎に影響する疾患もしくは障害または静
脈洞炎に関連する状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０６０３】 ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／または
ニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、あるいはニ
ュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストによ
って処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状態、疾患または症状
は、骨髄炎である。
【０６０４】 ニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび／または
ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あるいはニ
ュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのアゴニストによ
って処置、予防、および／または診断され得る、さらなる状態、疾患または症状
は、心内膜炎である。
【０６０５】 上記のすべての適用は、獣医学に適用され得る。
【０６０６】 ニュートロカイン−αのアンタゴニストは、結合抗体および／または阻害抗体
、アンチセンス核酸、リボザイム、ならびに本発明のニュートロカイン−αポリ
ペプチドを含む。これらは、上記のリガンドならびに以下のような臨床適用また
は実用的適用を見出されたリガンドの多くの活性を逆転させることが予想される
： 種々の局面の外来因子または自己に対する免疫応答をブロックする手段。例と
しては、自己免疫障害（例えば、ループス）、および関節炎、ならびに皮膚アレ
ルギーに対する免疫応答性、炎症、腸疾患、障害および病原体が挙げられる。本
発明者らの現在のデータは、Ｂ細胞および単球関連病理におけるニュートロカイ
ン−αの潜在的役割を直接言及するが、他の細胞型がニュートロカイン−αに対
する発現または応答性を獲得し得ることは可能なままである。従って、ニュート
ロカイン−αは、（ＣＤ４０およびそのリガンドのように）免疫系および細胞が
位置する微小環境の状態によって調節され得る。
【０６０７】 Ｂ細胞増殖および自己免疫疾患（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、全身性
エリテマトーデスおよびＭＳ）に関連するＩｇ選択を予防するための治療。
【０６０８】 対宿主性移植片病または移植拒絶のインヒビター。
【０６０９】 Ｂ細胞悪性疾患（例えば、ＡＬＬ、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、慢性リ
ンパ球性白血病、プラズマ細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、および
ＥＢＶ形質転換病）のための治療。
【０６１０】 非定量有意性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ヴァル
デンストレーム病、関連特発性単一クローン性高ガンマグロブリン血症、および
プラズマ細胞腫などの疾患において明らかな、慢性高ガンマグロブリン血症のた
めの治療。
【０６１１】 ラージＢ細胞リンパ腫の細胞増殖を減少させるための治療。
【０６１２】 慢性骨髄性白血病に関連するＢ細胞およびＩｇの関与を減少させるための手段
。
【０６１３】 免疫抑制剤。
【０６１４】 本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしくはポリヌクレオチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、あ
るいはアンタゴニストを使用して、インビトロまたはインビボにおけるＩｇＥ濃
度を調節し得る。
【０６１５】 別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドもしく
はポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもし
くはポリヌクレオチド、あるいはそれらのアンタゴニストの投与を使用して、Ｉ
ｇＥ媒介性アレルギー反応（喘息、鼻炎、および湿疹が挙げられるが、これらに
限定されない）を処置、予防、および／または診断し得る。
【０６１６】 ニュートロカイン−α誘導Ｂ細胞活性化に関連しているＥＲＫ１、ＣＯＸ２お
よびサイクリンＤ２を含むシグナル伝達経路のインヒビター。
【０６１７】 上記に列挙した適用は、広範な種々の宿主における使用を有する。このような
宿主としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、ネズミ、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、
ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ
、非ヒト霊長類、およびヒト。特定の実施形態においては、宿主は、マウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ
またはネコである。好ましい実施形態においては、宿主は哺乳動物である。最も
好ましい実施形態においては、宿主はヒトである。
【０６１８】 アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、
本明細書中で記載されるような）と共に、組成物中で使用され得る。
【０６１９】 アンタゴニストは、例えば、ニュートロカイン−α媒介走化作用および／また
はニュートロカイン−αＳＶ媒介走化作用を阻害するため、ならびにマクロファ
ージおよびそれらの前駆体の活性化、ならびに好中球、好塩基球、Ｂリンパ球、
および特定の自己免疫および慢性炎症および感染症におけるいくつかのＴ細胞サ
ブセット（例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞ならびにナチュラルキ
ラー細胞）の活性化を阻害するために利用され得る。自己免疫疾患の例としては
、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニスト
はまた、単球食細胞の補充および活性化を妨げることによって、感染症（ケイ肺
症、類肉腫症、特発性肺線維症を含む）を処置、予防、および／または診断する
ために使用され得る。これらはまた、好酸球産生および好酸球移動を妨げること
によって、特発性好酸球過剰症候群を処置、予防、および／または診断するため
に使用され得る。内毒素ショックもまた、マクロファージの移動ならびにそれら
の本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶポリペプチドの産生を妨げることにより、このアンタゴニストによって
処置され得る。このアンタゴニストはまた、動脈壁への単球の浸潤を妨げること
によって、アテローム性動脈硬化症を処置するために使用され得る。このアンタ
ゴニストはまた、ケモカイン誘導マスト細胞および好塩基性脱顆粒およびヒスタ
ミン放出を阻害することによって、ヒスタミン媒介性アレルギー反応および免疫
学的障害（後期アレルギー反応、慢性じんま疹、およびアトピー性皮膚炎を含む
）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。ＩｇＥ媒介性ア
レルギー反応（例えば、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、およびアレルギ
ー性湿疹）もまた処置され得る。このアンタゴニストはまた、単球の創傷部位へ
の誘引を妨げることによって、慢性炎症および急性炎症を処置、予防、および／
または診断するために使用され得る。これらはまた、正常な肺マクロファージ集
団を調節するために使用され得る。なぜなら、慢性炎症性肺疾患および急性炎症
性肺疾患は、肺における単球食細胞の壊死巣分離に関連するからである。アンタ
ゴニストはまた、患者の関節における滑液への単球の誘引を妨げることによって
、慢性関節リウマチを処置、予防、および／または診断するために使用され得る
。単球の流入および活性化は、変性関節症および炎症性関節症の両方の病原にお
いて、重要な役割を果たす。このアンタゴニストは、主にＩＬ−１およびＴＮＦ
に起因する有害なカスケードを妨害するために使用され得、これは、他の炎症性
サイトカインの生合成を妨げる。このように、このアンタゴニストは、炎症を予
防するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、ニュートロカイン−α
および／またはニュートロカイン−αＳＶによって誘導される、プロスタグラン
ジン非依存性の発熱を阻害するために使用され得る。このアンタゴニストはまた
、骨髄不全の症状（例えば、再生不良性貧血および脊髄形成異常症候群）を処置
、予防、および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはま
た、肺における好酸球蓄積を妨げることによって、喘息およびアレルギーを処置
、予防、および／または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはま
た、喘息の肺の顕著な特徴である、上皮下基底膜線維症を処置、予防、および／
または診断するために使用され得る。このアンタゴニストはまた、リンパ腫（例
えば、本明細書中に提供されたリンパ腫の広範な（しかし、限定されない）リス
トのうちの１つ以上）を処置、予防、および／または診断するために使用され得
る。
【０６２０】 上記の適用のすべては、獣医学に適用され得る。さらに、本明細書中に記載さ
れたすべての適用はまた、獣医学に適用され得る。
【０６２１】 本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、な
らびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用して
、哺乳動物（好ましくは、ヒト）における種々の免疫系関連障害および／または
これらの障害に関連する状態を、処置、予防、および／または診断し得る。多く
の自己免疫障害は、免疫細胞による、自己を外来物質とみなす不適切な認識によ
って生じる。この不適切な認識は、宿主細胞の破壊を引き起こす免疫応答を生じ
る。従って、免疫応答（特に、Ｂ細胞の増殖および／または免疫グロブリンの産
生）を阻害し得る本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポ
リペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニ
ストの投与は、自己免疫障害の処置および／または予防における効果的な治療で
あり得る。従って、好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−
αアンタゴニストおよび／またはニュートロカイン−αＳＶアンタゴニスト（例
えば、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶのポリペ
プチドフラグメントならびに抗ニュートロカイン−α抗体）を使用して、自己免
疫障害を治療、予防、および／または診断し得る。
【０６２２】 本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／ま
たはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）を用いて処置、予
防、および／または診断され得る、自己免疫障害およびこれらの障害に関連する
状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：自己免疫性溶血性
貧血、自己免疫性新生児血小板減少、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血
球減少症、溶血性貧血、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心
筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＡ腎
症）、多発性硬化症、神経炎、ブドウ膜炎性眼炎、多発性内分泌腺症、紫斑病（
例えば、ヘンノッホ−シェーンライン紫斑病）、ライター病、スティッフマン症
候群、自己免疫性肺炎、ギャン−バレー症候群、インスリン依存性糖尿病、およ
び自己免疫性炎症性眼病。
【０６２３】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらは非常にあり得る）としては、以下が挙げられるが、こ
れらに限定されない：自己免疫性甲状腺炎、甲状腺機能低下症（すなわち、橋本
甲状腺炎）（例えば、細胞媒介性および体液性甲状腺細胞障害性によってしばし
ば特徴付けられる）、全身性エリテマトーデス（例えば、循環および局所的に産
生される免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、グッドパスチャー症候
群（例えば、抗基底膜抗体によってしばしば特徴付けられる）、天疱瘡（例えば
、表皮棘融解抗体によってしばしば特徴付けられる）、レセプター自己免疫（例
えば、（ａ）グレーブス病（例えば、ＴＳＨレセプター抗体によってしばしば特
徴付けられる）、（ｂ）重症筋無力症（例えば、アセチルコリンレセプター抗体
によってしばしば特徴付けられる）、および（ｃ）インスリン抵抗性（例えば、
インスリンレセプター抗体によってしばしば特徴付けられる））、自己免疫性溶
血性貧血（例えば、抗体感受性ＲＢＣの食作用によってしばしば特徴付けられる
）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（例えば、抗体感受性血小板の食作用によっ
てしばしば特徴付けられる）。
【０６２４】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性関節リウマチ（例えば、関節における免疫複合体によってし
ばしば特徴付けられる）、抗コラーゲン抗体を伴う強皮症（ｓｃｈｌｅｒｏｄｅ
ｒｍａ）（例えば、核小体抗体および他の核抗体によってしばしば特徴付けられ
る）、混合結合組織病（例えば、可溶性核抗原（例えば、リボ核タンパク質）に
対する抗体によってしばしば特徴付けられる）、多発性筋症／皮膚筋炎（例えば
、非ヒストンＡＮＡによってしばしば特徴付けられる）、悪性貧血（例えば、抗
壁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体によってしばしば特徴付けられる）、
特発性アジソン病（例えば、体液および細胞媒介性副腎細胞傷害性によってしば
しば特徴付けられる）、不妊症（例えば、抗精子抗体によってしばしば特徴付け
られる）、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎およびＩｇＡ腎症）（例えば
、糸球体基底膜抗体または免疫複合体によってしばしば特徴付けられる）、水疱
性類天疱瘡（例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体によってしばしば特徴付けら
れる）、シェーグレン症候群（例えば、多重組織抗体、および／または特定の非
ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）によってしばしば特徴付けられる）、糖尿病（例え
ば、細胞媒介性および体液性島細胞抗体によってしばしば特徴付けられる）、な
らびにアドレナリン作動性薬剤抵抗性（喘息または嚢胞性線維症を伴うアドレナ
リン作動性薬剤抵抗性を含む）（例えば、βアドレナリンレセプター抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）。
【０６２５】 本発明の組成物を用いて処置、予防、および／または診断され得る、さらなる
自己免疫性障害（これらはあり得る）としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：慢性活性肝炎（例えば、平滑筋抗体によってしばしば特徴付けら
れる）、原発性胆汁性肝硬変（例えば、ミトコンドリア抗体によってしばしば特
徴付けられる）、他の内分泌腺不全（例えば、いくつかの場合は、特定の組織抗
体によってしばしば特徴付けられる）、白斑（例えば、メラノサイト抗体によっ
てしばしば特徴付けられる）、脈管炎（例えば、脈管壁におけるＩｇおよび補体
ならびに／または低血清補体によってしばしば特徴付けられる）、ＭＩ後（例え
ば、心筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、心臓切開症候群（例えば、心
筋抗体によってしばしば特徴付けられる）、じんま疹（例えば、ＩｇＥに対する
ＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特徴付けられる）、アトピー性皮
膚炎（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体によってしばしば特
徴付けられる）、喘息（例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体に
よってしばしば特徴付けられる）、炎症性筋障害、ならびに多くの他の炎症性障
害、肉芽種性障害、変性障害、および萎縮性障害。
【０６２６】 好ましい実施形態においては、自己免疫性疾患および障害ならびに／または上
記に列挙された疾患および障害に関連する状態は、抗ニュートロカイン−α抗体
および／または抗ニュートロカイン−αＳＶを用いて、処置、予防、および／ま
たは診断される。
【０６２７】 特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／も
しくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴ
ニストを用いて、慢性関節リウマチが処置、予防、および／または診断される。
【０６２８】 特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／も
しくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴ
ニストを用いて、ループスが処置、予防、および／または診断される。
【０６２９】 特定の好ましい実施形態においては、抗ニュートロカイン−α抗体および／も
しくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体ならびに／または他の本発明のアンタゴ
ニストを用いて、ループスに関連する腎炎が処置、予防、および／または診断さ
れる。
【０６３０】 特定の好ましい実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュー
トロカイン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用
して、全身性エリテマトーデスおよび／またはそれに関連する疾患、障害もしく
は状態を処置または予防する。本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチド、あるいはアンタゴニストを用いて処置または予防され
得るループスに関連する疾患、障害または状態としては、以下が挙げられるが、
これらに限定されない：血液学的障害（例えば、溶血性貧血、白血球減少症、リ
ンパ球減少症、および血小板減少症）、免疫学的障害（例えば、抗ＤＮＡ抗体、
および抗Ｓｍ抗体）、発疹、羞明、口内炎、関節炎、発熱、疲労、体重減少、漿
膜炎（例えば、胸膜炎）、腎障害（例えば、腎炎）、神経学的障害（例えば、発
作、末梢神経障害、ＣＮＳ関連障害）、胃腸障害、レーノー現象、および心膜炎
。好ましい実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしく
はポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもし
くはポリペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカ
イン−α抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用して、
全身性エリテマトーデスに関連する腎臓障害を処置または予防する。最も好まし
い実施形態においては、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、あるいはそれらのアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α
抗体および／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体）を使用して、全身性エ
リテマトーデスに関連する腎炎を処置または予防する。
【０６３１】 同様に、アレルギー反応および状態（例えば、喘息（特にアレルギー性喘息）
または他の呼吸性の問題）もまた、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／
またはアンタゴニストによって処置され得る。さらに、これらの分子を使用して
、アナフィラキシー、抗原性分子に対する過敏症、または血液型不適合を処置、
予防、および／または診断し得る。
【０６３２】 本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、な
らびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストをまた使用
して、器官拒絶または対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）および／またはそれに関連
する状態を処置、予防、および／または診断し得る。器官拒絶は、免疫応答を通
した移植された組織の宿主免疫細胞破壊によって起こる。同様に、免疫応答もま
た、ＧＶＨＤに関与するが、この場合、外来性の移植された免疫細胞は、宿主組
織を破壊する。本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペ
プチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリ
ペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニス
トの投与（これは、免疫応答（特にＴ細胞の増殖、分化、または走化性）を阻害
する）は、器官拒絶またはＧＶＨＤの予防における効果的な治療であり得る。
【０６３３】 同様に、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチ
ドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプ
チド、ならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを
また使用して、炎症を調節し得る。例えば、本発明のニュートロカイン−αポリ
ヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポ
リヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれらのアゴニスト
および／またはアンタゴニストは、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分化
を阻害し得る。これらの分子を使用して、炎症状態（慢性状態および急性状態の
両方）を処置、予防、および／または診断し得、これらの炎症状態としては以下
が挙げられる：慢性前立腺炎、肉芽種性前立腺炎およびマラコプラキア、感染に
関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症性応答症
候群（ＳＩＲＳ））、虚血再灌流障害、エンドトキシン致死性、関節炎、補体媒
介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸
疾患、クローン病、またはサイトカインの過剰産生の結果（例えば、ＴＮＦまた
はＩＬ−１）。
【０６３４】 特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および／も
しくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、炎症を処置、予防、調節、
検出、および／または診断する。
【０６３５】 特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および／も
しくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、炎症性障害を処置、予防、
調節、検出、および／または診断する。
【０６３６】 別の特定の実施形態においては、本発明の抗ニュートロカイン−α抗体および
／もしくは抗ニュートロカイン−αＳＶ抗体を使用して、アレルギーおよび／ま
たは過敏症を処置、予防、調節、検出、および／または診断する。
【０６３７】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶに対する抗体
を、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶに結合し、
そしてその活性を阻害するために使用して、損傷後の肺への好中球の侵入を妨げ
ることによって、ＡＲＤＳを処置、予防、および／または診断し得る。本発明の
アゴニストおよびアンタゴニストは、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、本
明細書中以下に記載されるような）との組成物中で使用され得る。
【０６３８】 本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶおよ
び／またはニュートロカイン−αレセプターポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを使用
して、肺系（例えば、気管支）の疾患および障害（例えば、洞肺および気管支の
感染）、ならびにこのような疾患および障害ならびに他の呼吸器疾患および障害
に関連する状態を処置、予防、および／または診断する。特定の実施形態におい
ては、このような疾患および障害としては、以下が挙げられるが、これらに限定
されない：気管支腺腫、気管支喘息、肺炎（例えば、気管支の肺炎、気管支肺炎
、および結核性気管支肺炎）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気管支ポリープ
、気管支拡張症（例えば、乾性気管支拡張症、円柱状気管支拡張症、および嚢胞
状気管支拡張症）、細気管支腺癌、細気管支癌、細気管支炎（例えば、滲出性細
気管支炎、閉塞性線維性細気管支炎、および増殖性細気管支炎）、細気管支癌、
気管支炎性喘息、気管支炎（例えば、喘息性気管支炎、カステラーニ気管支炎、
慢性気管支炎、クループ性気管支炎、線維素性気管支炎、出血性気管支炎、鳥類
の伝染性気管支炎、閉塞性気管支炎、形成性気管支炎、偽膜性気管支炎、腐敗性
気管支炎、および寄生虫性気管支炎）、気管支中心性肉芽腫症、気管支浮腫、気
管食道瘻、気管支原生癌、気管支性嚢胞、気管支結石症、気管支軟化症、気管支
真菌症（例えば、気管支肺アスペルギルス症）、気管支肺スピロヘータ症、出血
性気管支炎、気管支漏、気管支痙攣、気管支出血、気管支狭窄、ビオー呼吸、気
管支呼吸、クスマウル呼吸、クスマウル−キーン呼吸、呼吸性アシドーシス、呼
吸性アルカローシス、新生児呼吸窮迫症候群、呼吸不全、上気道硬化症、ＲＳウ
イルス、など。
【０６３９】 特定の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／または
アンタゴニストを使用して、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を処置、予防、およ
び／または診断する。
【０６４０】 別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドも
しくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストおよび／またはア
ンタゴニストを使用して、線維症および線維症に関連する状態（例えば、嚢胞性
線維症（膵臓の嚢胞性線維症、クラーク−ハッドフィールド症候群、膵線維嚢胞
症、ムコビシドーシス、および粘液過剰症のような線維症を含む）、心内膜心筋
線維症、特発性腹膜後線維症、軟膜線維症、縦隔線維症、結節性表皮下線維組織
増殖症、中心静脈周囲線維化、筋周囲線維化、パイプ軸線維症、置換性線維形成
、外膜下線維症、シンマーズ陶製パイプ柄状線維症があるが、これらに限定され
ない）を、処置、予防、および／または診断する。
【０６４１】 ＴＮＦファミリーのリガンドは、多数の細胞応答（細胞傷害性、抗ウイルス活
性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む）を含む、大部分
の多面的なサイトカインの間にあることが知られている（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅ
ｌら、「Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒｓ：Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｓｙｍ
ｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：５９７−６０９（１９８６）、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ；Ｂ．Ｂｅｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｃｅｒａｍｉ、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：５０５−５１８（１９８８）；Ｌ．
Ｊ．Ｏｌｄ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２５８：５９−７５（１９８８）；Ｗ．Ｆｉｅｒｓ
、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２８５：１９９−２２４（１９９１））。ＴＮＦファミ
リーのリガンド（本発明のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイ
ン−αＳＶを含む）は、ＴＮＦファミリーのレセプターに結合することによって
、このような種々の細胞応答を誘導する。ニュートロカイン−αポリペプチドお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、強力な細胞応答（細胞
、細胞株、組織、組織培養物または患者に対する、任意の遺伝子型の変化、表現
型の変化、および／または形態的変化を含む）を誘発すると考えられている。示
されるように、このような細胞応答は、ＴＮＦファミリーのリガンドに対する正
常な生理学的応答だけでなく、増加したアポトーシスまたはアポトーシスの阻害
に関連する疾患をも含む。アポトーシスをプログラムされた細胞死は、免疫系の
末梢Ｂリンパ球および／または末梢Ｔリンパ球の欠失に関与する生理学的メカニ
ズムであり、その調節不全は、多くの異なる病原性のプロセスを導き得る（Ｊ．
Ｃ．Ａｍｅｉｓｅｎ、ＡＩＤＳ ８：１１９７−１２１３（１９９４）；Ｐ．Ｈ
．Ｋｒａｍｍｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７９−２８
９（１９９４））。
【０６４２】 本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、な
らびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを用いて、診断、処置、または
予防され得る、増加した細胞生存またはアポトーシスの阻害に関連する疾患とし
ては、以下が挙げられる：癌（例えば、濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌、
およびホルモン依存性腫瘍（大腸癌、心臓腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫
、神経膠芽細胞腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽細胞腫、粘液腫、筋腫、
リンパ腫、内皮腫、骨芽細胞腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺腫、乳癌、
前立腺癌、カポジ肉腫および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない））
；自己免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデスおよび免疫関連糸球体腎炎性
慢性関節リウマチ）；ウイルス感染（例えば、ヘルペスウイルス、ポックスウイ
ルスおよびアデノウイルス）；炎症；対宿主性移植片病；急性移植片拒絶および
慢性移植片拒絶。従って、好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカ
イン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイ
ン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、ならびに／あるいはそれら
のアゴニストまたはアンタゴニストは、自己免疫疾患を処置、予防、および／ま
たは診断するため、ならびに／あるいは癌の増殖、進行、および／または転移を
阻害するために使用され、このような癌としては以下が挙げられるが、これらに
限定されない：本明細書中に記載された癌（例えば、リンパ球性白血病（例えば
、ＭＬＬおよび慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）および濾胞性リンパ腫
）。別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチド
もしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチ
ドもしくはポリペプチドを使用して、癌細胞または癌組織（例えば、Ｂ細胞系関
連癌（例えば、ＣＬＬおよびＭＬＬ）、リンパ球性白血病、またはリンパ腫）を
活性化、分化または増殖させ、そしてそれによって細胞を、癌治療（例えば、化
学療法または放射線療法）に対してより脆弱にする。
【０６４３】 さらに、他の実施形態において、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレ
オチドもしくはポリペプチドあるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニスト
を使用して、以下のような悪性腫瘍および関連する障害の増殖、進行、および／
または転移を阻害する：白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、
急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、
単球性白血病、および赤白血病を含む））、および慢性白血病（例えば、慢性骨
髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）を含む）、真性赤血球増
加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴ
ァルデンストレームマクロ大グロブリン血症、Ｈ鎖病、および固形腫瘍（肉腫お
よび癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊
索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫
、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、
前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭
状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛
癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺
癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上
衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅ
ｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫。
【０６４４】 本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、な
らびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを用いて診断、処置、または予
防され得る、増加したアポトーシスに関連する疾患としては、以下が挙げられる
：ＡＩＤＳ；神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎
縮性側索硬化症、色素性網膜炎、小脳変性）；脊髄形成異常性症候群（例えば、
再生不良性貧血）、虚血性障害（例えば、心筋梗塞、発作および再灌流障害によ
って引き起こされる障害）、毒素誘導性肝疾患（例えば、アルコールによって引
き起こされる障害）、敗血症性ショック、悪液質および食欲不振。従って、好ま
しい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリヌクレオチドもし
くはポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドも
しくはポリペプチドならびに／あるいはそれらのアゴニストまたはアンタゴニス
トを使用して、上記に列挙される疾患および障害を処置、予防、および／または
診断する。
【０６４５】 好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドお
よび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびに／またはそれら
のアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）
は、用量依存性様式でヒト細網肉腫 Ｕ−９３７細胞の増殖を阻害する。さらな
る好ましい実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドお
よび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドならびに／またはそれら
のアゴニストもしくはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗体）
は、ＰＣ−３細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、およびＡ
２９３細胞の増殖を阻害する。非常に好ましい実施形態においては、本発明のニ
ュートロカイン−αポリペプチドおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶポ
リペプチドならびに／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト（例え
ば、抗ニュートロカイン−α抗体）を使用して、前立腺癌、大腸癌、頸部癌、お
よび乳癌の増殖、進行、および／または転移を阻害する。
【０６４６】 従って、さらなる好ましい実施形態においては、本発明は、ＴＮＦファミリー
のリガンドによって誘導されるアポトーシスを増強させるための方法に関し、こ
の方法は、ニュートロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶレセプターを発現する細胞に、ニュートロカイン−αおよび／またはニュ
ートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達を増加または減少させ得るに有効な量の
、ニュートロカイン−αおよび／もしくはニュートロカイン−αＳＶ、またはそ
れらのアゴニストもしくはアンタゴニストを投与する工程を包含する。好ましく
は、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナ
ル伝達は、減少したアポトーシスまたは減少したサイトカインおよび接着分子発
現が提示される疾患を、処置、予防、および／または診断するために増加または
減少される。アゴニストまたはアンタゴニストは、可溶形態のニュートロカイン
−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ、ならびにニュートロカイン−α
ポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドを指向する
モノクロナール抗体を含み得る。
【０６４７】 さらなる局面においては、本発明は、ＴＮＦ−ファミリーのリガンドによって
誘導されるアポトーシスを阻害するための方法に関し、この方法は、ニュートロ
カイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達を増加ま
たは減少させ得るに有効な量の、アゴニストまたはアンタゴニストを、ニュート
ロカイン−αレセプターおよび／またはニュートロカイン−αＳＶレセプターを
発現する細胞に投与する工程を包含する。好ましくは、ニュートロカイン−αお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶ媒介シグナル伝達は、増加したアポトー
シスまたはＮＦ−κＢ発現が提示される疾患を、処置、予防、および／または診
断するために増加または減少される。アゴニストまたはアンタゴニストは、可溶
形態のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ、ならび
にニュートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
ポリペプチドを指向するモノクロナール抗体を含み得る。
【０６４８】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶは、ＴＮＦス
ーパーファミリーに属するので、このポリペプチドもまた、新脈管形成を調節す
るはずである。さらに、ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン
−αＳＶは、免疫細胞の機能を阻害するので、このポリペプチドは、広範囲の抗
炎症活性を有する。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶを抗新生血管形成剤として使用して、宿主防御細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ
細胞およびマクロファージ）の侵入および活性化を刺激することによって、そし
て腫瘍の新脈管形成を阻害することによって、固形腫瘍を処置、予防、および／
または診断し得る。当業者は、血管増殖が望ましくない、癌以外の他の適応症を
認識する。これらはまた、抵抗性の慢性感染および急性感染（例えば、殺菌性白
血球の誘引および活性化を介する筋細菌性感染）に対する宿主防御を増強するた
めに使用され得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶはまた、Ｔ細胞媒介性の自己免疫性疾患およびリンパ球性白血病（例えば、
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を含む）の処置のために、ＩＬ−２生合成の阻
害によってＴ細胞増殖を阻害するために使用され得る。ニュートロカイン−αお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、壊死組織片クリーニングおよび
結合組織促進炎症細胞の両方の補充によって、創傷治癒を刺激するために使用さ
れ得る。この同様の様式において、ニュートロカイン−αおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶはまた、他の線維症障害（肝硬変、変形性関節症および肺線
維症を含む）を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。ニュ
ートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはまた、組織に侵入
する寄生虫の幼生（住血吸虫症、旋毛虫症および回虫症におけるように）を殺す
独特の機能を有する好酸球の存在を増加させる。これらをまた使用して、例えば
、化学療法の後に骨髄から成熟白血球を放出する（すなわち、幹細胞流動）ため
に、種々の造血前駆細胞の活性化および分化を調節することによって、造血を調
節し得る。ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶはま
た、敗血症を処置、予防、および／または診断するために使用され得る。
【０６４９】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
れらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、広範囲の疾患および／ま
たは状態の診断および処置または予防において有用である。このような疾患およ
び状態としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌（例えば、免
疫細胞間連癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ｐ５３の変異または
変化に関連する癌、脳腫瘍、膀胱癌、子宮頸部癌、大腸癌、結腸直腸癌、肺の非
小細胞癌、肺の小細胞癌、胃癌など）、リンパ増殖性障害（例えば、リンパ節症
）、微生物（例えば、ウイルス、細菌など）感染（例えば、ＨＩＶ−１感染、Ｈ
ＩＶ−２感染、ヘルペスウイルス感染（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、ＣＭＶ、ＶＺ
Ｖ、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ＥＢＶを含むが、これらに限定されない）、アデ
ノウイルス感染、ポックスウイルス感染、ヒトパピローマウイルス感染、肝炎ウ
イルス（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶなど）、ヘリコバクターピロリ感染、
侵襲性ブドウ球菌感染など）、寄生生物感染、腎炎、骨疾患（例えば、骨粗鬆症
）、アテローム性動脈硬化症、疼痛、心臓血管障害（例えば、新生血管形成、低
脈管形成または減少した循環（例えば、虚血性疾患（例えば、心筋梗塞、発作な
ど））、ＡＩＤＳ、アレルギー、炎症、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー
病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜症、小脳変性など）、移
植片拒絶（急性および慢性）、対宿主性移植片病、骨髄形成異常による疾患（例
えば、再生不良性貧血など）、リウマチにおける関節組織破壊、肝疾患（例えば
、急性肝炎および慢性肝炎、肝傷害ならびに肝硬変）、自己免疫疾患（例えば、
多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、免疫複合体性糸球
体腎炎、自己免疫性糖尿病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グレーヴス病、橋
本甲状腺炎など）、心筋症（例えば、拡張型心筋症）、糖尿病、糖尿病合併症（
例えば、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害、糖尿病性網膜症）、インフルエンザ
、喘息、乾癬、糸球体腎炎、敗血症性ショック、ならびに潰瘍性大腸炎。
【０６５０】 本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそ
れらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、新脈管形成の促進、創傷
治癒（例えば、傷、火傷、および骨折）において有用である。本発明のポリヌク
レオチドおよび／もしくはポリペプチドならびに／またはそれらのアゴニストお
よび／もしくはアンタゴニストはまた、特定の抗原、抗ウイルス性免疫応答に対
する免疫応答性を増強するためのアジュバントとして有用である。
【０６５１】 より一般的には、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドな
らびに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、免疫応
答の調節（すなわち、増強および減少）において有用である。例えば、本発明の
ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドは、手術、外傷、放射線療法、化
学療法、および移植の準備または手術、外傷、放射線療法、化学療法、および移
植からの回復において有用であり得るか、あるいは高齢者および免疫無防備状態
の個体における免疫応答および／または免疫回復をブーストするために使用され
得る。あるいは、本発明のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドなら
びに／またはそれらのアゴニストおよび／もしくはアンタゴニストは、例えば、
自己免疫性障害の処置または予防における、免疫抑制剤として有用である。特定
の実施形態においては、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
は、慢性炎症、アレルギーまたは自己免疫状態（例えば、本明細書中に記載され
るか、そうでなければ、当該分野において公知の自己免疫状態）を処置または予
防するために使用され得る。
【０６５２】 好ましくは、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドもしくはポリペプチドお
よび／またはニュートロカイン−αＳＶポリヌクレオチドもしくはポリペプチド
、ならびに／あるいはニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶのアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、抗ニュートロカイン−α抗
体）を用いる処置は、有効量の本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよ
び／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド、あるいはそれらのアゴニス
トまたはアンタゴニストを、患者に投与することによるか、あるいは患者から細
胞を取り除き、ニュートロカイン−αポリヌクレオチドおよび／またはニュート
ロカイン−αＳＶポリヌクレオチドをその細胞に供給し、そして操作した細胞を
患者に戻す（エキソビボ治療）ことによるかのいずれかであり得る。さらに、本
明細書中でさらに考察されるように、ニュートロカイン−αポリペプチドもしく
はポリヌクレオチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドもし
くはポリヌクレオチドは、感染性疾患に対する免疫応答を生じるためのワクチン
におけるアジュバントとして使用され得る。
【０６５３】 （処方および投与） ニュートロカイン−αポリペプチド組成物および／またはニュートロカイン−
αＳＶポリペプチド組成物（好ましくは、ニュートロカイン−αおよび／または
ニュートロカイン−αＳＶ細胞外ドメインの可溶形態であるポリペプチドを含有
する）は、良好な医療行為に合った様式で、個体患者の臨床的状態（特に、ニュ
ートロカイン−αポリペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペ
プチドを単独で用いる処置の副作用）、ニュートロカイン−αポリペプチド組成
物および／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチド組成物の送達部位、投
与方法、投与スケジュール、ならびに医師が公知の他の要因を考慮して、処方お
よび服用される。従って、本明細書中の目的のための、ニュートロカイン−αポ
リペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの「有効量」
は、このような要件によって決定される。
【０６５４】 一般的な提案として、非経口的に投与されるニュートロカイン−αポリペプチ
ドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの、用量当たりの総薬
学的有効量は、約１マイクログラム／ｋｇ患者体重／日〜１０ｍｇ／ｋｇ患者体
重／日の範囲内であるが、上記のように、これは治療的裁量に供される。より好
ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ患者体重／日であり、そ
してヒトについて最も好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と１ｍｇ／ｋｇ／
日との間である。
【０６５５】 別の実施形態においては、本発明のニュートロカイン−αポリペプチドおよび
／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドは、０．０００１ｍｇ／ｋｇ／
日と０．０４５ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量で、好ましくは、０．００４５ｍｇ
／ｋｇ／日と０．０４５ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量で、ヒトに投与され、そし
てより好ましくは、ヒトにおいて約４５マイクログラム／ｋｇ／日の用量；マウ
スにおいて約３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で投与される。
【０６５６】 継続的に与えられた場合、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶポリペプチドは、代表的に、約１マイクログラム／ｋｇ／
時間から約５０μｇ／ｋｇ／時間の用量速度で、１日あたり１回から４回の注射
によってか、または継続的な皮下注入（例えば、ミニポンプを用いて）によって
のいずれかで、投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用され得る。
【０６５７】 変化を観察するのに必要とされる処置の長さおよび応答が生じる処置後の間隔
は、所望の効果に依存して変更するようである。
【０６５８】 特定の実施形態において、用量あたりの非経口的に投与される総薬学的有効量
のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチドは、患者の体重の約０．１μｇ／ｋｇ／日〜４５μｇ／ｋｇ／日の範囲
であるが、上記のように、これは、治療上の自由裁量に従う。より好ましくは、
この用量は、少なくとも０．１μｇ／ｋｇ／日、および最も好ましくは、ヒトに
対して、このタンパク質について約０．０１と５０μｇ／ｋｇ／日の間である。
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶは、継続的な注入、
１日あたり複数の慎重な（ｄｉｃｒｅｅｔ）注射（例えば、毎日３回以上、また
は毎日２回）、１日あたり１回の注射として、または断続的に与えられる慎重な
注射（例えば、毎日２回、毎日１回、１日おきに、毎週２回、毎週、各週、毎月
、隔月、および年４回）として投与され得る。継続的に与えられる場合、ニュー
トロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド
は、代表的に、約０．００１〜１０μｇ／ｋｇ／時間まで、約５０μｇ／ｋｇ／
時間までの用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によってか、または継続的な
皮下の注入（例えば、ミニポンプを使用して）によってのいずれかで投与される
。
【０６５９】 投与される本発明の組成物の有効な投与量は、生物学的半減期、バイオアベイ
ラビリティー、および毒性のようなこのようなパラメータを提出する、当業者に
周知の手順を介して、決定され得る。このような決定は、特に本明細書中に提供
される詳細な開示を考慮して、当業者の能力の範囲内で十分である。
【０６６０】 治療の間のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
αＳＶポリペプチドに対する生物体の生体暴露はまた、治療的有効量養成法およ
び／または薬学的有効量養成法を決定することにおいて重要な役割を果たす。相
対的に長期間での、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロ
カインαＳＶポリペプチドの相対的少用量の反復投与のような種々の用量は、相
対的に短期間でニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶポリペプチドの相対的高用量の反復投与を用いて達成された用量と、治
療的および／または薬学的に識別可能な効果を有し得る。例えば、実施例６に示
される血清免疫グロブリンレベル実験を参照のこと。
【０６６１】 Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ
ｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５０（４）：２１９−４４（１９６６））によって供給さ
れる等表面投薬転換係数（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ
ｄｏｓａｇｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）を使用して、当業者は、
所与の実験系におけるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュート
ロカインαＳＶポリペプチドの使用により得られるデータを、別の実験系におい
て１用量あたり投与されるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶポリペプチドの正確な推定値の薬学的有効量に転換し得る。
マウス中へのニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
αＳＶポリペプチドの投与を介して得られた実験データ（例えば、実施例６を参
照のこと）は、ラット、サル、イヌ、およびヒトにおけるニュートロカインαポ
リペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドの薬学的有効量
を正確な見積るために、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらによって供給される転換係数を介
して転換され得る。以下の転換表（表ＩＩＩ）はＦｒｅｉｒｅｉｃｈらにより提
供されたデータの概要である。表ＩＩＩは、ある種の、ｍｇ／ｋｇにより表現さ
れる用量を、表にした別の種において、ｍｇ／ｋｇとして表現される等表面積用
量へ転換するためにおよその係数を所与する。
【０６６２】
【表３】 従って、例えば、表ＩＩＩに示される転換係数を用いて、マウスにおける５０
ｍｇ／ｋｇの用量は、（５０ｍｇ／ｋｇ）×（１／４）＝１２．５ｍｇ／ｋｇに
より、サルにおいて適切な用量の１２．５ｍｇ／ｋｇへ転換する。さらなる実施
例のように、マウスにおける０．０２、０．０８、０．８、２および８ｍｇ／ｋ
ｇの用量は、ヒトにおいて、それぞれ１．６６７μｇ／ｋｇ、６．６７μｇ／ｋ
ｇ、６６．７μｇ／ｋｇ、１６６．７μｇ／ｋｇおよび０．６６７ｍｇ／ｋｇの
有効量に等しい。
【０６６３】 本発明のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインα
ＳＶポリペプチドを含む薬学的組成物を、経口的、直腸内、非経口的、皮下、槽
内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、
点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレー
（例えば、蒸気または粉剤の吸入を介して）として投与し得る。「薬学的に受容
可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被
包材または任意の型の製剤補助剤を意味する。１つの実施形態において、「薬学
的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希
釈剤、被包材または任意の型の製剤補助剤を意味する。特定の実施形態において
、「薬学的に受容可能」とは、合衆国もしくは州政府の管理機関により認可され
ている、または米国薬局方においてもしくは動物、およびさらに好適にはヒトに
おいて使用するために一般的に認識されている他の薬局方において収載されてい
ることを意味する。本実施形態に従う適切な薬学的キャリアの非限定な例は、Ｅ
．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」により提供され、そして水および油のような、石油
、動物、野菜、または合成起源（例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ごま
油など）を含む、無菌（ｓｔｅｒｉｌｅ）液を含む。薬学的組成物を静脈内に投
与する場合、水が好ましいキャリアである。生理食塩水および水溶性ブドウ糖な
らびにグリセロール溶液を、液体キャリアとして、特に注入溶液のために使用し
得る。所望される場合、この組成物はまた、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、また
はｐＨ緩衝剤を含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸
剤、カプセル、粉剤、徐放性処方などの形態を取り得る。
【０６６４】 本明細書中で使用される用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸
骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０６６５】 好ましい実施形態において、本発明のニュートロカインα組成物および／また
はニュートロカインαＳＶ組成物（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗
体、ならびにそれらのアゴニストおよび／アンタゴニストを含む）は、皮下に投
与される。
【０６６６】 別の好ましい実施形態において、本発明のニュートロカインα組成物および／
またはニュートロカインαＳＶ組成物（ポリペプチド、ポリヌクレオチド、およ
び抗体、ならびにそれらのアゴニストおよび／アンタゴニストを含む）は、静脈
に投与される。
【０６６７】 本発明のニュートロカインα組成物および／またはニュートロカインαＳＶ組
成物はまた、徐放性の系により、適切に投与される。徐放性組成物の適切な例と
しては、適切なポリマー材料（例えば、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリ
ックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）のような）、適切な疎水性
材料（例えば、受容可能な油における乳剤として）またはイオン交換樹脂、およ
び控えめに（ｓｐａｒｉｎｇｌｙ）可溶性の誘導体（例えば、控えめに可溶性な
塩のような）が挙げられる。
【０６６８】 徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメー
トのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ，Ｕら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７
−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ．
Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７
７（１９８１）およびＲ．Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１
０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒら、同書）
またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げら
れる。
【０６６９】 徐放性組成物はまた、リポソームに封入された本発明の組成物（一般に、Ｌａ
ｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅ
ａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ、Ｌｏｐｅｚ Ｂｅｒｅ
ｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３１７−
３２７頁および３５３−３６５頁（１９８９）を参照のこと）を包含する。ニュ
ートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチ
ドを含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製される（ＤＥ
３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４（１９８０
）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９
４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許
第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ１０２
，３２４）。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型
であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選
択された比率が、最適なニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチド治療のために調整される。
【０６７０】 別の実施形態において、本発明の徐放性組成物は、当該分野で公知の結晶処方
物を含む。
【０６７１】 さらに別の実施形態において、本発明の徐放性組成物は、ポンプの方法によっ
て送達される。（Ｌａｎｇｅｒ，（前出）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．
Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ
ら，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０６７２】 他の制御された放出システムは、Ｌａｎｇｅｒにより総説において議論される
（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０６７３】 非経口投与のために、１つの実施形態において、一般に、ニュートロカインα
ポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチドは、それを所
望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち用いる投薬量および
濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するキャ
リア）と、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合す
ることにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化剤、および
ポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０６７４】 一般に、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインα
ＳＶポリペプチドを液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方
と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物
を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より
好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビ
ヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液
が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもま
た、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０６７５】 キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適
切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対
して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩
、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のよう
な抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリア
ルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリ
ンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシ
ン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロ
ースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノース、スクロースまたはデキストリン
を含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；
マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対
イオン；クレゾール、フェノール、クロロブタノール、ベンジルアルコールおよ
びパラベンのような保存薬、ならびに／またはポリソルベート、ポロキサマーも
しくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０６７６】 ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチドは、代表的には、約０．００１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、または
約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度
で、約３〜１０、または３〜８、より好ましくは５〜８、もっとも好ましくは６
〜７のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャ
リアまたは安定化剤を使用することにより、ニュートロカインαポリペプチドお
よび／またはニュートロカインαＳＶポリペプチド塩の形成を生じることが理解
される。
【０６７７】 治療的投与に用いられるニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶポリペプチドは無菌状態でなけらばならない。無菌状態は、
滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）を通す濾過により、容易に達成
される。一般に、治療的ニュートロカインαポリペプチド組成物および／または
ニュートロカインαＳＶポリペプチド組成物は、滅菌アクセスポートを有する容
器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまた
はバイアルに配置される。
【０６７８】 ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチドは、通常、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルまた
はバイアルに、水溶液または再構成のための凍結乾燥処方物として貯蔵される。
凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ
）ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチド水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾
燥したニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶ
ポリペプチドを、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０６７９】 あるいは、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカイン
αＳＶポリペプチドは、凍結乾燥形態において、単位用量の容器に貯蔵される。
注入選択は、注射のための滅菌キャリアを用いて再構成される。
【０６８０】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分を充填した一つ以上の
容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品
の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような
容器に必要に応じて付属し得、この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用ま
たは販売に関する政府機関による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチ
ドを他の治療用化合物と組み合わせて使用され得る。
【０６８１】 本発明の組成物を単独でまたは他の補助剤と組み合わせて投与し得る。本発明
の組成物と共に投与され得る補助剤は、ミョウバン、ミョウバンおよびデオキシ
コール酸（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）
、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ、およびＭＰＬを含み得
るが、これに限定されない。特定の実施形態において、本発明の組成物をミョウ
バンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態において、本発明の組成物を
ＱＳ−２１と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るさらな
る補助剤は、モノホスホリル液体免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、Ｑ
Ｓ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、および
Ｖｉｒｏｓｏｍａｌアジュバント技術を含むが、これらに限定されない。本発明
の組成物と共に投与され得るワクチンは、ＭＭＲ（はしか、おたふくかぜ、風疹
）、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエ
ンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄
熱病、日本脳炎、ポリオ、狂犬病、腸チフス、および百日咳に対する防御へ指向
されるワクチン、ならびに／またはＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMを含むがこれら
に限定されない。同時に（例えば、混合剤として）、別々であるが同時もしくは
並行して；または経時的にのいずれかの配合物を投与し得る。これは、組み合わ
せた薬剤を治療混合剤として共に投与する提示、また組み合わせ剤を別々である
が、同時に（例えば、別々の静脈内ラインを個々の同じ静脈ラインへ通すように
）投与する手順を含む。さらに、「組み合わせての」投与は、化合物の１つの別
々の投与または、所与の第１の、続いて第２の薬剤の投与を含む。
【０６８２】 別の特定の実形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TM と組み合わせて使用され、それらと関連する、感染および／または任意の疾患、
障害、および／または状態を処置、予防、および／または診断する。１つの実施
形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み合わされ
て使用され、それらと関連する、任意のグラム陽性細菌感染および／または任意
の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、そして／または診断する。
別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと組み
合わされて使用され、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属および／またはＳｔｒｅｐｔ
ｏｃｏｃｃｕｓ属の１つ以上のメンバーと関連する、感染および／または任意の
疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／または診断する。別
の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡＸ−２３TMと任意に
組み合わされて使用され、Ｂ群連鎖球菌の一つ以上のメンバーと関連する感染お
よび／または任意の疾患、障害、および／または状態を、処置、予防、および／
または診断する。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＰＮＥＵＭＯＶＡ
Ｘ−２３TMと組み合わされて使用され、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅと関連する、感染および／または任意の疾患、障害、および／また
は状態を、処置、予防、および／または診断する。
【０６８３】 本発明の組成物は、単独または他の治療剤（化学療法剤、抗生物質、抗ウイル
ス薬剤、ステロイド系抗炎症剤および非ステロイド系抗炎症剤、従来の免疫治療
剤ならびにサイトカイン）と組み合わせて投与され得る。付随して（例えば、混
合剤として）、別々であるが同時もしくは並行して、；または経時的にのいずれ
かで組み合わせ剤を投与し得る。これは、組み合わせ剤を治療混合剤として共に
投与する提示、およびまた組み合わせ剤を別々であるが、同時に（例えば、別々
の静脈内ラインを個々の同じ静脈ラインへ通すように）投与する手順を含む。さ
らに、「組み合わせの」投与は、化合物の１つの別々の投与または、所与の第１
の、続いて第２の薬剤の投与を含む。
【０６８４】 １つの実施形態において、本発明の組成物を、ＴＮＦファミリーの他のメンバ
ーと組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る、ＴＮＦ、ＴＮ
Ｆ関連またはＴＮＦ様の分子は、以下を含むが、これらに限定されない：可溶形
態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても公知）、
ＬＴ−β（ＬＴ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出される）、ＯＰ
ＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ
３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ
−Ｉ（国際公開第ＷＯ ９７／３３８９９号）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開第ＷＯ
９７／３４９１１号）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１
１８５−１１９０）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ
９８／０７８８０号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、Ｏ
ＰＧおよびニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ
９８／１８９２１号）、ＯＸ４０および神経成長因子（ＮＧＦ）およびＦａｓの
可溶形態、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開
第ＷＯ ９６／３４０９５号）、ＤＲ３（国際公開第ＷＯ ９７／３３９０４号
）、ＤＲ４（国際公開第ＷＯ ９８／３２８５６号）、ＴＲ５（国際公開第ＷＯ
９８／３０６９３号）、ＴＲ６（国際公開第ＷＯ ９８／３０６９４号）、Ｔ
Ｒ７（国際公開第ＷＯ ９８／４１６２９号）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開
第ＷＯ ９８／５６８９２号）、ＴＲ１０（国際公開第ＷＯ ９８／５４２０２
号）、３１２Ｃ２（国際公開第ＷＯ ９８／０６８４２号）、およびＴＲ１２。
【０６８５】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０
Ｌ）、可溶性形態のＣＤ４０Ｌ（例えば、ＡＶＲＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの生物
学的に活性なフラグメント、改変体、もしくは誘導体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例え
ば、アゴニスト抗体、またはアンタゴニスト抗体）、および／または抗ＣＤ４０
抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）と組み合わされて投
与される。
【０６８６】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、抗レトロウイルス剤、ヌクレオ
シド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、および／またはプロテアーゼ
阻害剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るヌ
クレオシド逆転写阻害剤は、ＲＥＴＲＯＶＩＲTM（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩ
ＤＥＸTM（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤTM（ザルシタビン（ｚａｌｃｉｔ
ａｂｉｎｅ／ｄｄＣ）／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴTM（スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉ
ｎｅ）／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲTM（ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）／３
ＴＣ）、およびＣＯＭＢＩＶＩＲTM（ジドブジン／ラミブジン）を含むが、限定
されない。本発明の組成物と組み合わされて投与し得る非ヌクレオシド逆転写阻
害剤は、ＶＩＲＡＭＵＮＥTM（ネビラピン（ｎｅｖｉｒａｐｉｎ））、ＲＥＳＣ
ＲＩＰＴＯＲTM（デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ））、およびＳＵＳＴ
ＩＶＡTM（エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ））を含むが、これらに限定さ
れない。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るタンパク質阻害剤は、ＣＲ
ＩＸＩＶＡＮTM（インジナビル（ｉｎｄｉｎａｖｉｒ））、ＮＯＲＶＩＲTM（リ
トナビル（ｒｉｔｏｎａｖｉｒ））、ＩＮＶＩＲＡＳＥTM（サキナビル（ｓａｑ
ｕｉｎａｖｉｒ）、およびＶＩＲＡＣＥＰＴTM（ネルフィナビル（ｎｅｌｆｉｎ
ａｖｉｒ））を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抗レ
トロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写阻害剤、非ヌクレオシド逆転写阻害剤、お
よび／またはプロテアーゼ阻害剤は、本発明の組成物と任意に組み合わせて、使
用され、ＡＩＤＳを処置、防止、および／もしくは診断し得、ならびに／または
ＨＩＶ感染を処置、防止、および／もしくは診断し得る。
【０６８７】 他の実施形態において、本発明の組成物を抗日和見性感染剤と組み合わせて投
与し得る。本発明の組成物と組み合わせて投与され得る抗日和見性剤は、ＴＲＩ
ＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM 、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥTM、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTM、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM 、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTM 、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、ＡＺＩＴＨＲＯＭ
ＹＣＩＮTM、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、ＣＩＤＯＦＯ
ＶＩＲTM、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＫＥＴＯ
ＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTM、ＰＹ
ＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTM、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTM、ＮＥＵＰＯＧＥＮTM（フ
ィルグラスティム／Ｇ−ＣＳＦ）、およびＬＥＵＫＩＮＥTM（サーグラモスティ
ム（ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ／ＧＭ−ＣＳＦ）を含むが、これらに限定されな
い。特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−
ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥTM、ＤＡＰＳＯＮＥTM、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩ
ＮＥTM、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥTMと任意に組み合わせて使用され
、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ肺炎感染を予防的に処置し、予防
し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物
は、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤTM、ＲＩＦＡＭＰＩＮTM、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥTM 、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬTMと任意に組み合わせて使用され、日和
見性Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ菌複合感染を予防的に処置し、予
防し、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成
物は、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮTM、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、および／また
はＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮTM、と任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｍｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感染を予防的に処置、予防
、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は
、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲTM、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴTM、および／またはＣＩＤＯ
ＦＯＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性サイトメガロウイルス感
染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態にお
いて、本発明の組成物は、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥTM、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬ
ＥTM、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥTMと任意に組み合わせて使用さ
れ、日和見性真菌感染を予防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の
特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲTM、および／
またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性単純
ヘルペスウイルス型Ｉ感染および／または単純ヘルペスウイルス型ＩＩ感染を予
防的に処置、予防、および／または診断し得る。別の特定の実施形態において、
本発明の組成物は、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥTMおよび／またはＬＥＵＣＯＶ
ＯＲＩＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇ
ｏｎｄｉｉ感染を予防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。別の特
定の実施形態において、本発明の組成物は、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮTMおよび／ま
たはＮＥＵＰＯＧＥＮTMと任意に組み合わせて使用され、日和見性細菌感染を予
防的に処置し、予防し、および／または診断し得る。
【０６８８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、抗ウイルス剤と組み合わせて
投与する。本発明の組成物と共に投与され得る抗ウイルス剤は、アシクロビル、
リバビリン、アマンタジン、およびレマンチジン（ｒｅｍａｎｔｉｄｉｎｅ）を
含むが、これらに限定されない。
【０６８９】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を抗生物質剤と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る抗生物質剤は、アモキシリン、アミノ
酸糖体、β−ラクタム（糖ペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、
クロラムフェニコール、セファロスポリン、シプロフロキサシン、エリトロマイ
シン、フルオロキノロン類、マクロライド系抗生物質、メトロニダゾル、ペニシ
リン類、キノロン類、リファンピン、ストレプトマイシン、スルホンアミド、テ
トラサイクリン、トリペトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、
およびバンコマイシンを含むが、これらに限定されない。
【０６９０】 本発明の組成物と組み合わせて投与され得る、従来の非特定の免疫抑制剤は、
ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリンアナログ、シクロホスファミド、
シクロホスファミドＩＶ、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、アザチオプ
リン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスパーグアリン（ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕ
ａｌｉｎ）、およびＴ細胞に応答する機能を抑制することにより作用する他の免
疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。
【０６９１】 特定の実施形態において、本発明の組成物を、免疫抑制薬と組み合わせて投与
する。本発明の組成物と共に投与され得る免疫抑制薬製剤は、ＯＲＴＨＯＣＬＯ
ＮＥTM（ＯＫＴ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥTM／ＮＥＯＲＡＬTM／ＳＡＮＧＤＹ
ＡTM（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦTM（タクロリムス）、ＣＥＬＬＣＥＰ
ＴTM（マイコフェノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ））、アザチオプリン
、グルコルチコステロイド（ｇｌｕｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ）、および
ＲＡＰＡＭＵＮＥTM（シロリマス（ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ））を含むが、これらに
限定されない。特定の実施形態において、免疫抑制剤は、器官または骨髄移植の
拒絶を妨ぐために使用され得る。
【０６９２】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ステロイド治療と組み合わせ
て投与される。本発明の組成物と組み合わせて投与され得るステロイドとしては
、オーラル（ｏｒａｌ）コルチコステロイド、プレドニゾン、およびメチルプレ
ドニゾロン（例えば、ＩＶメチルプレドニゾロン）が挙げられるがこれらに限定
されない。特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレドニゾンと組み合
わせて投与される。さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、プレド
ニゾンおよび免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびプレ
ドニゾンと投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される免疫抑制剤であ
り、アザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロホスファミドＩＶが挙
げられるがこれらに限定されない。別の特定の実施形態において、本発明の組成
物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与される。さらなる特定の実施形
態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロンと組み合わせて投与され
る。さらに特定の実施形態において、本発明の組成物は、メチルプレドニゾロン
および免疫抑制剤と組み合わせて投与される。本発明の組成物およびメチルプレ
ドニゾロンの組成物と共に投与され得る免疫抑制剤は、本明細書中に記載される
免疫抑制剤であり、そしてアザチオプリン、シクロホスファミド、およびシクロ
ホスファミドＩＶが挙げられるがこれらに限定されない。
【０６９３】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬と組み合わせて
投与される。本発明の組成物と共に投与され得る抗マラリア薬としては、ヒドロ
キシクロロキン、および／またはキナクリンが挙げられるがこれらに限定されな
い。
【０６９４】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ＮＳＡＩＤと組み合わせて投
与される。
【０６９５】 非独占的な実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０
、またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：ＮＲＤ−１０１（
Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ）、ジクロフェナク（Ｄｉｍｅ
ｔｈａｉｄ）、オキサプロジンカリウム（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、メカセルミン（
ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ）、Ｔ−６１４（Ｔｏｙａｍａ）、ペメ
トレクスト二ナトリウム（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ ｄｉｓｏｄｉｕｍ）（Ｅｌｉ
Ｌｉｌｌｙ）、オトレルートン（ａｔｒｅｌｅｕｔｏｎ）（Ａｂｂｏｔｔ）ヴ
ァルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、エルテナク（
Ｂｙｋ Ｇｕｌｄｅｎ）、カンパッチ（ｃａｍｐａｔｈ）、ＡＧＭ−１４７０（
Ｔａｋｅｄａ）、ＣＤＰ−５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、ＣＭ−１０１（ＣａｒｂｏＭｅｄ）、ＭＬ−３０００（Ｍｅｒｃｋｌｅ）
、ＣＢ−２４３１（ＫＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｘ）、ＣＢＦ−ＢＳ２（ＫＳ Ｂｉｏ
ｍｅｄｉｘ）、ＩＬ−１Ｒａ遺伝子治療（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）（Ｖａｌ
ｅｎｔｉｓ）、ＪＴＥ−５２２（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、パクリタキセ
ル（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）、ＤＷ−１６６ＨＣ（Ｄｏｎｇ Ｗｈａ）、ダルブフ
ェロンメシレート（ｄａｒｂｕｆｅｌｏｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｗａｒｎｅ
ｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）、可溶性ＴＮＦレセプター１（ｓｙｎｅｒｇｅｎ；Ａｍｇ
ｅｎ）、ＩＰＲ−６００１（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、トロケード（ｔｒｏｃａｄｅ）（Ｈｏｆｆｍ
ａｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＥＦ−５（Ｓｃｏｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ
ｃａｌｓ）、ＢＩＩＬ−２８４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）
、ＢＩＩＦ−１１４９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｌｅｕ
ｋｏＶａｘ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｃｓ）、ＭＫ−６６３（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＴ
−１４８２（Ｓｉｇｍａ−Ｔａｕ）およびブチソコートプロピオネート（ｂｕｔ
ｉｘｏｃｏｒｔ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（ＷａｒｎｅｒＬａｍｂｅｒｔ）。
【０６９６】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１、２、３、４、５、１０、
またはそれ以上の、以下の薬物と組み合わせて投与される：メトトレキセート、
スルファサラジン、金チオリンゴ酸ナトリウム、オーラノフィン、シクロスポリ
ン、ペニシラミン、アザチオプリン、抗マラリア薬（例えば、上記のような）、
シクロホスファミド、クロラムブシル、金、ＥＭＢＲＥＬTM（Ｅｔａｎｅｒｃｅ
ｐｔ）、抗ＴＮＦ抗体、およびプレドニゾロン。
【０６９７】 より好ましい実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬、メトトレ
キセート、抗ＴＮＦ抗体、ＥＭＢＲＥＬTMおよび／またはスルファサラジンと組
み合わせて投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は、メトトレ
キセートと組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は
、抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組
成物は、メトトレキセートおよび抗ＴＮＦ抗体と組み合わせて投与される。別の
実施形態において、本発明の組成物は、スルファサラジンと組み合わせて投与さ
れる。別の特定の実施形態において、本発明の組成物は、メトトレキセート、抗
ＴＮＦ抗体、およびスルファサラジンと組み合わせて投与される。別の実施形態
において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMと組み合わせて投与される。別の
実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTMおよびメトトレキセート
と組み合わせて投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢ
ＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される
。別の実施形態において、本発明の組成物は、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセー
トおよびスルファサラジンと組み合わせて投与される。他の実施形態において、
１つ以上の抗マラリア薬は、上記に列挙された組み合わせ剤の１つと組み合わせ
られる。特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗マラリア薬（例えば、
ヒドロキシクロロキン）、ＥＭＢＲＥＬTM、メトトレキセートおよびスルファサ
ラジンと組み合わせて投与される。別の特定の実施形態において、本発明の組成
物は、抗マラリア薬（例えば、ヒドロキシクロロキン）、スルファサラジン、抗
ＴＮＦ抗体、およびメトトレキセートと組み合わせて投与される。
【０６９８】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは１以上の静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。本発明の組成物と組み合わ
せて投与され得る静脈内免疫グロブリン調製物としては、ＧＡＭＭＡＲTM、ＩＶ
ＥＥＧＡＭTM、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＵＬＩＮTM、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／ＤTM およびＧＡＭＩＭＵＮＥTMが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施
形態において、本発明の治療剤は、移植治療（例えば、骨髄移植）において静脈
内免疫グロブリン調製物と組み合わせて投与される。
【０６９９】 ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４０Ｌの可溶性形態（例えば、ＡＶＲ
ＥＮＤTM）、ＣＤ４０Ｌの、生物学的活性フラグメント、改変体、もしくは誘導
体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト抗体）、
および／または抗ＣＤ４０抗体（例えば、アゴニスト抗体またはアンタゴニスト
抗体） さらなる実施形態において、本発明の組成物は、単独でかまたは抗炎症剤と組
み合わせて投与される。本発明の組成物とともに投与され得る抗炎症剤としては
、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸
誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリ
ールプロピオン酸誘導体、ピラゾール類、ピラゾロン類、サリチル酸誘導体、チ
アジンカルボキサミド類、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオ
ニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎ
ｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾー
ル、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン
、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、
ピフオキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプが挙げられるが、
これらに限定されない。
【０７００】 別の実施形態において、本発明の組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与さ
れる。本発明の治療剤とともに投与され得る化学療法剤としては、抗生物質誘導
体（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、およびダクチ
ノマイシン）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；抗代謝物（例えば
、フルオロウラシル、５−ＦＵ、メトトレキサート、フロクスウリジン、インタ
ーフェロンα−２ｂ、グルタミン酸、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）
、メルカプトプリン、および６−チオグアニン）；細胞傷害剤（例えば、カルム
スチン、ＢＣＮＵ、ロムスチン、ＣＣＮＵ、シトシンアラビノシド、シクロホス
ファミド、エストラムスチン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、マイトマイ
シン、ブスルファン、シス−プラチン、および硫酸ビンクリスチン）；ホルモン
（例えば、メドロキシプロゲステロン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エ
チニルエストラジオール、エストラジオール、酢酸メゲストロール、メチルテス
トステロン、ジエチルスチルベストロールジホスフェート、クロロトリアニセン
、およびテストラクトン）；ナイトロジェンマスタード誘導体（例えば、メファ
レン（ｍｅｐｈａｌｅｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メ
クロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびチオテパ）；ステロイド類お
よび組み合わせ（例えば、ベタメタゾンリン酸ナトリウム）；ならびにその他（
例えば、ジカルバジン（ｄｉｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アスパラギナーゼ、ミトー
テン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、およびエトポシド）が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【０７０１】 特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロフォスファミ
ド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）と組み合わせて投
与されるか、ＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせで投与される。別の実施形態に
おいて、本発明の組成物は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂと組み合わせて投与される。さ
らなる実施形態において、本発明の組成物は、ＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰ
と共に、またはＲｉｔｕｘｍａｂおよびＣＨＯＰの成分の任意の組み合わせと共
に投与される。
【０７０２】 さらなる実施形態において、本発明の組成物は、サイトカインと組み合わせて
投与される。本発明の組成物とともに投与され得るサイトカインとしては、ＧＭ
−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、Ｉ
Ｌ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−α
、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βが挙げられるが、これ
らに限定されない。別の実施形態において、本発明の治療剤は、任意のインター
ロイキン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５
、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−
１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−
１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２２を含むが、これ
らに限定されない）と共に投与され得る。好ましい実施形態において、本発明の
組成物は、ＩＬ４およびＩＬ１０と組み合わせて投与される。ＩＬ４およびＩＬ
１０の両方が、ニューロカインα媒介Ｂ細胞増殖を増加させることが、本発明者
らによって観察された。
【０７０３】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインと共に投与する。
別の実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβ−８、ケモカインβ−
１、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質−４と共に投与する。好ま
しい実施形態において、本発明の組成物を、ケモカインβー８と共に投与する。
【０７０４】 さらなる実施形態において、本発明の組成物をＩＬ−４アンタゴニストと組み
合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与され得るＩＬ−４アンタゴニスト
は、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペプチド、可溶性ＩＬ−４レセプターポリペ
プチドの多量体の形態；ＩＬ−４により誘発される生物学的シグナルを形質導入
することなしに、ＩＬ−４レセプターに結合する抗ＩＬ−４レセプター抗体、１
つ以上のＩＬ−４レセプターへＩＬ−４を結合させることをブロックする抗ＩＬ
−４抗体、およびＩＬ−４レセプターを結合するがＩＬ−４により誘発される生
物学的シグナルを形質転換しないＩＬ−４のムテインを含むが、これらに限定さ
れない。好ましくは、この方法に従って使用される抗体は、モノクロ−ナル抗体
（例えば、本明細書中に記載される抗体フラグメントのような抗体フラグメント
を含む）である。
【０７０５】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を造血増殖因子と組み合わせて投
与する。本発明の組成物と共に投与され得る造血増殖因子は、ＬＥＵＫＩＮＥTM （ＳＡＲＧＲＡＭＯＳＴＩＭTM）およびＮＥＵＰＯＧＥＮTM（ＦＩＬＧＲＡＳＴ
ＩＭTM）を含むが、これらに限定されない。
【０７０６】 さらなる実施形態において、本発明の組成物を線維芽細胞増殖因子と組み合わ
せて投与する。本発明の組成物と共に投与され得る線維芽細胞増殖因子は、ＦＧ
Ｆ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧ
Ｆ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２
、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５を含むが、これらに限定さ
れない。
【０７０７】 さらに、本発明の組成物を、単独または他の治療養生法と組み合わせて投与し
得、この治療養生法は放射療法を含むが、これに限定されない。このような組合
せ治療を経時的におよび／または同時に投与し得る。
【０７０８】 （アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセイならびに分子） 本発明は、細胞に対するニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュ
ートロカインαＳＶポリペプチドの作用（例えば、レセプター分子のようなニュ
ートロカインα結合分子および／またはニュートロカインαＳＶ結合分子との相
互作用）を増強し、またはブロックする化合物を同定するために化合物をスクリ
ーニングする方法を提供する。アゴニストは、ニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶの天然の生物学的機能を増加させるか、またはニュー
トロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶと類似の様式で機能する化
合物であり、一方、アンタゴニストはこのような機能を減少または除去する。
【０７０９】 別の実施形態において、本発明は、ニュートロカインαポリペプチドおよび／
またはニュートロカインαＳＶポリペプチドへ特異的に結合する、レセプタータ
ンパク質または他のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。
例えば、細胞の区画（例えば、その膜または調製物）をニュートロカインαおよ
び／またはニュートロカインαＳＶに結合する分子を発現する細胞から調製し得
る。この調製を、標識したニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン
αＳＶを用いてインキュベートし、そしてレセプターまたは他の結合タンパク質
に結合したニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの複合体
を、慣用的な当業者に公知の方法により、単離し、そして特徴づける。あるいは
、細胞から可溶化された結合分子をカラムへ結合させ、次いで慣用的な方法に従
って溶出しそして特徴付けるためにニュートロカインαポリペプチドおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶポリペプチドを、固体支持体へ結合させ得る。
【０７１０】 アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞
区画（例えば、膜または膜の調製物）は、ニュートロカインαおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶに結合する分子（例えば、ニュートロカインαおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶによって調節されるシグナル経路または調節経路の
分子）を発現する細胞から調製され得る。その調製物は、ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶアゴニストもしくはニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶアンタゴニストであり得る候補分子の非存
在下または存在下で、標識されたニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶと共にインキュベートされる。候補分子の、結合分子に結合する能
力は、標識されたリガンド結合の減少に反映される。無償で（ｇｒａｔｕｉｔｏ
ｕｓｌｙ）結合する分子、すなわち、ニュートロカインα結合分子および／また
はニュートロカインαＳＶ結合分子に結合する場合にニュートロカインαの効果
を誘導することを伴わない分子は、最も、優良なアンタゴニストである可能性が
高い。うまく結合し、そしてニュートロカインαおよび／またはニュートロカイ
ンαＳＶと同じまたは密接に関連した効果を誘発する分子は、アゴニストである
。
【０７１１】 潜在的アゴニストおよびアンタゴニストのニュートロカインα様の効果および
／またはニュートロカインαＳＶ様の効果は、例えば、細胞または適切な細胞調
製物との候補分子の相互作用に続くセカンドメッセンジャー系の活性を決定する
ことにより、およびその効果をニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶの効果もしくはニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン
αＳＶと同じような効果を誘発する分子の効果と比較することにより測定され得
る。これに関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系としては、ＡＭＰグ
アニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解セカン
ドメッセンジャー系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０７１２】 ニュートロカインαアンタゴニストおよび／またはニュートロカインαＳＶア
ンタゴニストについてのアッセイの別の例は、競合アッセイである。このアッセ
イは、競合的阻害アッセイについての適切な条件下で、ニュートロカインαおよ
び／またはニュートロカインαＳＶおよび潜在的アンタゴニストと、膜結合レセ
プター分子または組換えニュートロカインαレセプター分子および／またはニュ
ートロカインαＳＶレセプター分子を組み合わせる。ニュートロカインαおよび
／またはニュートロカインαＳＶは、例えば、放射性活性によって標識され得、
その結果、レセプター分子に結合したニュートロカインα分子および／またはニ
ュートロカインαＳＶ分子の数が、潜在的アンタゴニストの有効性を評価するた
めに正確に決定され得る。
【０７１３】 潜在的アンタゴニストとしては、本発明のポリペプチドに結合し、そしてそれ
によってその活性を阻害または無効にする有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
（例えば、ＩＬ−１３）および抗体が挙げられる。潜在的アンタゴニストはまた
、ニュートロカインα誘導性活性および／またはニュートロカインαＳＶ誘導性
活性を誘導することなく、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同じ部位に
結合し、それによって結合からニュートロカインαおよび／またはニュートロカ
インαＳＶを除外することによりニュートロカインαおよび／またはニュートロ
カインαＳＶの作用を妨げる、密接に関連したタンパク質または抗体のような有
機低分子、ペプチド、ポリペプチドであり得る。
【０７１４】 他の潜在的アンタゴニストとしては、アンチセンス分子が挙げられる。アンチ
センス技術は、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、または三重鎖ヘリ
ックス形成を通して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技
術は、例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１
）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）において議論される。
アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを介して、
または三重鎖へリックス形成を介して、遺伝子発現を制御するために使用され得
る。アンチセンス技術は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５
６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａ
ｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒｏｔａｎ、ＦＬ（１９８８）
において議論される。三重鎖ヘリックス形成は、例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅ
ｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）において議論される。この方法
は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、
本発明の成熟ポリペプチドの細胞外ドメインをコードするポリヌクレオチドの５
’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレ
オチドを設計するために使用され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関
与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され、それによって転写およびニ
ュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの産生を妨げる。アン
チセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし
、そしてｍＲＮＡ分子のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュー
トロカインαＳＶポリペプチドへの翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオ
チドはまた、細胞に送達され得、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡは、
ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの産生を阻害するよ
うにインビボで発現され得る。
【０７１５】 １つの実施形態において、本発明のニュートロカインαアンチセンス核酸およ
び／またはニュートロカインαＳＶアンチセンス核酸は、外因性配列からの転写
によって細胞内で産生される。例えば、ベクターまたはその部分は、転写され、
本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じる。このようなベクターは、ニュー
トロカインαアンチセンス核酸および／またはニュートロカインαＳＶアンチセ
ンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターは、所望のアンチセンス
ＲＮＡを産生するように転写され得る限り、エピソーム性のままであり得るか、
または染色体に組み込まれ得る。このようなベクターは、当該分野で標準的な組
換えＤＮＡ技術方法によって構築され得る。ベクターは、脊椎動物細胞における
複製および発現に使用される、プラスミド、ウイルスまたは当該分野において公
知の他の物であり得る。ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインα
ＳＶをコードする配列、またはそのフラグメントの発現は、脊椎動物細胞（好ま
しくは、ヒト細胞）において作用する、当該分野において公知の任意のプロモー
ターによってであり得る。このようなプロモーターは、誘導性または構成的であ
り得る。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒ
ｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２９：３０４〜３１０（１９
８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７〜７９７（１９８０）、ヘルペスチミジ
ンプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
．Ｓ．Ａ．、７８：１４４１〜１４４５（１９８１）、メタロチオネイン遺伝子
の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９〜４２（１９８
２））などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０７１６】 本発明のアンチセンス核酸は、ニュートロカインα遺伝子および／またはニュ
ートロカインαＳＶ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に相補的な配列を含
む。しかし、完全な相補性が好まれるが、必要とはされない。本明細書中でいわ
れる「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズ
し、安定な二重鎖を形成し得るに十分な相補性を有する配列を意味する；二本鎖
ニュートロカインαアンチセンス核酸および／またはニュートロカインαＳＶア
ンチセンス核酸の場合、従って、二重鎖ＤＮＡの一本鎖が、試験され得るか、ま
たは三重鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス
核酸の相補性および長さの両方の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズする
核酸が長いほど、ニュートロカインα ＲＮＡおよび／またはニュートロカイン
αＳＶ ＲＮＡとの塩基のミスマッチはより多いが、これは、安定な二重鎖（ま
たは場合によっては三重鎖）を含み、そしてなおこれを形成し得る。当業者は、
ハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用によって
、ミスマッチの耐容可能な程度を確認し得る。
【０７１７】 メッセージの５’末端（例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの、およびこれを含む
５’非翻訳配列）に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効
率的に作用するはずである。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列
も同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが示されている。一
般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３〜３
３５を参照のこと。従って、図１Ａ〜Ｂに示されるニュートロカインαおよび／
またはニュートロカインαＳＶの５’または３’の翻訳されない非コード領域の
いずれかに相補的なオリゴヌクレオチドおよび５Ａ−Ｂのそれぞれは、アンチセ
ンスアプローチにおいて内因性ニュートロカインα ｍＲＮＡおよび／またはニ
ュートロカインαＳＶ ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために使用され得る。このｍ
ＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの
相補物を含むはずである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、翻訳のより非効率的なインヒビターであるが、本発明に従って使
用され得る。ニュートロカインα ｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインα
ＳＶ ｍＲＮＡの５’領域、３’領域またはコード領域にハイブリダイズするよ
うに設計されるにせよ、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドの
長さであるべきであり、そして好ましくは、６〜約５０個のヌクレオチドの長さ
の範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の局面において、このオリゴヌクレオ
チドは、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも１７個のヌクレオチド、
少なくとも２５個のヌクレオチドまたは少なくとも５０個のヌクレオチドである
。
【０７１８】 本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらのキメラ混
合物または誘導体または改変バージョンの一本鎖または二本鎖であり得る。この
オリゴヌクレオチドは、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを
改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格にて改変され得る。この
オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボ
で宿主細胞のレセプターを標的とするため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓ
ｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２（１９８７）；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８８
／０９８１０（１９８８年１２月１５日に公開）を参照のこと）もしくは血液脳
関門（例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ８９／１０１３４（１９８８年４月２５日
に公開）を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーショ
ン誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：９５８
〜９７６（１９８８）を参照のこと）またはインターカレート剤（例えば、Ｚｏ
ｎ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９（１９８８）を参照のこと）を含
み得る。この目的のために、このオリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペ
プチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション
誘発（ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤など）に結合体化され得る。
【０７１９】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下を含むがこれらに限定されない
群から選択される、少なくとも１つの改変された塩基部分を含み得る：５−フル
オロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル
、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒド
ロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリ
ジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ
−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メ
チルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルア
デニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６
−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メト
キシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５−メ
トキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ
６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソ
シン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏ
ｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラ
シル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチ
ルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル
、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３
）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。
【０７２０】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロア
ラビノース、キシルロース、およびヘキソースを含むが、これらに限定されない
群から選択される少なくとも１つの改変糖部分を含み得る。
【０７２１】 なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチ
オエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデ
ート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステ
ル、およびホルムアセタール、またはそれらのアナログを含むが、これらに限定
されない群から選択される少なくとも１つの改変リン酸骨格を含む。
【０７２２】 なお別の実施形態では、このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマ
ーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的なＲ
ＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のβ−単位とは反
対に、鎖は、互いに対して平行に進行する（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレ
オチドは、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．、１５：６１３１−６１４８（１９８７））、またはキメラＲＮ
Ａ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、２１５：３２７−
３３０（１９９７））である。
【０７２３】 本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な方法（例えば、自動
化ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓなどから市販される）の使用による）によって合成され得る。例えば
、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドがＳｔｅｉｎらの方法によって合成さ
れ得（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８））、メチ
ルホスホネートオリゴヌクレオチドが制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：７４４８−
７４５１（１９８８））などの使用によって調製され得る。
【０７２４】 ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶコード領域配列に
相補的なアンチセンスヌクレオチドが使用され得るが、転写された非翻訳領域に
対して相補的なアンチセンスヌクレオチドが最も好ましい。
【０７２５】 本発明による可能なアンタゴニストはまた、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイ
ムを含む（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４（１９９０年１０月４
日公開；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１２２２−１２２５（１９
９０）を参照のこと）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムが
ニュートロカインαｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶｍＲＮＡを
破壊するために使用され得るが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。
ハンマーへッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域
によって決定される位置でｍＲＮＡを切断する。ただ１つの要件は、標的ｍＲＮ
Ａが以下の２塩基配列５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリ
ボザイムの構築および生成は、当該分野で周知であり、そしてＨａｓｅｌｏｆｆ
およびＧｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５８５−５９１（１９８８）に
おいてより十分に記載されている。ニュートロカインαおよびニュートロカイン
αＳＶのヌクレオチド配列中には、多数の可能なハンマーヘッドリボザイム切断
部位が存在する（図１Ａ〜Ｂ）。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位
がニュートロカインαｍＲＮＡおよび／またはニュートロカインαＳＶｍＲＮＡ
の５’末端近傍に位置するように、すなわち、効率を増大させ、そして非機能的
ｍＲＮＡ転写物の細胞内蓄積を最小化するように、操作される。
【０７２６】 アンチセンスアプローチにおけるように、本発明のリボザイムは、改変オリゴ
ヌクレオチド（例えば、安定性の改善、標的化などのため）で構成され得、そし
てインビボでニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶを発現
する細胞に送達されるはずである。このリボザイムをコードするＤＮＡ構築物は
、ＤＮＡをコードするアンチセンスの導入について上述したのと同じ様式で、細
胞に導入され得る。好ましい送達方法は、強い構成的プロモーター（例えば、ｐ
ｏｌ ＩＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩプロモーターのような）の制御下
で、このリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用し、トランスフェクト
細胞が、内因性のニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの
メッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成す
ることを包含する。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるの
で、より低い細胞内濃度が効率化のために必要とされる。
【０７２７】 内因性遺伝子発現はまた、標的化された相同組換えを用いてニュートロカイン
α遺伝子および／もしくはニュートロカインαＳＶ遺伝子ならびに／またはその
プロモーターを不活化するか、または「ノックアウトする」ことにより減少され
得る（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０〜２３４（
１９８５）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ ５１：５０３〜
５１２（１９８７）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ５：３１３〜３２１（１
９８９）を参照のこと；これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援
用される）。例えば、内因性ポリヌクレオチド配列（遺伝子のコード領域もしく
は調節領域のいずれか）に相同なＤＮＡに隣接する本発明の変異ポリヌクレオチ
ド、非機能的ポリヌクレオチド（または完全に関連しないＤＮＡ配列）を選択マ
ーカーおよび／またはネガティブ選択マーカーありもしくはなしで使用して、イ
ンビボで本発明のポリペプチドを発現する細胞にトランスフェクトし得る。別の
実施形態において、当該分野で公知の技術を使用して、目的の遺伝子を含むが、
これを発現しない細胞中でノックアウトを生成する。ＤＮＡ構築物の挿入は、標
的化された相同組換えを介して、標的化された遺伝子の不活化を生じる。このよ
うなアプローチは、研究分野および圃場において個々に合わせられ、ここで、胚
幹細胞に対する改変を用いて、不活性な標的化遺伝子を有する動物子孫を生成す
る（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ １９８７およびＴｈｏｍｐ
ｓｏｎ １９８９（前出）を参照のこと）。しかし、このアプローチは、ヒトに
おける使用については慣用的に適合され得る（但し、組換えＤＮＡ構築物が、当
業者に明らかな適切なウイルスベクターを用いてインビボで必要な部位に直接投
与されるか、または標的化される条件で）。この段落に記載される文書の各内容
は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０７２８】 他の実施形態において、本発明に従うアンタゴニストは、ニュートロカインα
および／またはニュートロカインαＳＶの可溶性形態（例えば、リガンド結合ド
メイン、ＴＮＦ保存ドメイン、ならびに／またはニュートロカインαおよび／も
しくはニュートロカインαＳＶの細胞外ドメインを含む図１Ａ〜Ｂに示されるニ
ュートロカインαのフラグメントおよびリガント結合ドメイン、ＴＮＦ保存ドメ
イン、ならびに／またはニュートロカインαおよび／もしくはニュートロカイン
αＳＶの細胞外ドメインを含む図５Ａ〜Ｂに示されるニュートロカインαＳＶの
フラグメント）を含む。このようなニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶの可溶性形態は、天然に存在するか、または合成であり得、ニュ
ートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプター（
例えば、ＤＲ５（国際公開第ＷＯ ９８／４１６２９を参照のこと）、ＴＲ１０
（国際公開第ＷＯ ９８／５４２０２を参照のこと）、３１２Ｃ２（国際公開第
ＷＯ ９８／０６８４２を参照のこと）、ならびにＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、
およびＴＲ１１ＳＶ２（例えば、米国特許出願第０９／１７６，２００号を参照
のこと））に結合するための天然のニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶと競合することにより、および／またはレセプターと結合し得る
かまたは結合し得ないが、シグナル導入を誘発し得ないマルチマーを形成するこ
とによって、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカインαＳＶ媒介シ
グナル伝達と拮抗する。好ましくは、これらのアンタゴニストは、リンパ球（例
えば、Ｂ細胞）の増殖、分化、および／または活性化のニュートロカインαおよ
び／またはニュートロカインαＳＶ媒介刺激を阻害する。本発明のアンタゴニス
トはまた、ＴＮＦ−ファミリーリガンド（例えば、ＣＤ３０）ならびにニュート
ロカインα−Ｆｃ融合タンパク質および／またはニュートロカインαＳＶ−Ｆｃ
融合タンパク質に対して特異的な抗体を含む。
【０７２９】 「ＴＮＦ−ファミリーリガンド」とは、ＴＮＦレセプターファミリーのメンバ
ーに結合し、そしてリガンド／レセプターシグナル伝達経路を誘導および／また
はブロックし得る、天然に存在するリガンド、組換えリガンド、および合成リガ
ンドを意図する。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーとしては、ＴＮＦ−α、
リンホトキシン−α（ＬＴ−α、ＴＮＦ−βとしても知られる）、ＬＴ−β（Ｌ
Ｔ−α２−βのヘテロトリマー複合体において見出される）、ＦａｓＬ、ＣＤ４
０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開第ＷＯ ９６／１４３２８号）、ＡＩＭ−Ｉ（国際
公開第ＷＯ ９７／３３８９９号）、ＡＩＭ−ＩＩ（国際公開第ＷＯ ９７／３
４９１１号）、ＡＰＲＩＬ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（６）：１１８５−１
１９０）、エンドカイン（ｅｎｄｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第ＷＯ ９８／０
７８８０号）、ニュートロカイン（ｎｅｕｔｒｏｋｉｎｅ）−α（国際公開第Ｗ
Ｏ ９８／１８９２１号）、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−ｌＢＢＬ、ＯＸ４０
Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ
）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明
のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカインαＳＶ ＴＮＦ−ファ
ミリーリガンドは、ＤＲ５（国際公開第ＷＯ ９８／４１６２９を参照のこと）
、ＴＲ１０（国際公開第 ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ２（国際公開第
ＷＯ９８／０６８４２を参照のこと）およびＴＲ１１、ＴＲ１１ＳＶ１、および
ＴＲ１１ＳＶ２（米国特許出願第０９／１７６，２００を参照のこと）である。
【０７３０】 本発明のアンタゴニストはまた、ＴＮＦ−ファミリーレセプターまたは本発明
のニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリ
ペプチドに対して特異的な抗体を含む。本発明に従う抗体は、本発明のニュート
ロカインαイムノゲンおよび／またはニュートロカインαＳＶイムノゲンを使用
する種々の標準的な方法のいずれかによって調製され得る。示されたように、こ
のようなニュートロカインαイムノゲンおよび／またはニュートロカインαＳＶ
イムノゲンとしては、それぞれ、図１Ａ〜Ｂ（配列番号２）および図５Ａ〜Ｂ（
配列番号１９）に示された完全なニュートロカインαポリペプチドおよびニュー
トロカインαＳＶポリペプチド（リーダー配列を含んでもいいし、含まなくても
いい）ならびに例えば、リガント結合ドメイン、ＴＮＦ−保存ドメイン、細胞外
ドメイン膜貫通ドメイン、および／または細胞内ドメイン、あるいはその任意の
組み合わせを含むニュートロカインαポリペプチドフラグメントおよび／または
ニュートロカインαＳＶポリペプチドフラグメントが挙げられる。
【０７３１】 本発明によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のアゴニストまた
はアンタゴニストは、ＴａｒｔａｇｌｉａおよびＧｏｅｄｄｅｌ、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７（７）：４３０４−４３０７（１９９２）；Ｔａｒｔａｇｌ
ｉａら、Ｃｅｌｌ ７３：２１３−２１６（１９９３）、ならびにＰＣＴ出願第
ＷＯ９４／０９１３７に開示される方法に従って、惹起され得、好ましくは、配
列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のポリぺプチドに対して特異的（すなわ
ち唯一それに結合する）である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」（
Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、抗原に結合し得る、インタ
クトな分子ならびにそのフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（
ａｂ’）フラグメント）を含むことを意味する。Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’
フラグメントおよびＦ（ａｂ’）フラグメントは、Ｆｃフラグメントのインタ
クトな抗体を欠き、循環からより速く無くなり、そしてインタクトな抗体のより
少ない非特異的な組織結合性を有し得る（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．
、２４：３１６−３２５（１９８３））。
【０７３２】 好ましい方法では、本発明に従う抗体は、ｍＡｂである。このようなｍＡｂは
、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７（１９７５）および米国特許第４，３７６，１１０号；
Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９８；Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ
Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｐｌ
ｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８０；Ｃａｍｂｅｌｌ、
「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ１３（Ｂｕｒｄｏｎ
ら、編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４））、を使用して
調製され得る。
【０７３３】 ニュートロカインαドメインおよび／またはニュートロカインαＳＶドメイン
に結合するタンパク質およびその他の化合物はまた、本発明による候補アゴニス
トおよびアンタゴニストでもある。このような結合化合物は、酵母ツーハイブリ
ッド系を使用し、「捕捉」され得る（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ、Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４０：２４５〜２４６（１９８９））。この酵母ツーハイブリッド系の改
変された説明が、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔおよびその共同研究者らによって記載
されている（Ｇｙｕｒｉｓ、Ｃｅｌｌ ７５：７９１−８０３（１９９３）；Ｚ
ｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２（１９９３））。好ましくは、
この酵母ツーハイブリッド系は、本発明により使用され、ニュートロカインαお
よび／またはニュートロカインαＳＶのリガンド結合ドメイン、細胞外ドメイン
、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、および死ドメイン（ｄｅａｔｈ ｄｏｍａ
ｉｎ）に結合する化合物を捕捉する。このような化合物は、本発明の良好な候補
アゴニストおよびアンタゴニストである。
【０７３４】 例えば、上記のツーハイブリッドアッセイを使用して、ニュートロカインαレ
セプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターの細胞外ドメインま
たは細胞内ドメイン、あるいはその一部を使用して、インビボでニュートロカイ
ンαレセプターおよび／またはニュートロカインαＳＶレセプターと相互作用す
る細胞タンパク質を同定し得る。このようなアッセイを使用して、ニュートロカ
インαおよび／またはニュートロカインαＳＶのレセプターの機能の潜在的なア
ゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を有するリガンドもまた同定され得る。
このスクリーニングアッセイを先に使用して、ムテインＴＮＦ−ＲＩＩの細胞質
ドメインと相互作用するタンパク質を同定し、そして２つのレセプターに関連す
るタンパク質を同定することにつながる。Ｒｏｔｈｅら、Ｃｅｌｌ ７８：６８
１（１９９４）ニュートロカインαレセプターおよび／またはニュートロカイン
αＳＶレセプターの細胞質ドメインに結合するこのようなタンパク質およびアミ
ノ酸配列は、本発明の良好な候補アゴニストおよびアンタゴニストである。
【０７３５】 その他のスクリーニング技術は、レセプター活性化によって引き起こされる細
胞外ｐＨ変化を測定するシステム（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１８１−
２９６（１９８９）に記載されるような）において、本発明のポリぺプチドを発
現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用を含む。別の実施例
では、潜在的アゴニストまたはアンタゴニストが、本発明のポリぺプチドを発現
する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル
変換）が、潜在的アンタゴニストまたはアゴニストが有効か否かを決定するため
に測定され得る。
【０７３６】 本発明によるアゴニストは、天然に存在する化合物および合成化合物（例えば
、ＴＮＦファミリーリガンドペプチドフラグメント、形質転換増殖因子、神経伝
達物質（例えばグルタメート、ドーパミン、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート）
、腫瘍サプレッサー（ｐ５３）、細胞融解Ｔ細胞および代謝拮抗物質）を含む。
好ましいアゴニストは、化学療法薬（例えば、シスプラチン、ドキソルビシン、
ブレオマイシン、シトシンアラビノシド、ナイトロジェンマスタード、メトトレ
キセートおよびビンクリスチン）を含む。その他のものとしては、エタノールお
よび−アミロイドペプチドが挙げられる（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１４５７−
１４５８（１９９５））。
【０７３７】 好ましいアゴニストは、本発明のニュートロカインαポリぺプチドおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶポリぺプチドのフラグメントであり、これは、リン
パ球（例えばＢ細胞）の増殖、分化および／または活性化を刺激する。さらなる
好ましいアゴニストは、本発明のニュートロカインαポリぺプチドおよび／また
はニュートロカインαＳＶポリぺプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体、またはそのフラグメントを含む。ＴＮＦ−ファミリ
ーレセプターに対して惹起されたこのようなアゴニスト抗体は、以下に開示され
る：Ｔａｒｔａｇｌｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８８：９２９２−９２９６（１９９１）；およびＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４３０４−４３０７（１９９２）。また、ＰＣＴ出
願第ＷＯ９４／０９１３７号も参照のこと。
【０７３８】 さらなる実施形態では、免役調節分子（例えば、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、Ｉ
Ｌ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗−ＣＤ４
０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのような）が、本発明のニュート
ロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドの
アゴニストとして使用され得、このアゴニストはリンパ球（例えば、Ｂ細胞）の
増殖、分化および／または活性化を刺激する。特定の実施形態において、ＩＬ４
および／またはＩＬ１０を使用して、Ｂ細胞のニュートロカインαおよび／また
はニュートロカインαＳＶの媒介性増殖を増強する。
【０７３９】 本発明のさらなる実施形態において、本発明のポリぺプチドを発現するように
遺伝子操作される細胞、あるいは、本発明のタンパク質を発現しないように遺伝
子操作された細胞（例えば、ノックアウト）が、インビボで患者に投与される。
このような細胞は、患者（すなわち、動物（ヒトを含む））またはＭＨＣ適合性
ドナーから得られ得、そして、線維芽細胞、骨髄細胞、血球（例えば、リンパ球
）、脂肪細胞、筋肉細胞、内皮細胞などを含み得るが、これらに限定されない。
この細胞は、本発明のポリペプチドのコード配列をこの細胞に導入するために、
あるいは、コード配列および／または本発明のポリペプチドに関連する内因性の
調節配列を破壊するために（例えば、形質導入（ウイルスベクター、および好ま
しくは細胞ゲノムに導入遺伝子を組み込むベクターを使用する）、またはトラン
スフェクション手順（プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、裸のＤＮＡ、エレクトロ
ポレーション、リポソームなどの使用を含むがこれらに限定されない）によって
）、組換えＤＮＡ技術を用いてインビトロで遺伝子操作される。本発明のポリペ
プチドのコード配列は、強力な構成プロモーターまたは誘導プロモーターまたは
プロモーター／エンハンサーの制御下に配置されて、本発明のポリペプチドの発
現、および好ましくは分泌を達成し得る。本発明のポリペプチドを発現および好
ましくは分泌するこの操作された細胞は、例えば循環中で、または腹腔内で、全
身的に患者に導入され得る。
【０７４０】 あるいは、この細胞をマトリックスに組み込み得、そして身体に移植し得る（
例えば、遺伝子操作した線維芽細胞を皮膚移植片の一部として移植し得る；遺伝
子操作した内皮細胞をリンパ移植片または脈管移植片の一部として移植し得る）
（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４９号；およびＭｕ
ｌｌｉｇａｎおよびＷｉｌｓｏｎ、米国特許第５，４６０，９５９号を参照のこ
と：これらの各々は、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０７４１】 投与される細胞が非自己または非ＭＨＣ適合性細胞である場合、それらを、こ
の導入細胞に対する宿主免疫応答の発生を妨害する周知の技術を使用して投与し
得る。例えば、この細胞を被包性の形態で導入し得、この形態は、構成成分の即
時の細胞外環境との交換が可能である間は、導入細胞が宿主免疫系によって認識
され得ない。
【０７４２】 本発明のさらに別の実施形態では、ニュートロカインαポリぺプチドおよび／
またはニュートロカインαＳＶポリぺプチドの活性は、「ドミナントネガティブ
（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）」を使用して減少させられ得る。この
目的のために、欠損ニュートロカインαポリぺプチドおよび／またはニュートロ
カインαＳＶポリぺプチド（例えば、ＴＮＦ保存ドメインの全てまたは一部を欠
く変異体のような）をコードする構築物は、適切な標的細胞に対するニュートロ
カインαおよび／またはニュートロカインαＳＶの活性を減少させるための遺伝
子治療アプローチにおいて使用され得る。例えば、ニュートロカインαポリぺプ
チドおよび／またはニュートロカインαＳＶポリぺプチド（ＴＮＦ保存ドメイン
の全てまたは一部が改変されるかまたは欠けている）の宿主細胞発現を導くヌク
レオチド配列は、単球細胞もしくはその他の細胞または組織内に導入され得る（
本明細書中に記載されるかまたは別に当該分野で公知の、インビボまたはエキソ
ビボの遺伝子治療の方法のいずれかによって）。あるいは、標的相同組換えは、
このような欠失または変異を、単球中の被験体の内因性ニュートロカインα遺伝
子および／またはニュートロカインαＳＶ遺伝子に導入するために使用され得る
。この操作された細胞は、非機能性ニュートロカインαポリぺプチドおよび／ま
たはニュートロカインαＳＶポリぺプチド（すなわち、結合し得るが、シグナル
変換を誘発し得ないリガンド（例えばマルチマー））を発現する。
【０７４３】 （染色体アッセイ） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定のために役立つ。配列は、個々のヒト染
色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてそれとハイブリダイズし得る
。さらに、現在、染色体上の特定の部位を同定する必要性が存在する。実際の配
列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在、染色体位置をマ
ークすることについてほとんど利用可能ではない。本発明による、ＤＮＡの染色
体へのマッピングは、これらの配列を、疾患に関連する遺伝子に相関させること
における重要な最初の工程である。
【０７４４】 これに関しての特定の好ましい実施形態において、本明細書中に開示されるｃ
ＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、ニュートロカインαおよび／またはニュート
ロカインαＳＶの遺伝子のゲノムＤＮＡをクローン化するために使用される。こ
れは、種々の周知の技術およびライブラリー（これは一般に市販されている）を
使用して達成され得る。次いで、ゲノムＤＮＡは、インサイチュ染色体マッピン
グのために、この目的のために周知の技術を使用して、用いられる。
【０７４５】 さらに、いくつかの場合には、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ま
しくは１５〜２５ｂｐ）を調製することによって、染色体にマッピングされ得る
。この遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムＤＮＡにおいて
１つより多いエキソンにまたがらず、従って増幅プロセスを複雑にしないプライ
マーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々
のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために使用さ
れる。ｃＤＮＡクローンの分裂中期染色体展開物への蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するため
に使用され得る。この技術は、５０または６０ ｂｐほど短いｃＤＮＡ由来のプ
ローブとともに使用され得る（この技術の総説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕ
ｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ Ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８８）を参照のこと）。
【０７４６】 一旦配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理的
位置は、遺伝子地図データと相関付けられ得る。そのようなデータは、例えば、
Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙを通じてオンラインで利用可能であるＶ．ＭｃＫｕｓｉ
ｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ）に見出さ
れる。次いで、遺伝子と、同じ染色体領域にマッピングされている疾患との間の
関係は、連鎖解析（物理的に隣接する遺伝子の同時遺伝）を通して同定される。
【０７４７】 次に、罹患個体と非罹患個体との間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異
を決定することが必要である。変異が、いくらかのまたは全ての罹患個体におい
ては観察されるが、いかなる正常個体においても観察されない場合、この変異は
、疾患の原因である可能性が高い。
【０７４８】 物理的なマッピング技術および遺伝的なマッピング技術の最新の解明に関して
、疾患に関連する染色体領域に正確に位置付けられたｃＤＮＡは、５０と５００
との間の潜在的な原因遺伝子のうちの１つであり得る（これは、１メガベースマ
ッピング解明および２０ｋｂあたり１つの遺伝子と仮定する）。
【０７４９】 上記の技術を利用して、ニュートロカインαおよび／またはニュートロカイン
αＳＶの染色体位置が、体細胞ハイブリッドおよび放射線ハイブリッドの組み合
わせを使用して、染色体位置１３ｑ３４に高い信頼性とともに決定された。
【０７５０】 （実施例） 本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することに
よってより容易に理解される。これらは、説明のために提供されるものであり、
限定することを意図しない。多くの以下の実施例が、本発明のニュートロカイン
αポリヌクレオチドおよびポリペプチドを具体的に記載する。各々の例はまた、
本発明のニュートロカインαＳＶポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド
を生成および／または調査するために行われ得る。当業者は、以下の実施例をニ
ュートロカインαＳＶに対して容易に指向し得る。
【０７５１】 （実施例１ａ：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」ニュートロカインαの
発現および精製） 細菌発現ベクターであるｐＱＥ９（ｐＤ１０）を、本実施例における細菌発現
に用い得る（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）。ｐＱＥ９は、アンピシリン抗生
物質耐性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、
ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥ
Ｎ，ＩＮｃ．，前出のニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィ
ニティ樹脂固体を使用してアフィニティ精製が可能である、ヒスチジン残基をコ
ードする６個のコドン、ならびに適切な1つの制限酵素切断部位をコードする。
これらのエレメントを、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメン
トが、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すな
わち、「６Ｘ Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置する
。
【０７５２】 ニュートロカインαタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を、寄託
されたｃＤＮＡクローンから、このタンパク質の所望の部分のアミノ末端配列に
アニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、およびこの寄託構築物
中のｃＤＮＡコード配列の３’側の配列にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマーを用いて、増幅する。ｐＱＥ９ベクターへのクローニングを容易に
するための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドを、５’プライマー配列およ
び３’プライマー配列にそれぞれ付加する。
【０７５３】 このタンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマー
は、配列
【０７５４】
【化２２】 を有し、この配列は、下線部のＢａｍＨＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１Ｂ
の配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１８ヌクレオチドを含む。も
ちろん、当業者は、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列の点が、こ
の形態の細胞外ドメインよりも、より短いかまたはより長い完全ニュートロカイ
ンタンパク質の任意の所望の部分をコードするＤＮＡセグメントを増幅するよう
に改変され得る、ことを理解する。３’プライマーは、配列
【０７５５】
【化２３】 を有し、この配列は、下線部のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび
１ＢのこのＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含
む。
【０７５６】 増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ９を、ＢａｍＨＩおよびＨ
ｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。このＤ
ＮＡの制限ｐＱＥ９ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下流に
かつ開始ＡＵＧおよび６つのヒスチジンコドンとインフレームに、このタンパク
質コード領域を配置する。
【０７５７】 この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されるような標準的手順を用いて、コ
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリ
プレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える）の複数
のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される
例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、タンパク質を発現する
のに適している多くの１つにすぎない）は、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出から
市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下のＬ
Ｂプレート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニ
ーから単離し、そしてクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよ
びＤＮＡ配列決定によって確認する。所望の構築物を含むクローンを、アンピシ
リン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充
したＬＢ培地中の液体培養物において一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養
物を用いて、約１：２５から１：２５０の希釈度で、大規模培養に接種する。細
胞を、６００ｎｍ（「ＯＤ６００」）で０．４〜０．６の光学密度まで増殖させ
る。次いで、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）
を、１ｍＭの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることに
よって、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘発する。続いて
、細胞を、さらに３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によ
って収集する。
【０７５８】 次いで、この細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜
４時間攪拌する。その細胞破片を遠心分離によって取り除き、そしてこのタンパ
ク質を含有する上清を、ニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフ
ィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、前出）にロードする。６×Ｈ
ｉｓ ｔａｇを有するタンパク質は、高親和性でＮｉ−ＴＮＡ樹脂に結合し、そ
して単純な一工程手順で精製し得る（詳細については、Ｔｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎｉｓｔ，１９９５、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（前出）を参照のこと
）。簡単に述べると、この上清を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中のカラム
にロードし、このカラムをまず１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）で
洗浄し、次いで、１０容量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ６）で洗浄し、そし
て最後に、ニュートロカインαポリペプチドおよび／またはニュートロカインα
ＳＶポリペプチドを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ５）で溶出する。
【０７５９】 次いで、この精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）また
は５０ｍＭ Ｎａ−酢酸塩（ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透
析することによって再生させる。あるいは、このタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカ
ラムに固定化する間に、首尾良く再折り畳みさせ得る。推奨される条件は、以下
の通りである：プロテアーゼインヒビターを含有する、５００ｍＭ ＮａＣｌ、
２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７，４）中の、６Ｍ〜
１Ｍ尿素直線勾配を使用する再生。この再生は、１．５時間以上かけて行われる
べきである。再生の後、このタンパク質を、２５０ｍＭ イミダゾールの添加に
よって溶出し得る。イミダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（
ｐＨ６）緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって取り除く
。この精製したタンパク質を、４℃で保存するか、または−８０℃で凍結させる
。
【０７６０】 （実施例１ｂ：Ｅ．ｃｏｌｉにおけるニュートロカインαの発現および精製） この細菌発現ベクターｐＱＥ６０は、本実施例における細菌発現のために使用
される（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａ
ｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）。ｐＱＥ６０は、アンピシリン抗生物質耐
性（「Ａｍｐr」）をコードし、そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴ
Ｇ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉ
Ｎｃ．，（前出）のニッケル−ニトリロ−三酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニ
ティ樹脂固体を使用してアフィニティ精製が可能である、ヒスチジン残基をコー
ドする６個のコドン、ならびに適切な1つの制限酵素切断部位をコードする。こ
れらのエレメントを、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメント
が、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわ
ち、「６Ｘ Ｈｉｓタグ」）を有するポリペプチドを発現するように配置する。
しかし、本実施例においては、このポリペプチドコード配列は、６個のＨｉｓコ
ドンの翻訳を防ぐように挿入し、従って、このポリペプチドを、６×Ｈｉｓタグ
を有しないように産生される。
【０７６１】 細胞外ドメイン配列を含むタンパク質の所望の部分をコードするＤＮＡ配列を
、寄託されたｃＤＮＡクローンから、このタンパク質の所望の部分のアミノ末端
配列にアニーリングするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマー、およびこの寄託
構築物中のｃＤＮＡコード配列の３’側の配列にアニールするＰＣＲオリゴヌク
レオチドプライマーを用いて、増幅する。ｐＱＥ６０ベクターへのクローニング
を容易にするための制限部位を含む、さらなるヌクレオチドを、５’配列および
３’配列にそれぞれ付加する。
【０７６２】 このタンパク質の細胞外ドメインをクローニングするために、５’プライマー
は、配列
【０７６３】
【化２４】 を有し、この配列は、下線部のＢｓｐＨＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび１Ｂ
の配列の細胞外ドメインのアミノ末端コード配列の１７ヌクレオチドを含む。も
ちろん、当業者は、５’プライマーが開始するタンパク質コード配列の点が、こ
の形態の細胞外ドメインよりも、より短いかまたはより長い完全タンパク質の所
望の部分を増幅するように改変され得る、ことを理解する。３’プライマーは、
配列
【０７６４】
【化２５】 を有し、この配列は、下線部のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に続いて、図１Ａおよび
１ＢのこのＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な１８ヌクレオチドを含
む。
【０７６５】 増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＱＥ６０を、ＢｓｐＨＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結する。この
ＤＮＡの制限ｐＱＥ６０ベクターへの挿入は、ＩＰＴＧ誘導プロモーターから下
流にかつ開始ＡＵＧとインフレームに、これの付随する終止コドンを含むこのタ
ンパク質コード領域を配置する。この付随する終止コドンは、この挿入位置の下
流の６個のヒスチジンコドンの翻訳を防ぐ。
【０７６６】 この連結混合物を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されるような標準的手順を用いて、コ
ンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリ
プレッサーを発現しそしてカナマイシン耐性（「Ｋａｎr」）を与える）の複数
のコピーを含む、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｍ１５／ｒｅｐ４を、本明細書中に記載される
例証的な実施例を実行するのに用いる。この株（これは、タンパク質を発現する
のに適している多くの１つにすぎない）は、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出から
市販されている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下のＬ
Ｂプレート上で増殖する能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを耐性コロニ
ーから単離し、そしてクローニングしたＤＮＡの正体を、制限分析、ＰＣＲおよ
びＤＮＡ配列決定によって確認する。
【０７６７】 当業者は、いくらかの細菌発現ベクターのいずれかが、本実施例において示さ
れた発現プロトコルにおいてｐＱＥ９およびｐＱＥ６０の代わりに有用であり得
る。例えば、細菌発現ベクターの新規のｐＨＥ４シリーズ、特にｐＨＥ４−５ベ
クターは、本実施例における細菌発現に有用であり得る（ＡＴＣＣ受託番号２０
９３１１；およびその改変体）。このＡＴＣＣ寄託番号２０９３１１においてｐ
ＨＥ４−５／ＭＰＩＦＤ２３と称されたプラスミドＤＮＡは、別のＯＲＦをコー
ドする挿入物を含むプラスミドＤＮＡである。この構成物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０
１１０−２２０９に、１９９７年９月３０日に寄託された。関連のないＭＰＩＦ
ＯＲＦ挿入物に隣接するＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８制限部位を使用して、当
業者は、ｐＨＥ４−５ベクターにおける関連のないＯＲＦを、本発明のニュート
ロカインαＯＲＦと置換するための、現在の分子生物学技術を容易に使用し得る
。
【０７６８】 ｐＨＥ４−５細菌発現ベクターは、選択のためのネオマイシンホスホトランス
フェラーゼ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点、Ｔ５ファージプロモーター配列、２
つのｌａｃオペレーター配列、Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列、およびラク
トースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含む。これらのエレメント
を配置し、その結果、ポリペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメント
が、このポリペプチドのアミノ末端に共有結合された６個のＨｉｓ残基（すなわ
ち、「６×Ｈｉｓタグ」）を有するこのポリペプチドを発現する。ｐＨＥ４−５
ベクターのプロモーターおよびオペレーター配列は、合成的に作製された。核酸
配列の合成生成物は、当該分野で周知である（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ９５／９６Ｃ
ａｔａｌｏｇ、２１５−２１６頁、ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ、１０２０Ｅａｓｔ Ｍ
ｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ９４３０３）。
【０７６９】 所望のニュートロカインα構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地中
の液体培養物において一晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖する。Ｏ／Ｎ培養物を用いて、約
１：２５から１：２５０の希釈度で、大規模培養に接種する。細胞を、６００ｎ
ｍ（「ＯＤ６００」）で０．４と０．６との間の光学密度まで増殖させる。次い
で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を、１ｍ
Ｍの最終濃度まで添加し、ｌａｃＩリプレッサーを不活性にすることによって、
ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘発する。続いて、細胞を
、さらに３〜４時間インキュベートする。次いで、細胞を遠心分離によって収集
する。
【０７７０】 次いで、この細胞を、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で、４℃にて３〜
４時間攪拌する。その細胞破片を遠心分離によって取り除き、そしてニュートロ
カインαを含有する上清を、２００ｍＭ ＮａＣｌを補充した５０ｍＭ Ｎａ−
ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６に対して透析する。あるいは、このタン
パク質を、プロテアーゼインヒビターを含む５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリ
セロール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４に対して透析することによ
って首尾よく再折り畳みし得る。再生の後、このタンパク質を、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマト
グラフィーによって精製し得る。あるいは、アフィニティクロマトグラフィー工
程（例えば、抗体カラム）を使用して、純粋タンパク質を得ることができる。こ
の精製したタンパク質を４℃で保存するか、または−８０℃で凍結する。
【０７７１】 特定の実施形態において、ニュートロカインαポリペプチド配列における３つ
のシステイン残基の１つ以上を変異させるように、本実施例において詳述したよ
うに発現構築物を生成することが好ましい。ニュートロカインαポリペプチド配
列におけるシステイン残基は、配列番号２において示されるように１４７位、２
３２位、および２４５位、ならびに配列番号１９において示されるようにニュー
トロカインαポリペプチド配列の２１３位および２２６位に位置する（ニュート
ロカインαポリペプチド配列においてＣｙｓ−１４７に対応するニュートロカイ
ンαＳＶポリペプチド配列のシステインは、存在しない。なぜなら、ニュートロ
カインαポリペプチド配列のアミノ酸残基１４３〜１６０は、ニュートロカイン
αＳＶポリペプチド配列において存在しないからである）。
【０７７２】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるニュートロカインαタンパク質
のクローニング、発現および精製） この例示的な実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２ＧＰを使用
して、このタンパク質の細胞外ドメインをコードするクローン化ＤＮＡ（その天
然で会合した分泌シグナル（リーダー）配列を欠く）をバキュロウイルスに挿入
して、ニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインを発現させる。Ｓｕｍｍ
ｅｒｓら、Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｐｒｏｓｅｄｕｒｅｓ， Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９
８７））によって記載されるような標準的な方法を用いる。この発現ベクターは
、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮ
ＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーター、続いてバキュロウイルスｇｐ６７の
分泌シグナルペプチド（リーダー）ならびに簡便な制限部位（例えば、ＢａｍＨ
Ｉ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８）を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０
」）のポリアデニル化部位を、効果的なポリアデニル化のために使用する。組換
えウイルスの容易な選択のために、プラスミドは、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプ
ロモーターの制御下で、同じ配向でＥ．ｃｏｌｉ由来のβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子、続いて、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。この挿入
遺伝子を、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためのウイルス配
列によって、両側に隣接させて、クローン化ポリヌクレオチドを発現する生存可
能ウイルスを生成する。
【０７７３】 当業者が容易に理解するように、その構築物が転写、翻訳、分泌などのために
適切に配置されたシグナル（シグナルペプチドおよび必要な場合はインフレーム
ＡＵＧを含む）を提供する限りは、多くの他のバキュロウイルスベクターは、上
記のベクター（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１およびｐＡｃＩＭＩ）の代
わりに使用され得る。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗら、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９（１９８９）によって記載される。
【０７７４】 寄託されたクローン（ＡＵＧ開始コドン、天然に会合した細胞内ドメイン配列
および膜貫通ドメイン配列、ならびに図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）において
示されるアミノ酸Ｇｌｎ−７３からＬｅｕ−７９を欠く）におけるニュートロカ
インαタンパク質の細胞外ドメインのＭ末端欠失形態をコードするｃＤＮＡ配列
を、この遺伝子の５’配列および３’配列に相補的なＰＣＲオリゴヌクレオチド
プライマーを使用して増幅する。この５’プライマーは、配列
【０７７５】
【化２６】 を有し、下線部のＢａｍＨＩ制限酵素部位、続いて、図１Ａおよび１Ｂに示され
るニュートロカインαタンパク質の細胞外ドメインの配列の１８ヌクレオチド（
このタンパク質の細胞外ドメインの示されたＮ末端で開始する）を含む。この３
’プライマーは、配列
【０７７６】
【化２７】 を有し、下線部のＢａｍＨＩ制限部位、続いて、２つの終止コドンならびに図１
Ａおよび１Ｂの３’コード配列に相補的な１８ヌクレオチドを含む。
【０７７７】 特定の実施形態において、ニュートロカインαの完全推定細胞外ドメイン（す
なわち、アミノ酸残基Ｇｌｎ−７３〜Ｌｅｕ−２８５）を発現するために設計さ
れた構築物は、好ましい。当業者は、配列番号１および配列番号２として、それ
ぞれ提供されるポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を使用して、この
ようなクローンを生成するためのポリヌクレオチドプライマーを設計し得る。
【０７７８】 さらなる好ましい実施形態において、ｐＡ２ＧＰ発現構築物は、配列番号２と
して示されるニュートロカインαポリペプチド配列のアミノ酸残基Ｌｅｕ−１１
２〜Ｌｅｕ−２８５をコードする。
【０７７９】 別の好ましい実施形態において、ｐＡ２ＧＰ発現構築物は、配列番号２として
示されるニュートロカインαポリペプチド配列のアミノ酸残基Ｓｅｒ−７８〜Ｌ
ｅｕ−２８５をコードする。
【０７８０】 増幅したフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８
で消化し、そして再度、１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを
、本明細書中でＦ１と称す。
【０７８１】 このプラスミドを、当該分野で公知の慣用的な手順を使用して、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩで消化し、そして必要に応じて、ウシ腸ホスファターゼを使用して脱リン
酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」、
ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａ．）を使用して、１％アガ
ロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と称す
。
【０７８２】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
で互いに連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１または他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿
主（例えば、ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）細胞）を、連結混合物で形質転換し、そ
して培養プレートに塗布する。ヒト遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を、Ｂ
ａｍＨＩを用いて個々のコロニーからのＤＮＡを消化し、次いでゲル電気泳動に
よって消化産物を分析することによって同定する。このクローン化フラグメント
の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認する。このプラスミドを、本明細書中で
ｐＡ２ＧＰ−ニュートロカインαと称す。
【０７８３】 ５μｇのプラスミドｐＡ２ＧＰ−ニュートロカインαを、Ｆｅｌｇｎｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（
１９８７）によって記載されるリポフェクチン法を使用して、１．０μｇの市販
の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMバキュロウイルス
ＤＮＡ」、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と同時トランス
フェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇの
プラスミドｐＡ２ＧＰニュートロカインαを、５０μｌの無血清グレース培地（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ）を含むマイクロタイタープレートの滅菌ウェル中で混合する。その後、１
０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎおよび９０μｌのグレース培地を添加し、混合し
、そして１５分間室温にてインキュベートする。次いで、トランスフェクション
混合物を、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）に滴下して添加し、
１ｍｌのグレース培地（血清なし）を含む３５ｍｍ組織培養プレートに播種する
。次いで、このプレートを２７℃にて５時間インキュベートする。次いで、この
トランスフェクション溶液を、プレートから除去し、そして１０％仔ウシ血清を
補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで、培養を、２７℃にて４
日間続ける。
【０７８４】 ４日後に、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）によって記載されると通
りに、その上清を回収し、プラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙ
ｌａｎｄ）を含むアガロースゲルを使用して、ｇａｌ発現クローン（これは、青
色に染まったプラークを産生する）の容易な同定および単離を可能にする。（こ
のタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄによって配布
される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学のための使用者ガイドの９〜１０
頁に見出され得る）。適切なインキュベーションの後、青色に染まったプラーク
を、マイクロピペット（例えば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで
、組換えウイルスを含有する寒天を、２００μｌのグレース培地を含む微量遠心
分離管中に再懸濁し、そしてこの組換えバキュロウイルスを含有する懸濁物を使
用して、３５ｍｍディッシュに播種したＳｆ９細胞を感染させる。４日後、これ
らの培養ディッシュの懸濁物を収集し、次いでそれらを４℃にて保存する。この
組換えウイルスを、Ｖ−ニュートロカインαと呼ぶ。
【０７８５】 ニュートロカインα遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱
非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。この細胞を、約２の感染
多重度（「ＭＯＩ」）で、組換えバキュロウイルスＶ−ニュートロカインαに感
染させる。放射性標識したタンパク質が所望される場合、６時間後に、この培地
を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを含まないＳＦ９００ＩＩ培地（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤよ
り入手可能）と置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５
μＣｉの35Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍより入手可能）を添加する。この
細胞を、１６時間さらにインキュベートし、次いで遠心分離によって収集する。
上清中のタンパク質および細胞内タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてオー
トラジオグラフィー（放射性標識した場合）によって分析する。
【０７８６】 精製したタンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定を使用して、
このタンパク質の細胞外ドメインのアミノ末端配列（従ってこの分泌シグナルペ
プチドの切断位置および長さ）を決定し得る。
【０７８７】 特定の実験的な例において、組換えニュートロカインαを、以下のようにバキ
ュロウイルスで感染したＳｆ９細胞上清から精製した。この昆虫細胞を１％（ｖ
／ｖ）ウシ胎仔血清を含むＥＸＣＥＬ４０１培地（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ）において増殖させた。感染から９２時間後、収集された上清を、１８，００
０×ｇで遠心分離し、続いて０．４５ｍ深層濾過によって清澄した。脱脂質濾過
工程をまた、使用して、脂質夾雑物を除去し、次にニュートロカインαタンパク
質の最初の捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）を向上し得る。
【０７８８】 この上清をタンデム様式においてＰｏｒｏｓ ＨＳ−５０／ＨＱ−５０のセッ
トにロードした。代替として、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ Ｓｕｐｅｒ Ｑ（Ｔｏｓｏｈａｓｓ）、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）およびその等価な樹脂が使用され得る。この工程をネガティブ精製
工程として使用し、強アニオン結合夾雑物質を除去する。ＨＳ／ＨＱフロースル
ー物質を１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８でｐＨ７．５に調整し、等量の５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８で希釈し、そしてｐｏｒｏｓＰＩ−２０カラムま
たはＰＩ−５０カラムにロードした。このＰＩカラムを、まずカラムの４倍容量
の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中７５ｍＭ塩化ナトリウムで洗浄
し、次いでカラムの３〜５倍容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５中
３００ｍＭ、７５０ｍＭ、１５００ｍＭの塩化ナトリウムの段階的濃度勾配を使
用して溶出した。ニュートロカインαタンパク質は、還元化ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
で１７ＫＤのバンドとして現れ、そして０．７５Ｍ〜１．５Ｍの塩化ナトリウム
画分に存在する。
【０７８９】 ＰＩ画分を０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）
で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）サイズ
排除カラムを通してさらに精製した。Ｓ２００画分を終濃度３Ｍになるように塩
化ナトリウムと混合し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏ
ｈａｓｓ）カラムにロードした。Ｈｅｘｙｌカラムを、５〜１５倍カラム容量の
５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）中３Ｍ〜０．０５Ｍの塩化ナトリウムの直
線濃度勾配を用いて溶出した。この塩化ナトリウム濃度勾配をまた、Ｈｅｘｙｌ
クロマトグラフィー工程において５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６）中１Ｍ〜０
Ｍの硫酸アンモニウム濃度勾配によって置換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分
析された精製されたニュートロカインα含有画分を一緒にして、そして１５０ｍ
Ｍ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ６）を含む緩衝液に対し
て透析した。
【０７９０】 本明細書において例示した、最終的に精製されたバキュロウイルス系において
発現されたニュートロカインαタンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基Ａｌａ
−１３４で開始するＮ末端配列を有する。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、９５％の純度
より高い単一のピークを示す。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッセイにおい
て検出限界未満であった。
【０７９１】 別の実施例において、組換えニュートロカインαを、以下のように０．２５％
のウシ血清を含むバキュロウイルス感染したＳｆ９細胞上清から精製した。
【０７９２】 Ｓｆ９上清を１８，０００×ｇで遠心分離によって収集した。次いで、この上
清を、わずかにアルカリ状態で１０ｍＭ塩化カルシウムで１０〜１５分間処理し
、続いて、遠心分離、次いで０．２２μｍ深層濾過を行った。次いで、得られた
Ｓｆ−９細胞上清を、２倍に希釈して、そしてＰｏｒｏｓ ＰＩ−５０カラム（
ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）にロードした。このカラムを５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．４）で平衡化した。このＰＩ−５０カラムを１ＣＶの
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝７．４）で洗浄し、次いで３ＣＶより多くの５０ｍ
Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）中１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。ＰＩ画分を５０
ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）、１２５ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｅｐｈａ
ｃｒｙｌ Ｓ２００カラムにロードした。このＳ２００画分を、塩と混合し、最
終濃度を０．７Ｍ 硫酸アンモニウムおよび０．６Ｍ ＮａＣｌにし、そして５
０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）中０．６Ｍ ＮａＣｌ、０．７Ｍ 硫酸アンモ
ニウムを含む緩衝液で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ ６５０Ｃカ
ラム（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓから入手可能）にロードした。次いで、このカラムを
、２ＣＶの同一の緩衝液で洗浄した。次いで、組換えニュートロカインαを３Ｃ
Ｖの５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）、続いて２ＣＶの２０％エタノール洗浄
で段階的に溶出した。次いで、この組換えニュートロカインαタンパク質を、最
後に硫酸アンモニウム（０．３〜０Ｍ塩）濃度勾配で溶出した。この適切な画分
をプールし、そして５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝６）を含む緩衝液に対して透
析し、次いでＰｏｒｏｓ ５０ＨＱカラムに通した。このＨＱフロースルーを４
ｍｓに希釈し、そしてＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＤ ６５０Ｍ カラムにロー
ドし、次いで２５ｍＭクエン酸ナトリウム、１２５ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。
【０７９３】 別の実施例では、組換えニュートロカイン−αを、Ｓｆ＋昆虫細胞におけるバ
キュロウイルスベクター系を使用して発現し、そして精製した。
【０７９４】 始めに、図１Ａおよび１Ｂに示すニュートロカイン−αポリペプチド配列のア
ミノ酸残基（Ｓｅｒ−７８〜Ｌｅｕ−２８５）をコードするポリヌクレオチド（
これは、配列番号２に示すニュートロカイン−αポリペプチド配列のアミノ酸残
基（Ｓｅｒ−７８〜Ｌｅｕ−２８５）と正確に同一である）をバキュロウイルス
移入構築物ＰＳＣ中にサブクローニングし、バキュロウイルス発現プラスミドを
作製した。ｐＡ２ＧＰ移入ベクター（ｐＶＬ９４１由来）は、ｇｐ６７シグナル
ペプチド、改変された多重クローニング部位、および青いプラークの選択のため
のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ熱ショックプロモーターの下流にクローン化されたｌａ
ｃＺ遺伝子を含む。ニュートロカイン−α（配列番号２）の配列およびｐＡ２Ｇ
Ｐベクターの配列を使用して、クローニングストラテジーを、ＰＳＣシグナルペ
プチドコード配列をＡｌａ−１３４でニュートロカイン−αコード配列（配列番
号２ならびに図１Ａおよび図Ｂ１）にシームレス（ｓｅａｍｌｅｓｓｌｙ）で融
合し、そしてこれをＰＳＣバキュロウイルス移入プラスミド中に挿入するするた
めに設計した。このストラテジーは、２段階のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
手順の使用を含む。始めに、プライマーを、ニュートロカイン−α配列を増幅す
るために設計した。５’プライマーは、ＰＳＣシグナルペプチドＣ末端をコード
する配列の後のＡｌａ−１３４をコードする配列および以下の残基（５’−ＧＧ
Ｔ ＣＧＣ ＣＧＴ ＴＴＣ ＴＡＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＧ
Ｇ ＴＣＣ ＡＧＡ ＡＧ−３’；配列番号３１）からなる。３’プライマー（
５’−ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＧＧ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＡＧＣ Ｔ
ＴＧ ＴＡＣ ＣＴＴ ＡＧＡ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＴＡ ＧＡＴ Ｃ−３’；
配列番号３２）は、ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびスペーサー配列
（ＫｎｐＩにより増加される切断効率のために）の後の、ニュートロカイン−α
コード配列からすぐ下流のｐＡ２ＧＰベクター配列の逆相補体からなる。ＰＣＲ
を、ニュートロカイン−αプラスミド（鋳型）を含むｐＡ２ＧＰおよびプライマ
ー（Ｏ−１８８７およびＯ−１８８８）を用いて行い、そして得られたＰＣＲ産
物を標準技術を使用して精製した。
【０７９５】 さらなるＰＣＲ反応を、鋳型としてＰＳＣバキュロウイルス移入プラスミドｐ
ＭＧＳ１２を使用して行った。このｐＭＧＳ１２プラスミドは、ＰＳＣシグナル
ペプチドで置換されたＡＴＧ開始コドンの後のポリヘドリンコード配列およびポ
リリンカー部位を有するｐＵＣ８中に挿入されたＡｃＮＰＶ ＥｃｏＲＩ「Ｉ」
フラグメントからなる。ＰＣＲ反応は、鋳型としてｐＭＧＳ１２、独特のＮｇｏ
Ｍ ＩＶおよびＥｃｏＲ Ｖ部位の上流のＡｃＮＰＶ ＯＲＦ６０３においてア
ニーリングした５’プライマー（５’−ＣＴＧ ＧＴＡ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＧ
Ｇ ＡＧＴ ＧＴＧ−３’；配列番号３３）およびＰＳＣシグナルペプチドをコ
ードしている配列の３’末端にアニーリングした３’プライマー（５’−ＣＧＣ
ＧＴＴ ＡＧＡ ＡＡＣ ＧＧＣ ＧＡＣ Ｃ−３’；配列番号３４）を使用
した。
【０７９６】 ＰＳＣシグナルペプチドがニュートロカイン−αコード配列のＡｌａ−１３４
にシームレスに融合されているＰＣＲ産物を産生するために、ＰＳＣシグナルペ
プチド−ポリヘドリンの上流領域と組み合わせ、そしてＰＣＲ産物をさらなる回
のＰＣＲに供した。ＰＳＣシグナルペプチドのＰＣＲ産物（ｐＭＧＳ１２／Ｏ−
９５９／Ｏ−１０４４）の３’末端は、プライマー（Ｏ−１８８７／Ｏ−１８８
８）を用いて調製したニュートロカイン−αのＰＣＲ産物の５’末端に重複する
ので、２つのＰＣＲ産物を合せ、そしてプライマー（Ｏ−９５９およびＯ−１８
８８）を使用するＰＣＲにより重複−伸長した（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｄ
）。
【０７９７】 ニュートロカイン−α配列に融合したＰＳＣシグナルペプチドを含む、得られ
た重複−伸長ＰＣＲ産物を、続いてバキュロウイルス移入プラスミドｐＭＧＳ１
２中に挿入した。ＰＣＲ産物をＮｇｏＭ ＩＶおよびＫｐｎＩを用いて消化し、
そしてフラグメントを精製し、そしてＮｇｏＭ ＩＶ−ＫｐｎＩ切断したｐＭＧ
Ｓ１２中に連結した。連結混合物でコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞
を形質転換した後、コロニーを拾い、そしてプラスミドＤＮＡミニプレップを調
製した。各連結物からの数個の陽性クローンをプラスミドＤＮＡの制限消化分析
により同定し、そして３つのクローン（ｐＡｃＣ９６６９、ｐＡｃＣ９６７１お
よびｐＡｃＣ９６７２）を大量プラスミド精製のために選択した。得られたプラ
スミドＤＮＡをＤＮＡ配列分析に供し、ニュートロカイン−α挿入物を確認しそ
して配列決定配列決定した。
【０７９８】 以下の工程は、Ｓｆ＋昆虫細胞由来の組換えニュートロカイン−αの回収プロ
セスおよび精製プロセスを記載する。他に言及されないかぎり、このプロセスは
、２〜８℃で行われる。
【０７９９】 （回収） （工程１．ＣａＣｌ2処理） Ｓｆ＋細胞の上清を、８，０００×ｇの遠心分離により収集した。回収緩衝液
−１（１Ｍ ＣａＣｌ2）を、ＣａＣｌ2の最終濃度が１０ｍＭになるように上清
に添加した。（さらに好ましい実施形態では、１Ｍ ＣａＣｌ2の代わりに１Ｍ
ＺｎＣｌ2が使用される。）溶液のｐＨを、回収緩衝液−２（１Ｍ Ｔｒｉｓ
ｐＨ８（±０．２））で７．７±に調整した。この溶液を１５分間インキュベ
ーションし、次いで８，０００×ｇで遠心分離した。
【０８００】 （精製） （工程１．Ｐｏｒｏｓ ＰＩ−５０カラム上でのクロマトグラフィー） Ｓｆ＋細胞の上清を、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ−５０カラム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍ）上にロードした。このカラムをＰＩ−Ｉ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５
０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（±０．２））中で平衡化した。このＰＩ−５０
カラムを１〜２ＣＶのＰＩ−１緩衝液で洗浄し、次いで、３ＣＶを超える直線勾
配のＰＩ−２緩衝液（５０ｍＭ クエン酸Ｎａ ｐＨ６（±０．２））で溶出し
た。この溶出物を、２８０ｎｍで紫外（ＵＶ）吸光度によりモニターした。画分
を溶出ピークにわたって収集し、そしてＳＤＳ ＰＡＧＥにより分析した。適切
な画分をプールした。
【０８０１】 （工程２．Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈｅｘｙｌ ６５０Ｃカラム上でのクロマト
グラフィー） ＰＩプールを、最終濃度０．７Ｍ （ＮＨ4）2ＳＯ4まで塩と混合し、そして
ＨＩＣ−１緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、０．６Ｍ ＮａＣｌ，０．７Ｍ （
ＮＨ4）2ＳＯ4、ｐＨ６（±０．２））中で平衡化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｈ
ｅｘｙｌ ６５０Ｃ（Ｔｏｓｏ Ｈａａｓ）カラム上にロードした。次いで、こ
のカラムを２ＣＶのＨＩＣ−１緩衝液で洗浄した。続いて、組換えニュートロカ
イン−αを、３〜５ＣＶのＨＩＣ−２緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ６．
０（±０．２））続いて２ＣＶの２０％エタノール洗浄で段階的に溶出した。こ
の溶出物を２８０ｎｍでのＵＶ吸光度および伝導率によりモニターした。画分を
溶出ピークにわたり収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いで、
適切な画分をプールした。
【０８０２】 （工程３．ＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ上でのクロマトグラフィー） Ｈｅｘｙｌ画分を透析し、そしてＳＰ−１緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム
ｐＨ４．５（±０．２））でｐＨ４．５に調整し、４ｍｓに希釈し、そしてＳ
Ｐ−１緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ４．５（±０．２））で平衡化
したＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （陽イオン交換、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム
にロードした。次いで、組換えニュートロカイン−αタンパク質を、ｐＨ５．５
でＳＰ−２緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ５．５（±０．２））でＳ
Ｐカラムから溶出した。次いで、この溶出物を２８０ｎｍで紫外（ＵＶ）吸光度
によりモニターした。画分を溶出ピークにわたり収集し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより分析した。適切な画分をプールした。
【０８０３】 （工程４．組換えニュートロカイン−αの透析） ＳＰ画分を６〜８ｋｄカットオフ膜デバイス中に置き、次いで一晩Ｄｉａｌｙ
ｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化ナト
リウム ｐＨ６（±０．２））中へ透析またはダイアフィルトレーションした。
【０８０４】 （工程５．濾過および充填） 工程６由来の組換えニュートロカイン−α溶液のタンパク質濃度を、ビシンコ
ニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ）タンパク質アッセ
イにより決定した。組換えニュートロカイン−α処方物を適切な緩衝液で最終タ
ンパク質濃度に調整し、そして制御条件下で濾過した。濾過物（バルク物質）を
−２０℃未満で適切な滅菌容器中で保存した。
【０８０５】 特定の実施形態では、以下に記載されるように生成された本発明のニュートロ
カイン−αタンパク質を、１〜５ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度に調整し、そ
して１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、１４０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ＝６．
０±（０．４）中で緩衝化し、そしてＴｙｐｅ１ガラスバイアル中で−２０℃以
下で保存した。
【０８０６】 クロマトグラフィーを実施している間、プロセスを２８０ｎｍでのＵＶ吸光度
によりモニターする。適用可能である場合、処理中のクロマトグラフィー中間体
物を、伝導率、ｐＨについて試験し、そしてＳＤＳおよび／またはＲＰ−ＨＰＬ
Ｃによりモニターする。
【０８０７】 カラムおよび精製機器は、０．２Ｍまたは０．５Ｍ ＮａＯＨ、続いて脱イオ
ン水、次いで０．１Ｍまたは０．５Ｍ 酢酸で洗浄し、消毒される。このカラム
および精製機器を、脱イオン水でリンスし、そして必要であれば、適切な保存溶
液中で保存する。使用前に、この機器を、（本明細書中に記載するようにか、ま
たは当該分野で周知であるように）適切な緩衝液で平衡化する。
【０８０８】 さらに好ましい実施形態では、上記の回収の節の工程１において、１Ｍ Ｚｎ
Ｃｌ2を１Ｍ ＣａＣｌ2の代わりに使用する。また、本実施形態では、ＺｎＣｌ 2 およびＣａＣｌ2の組み合わせを、使用し得る。０．１Ｍ ＺｎＣｌ2および０
．９Ｍ ＣａＣｌ2の多くの組み合わせを組換えニュートロカイン−αタンパク
質の回収プロセスにおいて使用し得、例えば、以下の組み合わせを使用し得るが
これらに限定されない：０．１Ｍ ＺｎＣｌ2および０．９Ｍ ＣａＣｌ2、０．
２Ｍ ＺｎＣｌ2および０．８Ｍ ＣａＣｌ2、０．３Ｍ ＺｎＣｌ2および０．
７Ｍ ＣａＣｌ2、０．４Ｍ ＺｎＣｌ2および０．６Ｍ ＣａＣｌ2、０．５Ｍ
ＺｎＣｌ2および０．５Ｍ ＣａＣｌ2、０．６Ｍ ＺｎＣｌ2および０．４Ｍ
ＣａＣｌ2、０．７Ｍ ＺｎＣｌ2および０．３Ｍ ＣａＣｌ2、０．８Ｍ Ｚ
ｎＣｌ2および０．２Ｍ ＣａＣｌ2、０．９Ｍ ＺｎＣｌ2および０．１Ｍ Ｃ
ａＣｌ2など。しかし、ＥＤＴＡの存在は、回収プロセスを阻害する。さらに、
回収緩衝液−１中のＺｎＣｌ2および／またはＣａＣｌ2の存在は、大量の高分子
量（または分子質量）のニュートロカイン−αマルチマーの形成を誘導する。
【０８０９】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるニュートロカイン−αのクローニングおよ
び発現） 典型的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメントを含み、このプロ
モーターエレメントは、ｍＲＮＡ、タンパク質コード配列および転写の終結およ
び転写物のポリアデニル化に必要とされるシグナルの転写の開始を媒介する。エ
ンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列および介在配列を含む更なるエレメントは、ＲＮＡ
スプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接する。高効率な転
写は、ＳＶ４０由来の初期プロモーターおよび後期プロモーター、レトロウイル
ス（例えば、ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、
ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成し得
る。しかし、細胞要素（例えば、ヒトアクチンプロモーター）をまた、使用し得
る。本発明の実施における使用のための適切な発現ベクターとしては、例えば、
ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ
）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２），ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ
３７１４６）およびｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）が挙げられる。使
用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅＬａ、２９３、Ｈ９およびＪｕ
ｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３、Ｃ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７および
ＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（
ＣＨＯ）細胞ならびにＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。
【０８１０】 あるいは、遺伝子を、染色体中に組み込んだ遺伝子を含む適切な細胞株におい
て発現し得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン、ハイ
グロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされた細胞
の同定および単離を可能にする。
【０８１１】 トランスフェクトした遺伝子をまた、増幅し、大量のコードされたタンパク質
を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺伝
子の数百または数千ものコピーを保有する細胞株を開発するのに有用である。別
の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐ
ｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅｂｂ
ｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９
９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を、選択培地中で増殖し
、そして、最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は、染色体へ
組み込まれた増幅した遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞およびＮＳＯ細胞を、タンパク質の産生のためにしばしば使用する。
【０８１２】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３８−４４７（１９８５年３月））およびＣＭＶ−エン
ハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０
（１９８５））を含む。例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよび
Ａｓｐ７１８を有する多重クローニングサイトは、目的の遺伝子のクローニング
を容易にする。ベクターは、３’イントロンに加え、ラットプレプロインスリン
遺伝子のポリアデニル化および終結シグナルを含む。
【０８１３】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドであるｐニュートロカイン−α−ＨＡを、発現ベクターｐｃＤ
ＮＡＩ／ＡｍｐまたはｐｃＤＮＡＩＩＩ（これらは、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，
Ｉｎｃ．から入手され得る）に、タンパク質の細胞外ドメインをコードする寄託
したｃＤＮＡの部分をクローニングすることにより作製する。ポリペプチドの可
溶性分泌形態を生成するために、細胞外ドメインをヒトＩＬ−６遺伝子の分泌リ
ーダー配列へ融合する。
【０８１４】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは、以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよ
び他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉの複製起点；（２）プラ
スミドを含む原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）原核
生物細胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、
ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが、ＣＭＶプロモーターの
発現制御下に都合よく配置され得、そしてポリリンカーにおける制限部位により
、ＳＶ４０イントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得る
ように配列された終結コドンおよびポリアデニル化シグナルの前のヘマグルチニ
ンフラグメント（すなわち、精製を容易にするための「ＨＡ」タグ）をコードす
るいくつかのコドン。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（
１９８４）により記載されるインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエ
ピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピトープを
認識する抗体を用いる組換えタンパク質の検出および回収を簡単にする。ｐｃＤ
ＮＡＩＩＩは、さらに、選択ネオマイシンマーカーを含む。
【０８１５】 ニュートロカイン−αポリペプチドの細胞外ドメインをコードするＤＮＡフラ
グメントは、ベクターのポリリンカー領域内にクローン化され、その結果、組換
えタンパク質発現は、ＣＭＶプロモーターに指示される。プラスミド構築ストラ
テジーは以下である。寄託したクローンのニュートロカイン−α ｃＤＮＡを、
Ｅ．ｃｏｌｉ中のニュートロカイン−αの発現のためのベクターの構築について
上記で記載されたのと同様に、都合のよい制限部位を含むプライマーを使用して
増幅する。適切なプライマーとしては以下が挙げられ、このプライマーは本実施
例において使用される。下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、ＡＵＧ
開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダー配列をコードする配列、お
よびニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインの５’コード領域の１８
ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下：
【０８１６】
【化２８】 の配列を有する。下線を付したＢａｍＨＩ制限部位および終止コドンの直前の３
’コード配列に相補的な１８個のヌクレオチドを含む３’プライマーは、以下：
【０８１７】
【化２９】 の配列を有する。
【０８１８】 ＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、
ＢａｍＨＩで消化し、次いで連結する。連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ株であるＳＵ
ＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１１０９９
Ｎｏｒｔｈ Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ Ｒｏａｄ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ
９２０３７から入手可能である）に形質転換し、そして形質転換した培養物をア
ンピシリン培地プレートにプレーティングし、次いでこれをインキュベートし、
アンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから
単離し、そしてニュートロカイン−α細胞外ドメインをコードしているフラグメ
ントの存在について、制限分析または他の手段により試験する。
【０８１９】 組換えニュートロカイン−αの発現について、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）に
記載されるように、ＤＥＡＥ−ＤＥＸＴＲＡＮを使用して、上記に記載するよう
に発現ベクターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるニュートロカイ
ン−αの発現のための条件下でインキュベートする。
【０８２０】 ニュートロカイン−α−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗ
ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版
；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載
される方法を使用して放射性標識化および免疫沈降により検出する。この目的の
ために、トランスフェクションの２日後、細胞を、８時間35Ｓ−システインを含
む培地中でインキュベーションすることにより標識する。この細胞および培地を
収集し、そして細胞を洗浄し、そして上記で引用されるＷｉｌｓｏｎらにより記
載されるように、界面化性剤を含むＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１
％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ
ＴＲＩＳ、ｐＨ７．５）で溶解する。タンパク質を、ＨＡ−特異的モノクローナ
ル抗体を使用して、細胞溶解産物および培養培地から沈殿させる。次いで、沈殿
させたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分
析する。ネガティブコントロールには見られない、予想したサイズの発現産物が
細胞溶解産物において見出される。
【０８２１】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４をニュートロカイン−αタンパク質の発現に使用する。プラス
ミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒの誘導体である（ＡＴＣＣ受託番
号３７１４６）。ニュートロカイン−αポリペプチドの可溶性の分泌形態を産生
するために、細胞外ドメインをコードする、寄託したｃＤＮＡの部分をヒトＩＬ
−６遺伝子の分離リーダー配列に融合する。ベクタープラスミドは、ＳＶ４０初
期プロモーターの制御下のマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドで
トランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣細
胞または他の細胞を、化学療法剤であるメトトレキサートを補充した選択培地（
αマイナスＭＥＮ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖する
ことにより選択し得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対して耐性の細胞におけ
るＤＨＦＲ遺伝子の増幅は、十分に証明されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．
、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ
，Ｒ．Ｔ．１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０、
Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．１９９０、Ｂｉｏｃｈｍ．ｅｔ Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０９７：１０７−１４３、Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．および
Ｓｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．１９９１、Ｂｉｏｔｈｃｅｎｏｌｏｇｙ ９：６４
−６８を参照のこと）。ＭＴＸの増加濃度における細胞増殖は、ＤＨＦＲ遺伝子
の増幅の結果として標的酵素であるＤＨＦＲを過剰産生することにより薬物に対
する耐性を発現する。第二の遺伝子をＤＨＦＲ遺伝子に連結する場合、その遺伝
子は通常、同時に増殖され、そして過剰発現される。このアプローチが１，００
０を超えるコピーの増幅された遺伝子を保有する細胞株を開発するために使用さ
れ得ることは当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートを取り除
く場合、宿主細胞の１つ以上の染色体中に組み込まれた増幅された遺伝子を含む
細胞株が得られる。
【０８２２】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子を発現するために、ラウス肉腫ウイルスの
長い末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９８５年３月：４３８
−４４７）およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期遺伝子のエンハ
ンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２
１−５３０（１９８５））を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組み込みを
可能にする、以下の単一の制限酵素切断部位である：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよ
びＡｓｐ７１８。このプラスミドは、これらのクローニング部位の後に、ラット
プレプロインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。
他の高効率のプロモーター（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初
期プロモーターもしくはＳＶ４０後期プロモーター、または他のレトロウイルス
（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長い末端反復）をまた、発現のため
に使用し得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発
現系および類似の系を、哺乳動物細胞において調節された方法で、ニュートロカ
イン−αを発現するために使用し得る（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ
，Ｈ．１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５
４７−５５５１）。ｍＲＮＡのポリアデニル化について、例えば、ヒト成長ホル
モンまたはグロビン遺伝子由来の他のシグナルが、同様に使用され得る。染色体
に組み込まれた目的の遺伝子を保有する安定な細胞株をまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８
またはハイグロマイシンのような選択マーカーとの同時トランスフェクションの
際に、選択し得る。開始において１つを超える選択マーカー（例えば、Ｇ４１８
およびメトトレキサート）を使用することは、都合がよい。
【０８２３】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩで消化し、次いで当該分野で公知の
手順により仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を使用して脱リン酸
化する。次いで、ベクターを１％アガロースゲルから単離する。
【０８２４】 ニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列を
、この遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプ
ライマーを使用して増幅する。下線を付したＢａｍＨＩ部位、Ｋｏｚａｋ配列、
ＡＵＧ開始コドン、ヒトＩＬ−６遺伝子由来の分泌リーダーペプチドをコードす
る配列、およびニュートロカイン−αタンパク質の細胞外ドメインの５’コード
領域の１８ヌクレオチドを含む５’プライマーは、以下；
【０８２５】
【化３０】 の配列を有する。下線を付したＢａｍＨＩおよび終止コドンの直前に３’コード
配列に相補的な１８個のヌクレオチドを有する３’プライマーは、以下：
【０８２６】
【化３１】 の配列を有する。
【０８２７】 増幅したフラグメントをエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで消化し、次いで、１
％アガロースゲル上で再度精製する。次いで単離したフラグメントおよび脱リン
酸化したベクターをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。次いでＥ．ｃｏｌｉ Ｈ
Ｂ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、そして例えば、制限酵素
分析を使用して、プラスミドｐＣ４へ挿入したフラグメントを含む細菌を同定す
る。
【０８２８】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフ
ェクションに使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェクション（
Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を使用して、０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと
同時トランスフェクトする。このプラスミドｐＳＶｎｅｏは、優性の選択マーカ
ーである、Ｇ４１８を含む抗生物質の群に対して耐性を与える酵素をコードする
Ｔｎ５由来のｎｅｏ遺伝子を含む。この細胞を、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充
したαマイナスＭＥＭ中に播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そして
ハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の
１０、２５または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４
１８を補充したαマイナスＭＥＭ中に播種する。約１０〜１４日後、単一のクロ
ーンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎ
Ｍ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）のメトトレキサートを使用して、６ウェルペトリ
皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサートで
増殖したクローンを、さらに高い濃度（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２
０μＭ）のメトトレキサートを含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順を
１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンを得るまで繰り返す。所望の遺伝
子産物の発現を、例えばＳＤＳ−ＲＡＧＥおよびウェスタンブロットによるかま
たは逆相ＨＰＬＣ分析により分析する。
【０８２９】 少なくとも、６個のニュートロカイン−α発現構築物を、本明細書中の発明に
より作製し、いくつかの系におけるいくつかのサイズのニュートロカイン−αポ
リペプチドおよび／またはニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの産生を促進
した。発現構築物は以下である：（１）ｐＮａ．Ａ７１−Ｌ２８５（アミノ酸残
基Ａｌａ−７１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（２）ｐＮａ．Ａ８１−Ｌ２８
５（アミノ酸残基Ａｌａ−８１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（３）ｐＮａ．
Ｌ１１２−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ｌｅｕ−１１２〜Ｌｅｕ−２８５を発現する
）、（４）ｐＮａ．Ｌ１３４−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ａｌａ−１３４〜Ｌｅｕ
−２８５を発現する）、（５）ｐＮａ．Ｌ１４７−Ｌ２８５（アミノ酸残基Ｌｅ
ｕ−１４７〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）、（６）ｐＮａ．Ｇ１６１−Ｌ２８５
（アミノ酸残基Ｇｌｙ−１６１〜Ｌｅｕ−２８５を発現する）。
【０８３０】 好ましい実施形態では、発現構築物を、細菌系、バキュロウイルス系および哺
乳動物系由来の種々のニュートロカイン−αムテインを発現するために使用する
。
【０８３１】 特定のさらなる好ましい実施形態では、構築物は、Ｎ末端および／またはＣ末
端で異種ポリペプチド（例えば、ヒトＩＬ−６由来のシグナルペプチド、ＣＫ−
β８由来のシグナルペプチド（公開されたＰＣＴ出願 ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９
０５８に開示されるＣＫ−β８配列のアミノ酸−２１〜−１）またはヒトＩｇＧ
Ｆｃ領域）に融合したニュートロカイン−αポリペプチドフラグメントを発現
する。当業者に公知の他の配列を、使用し得る。
【０８３２】 （実施例４：ニュートロカイン−α ｍＲＮＡ発現の組織分布） ノーザンブロット分析を、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（上記引用）により記載さ
れる方法を使用して、ヒト組織におけるニュートロカイン−α遺伝子発現を試験
するために行った。ニュートロカイン−αタンパク質（配列番号１）の全ヌクレ
オチド配列を含むｃＤＮＡプローブを、製造業者の使用説明書に従い、ｒｅｄｉ
ｐｒｉｍｅTMＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）を使用して、32Ｐで標識する。標識後、プローブを、製造業者のプロトコー
ル番号ＰＴ１２００−１に従い、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００TMカラム（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）を使用して精製する。
次いで精製した標識プローブを使用し、ニュートロカイン−αおよび／またはニ
ュートロカイン−α ｍＲＮＡについて種々のヒト組織を試験する。
【０８３３】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含む多重組織ノーザン
（ＭＴＮ）ブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手し、そして製造業者のプロトコ
ール番号ＰＴ１１９０−１に従い、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーシ
ョン溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、標識プローブで試験する。ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄の後、そのブロットをマウントし、そして−７０℃に
て一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標準手順に従い現像した。
【０８３４】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α発現のパターンを
決定するために、多重組織ノーザーンブロットのパネルをプロービングした。こ
れは、末梢血液白血球、脾臓、リンパ節および骨髄における単一の２．６ｋｂの
ｍＲＮＡの優勢な発現、および胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓にお
ける検出可能な発現を明らかにした。細胞株のパネルの分析は、ＨＬ６０細胞に
おけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αの高い発現、
Ｋ５６２における検出可能な発現を実証したが、Ｒａｊｉ細胞、ＨｅＬａ細胞ま
たはＭＯＬＴ−４細胞における発現は示されなかった。全体的に、ニュートロカ
イン−αおよび／またはニュートロカイン−α ｍＲＮＡの発現は、免疫系にお
いて豊富であるようである。
【０８３５】 （実施例５：内因性ニュートロカイン−α遺伝子を使用する遺伝子治療） 本発明に従う遺伝子治療の別の方法は、本発明の内因性ニュートロカイン−α
配列を、例えば、米国特許番号５，６４１，６７０（１９９７年６月２４日発行
）；国際公開番号ＷＯ ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際
公開番号ＷＯ ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２〜８９３５
（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ，３４２：４３５〜４
３８（１９８９）に記載されるように、相同組換えを介してプロモーターに作動
可能に結合する工程を包含する。この方法は、その標的細胞中に存在するが、そ
の細胞中では発現されないかまたは所望されるよりも低いレベルで発現される、
遺伝子の活性化を包含する。プロモーターおよび標的化配列を含むポリヌクレオ
チド構築物を作製する。この標的配列は、プロモーターに隣接する、内因性ニュ
ートロカイン−αの５’非コード配列に相同である。この標的化配列は、このニ
ュートロカイン−αの５’末端に十分に近く、その結果、このプロモーターは、
相同組換えの際にこの内因性配列に作動可能に連結される。このプロモーターお
よび標的化配列を、ＰＣＲを使用して増幅し得る。好ましくは、この増幅したプ
ロモーターは、５’末端および３’末端上に異なる制限酵素部位を含む。好まし
くは、第１の標的化配列の３’末端は、増幅したプロモーターの５’末端と同じ
制限酵素部位を含み、そして第２の標的化配列の５’末端は、増幅したプロモー
ターの３’末端と同じ制限部位を含む。
【０８３６】 この増幅したプロモーターおよび増幅した標的化配列を、適切な制限酵素で消
化し、続いてウシ腸ホスファターゼで処理する。消化したプロモーターおよび消
化した標的化配列を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下でともに加える。生じた混
合物を、これら２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。この構築
物をアガロースゲル上でサイズ分画し、次いでフェノール抽出およびエタノール
沈殿により精製する。
【０８３７】 この実施例において、このポリヌクレオチド構築物を、エレクトロポレーショ
ンを介して裸のポリヌクレオチドとして投与する。しかし、このポリヌクレオチ
ド構築物はまた、トランスフェクション促進剤（例えば、リポソーム、ウイルス
配列、ウイルス粒子、沈殿剤など）とともに投与され得る。送達のこのような方
法は、当該分野で公知である。
【０８３８】 一旦、細胞をトランスフェクトすると、相同組換えが生じて、このプロモータ
ーがこの内因性ニュートロカイン−α配列に作動可能に連結される。これは、こ
の細胞中におけるニュートロカイン−αの発現を生じる。発現は、免疫学的染色
または当該分野で公知の他の任意の方法により、検出され得る。
【０８３９】 線維芽細胞を、皮膚生検により被験者から得る。得られた組織を、ＤＭＥＭ＋
１０％ウシ胎仔血清中に置く。対数増殖期または定常期初期の線維芽細胞を、ト
リプシン処理し、そしてプラスチックの表面から栄養培地でリンスする。細胞懸
濁液のアリコートを、計数のために取り出し、そして残りの細胞を遠心分離に供
する。上清を吸引し、そしてペレットを５ｍｌのエレクトロポレーション緩衝液
（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ
、０．７ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、６ｍＭデキストロース）に再懸濁する。この細胞
を再遠心分離し、上清を吸引し、そして細胞をアセチル化ウシ血清アルブミン１
ｍｇ／ｍｌを含むエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁する。この最終細胞懸
濁物は、約３×１０6細胞／ｍｌを含む。エレクトロポレーションを、再懸濁直
後に実施すべきである。
【０８４０】 プラスミドＤＮＡを、標準的技術に従って調製する。例えば、ニュートロカイ
ン−αの遺伝子座に標的化するためのプラスミドを構築するために、プラスミド
ｐＵＣ１８（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ａｍｈｅｒｓｔ、ＮＹ）をＨｉｎｄ
ＩＩＩで消化する。ＣＭＶプロモーターを、５’末端にＸｂａＩ部位および３’
末端にＢａｍＨＩ部位を備えてＰＣＲにより増幅する。２つのニュートロカイン
−α非コード配列をＰＣＲを介して増幅する：一方のニュートロカイン−α非コ
ード配列（ニュートロカイン−αフラグメント１）を、５’末端にＨｉｎｄＩＩ
Ｉ部位および３’末端にＸｂａ部位を備えて増幅する；他方のニュートロカイン
−α非コード配列（ニュートロカイン−αフラグメント２）を、５’末端にＢａ
ｍＨＩ部位および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を備えて増幅する。このＣＭＶ
プロモーターおよびこれらのニュートロカイン−αフラグメント（１および２）
を、適切な酵素（ＣＭＶプロモーター−ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ；ニュートロ
カイン−αフラグメント１−ＸｂａＩ；ニュートロカイン−αフラグメント２−
ＢａｍＨＩ）で消化し、そしてともに連結する。生じた連結生成物をＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１８プラスミドと連結す
る。
【０８４１】 プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの電極ギャップを備える滅菌キュベット（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）に添加する。最終ＤＮＡ濃度は、一般的に、少なくとも１２０μ
ｇ／ｍｌである。次いで、この細胞懸濁液の０．５ｍｌ（約１．５×１０6細胞
を含む）をこのキュベットに添加し、そしてこの細胞懸濁液およびＤＮＡ溶液を
、穏やかに混合する。エレクトロポレーションを、Ｇｅｎｅ−Ｐｕｌｓｅｒ装置
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて実施する。キャパシタンスおよび電圧を、それぞれ
、９６０μＦおよび２５０〜３００Ｖに設定する。電圧が増加すると、細胞の生
存が減少するが、導入されたＤＮＡをそのゲノム中に安定に組込む生存細胞の割
合が劇的に増加する。これらのパラメーターを考えると、パルス時間約１４〜２
０ｍＳｅｃが観察されるはずである。
【０８４２】 エレクトロポレーションした細胞を、室温で約５分間維持し、次いで、このキ
ュベットの中身を、滅菌した移動ピペットを用いて穏やかに取り出す。この細胞
を、１０ｃｍのディッシュ中の、予め温めた栄養培地（１５％ウシ血清を含むＤ
ＭＥＭ）１０ｍｌに直接加え、そして３７℃でインキュベートする。翌日、この
培地を吸引し、そして１０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そしてさらに１６〜２４
時間インキュベートする。
【０８４３】 次いで、操作された線維芽細胞を、宿主中に、単独か、またはサイトデックス
（ｃｙｔｏｄｅｘ）３マイクロキャリア（ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ）ビーズ上
でコンフルエントになるまで増殖させた後かのいずれかで、注入する。ここで、
この線維芽細胞は、タンパク質産物を生成する。次いで、この線維芽細胞を、上
記のような患者に導入し得る。
【０８４４】 （実施例６：Ｂリンパ球刺激物質として機能する腫瘍壊死因子リガンドファミ
リーの新規メンバーである、ニュートロカイン−α） ２８５個のアミノ酸タンパク質をＡＰＲＩＬ（２８．７％）（Ｈａｈｎｅ，Ｍ
．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、１１８５−１１９０（１９８８））、ＴＮ
Ｆ−α（１６．２％）（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２、７２
４−７２９（１９８４））およびＬＴ−α（１４．１％）（Ｇａｒｙ、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２、７２１−７２４（１９８４））に対するその推定細胞外レセプタ
ー−リガンド結合ドメイン内で有意な相同性を共有するヒト好中球／単球由来ｃ
ＤＮＡライブラリーにおいて同定した（図７Ａ）。本発明者は、このサイトカイ
ンであるニュートロカイン−αを設計した（著者らはまた、この分子をその生物
学的活性に基づいてＢ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（ＢＬｙ
Ｓ）として設計した）。ニュートロカイン−αタンパク質配列の疎水性分析は、
ニュートロカイン−αが、ＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーと同様に、
ＩＩ型膜結合タンパク質である（Ｃｏｓｍａｎ，Ｄ．Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｓ．１
２：４４０−５５（１９９４））ことを示唆する非疎水性アミノ酸の後のアミノ
酸残基４７と７３との間の潜在的な膜貫通ドメインを明らかにした。哺乳動物細
胞（ＨＥＫ２９３およびチャイニーズハムスター卵巣）およびＳｆ９昆虫細胞に
おけるこのｃＤＮＡの発現により、アミノ酸１３４におけるアラニン残基で始ま
るＮ末端配列を有する、この１５２アミノ酸可溶性形態を同定した。電荷に対す
る質量比の再構築により、１７，０３８ダルトン（この値は、一つのジスルフィ
ド結合を有する、この１５２アミノ酸タンパク質について推定された値（１７０
３７．５ダルトン）と一致する）のニュートロカイン−αについての質量を規定
した。
【０８４５】 ヒト／ハムスターの体細胞ハイブリッドおよび照射ハイブリッドマッピングパ
ネルを使用して、ニュートロカイン−αをコードする遺伝子を、ＴＮＦスーパー
ファミリーの遺伝子の任意の他のメンバーと以前は関連付けられていなかった領
域である（Ｃｏｓｍａｎ，Ｄ．Ｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌｓ．１２：４４０−５５（１
９９４））ヒト染色体１３ｑ３４に位置するマーカーＳＨＧＣ−３６１７１に結
合されて見出された。
【０８４６】 ニュートロカイン−αの発現プロフィールを、ノーザンブロット（図７Ｂ）
およびフローサイトメトリー分析（表Ｖおよび図８）により評価した。ニュート
ロカイン−αは、末梢血白血球、脾臓、リンパ節および骨髄において高レベルで
見出される単一の２．６ｋｂのｍＲＮＡによりコードされる。より低い発現レベ
ルを胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓において検出した。細胞株のパ
ネルの間で、ニュートロカイン−αのｍＲＮＡを、ＨＬ−６０およびＫ５６２に
おいて検出したが、Ｒａｊｉ、ＨｅＬａまたはＭＯＬＴ−４細胞では検出しなか
った。これらの結果を、ニュートロカイン−α特異的ｍＡｂ ２Ｅ５を使用する
フローサイトメトリー分析により確認した。表Ｖに示されるように、ニュートロ
カイン−α発現は、さらなるＴまたはＢ系列細胞では検出されず、骨髄起源にお
ける細胞に制限される。正常な血液型の分析は、３日間にわたるＩＦＮ−γ（１
００Ｕ／ｍＬ）への細胞の曝露後、約４倍に上方制御された休止単球における有
意な発現を実証する（図８Ａ）。ニュートロカイン−α特異的ｍＲＮＡにおける
同時の増加をまた、検出した（図８Ｂ）。対照的に、ニュートロカイン−αは、
新たに単離された末梢血の顆粒球、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞では発現され
なかった。
【０８４７】 精製された組換えニュートロカイン−α（「ｒニュートロカイン−α」）を、
Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、および種々の内皮起源および
上皮起源の細胞型を含む、多数の細胞ベースのアッセイにおける活性化、増殖ま
たは死を誘導するその能力について評価した。これらのアッセイの中で、精製し
た扁桃Ｂ細胞を、プライミング剤（ｐｒｉｍｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としてホルマ
リン固定したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（
ＳＡＣ）または固定した抗ヒトＩｇＭのいずれかの存在下で培養する標準的な同
時刺激アッセイ（Ｓｉｅｃｋｍａｎｎ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４
７：８１４−２９（１９７８）；Ｒｉｎｇｄｅｎ，Ｏ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．６：１１５９−６９（１９７７））において、ニュートロカイン
−αがＢ細胞増を増加することを特に見出した。図９Ａに示されるように、組換
えニュートロカイン−αは、扁桃Ｂ細胞の用量依存的増殖を誘発する。この応答
は、０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の用量に対するｒＩＬ２の応答に類
似した。ニュートロカイン−αはまた、固定した抗ＩｇＭで同時刺激された細胞
と共に培養した場合、Ｂ細胞増殖を誘発した（図９Ａ）。架橋剤の量が、固定濃
度のＩＬ２またはｒニュートロカイン−αのいずれかの存在下で増加するので、
用量依存性応答が容易に観察される。
【０８４８】 Ｂ細胞に特異的な生物学的活性とレセプター発現とを相関付けるために、精製
したニュートロカイン−αをビオチン化した。得られたビオチン−ニュートロカ
イン−αタンパク質は、標準的なＢ細胞増殖アッセイにおいて生化学的機能を保
持した。全ヒト末梢血細胞の系列特異的分析は、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４、Ｃ
Ｄ５６およびＣＤ６６ｂにより評価した場合に、ビオチン化されたニュートロカ
イン−αの結合がＴ細胞、単球、ＮＫ細胞および顆粒球において検出不可能であ
ったことを示した（図１０Ａ）。対照的に、ビオチン化されたニュートロカイン
−αは、末梢ＣＤ２０+Ｂ細胞に結合した。レセプター発現もまた、Ｂ細胞腫瘍
株ＲＥＨ、ＡＲＨ−７７、Ｒａｊｉ、Ｎａｍａｌｗａ、ＲＰＭＩ ８２２６およ
びＩＭ−９において検出したが、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０、Ｋ−５６２およびＵ
−９３７を含む試験された骨髄由来の株のいずれにおいても検出しなかった。骨
髄細胞株ＩＭ−９および組織球株Ｕ−９３７についての代表的なフローサイトメ
トリープロフィールを、図１０Ｂに示す。同様の結果をまた、化学的に修飾され
たビオチン−ニュートロカイン−αの代わりに、生物学的に活性なＦＬＡＧ−タ
グ化ニュートロカイン−αタンパク質を使用して得た。まとめると、これらの結
果は、ニュートロカイン−αがそのレセプター分布および生物学的活性の両方に
おいて明確なＢ細胞向性を示すことを確証した。細胞の活性化が末梢血細胞、他
の正常な細胞型または確立された細胞株においてニュートロカイン−αレセプタ
ーの発現を増加し得るか否かは、いまだ示されていない。
【０８４９】 ニュートロカイン−αの種特異性を試験するために、マウス脾臓Ｂ細胞を、ヒ
トニュートロカイン−αおよびＳＡＣの存在下で培養した。結果は、ｒニュート
ロカイン−αがマウス脾臓Ｂ細胞のインビトロ増殖を誘導し、そしてこれらの細
胞上の細胞表面レセプターに結合したことを実証した。興味深いことに、マウス
骨髄から単離された未成熟の表面ＩｇネガティブＢ細胞前駆体は、ニュートロカ
イン−αに応答して増殖もせず、またリガンドに結合もしなかった。
【０８５０】 ｒニュートロカイン−αのインビボ活性を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウ
ス（３匹／群）に、緩衝液のみ、または０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ
、２ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇのｒニュートロカイン−αを１日２回注射（
ｉ．ｐ．）した。マウスにこの処置を４日間連続して与え、この時点でそれらを
屠殺し、そして分析のために種々の組織および血清を収集した。代替的な実施形
態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の
任意の量のｒニュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。好ましい
実施形態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ（こ
の実施形態における特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが
、これらに限定されない：０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３
ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、
０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／
ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／
ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／
ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／
ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／
ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／
ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／
ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／
ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲の任意の量のｒニュー
トロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。さらに好ましい実施形態では
、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、０．０２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（この実施形態に
おける特に好ましい例示的な投与量としては、以下が挙げられるが、これらに限
定されない：０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、
０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ
／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍ
ｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍ
ｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍ
ｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍ
ｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍ
ｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲の任意の量のｒニ
ュートロカイン−αを１日２回注射（ｉ．ｐ．）する。
【０８５１】 微視的に、ニュートロカイン−α投与の効果は、慣用的なヘマトキシリンおよ
びエオシン（ＨおよびＥ）、ならびにＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）に特異的なｍＡｂ
で免疫組織化学的に染色した脾臓の切片において明白である（図１１Ａ）。正常
な脾臓の構築（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）を、白脾髄周辺帯の劇的な拡大およ
び赤脾髄の細胞性における異なる増加における劇的な発現により変化させた（図
１１Ａ）。周辺帯の拡大は、Ｂ細胞マーカーＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を発現する
増加した数のリンパ球の結果であるようである。さらに、Ｔ細胞の高密度な動脈
周辺リンパ性鞘（ｐｅｒｉａｒｔｅｒｉｏｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｈｅａ
ｔｈ）（ＰＡＬＳ）領域をまた、中程度の数のＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ポジティ
ブ細胞により、浸潤させた。このことは、白脾髄の変化がＢ細胞の増加した数に
起因したことを示唆する。赤脾髄の空間を頻繁に満たした高密度に詰められた細
胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）で染色されなかった。さらなる実験が、関与
する全ての細胞型を特徴付け、そしてニュートロカイン−αが脾臓構築を変化さ
せる機構をさらに規定するために必要とされる。
【０８５２】 ニュートロカイン−α処理した、２ｍｇ／ｋｇで処置したマウス由来の脾臓の
フローサイトメトリー分析は、ニュートロカイン−αが、コントロールマウスに
おいて観察された約１０倍を超える成熟（ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）dull、ＴｈＢ bright ）Ｂ細胞の割合を増加したことを示す（図１１Ｂ）。マウスを、緩衝液、
０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇのニ
ュートロカイン−αで処理した、さらに実施した分析は、０．０８ｍｇ／ｋｇ、
０．８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇが各々成熟（ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）dull、Ｔ
ｈＢbright）Ｂ細胞の割合をコントロールマウスにおいて観察された割合の約１
０倍を超えて増加したことを示したが、緩衝液および８ｍｇ／ｋｇは、およそ等
しい割合の成熟Ｂ細胞を生成した。表ＩＶを参照のこと。
【０８５３】
【表４】 増加した成熟Ｂ細胞のインビボでの提示の潜在的な結果は、血清ＩｇＧ力価に
おける相対的な増加である。従って、血清のＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭレベル
を、緩衝液処置したマウスとニュートロカイン−α処置したマウスとの間で比較
した（図１１Ｃ）。ニュートロカイン−α投与は、それぞれＩｇＡおよびＩｇＭ
の血清レベルにおける２倍および５倍の増加を生じた。興味深いことに、ＩｇＧ
の循環レベルは、増加しなかった。
【０８５４】 さらに、用量依存性応答を、４日間にわたり、種々の量のニュートロカイン−
αで処置したマウスの血清のＩｇＡ力価において観察したが、見かけ上の量依存
性は、２日間にわたる同じ量のニュートロカイン−αの投与によっては、観察さ
れなかった。４日間にわたる投与の場合、８、２、０．８、０．０８および０ｍ
ｇ／ｋｇのニュートロカイン−αの投与は、約８００μｇ／ｍｌ、約７００μｇ
／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌおよび約２００μｇ／ｍｌの
血清のＩｇＡ力価を生じた。すなわち、４日間にわたる８、２、０．８、０．０
８ｍｇ／ｋｇのニュートロカイン−αの投与は、それぞれ、緩衝液のみの投与に
より観察したバックグラウンドまたは基底レベルに対して約４倍、３．７５倍、
２倍および最小倍のＩｇＡ血清レベルにおける増加を生じた。代替的な実施形態
では、これらの実験は、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量のｒニュー
トロカイン−αを用いて実施され得る。好ましい実施形態では、０．０１ｍｇ／
ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量として
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０
２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ
、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍ
ｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍ
ｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍ
ｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍ
ｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍ
ｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍ
ｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍ
ｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍ
ｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇおよび３．０ｍｇ／ｋｇ）の範
囲のニュートロカイン−αを投与する。さらに好ましい実施形態では、０．０２
ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ（この実施形態における特に好ましい例示的な投与量
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：０．０２ｍｇ／ｋｇ、
０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ
／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．
１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．
５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．
９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．
３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．
６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇおよび
２．０ｍｇ／ｋｇ）の範囲のニュートロカイン−αを投与する。
【０８５５】 本明細書中に提示されるデータは、ニュートロカイン−αを、インビボおよび
インビトロでＢ細胞増殖および分化の両方を誘導するＴＮＦ−リガンドスーパー
ファミリーの新規メンバーとして規定する。ニュートロカイン−αは、他のＢ細
胞増殖因子または分化因子（例えば、ＩＬ２（Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら．，
Ｒｅｓ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１４６：４９９−５０５（１９９５））、ＩＬ４（Ａ
ｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２９２：
１２１−３０（１９９１）；Ｙｏｋｏｔａ，Ｔ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：５８９４−９８（１９８６））、ＩＬ５（
Ｔａｋａｔｓｕ，Ｋ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８４：４２３４−３８（１９８７）；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｊ．Ｎ．ら．，
Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．２３：３９８−４０２（１９９３））、ＩＬ６（
Ｐｏｕｐａｒｔ，Ｐ．ら．，ＥＭＢＯ Ｊ．６：１２１９−２４（１９８７）；
Ｈｉｒａｎｏ，Ｔ．ら．，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：７３−７６（１９８６））、
ＩＬ７（Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ｒ．Ｇ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３０２−０６（１９８９）；Ｎａｍｅｎ，Ａ．Ｅ．ら．
，Ｎａｔｕｒｅ ３３３：５７１−７３（１９８８））、ＩＬ１３（Ｐｕｎｎｏ
ｎｅｎ，Ｊ．ら．，Ａｌｌｅｒｇｙ．４９：５７６−８６（１９９４））、ＩＬ
１５（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４８３
−９０（１９９５））、ＣＤ４０Ｌ（Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら．，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３５７：８０−８２（１９９２）；Ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ，Ｃ．および
Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ．ｌｍｍｕｎｏ
ｌ．１１３：３９３−９９（１９９７））またはＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）（Ｏｓ
ｈｉｍａ，Ｈ．ら．，Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１０：５１７−２６（１９９８
）；Ｌｅｎｓ，Ｓ．Ｍ．ら．，Ｓｅｍｉｎ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１０：４９１−９
９（１９９８）））とは、単球特異的な遺伝子／タンパク質発現パターンならび
にその特異的なレセプター分布およびＢリンパ球に対する生物学的活性により区
別される。まとめると、これらのデータは、ニュートロカイン−αがＢ細胞と単
球またはそれらの分化した子孫との間のシグナルの交換に関与するようであるこ
とを示唆する。全てのＢ細胞は、このシグナル伝達の様式を利用し得るが、制限
された発現パターンおよびＩｇ分泌は、ＣＤ５+または「非従来的な」Ｂ細胞応
答の活性化におけるニュートロカイン−αの役割を示唆する。これらのＢ細胞は
、重要な成分を固有の免疫系に提供し、そして多反応性（ｐｏｌｙｒｅａｃｔｉ
ｖｅ）ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の分泌を介して周囲の病原体からの保護を提供す
る（Ｐｅｎｎｅｌｌ，Ｃ．Ａ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１９：１２８
９−９５（１９８９）；Ｈａｙａｋａｗａ，Ｋ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：２４９４−９８（１９８４））。あるいは、
ニュートロカイン−αは、Ｔ細胞依存性抗原活性化におけるＣＤ４０およびＣＤ
４０Ｌの調節因子に類似の様式でＴ細胞依存性応答の調節因子として機能し得る
（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７
８：１５５５−６５（１９９３）；Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５０：３１４１−４７（１９９３））。ニュートロカイン−αに
関して、そのレセプターまたは関連するアンタゴニストは、自己免疫、新生物お
よび／または免疫不全症候群に関連するＢ細胞の障害の処置における有用性を有
する。
【０８５６】 （方法） （マウス）ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲ（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉ
ｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入し、そして推薦される標
準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉ
ｍａｌｓ（１９９９））に従って、再生紙を敷いたマイクロアイソレーターケー
ジ中で維持し（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．、Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、そしてペレット化したげっ歯類の食餌（Ｈａｒ
ｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．）を与え、そして適宜飲用水
をボトルに与えた。この研究で使用された動物プロトコールは、ＨＧＳ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉ
ｔｔｅｅにより検閲されかつ認可された。
【０８５７】 （全長ニュートロカイン−α ｃＤＮＡの単離）ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使
用して、ＴＮＦファミリーのレセプター結合ドメインに対する相同性を有する配
列についてＨｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．の発現配列
タグ（ＥＳＴ）データベースを検索した。全長ニュートロカイン−αクローンを
、同定し、配列決定し、そしてＧｅｎＢａｎｋ（登録番号ＡＦ１３２６００）に
提出した。ニュートロカイン−αオープンリーディングフレームを、推定開始コ
ドンでアニーリングする５’プライマー（５’−ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＣ
Ｃ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＧ
−３’）および推定された下流の終止コドンでアニーリングするように設計した
３’プライマー（５’−ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＣＴＧ Ｃ
ＧＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＴ ＧＧＣ−３’）を使用してＰＣＲ増幅した。得
られた単位複製配列をＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８制限部位を末端に有し、そ
して哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。ニュートロカイン−αをま
た、ｐ−ＣＭＶ−１（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で発現した。
【０８５８】 （組換えヒトニュートロカイン−αの精製）ニュートロカイン−αをコードす
る全長ｃＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターｐＡ２にサブクローニングし
、そしてＳｆ９昆虫細胞へトランスフェクトした（Ｐａｔｅｌ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１１６３−７２（１９９７））。組換えニュートロ
カイン−αを、陰イオン交換カラム、サイズ排除カラムおよび疎水性相互作用カ
ラムの組み合わせを使用して、感染の９２時間後に細胞上清から精製した。精製
したタンパク質を０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃを含む緩衝液（
ｐＨ６）中に処方し、濾過滅菌し、そして必要とされるまで４℃で保存した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ分析の両方は、ｒニュートロカイン−αが
９５％より高い純度であることを示した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬアッ
セイ（Ｃａｐｅ Ｃｏｄ，Ｆａｌｍｏｕｔｈ，ＭＡの提携）における検出限界未
満であった。最終的に精製されたニュートロカイン−αタンパク質は、Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＰｒｏのＮ末端配列を有する。これはは、全長ニュー
トロカイン−α遺伝子で安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株由来の可溶
性ニュートロカイン−αの配列と完全に一致する。
【０８５９】 モノクローナル抗体産生。ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲマウスを、完全なＦｒｅｕ
ｎｄのアジュバント中に懸濁された５０μｇのＨｉｓＴａｇニュートロカイン−
αで免疫し、続いて不完全なＦｒｅｕｎｄのアジュバントで２回チャレンジした
。ハイブリドーマおよびモノクーナル抗体を（Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｓｏ
ｍａｔｉｃ．Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６（１９７７）；Ａｋｅｒ
ｓｔｒｏｍ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２５８９−９２（１９８５
））に記載されるように調製した。
【０８６０】 細胞株。すべてのヒト細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）より購入した
。
【０８６１】 ＦＡＣＳ分析。ニュートロカイン−αの発現を、ヒト細胞株（新たに単離され
た正常末梢血有核細胞）、およびインビトロで培養された単球において評価した
。マウス抗ヒトニュートロカイン−α Ａｂ ２Ｅ５（ＩｇＧ１）、続いてマウ
スＩｇＧ（ＣＡＬＴＡＧ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，
ＣＡ）に対するＰＥ結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗体を用いて使用した。死んだ細胞
を除外するためにヨウ化プロピジウムを用いたＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａ
ｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して細胞を分析した。ニュートロカイン−αの結合
を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン試薬（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ）でのｒニュートロカイン−αビオチン化を使用して評価し、続いて
ＰＥ結合ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎ
ｍａｒｋ）を使用して評価した。
【０８６２】 染色体マッピング。ニュートロカイン−α遺伝子の染色体位置を決定するため
に、個々の染色体を保持するモノ染色体体細胞ハイブリッドのパネル（Ｑｕａｎ
ｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｎａｄａ）を、ニュートロカイン−
α特異的プライマー（５’プライマー：５’−ＴＧＧＴＧＴＣＴＴＴＣＴＡＣＣ
ＡＧＧＴＧＧ−３’および３’プライマー：５’−ＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＣ
ＣＴＧＡＡＣＧＧ−３’）を使用するＰＣＲによってスクリーニングした。予期
された２３３ｂｐのＰＣＲ産物をヒト第１３染色体ハイブリッドにおいてのみ検
出した。８３の放射ハイブリッドのパネル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびＳｔａｎｆｏｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏ
ｍｅ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｈｇｃ．
ｓｔａｎｄｏｒｄ．ｅｄｕ．ＲＨ／ｒｈｓｅｒｖｅｒ）を使用。第１３染色体上
のＳＨＧＣ−３６１７１マーカーに連結したニュートロカイン−αを見出した。
このマップを、ヒト第１３染色体の細胞遺伝学マップに重ねることは、染色体上
のバンド１３ｑ３４に対するヒトニュートロカイン−αの同定を可能にした。
【０８６３】 Ｂリンパ球の増殖アッセイ。ヒト扁桃Ｂ細胞を、ＣＤ３陽性細胞の磁性ビーズ
（ＭＡＣＳ）の減少によって精製した。得られる細胞集団は、ＣＤ１９およびＣ
Ｄ２０の発現によって評価された９５％Ｂ細胞より慣習的に高かった。ヒトｒニ
ュートロカイン−αまたはコントロールタンパク質組み替えヒトＩＬ２の種々の
希釈物を、９６ウェルプレートの個々のウェルに置いた。そのウェルに、培養培
地（１０％ＦＢＳ、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００
μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０-5希釈のパンソルビン（Ｐａｎｓｏ
ｒｂｉｎ）（ＳＡＣ）または抗ＩｇＭを含むＲＰＭＩ １６４０））に懸濁され
た１０5のＢ細胞を１５０μｌの合計量で添加した。因子の添加７２時間後に始
まる、増殖を、3Ｈチミジン（６．７Ｃｉ／ｍＭ）の２０時間のパルス（１μＣ
ｉ／ウェル）によって定量した。
【０８６４】 組織学的分析。脾臓を、１０％の中性緩衝化されたホルマリンに固定し、パラ
フィンに包理し、５μｍで切片化し、ガラススライド上にマウントし、そしてヘ
マトキシリンおよびエオシンで染色するか、またはＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）につ
いて酵素標識された直接法免疫組織化学によって染色した（Ｈｉｌｂｅｒｔ，Ｄ
．Ｍ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２４１２〜１８（１９９３））
。
【０８６５】 （表Ｖ．ニュートロカイン−αの細胞表面の発現） 細胞株 細胞形態学 ニュートロカイン−α の 細胞表面の発現 単球系統 Ｕ−９３７ リンパ腫、組織球性／マクロファージ ＋ ＢＬ−６０ 白血病、急性前骨髄球性 ＋ （ａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ） Ｋ−５６２ 白血病、慢性骨髄形成 ＋ （ｃｈｒｏｎｌｃｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ） ＴＨＰ−１ 白血病、急性単球 ＋ （ａｃｕｔｅｍｏｎｏｃｙｔｉｃ） Ｔ系統 ジャーカット 白血病、Ｔリンパ球 − ＳＵＰ−Ｔ１３ 白血病、Ｔリンパ球 −ＭＯＬＴ−４ 白血病、Ｔリンパ球 − Ｂ系統 Ｄａｕｄｉ バーキット、リンパ芽球 − Ｎａｍａｌｗａ バーキット、リンパ球 − Ｒａｊｉ バーキット、リンパ球 − Ｒｅｈ 白血病、リンパ球 − ＡＲＨ−７７ 白血病、プラズマ細胞 − ＩＭ９ 骨髄腫 − ＲＰＭＩ８２２６ 骨髄腫 − （実施例７：Ｂ細胞の増殖および分化の刺激または阻害を検出するためのアッ
セイ） 機能的体液性免疫応答の産生は、Ｂ系統細胞とその微小環境の間の可溶性およ
び同族のシグナル伝達の両方を必要とする。シグナルは、Ｂ系統細胞がそのプロ
グラムされた発達を続けることを可能にする陽性の刺激、または細胞がその現在
の発達経路を阻止することを可能にする陰性の刺激を与え得る。現在まで、Ｂ細
胞応答性に影響する多数の刺激および阻害シグナルが見出され、それらは、ＩＬ
−２、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ１４
およびＩＬ１５を含む。興味深いことに、これらのシグナルは、それ自体、弱い
エフェクターであるが、種々の共刺激タンパク質と組み合わされて、Ｂ細胞の集
団において活性化、増殖、分化、ホーミング、耐性および死を誘導し得る。 Ｂ細胞共刺激タンパク質の最もよく研究されたクラスの１つは、ＴＮＦスーパー
ファミリーである。それぞれのリガンド、ＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５
３に従って、このファミリーに含まれるＣＤ４０、ＣＤ２７およびＣＤ３０は、
種々の免疫応答を制御することが見出された。これらＢ細胞の集団およびその前
駆体の増殖および分化の検出および／または観察を可能にするアッセイは、増殖
および分化の点で、これらのＢ細胞の集団に対して種々のタンパク質が有し得る
影響を決定する際に有用なツールである。以下に列挙されるのは、Ｂ細胞の集団
およびその前駆体の分化、増殖、または阻害の検出が可能であるように設計され
た２つのアッセイである。
【０８６６】 インビトロアッセイ。精製されたニュートロカイン−αおよび／またはニュー
トロカイン−αＳＶタンパク質または、その切断された形態を、Ｂ細胞の集団お
よびその前駆体における活性化、増殖、分化または阻害および／または死を誘導
するその能力について評価する。０．１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの用量範囲に
わたって定量的に測定された、精製ヒト扁桃Ｂ細胞におけるニュートロカイン−
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質の活性を、標準Ｂリンパ
球共刺激アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、精製扁桃Ｂ細胞を
、１次因子としてホルマリン固定Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
Ｃｏｗａｎ Ｉ（ＳＡＣ）または固定化抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下
で培養する。第２のシグナル（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−５）は、トリチウ
ム化したチミジンの取り込みによって測定されるＢ細胞の増殖を誘発するために
ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋を与える。新規のシナジー因子は、このアッセイを使用
して容易に同定され得る。このアッセイは、ＣＤ３陽性細胞の磁気性ビーズ（Ｍ
ＡＣＳ）の損失によってヒト扁桃Ｂ細胞を単離することを含む。得られる細胞集
団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現によって評価された９５％のＢ細胞より多
い。各サンプルの種々の希釈剤を、１５０μｌの総量で培養培地（１０％ＦＢＳ
、５×１０-5Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプ
トマイシン、および１０-5のＳＡＣの希釈剤を含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁さ
れた１０5Ｂ細胞が添加される９６ウェルプレートの個々のウェルに配置する。
増殖または阻害は、因子の添加、７２時間後に開始する3Ｈチミジン（６．７Ｃ
ｉ／ｍＭ）での２０時間のパルス（１ｕＣｉ／ウェル）によって定量化される。
陽性および陰性コントロールは、それぞれＩＬ２および培地である。
【０８６７】 アゴニスト（ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶ
ポリペプチドフラグメントが挙げられる）は、同じ数のＢ細胞の増殖が、同じ濃
度の刺激因子に接触された場合に観察される増殖と比較した場合、増加したＢ細
胞の増殖を実証する。本発明に従うアンタゴニストは、同じ数のＢ細胞、同じ濃
度の刺激因子、および同じ濃度の可溶性形態のニュートロカイン−α（アゴニス
トの非存在下でＢ細胞の増殖活性における増加を誘発する（例えば、配列番号２
に示されるニュートロカイン−αポリペプチドの７１〜２８５、８１〜２８５、
１１２〜２８５、または１３４〜２８５））を含むコントロールに比較した場合
、減少したＢ細胞の増殖を示す。
【０８６８】 インビボアッセイ。ＢＡＬＢ／ｃマウスに緩衝液のみか、または２ｍｇ／Ｋｇ
のニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質、
またはその切断形態を、１日に２度、（腹腔内）注射した。連続して４日間、こ
の処置を受けたマウスを４日目に屠殺し、種々の組織および血清を分析のために
収集する。正常脾臓およびニュートロカイン−α処理した脾臓および／またはニ
ュートロカイン−αＳＶタンパク質処理した脾臓由来のＨ＆Ｍの比較は、脾臓細
胞におけるニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタン
パク質（例えば、動脈周囲（ｐｅｒｉ−ａｒｔｅｒｉａｌ）リンパ鞘の拡散）の
活性の結果、および／または有核細胞性の赤色脾髄領域（Ｂ細胞の集団の分化お
よび増殖の活性化を示し得る）における有意な増加を同定する。Ｂ細胞マーカー
、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を使用する免疫組織学的研究は、脾臓細胞の任意の
生理的な変化（例えば、脾臓組織崩壊）は、確立されたＴ細胞の領域を浸潤する
大まかに定義されたＢ細胞の区域で増加されたＢ細胞の提示に起因するか否かを
決定するために使用される。
【０８６９】 ニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質処
理されたマウス由来の脾臓のフローサイトメトリー分析は、ニュートロカイン−
αおよび／またはニュートロカイン−αＳＶタンパク質が、コントロールマウス
において観察される割合においてＴｈＢ＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ
Ｂ細胞の割合を特異的に増加するか否かを示すために使用される。
【０８７０】 同様に、インビボにおいて増加した成熟Ｂ細胞の提示の予期された結果は、血
清Ｉｇタイターにおいて相対的に増加した。従って、血清ＩｇＭおよびＩｇＡの
レベルは、緩衝液とニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−α
ＳＶタンパク質処置マウスの間で比較される。
【０８７１】 （実施例８：マウスのリンパ萎縮症および発育不全に関連する対宿主性移植片
病の処置におけるニュートロカイン−αおよびそのアゴニストの効果） 対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）に関連するリンパ萎縮症／発育不全の処置、予
防、および／または診断のためのニュートロカイン−α使用の分析を、（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１（ＣＢＦ１）マウスモデルへのＣ５７ＢＬ／
６親の使用を介して行う。Ｆ１マウスモデルへの、この親はよく特徴付けられて
おり、そして骨髄移植患者における生殖可能なＧＶＨＤの動物モデルである。こ
の親は、当業者には周知である（例えば、Ｇｌｅｉｃｈｅｍａｎｎら、Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ５：３２４，１９８４）。可溶性ニュートロカイン−αは
、Ｂリンパ球の増殖および分化を誘導し、そしてＧＶＨＤのこの動物モデルにお
いて観察されるリンパ萎縮症および発育不全を矯正すると予期される（Ｐｉｇｕ
ｅｔ，ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１２８０（１９８７）；Ｈａｔｔｏｒ
ｉ，ら、Ｂｌｏｏｄ ９０：５４２（１９９７））。
【０８７２】 ＧＶＨＤ条件の開始は、（ＢＡＬＢ／ｃ Ｘ Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆ１マウスへ
のＣ５７ＢＬ／６マウス由来の約１〜５×１０8の脾臓細胞の静脈内注射によっ
て誘導される（両方は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａ
ｉｎｅより入手可能である）。６〜８匹のマウスの群は、０．１〜５．０ｍｇ／
ｋｇのニュートロカイン−αまたは緩衝液コントロールのいずれかを、腹腔内、
筋内または皮内に毎日受ける。それは親細胞の注入の後、リンパ萎縮症および発
育不全が軽症（約５日）、中程度（約１２日）、または重症（約２０日）である
日より始まる。リンパ萎縮症および脾臓の発育不全におけるニュートロカイン−
αの効果は、１０〜３０日の間の複数の時点（３〜４）でＦＡＣＳおよび組織病
理学よって分析される。簡単には、脾細胞は、正常ＣＢＦ１、ＧＶＨＤ、または
ニュートロカイン−α処理されたマウスより調製され、そしてフルオレセインフ
ィコエリトリン結合抗Ｈ−２Ｋｂ、ビオチン結合抗Ｈ−２Ｋｄ、およびＦＩＴＣ
結合抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、または抗Ｂ２２０、続いてＣｙＣｈｒｏｍｅ結合アビ
ジンで染色される。これらの結合抗体のすべては、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａ
ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購入され得る。次いで細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析する。受容者
およびドナーのリンパ球を、それぞれＨ−２Ｋｂ＋Ｋｄ＋およびＨ−２Ｋｂ＋Ｋ
ｄ−細胞として同定する。受容者またはドナー起源のＣＤ＋４Ｔ、ＣＤ８＋Ｔお
よびＢ２２０＋Ｂ細胞の細胞数は、回復された脾細胞の総数から計算し、そして
各々の亜集団の百分率は、３色分析によって決定される。他のＧＶＨＤ関連器官
（肝臓、皮膚、および腸）組織損傷の相対的な程度の組織学的評価は、動物を屠
殺した後、行われ得る。
【０８７３】 最後に、ニュートロカイン−αおよび緩衝処理された動物は、悪液質、体重、
および死亡率を評価するために１日おきに臨床的評価を受ける。
【０８７４】 ニュートロカイン−αアゴニストおよびアンタゴニストは、この急性ＧＶＨＤ
マウスモデルにおいて試験され得る。
【０８７５】 （実施例９．ｓｃＦｖｓのライブラリー由来のニュートロカイン−αポリペプ
チドに対する抗体フラグメントの単離） ヒトＰＢＬから単離された天然に生じるＶ遺伝子は、抗体フラグメントの大き
なライブラリー内に構築された。この抗体フラグメントは、ドナーが曝露されて
も、されなくてもよいニュートロカイン−αおよび／またはニュートロカイン−
αＳＶに対する反応性を含む（例えば、本明細書中にその全体が参考として援用
される米国特許第５，８８５，７９３を参照のこと）。
【０８７６】 （ライブラリーのレスキュー） ｓｃＦｖｓのライブラリーは、ＷＯ９２／０１０４７（本明細書中にその全体
が参考として援用される）に記載されるヒトＰＢＬのＲＮＡより構築される。フ
ァージディスプレイ抗体フラグメントをレスキューするために、ファージミドを
含む約１０9のＥ．ｃｏｌｉを使用して、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリン（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）を含む５０ｍｌの２×ＴＹに播
種し、振とうしながら０．８のＯ．Ｄ．まで増殖させる。５ｍｌのこの培地を使
用して、５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに播種し、２×１０8ＴＵのΔ遺
伝子３ヘルパー（Ｍ３Δ遺伝子ＩＩＩ、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）を
添加し、そして培養物を３７℃で４５分間、振とうしないで培養し、次いで３７
℃で４５分間振とうしながら培養する。培養物を、４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０
分間遠心分離し、そしてペレットを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５
０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２リットルの２×ＴＹに再懸濁し、一晩増殖
させる。ＷＯ９２／０１０４７に記載されるようにファージを調製した。
【０８７７】 Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩを以下のように調製する：Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩヘルパ
ーファージは、遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードせず、それ故、抗体フラグメン
トを示すファージ（ミド）は、抗体への結合のより大きな結合活性を有する。感
染性Ｍ１３Δ遺伝子ＩＩＩ粒子を、ファージ形態形成の間、野生型遺伝子ＩＩＩ
タンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を有する細胞内にヘルパーファージを増
殖させることによって作製する。培養物を、１時間３７℃で振とうしないで培養
し、次いでさらに１時間３７で振とうして培養する。細胞をスピンダウン（ＩＥ
Ｃ−Ｃｅｎｔｒａ８，４００回転／分で１０分）し、１００μｇアンピシリン／
ｍｌ、および２５μｇカナマイシン／ｍｌの両方を含む３００ｍｌの２×ＴＹ（
２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）に再懸濁し、３７℃で振とうしながら一晩培養する
。ファージ粒子を、２回のＰＥＧ沈澱によって培養培地より精製し、そして濃縮
し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０）、２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、そして０．
４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を通過
させ、約１０13形質転換ｕｎｉｔ／ｍｌの最終濃度（アンピシリン耐性クローン
）を得る。
【０８７８】 （ライブラリーパニング） Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅｓ（Ｎｕｎｃ）を、本発明のポリペプチドの１００μｇ
／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌのいずれかの４ｍｌを用いてＰＢＳ中で一晩被膜す
る。チューブを２％Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロックし、
次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０13ＴＵのファージをチューブに適用し、
そして、回転盤で上下に傾けながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさ
らに１．５時間静置しておく。チューブをＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で１
０回、そしてＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを
添加し、そして回転盤上で１５分間上下に回転させることによりファージを溶出
し、その後この溶液を０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４で
直ちに中和する。次いで、溶出したファージを細菌とともに３７℃で３０分間イ
ンキュベートすることにより、ファージを用いて、１０ｍｌの対数増殖中期のＥ
．ｃｏｌｉ ＴＧ１に感染させる。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉを１％グルコースおよ
び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上にプレートする。
次いで、得られる細菌ライブラリーを、上記のようにΔ遺伝子３ヘルパーファー
ジでレスキューし、次の回の選択のためのファージを調製する。次いで、このプ
ロセスを、アフィニティー精製の全４回について反復し、３回目および４回目に
はチューブ洗浄をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２０倍、そしてＰＢＳで
２０倍に増加する。
【０８７９】 （結合剤の特徴付け） 第３回目および４回目の選択から溶出したファージを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＨＢ ２１５１を感染させ、そして可溶性ｓｃＦｖをアッセイのために単一コロ
ニーから生成する（Ｍａｒｋｓら、１９９１）。５０ｍＭ炭酸水素塩、ｐＨ９．
６中の本発明のポリペプチドの１０ピコグラム／ｍｌのいずれかで被膜したマイ
クロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを実行する。ＥＬＩＳＡ中の陽性クロ
ーンをＰＣＲフィンガープリンティング（例えば、ＷＯ９２／０１０４７を参照
のこと）、次に配列決定することによりさらに特徴付ける。
【０８８０】 （実施例１０．抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体でのニュートロカ
イン−α／ニュートロカイン−αレセプター相互作用の中和） 以下の方法に従ってニュートロカイン−αタンパク質に対するモノクローナル
抗体を産生した。簡単には、マウスに、１００μｌの完全Ｆｒｅｕｎｄｓアジュ
バント中に乳化された１００μｌのＰＢＳにおいて、実施例２の方法によって生
成される５０μｇのＨｉｓタグ化ニュートロカイン−αタンパク質の皮下注射を
行った（背側の前面部分）。不完全Ｆｒｅｕｎｄｓアジュバントにおける２５μ
ｇのニュートロカイン−αの３回のさらなる皮下注射を２週間の間隔で与えた。
この動物を１ヶ月間休ませ、その後この動物は、ＰＢＳ中の２５μｇのニュート
ロカイン−αの最後の腹腔内ブーストを受けた。４日後、マウスを屠殺し、そし
て融合のために脾細胞を摘出した。
【０８８１】 「融合」のプロセスは、１つの脾臓由来の脾細胞を融合させることによって達
成され、上記の方法の製造者による改変に従い、ＰＥＧ１５００（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｔｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する２×１０Ｅ７ Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．
６５３プラズマ細胞腫細胞を用いた。（Ｇｅｇｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．らＳｏｎａｔｉ
ｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ３：２３１〜３６（１９７７）；Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＰＥＧ １５００（カタログ番号７８３６４１）製品
に関する文書を参照のこと。） 融合後、細胞を、２０％ＦＢＳおよび４％Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｓｕｐｐｌｅ
ｍｅｎｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）補充した４００ｍｌのＨ
ＡＴ培地に再懸濁し、９６ウェルプレートに、ウエルあたり２００μｌの密度で
分散した。融合後７日で、１００μｌの培地を吸引し、そして１００μｌの新鮮
な培地で置換した。融合後１４日で、ハイブリドーマを抗体産生のためにスクリ
ーニングした。
【０８８２】 ハイブリドーマ上清を、ＥＬＩＳＡによってプレートに固定化されたニュート
ロカイン−αタンパク質の結合についてスクリーニングした。１ｍｌあたり２μ
ｇの濃度で、ウェルあたり１００μｌのニュートロカイン−α（ＰＢＳ中）の一
晩の培養によってニュートロカイン−αで、プレートをコーティングした。ＰＢ
Ｓで１：１０に希釈したハイブリドーマ上清を、ニュートロカイン−αでコーテ
ィングされたプレートの個々のウェルに置き、そして４℃で一晩培養した。次の
日に、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、抗マ
ウスＩｇＧ ＡＢＣ系（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して
発達させる。色の発達反応を、２５ｍｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ2ＳＯ4の添加を用い
て停止させた。次いでそのプレートを４５０ｎｍで読んだ。
【０８８３】 ハイブリドーマ上清を、Ｉｓｏｓｔｒｉｐｓを用いてＩｇアイソタイプについ
て調べた。クローニングを、ＨＴ培地の限界希釈の方法によって行った。０．９
ｍｌのＨＢＳＳ中の約３×１０Ｅ６の細胞は、プリスタンで初回刺激されたマウ
スに注射された。７〜９日後、１９ｇ針を使用して腹水を収集した。すべての抗
体を、Ａｃｔａ ＦＰＬＣシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するタンパク
質Ｇアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０８８４】 第１および第２の連続する腹腔内注射の後、３匹のマウスのすべては、強い免
疫応答を発達した；ニュートロカイン−αでコーティングされたプレートにおけ
るＥＬＩＳＡによって評価された血清タイターは、１０Ｅ−７であった。
【０８８５】 １つの実施形態において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して、１０００以上
の第１のハイブリドーマを生成した。それらの９１７を、抗ニュートロカイン−
α抗体の産生のためにスクリーニングした。スクリーニングを、すべての陽性ク
ローンを検出するために１：１希釈上清を使用して実行した。スクリーニングさ
れた９１７のハイブリドーマの７６が、陽性であることが見出され、そしてそれ
らの１７が、ＩｇＧプロデューサーであると見出された。アフィニティー試験お
よびクローニングの後、それらの９を、さらなる拡大および精製のために選択し
た。
【０８８６】 精製されたモノクローナル抗体のすべては、ウェスタンブロット分析およびＥ
ＬＩＳＡの両方において異なる形態のニュートロカイン−α（Ｈｉｓタグ化およ
びバキュロウイルス系からのタンパク質生成を含む（実施例２参照のこと））に
結合可能であった。９のクローンのうちの６はまた、ＴＨＰ−１細胞の表面上の
ニュートロカイン−αに結合可能であった。しかし、試験された抗体のどれもが
、溶液からニュートロカイン−αを捕獲不可能であった。
【０８８７】 細胞表面上に発現されたニュートロカイン−αを認識するが、溶液中のニュー
トロカイン−αは認識しない、産生された高アフィニティー抗ニュートロカイン
−αモノクローナル抗体は、インビボでの中和研究、およびインビトロでの単球
ならびにＢ細胞のアッセイにおいて使用され得る。これらの抗体はまた、ウェス
タンブロットにおけるニュートロカイン−α感受性の検出について有用である。
【０８８８】 独立した実験において、陽性マウス由来の脾細胞を使用して、１０００以上の
第１ハイブリドーマを生成した。ついで第１のハイブリドーマの７２９を、抗ニ
ュートロカイン−αの抗体の産生についてスクリーニングした。スクリーニング
を、高アフィニティーのクローンのみを得るために１：１０の希釈上清を使用し
てストリンジェントな条件下で行った。スクリーニングされた７２９のハイブリ
ドーマの２３は、陽性であり、１６のＩｇＭおよび７のＩｇＧプロデューサーを
含んだ（後者の間で、４は強いＩｇＭバックグラウンドを得た）。この実験にお
いて、ＩｇＧ抗体のアイソタイプ分布は、ＩｇＧ２サブクラスに偏った。７のＩ
ｇＧハイブリドーマの３は、ＩｇＧ２サブクラスの抗体を産生し、そして２は、
ＩｇＧ２ｂサブクラスの抗体を産生し、一方で残りの２は、ＩｇＧ１プロデュー
サーであった。
【０８８９】 第２の実験において生成されたすべての陽性ハイブリドーマ由来の上清を、Ｂ
細胞のニュートロカイン−α媒介性増殖を阻害する能力について試験した。第１
のスクリーニング実験において、ＩｇＧ中和抗体を産生する２つのハイブリドー
マが、検出された（これらは、抗体１６Ｃ９および１２Ｃ５であった）。さらな
る実験において、ハイブリドーマ（すなわち、１６Ｃ９および１２Ｃ５）のＩｇ
Ｇ中和活性を確認し、そしてハイブリドーマ１５Ｃ１０および４Ａ６由来の２つ
のさらなる強い中和上清を同定した。
【０８９０】 ３つのクローンを引き続いて、インビボで拡大し（１つのクローン（すなわち
、１５Ｃ１０）はまたホローファイバー系で拡大した）、そして抗体をアフィニ
ティークロマトグラフィーによって精製した。３つのクローンすべては、ＴＨＰ
−１細胞の表面上のニュートロカイン−αに結合可能であり、そして溶液よりニ
ュートロカイン−αを結合（すなわち「捕獲」）可能であった。
【０８９１】 具体的には、抗体がニュートロカイン−α／ニュートロカイン−αレセプター
の結合を中和するか否かを決定するために上記の第２の実験において記載される
抗ニュートロカイン−αモノクローナル抗体を使用して実験を行った。簡単には
、ニュートロカイン−αタンパク質を、ＥＺ結合Ｔ ＮＨＳビオチン試薬（Ｐｉ
ｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用してビオチン化した。次いでビオチ
ン化ニュートロカイン−αを、ニュートロカイン−αに結合する細胞表面タンパ
ク質を同定するために使用した。予備的な実験は、ニュートロカイン−αがＢリ
ンパ球上のレセプターに結合することを実証した。
【０８９２】 上記の第２の実験において産生される抗ニュートロカイン−α抗体の封入は、
ニュートロカイン−αレセプターへのニュートロカイン−αの結合を中和した。
特定の実施形態において、抗ニュートロカイン−α抗体１５Ｃ１０は、ニュート
ロカイン−αのニュートロカイン−αレセプターへの結合を中和した。
【０８９３】 従って、上記の第２の実験において産生された抗ニュートロカイン−αモノク
ローナル抗体（特に、抗体１５Ｃ１０）は、膜結合ニュートロカイン−αタンパ
ク質および可溶性ニュートロカイン−αタンパク質の両方を認識し、そして結合
し、ならびにニュートロカイン−α／ニュートロカイン−αレセプターのインビ
トロでの結合を中和する。
【０８９４】 本発明が、上記説明および実施例に特に記載したものとは別のやり方で実施さ
れ得ることは明らかである。本発明の多くの改変および変更が、上記の教示に照
らして可能であり、それゆえ添付の請求の範囲内にある。
【０８９５】 本明細書中で引用された全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌文献、研究室マ
ニュアル、本、または他の文献を含む）の開示が、本明細書中に参考として援用
される。
【０８９６】 さらに、本明細書と共に提出された配列表、および同時係属出願の出願番号９
０９／００５，８７４（１９９８年１月１２日提出）、ＵＳ６０／０３６，１０
０（１９９７年１月１４日提出）、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１７９５７（１９
９６年１０月２５日）において提出された配列表は、各々の場合コンピューター
および紙の形式の両方で、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０８９７】
【表５】 ＡＴＣＣ受託番号９７７６８。
【０８９８】 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０８９９】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９００】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９０１】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９０２】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９０３】 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０４】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０５】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９０６】
【表６】 ＡＴＣＣ受託番号２０３５１８。
【０９０７】 （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９０８】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９０９】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１０】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９１１】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９１２】 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１３】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１４】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９１５】
【表７】 ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５８ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９１６】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９１７】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９１８】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９１９】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９２０】 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２１】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２２】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【０９２３】
【表８】 ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１５９ （カナダ） 出願人は、出願に基づきカナダ国特許が発行されるか、あるいは同出願が拒絶
または放棄されて回復され得なくなるかもしくは取り下げられるまでは、特許庁
長官（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ）が、長官により指名
された独立の専門家に対してのみ出願中で言及された寄託済みの生物学的材料の
サンプルの供与を許可する旨を請求し、出願人は、国際出願の公表のための規則
上の準備が完了する前に、書面によりその旨を国際事務局に告知しなければなら
ない。
【０９２４】 （ノルウェー） 出願人はここにおいて、出願が（ノルウェー特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにノルウェー特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、ノルウェー特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりノルウェー特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、ノルウェー特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２５】 （オーストラリア） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は、特許の付与前において、
あるいは出願の放棄（ｌａｐｓｉｎｇ）、拒絶あるいは取り下げ前において、発
明に対し利害関係を有さない当業者である対象者（ｓｋｉｌｌｅｄ ａｄｄｒｅ
ｓｓｅｅ）に対してのみ行われる旨を、告知するものである（オーストラリア国
特許法第３．２５（３）号規定）。
【０９２６】 （フィンランド） 出願人はここにおいて、出願が（特許および統制委員会（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）により
）公開に付されるかあるいは公開を経ずに国立特許および法規委員会による決定
を受けるまでは、サンプルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を
、請求する。
【０９２７】 （英国） 出願人はここにおいて、微生物のサンプルの供与は専門家に対してのみ利用可
能にされる旨を、請求する。この旨の請求は、出願の国際公表のための規則上の
準備が完了する前に、出願人により国際事務局に対してなされなければならない
。
【０９２８】 （デンマーク） 出願人はここにおいて、出願が（デンマーク特許庁により）公開に付されるか
あるいは公開を経ずにデンマーク特許庁による決定を受けるまでは、サンプルの
供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請求は
、デンマーク特許法第２２条および第３３条（３）に基づき出願が公に利用可能
にされる時点以前に、出願人によりデンマーク特許庁に対してなされるものとす
る。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサンプルの供
与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする。専門家
は、デンマーク特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓｔ ｏｆ
ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、あるいは、
個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９２９】 （スウェーデン） 出願人はここにおいて、出願が（スウェーデン特許庁により）公開に付される
かあるいは公開を経ずにスウェーデン特許庁による決定を受けるまでは、サンプ
ルの供与は当該技術の専門家に対してのみ行われる旨を、請求する。この旨の請
求は、優先日から１６ヶ月が経過するよりも前に、出願人により国際事務局に対
してなされるものとする（好ましくはＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｎｔ’ｓ Ｇｕｉ
ｄｅのＶｏｌｕｍｅ Ｉのａｎｎｅｘ Ｚに記載された書式ＰＣＴ／ＲＯ／１３
４による）。そのような請求が出願人によりなされた場合は、第三者によるサン
プルの供与のいかなる請求においても、利用される専門家を表示するものとする
。専門家は、スウェーデン特許庁により作成された公認専門家のリスト（ｌｉｓ
ｔ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｅｘｐｅｒｔｓ）に記載された任意の者か、
あるいは、個々の場合において出願人により承認された任意の者であり得る。
【０９３０】 （オランダ） 出願人はここにおいて、オランダ特許の発行日まで、あるいは出願が拒絶、取
り下げあるいは放棄（ｌａｐｓｅｄ）される日までは、特許法３１Ｆ（１）の規
定に基づき、微生物は専門家へのサンプル供与の形でのみ行われる旨を、請求す
る。この旨の請求は、オランダ王国特許法の第２２Ｃ条または第２５条に基づき
出願が公に利用可能にされる日のうちいずれか早い方の日付よりも前に、出願人
によりオランダ工業所有権局に対して提出されるものとする。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本発明の実施形態の例示であり、特許請求の範囲に含まれる本
発明の範囲を限定することを意味しない。
【図１Ａ】 図１Ａは、ニュートロカイン−αのヌクレオチド配列（配列番号１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、推定細胞内ドメイ
ンを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、
およびアミノ酸７３〜２８５は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在
的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図１Ａおよび１Ｂのニュートロカ
イン−αアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュー
トロカイン−αヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌク
レオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結
合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αアミノ酸配列中の以下の位置で
見出される：Ｎ１２４〜Ｑ１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−
１２７）およびＮ−２４２〜Ｃ−２４５（Ｎ−２４２、Ｎ−２４３、Ｓ−２４４
、Ｃ−２４５）。 ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮ
Ｆ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整
列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線
を付している。これらの領域は、限定されず、そして図１Ａおよび１Ｂにおいて
保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ
、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、および
ＣＤ−ＸＩとして表示されている。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、ニュートロカイン−αのヌクレオチド配列（配列番号１）および推
定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸１〜４６は、推定細胞内ドメイ
ンを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を引いた配列）を、
およびアミノ酸７３〜２８５は推定細胞外ドメイン（残りの配列）を表す。潜在
的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図１Ａおよび１Ｂのニュートロカ
イン−αアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太字にし、そしてニュー
トロカイン−αヌクレオチド配列中のアスパラギン残基をコードする最初のヌク
レオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を付けている。潜在的なＮ結
合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αアミノ酸配列中の以下の位置で
見出される：Ｎ１２４〜Ｑ１２７（Ｎ−１２４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−
１２７）およびＮ−２４２〜Ｃ−２４５（Ｎ−２４２、Ｎ−２４３、Ｓ−２４４
、Ｃ−２４５）。 ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮ
Ｆ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整
列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線
を付している。これらの領域は、限定されず、そして図１Ａおよび１Ｂにおいて
保存ドメイン（ＣＤ）−１、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＶ、ＣＤ−Ｖ
、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−ＶＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、および
ＣＤ−ＸＩとして表示されている。
【図２Ａ】 図２Ａは、「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡ＊Ｓｔａｒ」と呼ばれる
コンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカイン
−α（配列番号２）およびニュートロカイン−αＳＶ（配列番号１９）、ならび
にＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦα」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５
０２６；配列番号３）、ＴＮＦ−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦβ」；Ｇｅ
ｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号４）、リンホトキシン−β（図２Ａおよ
び２Ｂ中の「ＬＴβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ１１０１６；配列番号５）および
ＦＡＳリガンド（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＦＡＳＬ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ１
１８２１；配列番号６）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。コンセンサス
と適合する残基には、影を付けている。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」ルーチン（「ＤＮＡ＊Ｓｔａｒ」と呼ばれる
コンピュータープログラムの部分である）により決定された、ニュートロカイン
−α（配列番号２）およびニュートロカイン−αＳＶ（配列番号１９）、ならび
にＴＮＦ−α（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦα」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｚ１５
０２６；配列番号３）、ＴＮＦ−β（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＴＮＦβ」；Ｇｅ
ｎＢａｎｋ番号Ｚ１５０２６；配列番号４）、リンホトキシン−β（図２Ａおよ
び２Ｂ中の「ＬＴβ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｌ１１０１６；配列番号５）および
ＦＡＳリガンド（図２Ａおよび２Ｂ中の「ＦＡＳＬ」；ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｕ１
１８２１；配列番号６）のアミノ酸配列間の同一性の領域を示す。コンセンサス
と適合する残基には、影を付けている。
【図３】 図３は、ニュートロカインαアミノ酸配列の分析を示す。記載されたコンピュ
ータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて配列番号２のアミノ酸配列
について予測される、α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および疎水性；
両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面確率を示す。「抗原性指標−
Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」グラフは、ニュートロカインαの高度に抗原性の領
域の位置、すなわち、本発明のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域を示す
。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸配列の約Ｐｈｅ−１１５
〜約Ｌｅｕ−１４７、約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３、約Ｓｅｒ−１７１
〜約Ｐｈｅ−１９４、約Ｇｌｕ−２２３〜約Ｔｙｒ−２４６、および約Ｓｅｒ−
２７１〜約Ｐｈｅ−２７８が挙げられる。 図３に示されるデータはまた、表形態で表１に示される。この列には、「残基
」、「位置」、およびローマ数字でＩ〜ＸＩＶと表示している。この列の見出し
は、図３および表１に示されるアミノ酸配列の以下の特徴をいう：「残基」：配
列番号２ならびに図１Ａおよび１Ｂのアミノ酸残基；「位置」：配列番号２なら
びに図１Ａおよび１Ｂ内の対応する残基の位置；Ｉ：α領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−
Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＩ：α領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；ＩＩＩ：β領域−Ｇａ
ｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＩＶ：β領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ；Ｖ：ター
ン領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩ：ターン領域−Ｃｈｏｕ−Ｆａｓ
ｍａｎ；ＶＩＩ：コイル領域−Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ；ＶＩＩＩ：親水
性プロット−Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；ＩＸ：疎水性プロット−Ｈｏｐｐ
−Ｗｏｏｄｓ；Ｘ：α両親媒性領域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩ：β両親媒性領
域−Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ；ＸＩＩ：可撓性領域−Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚ
；ＸＩＩＩ：抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ；およびＸＩＶ：表面確率
プロット−Ｅｍｉｎｉ。
【図４Ａ】 図４Ａは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定された
ニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、Ｈ
ＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された
本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定された
ニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、Ｈ
ＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された
本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、ＡＴＣＣ番号９７７６８で寄託されたヒトｃＤＮＡから決定された
ニュートロカイン−αヌクレオチド配列と、ＨＳＯＡＤ５５（配列番号７）、Ｈ
ＳＬＡＨ８４（配列番号８）およびＨＬＴＢＭ０８（配列番号９）と指定された
本発明の関連ヒトｃＤＮＡクローンとの整列を示す。
【図５Ａ】 図５Ａは、ニュートロカイン−αＳＶタンパク質のヌクレオチド配列（配列番
号１８）および推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。アミノ酸１〜４６は
推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を
引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２６６は推定細胞外ドメイン（残りの配
列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図５Ａおよび５
Ｂのニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太
字にし、そしてニュートロカイン−αＳＶヌクレオチド配列中のアスパラギン残
基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を
付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αＳＶ
アミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ−１２４〜Ｑ−１２７（Ｎ−１２
４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２２３〜Ｃ−２２６（Ｎ
−２２３、Ｎ−２２４、Ｓ−２２５、Ｃ−２２６）。抗原性ポリペプチドとして
は、配列番号１９のアミノ酸配列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ
−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ
−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１、約Ｉｌｅ
−２４４〜約Ａｌａ−２４９、および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７が挙
げられる。 ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮ
Ｆ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整
列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線
を付している。（ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶの）こ
れらの保存された領域は、図５Ａおよび５Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１
、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−Ｖ
ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。ニュ
ートロカイン−αＳＶは、図１Ａおよび１Ｂの凡例に記載されるＣＤ−ＩＶの配
列を含まない。 ニュートロカイン−αポリペプチド配列（配列番号２）とＡＰＲＩＬ、ＴＮＦ
αとＬＴαとのさらなる整列を図７Ａに示す。図７Ａにおいて、βシート領域を
図７Ａの凡例において以下に記載するように示す。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ニュートロカイン−αＳＶタンパク質のヌクレオチド配列（配列番
号１８）および推定アミノ酸配列（配列番号１９）を示す。アミノ酸１〜４６は
推定細胞内ドメインを、アミノ酸４７〜７２は推定膜貫通ドメイン（二重下線を
引いた配列）を、およびアミノ酸７３〜２６６は推定細胞外ドメイン（残りの配
列）を表す。潜在的なアスパラギン結合型グリコシル化部位は、図５Ａおよび５
Ｂのニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列中のアスパラギンの記号（Ｎ）を太
字にし、そしてニュートロカイン−αＳＶヌクレオチド配列中のアスパラギン残
基をコードする最初のヌクレオチド上にボールドにしたポンド記号（＃）で印を
付けている。潜在的なＮ結合型グリコシル化配列は、ニュートロカイン−αＳＶ
アミノ酸配列中の以下の位置で見出される：Ｎ−１２４〜Ｑ−１２７（Ｎ−１２
４、Ｓ−１２５、Ｓ−１２６、Ｑ−１２７）およびＮ−２２３〜Ｃ−２２６（Ｎ
−２２３、Ｎ−２２４、Ｓ−２２５、Ｃ−２２６）。抗原性ポリペプチドとして
は、配列番号１９のアミノ酸配列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ
−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ
−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１、約Ｉｌｅ
−２４４〜約Ａｌａ−２４９、および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５７が挙
げられる。 ニュートロカイン−αと、ニュートロカイン−αＳＶと、ＴＮＦ−αと、ＴＮ
Ｆ−βと、ＬＴ−βと、最も密接に関連したＦａｓリガンド（これらの配列の整
列を図２に示す）との間の高い同一性の領域は、図１Ａおよび１Ｂにおいて下線
を付している。（ニュートロカイン−αおよびニュートロカイン−αＳＶの）こ
れらの保存された領域は、図５Ａおよび５Ｂにおいて保存ドメイン（ＣＤ）−１
、ＣＤ−ＩＩ、ＣＤ−ＩＩＩ、ＣＤ−Ｖ、ＣＤ−ＶＩ、ＣＤ−ＶＩＩ、ＣＤ−Ｖ
ＩＩＩ、ＣＤ−ＩＸ、ＣＤ−Ｘ、およびＣＤ−ＸＩとして表示されている。ニュ
ートロカイン−αＳＶは、図１Ａおよび１Ｂの凡例に記載されるＣＤ−ＩＶの配
列を含まない。 ニュートロカイン−αポリペプチド配列（配列番号２）とＡＰＲＩＬ、ＴＮＦ
αとＬＴαとのさらなる整列を図７Ａに示す。図７Ａにおいて、βシート領域を
図７Ａの凡例において以下に記載するように示す。
【図６】 図６は、ニュートロカイン−αＳＶアミノ酸配列の分析を示す。記載されたコ
ンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを用いて配列番号１９のアミ
ノ酸配列について予測される、α、β、ターンおよびコイル領域；親水性および
疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指標および表面確率を示す。ニュー
トロカインαタンパク質の高度に抗原性の領域の位置、すなわち、本発明のエピ
トープ保有ペプチドが得られ得る領域を、「抗原性指標−Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏ
ｌｆ」グラフに示す。抗原性ポリペプチドとしては、配列番号１９のアミノ酸配
列の約Ｐｒｏ−３２〜約Ｌｅｕ−４７、約Ｇｌｕ−１１６〜約Ｓｅｒ−１４３、
約Ｐｈｅ−１５３〜約Ｔｙｒ−１７３、約Ｐｒｏ−２１８〜約Ｔｙｒ−２２７、
約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｔｈｒ−２５８、約Ａｌａ−２３２〜約Ｇｌｎ−２４１；
約Ｉｌｅ−２４４〜約Ａｌａ−２４９および約Ｓｅｒ−２５２〜約Ｖａｌ−２５
７からのアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されな
い。 図６に示されるデータは、表Ｉに示されるデータと類似の表形式で容易に示さ
れ得る。図６に開示された正確なデータをこのような表で表すことは、デフォル
トパラメーターに設定されたＤＮＡ＊ＳＴＡＲコンピューター配列分析パッケー
ジのＭｅｇＡｌｉｇｎコンポーネントを使用して行われ得る。これは、本出願の
図３および６を作成するために使用したプログラムと同一である。
【図７】 図７Ａ。ニュートロカイン−αのアミノ酸配列、ならびにその推定リガンド結
合ドメインと、ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦ−αおよびＬＴ−α（具体的には、ヒトＡＰ
ＲＩＬポリペプチド（配列番号２０；ＡＴＣＣ受託番号ＡＦ０４６８８８）のア
ミノ酸残基１１５〜２５０）、ＴＮＦα（配列番号３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
２１５０２６）のアミノ酸残基８８〜２３３、ならびにＬＴα（（ＴＮＦβとも
指定される）配列番号４のアミノ酸残基６２〜２０５；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
Ｚ１５０２６））の推定リガンド結合ドメインとの整列。ニュートロカイン−α
の推定の膜にまたがる領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏ
ｎ）が示され、そしてニュートロカイン−αの切断部位が矢印で示される。線を
引いた重複する領域（ＡからＨ）は、β−プリーツシート領域を示す。 図７Ｂ。ニュートロカイン−α ｍＲＮＡの発現。ニュートロカイン−αのｏ
ｒｆをプローブとして用いて、ヒト組織型のスペクトルおよび癌細部株の選択か
らポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のブロットに対してノーザンハイブ
リダイゼーションブロット分析を行った。２．６ｋｂのニュートロカイン−α
ｍＲＮＡを、胎盤、心臓、肺、胎児肝臓、胸腺および膵臓において高レベルで検
出した。２．６ｋｂのニュートロカイン−α ｍＲＮＡは、ＨＬ−６０およびＫ
５６２細胞株においても検出された。
【図８】 ニュートロカイン−α発現は、ＩＦＮ−γによるヒト単球の活性化後に増加す
る。図８Ａ。インビトロ培養した単球に対するニュートロカイン−αタンパク質
発現のフローサイトメトリー分析。精製単球をＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）の
存在下または非存在下で３日間培養した。次いで、細胞をニュートロカイン−α
特異的ｍＡｂ（２Ｅ５）（実線）またはアイソタイプ適合コントロール（ＩｇＧ
１）（破線）で染色した。これらの独立した実験において３名の異なるドナーか
ら精製された単球で匹敵する結果が観察された。 図８Ｂ。ニュートロカイン−α特異的ＴａｑＭａｎプライマーを調製し、そし
てこれを用いて、非刺激およびＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）処理単球における
相対的ニュートロカイン−α ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。ＴａｑＭａｎ
プライマーのヌクレオチド配列は、以下のとおりである：（ａ）プローブ：
【化３２】 （配列番号２４）； （ｂ）５’増幅プライマー：
【化３３】 （配列番号２５）；および （ｃ）３’増幅プライマー：
【化３４】 （配列番号２６）。
【図９】 ニュートロカイン−αは、強力なＢリンパ球刺激剤である。図９Ａ。ニュート
ロカイン−αの生物学的活性を、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
ｃｏｗａｎ １ ＳＡＣを感作因子として利用して、標準的Ｂリンパ球同時刺
激アッセイにおいて評価した。ＳＡＣ単独では、１４２７＋／−３１６のバック
グラウンド数を得た。三連のウェルの平均＋／−標準偏差として値を報告する。
同様の結果を安定なＣＨＯトランスフェクタントおよび一過性にトランスフェク
トしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞から精製した組換えニュートロカイン−αを用いて
得た。 図９Ｂ。ニュートロカイン−αに対する扁桃Ｂ細胞の増殖、および抗ＩｇＭと
の同時刺激に対する扁桃Ｂ細胞の増殖。個々のウェルをＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ
でヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体で予めコーティングしたことを除いて、ＳＡＣについて
記載したように、バイオアッセイを行った。
【図１０】 正常ヒト末梢血単球および腫瘍細胞株の中でのニュートロカイン−αレセプタ
ー発現。図１０Ａ。ヒト末梢血有核細胞を正常ヒトボランティアから得、そして
密度勾配遠心分離により単離した。細胞をビオチン化ニュートロカイン−α、次
いでＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ１４、ＣＤ５６、およびＣＤ６６に対して特異的な
ＰＥ結合体化ストレプトアビジンおよびＦＩＴＣまたはＰｅｒＣＰカップリング
ｍＡＢで染色した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＢｅｃｔｏｎ Ｄ
ｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎで細胞を分析した。データは、４つの独立し
た実験のうちの１つを示す。 図１０Ｂ。細胞肉腫（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ）細胞株Ｕ−９３７および骨髄
腫株ＩＭ−９に結合するニュートロカイン−α。
【図１１】 ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣＲマウスにおけるニュートロカイン−α投与のインビボ
での効果。図１１Ａ。ホルマリン固定した脾臓をパラフィンに包埋し、そして５
μｍ切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（上パネル）。下パネルは
、同じ動物から採取した切片であり、抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｍＡｂで染色し
、西洋ワサビペルオキシダーゼカップリングウサギ抗ラットＩｇ（マウス吸収）
および基質ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）で発色させた。
スライドをＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０
）発現細胞は褐色に見える。 図１１Ｂ。ＰＥ−ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）およびＦＩＴＣ−ＴｈＢ（Ｌｙ６Ｄ
）で染色した、正常（左パネル）およびニュートロカイン−α処理（右パネル）
のフローサイトメトリー分析。 図１１Ｃ。正常およびニュートロカイン−α処理マウスにおける血清ＩｇＭ、
ＩｇＧ、およびＩｇＡレベル。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/52 37/06 16/24 Ｃ０７Ｋ 14/52 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/24 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１２４，０９７ (32)優先日 平成11年３月12日(1999．3．12) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１２６，５９９ (32)優先日 平成11年３月26日(1999．3．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１２７，５９８ (32)優先日 平成11年４月２日(1999．4．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３０，４１２ (32)優先日 平成11年４月16日(1999．4．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３０，６９６ (32)優先日 平成11年４月23日(1999．4．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３１，２７８ (32)優先日 平成11年４月27日(1999．4．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３１，６７３ (32)優先日 平成11年４月29日(1999．4．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１３６，７８４ (32)優先日 平成11年５月28日(1999．5．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４２，６５９ (32)優先日 平成11年７月６日(1999．7．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４５，８２４ (32)優先日 平成11年７月27日(1999．7．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６７，２３９ (32)優先日 平成11年11月24日(1999．11．24) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１６８，６２４ (32)優先日 平成11年12月３日(1999．12．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７１，１０８ (32)優先日 平成11年12月16日(1999．12．16) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７１，６２６ (32)優先日 平成11年12月23日(1999．12．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１７６，０１５ (32)優先日 平成12年１月14日(2000．1．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローゼン， クレイグ エイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20882， レイトンズビル， ローリング ヒル ロード 22400 (72)発明者 ニ， ジアン アメリカ合衆国 メリーランド 20853， ロックビル， マナーフィールド ロー ド 5502 (72)発明者 エブナー， レインハード アメリカ合衆国 メリーランド 20878， ゲイザーズバーグ， シェルバーン テ ラス ナンバー316 9906 (72)発明者 ユ， グオ−リアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94705， バークレイ， グラバット ドライブ 242 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA04 DA02 DA05 DA11 EA02 EA03 EA04 FA02 GA01 GA11 GA25 HA01 HA03 HA11 4B064 AG02 AG26 CA01 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA90X AA93Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA06 AA07 BA01 BA22 CA53 DA01 ZB072 ZB082 ZB092 ZB262 ZB332 ZB352 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA01 DA75 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同一
    であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子
    ： （ａ）図１Ａおよび１Ｂ中の完全なアミノ酸配列（配列番号２）を有するニュー
    トロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローン
    によってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペ
    プチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞外ドメインをコードするヌクレオ
    チド配列； （ｄ）ニュートロカイン−αポリペプチド膜貫通ドメインをコードするヌクレオ
    チド配列； （ｅ）ニュートロカイン−αポリペプチ細胞内ドメインをコードするヌクレオチ
    ド配列； （ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く可
    溶性ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）に記載の任
    意のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが図１Ａおよび１Ｂにおける完全なヌ
    クレオチド配列（配列番号１）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂにおける完全な
    アミノ酸配列（配列番号２）を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコー
    ドする図１Ａおよび１Ｂにおけるヌクレオチド配列（配列番号１）を有する、請
    求項１に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａおよび１Ｂに示される細胞
    外ドメインを含む可溶性ニュートロカイン−αをコードするヌクレオチド配列（
    配列番号２）を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 以下からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一
    のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号２の残基ｎ〜２８５からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列であって、ここでｎは、２〜１９０の範囲の整数
    である、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の残基１〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
    ードするヌクレオチド配列であって、ここでｍは、２７４〜２８４の範囲の整数
    である、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２の残基ｎ〜ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
    ードするヌクレオチド配列であって、ここでｎおよびｍは、それぞれ上記の（ａ
    ）および（ｂ）において定義されるような整数である、ヌクレオチド配列；およ
    び （ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローン
    によってコードされる完全なニュートロカイン−αアミノ酸配列の一部からなる
    ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで該一部は、該完全
    なアミノ酸配列のアミノ末端から１〜１９０のアミノ酸およびＣ末端から１〜１
    １のアミノ酸を除外する、ヌクレオチド配列。
  6. 【請求項６】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有
    する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンの完全なヌクレオチド配列を有する、請
    求項１に記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有
    する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配
    列を有するニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    有する、請求項１に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有
    する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる細胞外ドメインを
    含む可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
    有する、請求項１に記載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、また
    は（ｆ）におけるヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌク
    レオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイ
    ズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子であって、ここで、該ハイ
    ブリダイズするポリヌクレオチドが、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌク
    レオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブ
    リダイズしない、単離された核酸分子。
  10. 【請求項１０】 請求項１の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、ま
    たは（ｆ）におけるアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αポリペプチドの
    エピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離
    された核酸分子。
  11. 【請求項１１】 以下からなる群から選択されるニュートロカイン−αポリ
    ペプチドのエピトープ保有部分をコードする、請求項１０に記載の単離された核
    酸分子：約Ｐｈｅ−１１５〜約Ｌｅｕ−１４７のアミノ酸残基（配列番号２）を
    含むポリペプチド；約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３のアミノ酸残基（配列
    番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ−１７１〜約Ｐｈｅ−１
    ９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ−２２３〜約
    Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；および約Ｓ
    ｅｒ−２７１〜約Ｐｈｅ−２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプ
    チド。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載の単離された核酸分子を、ベクター中に挿
    入する工程を包含する、組換えベクターを作製するための方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法によって生成される組換えベクタ
    ー。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の組換えベクターを、宿主細胞に導入す
    る工程を包含する、組換え宿主細胞を作製する方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の方法によって産生される、組換え宿主
    細胞。
  16. 【請求項１６】 ニュートロカイン−αポリペプチドを産生するための組換
    え方法であって、該ポリペプチドが発現されるような条件下で請求項１５に記載
    の組換え宿主細胞を培養する工程、および該ポリペプチドを回収する工程を包含
    する、方法。
  17. 【請求項１７】 以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同
    一のアミノ酸配列を含む、単離されたニュートロカイン−αポリペプチド： （ａ）図１Ａおよび１Ｂ（配列番号２）における完全なアミノ酸配列を有する、
    ニュートロカイン−αのアミノ酸配列； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号９７７６８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクローン
    によってコードされる完全なアミノ酸配列を有する、ニュートロカイン−αのア
    ミノ酸配列； （ｃ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞外ドメインのアミノ酸配列； （ｄ）ニュートロカイン−αポリペプチド膜貫通ドメインのアミノ酸配列； （ｅ）ニュートロカイン−αポリペプチド細胞内ドメインのアミノ酸配列 （ｆ）ドメインを含む可溶性ニュートロカイン−αポリペプチドのアミノ酸配列
    ；および （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチド
    のいずれか１つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
  18. 【請求項１８】 ニュートロカイン−αタンパク質のエピトープ保有部分を
    含む請求項１７に記載のポリペプチドであって、ここで、該部分は以下からなる
    群から選択される：約Ｐｈｅ−１１５〜約Ｌｅｕ−１４７のアミノ酸残基（配列
    番号２）を含むポリペプチド；約Ｉｌｅ−１５０〜約Ｔｙｒ−１６３のアミノ酸
    残基（配列番号２）のアミノ酸残基を含むポリペプチド；約Ｓｅｒ−１７１〜約
    Ｐｈｅ−１９４のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；約Ｇｌｕ−
    ２２３〜約Ｔｙｒ−２４６のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリペプチド；
    約Ｓｅｒ−２７１〜約Ｐｈｅ−２７８のアミノ酸残基（配列番号２）を含むポリ
    ペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１７に記載のニュートロカイン−αポリペプチドに
    特異的に結合する、単離された抗体。
  20. 【請求項２０】 請求項１７に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能
    なキャリアを含む、薬学的組成物。
  21. 【請求項２１】 改変されたニュートロカイン−αタンパク質をコードする
    単離されたポリヌクレオチドであって、ここで少なくとも１つの保存的なアミノ
    酸置換を除き、該改変されたペプチドは、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２８５； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜２８５； （ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜４６； （ｄ）配列番号２のアミノ酸４７〜７２；および （ｅ）配列番号２のアミノ酸７３〜２８６ からなる群より選択されるメンバーに同一なアミノ酸配列を有する、ポリヌクレ
    オチド。
  22. 【請求項２２】 改変されたニュートロカイン−αポリペプチド分子であっ
    て、ここで少なくとも１つの保存的なアミノ酸置換を除き、該改変されたペプチ
    ドは、以下： （ａ）配列番号２のアミノ酸１〜２８５； （ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜２８５； （ｃ）配列番号２のアミノ酸１〜４６； （ｄ）配列番号２のアミノ酸４７〜７２；および （ｅ）配列番号２のアミノ酸７３〜２８６ からなる群より選択されるメンバーに同一なアミノ酸配列を有する、ポリペプチ
    ド分子。
  23. 【請求項２３】 以下からなる群から選択される配列に少なくとも９５％同
    一の配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： （ａ）配列番号７のヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号８のヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号９のヌクレオチド配列； （ｄ）図１Ａおよび１Ｂに示される配列（配列番号１）の一部のヌクレオチド配
    列であって、ここで、該部分は、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２４４２の少な
    くとの３０の連続したヌクレオチドを含み、ヌクレオチド１３８７〜１４２１の
    配列、ヌクレオチド９〜３８２の配列、ヌクレオチド１６７４〜１９９６の配列
    、ヌクレオチド１４０１から１７８４の配列、ヌクレオチド９００〜１２３７の
    配列、およびこれらの配列内に位置する任意のフラグメントを除外するヌクレオ
    チド配列；および （ｅ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、または（ｄ）におけるヌクレオチド配列
    のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
  24. 【請求項２４】 以下からなる群より選択される配列に対して少なくとも９
    ５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸
    分子： （ａ）図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１９）において完全なアミノ酸配列を有する
    ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３５１８を有する寄託物に含まれるｃＤＮＡクロー
    ンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するニュートロカイン−αＳＶ
    ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｃ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌ
    クレオチド配列； （ｄ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの膜貫通ドメインをコードするヌ
    クレオチド配列； （ｅ）ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドの細胞内ドメインをコードするヌ
    クレオチド配列； （ｆ）細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く、
    可溶性ニュートロカイン−αＳＶポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
    および （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）におけるヌ
    クレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
  25. 【請求項２５】 請求項１９に記載の単離された抗体であって、ここで該単
    離された抗体は、配列番号２のタンパク質のニュートロカイン−αレセプターへ
    の結合を阻害する、抗体。
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