JP2003519167A - 微生物による接着を阻害するための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、概して、細胞、組織、細胞外マトリックス、歯、及び／又は義歯への微生物による接着の酵素的低減のための組成物及び方法に向けられている。本発明の組成物には、細胞、組織、又は表面への微生物の結合を低減することができる酵素を含有する医薬組成物、口内ケア組成物が含まれる。適する酵素には、ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼが含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】

本発明は、概して、細胞、組織、細胞外マトリックス、歯、プロテーゼ、及び
医療用デバイスのような表面への微生物による接着の酵素的低減のための組成物
及び方法に向けられている。本発明の組成物には、細胞、組織、又は表面への微
生物の結合を低減することができる１種又はそれを越える酵素を含有する医薬組
成物、口内ケア組成物、及び清浄剤組成物が含まれる。適する酵素には、ポリフ
ェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが含まれる。

【０００２】

【発明の背景】

幾つかの病原性微生物の中の薬剤耐性の出現は、感染と闘うための代替手法に
ついての研究を余儀なくさせる。研究者は、感染する微生物に有毒な物質を発見
し且つ研究してきた。研究者の何人かは、感染の早期を阻害することにより病気
と闘うことを模索する。これら早期には、有害な感染を成立させるのに必要条件
であることができる微生物による宿主組織への接着が含まれる。微生物による接
着を低減することは、感染を防止することができるので、それ故に病気を予防で
きる。微生物による接着を理解することが押し進められてきた（Ofek,1.and Doy
le R.J.,Bacterial Adhesion to Cells and Tissues.Chapman and HA New York(
1994)）。微生物による接着を低減するための公知の戦略には、微生物上のアド
ヘシン分子（ashesin molecule）と宿主細胞又は組織上の糖との間の相互作用を
阻害することに炭水化物類縁体を使用することが含まれる（Zopf, D.et al, Adv
. Exp. Med. Biol. 408:35-8(1996)）。これら類縁体は、微生物の１又はそれを
越えるレクチンに対応する様々な構造を有する炭水化物を含む炭水化物カクテル
（coctail）の部分であることができる（Beuth,S. et al., Adv. Exp. Med. Bio
l. 408:51-56(1996)）。接着が加わった変異体への微生物による表現型スイッチ
ングを防止するのに遺伝子調節を操作することが、微生物による接着を低減する
ためのもう１つの戦略を提供する（Kahane,I. et aL, Adv. Exp. Med. Biol. 40
8:107-111(1996)）。

【０００３】 研究者は、口腔内においてストレプトコッカス（Streptococcus）変異体が歯
表面上に堆積したグルカンに接着すると報告している（Koga, T. et al., J. Ge
n. Microbiol. 132:2873-2883(1986)）。そのような接着は、食物スクロースを
酸へ代謝し、歯エナメルを破壊して最終的には虫歯をもたらすストレプトコッカ
ス変異体の能力を増強すると考えられる。ストレプトコッカス変異体及び他の口
内ストレプトコッカス類は、表面に結合したグルカンに接着するため、グルカン
結合レクチン（ＧＢＬ）と呼ばれる表面タンパク質を使用する（Gibbons, R. J.
et al, J. Bacteriol. 98:341-346(1969)）。Drakeらは、ＧＢＬ結合を試験す
るために、水溶性高分子量デキストラン及びＳ．クリセタス（S. cricetus）の
全細胞懸濁液を使用するin vitroモデル系を開発した（Drake, D. et al., Infe
ct. Immun. 56:1864.4872(1988); Drake, D. et al., Infect. Immun. 56:2205-
2207(1988)）。そのグルカン結合は、分光光度計で定量可能な凝集をもたらす。

【０００４】 細菌及びウイルスからの幾つかの特異的結合性レクチンの活性部位の分析は、
チロシン及び／又はアスパラギン残基がそれら活性部位に存在することを具体的
に示した。しかしながら、現在まで、微生物のアドヘシン分子上のチロシン又は
アスパラギン残基の酵素的修飾は、微生物による接着を低減することに活用され
ていない。微生物での感染により引き起こされる病害の蔓延、そしてこれら感染
と闘うのに費やされる医療努力及び費用から、微生物による感染と闘うための追
加的且つ改良された組成物及び方法についての要求が存在する。また、微生物に
よる動物組織へ及びその中への接着を低減するため並びに微生物による義歯への
接着を低減するための追加的且つ改良された組成物及び方法についての要求が存
在する。

【０００５】

【発明の要旨】

本発明は、概して、細胞、組織、細胞外マトリックス、歯、プロテーゼ、及び
医療用デバイス、及び／又は他の表面への１種又はそれを越える微生物による接
着の酵素的低減のための組成物及び方法に向けられている。本発明における使用
に好ましい酵素には、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが含ま
れる。

【０００６】 一の態様では、本発明は、表面への微生物の結合を低減する方法を含み、その
微生物上の炭水化物結合性部位のようなアドヘシン（adhesin）を酵素的に修飾
することを含む。好ましい酵素的修飾には、ポリフェノールオキシダーゼ及び／
又はアスパラギナーゼが使用される。他の態様においては、本発明は、哺乳動物
組織又は細胞への微生物による接着を低減する方法を提供する。その方法は、一
種の微生物又は複数種の微生物によるそのような接着を阻害するか又は破壊する
のに有効量のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような
酵素を動物に投与することを含むことができる。動物への酵素の投与は、動物組
織若しくは細胞での又はその中の微生物の存在部位まで酵素を送り届けるのに適
するあらゆる方法により達成される。例えば、動物への酵素の投与は、経口又は
局所的であることができる。投与は、場合により、組織破壊性病原体により感染
した動物組織、又は動物の鼻、耳、膣、皮膚、肺若しくは消化管を標的にするこ
とができる。

【０００７】 他の態様では、本発明は、口内組織若しくは細胞へ又は義歯への微生物による
接着を低減するのに有効量のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギ
ナーゼのような酵素、及び口内ケア組成物に適するキャリヤーを含む口内ケア組
成物を提供する。本発明の口内ケア組成物は、うがい薬、練り歯磨き、インプラ
ント、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されず、そして、場合により
固体、半固体、液体、又はエアロゾルの形態であり得る。

【０００８】 また他の態様では、本発明は、哺乳動物口内組織若しくは細胞へ又は義歯への
微生物による接着を低減するための方法を提供する。本法は、微生物による接着
を低減するのに有効量のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナー
ゼのような酵素を含む口内ケア組成物を哺乳動物の口腔に投与することを含み得
る。この方法の利点は、一種又はそれを越える微生物による歯への接着を低減す
ること；虫歯、歯垢又は結石を低減すること；微生物の共凝集を低減すること；
ペリクル形成を低減すること；グルコシルトランスフェラーゼを阻害すること；
又はそれらの組合せを含むことができる。

【０００９】 哺乳動物の口腔への口内ケア組成物の投与は、その口腔まで組成物を送り届け
るのに適するあらゆる方法により達成することができる。例えば、口内ケア組成
物の投与は、液体で濯ぐこと；歯ブラシ、綿棒若しくはシリンジで半固体を適用
すること；固体をインプラントすること；又はそれらの組合せを含むことができ
る。場合により、口内ケア組成物を口腔内又は口腔外で義歯を処置するのに使用
することができる。そのような処置は、哺乳動物の口腔から取り出した義歯に、
微生物による接着を低減するのに有効量のポリフェノールオキシダーゼ、アスパ
ラギナーゼ、及び／又は他の酵素を適用することを含むことができる。

【００１０】

【好ましい態様の詳細な説明】定義 本明細書中に使用されるように、細胞、組織又は表面への微生物の結合若しく
は接着を低減するか又は阻害する酵素には、細胞と接触したときに、好ましくは
、その微生物を死滅させることも増殖を停止させることもなく、細胞、組織又は
表面へのその微生物の結合若しくは接着を低減するか又は阻害するあらゆる酵素
が含まれる。そのような酵素は、好ましくは、結合部位チロシン及び／又はアス
パラギン持つアドヘシン、炭水化物結合性部位、又は他のアドヘシンのような微
生物上のアドヘシンを酵素的に修飾する。例えば、そのような酵素は、その微生
物上の分子を修飾するための反応を触媒することができる。そのような反応には
、アミノ酸の側鎖の修飾が含まれる。本発明の方法又は組成物中に使用される酵
素は、例えば、微生物上のレクチン又は他の炭水化物結合性部位のようなアドヘ
シンの結合部位に見られるアミノ酸の修飾のような反応を触媒することができる
。好ましくは、その酵素は、アスパラギン及び／又はチロシン残基のようなアド
ヘシン分子によって結合するために重要な残基の側鎖を修飾する。本発明の方法
及び組成物中に使用されることができる好ましい酵素には、ポリフェノールオキ
シダーゼ、アスパラギナーゼ、及びそれらの組合せが含まれる。

【００１１】 本明細書中に使用される“アスパラギナーゼ”は、アスパラギンの側鎖アミド
基のカルボキシル基への加水分解を触媒する酵素活性を意味する。つまり、アス
パラギナーゼは、タンパク質中のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への変
換を触媒する。適するアスパラギナーゼは、あらゆる様々な生物に由来すること
も、天然供給源から単離されても、組換え体法で製造されてもよい。アスパラギ
ナーゼには、Ｅ．Ｃ．番号３．５．１．１により同定される酵素が含まれる。

【００１２】 本明細書中に使用される“ポリフェノールオキシダーゼ”は、モノフェノール
類及び／又はオルトジフェノール類のオルトジキノン類への酸化を触媒する酵素
活性を意味する。本明細書中に使用されるポリフェノールオキシダーゼには、カ
テコールオキシダーゼ、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、ラッカーゼ、クレ
ゾラーゼ、チロシナーゼ、フェノラーゼ、カテコラーゼ、及びフェノールオキシ
ダーゼとして知られる酵素が含まれる。そのフェノールオキシダーゼには、ＥＣ
番号１．１４．１８．１及び１．１０．３．１が与えられた酵素が含まれる。本
発明のポリフェノールオキシダーゼは、植物及び真菌を含む様々な生物中に見出
すことができ、典型的には銅含有オキシドレダクターゼである。本発明における
使用に好ましいポリフェノールオキシダーゼは、好熱性真菌中に見出され且つそ
こから単離され、より好ましくは、ポリフェノールオキシダーゼ遺伝子を宿主細
胞中に含有するベクターを発現させることにより組換え体として製造される。本
発明における使用に好ましい他のポリフェノールオキシダーゼは、当該技術分野
において、ポリフェノールオキシダーゼ、モノフェノールモノオキシゲナーゼ、
チロシナーゼ、フェノラーゼ、カテコラーゼ、又はフェノールオキシダーゼとし
ても言及されるＥＣ番号１．１４．１８．１が割り当てられたポリフェノールオ
キシダーゼである。

【００１３】 ポリフェノールの任意の供給源には、マッシュルーム、植物、及び好熱性真菌
が含まれる。ポリフェノールオキシダーゼの適する任意の供給源は、Somkuti G.
et al. Biotechnology Letters 15:773-78(1993)を含む科学技術文献に記載さ
れている。ポリフェノールオキシダーゼは、その酵素の天然供給源からの単離又
は精製によるか、或いは適する宿主細胞中にポリフェノールオキシダーゼ遺伝子
を含有するベクター又はプラスミドの組換え発現とそれに続くその宿主細胞から
の単離及び精製により調製されることができる。

【００１４】 ポリフェノールオキシダーゼは、当業者に知られている様々な生物から単離又
は精製されている。例えば、ポリフェノールオキシダーゼは、phillipsn et al.
J. Basic Microbiol. 31(4)293-300(1991)により報告されたように、ストレプ
トミセス・ミシガネシス（Streptomyces michiganensis）から単離されている。
幾つかのポリフェノールオキシダーゼタンパク質が配列決定され、且つそれらの
構造が特徴付けられている。これらには、ストレプトコッカス・サーモフィルス
（Streptococcus thermophilus）、スロレプトミセス・ガローセンス（Streptom
yces glauscens）、ニューロスポラ・クラサ（Neurospora crassa）、及びそれ
らに類したもののような微生物からの酵素；及びソラマメ、ポテト、トマト、及
びそれらに類したもののような植物からの酵素が含まれる。例えば、上記のsomk
uti et al. Stelfens et al. in Genetic Engr Plant Secondary Metabolism (E
llis B.E. et al. eds.) Plenum Press, NY, pp. 275-312(1994)を参照されたい
。幾種かのポリフェノールオキシダーゼをコードする遺伝子又はｍＲＮＡが、標
準的な方法を用いて配列決定され且つ宿主細胞中で発現されている。これらには
、ソラマメ及びその他のもののような植物からの酵素が含まれる。ポリフェノー
ルオキシダーゼは、当業者に知られている方法を用いてクローニングされ且つ宿
主細胞中で発現されている。例えば、Robinson S.P et al. Plant Physiol. 99:
317-323(1992); and Lax, A.R. et al.を参照されたい。

【００１５】 本発明における使用に好ましいポリフェノールオキシダーゼは、ジフェノール
よりも優先的にモノフェノールの酸化を触媒する能力；微生物による接着に関与
するアドヘシン分子の１つ又はそれを越えるチロシン残基の酸化を触媒する能力
；及びポリマーコーティング、プラスチック又は金属よりに優先するチロシン含
有基層（tyrosine containing substrata）への特異性の１つ又はそれを越える
能力を含む特性を有する。

【００１６】 本明細書中に使用される“組換え”酵素は、人間によりそのＤＮＡレベルで操
作された酵素を意味する。例えば、その酵素をコードするＤＮＡは、異種宿主細
胞中で発現されることができる。別のやり方では、天然に存在する酵素をコード
するＤＮＡ配列が、天然に存在する酵素と対比してその酵素配列中に１つ又はそ
れを越えるアミノ酸の置換、挿入、又は欠失をコードする突然変異ＤＮＡ配列を
調製するために修飾される。

【００１７】 本明細書中に使用される“微生物”とは、真核生物、原核生物、又はウイルス
を含む微生物をいい、それには、細菌（グラム陽性又はグラム陰性のいずれかで
ある）、真菌、ウイルス、原生動物、及び他の微生物、又は微視的生物を含むが
、これらに限定されない。

【００１８】 本明細書中に使用される“アドヘシン分子”又は“アドヘシン”は、微生物の
表面上に典型的に発現されるものであって、細胞、組織、細胞外マトリックス、
歯、義歯、医療用デバイス若しくはカテーテル、又は他の表面への微生物による
接着を媒介する、分子又は分子の複合体を意味する。幾種かの接着分子は、他の
細胞、組織、又は細胞外マトリックスの表面上のレセプターに結合する。幾種か
の接着分子は、歯、歯肉、義歯、及び口腔内の他の組織を被覆するポリサッカラ
イドに接着する。幾種かの接着分子は、中耳、膣及びそれらに類したものを含む
体腔並びにこれら体腔内の組織を被覆するポリサッカライド又は他の分子に接着
するか；或いはこれら体腔に感染する他の微生物に接着する。アドヘシンには、
微生物の表面上の炭水化物結合性タンパク質又は部位、及び結合部位チロシン残
基及び／又は結合部位アスパラギン残基を持つアドヘシン（チロシン依存性アド
ヘシン、アスパラギン依存性アドヘシン、又はチロシンとアスパラギン依存性ア
ドヘシンとも称する）が含まれる。アドヘシン分子には、レクチン、グルコシル
トランスフェラーゼ、リポテイコ酸、疎水素（hydrophobin）、外膜タンパク質
、鞭毛、線毛、性線毛、原繊維（fibrillae）、及びそれらに類したものが含ま
れる。

【００１９】 本明細書中に使用される“結合部位チロシン残基”とは、そのアドヘシン分子
が接着する結合部位を形成することによるような、微生物による接着に関与する
アドヘシン分子のチロシン残基をいう。そのようなチロシン残基は、この結合部
位にその場で又はその近くで影響するものでも、又はその結合部位にとって重要
なものであってもよい。例えば、多種多様な細菌アドヘシンレクチンは、チロシ
ンを炭水化物結合性部位の一部として使用し、結合部位自体の一部として且つ／
又はその結合部位の形状を維持するタンパク質構造の一部としてでもよい。

【００２０】 本明細書中に使用される“結合部位アスパラギン残基”とは、そのアドヘシン
分子が接着する結合部位を形成することによるような、微生物による接着に関与
するアドヘシン分子のアスパラギン残基をいう。そのようなアスパラギン残基は
、この結合部位にその場で又はその近くで影響するものでも、又はその結合部位
にとって重要なものであってもよい。例えば、多種多様な細菌アドヘシンレクチ
ンは、アスパラギンを炭水化物結合性部位の一部として使用し、結合部位自体の
一部として且つ／又はその結合部位の形状を維持するタンパク質構造の一部とし
てでもよい。

【００２１】 本明細書中に使用される“微生物による接着”とは、細胞、組織、細胞外マト
リックス、歯、義歯、又は洗浄剤若しくは清浄剤により清浄化される堅い表面を
含む他の表面への微生物の結合をいう。その表面は、口腔、膣、中耳、又はそれ
らに類したところのような体腔の表面であることができる。

【００２２】 本明細書中に使用される“微生物による接着を低減する”又は“微生物による
接着を低減すること”とは、細胞、組織、細胞外マトリックス、歯、及び／又は
義歯への又はその上に微生物が接着してコロニー形成する他のあらゆる表面への
微生物による接着量を減少させることをいう。接着の減少は、対照実験の細胞、
組織、細胞外マトリックス、歯、及び／又は義歯との比較を使用して観察しても
、対照実験の個体数との比較を使用して観察してもよい。一般的には、“低減す
る”又は“低減すること”とは、阻害する若しくは阻害すること、減少する若し
くは減少すること、又は破壊する若しくは破壊すること、及びそれらに類した用
語として表現されることもできる。微生物による接着について対照実験値に満た
ないとの統計学的有意性で測定可能な量によるところの微生物による接着の低減
とは、“有意に低減した微生物による接着”として表現されることができる。ま
た、微生物による接着の有意な低減は、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又は
アスパラギナーゼのような酵素での微生物の処置へ望まれる生物学的効果を、好
ましくは、この効果の微生物による接着との相関性を含めて具体的に示すことに
より測定されることができる。

【００２３】 本明細書中に使用される“体腔”とは、口腔、膣、直腸、腸管、中耳、鼻孔（
外鼻孔）、洞（cinus）、喉、食道、耳管、気管支、膀胱、尿道、及びそれらに
類したところのような動物の身体に見られるあらゆる腔をいう。

【００２４】 本明細書中に使用される“義歯”とは、１つ又はそれを越える動物の歯又は他
の口内構造体についての置換体をいい、単一の歯、あらゆるタイプの入れ歯、あ
らゆるタイプの架工入れ歯の置換体が含まれる。義歯は、動物の口腔内に固定さ
れたものでも、動物の口腔から取り外し可能なものでもよい。本明細書中に使用
される“入れ歯”とは、部分入れ歯、総入れ歯、固定入れ歯、及び取り外し可能
な入れ歯を含むあらゆるタイプの入れ歯をいう。

【００２５】 本明細書中に使用される“表面”とは、それに微生物が結合又は接着できるあ
らゆる表面をいう。表面には、細胞、組織、細胞外マトリックスが含まれる。表
面には、あらゆるカテーテル；インプラント；プロテーゼ；或いは哺乳動物の身
体又は体腔の中かその上に存在するか若しくは入れられる人工デバイスの表面も
含まれる。表面には、腹膜透析装置、腎透析装置、人工心臓／肺臓、及びそれら
に類したもののような、哺乳動物の外部であるが、哺乳動物又はその哺乳動物の
体液若しくは組織に接触する医療用デバイスの表面のように、そこに微生物が結
合し得る他の表面も含まれる。表面には、醸造装置、発酵装置、排水処理装置、
並びに他の反応器及び装置の中のような、微生物が接着できる装置又は器具内の
表面も含まれる。表面には、洗浄剤又は他の清浄剤により清浄化される堅い表面
が含まれる。

【００２６】 本明細書中に使用される“処置すること”、“処置”、及び“治療”とは、治
癒的療法、感染防止療法、及び予防療法をいう。処置すること、処置、及び治療
は、症候の障害の重篤さ又は状態を低減するか又は改善するものでも、その障害
を治癒するものでもよい。

【００２７】 本明細書中に使用される“哺乳動物”という用語は、動物として分類されてい
るあらゆる哺乳動物いい、それにはヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコが含まれる。
本発明の好ましい態様において、哺乳動物はヒトである。

【００２８】 本明細書中に使用される“動物”という用語は、鳥類、哺乳類、爬虫類、両生
類、及びそれらに類したものを含む脊椎動物をいう。好ましい動物には、哺乳類
及び鳥類が含まれる。

【００２９】 本明細書中に使用される“医薬組成物”という用語は、ポリフェノールオキシ
ダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を投与して１種又はそれを越え
る微生物による接着を低減することから恩恵を受け得る障害を治療するために、
治療対象、好ましくは哺乳動物に投与されることができる組成物をいう。

【００３０】 本明細書中に使用される“口内ケア組成物”という用語は、ポリフェノールオ
キシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を投与して１種又はそれを
越える微生物による接着を低減することから恩恵を受け得る口腔の又はその中の
障害を治療するための、治療対象、好ましくは哺乳動物の口内への投与に適する
組成物をいう。

【００３１】 本明細書中に使用される“有効量”という用語は、細胞、組織、細胞外マトリ
ックス、歯、義歯、又は洗浄剤若しくは清浄剤により清浄化される堅い表面を含
む他の表面への微生物による接着を低減するか又は阻害するのに十分であるポリ
フェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素の量をいう。

【００３２】 本明細書中に使用される“感染”とは、組織、細胞、細胞外マトリックス、歯
、及び／又は義歯における１種又はそれを越える微生物の侵襲及び増殖をいう。
義歯の感染とは、基層として義歯を利用するか、基層としての義歯上の生体分子
を利用するか、又はそれを介して微生物が義歯内かその上で増殖できる他の機構
を利用する微生物の増殖をいう。

【００３３】 本明細書中に使用される“単離された”とは、ポリフェノールオキシダーゼ及
び／又はアスパラギナーゼのような様々な酵素を描写するのに使用される場合、
その自然環境の構成成分から同定されて分離され、且つ／又は回収されているポ
リフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を意味する
。その自然環境の夾雑成分は、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラ
ギナーゼのような酵素のための診断的又は治療的使用を妨げ得る材料であり、そ
れには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様溶質又は非タンパク質様溶質が
含まれ得る。ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような
単離された酵素には、宿主細胞内のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアス
パラギナーゼのようなin situの酵素が含まれる。なぜなら、少なくとも、その
ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素の成分は
自然環境下に存在しないからである。しかし、通常は、単離されたポリフェノー
ルオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、少なくとも１の精
製工程により調製されるであろう。方法及び組成物 本発明には、好ましくは、微生物を死滅させることもその増殖を停止させるこ
ともなく、その微生物による接着を低減するためのポリフェノールオキシダーゼ
及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を使用する方法及び組成物が含まれる
。本発明の方法及び組成物は、細胞、組織、他の表面への微生物の結合又は接着
を低減することも阻害することもできる。本発明の方法及び組成物は、それが細
胞と接触したときに細胞、組織、又は表面へのその微生物の結合又は接着を低減
することも阻害することもできるあらゆる酵素を使用する。本発明の方法は、例
えば、体腔、義歯、組織、カテーテルの部位、及びそれらに類したところが含ま
れる動物の身体における微生物による感染の部位での微生物による接着を低減す
るのに有効量の酵素、例えば、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラ
ギナーゼを投与することを含む。本発明の組成物は、有効量のポリフェノールオ
キシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を、この酵素を微生物によ
る接着を低減するに活性な形態で維持するのに適するキャリヤー中に含む。一の
態様では、その組成物には、動物への治療的投与に適する医薬組成物が含まれる
。本発明の組成物には、口内ケア組成物も含まれる。本発明の組成物には、ポリ
フェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を、プロテー
ゼの表面、医薬デバイス（例えば、カテーテル）、ポリマー表面、金属表面、又
は清浄剤若しくは洗浄剤で清浄化できるそれらに類したところに適用するのに適
する組成物が含まれる。

【００３４】 本発明の方法又は組成物中に使用される酵素は、好ましくは、微生物上の炭水
化物結合性部位のようなアドヘシンを酵素的に修飾する。そのような酵素は、微
生物上若しくはレクチンの結合部位内のアドヘシン又は他の分子を修飾するため
の或いはその微生物上の他の炭水化物結合性部位を修飾するための、例えば、ア
ミノ酸の側鎖を修飾するための反応を触媒することができる。好ましくは、その
酵素は、アスパラギン及び／又はチロシン残基の側鎖を修飾する。本発明の方法
及び組成物に使用できる好ましい酵素には、ポリフェノールオキシダーゼ、アス
パラギナーゼ、又はそれらの組合せが含まれる。

【００３５】 微生物による接着は、様々な機構を介して様々な基層へ起こることができる。
例えば、動物の口腔に生息する微生物は、歯、歯肉、喉、頬側、義歯、及び口腔
内の他の組織を被覆するポリサッカライドに接着することができる。微生物は、
動物の身体の中かその上の又は動物の体腔の一つの中かその上の細胞、組織、及
び細胞外マトリックスに接着することもできる。それら細胞には、微生物が含ま
れ得る。そのような微生物と微生物との結合は、共沈と称することができる。共
凝集する微生物には、磨いたばかりの歯の遅かれ早かれコロニー形成体となる微
生物が含まれる。

【００３６】 微生物は、レクチン及びグルコシルトランスフェラーゼのような炭水化物結合
性部位を含むアドヘシンを頻繁に使用する。典型的な微生物のレクチンとグルコ
シルトランスフェラーゼ及び他のアドヘシンは、１つ又はそれを越える結合部位
チロシン及び／又はアスパラギン残基を含むことができる。そのようなチロシン
及び／又はアスパラギン残基の修飾は、ポリサッカライド又は他の基層への微生
物による結合を低減することができる。

【００３７】 約２００の炭水化物結合性タンパク質がそれらのリガンドとの複合体において
分析されたので、炭水化物と“接触する”（ファンデルワールス接触、水素結合
接触等）アミノ酸残基の検出が可能となった。Protein Data bank on The Resea
rch Collaborative for Structural Bioinformaticsから入手可能なリガンド−
タンパク質接触プログラムを接触残基を評価するのに使用した。炭水化物結合性
タンパク質の全クラスに関して、リガンドと最も頻繁に接触するアミノ酸はアス
パラギンであった（下の表Ａ）。表Ａの第３欄では、アスパラギンは、それがタ
ンパク質内に予期される頻度が５％であるから、その結合ポケット内に過度に存
在すると示される。非常に多くの部位が、少なくとも１つのアスパラギン及びリ
ガンドと接触する１つの芳香族残基（Ｔyｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）を含有する。そ
れら芳香族の中で、チロシンは、最も一般的なものであろう。

【００３８】

【表１】

【００３９】 結合部位チロシン残基を含むアドヘシン分子には、Ｍタンパク質及び線毛が含
まれる（London, L, Meth. Enzymol. 253:197-406(1995)）。Ｍタンパク質アド
ヘシン分子は、結合部位チロシン残基であると考えられる幾つかのチロシン残基
をそれらのアミノ末端で有する（Cederval T. et al, Biochem. 36:4987-4994(1
997); Jones &F. et al, J. Exp. Med. 164:1226-1238(1986); Hasty D.L. et a
l., In: Fibronectin in Health and Disease. (S.E. Carsons, ed.), CRC Pres
s, Boca Raton, pp.89-112 (1989)）。他の細菌アドヘシン分子及び表面タンパ
ク質も、結合部位チロシン残基を含む（Cornelissen, C. N. et al., Infect. I
mmun. 65:822-828(1997); Lutwyche, P., R. et al., Infect. Immun. 62:5020-
5026(1994); McNab, R., H. F. et al., Mol. Microbiol. 14:743-754(1994); N
agata, R, A. et al., Infect. Immun. 65:422-427(1997); Sasty, A. et al.,
FEBS Lett. 151:253-256(1983); Scalbert, A, Phytochem. 30:3875-3883(1991)
; Schembri, M. A. et al. FEMS Microbiol. Lett. 137:257-63(1996)）。Ｆｉ
ｍＨと呼ばれる１型線毛の接着性サブユニットは結晶化されて、その結合界面が
示された。チロシンとアスパラギンは、双方ともリガンドとの相互作用に決定的
な残基である（Choudhury et al., 1999, X-Ray Structure of the FimC-FimH C
haperone-Adhesin Complex from Uropathogenic Escherichia colt. Science 28
5:1061-1066）。インフルエンザＡウイルスは、呼吸肺胞細胞上の末端ノイラミ
ン酸を認識するヘマグルチニンと呼ばれるレクチン様タンパク質を有する。その
リガンドと複合化したヘマグルチニンの３次元構造の分析で、チロシンとアスパ
ラギンの双方が接触残基であると示された。さらに、これら残基は１９６８年の
最後の主要な抗原シフト後そのウイルス系統中に保存されてきたが、その周りの
残基は頻繁に変異している（Weis W. et al, Nature 333:426-431(1988)）。Ｅ
．ヒストリチカ（E.histolytica）のアドヘシン分子も、結合部位チロシン残基
を含む。Ｃ．アルビカンス（C.albicans）は、疎水素とＧｌｃＮＡｃに特異的な
レクチンのような複数のアドヘシン分子を有すると報告されている。

【００４０】 結合部位チロシン及び／又はアスパラギン残基を有するアドヘシン分子を使用
する微生物には、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Actinobaci
llus actinomycetemcomitans）、アクチノミセス・イスラエリ（Actinomyces is
raelii）、Ａ．ナエスルンジイ（A. naeslundii）、及びＡ．ヴィスコサス（A.
viscosus）、カプノサイトファガ・オクラセア（Capnocytophaga ochracea）、
エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）大腸菌、フソバクテリウム・
ヌクレアテム（Fusobacterium nucleatum）、ヘモフィラス・インフルエンザ（H
aemophilus influenzae）、ポルフィロモナス・ギンギヴァリス（Porphyromonas
gingivalis）、プレヴォテラ・インテルメディア（Prevotella intermedia）、
プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ヴルガリス（Pro
teus vulgaris）、Ｐ．エルギノサ（P. aeruginosa）、Ｐ．ロエスシェイ（P. l
oeschei）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Streptococcus gordonii）、Ｓ
．ムタンス（S. mutans）、Ｓ．オラリス（S. oralis）、Ｓ．サングイス（S. s
anguis）、様々なグループＡストレプトコッカス類、様々な侵襲性抗生物質耐性
スタフィロコッカス類、及びトレポネマ・デンチコラ（Treponema denticola）
のような細菌；インフルエンザウイルス、特にインフルエンザＡウイルスのよう
なウイルス；カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のような酵母；及び
エンタモエバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）のような原生動物が含
まれる。ストレプトコッカス類の幾つかのＭ５、Ｍ６及びＭ２４陽性株のアドヘ
シン分子が検討されている（Dale J.B. et al., Vaccine 14-944-948 (1996); C
ourtney et al., REMS Microbiol. Letters 151:65-70 (1997)）。Ｐ．エルギノ
サは、その接着が２つのレクチン、つまりＰＡ−１及びＰＡ−２に左右され得る
ので、検討のための良いモデルになる。さらに、その細菌は、ガラス及びスチー
ルからヒト肺臓までの様々な表面上の生物膜を形成するであろう。

【００４１】 非常に多くのアドヘシン分子は、結合部位アスパラギン残基を含み、それには
線毛、Ｍタンパク質、及びそれらに類したものが含まれる。結合部位アスパラギ
ン残基を持つアドヘシン分子を有する有機体には、真菌、ウイルス、細菌、及び
植物が含まれる。

【００４２】 微生物による接着は、当業者に知られている様々な技術を用いて測定すること
ができる。これら技術には、濁度測定を介するようにして対象となる微生物の細
胞との共沈を測定すること；溶液中の凝集体又はペリクルの形成のような、微生
物のポリサッカライドとの凝集を測定すること；哺乳動物細胞への微生物の結合
を測定すること；血球凝集を監視すること；及び細胞外マトリックスへの微生物
の結合を測定することが含まれる。血球凝集は、様々な組織への多数の細菌によ
る接着を検討するためのモデルとして使用されている（Goldhar, J., Meth Enzy
mol. 253:43-49(1995)）。エイケネラ・コロデンス、Ｆ．ヌクレアテム、ヘモフ
ィラス・インフルエンザ、Ｐ．ギンギヴァリス、及びＴ．デンチコラのような典
型的な口内病原体は、ヒト赤血球を血球凝集させる能力を有する（Leung K.-P.
et al., Oral Microbiol. Immunol. 4:204-210 (1989); Nesbitt et al., Infec
t. Immun. 61:20112014 (1993); Socransky and Haffejee, J. Periodont. Res.
26:195-212 (1991); van Ham et al., J. Infect. Dis. 165:S97-99 (1992); G
renier, D., Oral Microbiol. Immunol. 6:246-249 (1991), and others）。ポ
リフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素で処置され
た微生物は、その酵素が血球凝集力価、微生物の共沈、微生物との凝集、微生物
による結合のような微生物による接着の指標に影響を与えることができるか否か
を決定するのに使用されることができる。

【００４３】 微生物を含む凝集又は共沈についての典型的なアッセイは、適する緩衝液中で
行うことができ、そして、血小板凝集計を使用するもののような視覚的終点予期
（visual end-point estimate）又は反応速度測定を伴うことができる。視覚的
終点予期は、Kolenbranderにより示されたもののような当業者に知られている方
法により測定されることができる（Kolenbrander, P.E., Metli. Eiazymol. 253
:385-396 (1995)）。そのような評点化システムにおいて、０は凝集無しを表し
；＋１は小さな一様に分散した凝集を表し；＋２は幾らかの綿状沈殿（floc）を
伴うはっきりとした凝集を示し；＋３は幾らかのバックグラウンド濁度を伴う大
きな綿状沈殿を表し；そして、＋４は多量の綿状沈殿の結果としての透明な上清
を表す。血小板凝集計は、共沈反応が１５分以内に完了となるような理に適って
速い場合に良く機能する。その血小板凝集計は、濁度の減少を計測し、そして、
それら結果は、ストリップチャートレコーダーへ継続的にプロットされる（Ofek
and Doyle, supra）。非凝集性ペアについて、その傾きはゼロである。他のも
のついては、その傾きは、アドヘシン分子及びレセプターの性質と数量に依存す
る。

【００４４】 共凝集を測定するのに適する微生物の反応ペアには、次のものが含まれる。

【００４５】

【表２】

【００４６】 典型的には、微生物のこれらペアにおいて、アドヘシン分子は加熱及び／又は
プロナーゼにより不活性化されるが、そのレセプターは加熱及び／又はプロナー
ゼに耐性である。これら微生物は、遅かれ早かれコロニー形成体となるもの、つ
まりグラム陽性とグラム陰性であって、炭水化物による保護を受けやすいものと
炭水化物の効果に耐性のものを代表する。追加の共沈性ペアは、下の実施例中に
報告された研究に使用されている。多くの他の適する共沈性ペアは、当業者に知
られており、その献中に記載されている。

【００４７】 動物組織から細胞までの微生物の接着は、当業者に知られているあらゆる様々
な方法により測定することができる。そのような方法には、例えば、Ｐａｐ型線
毛を持つ大腸菌株を、それらの基層、つまりジガラクトースへの接着についてア
ッセイすることであって、Garcia et alの操作に従い、それら大腸菌をその二糖
（EY Laboratories）とコンジュゲートしたラテックスビーズの懸濁液と混合す
ることによりアッセイすることが含まれる（Garcia E. et al., Curr. Microbio
l. 17:333-337(1988)）。グループＡストレプトコッカス類の接着のために、ヒ
ト咽頭細胞（HEp-2 from ATCC）を基層として使用することができる。そのよう
なアッセイのために、細菌を、例えば、高濃度の１０⁹／ｍｌで始めて約１０⁷／
ｍｌ又はそれより低い濃度まで希釈して、様々な濃度で試験することができる。
これら範囲を、上記のChapter 2 of Ofek and Doyle, 1994に記載されるように
して結合等温線を描くのに使用することができる。その接着反応混合物をインキ
ュベートし、次いで、吸い上げてから培地で洗って非接着性で偶発的に結合した
細胞を除去することができる。得られたデータは、例えば、正規の結合等温線、
Langmuir（ラングミュア）プロット、スキャッチャード（Scatchard）プロット
、及び／又は“共同的”接着の分析をもたらし得る（上記のOfek and Doyle）。
例えば、ポリフェノールオキシダーゼが、接着結果のスキャッチャードプロット
の正の傾きを失わせるなら、その酵素が正の共同性を妨げていると言える。

【００４８】 様々な基層へのＣ．アルビカンスの接着は、HazenとGleeの一般的操作を用い
て測定されることができる（Hazen, K.C. and Glee, P.M., Meth. Enzymol. 253
:414-424 (1995)) and of Segal and Sandovsky-Losica (Segal, E. and Sandov
sky-Losica, H., Meth. Enzymol. 253:439-452 (1995)）。接着検討のためのＣ
．アルビカンスは、ＹＥ（酵母抽出物）中の指数（酵母相）培養から得ることが
できる。データは、上に記載したようにして処理されることができる。加えて、
接着／頬側細胞 ＶＳ 加えられた細胞の数のプロットを、接着機能の破壊を媒
介する酵素における定量的傾向を評価するために作成することができる。Ｃ．ア
ルビカンスは、入れ歯着用者、頭−頚部照射患者、シェーグレン病の患者、エイ
ズ患者、及び他の免疫無防備化患者に感染することができる。

【００４９】 口内細菌のような様々な微生物が、様々な細胞外マトリックスタンパク質を含
む多くの基層に接着することができる。細胞外マトリックスタンパク質への接着
は、当業者に知られている様々な方法により測定されることができる。幾種かの
口内細菌に関して、フィブロネクチンは、それらのアドヘシン分子についてのレ
セプターである。その他のものに関しては、コラーゲンがレセプターとして役立
つ。他のレセプターも知られている（Ljungh, A. and Wadstrom, T. Meth. Enzy
mol. 253:501-573 (1995))。コラーゲンに接着することが知られている細菌には
、アクチノミセス・ヴィスコサス、ポルフィロモナス・,ギンギヴァリス、及び
プレヴォテラ・インテルメディアが含まれる(Liu, T., R.J. Gibbons, D.I. Hay
, and Z. Skobe, Oral Microbiol Inzmunol. 6:1-5 (1991); Naito, Y., and R.
J. Gibbons, J Dent. Res. 67:1075-1080; Grenier, D., Microbiology 142:153
7:1541 (1996)）。フィブロネクチン結合に接着することが知られている細菌に
は、Ｓ．サングイス、Ｓ．ピオゲネスＭ５⁺タンパク質、及びトレポネマ・デン
チコラが含まれる(Ofek and Doyle, Bacterial Adhesion to Cells and Tissues
. Chapman and Hall, New York. 1994において再検討された)が含まれる。コラ
ーゲンへの接着は、上記のGrenier 1996により示された方法により検討し得るの
で、フィブロネクチンでの実験は、コラーゲンの実験をまねて行うことができる
。

【００５０】 接着の検討に使用される微生物は、当業者に知られているあらゆる様々な方法
により調製され且つ単離されることができる。例えば、微生物は、購入されても
、臨床単離物から得られても、他の方法で調製されてもよい。Ｅ．ヒストリティ
カのような原生動物は、PetriとSchnaarにより示されたように無菌培養的に増殖
させることができる（Petri, W.A. Jr. and Schnaar, R.L., Meth. Enzymol. 25
3:98-104 (1995)）。それら栄養体型個体を、示されたように採取し且つ洗うこ
とができる。接着検討には、レクチンについてアッセイするための栄養体型膜と
血球凝集を使用することができる。インフルエンザＡウイルスのようなウイルス
は、当該技術分野において周知の操作により培養し、採取し、且つ取り扱うこと
ができる。ウイルス粒子をアスパラギナーゼのような酵素で様々な時間及び様々
な濃度で処置し、次いで、Casals，J. Meth. Virology III: 113-198 (1967)に
より報告されたような公知の方法により血球凝集についてアッセイすることがで
きる。

【００５１】 有効量のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵
素を動物組織、細胞、細胞外マトリックス、歯、及び／又は義歯へ投与すること
は、好ましくは、１種又はそれを越える微生物による接着に、そのような接着か
らもたらされる有害な影響又は疾患を改善するのに十分な低減をもたらす。この
やり方でのポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵
素の効果的な投与又は使用は、典型的には、感染の予防又は阻止、感染の症候の
低減又は緩和、接着の低減、及びそれらに類したことにより明らかとなる。感染
がないこと又はその低減及び症候の緩和は、一般の臨床的又は実験的方法により
確認することができる。接着の低減を、プレートカウント、顕微鏡、凝集測定法
、濁度測定法、放射性同位元素標識、及び当該技術分野において標準的な他の方
法により測定することができる。

【００５２】 接着を低減するポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのよ
うな酵素は、例えば、腹膜透析において生物汚染と闘うこと；虫歯を低減するこ
と；動物の腸管内の大腸菌の接着を低減することにより感染の症候を治療するこ
と；エンタモエバのような１種又はそれを越える原生動物による接着を低減する
ことにより感染を治療すること；例えば、ヘリコバクターの接着を低減すること
により潰瘍を治療すること；インフルエンザウイルスのようなウイスルの接着を
低減することによりウイスル感染を治療すること；避妊薬として供されること；
鶏におけるサルモネラのレベルを低減するためのニワトリ補助飼料として供され
ることにより卵及び又は他の鶏肉の汚染を低減すること；ヘモフィラス、ストレ
プトコッカス、又はカンジダによる接着を低減するようなことにより歯周組織、
目、耳、又は喉の感染を治療すること；点眼剤又は鼻滴剤、うがい薬（例えば、
痛めた喉のためのもの）、歯周病用パッキング中のゲルの成分として；Ｂｔ中に
クローン化されたときの蚊の幼虫を殺すこと；プロバイオテック（Probiotic）
（例えば、ラクトバチルス（Lactobachillus）中にアスパラギナーゼをクローン
化するもの）；皮膚感染（インペチゴ）又は（毒素がＣＨＯと結合する）ビブリ
オと闘うことを含む、様々な用途の１つ又はそれ以上において有用であることが
できる。

【００５３】 本発明の方法及び組成物は、尿路感染を治療するのに使用されることができる
。そのような感染は、１年間当たり９６０万人の外来患者によるものである。こ
れらの殆どが大腸菌により引き起こされる。殆どすべての大腸菌株が１型線毛で
あるが、その線毛の対立遺伝子変異体は尿路下方部にコロニーを形成する能力と
関わってる。Ｐ線毛大腸菌は、尿路上方部（すなわち腎臓）感染と大きく関わっ
ている。

【００５４】 本発明の方法及び組成物は、カテーテル及び／又はカニューレの部位での感染
を治療するのに使用されることができる。プロテウス・ミラビリス、プロテウス
・ヴルガリス、及びＰ．アエルギノサのような有機体はカテーテルに頻繁にコロ
ニーを形成し、その治療対象者におけるカテーテルの取外し及び／又は感染をも
たらす。ウレアーゼからのアンモニアは、ストルバイト（strivote）（Ｍｇ−Ｎ
Ｈ₄リン酸塩）及びヒドロキシラパタイト（リン酸Ｃａ）を沈殿させるほどｐＨ
を上昇させるので、接着が堆積を導き得る。アスパラギナーゼ及びポリフェノー
ルオキシダーゼは、ウレアーゼ及び／又は接着を阻害するものであり得る。或い
は、それら酵素は、ウレアーゼには如何なる効果も有しないが、接着を低減する
ものであり得る。いずれの場合にも、堆積を低減して、カテーテルの耐用期間を
延ばすことが望ましい。Tunneyらにより幾らか詳細に示されたモデル（1999, Bi
ofilm and biofilm-related encrustation of urinary tract devices. Meth. E
nzymol. 310:558-566）を、堆積に関係するそのような接着に対するポリフェノ
ールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素の効果を具体的に示
すことに使用することができる。カテーテル及びそれに類した器具は、接着及び
／又は堆積を低減するか又は遅らせるために、ポリフェノールオキシダーゼ及び
／又はアスパラギナーゼのような酵素で被覆されるか又は他のやり方で処置され
ることができる。

【００５５】 本発明の方法及び組成物は、膣及び中耳を含む体腔の感染を治療するのに使用
されることができる。膣の感染を治療することにより、本法及び本組成物で、新
生児の感染を治療することができる。グループＢストレプトコッカスは、新生児
の生命に危機的な感染の最も一般的な原因である。幼児は、産道を通過する際に
又は出産後にもその感染を獲得する。新生児へ又は膣へのこれら微生物による接
着を低減することで、そのような感染を低減することも治療することもできる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）とヘモフィラ
ス・インフルエンザは、中耳感染（中耳炎）の第１と第２の原因である。耳の上
皮又は他の細胞へのこれら細菌による接着を崩壊させることで、そのような感染
を低減することも治療することもできる。

【００５６】 本発明の方法及び組成物は、トリ、特にニワトリのような非ヒト動物の感染を
治療するのに使用されることができる。本発明の医薬組成物には、獣医療用途に
適する組成物が含まれる。食肉又は乳製品のために使用される動物の処置は、食
物伝染病の発生を予防するか又は低減するのに使用されることができる。例えば
、サルモネラで汚染された卵は、食物伝染病を引き起こす他のあらゆる供給源よ
りも大きな影響をもたらしている。Ｓ．エンテリティディス（S.enteritidis）
を獲得した雛鶏は、その細菌を生存のために有しており、卵汚染をもたらす。そ
れら雛鶏の消化管又は卵産出管の細胞へのこれら細菌による接着を崩壊させるこ
とで、そのような感染を治療することができる。微生物の接着を低減する酵素は
、雛鶏又は他の食品産出動物に、水、飼料中において投与されても、他の適する
方法により投与されてもよい。飼料又は水を介して投与される酵素は、好ましく
は、その酵素の腸溶性組成物又は安定化された組換え変異体のような、消化管内
で安定なものである。

【００５７】 本発明の方法及び組成物は、プロテーゼ、カテーテル若しくはカニューレ、他
の医療用デバイス若しくは機器の表面、又は醸造、発酵、排水処理、及びそれら
に類したことに使用される装置の表面のような人工表面への微生物の接着に対し
て使用されることもできる。酵素は、一般に清浄化組成物又は衛生用組成物中に
使用される。微生物による接着を低減するポリフェノールオキシダーゼ及び／又
はアスパラギナーゼのような酵素は、清浄剤組成物及び／又は衛生用組成物中へ
の含有について当業者に知られている方法と処方で配合されることができる。一
定の状況下では、そのような酵素は、そのデバイス又は装置により成し遂げられ
る方法及び処置に際して、微生物の接着を低減するのに使用されることができる
。

【００５８】 下の実施例中に示されるように、Ｓ．ソブリナス（S.sobrinus）をポリフェノ
ールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素と接触させることで
、この微生物による接着を低減することができる。接着のこの低減は、ポリフェ
ノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素が媒介するＳ．ソ
ブリナスのグルカン結合レクチンの不活性化からもたらされると考えられる。観
測された接着の低減は、幾つかの徴候を有していた。例えば、ポリフェノールオ
キシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、この細菌の溶解性高分
子量デキストランの凝集を濃度依存性且つ時間依存性の様式で低減する。ポリフ
ェノールオキシダーゼをＳ．ソブリナス及びデキストランの凝集体と混合するこ
とで、凝集体の再形成も低減される。ポリフェノールオキシダーゼは、Ｓ．ソブ
リナス高分子量グルコシルトランスフェラーゼイソ酵素によるグルカン合成も低
減する。

【００５９】 下にも示したように、本発明の組成物及び方法に使用される酵素、例えば、ア
スパラギナーゼ及び／又はポリフェノールオキシダーゼは、好都合なことに、微
生物の増殖を終わらせることも妨げることもなく、接着若しくは結合を低減する
か又は阻害することができる。例えば、ポリフェノールオキシダーゼは、Ｓ．ソ
ブリナスも、１型線毛とＰ線毛大腸菌のいずれも殺さなかった。アスパラギナー
ゼは、Ｓ．ソブリナス、大腸菌の２つの菌株のいずれも、Ｓ．ピオゲネス（S.py
ogenes）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、バチルス
・セレウス（Bacillus cereus）、又はプロテウス・ヴルガリスのいずれの増殖
を終わらせることも、有意に阻害することもなかった。

【００６０】 下の実施例中に示されるように、アドヘシン分子を修飾するポリフェノールオ
キシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素と接触させることで、歯周
感染及び疾患に関与する歯周病原体のような微生物の共凝集を阻害することがで
きる。それら歯周病原体には、Ｓ．サングイス、アクチノミセス・ナエスルンジ
イ、ポルフィロモナス・ギンギヴァリス、アクチノバチルス・アクチノミセテム
コミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアテム、カプノサイトファガ・オクラセ
ア、及びプレヴォテラ・インテルメディアが含まれる。さらに、チロシン様プロ
テアーゼ活性が、Ｐ．ギンギヴァリスの発毒のために必要とされる。ポリフェノ
ールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、このプロテアーゼを阻害する。

【００６１】 下の実施例中に示されるように、アドヘシン分子を修飾するポリフェノールオ
キシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素と接触させることで、様々
な基層への様々な微生物の接着を阻害することができる。それら微生物には、大
腸菌、ニューモコッカス類、サルモネラ（例えば、Ｓ．エンテリチディス）、ス
トレプトコッカス類（例えば、Ｓ．ピオゲネス）、及びＨ．ピロリ（H. pylori
）のような細菌；インフルエンザウイスルのようなウイルス；及びエンタモエバ
のようなアメーバーが含まれる。基層には、マンノースレセプターのようなレセ
プター；酵母、赤血球、上皮細胞（例えば、尿中及び頬側の上皮細胞）のような
真核又は哺乳動物細胞；コラーゲン又はフィブリンのようなマトリックスタンパ
ク質；生体表面をモデルとする表面、例えば、ヒドロキシラパタイトが含まれる
。大腸菌による接着の阻害は、これら酵素が大腸菌による感染からの症候により
若しくはそれと共に引き起こされるあらゆる様々な感染、疾患、又は障害を治療
することに使用可能であることを示す。Ｈ．ピロリによる接着の阻害は、これら
酵素が消化管潰瘍を治療することに使用可能であることを示す。インフルエンザ
ウイルスによる接着の阻害は、これら酵素がインフルエンザウイルスによる感染
を治療することに使用可能であることを示す。サルモネラによる接着の阻害は、
これら酵素が食物伝染性微生物による感染を治療することにもその可能性を低下
させることにも使用可能であることを示す。エンタモエバによる接着の阻害は、
これら酵素がアメーバーによる感染を治療することにもその可能性を低下させる
ことにも使用可能であることを示す。酵母による接着の阻害は、これら酵素が酵
母感染を治療することにもその可能性を低下させることにも使用可能であること
を示す。細胞外マトリックスタンパク質への接着の阻害は、これら酵素が微生物
による組織の侵襲を含む細胞外マトリックスタンパク質への微生物の結合により
引き起こされる障害又は症候を治療することにも低減することにも使用可能であ
ることを示す。それら酵素は、長期非病原性コロニー形成体（正常生物相）とは
不釣り合いに、病原体（新たにコロニーをつくる）細菌に影響を与えるので、ポ
リフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼの治療的使用を容易にすること
ができる。医薬組成物 本発明の一態様において、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギ
ナーゼのような酵素を含む医薬組成物が提供される。ポリフェノールオキシダー
ゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、例えば、微生物性病態の治療の
ためのそのような医薬組成物中に使用されることができる。本発明の医薬組成物
は、結合部位チロシン及び／又はアスパラギン残基を持つアドヘシン分子に依拠
する１種又はそれを越える微生物による感染を治療するのに使用されることがで
きると意図されている。

【００６２】 本発明の医薬組成物は、好ましくは、微生物による接着を低減するのに有効量
のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含有
する。ポリフェノールオキシダーゼは、好ましくは、チロシナーゼ、カテコラー
ゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、又はチロシン残基へ作用する他の酸化酵素
である。場合により、医薬組成物は、ポリフェノールオキシダーゼの活性を安定
化するか又は増強する物質を含んでもよい。そのような物質には、スターチ、ゼ
ラチン、カラゲナン、グリコール、及び医薬品を調合するのに使用される他の物
質が含まれる。

【００６３】 本発明の医薬組成物は、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナ
ーゼのような酵素を薬理学的に許容し得るキャリヤー中に含む。薬理学的に許容
し得るキャリヤーは、当業者に知られており、それには、医薬を投与するという
目的に有用な材料であって、好ましくは、無毒で且つ固体状、液体状若しくは気
体状の材料、又は他のやり方において、不活性で医学的に許容し得るもので且つ
ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素及び存在
するあらゆる他の有効成分と相溶性である材料が含まれる。

【００６４】 水、生理食塩水、水性デキストラン、及びグリコールは、好ましい液体キャリ
ヤー、特に（等張である場合）注射可能な溶液である。そのキャリヤーは、石油
、哺乳動物、野菜、又は合成源のオイル、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイ
ル、鉱物オイル、及び胡麻オイルを含む様々なオイルから選択されることができ
る。適する医薬賦形剤には、スターチ、セルロース、タルク、グルコース、ラク
トース、スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、穀粉、チョーク、シリカゲル
、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリ
セロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリ
コール、水、及びエタノールが含まれる。それら組成物は、滅菌化のような慣例
的な薬理学的処理を受けることができ、且つ保存剤、安定化剤、湿潤剤若しくは
乳化剤、エアロゾル、浸透圧を調節するための塩、又は緩衝剤のような慣用的な
医薬添加物を含有することができる。適する医薬キャリヤー及びそれらの製剤は
、Martin,“Remington's Pharmaceutical Sciences,”15th Ed.; Mack Publishi
ng Co., Easton (1975)（例えば、pp. 1405-1412 and pp. 14611487を参照せよ
）に記載されている。そのような組成物は、概して、微生物による接着を低減す
るのに有効量のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのよう
な酵素を、動物への適正な投与のための適正な投与形態を調製するのに適する量
のキャリヤーと一緒に含有するであろう。

【００６５】 本発明の医薬組成物は、その製剤が１種又はそれを越える微生物による内部感
染を治療するのに使用されるのか又はその外部感染を治療するのに使用されるの
かに依存して、経口投与されたり、坐剤又は膣坐剤として使用されたり；軟膏剤
、クリーム剤、エアロゾル、散剤として局所的に適用されたり；点眼剤若しくは
鼻滴剤として与えられるなどを含む様々な経路により投与されることができる。
本組成物は、０．１〜９９％のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラ
ギナーゼのような酵素を含有することができる。好ましくは、本組成物は、約０
．１〜約１．０重量％のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナー
ゼのような酵素を含む。それら酵素は、通常、医薬組成物中に可溶である。

【００６６】 経口投与のために、微細散剤又は顆粒剤は、希釈剤、分散剤、及び／又は界面
活性剤を含有することができ、それは、頓服水剤中、水剤中又はシロップ剤中に
；乾燥状態のカプセル若しくはサクネット（sacnet）中又は懸濁剤を含むことが
できる非水溶液若しくは懸濁液中に；結合剤若しくは滑剤を含むことができる錠
剤又は腸溶性コーティングピル中に；又は水若しくはシロップの懸濁剤中に存在
することができる。幾つかの場合に、酵素は、エアロゾルを形成するのに配合さ
れ得る。望まれるか又は必要とされる。矯味剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤、又は
乳化剤を含ませることができる。錠剤と顆粒剤は好適であり、そして、これらを
コーティングすることができる。経口投与のための好ましい製剤は、フェノール
オキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素の胃又は腸内での活性を
維持する物質を含む。そのような物質には、緩衝剤、及び“徐放”成分が含まれ
る。

【００６７】 バッカル剤投与のために、本組成物は、慣用的やり方で配合された錠剤又はト
ローチ剤の形態をとることができる。 別のやり方では、皮膚又は他の外部組織の感染のために、本組成物は、好まし
くは、局所的軟膏剤、クリーム剤又はスプレー剤として動物の身体の感染部分に
適用される。ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような
酵素は、軟膏剤中に、例えば、水溶性軟膏基剤と共に存在するか、又はクリーム
剤中に、例えば、水クリーム基剤中にオイルと共に存在することができる。局所
的形態又はゲルをベースとする形態のためのキャリヤーには、メチルセルロース
のようなポリサッカライド、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール
、及び木精油が含まれる。局所的投与のために、ポリフェノールオキシダーゼ及
び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、約０．０１〜１０％、好ましくは０
．１〜１．０ｗ／ｖ％の濃度で医薬組成物中に存在することができる。局所的投
与のために、成人治療のために使用される１日投与量は、０．１ｍｇ〜１０００
ｍｇ、好ましくは０．５〜１０ｍｇであろう。しかし、拡大性皮膚感染は、より
多い投与量の使用を要求することができると考えられる。

【００６８】 すべての投与のために、慣用的なデポー形態が適するように使用される。その
ような形態には、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏
剤、吸入剤形態、鼻スプレー、舌下錠、及び持効性製剤が含まれる。ポリフェノ
ールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、典型的には、そ
のようなキャリヤー中に約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で配合されるであろ
う。ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、
徐放性製剤の形態で投与されることもできる。徐放性製剤の適する例には、その
タンパク質を含有する固体状疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、
成型品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態であるマトリックスが含
まれる。当該技術分野において周知である徐放性マトリックスの例には、ポリエ
ステル、ヒドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グ
ルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−
グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ（−）３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

【００６９】 ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、遺
伝子治療に適する組成物を使用して投与されることもできる。動物の細胞内への
核酸（場合によりベクター中に含有されているもの）のin vivoデリバリーのた
めには、その核酸が直接的に動物内に、通常、そのポリペプチドを必要とする部
位で注入される。公知のin vivo核酸移送技術には、ウイルス又は非ウイルスベ
クター（アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスシンプレックスＩウイルス
、又はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、及び脂質をベースとする系（その遺伝子
の脂質媒介移送に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃ
ｈｏｌである；例えば、Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14(1): 54-
65 (1996)を参照せよ）のようなもの）でのトランスフェクションが含まれる。
ウイルスベクターは、典型的には、遺伝子発現を制御する少なくとも１つのエレ
メント、つまり翻訳開始配列、パッケージングシグナル、長い末端反復部分（Ｌ
ＴＲ）、又はそれらの部分、及び使用されるウイルスに適切なポジティブ鎖とネ
ガティブ鎖プライマー結合部位として作用するエレメント（これらがウイルスベ
クター中に未だ存在していないなら）を含む。加えて、そのようなベクターは、
典型的には、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような
酵素のそれを産生する宿主細胞からの分泌のためのシグナル配列を含む。口内ケア組成物 本発明は、更に、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼの
ような酵素を含む口内ケア組成物を提供する。ポリフェノールオキシダーゼ及び
／又はアスパラギナーゼのような酵素は、例えば、微生物が口腔に感染したとこ
ろの病変部の処置のために、そのような口内ケア組成物中に使用されることがで
きる。本発明の口内ケア組成物は、結合部位チロシン及び／又はアスパラギン残
基を持つアドヘシン分子に依拠する１種又はそれを越える微生物によるあらゆる
感染を治療するのに使用されることができると考えられる。

【００７０】 本発明の口内ケア組成物は、好ましくは、口内の細胞若しくは組織へ又は義歯
（例えば入れ歯）への微生物による接着を低減するのに有効量のポリフェノール
オキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含有する。ポリフェノ
ールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素は、好ましくは、低
温殺菌に耐性があり、配合する物質中で安定性であり、且つ固体、液体又はエア
ロゾルとしての製剤化になじむものである。場合により、その口内ケア組成物は
、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素の活性
を安定化するか又は増強する物質を含み得る。そのような物質には、銅イオンの
ような微量金属、及び過酸化水素のような酸素放出性化合物が含まれる。

【００７１】 ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含む
口内ケア組成物は、例えば、哺乳動物の口腔内の口内衛生を維持及び／又は改善
するために、及び／又は哺乳動物における歯の疾患を予防又は治療するために使
用されることができる。この口内ケア組成物は、１種又はそれを越える微生物に
よる接着を低減するために義歯に使用されることもできる。例えば、入れ歯を、
その着用者の口腔内においてか又は着用者の口腔から取り出して、ポリフェノー
ル及オキシダーゼび／又はアスパラギナーゼのような酵素を含有する口内組成物
で清浄化することができる。本発明の口内組成物には、練り歯磨き、歯用クリー
ム、歯用ゲル若しくは歯磨き粉、うがい薬又は口内濯ぎ液、入れ歯清浄剤（例え
ば、クリーム又は浸漬液）、チューインガム、トローチ、及びキャンディーが含
まれるが、これらに限定されない。その口内ケア組成物は、固体、半固体（例え
ば、ゲル、ペースト、又は粘性液体）、液体、又はエアロゾルの形態であること
ができる。

【００７２】 練り歯磨き又は歯磨きゲル及びうがい薬又は口内濯ぎ液に含ませ得る様々な成
分は、当該技術分野において周知である。ポリフェノールオキシダーゼ及び／又
はアスパラギナーゼのような酵素に加えて、本発明の練り歯磨き又は歯磨きゲル
は、典型的には、１種又はそれを越える研磨剤又はつや出し材料、発泡剤、矯味
剤、湿潤剤、結合剤、増量剤、甘味料、又は水を含むであろう。ポリフェノール
オキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含有するうがい薬又は
口内ゆすぎ液は、典型的には、水／アルコール溶液と１種又はそれを越えるフレ
ーバー、湿潤剤、甘味料、発泡剤、及び着色料も含むであろう。

【００７３】 適する公知の研磨剤又はつや出し材料には、アルミナとその水和物（例えば、
アルファアルミナ三水和物）、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、二炭
酸ナトリウム、カオリン、アルミノシリケート（例えば、ケイ酸アルミニウム）
、炭酸カルシウム、ケイ酸ジルコニウム、粉末化されたプラスチック（例えば、
粉末化された塩化ポリビニル、ポリアミド、又は様々な樹脂）、キセロゲル、ヒ
ドロゲル、エーロゲル、ピロリン酸カルシウム、水に不溶性のアルカリメタリン
酸塩、リン酸二カルシウム及び／又はその二水和物、オルトリン酸二カルシウム
、リン酸三カルシウム、粒状ヒドロキシラパタイト、及び、これら研磨剤又はつ
や出し材料の混合物が含まれる。典型的には、その研磨剤又はつや出し剤は、０
〜約７５重量％、好ましくは１％〜約６５重量％、より好ましくは、練り歯磨き
又は歯磨きゲルについて、その練り歯磨き又は歯磨きゲルの約１０〜約５５重量
％で存在することができる。

【００７４】 練り歯磨き若しくは歯磨きゲル又は他の組成物からの水分の喪失を防ぐのに典
型的に使用される適する公知の湿潤剤には、グリセロール、ポリオール、ソルビ
トール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、１，３−
プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、部分加水分解された水素化ポリサ
ッカライド、及びこれら湿潤剤の混合物が含まれる。練り歯磨き又は歯磨きゲル
中において、湿潤剤は、典型的には、その組成物の約０〜約７０重量％、好まし
くは約５〜約５５重量％である。

【００７５】 口内ケア組成物の安定性を維持する適する公知の増量剤及び結合剤には、シリ
カ、スターチ、トラガカントガム、キサンタンガム、アイリッシュモスの抽出物
、アルギナート、ペクチン、一定のセルロース誘導体（例えば、ヒドロキシエチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はヒドロキシプロピルセルロー
ス）、ポリアクリル酸とその塩、及びポリビニルピロリドンが含まれる。典型的
には、練り歯磨き又は歯磨きゲルは、約０．１〜約２０重量％の１種又はそれを
越える増量剤、及び約０．０１〜約１０重量％の１種又はそれを越える結合剤を
含む。

【００７６】 そのような口内ケア組成物中の適する発泡剤又は界面活性剤は、典型的には、
本組成物中に存在するポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼ
のような酵素の活性を有意に低減させないであろう。そのような発泡剤又は界面
活性剤は、アニオン性、カチオン性、非イオン性、及び両親媒性及び／又は両イ
オン性界面活性剤から選択されることができる。これらには、硫酸脂肪アルコー
ル、スルホン化されたモノグリセリド又は１０〜２０個に炭素原子を有する脂肪
酸の塩、脂肪酸−アルブミン濃縮組成物、脂肪酸アミドの塩、タウリン、及び／
又はイソチオン酸（isothionic acid）の脂肪酸エステルの塩が含まれる。その
発泡剤又は界面活性剤は、本組成物中に約０〜約１５重量％、好ましくは約０．
１〜約１０重量％、より好ましくは０．２５〜７重量％のレベルであることがで
きる。

【００７７】 適する公知の甘味料には、サッカリン及びアスパルテームのような人工甘味料
が含まれる。適する公知のフレーバーには、スペアミント及びペパーミントが含
まれる。そのようなフレーバー又は甘味料は、典型的には、約０．０１〜約５重
量％、又は約０．１〜約５重量％のレベルで存在する。

【００７８】 本発明の口内ケア組成物は、添加される１種又はそれを越える抗菌剤、抗歯石
剤、抗歯垢剤、フッ化物供給源として使用されることができる化合物、染料／着
色料、保存剤、ビタミン、ｐＨ調節物質、抗虫歯剤、又は知覚鈍麻剤を含むこと
もできる。

【００７９】 ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含む
口内ケア組成物は、口内ケア組成物を投与することに関して当業者に多く知られ
ているあらゆる方法を使用して、哺乳動物の口腔に適用されることができる。例
えば、口内ケア組成物は、一般的に使用されるあらゆる練り歯磨き又はうがい薬
として適用されることができる。その口内ケア組成物は、口腔内に導入されても
、歯及び／又は歯肉のような口内組織に塗布されても、その口腔から取り出され
ても（例えば、濯ぐことにより）、口内を濯いでもよい。他のやり方では、その
口内ケア組成物は、半固体として又は固体インプラントとして歯周ポケットに適
用されることができる。ゲル、ペースト、又は粘性液体は、例えば、歯ブラシ、
綿棒、指、シリンジ、又は歯科医療器具で適用されることができる。また他の態
様において、口内ケア組成物は、入れ歯を浸漬するのに使用されることができる
。例えば、入れ歯をその着用者の口腔から取り外し、ポリフェノールオキシダー
ゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素を含む溶液又は懸濁液中に沈めるこ
とができる。他の態様は、有効投与量を服用させるためのエアロゾルの使用を伴
う。

【００８０】 口内ケア組成物は、口内ケア組成物を製造することに関して当該技術分野にお
いて知られている方法を用いて製造されることができる。口内ケア組成物は、０
．１〜９９％のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのよう
な酵素を含有することができる。好ましくは、その組成物は、約０．１〜約１．
０重量％のポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵
素を含む。

【００８１】 本発明の組成物の他の態様には、義歯、医療用デバイス、インプラント、カウ
ンター、磁器製又はプラスチック製の固定具、器具、及びそれらに類したものを
含む堅い表面への微生物の接着若しくは結合を低減するか又は阻害するのに適す
る組成物が含まれる。そのような組成物は、ポリフェノールオキシダーゼ及び／
又はアスパラギナーゼのような酵素を含む清浄剤又は洗浄剤組成物であることが
できる。ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素
を不活性化させないか又はその活性を持続させる清浄剤又は洗浄剤のための配合
は、当業者に知られている。製品 本発明は、更に製品を提供する。微生物による接着を低減するために又は本明
細書に記載された障害の治療のために有用なポリフェノールオキシダーゼ及び／
又はアスパラギナーゼのような酵素を含有するキットのような製品は、少なくと
も容器及びラベルを含む。適する容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリン
ジ、及び試験管が含まれる。それら容器は、ガラス又はプラスチックのような様
々な材料から形成され得る。容器は、症状を処置するのに効果的である組成物を
保持し、且つ滅菌された取り出し口を有し得る。その組成物中の活性物質は、ポ
リフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナーゼのような酵素である。容
器上の又はそれと関連するラベルは、その組成物が、選択対象の症状を処置する
のに使用されることを示す。製品は、リン酸緩衝塩類溶液、リンゲル液、及びデ
キストロース溶液のような薬学的に許容し得る緩衝液を含む第２の容器を更に含
み得る。それは、商業上の及びユーザーの視点から望まれる他の材料を更に含み
得るもので、それには他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、及びの
使用のための指示を伴うパッケージ内印刷物が含まれる。製品は、上で記載した
ような他の活性物質と共に第２又は第３の容器も含み得る。

【００８２】 本発明は、下の実施例への参照でより良く理解され得る。これら実施例は、本
発明の具体的態様を表すことを意図したもので、本発明の範囲を限定するように
意図したものではない。実施例 実施例１：ストレプトコッカス・ソブリナスの凝集のポリフェノールオキシダー ゼによる阻害とアスパラギナーゼによる阻害 ポリサッカライドは、微生物の接着と凝集のための重要な基層を提供する。デ
キストランへのＳ．ソブリナスによる接着へのポリフェノールオキシダーゼ及び
／又はアスパラギナーゼの効果の検討は、これら酵素のいずれかでの処置がポリ
サッカライドへの微生物による接着を低減することを具体的に示す。材料及び方法 細菌及び増殖条件 実験のために、Ｓ．ソルビナス６７１５をトリプシン処理ｓｏｙ寒天（Difco, Detroit, MI ）上に維持し、そして、Terleckyjの合成培地、又はデキストラナ
ーゼ（乾燥培地ｇ当たり１ｍｇの酵素）とインベルターゼ（乾燥培地ｇ当たり５
ｍｇ）で２時間前処理されたトリプシン処理ｓｏｙブロス（TSB）（Difco）中で
、各々に５％ＣＯ₂中の３７℃で１６〜１８時間増殖させた。培養物を１２，０
００×ｇで１０分間遠心分離し、そして、冷えた酸緩衝化塩類溶液（ＰＢＳ、２
０ｍＭ、ｐＨ７．２）で２回洗った。細胞をＰＢＳ中に０．８（Ａ₅₄₀）の光学
濃度に懸濁させた。ＴＳＢ中に増殖させた培養菌を採取してＰＢＳ中に懸濁し、
続いてデキストラナーゼで１時間処理し、そして、ＰＢＳ中で２回洗った。凝集アッセイ Drakeらにより発表された標準速度アッセイ（Drake D. et al. Infect. Immun
. 56:1864-1872 (1988)）を、Ｓ．ソルビナス６７１５グルカン結合レクチンの
高分子量デキストランとの相互作用を検討するのに使用した。簡単に説明すると
、細菌懸濁液をＰＢＳ中の０．７５〜０．９０の光学濃度に調節し、そして、３
ｍｌの懸濁液を試験管（１３×１００ｍｍ）に加えた。デキストランＴ−２００
０を１０μｇ／ｍｌの最終濃度で加え、そして、その懸濁液を５秒間攪拌した。
対照実験の試験管にはＰＢＳが加えられた。光学濃度の低減を分光光度測定によ
り継続的に５分間追跡した。速度定数は、ＩｎＡ／Ａ₀（Ａ＝観測された光学濃
度；Ａ₀＝０時間での光学濃度）の１次プロット ＶＳ 分時間の傾きから得ら
れた。各試料を少なくとも３回アッセイした。凝集競合アッセイ 炭水化物デキストランＴ−１０（分子量１０，０００、１ｍｇ／ｍｌ）又はグ
リコゲン（２．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を高分子量デキストランの添加前に
凝集アッセイに加えた。酵素で凝集を低減させる 細胞をリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６．５）中に懸濁し、いずれかのポリフ
ェノールオキシダーゼ（Worthington Biochemical Corporation, Freehold NJ,
Lot 37A889）（1260 U/ml）で、３７℃で回転振動（１５０rev/min）させながら
１時間処置し、次いで、冷えたＰＢＳで２回洗った。阻害剤（すべてＳｉｇｍａ
からのもの）を、存在する場合に次の濃度：フェニルメチルスルホニルフッ化物
（ＰＭＳＦ）５００μＭ；ロイペプチン５００μｇ／ｍｌ；エチレンジアミンテ
トラ酢酸（ＥＤＴＡ）５ｍＭ、塩化カリウム２００ｍＭ；ポリビニルピロリドン
５００μｇ／ｍｌ；アスコルビン酸３ｍＭ；乳酸１０％で、ポリフェノールオキ
シダーゼ添加前に添加した。

【００８３】 他の実験では、細胞をアスパラギナーゼで処置した。結果 ポリフェノールオキシダーゼでグルカン凝集を低減させる 図１は、増殖が複雑な培地（トリプシン処理ｓｏｙブロス）中で起こったとき
に高分子量デキストランと複合化するＳ．ソブリナス６７１５グルカン結合レク
チンに伴って吸光度が低下することを示す。Terleckyjの合成培地中に増殖させ
た細胞は、阻害のために７倍低い濃度のポリフェノールオキシダーゼを必要とし
た（データは示していない）。

【００８４】 ポリフェノールオキシダーゼは、その反応に低分子量グルカン（デキストラン
Ｔ−１０）が含められた場合に見られるレベル近くまで凝集形成を低減させた（
図１）。ポリフェノールオキシダーゼ処置前に細菌をＴ−１０で前インキュベー
トすることが、凝集のポリフェノールオキシダーゼによる阻害の有意な遮断をも
たらした。対照的に、グリコーゲンでの前インキュベーションは効果を有しなか
った。プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ、及びロイペプチンは、ポリフェノールオ
キシダーゼにより誘導される不活性化を妨げた。

【００８５】 ＥＤＴＡ、アスコルビン酸、ポリビニルピロリドン、乳酸、及び増加させたＣ
ｌ^-のような公知のポリフェノールオキシダーゼ阻害剤は、ポリフェノールオキ
シダーゼのグルカン凝集への効果を低下させた。同様に、ポリフェノールオキシ
ダーゼ活性を温度を下げることにより低下させた場合、そのグルカン結合レクチ
ン活性は変化が認められなかった（表１）。

【００８６】

【表３】

【００８７】ポリフェノールオキシダーゼによる凝集の可逆性 ポリフェノールオキシダーゼを予め形成したグルカン結合レクチン−グルカン
凝集体と混合した場合、凝集再形成が有意に遅くなった。この現象を、その懸濁
液を更なるポリフェノールオキシダーゼ添加と再混合せずに繰り返した（図２）
。Ｓ．ソブリナス細胞結合グルコシルトランスフェラーゼによるペリクル形成の低 減 表２は、１ｍｇ／ｍｌポリフェノールオキシダーゼが、スクロースの存在下に
増殖させたＳ．ソブリナスの培養により形成されるペリクルの形成を効果的に阻
害したことを示す。

【００８８】

【表４】

【００８９】考察及び結論 ポリフェノールオキシダーゼは、酵素分子当たり４つの銅イオンを必要とする
４量体金属酵素である（Vamos-Vigyazo, L., Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 15:4
9127 (1981)）。したがって、一定の金属キレート剤がその活性に阻害性である
と分かっている（Walker, J.R.L., Enzyme Technol. Dig. 4:89 (1975)）ポリフ
ェノールオキシダーゼの効果のＥＤＴＡによる阻害（表１）は、この発見を支持
する。この検討では、微生物のグルカン結合レクチンの結合活性は、ポリフェノ
ールオキシダーゼでの前処理によって有意に低下した。栄養培地中に増殖させた
細胞を最初にデキストラナーゼで処置しなかった場合、ポリフェノールオキシダ
ーゼの効果がマスクされた。このことは、細胞結合グルコシルトランスフェラー
ゼによりその培地中の微量糖から作られた低分子量デキストランが、グルカン結
合レクチン結合部位に強く結合したことを示す。この効果は、その反応混合物を
デキストランＴ−１０と共に前インキュベートすることにより行われたブロック
実験と似たものである。スクロースの無い合成培地中に増殖させた細胞は、ポリ
フェノールオキシダーゼが効果的であるためのデキストラナーゼ処置を必要とし
なかった。

【００９０】 緩やかな攪拌又はポリフェノールオキシダーゼの存在のいずれかが、グルカン
結合レクチンから、Ｔ−１０ではなくデキストランＴ−２０００を除去できるら
しいので、高分子量デキストランについての結合定数は、低分子量デキストラン
よりも低いと考えられる。アスパラギナーゼでグルカン凝集を低減させる アスパラギナーゼでのＳ．ソブリナスの処置は、これら細胞の高分子量デキス
トランを凝集させる能力を低下させた。実施例２：ポリフェノールオキシダーゼによるか又はアスパラギナーゼによるス トレプトコッカス・ソルビナスグルコシルトランスフェラーゼの阻害 微生物には、他の細胞及び組織への接着のためのグルコシルトランスフェラー
ゼ上の交互結合部位を利用するものがある。ポリフェノールオキシダーゼ又はア
スパラギナーゼのグルコシルトランスフェラーゼへの効果は、ポリフェノールオ
キシダーゼ又はアスパラギナーゼが微生物による接着を低減することができる機
構を具体的に示すために検討された。材料及び方法 細胞を増殖させ、そして、実施例１中に記載したようにして一定の操作を行っ
た。追加の操作は、次のようにして行われた。細胞結合グルコシルトランスフェラーゼの阻害 Ｓ．ソブリナス６７１５を、ＴＳＢの管（５ｍｌ）内に植えた。幾つかの管に
は、スクロース（最終濃度＝２００ｍＭ）及び／又はポリフェノールオキシダー
ゼ（最終濃度＝１．０ｍｇ／ｍｌ）を追加的に含有させた。１８時間の増殖後、
管をガラス表面へのペリクルの形成について検査した。精製されたグルコシルトランスフェラーゼＩ及びグルコシルトランスフェラーゼ Ｓの阻害 グルコシルトランスフェラーゼ活性を、下に記載した幾つかの修飾法で当該技
術分野に知られるようにして検出した。タンパク質試料を電気泳動試料用緩衝液
と混合し、そして、ゲルを泳動にかける前に３７℃で１〜４時間インキュベート
した。未固定ゲルを１％ｖｏｌ／ｖｏｌトリトンＸ−１００、２％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ）スクロース、及び０．０７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＮ₃を含有する５０ｍＭ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５．）中に３７℃で２４時間インキュベートした。ま
た、ゲルを、グルコシルトランスフェラーゼとグルカン結合タンパク質（ＧＢＰ
）の双方を検出するために、グルカンＴ２０００（２〜４ｍｇ／ｍｌ）又はフル
オレセインイソチオシアネートとコンジュゲートしたグルカンＴ−１０（２ｍｇ
／ｍｌ）と共に同じ緩衝液中にインキュベートした。インキュベーション後、そ
れらゲルを７５％エタノール中で３０分間固定し、そして、５％酢酸中に０．７
％過ヨウ素酸と共に振動機上で３０分間振動させた。メタ硫酸水素ナトリウム及
び酢酸中での２つの追加的処置の後、それらゲルをシッフ試薬中に０．５〜１時
間入れた。最後に、それらゲルを脱色するために４５％メタノール−４５％酢酸
−１０％Ｈ₂Ｏ中で良く洗った。幾つかの実験において、そのゲルへ荷電する前
に、精製タンパク質を１００μｇ／ｍｌポリフェノールオキシダーゼで１時間、
又はアスパラギナーゼで処置した。結果、考察及び結論 高分子量グルコトランスフェラーゼＩ（約１４５ｋｄａ）は、シッフ試薬によ
り着色されないままの種により明らかとなるように、１００μｇ／ｍｌポリフェ
ノールオキシダーゼと共にする前インキュベーション後、スクロースからデキス
トランを生成することができなかった（図３）。活性ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルの再生後のスクロースの加水分解への活性）が失活を暴露した（図示していな
い）。同様に、化学発光が高められたゲルは、グルカン結合の喪失を暴露した（
図示していない）。グルコシルトランスフェラーゼＳ（約１３５ｋｄａ）の阻害
は見られなかった。

【００９１】 グルコシルトランスフェラーゼ、つまり食物スクロースからグルカンを合成す
るための役目を担うストレプトコッカス酵素は、そのスクロース結合部位とは空
間配置的に異なるグルカン結合活性も有する（Mooser, G. and C. Wong, Infect
. Immun. 56:880-884 (1988)）。本明細書に示したように、ポリフェノールオキ
シダーゼは、増殖培養中のペリクル形成に見られるように、グルカン生成を効果
的に低下させる（表２）。この低下がポリフェノールオキシダーゼによるグルコ
シルトランスフェラーゼＩの阻害に起因することは明らかである（図３）。した
がって、グルカン結合レクチンとグルコシルトランスフェラーゼＩ阻害の組合せ
は、Ｓ．ソブリナスによる歯のコロニー形成への効果を有することができる。

【００９２】 ポリフェノールオキシダーゼは、グルコシルトランスフェラーゼのグルカン結
合活性を阻害することが示された。ポリフェノールオキシダーゼは、グルコシル
トランスフェラーゼによるグルカン生成も妨げる。そのような阻害は、それを介
してポリフェノールオキシダーゼが微生物による接着を低減するところの機構を
提供することができる。アスパラギナーゼによる精製グルコシルトランスフェラーゼの阻害 精製されたＳ．ソブリナスグルコシルトランスフェラーゼのアスパラギナーゼ
での処置は、そのグルコシルトランスフェラーゼによる高分子量デキストランへ
の結合を低減する。活性ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの再生後のスクロースの加
水分解への活性）が失活を暴露した（図示していない）。同様に、化学発光が高
められたゲルは、グルカン結合の喪失を暴露した（図示していない）。実施例３：ポリフェノールオキシダーゼもアスパラギナーゼも微生物を殺さない ポリフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼの阻害的効果の原因として
の致死の可能性を排除するため、これら酵素を、幾つかのタイプの微生物、典型
的には細菌を殺すそれらの能力について評価した。いずれの酵素も、試験された
如何なる微生物も殺さなかった。材料及び方法 細菌を増殖させ、そして、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼ
を、下の事項以外は前述び後述の実施例に記載した方法に従って使用した。Ｓ．ソブリナスの増殖へのポリフェノールオキシダーゼの効果 標準ディスク拡散アッセイを、５００μｇ／ｍｌ及び１．０ｍｇ／ｍｌのポリ
フェノールオキシダーゼで行った。Ｓ．ソブリナスの指数増殖後期の１０倍希釈
（１０^-8まで）の２重シリーズ（duplicate series）をＰＢＳ中に作った。各濃
度の８０μｌのポリフェノールオキシダーゼを１３ｍｍ無菌ろ紙ディスク上にピ
ペットした。それらディスクを、Ｓ．ソブリナスのローン（lawn）を予め植えた
寒天プレートの中央に適用した。プレートを１８時間インキュベートし、そして
、その細菌の増殖へのポリフェノールオキシダーゼのあらゆる効果について視覚
的に検査した。Ｓ．ソブリナスの増殖へのアスパラギナーゼの効果 Ｓ．ソブリナスの増殖の可及的阻害は、典型的には、次のように測定された。
標準ディスク拡散アッセイを、５００μｇ／ｍｌ及び１．０ｍｇ／ｍｌのアスパ
ラギナーゼで行った。Ｓ．ソブリナスの指数増殖後期の１０倍希釈（１０^-8まで
）の２重シリーズをＰＢＳ中に作った。各濃度の８０μｌのアスパラギナーゼを
１３ｍｍ無菌ろ紙ディスク上にピペットした。それらディスクを、Ｓ．ソブリナ
スのローンを予め植えた寒天プレートの中央に適用した。プレートを１８時間イ
ンキュベートし、そして、その細菌の増殖へのアスパラギナーゼのあらゆる効果
について視覚的に検査した。アスパラギナーゼ又はポリフェノールオキシダーゼの他の微生物への効果 類似の方法及び／又は当業者に認識されている方法を、大腸菌の２つの株、Ｓ
．ピオゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、バチルス・セレウス、及びプロテ
ウス・ブルガリスを含む他の微生物の増殖へのアスパラギナーゼの効果を追跡す
るのに使用した。１型線毛とＰ線毛大腸菌の双方をポリフェノールオキシダーゼ
、アスパラギナーゼ、及びアンピシリンと共にインキュベートして、それら細菌
の増殖を阻害するこれら物質の能力を試験した。結果 Ｓ．ソブリナス６７１５の増殖の阻害は、ポリフェノールオキシダーゼを染み
込ませたディスクを使用したディスク拡散アッセイに見られなかった。アスパラ
ギナーゼは、Ｓ．ソブリナス、大腸菌の２つの株、Ｓ．ピオゲネス、クレブシエ
ラ・ニューモニエ、バチルス・セレウス、又はプロテウス・ブルガリスのいずれ
の増殖も有意に阻害しなかった。

【００９３】 全濃度のアンピシリン（（１ｍｇ／ｍｌ〜０．０１５ｍｇ／ｍｌ）が、１型線
毛とＰ線毛大腸菌の各々の増殖を阻害した。試験されたポリフェノールオキシダ
ーゼ（１１２８ユニット／ｍｌ〜１７．５ユニット／ｍｌ）又はアスパラギナー
ゼ（２０ユニット／ｍｌ〜０．３１ユニット／ｍ１）濃度はいずれも、１型線毛
とＰ線毛大腸菌の増殖を阻害することができなかった（データは示していない）
。実施例４：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼによる歯周病原体 の接着の阻害 歯周感染と疾患に対するそれらの有用性を評価することに供するため、ポリフ
ェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、幾つかの歯周病原体による接着
を阻害することが検討され且つ測定された。材料及び方法 細菌はすべて、American Type Culture Collectionから購入されたもので、そ
れには、Ｓ．サングイス１０５５６、アクチノミセス・ナエスルンジイ株Ｔ１４
Ｖと１２１０４、ポルフィロモナス・ギンギヴァリスＷ５０、アクチノバチルス
・アクチノミセテムコミタンス３３３８４、フソバクテリウム・ヌクレアタム２
５５８６、カプノサイトファガ・オクラセア２７８７２、及びプレヴォテラ・イ
ンテルメディア２５６１１が含まれる。１型線毛大腸菌は、Prof D.L.Hasty, VA
MC,. Memphis,TNにより提供された。

【００９４】 Ｓ．サングイス１０５５６、Ａ．ナエスルンジイ株１２１０４とＴ１４Ｖ、及
び大腸菌は、Todd-Hewittブロス（BBL Microbiology Systems, Cockeysville, M
D）中に静置培養で増殖させた。Ｐ．ギンギヴァリスＷ５０、Ａ．アクチノミセ
テムコミタンス、及びＣ．オクラセアは、脳心臓浸出ブロス（ＢＢＬ）中に増殖
させた。Ｆ．ヌクレアタム２２５８６、及びＰ．インテルメディア２５６１１は
、修飾されたSchaedlerブロス(ＢＢＬ)中に増殖させた。Ｓ．サングイス１０５
５６を除いたすべての口内種は、ＧａｓＰａｋｓ（ＢＢＬ）で、Ｈ₂、ＣＯ₂及び
Ｎ₂（１０：１０：８０）を有する嫌気雰囲気下に静置培養として３７℃でイン
キュベートした。Ｓ．サングイスは、５％ＣＯ₂中の静置培養として３７℃でイ
ンキュベートした。

【００９５】 細菌を指数増殖期中期〜後期に遠心分離（４℃で１０，０００×ｇ１０分間）
により採取した。それら細胞を、共沈緩衝液（３０ｍＭの３［Ｎ−モルフォリノ
］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ７）中で２回洗い、そして、５４０ｎ
ｍで０．６〜０．８ｎｍ（１ｃｍパス）の光学濃度に調節した。双方の共沈パー
トナーを含有する３ｍｌの最終容量を使用した。細胞を３７℃で６０分間インキ
ュベートし、リン酸緩衝液（ＰＢ）で２回洗い、０．８のＯＤに懸濁し、そして
、それらのパートナーと混合した。細胞上のアドヘシンは、１００℃で１５分間
加熱することにより不活性化することができた。酵素濃度は、アスパラギナーゼ
について２０Ｕ／ｍｌとし、ポリフェノールオキシダーゼについて９０Ｕ／ｍｌ
とした。ポリフェノールオキシダーゼはマッシュルームポリフェノールオキシダ
ーゼ；ペル（Ｐｅｒ）は西洋わさびポリフェノールオキシダーゼ；アスパラギナ
ーゼは大腸菌アスパラギナーゼとした。

【００９６】 共沈を濁度変化により評価した。攪拌混合機上のそれら細胞の１０秒間混合の
後、吸光度読取りを３０秒毎に行った。共沈のパーセンテージは、次式：パーセ
ント共沈＝［ＯＤ₅₄₀（Ａ）＋ＯＤ₅₄₀（Ｂ）−ＯＤ₅₄₀（Ａ＋Ｂ）］／（ＯＤ₅₄₀ （Ａ）＋ＯＤ₅₄₀（Ｂ））から計算される（式中、Ａは１株の細胞を含有する対
照実験、Ｂは他の１株の細胞を含有する対象実験、Ａ＋Ｂは両細胞を含有する反
応混合物である）。それら共沈アッセイを、データの再現性を確かめるために３
回繰り返した。

【００９７】 血球凝集は、リン酸緩衝液（１０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、１０ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄ 、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣ１）中のヒツジ血液の５０μｍｌの１％
懸濁液及び段階的に希釈された５０μｍｌの細胞懸濁液が加えられた９６マイク
ロウェル（Ｎｕｎｓ）プレート中で行われた。それら細胞を５４０ｎｍで１．４
ＯＤで調節した。すべての株は、血球凝集前に、ポリフェノールオキシダーゼ（
９０Ｕ／ｍｌ）又はアスパラギナーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）と共にＮａＣｌの無い緩
衝液中に３７℃で９０分間処置された。結果 結果を表３及び表４に示す。表４は、歯周病原体に関する血球凝集アッセイの
結果を示す。

【００９８】

【表５】

【００９９】

【表６】

【０１００】実施例５：アスパラギナーゼ及びポリフェノールオキシダーゼがＰ．ギンギヴァ リスの“トリプシン様”プロテアーゼ活性を阻害する これら酵素が作用し得る機構の検討の一部として、ポリフェノールオキシダー
ゼ及びアスパラギナーゼは、Ｐ．ギンギヴァリスによる接着に関与するプロテア
ーゼ活性を阻害することが評価され且つ具体的に示された。材料及び方法 Ｐ．ギンギヴァリスの細胞懸濁液をＰＢ中に５４０ｎｍで１．３ＯＤに調節し
た。１００μｌ量の７００μｇ／ｍｌＢＡＰＮＡ（ベンゾイル−ＤＬ−アルギニ
ン−ｐ−ニトロアニリド）を３ｍｌの細胞懸濁液に加えた。それら細胞を３７℃
で異なる時間インキュベートした。ブランクには、Ｐ．ギンギヴァリス細胞懸濁
液と同じ比率でＢＡＰＮＡ及び緩衝液を含有させた。管を遠心分離にかけ、その
結果得られた上清を１：３で希釈し、４０５ｎｍで読み取った。アスパラギナー
ゼ及びポリフェノールオキシダーゼは、それぞれ２０Ｕ／ｍｌ及び８０Ｕ／ｍｌ
とした。結果 結果は、トリプシン様活性がポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラ
ギナーゼにより減少したことをはっきりと示した。結論 かくして、アスパラギナーゼ及びポリフェノールオキシダーゼは、接着及び／
又は血球凝集にだけでなく、Ｐ．ギンギヴァリスのタンパク質分解活性にも影響
を与える。プロテアーゼへの効果の確認は、コラーゲン基質（アゾコール（azoc
oll））アスパラギナーゼ又はポリフェノールオキシダーゼの加水分解の低減を
介して示された。実施例６：アスパラギナーゼがマンノースレセプターへの大腸菌の接着を阻害す る 材料及び方法は、概して上の実施例に記載したが、大腸菌によるマンノースレ
セプターへの接着を観察することに関して修飾された。例えば、１型線毛を持つ
大腸菌を増殖させ、そして、アスパラギナーゼ又はポリフェノールオキシダーゼ
のいずれかでの実験のための上に記載した方法に従ってアスパラギナーゼで処置
した。次いで、それら大腸菌をマンノースレセプターの供給源と共にインキュベ
ートした。

【０１０１】 アスパラギナーゼで処置されている大腸菌は、そのように処置されていない細
胞と比較して、マンノースレセプターへの結合の低減を示した。実施例７：ポリフェノールオキシダーゼが大腸菌の酵母への接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により阻害できる広範な相互作用を具体
的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼは、真核細胞への細菌の接着を阻
害することが評価され且つ示された。材料及び方法 材料及び方法は、概して、上述の実施例に記載したが、酵母への大腸菌による
接着を観察することに関して少し修飾された。例えば、１型線毛を持つ大腸菌を
トリプシン処理ｓｏｙブロス（ＴＳＢ）中に３７℃に１８時間静置して増殖させ
た。細胞をＰＢＳ中で２回洗い、そして、ＰＢ中に懸濁した。細胞をポリフェノ
ールオキシダーゼで３７℃で処置し、２回洗い、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。
大腸菌（１×１０⁸細胞）を１×１０⁵サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharo
myces cerevisiae）細胞と共に３ｍｌ量でインキュベートして、且つ３７℃で３
０分間反転動作で回転させた。懸濁液を採取し、ＰＢＳ中で２回洗い、そして、
３００μｌＰＢＳ中に再懸濁した。メチル−α−Ｄ−マンノースを幾つかの反応
混合物に加えた。１０μｌの試料を取り出して顕微鏡スライド上に載せ、加熱固
定し、クリスタルバイオレットで２分間染色してから濯ぎ、そして、乾燥させた
。調製物を位相差顕微鏡で１０００倍で見た。酵母細胞に接着していた細菌の数
を表にまとめた。結果及び結論 大腸菌のポリフェノールオキシダーゼ処置は、マンノース含有サッカロミセス
細胞へのその接着を有意に低減させた。対照実験細胞に加えられたメチル−α−
マンノースは、サッカロミセスへのそれらの接着を妨げた。ポリフェノールオキ
シダーゼ処置前に大腸菌をメチル−マンノースと共に前インキュベートすること
は、接着の低減を媒介するポリフェノールオキシダーゼを排した。したがって、
１型線毛の大腸菌は、ポリフェノールオキシダーゼに感受性であり、且つマンノ
ースリガンドは、ポリフェノールオキシダーゼの効果に対して防護物質となる。
ポリフェノールオキシダーゼは、その大腸菌の生存能力を低下させなかった。実施例８：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがヘリコバクター ・ピロリによる接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により阻害可能である広範な細菌を具体
的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼは、真核細胞へのＨ．ピロリの接
着を阻害することが評価され且つ示された。実験１ 材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼの取り扱い方法及び微生物による接着の観察方法
は、概して、上述の実施例に記載したもので、Ｈ．ピロリに適合させた変法を伴
った。

【０１０２】 血球凝集は、当業者に知られているあらゆる様々な方法により測定されること
ができる。特に、微生物による接着へのポリフェノールオキシダーゼの効果は、
ポリフェノールオキシダーゼで処置された細菌（通常、５０μｌ）が丸底マイク
ロタイタープレートウェル内に段階的に希釈されたところへの操作により検討で
きる。等容量の赤血球懸濁液が加えられた。対照実験、つまり細菌無し又は未処
置細菌が平行して実験された。未処置細菌は、ポジティブコントロールとして供
された。それらプレートを３０分間緩やかに回転（相互反転動作）させ、そして
、凝集物を沈殿させた。その力価は、凝集を生じさせる最大細菌希釈度の逆数と
して得ることができた。実験は、典型的には２重に行われた。すべてのウェルを
ネガティブ（細菌なし）コントロールと比較した。

【０１０３】 Ｈ．ピロリの臨床単離物は、ルイビル（Louisville）の大学病院から得られた
。その生物を１０％ＣＯ₂及び５％Ｏ₂中に血液寒天Isovitalex上で３６〜４０時
間継代培養した。細胞をその培地から掻き出し、そして、ＰＢＳで２回洗った。
それら細菌を０．８の吸光度（１ｃｍ、５４０ｎｍ）に懸濁し、そして、１００
μｇ／ｍｌ最終濃度のマッシュルームポリフェノールオキシダーゼ（Sigma Chem
ical Company）を加えた。次いで、それら細胞を再びＰＢＳ中で２回洗ってから
１．０の吸光度に懸濁した後、その懸濁液を３７℃で１時間インキュベートした
。ポリフェノールオキシダーゼの不在下に同じく処置された細胞を対照実験とし
て供した。ヒト赤血球細胞（ＲＢＣ）（Ｏ型）を有志者から取得し、そして、Ｐ
ＢＳで３回洗った。それらＲＢＣを３％の懸濁液として使用した。

【０１０４】 それら細菌を、丸底マイクロタイタープレート内に１．０の吸光度で始めて２
倍希釈にした。細菌の５０μｌ希釈液に５０μｌ量のＲＢＣを加えた。すべての
試料が２重に実験された。血球凝集は、マイクロタイタープレート内に散在させ
られたか又はほぼ沈殿させられた細胞の出現により認められた。対照実験ＲＢＣ
は、プレート内にむらなく均一に沈んだ。結果及び結論 それら結果は、段階的６回希釈まで細菌が血球凝集させるはずであるが、ポリ
フェノールオキシダーゼで処置された細菌は、３回希釈までしか血球凝集させな
いことを示した。換言すると、それら結果は、対照実験細胞が０．０１５６の吸
光度で血球凝集したが、ポリフェノールオキシダーゼで処置された細菌は、０．
１２５吸光度ユニットの細胞濃度を要求したことを示す。実験２ 材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び血球凝集
の観察方法は、概して、上に記載したもの及び上述の実施例中のもので、次の変
法を伴った。

【０１０５】 ２種の口腔咽頭単離物（１つはVA病院（Dr.Mary Kemper）からもので、もう１
つはUL病院（Dr.Jim Snyder）からのものであり、双方とも生体タイプ１である
）を、４％フィルデ（Difco）試薬を添加した浅いＢＨＩ培地に３５℃で５％Ｃ
Ｏ₂中に一晩増殖させた。それら細胞を遠心分離し、そして、適切なＰＢ又はＰ
ＢＳ緩衝液中で２回洗った。懸濁後、それら細胞をアスパラギナーゼ又はポリフ
ェノールオキシダーゼと共にインキュベートしてから、ＰＢＳ中で２回洗い、そ
して、ヒトＯ型赤血球細胞を使用して血球凝集についてアッセイした。懸濁した
Ｈ．インフルエンザは、１．０吸光度ユニットの濃度を有した。結果及び結論 実験２の結果を表５に示す。これら結果は、アスパラギナーゼ又はポリフェノ
ールオキシダーゼでの処置が、一方の単離物についての血球凝集実験におけるＨ
．インフルエンザによる接着を検出し得ないレベルにまで低減可能であり、且つ
もう一方の単離物についての力価を４〜８倍に上昇可能であることを示す。

【０１０６】

【表７】

【０１０７】実施例９：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが赤血球へのイン フルエンザウイルス吸着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物を
具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、赤
血球へのインフルエンザウイスルの接着を阻害することが評価され且つ示された
。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び血球凝集
の観察方法は、概して、上の実施例中に記載したもので、インフルエンザウイス
ルのための次の変法を伴った。ニワトリ赤血球の血球凝集 インフルエンザＡ株Ｈ１Ｎ１をUniversity of Michigan Department of Publi
c Healthから得た。それを、特定病原体を持たない発育鶏卵の尿膜腔液中で増殖
させた。ウイルスを含有する尿膜腔液をポリフェノールオキシダーゼ（７０Ｕ／
ｍｌ）又はアスパラギナーゼ（１０Ｕ／ｍｌ）で処置し、そして、それらの表面
上にノイラミン酸糖タンパク質を含有するニワトリ赤血球を血球凝集させるその
能力について試験した。血球凝集前に、それら酵素を３００，０００ダルトンカ
ットオフでの膜を介した限外ろ過により除去した。すべての試験が３重に行われ
、且つ適切な緩衝液を共にするインキュベーションからなる対照実験が行われた
。結果及び結論 ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼによるニワトリ赤血球の血
球凝集の阻害が見られた（表６）。血球凝集は、インフルエンザウイルスによる
接着を必要とする。低い力価は、接着又は阻害の弱い接着を得るために高い濃度
又は多量のウイルスが必要とされたことを示す。

【０１０８】

【表８】

【０１０９】実施例１０：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがニワトリから のサルモネラ菌株による接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な細菌を具
体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、ニワ
トリから単離されたサルモネラによる赤血球への結合を阻害することが具体的に
示された。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、上の実施例に記載されたもので、これら方法を
サルモネラに適合させた変法とした。

【０１１０】 ３株のサルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）臨床単離
株、つまりＳＥ７９、ＳＥ８９−８３１２及びＳＥＳ１−０７２−Ｚを使用した
。それら細菌株を脳心臓浸出（ＢＨＩ）ブロス中に３７℃で４８時間静置増殖さ
せた。それら細胞を遠心分離により採取し、そして、１０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ
Ｂ）ｐＨ７．５中で２回洗った。次いで、最終細菌ペレットを同じ緩衝液中に望
ましい濃度に懸濁した。

【０１１１】 細菌懸濁液ＯＤ１．０（各々５ｍｌ）を、ポリフェノールオキシダーゼ（７０
Ｕ／ｍｌ）又はアスパラギナーゼ（６５Ｕ／ｍｌ）の不存在下に又は存在下に混
合し、そして、３７℃で２時間静置でインキュベートした。次いで、それら細胞
を遠心分離し、ＰＢ（ｐＨ７．５）で２回洗い、そして、最終容量１２５μｌで
懸濁した。これら細胞を血球凝集試験にかけた。

【０１１２】 血球凝集検討のために、ウマからの赤血球を使用した。それら赤血球を低速遠
心分離１０分間によりＰＢＳ（ｐＨ７．５）で洗い、そして、同じ緩衝液中に２
％に懸濁した。結果及び結論 ニワトリから単離されたサルモネラ菌株により引き起こされる血球凝集は、ポ
リフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼにより阻害された（表７及び８
）

【０１１３】

【表９】

【０１１４】

【表１０】

【０１１５】実施例１１：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがヒツジ血球へ のエンタモエバの接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物を
具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、血
球へのアメーバ病原体の接着を阻害することが評価され且つ示された。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、上の実施例に記載されたもので、これら方法を
エンタモエバに適合させた変法とした。

【０１１６】 エンタモエバ種を５％ＣＯ₂でのＴＹＩ−Ｓ−３３培地中に３７℃で７２時間
増殖させた。その培養物をエンタモエバを４℃で冷蔵し且つ６００×ｇで１０分
間遠心分離することにより採取した。集められたアメーバをリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４での１６ｍＭのＫ₂ＰＯ₄、３ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄）で２回洗った。それらア
メーバを同じ緩衝液中に５４０ｎｍで１．０の光学濃度に懸濁した。

【０１１７】 それらアメーバをポリフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼで３７℃
で９０分間処置した。アスパラギナーゼ処置については、アメーバをリン酸緩衝
液中にｐＨ８で懸濁した。処置後、それらアメーバをリン酸緩衝液中で２回洗っ
た。

【０１１８】 ヒツジ血球を０．１５ＭのＮａＣｌで３回洗った。洗ったＲＢＣを固定するた
めに、それらを０．１５ＭのＮａＣｌで５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）懸濁液に希釈
し、５０容量の固定溶液（９ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄、８５ｍＭのＮａＣｌ、１％グ
ルタルアルデヒド）と４℃で混合し、そして、３０分間緩やかに攪拌した。それ
ら固定されたＲＢＣを０．１５ＭのＮａＣｌで５回、蒸留水で５回洗い、そして
、最終的に０．１５ＭのＮａＣｌ中に懸濁した。接着実験 ５０μｌのアメーバ懸濁液を５０μｌのＲＢＣ（１％）と室温で３０分間緩や
かな攪拌下に混合することにより接着を開始させた。接着を２．５％グルタルア
ルデヒド固定により停止させた。それらアメーバをハリス（Harris）修飾ヘマト
キシリン試薬で２〜３分間染色した。その接着を顕微鏡で可視化した。最小でも
１００血球がカウントされた。

【０１１９】 その血球凝集は、１％グルタルアルデヒドで固定されたヒツジ血球の５０μｌ
の懸濁液と、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に段階的に希釈された５０μｌの細
胞懸濁液とが加えられたところの９６マイクロウェル（Ｎｕｎｃ）プレート内で
行われた。それら細胞を５４０ｎｍで１．０４ＯＤに調節した。エンタモエバは
、ＮａＣｌの無い緩衝液中３７℃でポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギ
ナーゼで、それぞれ９０分間及び３時間処置された。結果 エンタモエバによる結合の阻害は、表９及び１０に示される結果により具体的
に示された。

【０１２０】

【表１１】

【０１２１】

【表１２】

【０１２２】実施例１２：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが尿路上皮細胞 への１型及びＰ線毛大腸菌の接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物と
基層細胞を具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナ
ーゼは、上皮細胞への細菌の接着を阻害することが評価され且つ示された。実験１ 材料及び方法 １型線毛活性を持つ大腸菌株及びＰ線毛活性を持つ大腸菌株を、上の実施例に
記載した方法及び当業者に知られている方法により増殖し、処置してアッセイし
た。

【０１２３】 尿路上皮細胞（ＵＥＣ）を当業者に知られている方法により得た。簡単に説明
すると、それら細胞は、２００ｍｌの無菌的に採取した男性早朝尿の遠心分離（
５０００×ｇ）により得た。細胞をＰＢＳ中で３回洗い、そして、反転回転装置
内に１×１０⁹細胞／ｍｌの濃度に懸濁した。３０分後、混合物をポリカーボネ
ートフィルター（孔径＝１０μｍ）上に集め、そして、３倍容量の冷えたＰＢＳ
で洗った。フィルターを顕微鏡用ガラススライド上に押しつけ、次いで加熱固定
し、そして、クリスタルバイオレットで２分間染色した。スライドを位相差顕微
鏡での１０００倍で検査した。各実験条件について、２００ＵＥＣを検査した。
接着細菌を既述の実施例に記載されるようにして定量した。結果及び結論 大腸菌のアスパラギナーゼへの曝露は、これら細菌の尿路上皮細胞への結合の
低減をもたらした（図４）。増加した濃度のアスパラギナーゼとの細菌のインキ
ュベーション、又はアスパラギナーゼとのインキュベーションの増加した期間で
の細菌のインキュベーションで、結合のより大きな低減が見られた。実験２ 接着のフロー血球計数分析は、脱落したヒト尿路上皮細胞（ＵＥＣ）に接着す
るそれら細菌の能力への、ポリフェノールオキシダーゼ及び／又はアスパラギナ
ーゼでそれら細菌を前処置することの阻害的効果を具体的に示した。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、上の実施例に記載したもので、これら方法を上
皮細胞に適合させた変法とした。

【０１２４】 それら細菌を蛍光色素ＣＦＤＡ−ＳＥで細胞内標識した。それらＵＥＣの蛍光
強度中央値を、それらに接着した細菌数の指標として用いた。添付の図面におい
て、蛍光強度中央値は、対照実験状態（ＵＥＣ＋未処置細菌）を１００％として
用いて、接着％に変換されている。結果及び考察 １型線毛大腸菌 ７１ユニット／ｍｌの濃度でのポリフェノールオキシダーゼでの細菌の処置は
、低減の殆ど無い接着（６％）をもたらしたが、１４１ユニット／ｍｌと２８２
ユニット／ｍｌの濃度でのポリフェノールオキシダーゼでの処置は、大きく低減
された接着（それぞれ６０％と４４％）をもたらした（図１）。最大ポリフェノ
ールオキシダーゼ濃度は１４１ユニット／ｍｌよりも効果的でない事が、様々な
アドヘシンのポリフェノールオキシダーゼ処置について一貫して見られた。本発
明を限定する事ではないが、この発見は、宿主細胞膜上のタンパク質を含み得る
、高濃度で取り囲むタンパク質とのシッフ塩基の形成に起因するものであり得る
。

【０１２５】 アスパラギナーゼでの１型線毛大腸菌の処置は、ポリフェノールオキシダーゼ
での処置後に得られた結果よりも一貫性のある結果をもたらした。アスパラギナ
ーゼの濃度＜２ユニット／ｍｌは、接着の限定的低減（１３％）をもたらしたが
、濃度＞２ユニット／ｍｌは、ＵＥＣへの大きく低減した接着（８５〜９０％）
をもたらした（図２）。

【０１２６】 連続的酵素処置、つまりポリフェノールオキシダーゼの後にアスパラギナーゼ
又はその逆順序の処置に細菌をかけることは、ＵＥＣへの細菌接着を低減するこ
とに、それら酵素を単独にしたときと同様の大きな効果を有しなかった。ポリフ
ェノールオキシダーゼ１４１ユニット／ｍｌ後のアスパラギナーゼ１０ユニット
／ｍｌは、接着の２５％低減しかもたらさなかったが、アスパラギナーゼ１０ユ
ニット／ｍｌ後のポリフェノールオキシダーゼ１４１ユニット／ｍｌは、接着の
４５％低減を与えた。これら処置で接着の低減は生じたが、ポリフェノールオキ
シダーゼとアスパラギナーゼは、単独でそれぞれ６０％と９０％の、より良好な
接着の防止を提供した（図３）。

【０１２７】 その酵素作用部位を探るため、１型線毛大腸菌を４メチルumbelliferyl１α−
Ｄ−マンノピラノシド（ＭＵＭＢ、５０ｍＭ）と共にインキュベートし、その結
合部位を保護した後にポリフェノールオキシダーゼ（１４１ユニット／ｍｌ）又
はアスパラギナーゼ（１０ユニット／ｍｌ）のいずれかで処置した。これら処置
は、それぞれに接着の２５％と５０％低減をもたらした。容量依存性効果につい
て観察するために、それら細菌を様々な濃度（１０ｍＭ、５０ｍＭ、又は２００
ｍＭ）のマンノピラノシドと共にインキュベートし、次いで、ポリフェノールオ
キシダーゼで１４１ユニット／ｍｌの濃度で処置した。試験されたマンノピラノ
シドの各濃度（〜３０％）に関し、接着の低減のパーセントが実質的に未変化で
あったので、５０ｍＭが更なるアッセイに使用された。それら細菌をマンノピラ
ノシド（５０ｍＭ）の後にポリフェノールオキシダーゼ（１４１ユニット／ｍｌ
）又はアスパラギナーゼ（１０ユニット／ｍｌ）と共にインキュベートし、それ
ぞれにＵＥＣへの接着の２５％低減と４０％増加がもたらされた（図４）。Ｐ線毛大腸菌 ７１ユニット／ｍｌの濃度でのポリフェノールオキシダーゼでの細菌の処置は
、一貫して接着の４０％低減をもたらした。１４１ユニット／ｍｌと２８２ユニ
ット／ｍｌの濃度のポリフェノールオキシダーゼでの細菌の処置は、平均してそ
れぞれ３０％と５５％の接着の低減となった（図５）。増加する濃度のスパラギ
ナーゼ（２．５、５、及び２５ユニット／ｍｌ）でのＰ線毛大腸菌の処置は、そ
れぞれ接着の４５、５５、８５％低減をもたらした（図６）。連続的酵素処置、
つまりポリフェノールオキシダーゼの後にアスパラギナーゼ又はその逆順序の処
置にＰ線毛大腸菌をさらすことは、ＵＥＣへの細菌接着を低減することへの効果
の変動を有した。ポリフェノールオキシダーゼ１４１ユニット／ｍｌ後のアスパ
ラギナーゼ１０ユニット／ｍｌは、接着に５５％低減をもたらしたが、アスパラ
ギナーゼ１０ユニット／ｍｌ後のポリフェノールオキシダーゼ１４１ユニット／
ｍｌは、対照実験の接着量からの低下をもたらさなかった（図７）。

【０１２８】 その酵素作用部位を探るため、Ｐ線毛大腸菌をグロボシドと共にインキュベー
トし、その結合部位を保護した後にポリフェノールオキシダーゼ（２８２ユニッ
ト／ｍｌ）又はアスパラギナーゼ（５ユニット／ｍｌ）のいずれかで処置した。
これら処置は、未処置細菌とほぼ同じだけのＵＥＣへの接着の低減に終わった。 結論 上の結果は、ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの双方が大腸菌
の両タイプの接着を低減する能力を有することを具体的に示す。同族炭水化物リ
ガンドでの細菌の前インキュベーション後の酵素効果の減少は、それら酵素がそ
れら細菌アドヘシン上の実際の結合部位に影響を与えていることを具体的に示す
。実施例１３：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがストレプトコ ッカス・ピオゲネスの頬側上皮細胞（Buccal Epithelial Cell）への接着を阻害 する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物と
基層細胞を具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナ
ーゼは、上皮細胞への細菌の接着を阻害することが評価され且つ示された。

【０１２９】 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法をストレプトコ
ッカス及び上皮細胞に適合させた変法とした。Ｓ．ピオゲネスへのポリフェノールオキシダーゼ効果の濃度依存性 図９は、フロー血球計算を使用して測定されたＳ．ピオゲネスの頬側上皮細胞
に対する相対的接着を示す。アスパラギナーゼがストレプトコッカス・ピオゲネスの頬側上皮細胞への接着を 阻害する この実験は、Ｍ１４Lowe、ＹＬ３、Ｍ２４、及びＴ２／ＭＲを含む５株のＳ．
ピオゲネスの増殖及び採取から開始された。それら株を３７℃インキュベーター
内でＢＨＩブロス中に一晩増殖させた。それら培養物を静置条件下で増殖させた
。次いで、それら細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７）で２回洗うことにより採取した
。それら細胞のポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼでの処置は、
採取した細胞の原料溶液の光学濃度を調べることから開始された。これは分光光
度計を使用して行われた。各株を、２つの濃度（１００μｇ／ＯＤと３００μｇ
／ＯＤ）のポリフェノールオキシダーゼ及び１つ濃度（３００μｇ／ＯＤ）のア
スパラギナーゼで処置した。それら細胞のポリフェノールオキシダーゼでの処置
は、３７℃インキュベーター内で１．５時間施された。次いで、それら細胞をリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）で２回洗った。この時点で共凝集が作られ、そして、静置
条件で２時間置かれた。次いで、各共凝集のスライドを作った。

【０１３０】 それら細胞のアスパラギナーゼでの処置も、３７℃インキュベーター内で３時
間施された。処置前に、それら細胞をｐＨ＝８のリン酸緩衝液で２回洗った。処
置後、それらをｐＨ＝７のリン酸緩衝液で２回洗った。次いで、共凝集及びスラ
イドをポリフェノールオキシダーゼについてのようにして作った。

【０１３１】 頬側細胞は、綿棒を使用して頬内側から採取された。次いで、それら細胞を、
共凝集に用いる前にリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で５回洗った。 データは、Ｓ．ピオゲネスのアスパラギナーゼでの処置がこれら細菌の頬側細
胞への結合を低減させたことを具体的に示した。アスパラギナーゼは、等量のポ
リフェノールよりも大きな接着の低減を提供した。ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがストレプトコッカス・ピオ ゲネスのヒト頬側細胞への接着を阻害する 操作 ストレプトコッカス・ピオゲネス株を増殖させ、そして、純粋培養物を血液寒
天プレート上へ３７℃で単離した。続いて、各々を脳−心臓浸出（ＢＨＩ）栄養
ブロス中に３７℃で継代増殖のために植えた。

【０１３２】 次いで、各Ｓ．ピオゲネス株の細胞をリン酸緩衝液（ｐＨ７）で３回洗った。
各株の光学濃度（ＯＤ）を分光高度計を使用して測定し、そして、０．８に調節
した。各株の１ｍｌをポリフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼで処置
した。対照実験細胞と酵素添加細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。各
々を１５，０００ｒｐｍで１０分間３回洗い、そして、０．９ｍｌリン酸緩衝液
中に再び集めた。

【０１３３】 ヒト頬側細胞をリン酸緩衝液中に収集し且つ洗った。それら頬側細胞とＳ．ピ
オゲネスを、各株についてそれぞれ３：１の比率で合わせ、そして、３０分イン
キュベートした。頬側細胞を遠心分離により取り出し、そして、ストレプトコッ
カスバックグラウンドを低減するために３回洗った。次いで、頬側細胞−ストレ
プトコッカス複合体をスライド上に塗った。得られたスライドをグラム法を使用
して染色し、そして、１００倍オイル浸漬レンズ下で見た。各株についてのＳ．
ピオゲネスの数を、少なくとも５０頬側細胞についてカウントした。結果及び結論 それら結果（表１１）は、グループＡストレプトコッカス類の幾つかのセロタ
イプが、アスパラギナーゼとポリフェノールオキシダーゼに感受性であることを
示した。それら結果で、アスパラギナーゼ又はポリフェノールオキシダーゼを含
むマウスウオッシュ／うがい薬が、傷んだ喉に有用であろうことが示された。

【０１３４】

【表１３】

【０１３５】実施例１４：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがニューモコッ カス類及びグループＡストレプトコッカス類の頬側細胞への接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物と
基層細胞を具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナ
ーゼは、上皮細胞への追加的細菌の接着を阻害することが評価され且つ示された
。

【０１３６】 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法をこれら細菌及
び頬側細胞に適合させた変法とした。特に、接着は、Ｓ．ピオゲネスについて示
されたのと同様のやり方で測定された。

【０１３７】 それらＳ．ニューモニエ株は接着性に乏しかったが、アスパラギナーゼは、株
６３０３の接着を低減させた。Ｓ．アガラクチア（S.agalactiae）については、
その接着が両酵素により低減した。少なくとも１００頬側細胞をカウントした。 実施例１５：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが、尿中上皮細 胞に接着した正常生物相（Normal Biota）へ小さな効果を有する ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼは、長時間非病原性コロニー
形成体（正常生物相）と比較して、病原性（新たにコロニー形成する）細菌へ不
釣り合いな効果を有することが評価され且つ示された。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法を正常生物相に
適合させた変法とした。

【０１３８】 脱落した上皮細胞をそれら酵素と共にインキュベートし、ろ過により収集し、
顕微鏡用スライドに移し、そして、クリスタルバイオレットで染色した。次いで
、各スライドからの５０上皮細胞を、それらと結合している細菌の数について評
価し、且つ、４つのカテゴリー：それらと結合している０〜９細菌、１０〜２９
細菌、３０〜４９細菌、又は５０を越える細菌を持つ細胞のうちの１カテゴリー
に入れた。結果 脱落した尿中上皮細胞からの内在性生物相の除去 ポリフェノールオキシダーゼ（７０Ｕ／ｍｌ又は１４０Ｕ／ｍｌ）又はアスパ
ラギナーゼ（５Ｕ／ｍｌ又は１０Ｕ／ｍｌ）のいずれかでの処置は、それら酵素
と共にする３０分インキュベーション後、ＵＥＣに接着した内在性細菌の数への
比較的小さな効果を有した。

【０１３９】 表１２は、３０を越える細菌を運ぶＵＥＣの数（５０ＵＥＣのパーセンテージ
として）を示す。酵素処置のそれら効果は、濃度依存性であった。ポリフェノー
ルオキシダーゼ処置は、多くの内在性細菌を持つＵＥＣの数を減少させたが、ア
スパラギナーゼは殆ど効果を有しないか又は効果を有しなかった。

【０１４０】

【表１４】

【０１４１】結論 それら酵素が病原性（新たにコロニー形成する）細菌に対し、長期非病原性コ
ロニー形成体（正常生物相）とは不釣り合いな影響を与えることを示すという事
は、ポリフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼの治療的使用を促進する
ことができる。実施例１６：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが酵母による軟 組織細胞への接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な微生物を
具体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、真
核生物、つまり酵母の、軟組織細胞への接着を阻害することが評価され且つ示さ
れた。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法を酵母に適合さ
せた変法とした。

【０１４２】 Ｃ．アルビカンスをSchaedlerブロス中に３７℃で一晩増殖させた。コロニー
をSabaroud寒天上に維持した。菌糸は同じ培地からのものであったが、１％トリ
トン（Triton）Ｘ−１００が添加された。一晩培養からのそれら細胞を遠心分離
により採取し、ＰＢ中で２回洗い、そして、最終的に同じ緩衝液中に０．８の濃
度に懸濁した。次いで、これら細胞をアスパラギナーゼ又はポリフェノールオキ
シダーゼと共にインキュベートし、ＰＢＳで２回洗って懸濁し、そして、洗われ
ているヒト頬側細胞と混合した。

【０１４３】 インキュベーションの後、それら頬側細胞−カンジダ混合物を５００×ｇで遠
心分離し、ＰＢＳ中で２回洗い、そして、染色及びカウントのためのスライド上
に塗り付けた。バックグラウンドのカンジダは無視した。頬側細胞に直接接着し
た細胞のみを数えた。幾つかの実験において、カンジダの分布を測定してプロッ
トした（示していない）。他の実験では、Ｃ．アルビカンス菌糸についての増殖
（enrichment）が、それら培養物をインキュベートすることにより実現した。結果 結果を表１３に示す。各条件に関して、最小で１００頬側細胞を接着について
分析した。

【０１４４】

【表１５】

【０１４５】実施例１７：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが細菌による細 胞外マトリックスタンパク質への接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な基層を具
体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、真核
生物、つまり酵母の軟組織細胞への接着を阻害することが評価され且つ示された
。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法を細胞外マトリ
ックスに適合させた変法とした。コラーゲン結合アッセイ ウェルを１ｍｇ／ｍｌ溶解性コラーゲンで満たし、４℃で一晩置いた。対照実
験ウェルは１％ＢＳＡで被覆された。それらタンパク質溶液を除去し、そして、
３７℃で１時間置いた。２％ＢＳＡの溶液をそれらウェルに加え、占められてい
ない部位をブロックして細菌の非特異的結合を防いだ。３０分後、ＢＳＡを除去
し、そして、それらウェルを蒸留水で一度洗った。最後に、細菌懸濁液（１００
μｌ、ＯＤ１．４）をそれらプレートに加え、そして、３７℃で２時間インキュ
ベートした。結合していない細菌は、それらウェルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０
を含有するＰＢＳで３回洗うことにより除去された。それらウェルを３７℃で３
０分間乾燥し、そして、クリスタルバイオレットで１５分間染色した。ウェルを
蒸留水で濯ぎ、そして、３７℃で２時間乾燥させた。次いで、各ウェルに１００
μｌの９５％（ｖ／ｖ）エタノールを加えた後、それらプレートを揺すって染料
を放出させ、そして、５５０ｎｍの読み取りを行った。フィブロネクチン結合アッセイ ウェルを炭酸緩衝液（５０ｍＭＮａ₂ＣＯ₃−ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ９．５オーバ
ーナイト）中に希釈したヒト血清フィブロネクチン（５０μｇ／ｌ）で満たした
。対照実験では、１％ＢＳＡを被覆した。それらウェルをＰＢＳで３回洗い、そ
して、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％Ｔｗｅｅｎ及び０．０５％ＮａＮ₃）と共
に３７℃で１時間インキュベートした。接着後、それらウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅ
ｅｎで３回洗い、そして、乾燥させた。それに続くアッセイを上に記載したよう
に行った。 結果 ポリフェノールオキシダーゼ又はアスパラギナーゼによる、結合組織への細菌
による結合の阻害が見られたので、それら結果を表１４及び１５に示す。

【０１４６】

【表１６】

【０１４７】

【表１７】

【０１４８】実施例１８：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがストレプトコ ッカス・サングイスのヒドロキシラパタイトへの接着を阻害する アドヘシンの結合部位を修飾する酵素により接着を阻害できる広範な基層を具
体的に示すために、ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼは、細菌
のヒドロキシラパタイトへの接着を阻害することが評価され且つ示された。材料及び方法 ポリフェノールオキシダーゼとアスパラギナーゼの取り扱い方法及び微生物に
よる接着の観察方法は、概して、既述の実施例に記載された方法をヒドロキシラ
パタイトに適合させた変法とした。

【０１４９】 Ｓ．サングイスは、当業者に知られている操作に従って増殖させ且つ取り扱わ
れた。ヒドロキシラパタイトビーズを唾液で被覆し、そして洗った。接着を［³
Ｈ］チミジンでラベルされたストレプトコッカス類を使用して測定した。様々な
細胞濃度が試されたが、４０ｍｇ重量のビーズのだけが使用された。結果 低濃度、つまり１００μｇ／ｍｌ又は１５０Ｕのポリフェノールオキシダーゼ
が接着を低減させた。アスパラギナーゼ（２０Ｕ／ｍｌ）も接着を低減させた。
その“共同的”接着（スキャッチャードプロット上の上方への傾きの減少）は、
両酵素処置後に見られなかった。酵素と共にする細胞のインキュベーションは３
７℃で１時間とした。

【０１５０】 高濃度、つまり５００μｇ／ｍｌのポリフェノールオキシダーゼは接着を増強
した。これは、高レベルの酸化後のシッフ塩基形成に起因すると考えられる。実施例１９：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが生物膜の形成 及び維持を阻害する Ｐ．エルギノサの接着 Ｐ．エルギノサの接着へのポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼ
の効果は、既述の実施例に記載された基本的方法を使用して検討することができ
る。５０ユニット／ｍｌアスパラギナーゼで処置された培養上清を使用した実験
において、そのアスパラギナーゼがアゾコール（azocoll）へのタンパク質分解
活性を著しく低減させた。

【０１５１】 Ｐ．エルギノサ検討のためには、ロビンス装置（Robbins device）（Kharazmi
et al, 1999 Robbins device in biofilm research. Meth. Enzymol. 310:207-
215）が使用されるであろう。その装置は、ずれを生じない速度（non-shearing-
rate）で細胞培養物又は増殖培地と共にするポストとスタッドの湯せん（bathin
g of posts and studs）を可能にする。それら細菌を入口を通して導入し、次い
で、生物膜発生のために十分な時間が経過するまで滅菌培地を循環させる。その
実験では培地を再循環させることで、ポリフェノールオキシダーゼもアスパラギ
ナーゼも極めて不経済とはならない。その実験では、その培地を、それがそれ自
身で汚染されることに注意を払いつつ再循環させる。しかし、そのロビンス装置
は、検査及び分析のためにスタッドの除去が可能である。そのような実験で、Ｃ
ＦＵ又はアルギン酸塩のいずれか ＶＳ 時間をプロットすることにより、アス
パラギナーゼ又はポリフェノールオキシダーゼがＰ．エルギノサ生物膜発生への
効果を有するか否かが決定される。対照実験（アスパラギナーゼ又はポリフェノ
ールオキシダーゼが無いもの）も比較のために行われるであろう。尿路生物膜 プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ヴルガリス（P
roteus vulgaris）、及びＰ．エルギノサのような生物は、カテーテルのような
医療用デバイスにコロニーを形成する。コロニー形成は、堆積物をもたらすであ
ろう。Tunneyら（1999, Biofilm and biofilm-related encrustation of urinar
y tract devices. Meth. Enzymol. 310:558-566）により示されたモデルを使用
することとなる。簡単に説明すると、その技術は、ロビンス装置に似たものであ
るが、現実のカテーテル材料を検討するための機会を提供する。滅菌カテーテル
断片を滅菌ガラス反応容器上へ入れ、その後、細菌懸濁液及び人工尿が約２時間
通して送り込まれるであろう。次いで、その系を無菌人工尿でさっと流し、そし
て、最後にアスパラギナーゼ又はポリオキシダーゼの添加液で流す。断片を取り
出して濯ぎ、そして、原子吸光によってＭｇ及びＣａについて分析することがで
きる。存在する金属の量は、それらカテーテル上の細菌、並びにそのウレアーゼ
の量と比例する。それら実験では、Percuflex、Siltak、ポリウレタン等のよう
な様々なカテーテル材料が使用されるであろう。実施例２０：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがグループＢス トレプトコッカスによる膣コロニー形成を阻害する グループＢストレプトコッカスは、新生児において生命に危機的な感染に最も
よく見られる原因である。その感染は、産道を通る際又は出産後の期間にも幼児
に移される。グループＢストレプトコッカスの膣組織への接着を阻害することで
、これら感染を低減することも予防することもできる。細菌 ストレプトコッカス・アガラクチエ（LancefieldグループＢ）をトッド−ヒュ
ーウィットブロス（ＴＨＢ）中に植え、そして、３７℃で１２時間インキュベー
トする。次いで、培養物を３回洗い、そして、５ｍｌのＴＨＢ中に１０⁸〜１０^{1 0} 細菌／ｍｌの濃度に再懸濁する。ラット ３６匹の８０〜９０日齢ヴァージン雌アルビノSprague-Dawleyラットを標準的
条件（２５℃；相対湿度４０％）下に飼う。餌と水を自由摂取にする。In vivo感染モデル Sprague-Dawleyラットの膣感染は、ヒト感染と非常に似ていることが示されて
いる（Ancona and Ferrieri, 1979, Experimental vaginal colonization and m
other-infant transmission of Group B streptococci in rats. Infect Immun
26:599-603）。ラットは、生殖器外観の観察により発情期に調えて、接種を発情
期間中に２日連続で行う。自動ピペットを外傷を与えないように膣内に自動的に
挿入し、そして、１０⁷〜１０⁹細菌を含有する０．１ｍｌの懸濁液を３０匹の全
ラットに注入する。２回目細菌接種の３６時間及び４８時間後、１２匹のラット
に０．１ｍｌ無菌ＰＢＳで同じように滴注する。１２匹のラットに０．１ｍｌＰ
ＢＳ中の４０Ｕポリフェノールオキシダーゼを滴注し、そして、１２のラットに
０．１ｍｌＰＢＳ中の８Ｕアスパラギナーゼを滴注する。

【０１５２】 膣培養は、細菌での両接種直前と、酵素又は緩衝液での１回目及び２回目接種
直前に行われる。更なる培養は、その後２４時間間隔で行われる。膣培養物は、
ＴＨＢで湿らせた綿棒を膣口内で回転させることにより得られる。また、５μｌ
の尾部静脈血液を培養のために、１回目酵素投与直前と２回目酵素投与２４時間
直後に全ラットから得る。

【０１５３】 接種前に得られた培養物を６％ヒツジ血液を含有するトリプトース寒天ベース
上に擦り付ける。他のすべての培養物は、１０μｇ／ｍｌの硫酸コリスチン及び
１５μｇ／ｍｌのナリジクス酸を含有するコロンビア血液寒天ベースのプレート
上に擦り付ける。綿棒は、それら寒天プレートに使用される０．５ｍｌの無菌Ｐ
ＢＳ中をかき回す。

【０１５４】 その実験の経過に亘り、グループＢストレプトコッカスの低減を示すラットす
べてにおいて、別の膣培養物菌が得られるであろうが、すべて単離されている好
気性細菌であろう。各好気性コロニーは、増殖阻害について試験するためのグル
ープＢストレプトコッカスのローン（lawn）へスポットされる。

【０１５５】 それら処置の毒性的効果は、膣組織の観察及び膣分泌の存在により監視される
であろう。統計値 カイ自乗テストが、処置と未処置グループとを各時点で比較するのに使用され
るであろう。

【０１５６】

【表１８】

【０１５７】実施例２１：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがヘモフィラス ・インフルエンザ及びストレプトコッカス・ニューモニエによる中耳感染を阻害 する ストレプトコッカス・ニューモニエとヘモフィラス・インフルエンザは、中耳
感染の第１及び第２の原因（耳炎媒体）である。抗生物質の使用を介したこれら
細菌の溶菌よりもそれら細菌の接着を絶つことの方が、治療のために魅力的な代
替手段を提供する。動物 チンチラは、中耳感染について好都合な動物モデルである。その疾患は、中耳
内に注入する極めて僅かな接種により引き起こされ、且つ殆どの場合にその疾患
が中耳に局在化したままとなる（Giebink, 1999, Otitis media: The chinchill
a model. Microbial Drug. Resist. 5:57-72)。３０健康成体をそれら検討のた
めに６つのグループに分ける。細菌 ストレプトコッカス・ニューモニエのカプセル封入株をトリプシン処理soyブ
ロス及び寒天中で１６時間培養する。ヘモフィラス・インフルエンザをチョコレ
ート寒天上で１０％ＣＯ₂において４８時間培養する。細菌を採取して３回洗い
、そして、無菌塩類溶液中に１×１０⁹〜１０¹⁰細胞／ｍｌの濃度に再懸濁する
。In vivo感染モデル ストレプトコッカス又はヘモフィラスの鼻腔内接種は、対象がアデノウイルス
又はインフルエンザＡウイルスで既に感染されている場合、殆ど常に中耳感染を
もたらす。提案してきた検討において、中耳内への細菌の直接接種を、ウイルス
との共同感染の使用を避けるために行う。動物を耳鏡により中耳感染の徴候につ
いて確認し、次いで、次表の処置グループに分ける。

【０１５８】

【表１９】

【０１５９】 各動物の両耳に自動ピペットを使用して０．１ｍｌの容量の１０⁸〜１０⁹細菌
を注入する。２４時間後、それら動物に再接種する。更なる２４時間後に処置が
なされる。０．１ｍｌ塩類溶液中の０．１ｍｌポリフェノールオキシダーゼ（４
０Ｕ）若しくはアスパラギナーゼ（１０Ｕ）又は．１ｍｌ塩類溶液単独を各動物
の両耳内に滴注する。感染結果 各接種及び処置の前と、最後の処置後２４時間間隔とで、疾患状態を中耳の耳
鏡観察と鼓室測定により盲検的に評価する。鼓膜炎症の徴候を０〜４＋のスケー
ルへ査定し、中耳圧力、鼓室幅、及び鼓膜コンプライアンスの変化を監視するの
に使用する（Suzuki and Bakaletz, 1994, Synergistic effect of adenovirus
type 1 and nontypeable Haemophilus influenzae in a chinchilla model of e
xperimental otitis media. Infect. Immun. 62:1710-1718）。

【０１６０】 鼻咽頭（ＮＰ）洗浄液を、処置溶液の１回目滴注直後と、その後３日間隔とで
採取する。ＮＰ洗浄は、一方の鼻孔内に５００μｌの無菌生理食塩水（小滴中）
を入れること、及び反対側の鼻孔からのその流体の収集により行われる。これら
流体を段階邸に希釈し、そして、適切な固体培地上にプレートする（Kennedy et
al., 2000, Passive transfer of antiserum specific for immunogens derive
d from a nontypeable Haemophilus influenzae adhesin and lipoprotein D pr
events otitis media after heterologous challenge. Infect. Immun. 68:2756
-2765）。統計値 ログランク（log-rank）試験を、鼻咽頭洗浄の細菌除去までの相対的時間を比
較するのに使用した。反復測定ＡＮＯＶＡを、耳鏡及び鼓室観察の間に亘り応答
のパターンを比較するために使用した。実施例２２：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが組織培養モデ ルにおけるウイルス感染を阻害する ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼが、シアル酸含有赤血球へ
のインフルエンザＡウイルス接着を低減するのに効果的であることが具体的に示
された。これら実験は、培養された上皮細胞における細胞変性効果を低減する酵
素処置の能力を調べるための検討に及ぶであろう。細胞系統及びウイルス インフルエンザ株Ｈ１Ｎ１を上述の実施例に記載されるようにして増殖させる
。Ｈｅｐ−２（呼吸肺胞のためのモデルとして使用されるヒト上皮細胞系統）及
びＭＤＣＫ（Madin Darby canine 腎臓細胞）を宿主細胞として使用する。両細
胞系統をウシ胎児血清が添加された最小必須培地中に５％大気ＣＯ₂における湿
った大気中に３７℃で維持して、週当たり２回継代培養した。ウイルス力価は、
プラーク低減アッセイを使用して両細胞系統へ決定した。細胞毒性 細胞系統は、それら酵素処置の細胞毒性効果について次のように観察される。
細胞を９６ウェル培養プラット中に３．５×１０⁴細胞／ウェルの濃度で植える
。１６〜１８時間のインキュベーション後、様々な濃度のポリフェノールオキシ
ダーゼ及びアスパラギナーゼを４つ１組のウェルに加え、そして、４８時間イン
キュベーションを続ける。テトラゾリウム（ＭＭＴ）を５ｍｇ／ｍｌの濃度で加
え、そして、それらウェルを更に２〜３時間インキュベートする。次いで、培地
を取り出し、そして、ＤＭＳＯを、ＭＴＴの細胞性還元により形成されるホルマ
ザン結晶を溶解するために加える。各ウェルの吸光度（波長＝５７０ｎｍ）を測
定する。細胞毒性は、試験される各酵素の５０％細胞毒性濃度（ＣＣ₅₀）として
表される。細胞毒性（ＣＰＥ）の阻害 ウイルスの５０％細胞培養阻害量（ＣＣＩＤ₅₀）を測定する。ウイルスを血清
の無いＭＥＭでＣＣＩＤ₅₀に希釈し、そして、９６ウェル培養プレート内の集密
細胞に加える。直ちに、ポリフェノールオキシダーゼ（７０〜２８０Ｕ／ｍｌ）
及びアスパラギナーゼ（１０〜４０Ｕ／ｍｌ）を含有する培養培地を４つ組みウ
ェルに加える。プレートを１〜３日間インキュベートし、そして、ＭＴＴアッセ
イ（上のもの）を行う。５０％有効濃度（ＥＣ₅₀）を次式：（（（ＯＤ_t）_v−（
ＯＤ_c）_v）／（（ＯＤ_c）_mock−（ＯＤ_c）_v）×１００）で計算する。その式中
、（ＯＤ_t）_vはウイルスと物質で処置された細胞のＯＤであり、（ＯＤ_c）_vは対
照実験ウイルスで処置された細胞のＩＤであり、そして、（ＯＤ_c）_mockはｍｏ
ｃｋが感染した細胞のＯＤである。抗ウイスル活性は、ＣＣ₅₀を５０％有効濃度
（上のＥＣ₅₀）で割った値として表される。プラーク低減アッセイ ２４ウェルプレート内で増殖させた集密宿主細胞をウイルスで感染させて、１
００〜２００プラーク／ウェルを与える。それらプレートを５％ＣＯ₂中の３７
℃で断続的に振動させながら１時間インキュベートする。次いで、ウェルに、上
の濃度で酵素を含有するか又は緩衝液のみを含有する寒天積層培地を積層する。
１〜３日間インキュベーション後、ウェルを５％緩衝化ホルマリンで固定し、０
．０５％クリスタルバイオレットで染色し、そして、プラークの数を数える。阻
害の程度は対照実験の収率（yield）として表され、そして、ＥＣ₅₀の値を回帰
分析により計算する（Eo et al., 1999, Antiviral activities of various wat
er and methanol soluble substances isolated from Ganoderma lucidum. J. E
thnopharmacol. 68:129-136）。実施例２３：ポリフェノールオキシダーゼ及びアスパラギナーゼがサルモネラ・ エンテリティディスによるニワトリの感染を阻害する 食物で伝わる病気に関して、サルモネラで汚染された卵は、症候を引き起こす
他のあらゆる原因よりも大きな影響を与えてきた。Ｓ．エンテリティディスを獲
得したニワトリは、生きている間その細菌を保持し、卵汚染をもたらす。我々は
、Ｓ．エンテリティディス株の血球凝集がアスパラギナーゼ及びポリフェノール
オキシダーゼに感受性であることを発見したので、ニワトリからのその細菌を低
減又は除去するためのそれら酵素の使用を検討することを提案する。細菌 Prof.Peter Holt, USDA, Athens, GAから得ることができるＳ．エンテリティ
ディスの雛鶏単離物を使用する。その株は、ナリジキシン酸に抵抗性で、且つフ
ァージタイプ１３である。２０μｇ／ｍｌナリジキシン酸を含有するテトラチオ
ナートブリリアントグリーン寒天がプレートカウントに使用され、且つそれはＳ
．エンテリティディスに選択的である。雛鶏 New hatched Single Comb White Leghorn雛鶏を感染封鎖エリア内で１０のグ
ループにして飼う。それら雛鶏に指数増殖期Ｓ．エンテリティディスを経口で接
種する（約７．５×１０⁶ＣＦＵ／１ｍｌ投与量）。すべての鶏に自由摂取の飼
料及び滅菌水（１００μｇ／ｍｌで±アスパラギナーゼ又はポリフェノールオキ
シダーゼ）を与える。条件はGastとHolt（1998, Persistence of Salmonella en
teritidis from one day of age until maturity in experimentally infected
layer chickens. Poultry Sci. 77:1759-1762）により示されたものである。微生物学 雛鶏を頸部絞めにより殺し、盲腸、肝臓、及び脾臓を選択寒天上でＣＦＵにつ
いて検査する。幾つかの実験において、雌鶏が２１〜２４週齢のときに卵にＣＦ
Ｕへの検査を行う。加えて、排泄された糞を細菌についてアッセイする。対照実
験（酵素無し）が平行して行われる。GastとHolt（上記参照）に基づくと、それ
ら内臓は８週間まで細菌が無いが、糞は培養陽性であり続ける。酵素がその数を
有意に減少させるなら、水中又は飼料中の酵素を使用して、サルモネラ−雛−酵
素関係だけに検討がなされることとなる。

【０１６１】 その初期の検討において、酵素処置は、雛鶏の到着に始まる。それら動物を１
０のグループにして飼う。細菌を１日後に導入した後、Ｓ．エンテリティディス
について糞のアッセイを行う。それら雛鶏を接種５日後で殺し、そして、盲腸、
肝臓、及び脾臓をその細菌についてアッセイする。細菌がその内臓中に見られな
いなら、生存早期における酵素の添加は、一群の鶏からサルモネラを無くすのに
十分であることが示唆される。

【０１６２】 本明細書及び添付クレーム中に使用された単数形“a”“an”及び“the”には
、その内容が明らかにそうではないと指示されない限り、複数への言及を含むこ
とに注意すべきである。したがって、例えば、 “１種の化合物”を含有する組成物への言及には、２つ又はそれを越える化合物
の混合物が含まれる。また、“又は”という用語は、その内容が明らかにそうで
はないと指示されない限り、一般的に“及び／又は”を含む意味で使用されるこ
とに注意すべきである。

【０１６３】 本明細書中のすべての刊行物及び特許出願は、当業者のレベルを示唆するもの
である。すべての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物及び特許出願が具体的且
つ個別的に参照により摘示されたのと同じ程度まで、参照により本明細書に組み
込まれる。

【０１６４】 本発明を様々な具体的且つ好ましい態様と技術を参照しつつ説明してきた。し
かし、本発明の精神及び範囲を逸脱せずに多くの変法及び修飾法を成し得ること
が理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、Ｓ．ソブリナスのグルカン凝集について時間の関数として
の吸光度の変化、及びポリフェノールによるこの凝集の防止を表す。

【図２】 図２は、Ｓ．ソブリナスのグルカン凝集のポリフェノールオキシダ
ーゼ誘導性逆転を表す。それらプロットは、凝集により起こる時間の関数として
の吸光度の変化を示す。矢印は、ポリフェノールオキシダーゼが加えられた時点
を示す。

【図３】 図３は、グルコシルトランスフェラーゼＩ及びグルコシルトランス
フェラーゼＳの活性へのポリフェノールオキシダーゼの効果を示す電気泳動作動
ゲルを表す。レーン１及び３の各々は、未処置グルコシルトランスフェラーゼ調
製物を示す。レーン２及び４の各々は、ポリフェノールで処置されたグルコシル
トランスフェラーゼ調製物を示す。２．１μｇのタンパク質試料がレーン１及び
２へ載せられ、そして、０．２μｇがレーン３及び４に載せられた。

【図４】 図４は、尿中上皮細胞（ＵＥＣ）への大腸菌による結合のアスパラ
ギナーゼによる阻害を表す。

【図５】 図５は、１型線毛大腸菌による接着のポリフェノールオキシダーゼ
処置による阻害を表す。細菌は、ポリフェノールオキシダーゼの増加する濃度（
７１、１４１、又は２８２ｕ／ｍｌ）で処置され、次いで、接着が見込まれるま
でＵＥＣと共にインキュベートされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づく
パーセンテージとして表し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図６】 図６は、１型線毛大腸菌による接着のアスパラギナーゼ処置による
阻害を表す。細菌は、アスパラギナーゼの増加する濃度（１．２５、２．５、５
、又は１０ｕ／ｍｌ）で処置され、次いで、接着が見込まれるまでＵＥＣと共に
インキュベートされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパーセンテージ
として表し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図７】 図７は、ＵＥＣへの１型線毛大腸菌の接着のポリフェノールオキシ
ダーゼ及びアスパラギナーゼでの連続的処置による阻害を表す。細菌は、ポリフ
ェノールオキシダーゼ（１４１ｕ／ｍｌ）で処置された後にアスパラギナーゼ（
１０ｕ／ｍｌ）で処置されるか又はその逆順序で処置され、次いで、ＵＥＣと共
にインキュベートされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパーセンテー
ジとして表し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図８】 図８は、ポリフェノール及びアスパラギナーゼのＦｉｍＨ結合部位
への作用に対するマンノースの防護的効果を表し、それはマンノースで競合的に
ブロックされた。マンノース（５０ｍＭ）を使用してその結合部位が完全にブロ
ックされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパーセンテージとして表し
、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図９】 図９は、Ｐ線毛大腸菌による接着のポリフェノールオキシダーゼ処
置による阻害を表す。細菌は、ポリフェノールオキシダーゼの増加する濃度（７
１、１４１、又は２８２ｕ／ｍｌ）で処置され、次いで、接着が見込まれるまで
ＵＥＣと共にインキュベートされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパ
ーセンテージとして表し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図１０】 図１０は、Ｐ線毛大腸菌による接着のアスパラギナーゼ処置によ
る阻害を表す。細菌は、アスパラギナーゼの増加する濃度（２．５、５、又は２
５ｕ／ｍｌ）で処置され、次いで、接着が見込まれるまでＵＥＣと共にインキュ
ベートされた。接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパーセンテージとして表
し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図１１】 図１１は、ＵＥＣへのＰ線毛大腸菌による接着への連続的な酵素
処置による阻害を表す。細菌は、ポリフェノールオキシダーゼ（１４１ｕ／ｍｌ
）で処置された後アスパラギナーゼ（１０ｕ／ｍｌ）で処置されるか又はその逆
順序で処置され、次いで、ＵＥＣと共にインキュベートされた。接着の程度を未
処置細菌の接着に基づくパーセンテージとして表し、その未処置細菌の接着を１
００％に合わせた。

【図１２】 図１２は、ＰａｐＧ部位へのポリフェノールオキシダーゼ及びア
スパラギナーゼの作用に対するグロボシドの保護効果を表し、それはグロボシド
で競合的にブロックされた。グロボシドを使用してその結合部位が完全にブロッ
クされた。未接着の程度を未処置細菌の接着に基づくパーセンテージとして表し
、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

【図１３】 図１３は、頬側上皮細胞へのＳ．ピオゲネスによる接着のポリフ
ェノールオキシダーゼによる阻害を表す。接着の程度を未処置細菌の接着に基づ
くパーセンテージとして表し、その未処置細菌の接着を１００％に合わせた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｋ 37/48 31/10 37/50 31/12 37/54 (72)発明者 ドイル，ロン・ジェイ アメリカ合衆国ケンタッキー州40299，ル イスヴィル，ジャンリン・ロード 2311 (72)発明者 コーワン，エム・エム アメリカ合衆国オハイオ州45246，シンシ ナティ，キャメロン・ロード 389 Ｆターム(参考） 4C058 AA13 AA28 AA30 BB07 JJ08 JJ21 JJ23 4C083 AB211 AB411 AD471 BB44 BB55 CC41 CC42 DD21 DD22 DD23 EE31 4C084 AA02 BA44 DC50 MA02 MA52 MA59 NA14 ZB322 ZB332 ZB352

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 表面への微生物の結合を低減する方法であって、該微生物上
   のアドヘシンを酵素的に修飾することを含んでなる方法。
2. 【請求項２】 酵素的に修飾することが、該微生物をポリフェノールオキシ
   ダーゼ、アスパラギナーゼ、又はそれらの組合せ体と接触させることを含んでな
   る、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 該微生物が、原核生物、真核生物、ウイルス、又はそれらの
   組合せを含んでなる、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 該原核生物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、又はそれ
   らの組合せを含んでなる、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 該原核生物がスタフィロコッカスを含んでなる、請求項３の
   方法。
6. 【請求項６】 該真核生物が、真菌又は原生動物を含んでなる、請求項３の
   方法。
7. 【請求項７】 該真菌がカンジダを含んでなる、請求項６の方法。
8. 【請求項８】 該アドヘシンがレクチンを含んでなる、請求項１の方法。
9. 【請求項９】 微生物による接着を低減する方法であって、該微生物を、微
   生物による接着を低減する有効量の酵素に曝すことを含んでなる方法。
10. 【請求項１０】 該酵素が、該微生物上の分子を修飾するための反応を触媒
    する、請求項９の方法。
11. 【請求項１１】 該酵素が、アミノ酸の側鎖の修飾を触媒する、請求項９の
    方法。
12. 【請求項１２】 該アミノ酸が、その結合部位アドヘシン中に見出されるも
    のである、請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 該アミノ酸が、アスパラギン、チロシン、又はそれらの組
    合せを含んでなる、請求項１１の方法。
14. 【請求項１４】 該酵素が、該微生物上の炭水化物結合性部位を修飾する、
    請求項９の方法。
15. 【請求項１５】 レクチンが、該炭水化物結合性部位を含んでなる、請求項
    １２の方法。
16. 【請求項１６】 該酵素が、ポリフェノールオキシダーゼ、アスパラギナー
    ゼ、又はそれらの組合せを含んでなる、請求項９の方法。
17. 【請求項１７】 該微生物が、原核生物、真核生物、ウイルス、又はそれら
    の組合せを含んでなる、請求項９の方法。
18. 【請求項１８】 該原核生物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、又はそ
    れらの組合せを含んでなる、請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 該原核生物がスタフィロコッカスを含んでなる、請求項１
    ８の方法。
20. 【請求項２０】 該真核生物が、真菌又は原生動物を含んでなる、請求項１
    ７の方法。
21. 【請求項２１】 該真菌がカンジダを含んでなる、請求項２０の方法。
22. 【請求項２２】 動物を治療する方法であって、該動物の細胞又は組織への
    微生物による接着を低減する有効量の酵素を該動物に投与することを含んでなる
    方法。
23. 【請求項２３】 該酵素が、ポリフェノールオキシダーゼ、アスパラギナー
    ゼ、又はそれらの組合せを含んでなる、請求項２２の方法。
24. 【請求項２４】 該微生物が、原核生物、真核生物、ウイルス、又はそれら
    の組合せを含んでなる、請求項２２の方法。
25. 【請求項２５】 該原核生物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、又はそ
    れらの組合せを含んでなる、請求項２４の方法。
26. 【請求項２６】 該原核生物がスタフィロコッカスを含んでなる、請求項２
    ４の方法。
27. 【請求項２７】 該真核生物が、真菌、又は原生動物を含んでなる、請求項
    ２４の方法。
28. 【請求項２８】 該真核生物がカンジダを含んでなる、請求項２７の方法。
29. 【請求項２９】 該酵素を投与することが、経口又は局所的投与を含んでな
    る、請求項２２の方法。
30. 【請求項３０】 該酵素を投与することが、鼻部組織への局所的投与を含ん
    でなる、請求項２９の方法。
31. 【請求項３１】 該酵素を投与することが、消化管への経口投与を含んでな
    る、請求項２９の方法。
32. 【請求項３２】 該消化管への経口投与が、徐放性製剤、又は腸溶性製剤を
    投与することを含んでなる、請求項３１の方法。
33. 【請求項３３】 微生物による接着を低減する有効量の酵素を含んでなる口
    内ケア組成物。
34. 【請求項３４】 該酵素が、ポリフェノールオキシダーゼ、アスパラギナー
    ゼ、又はそれらの組合せ体を含んでなる、請求項３３の口内ケア組成物。
35. 【請求項３５】 該微生物が、原核生物、真核生物、ウイルス、又はそれら
    の組合せを含んでなる、請求項３３の口内ケア組成物。
36. 【請求項３６】 該原核生物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、原生動
    物、又はそれらの組合せを含んでなる、請求項３５の口内ケア組成物。
37. 【請求項３７】 該原核生物がスタフィロコッカスを含んでなる、請求項３
    ５の口内ケア組成物。
38. 【請求項３８】 該真核生物が、真菌、又は原生動物を含んでなる、請求項
    ３５の口内ケア組成物。
39. 【請求項３９】 緩衝剤、過酸化物、銅イオンの供給源、酸素放出性化合物
    、又はそれらの組合せを更に含んでなる、請求項３３の口内ケア組成物。
40. 【請求項４０】 該口内ケア組成物が、うがい薬、練り歯磨き、インプラン
    ト、又はそれらの組合せを含んでなる、請求項３３の口内ケア組成物。
41. 【請求項４１】 該口内ケア組成物が、固体、半固体、又は液体組成物を含
    んでなる、請求項３３の口内ケア組成物。
42. 【請求項４２】 口内組織又は細胞への微生物による接着を低減する方法で
    あって、該口内組織又は細胞を、微生物による接着を低減する有効量の酵素を含
    んでなる口内ケア組成物に曝すことを含んでなる方法。
43. 【請求項４３】 該口内ケア組成物が、うがい薬、練り歯磨き、インプラン
    ト、又はそれらの組合せを含んでなる、請求項４２の方法。
44. 【請求項４４】 義歯への微生物による接着を低減する方法であって、該義
    歯を、微生物による接着を低減する有効量の酵素を含んでなる口内ケア組成物に
    曝すことを含んでなる方法。
45. 【請求項４５】 該義歯が入れ歯を含んでなる、請求項４４の方法。
46. 【請求項４６】 微生物による接着を低減するのに有用な口内組成物を製造
    する方法であって、微生物による接着を低減する有効量の酵素を口内組成物に加
    える工程を含んでなる方法。
47. 【請求項４７】 微生物による接着を低減する有効量のポリフェノールオキ
    シダーゼ、及び薬理学的に許容し得るキャリヤーを含んでなる医薬組成物。
48. 【請求項４８】 該ポリフェノールオキシダーゼが、微生物又は植物から単
    離されたポリフェノールオキシダーゼを含んでなる、請求項４７の医薬組成物。
49. 【請求項４９】 該微生物又は植物が、好熱微生物、好熱真菌、又はマッシ
    ュルームである、請求項４７の医薬組成物。
50. 【請求項５０】 該ポリフェノールオキシダーゼが、組換えポリフェノール
    オキシダーゼである、請求項４７の医薬組成物。