JP2003511468A - 同種凝集素枯渇血液組成物および同種凝集素枯渇血液組成物の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血液組成物（例えば、血漿）から同種凝集素を分離するために有用な樹脂−抗原の組合せの生成方法および再生方法を開示する。再生手順は、同種凝集素枯渇血液に基づく組成物の収率を最大化するのみならず、樹脂−抗原の組合せの使用可能な寿命を増加させる。この再生はまた、この樹脂中に含まれるウイルス病原体およびプリオン夾雑物を不活性化し、そして除去する。詳細には、血液由来の組成物から同種凝集素を除去するための樹脂を再生する本発明の方法は、以下：（ａ）抗原−同種凝集素複合体に連結された樹脂を提供する工程；および（ｂ）抗原−同種凝集素複合体から同種凝集素を選択的に除去するに十分な条件下で、再生緩衝液を用いて樹脂を洗浄する工程であって、それによって、樹脂を再生する、工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般に、選択されたタンパク質を、タンパク質の複合体サンプルか
ら除去する方法、特に、血液由来の産物から同種凝集素を除去する方法に関する
。

【０００２】 （発明の背景） ヒト血液は、個体ごとに変化し得る。これらの個体間の差異に基づく複数の血
液型群が記載されている。一般に、句「血液型群」は、個体の血液が、個体の赤
血球（すなわち、赤血球細胞）の表面上に位置する特定の抗原の存在または非存
在に基づいて分類され得る多数の型のいずれか１つを同定するために使用され得
る。各特異的血液型群は、他のグループの細胞に対して反応する血清内に抗体を
含有するか、または含有し得る。これらの抗体は、「血液型群抗体」または「同
種凝集素」と呼ばれる。

【０００３】 血液型群の特徴づけシステムまたは分類化の３０を超える系が記載されている
。もっとも一般的に使用されるもののひとつは、ＡＢＯ分類システムである。こ
のシステムにおける主要な同種凝集素は、抗Ａ、抗Ｂ、および抗Ａ，Ｂ抗体であ
り、これらは、主として、ＩｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンアイソタイプから
構成される。（ｉ）血液型群Ａの血清は、抗原Ｂに対する抗体を含有し；（ｉｉ
）血液型群Ｂのそれは、抗原Ａに対する抗体を含有し；（ｉｉｉ）血液型群ＡＢ
のそれは、いずれの抗体をも含有せず；そして（ｉｖ）血液型群Ｏからの血清は
、抗体の両方の型を保有することが実証されている。

【０００４】 血液型群の差異は、血液が１の個体から他の個体に輸液される場合に考慮され
なければならない。不適合な血液型群抗体によって沈着される輸液反応物は、輸
液された宿主における血液細胞の凝集を生じ得る。さらに、このような不適合な
個体間の輸液は、補体を固定しそして活性化し得、したがって、赤血球の破壊（
すなわち、溶血）を誘導する。これは、貧血およびその他の類似の合併症の発症
を導き得る。不適合な血液の輸液は、重篤な医学的非常事態を生じ得、これは死
を生じ得る。免疫溶血およびその他の関連する輸液反応を回避するために、ドナ
ーの血漿型およびレシピエントの血液型が交差整合され、分類され、そしてスク
リーニングされる。

【０００５】 溶血を引き起こす同種凝集素を含まない血液に由来する組成物は、潜在的に、
ドナーまたはレシピエントのいずれかの血液型群にかかわらず、投与され得る。
結果として、同種凝集素を血液から除去するための方法が記載されている。しか
し、現在利用可能な方法は、血液型群同種凝集素の非効率的な除去を生じ得、そ
して長期のインキュベート時間を必要とし得るか、または反復する分離工程を必
要とし得る。さらに、同種凝集素を除去するためのほとんどの免疫吸着に基づく
方法は、単回の適用のみを意図する。これは、同種凝集素を含まない血液を調製
するための増大したコストを生じ得る。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、血液から同種凝集素を除去するための、免疫吸着樹脂の反復した使
用を可能にする手順の発見に、部分的に基づいている。したがって、１つの局面
において、本発明は、同種凝集素を血液に由来する組成物から選択的に除去する
ための方法を提供する。その方法は、同種凝集素に特異的な抗原を連結した樹脂
を提供する工程、およびその樹脂を再生緩衝液で洗浄して再生された樹脂を形成
する工程を包含する。その再生された樹脂は、次いで、血液に由来する組成物と
、樹脂上で同種凝集素抗原複合体を形成する条件下で接触される。その血液に由
来する組成物は、次いで、同種凝集素抗原複合体から分離され、このようにして
、その同種凝集素はその組成物から除去される。所望であれば、その樹脂−抗原
は、再生緩衝液で再洗浄され、そして第二の血液に由来する組成物が添加される
。

【０００７】 別の局面において、本発明は、同種凝集素を血液に由来する組成物から除去す
るための樹脂を再生するための方法を提供する。その方法は、抗原同種凝集素複
合体に結合した樹脂を提供する工程；およびその樹脂を再生緩衝液で、同種凝集
素を抗原−同種凝集素複合体から選択的に除去するために十分な条件下で洗浄し
、それによりその樹脂を再生する工程を包含する。その洗浄された樹脂は、次い
で、同種凝集素を含む血液に由来する組成物と、第二の抗原同種凝集素複合体を
形成するために十分な条件下で混合され得る。その血液に由来する組成物は、次
いで第二の抗原−同種凝集素複合体から分離され、それにより、血液に由来する
組成物を同種凝集素から分離する。

【０００８】 さらなる局面において、本発明は、同種凝集素を結合するための組成物を包含
する。その組成物は、同種凝集素に特異的な抗原に連結したポリメタクリレート
樹脂を包含し、ここで、該抗原は、該樹脂に、その樹脂上のカルボキシル基によ
って連結される。

【０００９】 本明細書に記載される方法および組成物は、種々の血液に由来する組成物（例
えば、「汎用」ＳＤ血漿として使用するための溶媒−界面活性剤処理（ｓｏｌｖ
ｅｎｔ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（ＳＤ）血漿）（これは、任意の個体に、その特
定の血液型群型にかかわらず、投与（すなわち、輸液）され得る））を提供する
ために使用され得る。これらの方法は、Ａ，Ｂ、およびＯ血液型組成物のために
特に適切であり、そして非適合性の患者への輸液のための抗Ａ、抗Ｂ、および抗
Ａ，Ｂ最終同種凝集素力価の臨床的に受容可能なレベルを提供する。

【００１０】 1つ以上の本発明の実施形態の詳細は、以下に添付の詳細な説明に示される。
本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料が本発明の
実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料は、ここに記載され
る。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および特許請求の
範囲から明らかである。明細書および添付の請求の範囲において、単数形はまた
、その文脈が明らかにその反対を示さない限り、複数を含む。そうでないと規定
されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的な用語
は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有す
る。本明細書において引用されるすべての特許および刊行物は、参考として援用
される。

【００１１】 （発明の詳細な説明） 本発明は、反復的に使用され得る分離システムを使用して、血液産物から同種
凝集素を除去するための方法を提供する。

【００１２】 これらの方法に従って精製されたこの同種凝集素枯渇組成物は、元々の血液組
成物のすべての固有の特徴（すなわち、同じ凝固因子レベル、タンパク質含有量
、および防御抗体力価（例えば、パルボウイルスおよびＡ型肝炎に対する））を
維持するが、顕著に減少した抗Ａおよび／または抗Ｂ同種凝集素力価を有する。
これらの低レベルの同種凝集素は、非血液型群型特異的または「汎用」臨床輸液
的使用を可能にする。

【００１３】 一般に、血液組成物は、抗Ａ、抗Ｂ、および／または抗Ａ，Ｂ抗体（同種凝集
素）に結合しそしてそれらを除去する化学的に合成された炭化水素部分が結合さ
れた再使用可能な樹脂を含むカラムを通過する。

【００１４】 その方法は、１つ以上の同種凝集素を含有することが知られているか、または
含有すると疑われる任意の血液に由来する組成物上で使用され得る。本明細書で
使用される場合、用語「血液に由来する組成物」および「血液組成物」は、互換
的に使用され、そして全血、血漿、血漿画分、血漿沈殿物（例えば、寒冷沈殿物
、エタノール沈殿物、またはポリエチレングリコール沈殿物）、血漿上清（例え
ば、寒冷上清、エタノール上清、またはポリエチレングリコール上清）、溶媒／
界面活性剤処理（ｓｏｌｖｅｎｔ／ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（ＳＤ）血漿、血小板
、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、ＩｇＭ、精製同種凝集素因子濃縮物、フ
ィブリノゲン濃縮物、またはヒトもしくは動物由来の種々のその他の競合剤を含
むことを意味する。血液に由来する組成物はまた、当該分野で一般的である任意
の種々の方法（イオン交換、アフィニティ、ゲル透過、および／または疎水性ク
ロマトグラフィーあるいはディファレンシャル沈殿）によって調製された精製凝
固因子濃縮物（例えば、第ＶＩＩＩ因子濃縮物、第ＩＸ因子濃縮物、フィブリノ
ゲン濃縮物など）を含む。

【００１５】 除去され得る同種凝集素には、例えば、抗Ａ同種凝集素、抗Ｂ同種凝集素、抗
Ａ，Ｂ同種凝集素が含まれる。同種凝集素を含有するかまたは含有すると疑われ
る血液組成物は、少なくとも１つの同種凝集素に特異的な抗原が結合した樹脂と
ともに混合される。樹脂−抗原の組み合わせは、当該分野で周知である。例えば
、米国特許第４，３６２，７２０号；同第４，３０８，３７６号；同第４，２３
８，４７３号、同第４，１９５，１７４号；同第４，１３７，４０１号、同第４
，６６４，９１３号、および同第５，５４１，２９４号を参照のこと。アフィニ
ティクロマトグラフィーベースの同種凝集素除去のために使用される樹脂の多く
の例が存在する。本明細書に参考として援用される米国特許第５，５４１，２９
４号および同第４，６６４，９１３号を参照のこと。樹脂を選択するにおける重
要な要因には、タンパク質（例えば、抗ウイルス抗体および凝固因子）の最小非
特異的吸着および選択された抗原で誘導体化される能力が含まれる。使用のため
に好ましい樹脂は、ポリメタクリレートマトリックスを含有するものである。最
も好ましいものは、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ樹脂（Ｔｏｙｏ−Ｈ
ａａｓ、Ｊａｐａｎ）である。さらに、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ
樹脂は、遊離のアミン基を保有するリガンドに結合するために使用され得るカル
ボキシル基を有する。その樹脂はまた、生産規模のクロマトグラフィーがしやす
い。

【００１６】 好ましい抗原は、血液型群抗体に特異的であるものである。特に好ましい抗原
には、オリゴ糖（例えば、血液型群抗体に対する全抗原の結合を模倣する３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２以上のサッカリドを有するサッ
カリド）が含まれる。Ｂ樹脂（すなわち、Ｂトリサッカリド）については、好ま
しいリガンド密度は、０．８から１．５μｍｏｌ／ｍｌの範囲であり、最も好ま
しくは、１．０μｍｏｌ／ｍｌの密度である。Ａ樹脂（すなわち、Ａトリサッカ
リド）については、好ましいリガンド密度は、１．２μｍｏｌ／ｍｌである。

【００１７】 血液産物の精製の前に、その樹脂−抗原の組み合わせは、エタノールアミンで
の処理によってブロックされる。好ましい血漿樹脂−接触時間は、２から６分の
範囲であり、好ましくは、４分であり、そして樹脂容量あたりの好ましい血漿容
量は、２０：１から４０：１の範囲であるべきであり、そして最も好ましくは、
３０：１である。その樹脂は、使用前には、エタノール／水溶液中にて、低温（
例えば、２０％エタノール、４℃）で保存され得る。

【００１８】 その抗原は、抗原リガンドの損失なしにカラムの複数回の使用を可能にするの
に十分安定な任意の手段により樹脂に結合される。その結合は、共有結合、また
は安定な非共有結合相互作用であり得る。アミド結合は、抗原−樹脂複合体には
好ましい。代表的には、遊離の末端アミンを有するトリサッカリドは、Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ樹脂のカルボキシル官能性と結合される。

【００１９】 血液由来の組成物における抗原のその対応する同種凝集素との接触は、抗原−
同種凝集素複合体の形成を生じる。その複合体は、抗原−樹脂上に維持され、一
方、実質的にすべての残りの血液成分は、抗原にも樹脂にも結合しない。したが
って、抗原−樹脂は、同種凝集素を血液産物組成物から分離する。

【００２０】 その樹脂−抗原は、他の分離技術（例えば、クロマトグラフィー分離およびバ
ッチ吸着）の一部として使用され得る。クロマトグラフィーが使用される場合、
樹脂−抗原は、緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または生理
食塩水）中で平衡化され、約２から１０の範囲のｐＨを有し、好ましい範囲は３
．５から９．５であり、そして最も好ましい範囲は、ｐＨ４から７．８である。
平衡温度は、０℃未満から４５℃の範囲であり得、好ましくは、１９℃から２６
℃の温度範囲であり、そしてもっとも好ましい温度は、２３℃である。血液型群
抗体および他の血液成分（例えば、凝固因子）を含有する血液由来の組成物は、
次いで、樹脂カラムを介して接触時間を１分未満から１２０分の範囲で流され、
そして好ましい接触時間は、２から１０分（例えば、４分）である。凝固因子の
保持は、選択される特定の樹脂によって、そしてさらに特には、樹脂のマトリッ
クスによって影響され得る。好ましくは、樹脂−抗原の組み合わせは、実質的に
同種凝集素因子を除去せずに同種凝集素を除去する。

【００２１】 バッチ吸着は、別のアフィニティベースの技術であり、これは、カラムクロマ
トグラフィーに加えて、またはその代わりに使用され得る。バッチ吸着において
、抗原−樹脂は、適切な容器（例えば、不活性ポリマー）中にて、血液型群抗体
および凝固因子を含有する組成物に添加され、適切な温度（例えば、０℃〜４５
℃（好ましくい温度は、室温である））で少なくとも１時間（好ましくは、４時
間）で混合される。血液組成物は、いまや実質的に同種凝集素を含まないが、次
いで、樹脂−抗原複合体から、当該分野で認識されている技術（例えば、重力沈
殿、濾過、または遠心分離）によって除去される。

【００２２】 樹脂−抗原複合体は、次いで、再生緩衝液または因子で洗浄される。その再生
緩衝液は、抗原−樹脂に結合した同種凝集素を除去し、そして抗原が第二の同種
凝集素（例えば、第二の血液組成物または抗原−樹脂カラムに引き続き添加され
た血液由来の組成物に存在する同種凝集素）に結合することを可能にする。再生
緩衝液は、抗原および樹脂の両方の構造的および機能的な完全性を維持すること
が好ましい。したがって、結合した同種凝集素の再生緩衝液での除去は、樹脂−
抗原組み合わせの再使用を可能にする。

【００２３】 チオ硫酸ナトリウムが強力な再生緩衝液または因子であることが予想外に見出
された。したがって、再生緩衝液は、チオ硫酸ナトリウムを、例えば、０．５Ｍ
から室温での飽和溶液まで、含み得る。チオ硫酸ナトリウムの好ましい濃度は、
３．０Ｍである。理論により拘束されることを望まないが、リオ硫酸ナトリウム
は、部分的に、抗体をアフィニティ樹脂から脱結合するための酸化剤として作用
することが考えられる。この機構は、鎖間Ｆａｂ免疫グロブリンフラグメント間
および／または軽鎖サブユニットと重鎖サブユニットとの間のジスルフィド基（
−Ｓ−Ｓ−）の−ＳＨ基への還元を含み得、そのようにして、抗体の抗体−抗原
複合体からのより完全な解離を引き起こす。別の可能性は、チオ硫酸ナトリウム
のカオトロピックな特性が、樹脂−抗原に結合した同種凝集素を溶解することで
あり得る。

【００２４】 再生緩衝液または因子は、他の因子（例えば、尿素、エタノール、酢酸、およ
び過酢酸）と組み合わせて使用され得る。チオ硫酸ナトリウムの尿素およびエタ
ノール（ＥｔＯＨ）洗浄との組み合わせての使用は、さらなる使用のためにカラ
ムを再生するのに役立つだけでなく、ウイルスおよびプリオンの夾雑物を不活性
化し除去する。過酢酸は、さらに、樹脂−抗原組み合わせを樹脂または抗原のい
ずれをも損傷せずに、消毒する。再生緩衝液（例えば、チオ硫酸ナトリウム、尿
素、エタノール、または酢酸）の成分は、引き続いて、同時に、またはその種々
の組み合わせで、使用され得る。

【００２５】 再生剤を使用しての樹脂サッカリド抗原を含有するカラムの再生により、カラ
ムが、再度複数回（例えば、２、５、１０、１５、２５、５０、７５、または１
００回）、選択された同種凝集素の結合の減少または血液組成物に内在する他の
タンパク質および同種凝集素因子の非特異的結合の増大を伴わずに、使用される
ことを可能にする。その樹脂は、２、５、１０、１５、２５、５０、７５、１０
０、または２００以上の回数のオーダーで、再使用のために使用および再生され
得る。

【００２６】 以前に記載されたアッセイは、同種凝集素の除去を定量するために、そして再
生の後に樹脂−抗原複合体にとって損失した非同種凝集素タンパク質（例えば、
血液凝固因子）の量を確認するために、使用され得る。血液型群特異的同種凝集
素が、血液に由来する組成物から除去されているか否かを決定するために、その
組成物内の血液型群抗体力価が、その組成物を樹脂−抗原組み合わせに接触させ
た後に決定される。これは、急速スピン試験（ＩＳ）、直接的血液型群抗体試験
（ＤＡＴ）、または間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験（ＩＣＴ）のいずれかによって、決
定され得る。血液に由来する組成物から除去された同種凝集素因子の量を決定す
るために、処理された血液に由来する組成物は、凝固因子または目的の因子（例
えば、第Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩ因子
）の活性について、１段階凝固法（これは、活性化部分トロンボプラスチン（Ａ
ＰＴＴ）試薬の存在下で、特定の因子における血漿欠損の凝固時間における補正
の程度を決定する）によって、または当該分野で公知の種々の他のアッセイ方法
によって、アッセイされ得る。例えば、血液組成物中の同種凝集素レベルは、オ
ルソダイアゴニスティックスから市販されているＭＴＳ 抗ＩｇＧ Ｇｅｌ Ｃ
ａｒｄ Ｓｙｓｔｅｍ^TMおよびＭＴＳ緩衝化Ｇｅｌ Ｃａｒｄ Ｓｙｓｔｅｍ^TM を使用してアッセイされ得る。

【００２７】 血液由来の組成物のタンパク質含有量および分布を評価するために、タンパク
質含有量は、Ｂｉｕｒｅｔ試薬によって測定され、そしてタンパク質分布は、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳導によって測定され得る。

【００２８】 ウイルス含有血液由来組成物はまた、ウイルス含有組成物から血液型群特異的
抗体を除去する前または後のいずれかに、不活性化され（すなわち、非感染性に
され）得る。ウイルスを不活性化するために溶媒（ｓｏｌｖｅｎｔ）および界面
活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）によって処理された新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）は、
溶媒−界面活性剤処理血漿（ＳＤ血漿）と呼ばれる。ウイルス不活性化のための
種々の方法が、米国特許第４，７６４，３６９号（この開示は、本明細書中で参
考としてその全体が援用される）において議論されている。ウイルス不活性化法
において使用される化学物質の除去は、米国特許第５，０９４，９６０号に開示
され、この開示は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。

【００２９】 溶媒−界面活性剤処理血漿は、血液由来の被覆ウイルスを除去するために有機
溶媒および界面活性剤で処理されている血漿組成物である。これを達成するため
に使用される多くの異なる試薬が、当該分野で提案されている。例えば、米国特
許第４，４８１，１８９号；同第４，５４０，５７３号；同第４，７６４，３６
９号；同第４，７８９，５４５号を参照のこと。これらの全てが、本明細書中で
参考として援用される。本発明の最も好ましい試薬には、有効量のアルキルホス
フェート試薬、好ましくは、「溶媒」としてのトリ−（ｎ−ブチル）ホスフェー
ト（ＴＮＢＰ）、および界面活性剤としてのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００が含まれ
る。これらの試薬でのサンプルの処理のあとに、ダイズ油での抽出、およびその
ウイルス不活性化試薬を除去するための標準的な疎水性樹脂上でのカラムクロマ
トグラフィーが続く。これらの方法は、内因性のタンパク質を変性せずに、ウイ
ルス不活性化血液由来組成物を提供する。

【００３０】 その他のウイルス不活性化法（例えば、メチレンブルーの存在下でのウイルス
の光力学不活性化または糖および／またはアミノ酸の存在下でのウイルスの熱不
活性化）もまた、使用され得る。血液型群抗体の除去は、ウイルス不活性化と比
較して任意の時間に：不活性化手順の前、その間、または後に、行われ得る。こ
れらの方法によって不活性化されるウイルスには、例えば、水疱性口炎ウイルス
（ＶＳＶ）、シンドビスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎
ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスが含まれる。

【００３１】 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために示さ
れる。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明を限
定するものとかいされるべきでは決してない。

【００３２】 （実施例） 本発明は、血液ベースの組成物からの同種凝集素の枯渇においてＡトリサッカ
リドおよび／またはＢトリサッカリドを、特定の血液型群型に依存して、利用し
得る。しかし、以下の節は、例示のためであり限定するものではなく、主として
、Ｂトリサッカリドを使用する方法論および結果を議論する。

【００３３】 （実施例１ ＴＮＢＰ／Ｔｒｉｔｏｎ−１００−処理（ＳＤ）、同種凝集素枯
渇血漿の調製） 本発明は、ＳＤ血漿の製造において、樹脂−抗原組成物を使用しての同種凝集
素除去工程の組み込みを含む。図１は、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（Ｔ
ＮＢＰ）／ＴｒｉｔｏｎＸ−１００処理された同種凝集素枯渇血漿の調製を例示
する模式的なフローチャートをあらわす。このプロセスは、溶媒−界面活性剤処
理（ＳＤ）血漿の産生のための当該分野で公知のプロトコルに類似し、そこにお
いて、血漿は、１％ トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）および１％
Ｔｒｉｔｏｎ−１００で、３０℃で４時間処理される。

【００３４】 ＳＤプロトコルの改変は、Ｃ１８カラム後の（すなわち、ＳＤ血漿産生工程の
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）限外濾過工程の前か後のいずれか）同種凝集素枯
渇／除去クロマトグラフィーカラムの追加からなる（図１）。この改変において
、Ｃ１８カラム由来の溶出物（または溶出物の濃縮物）は、適切なアフィニティ
カラムを通過される。例えば、回収した「Ａ」型血漿で開始したとき、そのサン
プルは、Ｂ抗原（Ｂ樹脂）を含有するカラムを通過される。同様に、プールした
「Ｂ」型血漿で開始して、そのサンプルは、Ａ抗原（Ａ樹脂）を含有するカラム
を通過される。「Ｏ」血漿のサンプルは、Ｃ１８カラムのすぐ下流に連続して配
置された２つのアフィニティカラム（ＡおよびＢ樹脂）を通過される。「ＡＢ」
型の血漿は、特定の同種凝集素除去を必要としない。

【００３５】 ４つの市販のＳＤ血漿型の間の差異を担う実質的にすべての同種凝集素の除去
は、血液型群型にかかわらずすべてのレシピエントへの投与のために適切である
単一の型のＳＤ血漿の産生を可能にする。

【００３６】 （実施例２ 血液型群特異的トリサッカリドロード樹脂の調製） トリサッカリドリガンドの最適なロード密度を確認するための研究を行った。
第一の一連の実験において、受容可能な直接的同種凝集素試験（すなわち、急速
スピン試験）および間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験の結果は、１および１０μｍｏｌ／
ｍｌの初期トリサッカリド濃度で達成した。２００ｍｌの血漿は、１ｍｌの樹脂
に適用され得た。しかし、０．１μｍｏｌ／ｍｌの初期濃度は、同種凝集素力価
を受容可能な１：２値以下に減少することに失敗した。第二の一連の実験におい
て、１：２以下の同種凝集素力価を、０．７５から３．０μｍｏｌ／ｍｌのＢト
リサッカリドを使用して、すべての樹脂で得た。より高い力価のトリサッカリド
密度を有する樹脂は、より大きな容量の血漿を処理することに成功したが、樹脂
のコストに基づく最も現実的な実行は、１μｍｏｌ／ｍｌのトリサッカリド密度
で達成される。類似の結果がＡトリサッカリドについて得られた。

【００３７】 Ａ樹脂の構造は、２−Ｏ−（α−Ｌ−ｆｕｃｏ−ピラノシル）−３−Ｏ−（２
−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドである。

【００３８】 Ｂ樹脂の構造は、ガラクトース−α−１−３（ｆｕｃα１−２）Ｇａｌβ−Ｏ
−である。

【００３９】 図２は、Ｂ群トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍ
結合体化樹脂の調製を例示する模式的フローチャートをあらわす。化合物Ｉ（１
６２ｍｇ）を、１０ｍｌのメタノールおよび５ｍｌの１，２−ジアミノエタンを
添加して溶解した。４日後、室温で、その混合物を２００ｍｌのキシレン中に注
ぎ、そして４０℃未満の水浴温度でガム状の固体が残るまでロータリー蒸発した
。その時点で、さらなる２００ｍｌのキシレンを添加し、そして再び、その混合
物をロータリー蒸発して乾燥させた。蒸発後、その生成物を、３０分間、減圧に
供して、乾燥プロセスを完了した。

【００４０】 総量１０ｇの逆相シリカゲル（Ｃ−１８）を、焼結ガラスカラム中で水：エタ
ノール（９：１ｖ／ｖ）で平衡化した。３０ｍｌの水：エタノール（９：１ｖ／
ｖ）に溶解したその不純生成物を、次いで、平衡化カラムにかけ、そして１５０
ｍｌの水：エタノール（９：１ｖ／ｖ）で溶出し、次いで、さらに水：メタノー
ル（４：６ｖ／ｖ）を添加した。後者の溶媒系において溶出した精製産物および
その溶出物を、ロータリー蒸発し、そいて約５ｍｌの容量にし、次いで凍結乾燥
した。精製化合物ＩＩの総収量は、１６１ｍｇであり、その純度は９５％を超え
ることが、１：１：１のブタノール：エタノール：０．８８０アンモニア溶媒を
使用して、シリカゲルプレート上でのＴＬＣによって見出された。

【００４１】 次いで、合計７０ｍｌのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍ樹
脂を、３００ｍｌの１，４−ジオキサンを用いて洗浄して、保存緩衝液の除去を
容易にする。次いで、この樹脂を、４．０３ｇの１−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド、３．０ｍｌのジイソプロピ
ルエチルアミンおよび２．４１ｇのＮ−ヒドロキシスクシニミドを含む６０ｍｌ
の１，４−ジオキサン中で３時間周囲温度にて振盪することによって平衡化した
。この樹脂を、次いで、クロマトグラフィーカラムに移し、そして約１００ｍｌ
の１，４−ジオキサン、次いで、３００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）を用いて洗浄し、次いで、合計３つの２０ｍｌのロット（すなわち、２０ｍｌ
に設定された容量）に分配した（ＤＭＳＯベースのスラリーとして）。

【００４２】 （（ｉ）１０μモル／ｍｌでの樹脂ローディング） １つの２０ｍｌのロットに、２０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解された２００μＭ（
すなわち、１３７．２ｍｇ）の化合物ＩＩを添加し、そしてこの混合物を周囲温
度にて３時間振盪した。このインキュベーション後、上清の少量のサンプルを、
シリカゲルＴＬＣプレート上にスポットし、減圧下で乾燥させ、１：１：１のブ
タノール：エタノール：０．８８０アンモニア溶媒系を用いてクロマトグラフし
、次いで、イソプロパノール中の１％レスクレイノール（ｒｅｓｃｒｅｉｎｏｌ
）：１％硫酸混合物中に浸漬し、そして４００℃まで加熱することによって可視
化した。２％未満の本来の濃度のトリサッカリドが検出され得るという結果が示
され、ほぼ完全な樹脂への結合が生じたことを示す。エタノールアミン（０．２
４ｍｌ）を、元々の混合物に添加し、そして周囲温度（すなわち、１９℃〜２６
℃）で振盪をさらに２時間継続した。次いで、樹脂をクロマトグラフィーカラム
に移し、そして約８００ｍｌの５℃の水を用いて洗浄した。このカラムを、０．
０２％アジ化合物を含有する水中で平衡化された樹脂と共に保存した。

【００４３】 （（ｉｉ）１．０μモル／ｍｌでの樹脂ローディング） １３．７ｍｇの化合物ＩＩを、２０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解したことを除いて
、この樹脂を本質的に上記のように処理し、そしてこの混合物を周囲温度にて２
時間振盪させた。この反応を、上記のように可視化した。トリサッカリドが全く
検出され得ないという結果が示され、完全な樹脂への結合が生じたことが示され
た。

【００４４】 （（ｉｉｉ）０．１μモル／ｍｌでの樹脂ローディング） １３．７ｍｇの化合物ＩＩを、２０ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解したことを除いて
、同様の手順に従って、０．１μモル／ｍｌでローディングされた樹脂を生成し
、そしてこの混合物を周囲温度にて２時間振盪させた。この反応を、上記のよう
に可視化した。トリサッカリドが全く検出され得ないという結果が示され、完全
な樹脂への結合が生じたことが示された。

【００４５】 （実施例３ アフィニティクロマトグラフィー） １ｍｌのＢ型トリサッカリド−結合体化樹脂（すなわち、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
ＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍメタクリレート樹脂）を、１×１０ｃｍカラムに
充填し、そして合計２０カラム容量の１５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
４）で洗浄して、樹脂中のいかなる防腐薬をもすすぎ流す。次いで、この洗浄さ
れ平衡化された樹脂に、０．２５ｍｌ／分の流速で３０ｍｌの血漿をローディン
グする（滞留時間４分間）。すべての処理を、室温（２０〜２５℃）で実施した
。

【００４６】 サンプル溶出の間、５ｍｌの画分を収集し、そしてほぼ５回目毎の画分を、そ
の後の分析のために保存した。サンプルを開始材料から採取し、そして、所定の
クロマトグラフィー泳動からのすべての画分が収集されるまで、室温で維持した
。このサンプルを同時に凍結および解凍して、収集および保存の間に生じ得る可
能性がある、あらゆる活性損失について補正した。血漿サンプルを、急速スピン
（ＩＳ）凝集試験により抗Ｂ ＩｇＭ免疫グロブリン除去について、および間接
的Ｃｏｏｍｂｓ試験（ＩＣＴ）により抗Ｂ ＩｇＧ免疫グロブリン除去について
アッセイした。凝固因子Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩおよび
ＸＩＩＩの生物学的活性の維持を一段階部分的トロンボプラスチン時間（ｏｎｅ
−ｓｔａｇｅ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）に
よりアッセイした。さらに、２８０ｎｍの吸光度を、各クロマトグラフィー泳動
についてモニターし、そして溶出吸光度プロフィールを記録した。

【００４７】 同様の分析を、より大量（５ｍｌ）のカラム容量を用いて実施し、凝固因子の
回収を再確認し、そして溶出構成成分を分析した。溶出された画分を、２５ｍＭ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の１００容量に対して合計５回透析し、そし
て還元８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動した。開始Ｓ−Ｄ血漿および
（未吸着血漿）通過画分が、ゲル電気泳動分析を受けた。その後の大規模生成に
おいて、血漿プール形成（すなわち、予備的プール形成（ｐｒｅ−ｐｏｏｌｉｎ
ｇ））および各ロットのプール形成を、血液型群特異的様式で実施した。

【００４８】 （実施例４ 自動化クロマトグラフィー） プールされた溶媒−界面活性剤処理（Ｓｏｌｖｅｎｔ−Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）
（ＳＤ）血漿および再生緩衝液を、４つの入り口を備えたマニホルド２つに接続
し、このバルブの開／閉を、プログラム可能なタイミング制御ユニット（Ｋｅａ
ｒｓａｒｇｅモデル ８３１ ８チャネル汎用タイマー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ
ｔｕｍｅｒ），Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）により電気的に制御した。この溶液を、１
ｍｌの樹脂を含む１×１０ｃｍの２つのクロマトグラフィーカラムの各々に、０
．２５ｍｌ／ｍｍの流速に較正した蠕動ポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−３ポ
ンプ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりポンプ輸送した。各カラムの出口は
、インライン２８０ｎｍ検出器（ＬＫＢ２１３８ ＵＶＩＣＯＲＤ ５，Ｂｒｏ
ｍｍｅｒ，Ｓｗｅｄｅｎ）および記録器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ モデル４８３ス
トリップチャートレコーダー）、そして最終的に画分コレクター（ＬＫＢ ２１
１２ ＲＥＤＩＲＡＣコレクター）を通過するような向きにあわせた。５ｍｌの
画分を回収した。このタイムコレクターをプログラムして、４週間までにわたり
３４サイクル／週で連続的にクロマトグラフィーカラムをローディングし、かつ
再生した。クロマトグラフィーを金曜日に停止し、そして月曜日に再開した。こ
の時間の間、この樹脂を、４℃において２０％エタノール中に保存した。この保
存後（すなわち、各週の開始時）に、この樹脂を再懸濁し、そして完全に再生お
よび平衡化して、クロマトグラフィーを再開した。

【００４９】 （実施例５ クロマトグラフィー樹脂の再生） ポリメタクリレート樹脂−Ｂ抗原の組合せを含む１ｍｌのカラムを、機能の損
失を伴わずに、１００回より多く使用および再生した。血漿サンプルのローディ
ング後、１カラム容量（ＣＶ）の洗浄を実施して、樹脂から血漿を回収し、そし
て再生手順の開始前にチュービングする。３ＣＶの使用を、このカラムの樹脂の
緩衝液交換のために使用した。この容量は、ＳＤ血漿およびフィブリノゲンアフ
ィニティＴｏｙｏＰｅａｒｌ樹脂の再生について当該分野で使用されている再生
手順と一致する。合計６ＣＶの１５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ７．４）平衡緩衝液
を樹脂のｐＨ調整のために使用して、カラムの再ローディング前のｐＨ中和およ
び生産環境下の任意の潜在的な夾雑物の除去を確実にした。１ｍｌのポリメタク
リレートベースのアフィニティカラムの使用および再生のための基本的プロトコ
ールを、表１に解説する。

【００５０】

【表１】 再生研究の結果によって、以下のことが実証された：（ｉ）合計１０３回のリ
サイクル後に、樹脂に存在する炭水化物ベースのリガンドの量に検出可能な変化
は存在しない；および（ｉｉ）樹脂からの溶出物（主に、タンパク質からなる）
の分析は、１回目と１０３回目との間に有意な変化を示さない。

【００５１】 凝固因子Ｖ、ＶＩＩ、ＸおよびＸＩは、２００回より多くを通して、Ｂ型トリ
サッカリド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍ結合体化樹脂に
ついて高収率で回収された。表２に示されるように、凝固因子の回収は、一貫し
て１００％に近かった。

【００５２】

【表２】 血漿＝ＳＤ血漿ＦＥ ７０９１８ ０．０５％過酢酸（ｐｅｒａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）／２０％ＥＴＯＨ／０．０
１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０） Ｂトリサッカリド樹脂 （実施例６ 同種凝集素枯渇の決定） 収集後、ＢトリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍ
結合体化樹脂を用いた、アフィニティクロマトグラフィー媒介性Ｂ同種凝集素枯
渇からのサンプルを、アッセイするまで−８０℃で凍結した。抗体力価の決定を
、ＡＡＢＢ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌで示された手順に従って行った
。抗Ｂ ＩｇＭ免疫グロブリン検出のための急速スピン凝集試験については、２
滴のサンプル血漿を、ラベルを付けた１２×７５のガラス製試験管にいれ、そし
て８つの希釈系列にわたり、通常の生理食塩水で２倍に段階希釈した。１滴の３
％試薬赤血球（ＣＯＮＦＩＲＭＣＥＬＬＳ Ｂ型；ＢＧＡ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓ
ｔｅｒ、ＰＡ）を各試験管に添加した。この試験管を穏やかに混合し、１０００
×ｇで１分間遠心分離した。次いで、赤血球の沈殿粒（ｂｕｔｔｏｎ）を、各試
験管の壁から穏やかに振り落とし、そして凝集の徴候について試験した。全ての
反応物を肉眼で読み取り、そしてＭａｒｓｈの点数付けシステムに基づいて、４
〜１２の値で点数付けした。Ｍａｒｓｈら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１２：３
５２−３５３，１９７２を参照のこと。逆に、４の値未満の任意の点数は、顕微
鏡で定量したのみであり得、そして輸液目的に臨床的に関連するとはみなされな
い。凝集が見られなかった希釈系列における最初の試験管を、０と点数付けし、
そして終点力価と記録した。

【００５３】 抗Ｂ ＩｇＧ免疫グロブリン検出のための間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験（ＩＣＴ）
と使用する決定においては、この試験管を、３７℃で３０分間さらにインキュベ
ートし、次いで、遠心分離工程をして、上清の除去を容易にした。次いで、この
収集された赤血球を洗浄し、そして１ｍｌの通常生理食塩水で合計３回再遠心分
離し、そして最後の洗浄の後、上清を注意深くそして完全に注ぎだした。２滴の
ポリ特異的（ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗ＩｇＧ−Ｃ３ｄ抗ヒトグロブリン
を各試験管に添加した。これらの試験管を穏やかに混合し、遠心分離した。各試
験管を、上記と同じ様式で、抗Ｂ ＩｇＭ免疫グロブリン検出のために急速スピ
ン凝集試験について点数付けした。

【００５４】 図３は、異なる回の画分を通過したプール血漿中に存在する抗Ｂ ＩｇＭおよ
び抗Ｂ ＩｇＧ免疫グロブリンの力価を例示する（１回は、カラムの使用および
再生に等しい）。Ｂ型トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ−
６５０Ｍ結合体化樹脂を用いた抗Ｂ ＩｇＭ保持の能力は優良であった。なぜな
ら、最初の２５〜３０回のリサイクルについて、希釈されていない血漿サンプル
中に抗体が検出され得なかったからである。その後の回では、約４５回のリサイ
クルについて抗Ｂ ＩｇＭ免疫グロブリンの４倍の力価の希釈除去が存在し、次
いで、合計１０３回のリサイクルを通しては８倍の希釈除去が存在することが見
出された。吸着は、抗Ｂ ＩｇＧ免疫グロブリンの除去と非常に類似することが
示されたが、全体的な保持は、減少した。この結果の１つの可能な説明は、Ｉｇ
Ｍが五量体の免疫グロブリンであるという事実に起因し得、従って、大きなサイ
ズおよび結合部位の数の大きさに起因して、これはＩｇＧ免疫グロブリンよりも
はるかに多い抗原性部位に結合し得る。詳細には、合計１００回を通して、１ｍ
ｌのＢ型トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシ−６５０Ｍ結合
体化樹脂は、３リットルの血漿において、３倍の力価希釈の抗Ｂ ＩｇＭおよび
ＩｇＧの除去（それぞれ、２¹および２¹のＩｇＭおよびＩｇＧ力価の残留を伴う
）を可能にすることが見出された。

【００５５】 さらなる確証研究を実施して、Ｂ型トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ
−カルボキシ−６５０Ｍ結合体化樹脂での免疫選択後のＡ血液型群の血漿中に残
留する抗Ｂ免疫グロブリンの力価を決定した。カラム溶出画分を、樹脂の９回の
再生および８９回の再生後に採取し、そしてこの画分を、抗Ｂ ＩｇＭ（急速ス
ピン）および抗Ｂ ＩｇＧ（間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験）について試験した。二段
階完全溶血試験を、市販の酸溶出キットと使用する吸着および溶出研究と共に実
施した。以下の結果（表３にまとめた）が得られた：（ｉ）陽性の凝集反応は、
急速スピン（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｓｐｉｎ）での９回後に見出されず、これは
、急速スピンでの８９回後にわずかに増加するのみであった；（ｉｉ） 新鮮な
補体の添加によって、同じサンプルで溶血の証拠は示されなかった；および（ｉ
ｉｉ）溶出研究は、両方のサンプルについて陰性であった。従って、血液型を越
えて輸液を受けた患者は、この反応の供給源として関連付けられるＳＤ血漿由来
同種凝集素を有さない。なぜなら、抗体が、赤血球から溶出しないからである。

【００５６】

【表３】 結果を、１〜１２（１２を、最高凝集とする）の血球凝集点数で与える。 ＩＳ＝急速スピン ＲＴ＝室温 ＩＡＴ＝間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験 ９回および８９回は、リサイクル研究の各回からである。 画分４および６は、特定の回の溶出血漿プール由来の画分である。

【００５７】 （実施例７ 凝固因子アッセイ） 収集後、凝固因子決定のためのサンプルを、アッセイまで、−８０℃で凍結し
た。各サンプルを二連でアッセイし、そして結果を平均化した。第ＶＩＩＩ因子
および第ＸＩ因子の凝固因子活性を、Ｓｙｓｍｅｘ ＣＡ−５０００自動化凝固
分析器（ＴＯＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌｏａ Ａｌａｍ
ｉｔｏｓ，ＣＡ）で一段階の活性化部分的トロンボプラスチン時間凝固アッセイ
（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏ
ｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＡＰＴＴ）によ
り決定した。ＡＰＴＴ時間を、ＡＰＴＴ試薬（Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ
；Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ）の存在下で血漿欠損因子（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂ
ｉｏｍｅｄｉｃａｌ；Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ、ＫＳ）の凝固時間の較正程
度を測定する。第Ｖ因子および第ＶＩＩ因子の活性を、カルシウムを有するトロ
ンボプラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）を、ＡＰＴＴ試薬の代わりに使用したことを除いて、同様にアッセイした。
次いで、生物学的活性（ユニット／ｍｌ）を、較正した標準血漿（Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）
を用いた検量線に対して比較することにより決定した。

【００５８】 さらに、個々のサンプルをまた、−３０℃で、長期安定性研究のために保存お
よび貯蔵した。これらのサンプルを、６ヶ月後に凝固因子活性の保持についてア
ッセイした。

【００５９】

【表４】 （実施例８ 血漿タンパク質アッセイ） 本発明の方法に従って調製されたＳＤ血漿を、標的化同種凝集素以外のタンパ
ク質の損失について試験した。上述のように、同種凝集素除去についての多くの
方法に伴う一般的な問題は、それらが、固有のタンパク質（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕ
ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ）の高い割合の損失を有するということである。これらのタ
ンパク質としては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）のようなウイルスに対する抗体
、血液凝固因子、および他の因子（すなわち、カリクレインおよびフォン・ビル
ブラント因子［ｖＷＦ］メタロプロテイナーゼ）が挙げられる。コントロール（
親）および汎用（未吸着、同種凝集素枯渇）血漿中に存在するタンパク質のパー
センテージの比較を、表５〜７に示す。

【００６０】

【表５】 コントロール＝開始ＳＤ血漿ＦＥ７０９１８。 １７回、４９回および８９回は、リサイクル研究の各回からである。 画分４および６は、特定の回の未吸着血漿プール由来の画分である。 ｍＩＵ／ｍｌ＝１ｍｌのサンプルあたりの１ミリ国際単位。

【００６１】

【表６】 コントロール＝開始ＳＤ血漿ＦＥ７０９１８。 １７回、４９回および８９回は、リサイクル研究の各回からである。 画分４および６は、特定の回の未吸着血漿プール由来の画分である。 ＩＵ／ｍｌ＝１ｍｌのサンプルあたりの１国際単位。

【００６２】

【表７】 さらなる実験を実施して、プールされたＳＤ血漿および同種凝集素枯渇ＳＤ血
漿中のフォン・ビルブラント因子（ｖＷｆ）切断メタロプロテイナーゼの活性を
決定した。合成樹脂に連結した抗Ａまたは抗Ｂトリサッカリドを用いる抗Ａまた
は抗Ｂ同種抗体の除去は、処理したＳＤ血漿中のｖＷｆ切断メタロプロテイナー
ゼ活性を検出可能に減少させない。

【００６３】 （実施例９ 同種凝集素枯渇血漿の長期安定性） 長期間にわたる血漿の安定性を、種々の血漿パラメーター、α１グロブリン、
α２グロブリン、βグロブリン、γグロブリン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ
因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、およびフィブリノゲンを測定することによ
って試験した。Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）および血漿タンパク質のレベルを含
むパルボウイルス、感染因子、ならびにｐＨのレベル。試験されたタンパク質に
はアルブミンが含まれ、１９の核酸もまた測定され、ｐＨも同様に測定された。

【００６４】 血漿サンプルを、−１８℃で保存した。同種凝集素枯渇血漿の９個の別個のロ
ットを試験した。各ロットについて、示されるパラメーターを、血清調製の０、
３、６、９および１２ヶ月後に測定した。試験された時点で測定されたタンパク
質または核酸のレベルに有意差は見出されなかった。これらの結果によって、同
種凝集素枯渇血漿が、少なくとも１２ヶ月のわたって安定であることが示された
。

【００６５】 （実施例１０ 溶媒洗浄処理Ｏ型ヒト血漿からの抗Ａ同種凝集素および抗Ｂ同
種凝集素の除去） Ａサッカリド樹脂を使用して、生産スケール操作パラメーターを用いて、溶媒
洗浄処理プールヒト血漿を取り出した。Ｏ型 ＳＤ血漿からのＡおよびＢ同種凝
集素の枯渇は、樹脂の順序とは無関係であるようである。すなわち、Ａの除去に
続いてＢを除去することは、Ｂに続いてＡと等しい。本実施例では、抗Ｂ同種凝
集素を最初に枯渇した血漿を、抗Ａ同種凝集素の除去を確証するための開始材料
として使用した。

【００６６】 Ｂトリサッカリド樹脂を、１．０μモルのＢトリサッカリド／ｍｌ Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌ（ＴｏｓｏＨａａｓ）樹脂のリガンド密度で使用して、Ｂ同種凝集素
のＯ型 ＳＤ血漿を枯渇させた。次いで、１．２μモルのＡトリサッカリド／ｍ
ｌ樹脂のリガンド密度でのＡトリサッカリド樹脂を使用して、Ａ同種凝集素のＳ
Ｄ血漿をさらに枯渇させた。両方の樹脂は、ＰｒｏＭｅｔｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅ
ｎｃｅ（Ｉｓｌｅ ｏｆ Ｍａｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）によって製
造された。操作パラメーターを、生産スケール条件を反映するように選択した。
ベッド高は１．２７〜２０ｃｍであり、目標ベッド高は１２．７ｃｍである。他
のパラメーターとしては、１２７〜３８０ｃｍ／時間の直線流速（目標直線流速
は１９０ｃｍ／時間）、血漿容量：樹脂容量で２０：１〜４０：１のロード比（
目標ロード比は、３０：１の血漿容量：樹脂容量）、ｐＨ７．０〜８．０（目標
は７．４）、および温度２０℃〜２５℃（目標温度は２３℃）が挙げられる。

【００６７】 目標の樹脂に対する血漿ロード比３０：１は、可能性の高い産生操作条件の代
表として選択した。断続的に、２０：１および４０：１の比を評価して、ロード
範囲の極値を評価した。

【００６８】 すべての化学薬品は、他に示されない限りＵＳＰ等級であった。クエン酸三ナ
トリウム（カタログ番号ＳＸ０４４４−１）およびチオ硫酸ナトリウム（カタロ
グ番号ＳＸＯ８１３−１）を、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、Ｎ
Ｊ）から得た。氷酢酸（カタログ番号９５２２−０２１）、尿素（カタログ番号
８６４２）、および塩化ナトリウム（カタログ番号７５４０）を、Ｍａｌｌｉｎ
ｃｋｒｏｄｔ（Ｐａｒｉｓ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から得た。再蒸留された９５％
ＥｔＯＨを、ＶＩＴＥＸ’ｓ Ｍｅｌｖｉｌｌｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｉｎ
ｇ ｓｉｔｅから得た。試薬赤血球（Ｉｍｍｍｕｃｏｒ／Ｇａｍｍａ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）およびポリ特異的ＩｇＧ，−
Ｃ３ｄ抗ヒトグロブリンを、Ｉｍｍｕｃｏｒ Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，Ｇ
Ａ）から得た。

【００６９】 プールされたＯ型溶媒洗浄処理血漿を、使用されるまで−３０℃の冷凍庫中で
保存した。Ｂトリサッカリド樹脂クロマトグラフィーを、１．０μモルＢトリサ
ッカリド／ｍｌ樹脂のリガンド密度で５０ｍｌのＢトリサッカリド樹脂を含む、
２．５×２０ｃｍカラムを実施した。この樹脂は、１０カラム容量（ＣＶ）の０
．１５Ｍ ＮａＣｌを用いて調製および平衡化された。Ｏ型 ＳＤ血漿を、９．
１ｍｌ／分の流速（５．５分間の接触時間を表す）で５０ｍｌの樹脂カラムにロ
ーディングして、Ａトリサッカリド樹脂上にローディングする前に、抗Ｂ同種凝
集素の血漿を枯渇させた。１０．２ｃｍのベッド高および１１１ｃｍ／時間の直
線流速は、生産スケールアップ泳動において使用される１リットル樹脂カラムの
ベッド高（１２．７ｃｍ）および直線流速（１９０ｃｍ／時間）に近似する。す
べてのクロマトグラフィーを、周囲温度で実施した。

【００７０】 ７単位（１，４００ｍｌ）のＯ型 ＳＤ血漿を解凍し、そしてこの解凍血漿を
Ｏ’１Ｎ ＨＣＬでｐＨ７．４に調整し、そして３０：１（血漿：樹脂）の比率
でＢトリサッカリド樹脂上にローディングした。この血漿を、２０℃〜２５℃（
ＲＴ）での５．５ｍｍの接触時間でクロマトグラフして、抗Ｂ同種凝集素を除去
した。

【００７１】 Ｂ同種凝集素枯渇したＯ型のＳＤ血漿を、Ａ同種凝集素の除去のために、Ａト
リサッカリド樹脂についての開始血漿として用いた。次いで、Ｂトリサッカリド
樹脂を完全に再生し、室温（ＲＴ）で９５％エタノール中にて一晩保存し、そし
て再使用する前に１０ＣＶ ０．１５Ｍ ＮａＣで翌日平衡化した。

【００７２】 Ａトリサッカリド樹脂クロマトグラフィーを、重力下で充填した１０ｍｌのＡ
トリサッカリド樹脂を用いて行い、そして１×２０ｃｍのＢｉｏ Ｒａｄホウケ
イ酸ガラスカラムの底に沈澱させた。これを、生産スケールおよびパイロットス
ケールの実施において用いるために、１２．７ｃｍのベッド高および１９１ｃｍ
／時間の直線流速にみせかけた。この樹脂を、使用前に１０カラム容量の０．１
５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。

【００７３】 １サイクルあたり３００ｍｌのＢ同種凝集素枯渇したＯ型のプールしたＳＤ血
漿を、流速９．１ｍｌ／分（１１１ｃｍ／時間）で１０ｍｌのＡトリサッカリド
樹脂カラム上にロードした。この流速は、５．５ｍｍの滞留時間（ｒｅｓｉｄｅ
ｎｃｅ ｔｉｍｅ）を表す。クロマトグラフィー工程の順序を以下に示す。１２
サイクル、４６サイクル、および７６サイクルの後に、この樹脂を２０ＣＶの血
漿で最初にチャレンジし、再生し、続いて、このタンパク質ロード範囲の極値を
試験するために、４０ＣＶの血漿でチャレンジした。１週間の循環の後（例えば
、１日につき４サイクル、１週間で１６サイクル）、カラムを洗浄し、９５％ア
ルコールで平衡化し、次いで、ＲＴで保存した。翌週の初めに、このカラムを洗
浄し、そして１０ＣＶの０．１５Ｍ ＮａＣｌで平衡化し、そしてリサイクルを
再開した。この循環を、１０６回のリサイクルの初めから終わりまで続けた。

【００７４】

【表８】 全ての処理を室温（ＲＴ）で行った。

【００７５】 ５０ｍｌの画分を回収し、そして約５サイクルごとの画分を分析のためにとっ
ておいた。サンプルを開始物質から採取し、そしてクロマトグラフィーの実施か
らの全ての画分を回収するまで室温で維持した。このサンプルを、−３０℃で凍
結した。全てのサンプルを回収し、そして回収、保存および凍結融解の間に失わ
れた任意のあり得る活性を較正するために、同時に融解した。分析する前に、こ
れらのサンプルを、３７℃のＨ₂Ｏ浴中で同時に融解した。

【００７６】 血漿サンプルを、急速スピン試験（ＩＳ）により抗Ａおよび抗Ｂ ＩｇＭ除去
について、および間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験（ＩＣＴ）により抗Ａおよび抗Ｂ Ｉ
ｇＧ除去についてアッセイした。凝固因子Ｖ、ＶＩＩ、ＸおよびＸＩの活性を一
段階部分的トロンボプラスチン時間（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ｐａｒｔｉａｌ ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）によりアッセイした。２８０ｎｍの吸
光度を、各クロマトグラフィー実施についてモニターし、そしてプロフィールを
記録した。

【００７７】 自動化クロマトグラフィーについては、Ｂ同種凝集素枯渇した、プールしたＯ
型のＳＤ血漿および再生緩衝液を、４つの入り口を備えたマニホルド２つに接続
した。このマニホルドの開／閉バルブをプログラム可能なタイミング制御ユニッ
ト（Ｋｅａｒｓａｒｇｅモデル ８３１ ８チャネル汎用タイマー（ｕｎｉｖｅ
ｒｓａｌ ｔｕｍｅｒ），Ｒｅｓｔｏｎ，ＶＡ）により電気的に制御した。この
溶液を、１０ｍｌの樹脂を含む１×２０ｃｍカラムに、１．８ｍｌ／ｍｍ（１３
７ｃｍ／時間）の流速に較正した蠕動ポンプ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−３ポン
プ，Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によりポンプ輸送した。このカラムは、イン
ラインＵＶ吸光度Ａ２８０検出器（ＬＫＢ２１３８ ＵＶＩＣＯＲＤ Ｓ，Ｂｒ
ｏｍｍｅｒ，Ｓｗｅｄｅｎ）および記録器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ストリップチ
ャートレコーダー，モデル４８３）、最終的にタイムコレクター（ＬＫＢ ２１
１２ ＲＥＤＩＲＡＣコレクター）へとつなげた。５０ｍｌの画分を回収した。
このタイムコレクターをプログラムして、８週間にわたり１６サイクル／週で連
続的にカラムをロードおよび再生した。

【００７８】 クロマトグラフィーを木曜日に停止し、そして月曜日に再開した。この時間の
間、この樹脂を、週末の間ＲＴにおいて９５％エタノール中に保存した。

【００７９】 同種凝集素除去アッセイのためのサンプルを、アッセイするまで−３０℃で保
存した。抗体力価の決定を、ＡＡＢＢ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（５
５５〜５６４頁、第１０版、１９９０）で概説された標準的手順に従って行った
。抗Ａおよび抗Ｂ ＩｇＭ検出のための急速スピン試験（ＩＳ）については、２
滴のサンプル血漿を、ラベルを付けた１２×７５のガラス製試験管にいれ、そし
て８つの一連の希釈にわたり、生理食塩水で２倍に段階希釈した。１滴の３％試
薬赤血球（Ｉｍｍｕｃｏｒ Ｇｒｏｕｐ Ｂ ｃｅｌｌｓ／Ｇａｍｍａ Ｂｉｏ
ｌ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を各試験管に添加した。この試験管を混合し、次い
で、１０００×ｇで１分間遠心分離した。ついで、この赤血球沈殿粒（ｒｅｄ
ｃｅｌｌ ｂｕｔｔｏｎ）を、各試験管の壁から穏やかに振り落とし、そして凝
集について試験した。全ての反応物を肉眼で判断し、そしてＭａｒｓｈの点数付
けシステムに基づいて、４〜１２の値で点数付けした。Ｍａｒｓｈら、Ｔｒａｎ
ｓｆｕｓｉｏｎ，１２：３５２−３５３，１９７２。４未満の任意の点数は、顕
微鏡で定量したのみであり得、そして輸液目的には臨床的には関連しない。凝集
が見られなかった一連の希釈における最初の試験管を、０と点数付けし、そして
終点力価と記録した。抗Ａおよび抗Ｂ ＩｇＧ検出のための間接的Ｃｏｏｍｂ’
ｓ試験（ＩＣＴ）については、この試験管を、３７℃で３０分間さらにインキュ
ベートし、次いで、遠心分離して、上清を除去した。次いで、この細胞を洗浄し
、そして１ｍｌの通常生理食塩水で３回遠心分離し、次いで、最後の洗浄の後、
上清を注意深く注ぎだした。２滴のポリ特異的抗ＩｇＧ、−Ｃ３ｄ抗ヒトグロブ
リン（Ｉｍｍｕｃｏｒ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を各試験管に添加した。これ
らの試験管を混合し、遠心分離し、そして最終的に上記のように点数付けした。

【００８０】 凝固因子決定のためのサンプルを、アッセイの準備ができるまで、−３０℃で
凍結した。各サンプルを二連でアッセイし、そして結果を平均化した。第Ｘ因子
および第ＸＩ因子の凝固因子活性を、Ｓｙｓｍｅｘ ＣＡ−５０００自動化凝固
分析器（ＴＯＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｌｏａ Ａｌａｍ
ｉｔｏｓ，ＣＡ）で一段階の活性化部分的トロンボプラスチン時間凝固アッセイ
（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏ
ｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ａｓｓａｙ）（ＡＰＴＴ）によ
り決定した。ＡＰＴＴ時間を、ＡＰＴＴ試薬（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ
Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で血漿欠損因子（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ａｔｉｏｎ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の凝固時
間の較正程度を測定する。第Ｖ因子および第ＶＩＩ因子の活性を、カルシウムを
有するＰＴフィブリノゲン（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌｏｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）を、ＡＰＴＴ試薬の代わりとしたことを除いて、同様にアッセイし
た。生物学的活性（ユニット／ｍｌ）を、較正した標準血漿（Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔａｔｉｏｎ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた検量線に対して比較する
ことにより決定した。

【００８１】 初期サイクル、中間サイクル、および後期サイクルの間に樹脂を通った流れの
２８０ｎｍでのＯＤプロフィールは、似ていた。ロードプロフィール全て（低血
漿ロード比および高血漿ロード比を含む）は、似ているようであった。大部分の
再生プロフィールは、サイクル１およびサイクル３の再平衡化基線（ｂａｓｅｌ
ｉｎｅ）（上にシフトした）およびリサイクル研究の最後付近のサイクルを除い
て、同一であるようであった。ここで、再生手順のＯＤ追跡は、初期サイクルに
おけるものと同程度にはこの基線まで急勾配で低下しないようである。矛盾の理
由はわかっていない。この材料は、製造の間に収集されず、そしてどのような製
品影響も有さない。

【００８２】 凝固因子Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ、およびＸＩの回収は、１０２サイクルの初めから終
わりまで（極端なタンパク質ロードサイクルが含まれる場合は１０８サイクル）
、樹脂について満足いくものであった。大部分のプレカラムおよびポストカラム
値は、１０％以内で変化した。平均および標準偏差は、プレカラムについては１
．０ｕ／ｍｌおよび０．０７０１、ならびにポストＢカラムＦＶについては１．
０ｕ／ｍｌおよび０．０８２０、ならびにポストＡカラムＦＶについては０．９
ｕ／ｍｌおよび０．０５２２；プレカラムについては１．０ｕ／ｍｌおよび０．
０５０５、ならびにポストＢカラムＦＶＩＩについては１．０ｕ／ｍｌおよび０
．０５０５、ならびにポストＡカラムＦＶＩＩについては、１．０ｕ／ｍｌおよ
び０．０５３９；プレカラムについては１．０ｕ／ｍｌおよび０．０５０５、な
らびにポストＢカラムＦＸについては１．０ｕ／ｍｌおよび０．０５０５、なら
びにポストＡカラムＦＸについては１．０ｕ／ｍｌおよび０．００００；最後に
、プレカラムについては０．９ｕ／ｍｌおよび０．０４５９、ならびにポストＢ
カラムＦＸＩについては０．９ｕ／ｍｌおよび０．０６８８、ならびにポストＡ
カラムＦＸＩについては０．８ｕ／ｍｌおよび０．０８２０であった。

【００８３】 ３０：１（血漿：樹脂）のロード比で異なるサイクルの画分を通じてプールし
た血漿の流れ中に存在する抗Ａおよび抗ＢのＩｇＭ（ＩＳ）およびＩｇＧ（ＩＣ
Ｔ）両方の力価を試験した。抗Ｂ ＩｇＭ（１８）および抗Ｂ ＩｇＧ（ＩＣＴ
）両方の１２〜１４倍希釈または９８％〜９９％減少は、１０２回のサイクルの
初めから終わりまで、血漿力価１および２〜４それぞれを通したポストカラム流
れに対して存在した。抗Ａ除去に関しては、抗Ａ ＩｇＭ（ＩＳ）の１０倍希釈
または９７％減少が、４８サイクルの初めから終わりまで１の血漿力価を通した
、および１０２サイクルの初めから終わりまで２の力価を通したポストカラム流
れに対して存在した；抗Ａ ＩｇＧ（ＩＣＴ）除去に関しては、１２倍希釈また
は９８％減少が、１９サイクルの初めから終わりまで４の血漿力価を通したポス
トカラム流れに対して、そして１０倍希釈または９７％減少が、１０２サイクル
の初めから終わりまで８の血漿力価を通したポストカラム流れに対して存在した
。

【００８４】 血漿：樹脂の比が２０：１では、抗Ｂ ＩｇＭ（ＩＳ）およびＩｇＧ（ＩＣＴ
）の力価は、１２サイクルについてはそれぞれ０および２、４６サイクルのにつ
いては１および４、７６サイクルについては０および２であった。抗Ａに関して
は、ＩｇＭ（ＩＳ）およびＩｇＧ（ＩＣＴ）力価は、サイクル１２の後にそれぞ
れ１および４、サイクル４６の後に１および８、ならびにサイクル７６の後に１
および８であった。

【００８５】 ４０：１（血漿：樹脂）のロード比では、抗Ｂ ＩｇＭ（ＩＳ）およびＩｇＧ
（ＩＣＴ）の力価は、１２サイクルについてそれぞれ０および２、４６サイクル
について１および４、７６サイクルについて１および２であった。抗Ａに関して
は、ＩｇＭ（ＩＳ）およびＩｇＧ（ＩＣＴ）の力価は、１２サイクルのあとにそ
れぞれ０および４、４６サイクルの後に２および１６、ならびに７６サイクルの
後に２および８であった。

【００８６】 この実施例は、Ａ同種凝集素の除去についての実際の製造プロセスにより調製
されたＡトリサッカリド樹脂の効力を実証する。１２．７ｃｍのベッド高にし、
そして１９１ｃｍ／時間の直線流にした１０ｍｌのＡトリサッカリド樹脂を、臨
床等級の材料の生成のためにパイロット研究で用いた１リットルの樹脂カラムを
含む実地規模（ｆｕｌｌ ｓｃａｌｅ）の生成を模倣するために選択した。しか
し、Ｂトリサッカリド樹脂のクロマトグラフィーの間に経験した静水背圧（ｈｙ
ｄｒｏｓｔａｔｉｃ ｂａｃｋｐｒｅｓｓｕｒｅ）の増加に起因して、Ａトリサ
ッカリドの直線流を、約１４０ｃｍ／時間の直線流で５．５ｍｍの接触時間に低
減した。

【００８７】 リサイクル研究の間に、この樹脂の流速を、約サイクル７２からの連続リサイ
クルに対して低減した。樹脂の塊（ｃｌｕｍｐ）が、樹脂ベッドの上部に存在し
た。これは、電子バルブ（異なる洗浄緩衝液の切り換えを担う）の不全によって
引き起こされた不完全なカラム再生に起因し得る。このことが原因で、この樹脂
を再懸濁し、そしてバルブを交換する前に数サイクルの初めから終わりまで数回
再充填した。サイクル９４の後、低倍率下での樹脂の鏡検により、未使用の樹脂
の割合（約１〜５％）に対して、切断したビーズの割合が増加した（約２０％）
ことが明らかになった。樹脂上清の拡大により、区別不能な内部の微粒子物質が
明らかになった。この微粒子物質は、切断したビーズのより密度の高い充填とと
もに樹脂の流速の減少の一因となった可能性がある。引き続いて、このカラムを
、再充填し、そして１日４サイクル実施の前に規定どおりに完全に再生した。毎
日の実施の最初のサイクルの流速を、設計した流速（１１８ｍｌ／分に対して１
．６５ｍｌ／分）に近づけたが、４サイクルの期間の初めから終わりまでで徐々
に減少させた。重要なことは、研究の間を通した同種凝集素の除去および凝固因
子の回収の結果により示されるように、樹脂の性能全体が影響を及ぼさなかった
ことである。

【００８８】 Ｂトリサッカリド樹脂およびＡサッカリド樹脂の両方は、抗Ａ抗体については
、６４（ＩＳ）および２５６（ＩＣＴ）の開始力価、ならびに抗Ｂ抗体について
は、６４（ＩＳ）および１２８〜２５６（ＩＣＴ）の開始力価で、急速スピン（
ＩＳ）については各々２以下の最終力価および間接的Ｃｏｏｍｂｓ試験（ＩＣＴ
）については８以下の最終力価へと、Ｏ型血漿から１０２サイクルの初めから終
わりまでで抗Ｂおよび抗Ａ同種凝集素を効率的に除去した。凝固因子Ｖ、ＶＩＩ
、Ｘ、およびＸＩの回収は、サイクルの初めから終わりまで満足のいくものであ
り続け、そしてこのクロマトグラフィープロフィールは、１０２サイクルの初め
から終わりまで一致していた。Ａ樹脂およびＢ樹脂両方の機能的完全性は、研究
の初めから終わりまでインタクトであり続け、そして抗Ａおよび抗Ｂ同種凝集素
枯渇したＯ型汎用血清の実地生成規模製造が予測される。

【００８９】 本発明の前述の詳細な説明および特定の実施形態から、アフィニティクロマト
グラフィーを利用した血液型特異的同種凝集素の枯渇を行った血液由来組成物の
生成のための独特の方法を記載してきたことは容易に明らかである。本明細書中
に特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは、例示目的のために行ったに
過ぎず、上記の特許請求の範囲の範囲を限定することを意図しない。特に、種々
の置換、変更および改変が特許請求の範囲に規定された発明の趣旨および範囲か
ら逸脱することなく本発明に対して行われ得ることが本発明者らにより意図され
る。例えば、同種凝集素枯渇のために選択された特定の血液由来組成物は、本明
細書中に記載の実施形態の知見があれば、当業者にとっては慣用的な事項である
と考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、トリ−（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）／Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００処理した同種凝集素枯渇血漿の調製を例示する模式的フロー
チャートを表す。

【図２】 図２は、Ｂ型トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボ
キシ−６５０Ｍ結合体化樹脂の調製を例示する模式的フローチャートを表す。

【図３】 図３は、Ｂ型トリサッカリドＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボ
キシ−６５０Ｍ結合体化樹脂での免疫選択後に、異なるサイクルの画分を通過し
たプールされた血漿に存在する抗Ｂ ＩｇＭおよび抗Ｂ ＩｇＧ免疫グロブリン
の力価を例示する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０１Ｄ 15/08 Ｂ０１Ｄ 15/08 // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハモンド， デイビッド ジェイ． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10567， コートランド マナー， チェスター コート ２ Ｆターム(参考） 4C087 AA01 AA02 AA05 BB34 BB35 BB38 DA02 DA03 DA23 ZA51 ZA52 ZA53 4D017 AA11 BA07 CA13 CB01 DA01 DA03 DB10 EA05 EA10 EB10

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液由来の組成物から同種凝集素を除去するための樹脂を再
   生する方法であって、該方法は、以下： （ａ）抗原−同種凝集素複合体に連結された樹脂を提供する工程；および （ｂ）該抗原−同種凝集素複合体から該同種凝集素を選択的に除去するに十分
   な条件下で、再生緩衝液を用いて該樹脂を洗浄する工程であって、それによって
   、該樹脂を再生する、工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、さらに以下： （ｃ）第二の抗原−同種凝集素複合体を形成するに十分な条件下で、該再生さ
   れた樹脂を、該同種凝集素を含む血液由来組成物と接触させる工程；および （ｄ）該第二の抗原−同種凝集素複合体から該血液由来組成物を分離する工程
   であって、それによって、該同種凝集素から該血液由来組成物を分離する、工程
   、 を包含する、方法。
3. 【請求項３】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも２回繰り返す、請求項２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも５回繰り返す、請求項２に
   記載の方法。
5. 【請求項５】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも２０回繰り返す、請求項２
   に記載の方法。
6. 【請求項６】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも５０回繰り返す、請求項２
   に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記再生緩衝液がチオ硫酸ナトリウムを含む、請求項１に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 前記再生緩衝液が過酢酸を含む、請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記同種凝集素が抗Ａ同種凝集素、抗Ｂ同種凝集素、または
   抗Ａ，Ｂ同種凝集素である、請求項１に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記洗浄する工程が、前記樹脂におけるウイルスまたはプ
    リオンを不活性化するか、非感染性にするか、または除去する、請求項１に記載
    の方法。
11. 【請求項１１】 前記血液由来の組成物が、全血、血漿、血小板調製物、新
    鮮凍結血漿、溶媒−界面活性剤処理血漿、ＩＶＩＧ、ＩｇＭ調製物、精製凝固因
    子濃縮物、およびフィブリノゲン濃縮物からなる群から選択される、請求項２に
    記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記分離する工程が、前記第二の抗原−同種凝集素複合体
    から血液組成物タンパク質を除去する、請求項２に記載の方法。
13. 【請求項１３】 血液に基づくタンパク質が、以下の血液凝固因子：第Ｖ因
    子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第Ｘ
    ＩＩ因子、および第ＸＩＩＩ因子；Ａ同種凝集素でもＢ同種凝集素でもない抗体
    ；固有のタンパク質および酵素；フォン・ビルブラント因子メタロプロテイナー
    ゼ、ならびにカリクレインのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の
    方法。
14. 【請求項１４】 前記樹脂が、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシポリ
    メタクリレート樹脂である、請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記抗原が、１以上のトリサッカリドを含む、請求項１に
    記載の方法。
16. 【請求項１６】 血液由来組成物から同種凝集素を選択的に除去する方法で
    あって、該方法は、以下： （ａ）該同種凝集素に特異的な抗原に連結された樹脂を提供する工程； （ｂ）再生緩衝液を用いて該樹脂を洗浄して、再生された樹脂を形成する工程
    ； （ｃ）該樹脂における同種凝集素−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、
    該洗浄された樹脂を、該血液由来組成物と接触させる工程； （ｄ）該同種凝集素−抗原複合体から該血液由来組成物を分離する工程；およ
    び （ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程であって、それによって、該血液由
    来組成物から該同種凝集素を選択的に除去する、工程、 を包含する、方法。
17. 【請求項１７】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも５回繰り返す、請求項１
    ６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも１０回繰り返す、請求項
    １６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも２５回繰り返す、請求項
    １６に記載の方法。
20. 【請求項２０】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも５０回繰り返す、請求項
    １６に記載の方法。
21. 【請求項２１】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも７５回繰り返す、請求項
    １６に記載の方法。
22. 【請求項２２】 工程（ｂ）〜（ｄ）を少なくとも１００回繰り返す、請求
    項１６に記載の方法。
23. 【請求項２３】 前記同種凝集素が抗Ａ同種凝集素、抗Ｂ同種凝集素、また
    は抗Ａ，Ｂ同種凝集素である、請求項１６に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記再生緩衝液がチオ硫酸ナトリウムを含む、請求項１６
    に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記再生緩衝液が３Ｍチオ硫酸ナトリウムを含む、請求項
    １６に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記再生緩衝液が過酢酸を含む、請求項１６に記載の方法
    。
27. 【請求項２７】 前記樹脂−抗原の組合せを洗浄する工程が、いかなるウイ
    ルスもプリオン夾雑物も不活性化するか、非感染性にするか、または除去する、
    請求項１６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記樹脂が、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ−カルボキシポリ
    メタクリレート樹脂である、請求項１６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記接触させる工程が、カラムクロマトグラフィーによる
    、請求項１６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記接触させる工程が、バッチ吸着による、請求項１６に
    記載の方法。
31. 【請求項３１】 血液由来組成物から同種凝集素を選択的に除去する方法で
    あって、該方法は、以下： （ａ）該同種凝集素に対して特異的な抗原に連結されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ
    ＡＦ−カルボキシポリメタクリレート樹脂を提供する工程； （ｂ）チオ硫酸ナトリウムを用いて該樹脂を洗浄して、再生された樹脂を形成
    する工程； （ｃ）該樹脂における同種凝集素−抗原複合体の形成を可能にする条件下で、
    該洗浄された樹脂を、該血液由来組成物と接触させる工程； （ｄ）該同種凝集素−抗原複合体から該血液由来組成物を分離する工程；およ
    び （ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返す工程であって、それによって、該血液由
    来組成物から該同種凝集素を選択的に除去するが、該血液由来組成物中の他の血
    液タンパク質は残存する、工程 を包含する、方法。
32. 【請求項３２】 前記同種凝集素が抗Ａ同種凝集素、抗Ｂ同種凝集素、また
    は抗Ａ，Ｂ同種凝集素である、請求項３１に記載の方法。
33. 【請求項３３】 工程（ｂ）がさらに、過酢酸を用いて前記樹脂を洗浄する
    工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
34. 【請求項３４】 同種凝集素を結合する組成物であって、該組成物は、該同
    種凝集素に対して特異的な抗原に連結されたポリメタクリレート樹脂を含み、こ
    こで該抗原は、該樹脂上のカルボキシル基によって該樹脂に連結されている、組
    成物。
35. 【請求項３５】 前記抗原がオリゴ糖である、請求項３４に記載の組成物。
36. 【請求項３６】 前記オリゴ糖抗原がトリサッカリドである、請求項３５に
    記載の組成物。