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JP2003509065A - スピロヘータを検出するための一本鎖オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび方法 - Google Patents

スピロヘータを検出するための一本鎖オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび方法

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JP2003509065A
JP2003509065A JP2001523799A JP2001523799A JP2003509065A JP 2003509065 A JP2003509065 A JP 2003509065A JP 2001523799 A JP2001523799 A JP 2001523799A JP 2001523799 A JP2001523799 A JP 2001523799A JP 2003509065 A JP2003509065 A JP 2003509065A
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ラウル、デディエ
ドランクール、ミシェル
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Aix Marseille Universite
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Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、配列番号１〜配列番号４（「Ｎ」は、イノシンか、もしくは、Ａ，Ｔ，ＣまたはＧの中から選択される４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物から選択される同一でも異なってもよいヌクレオチドを示す）の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中から、ならびに該オリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドの中から選択される一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。本発明は、スピロヘータ科の細菌を検出するために該オリゴヌクレオチドを使用することにも関する。本発明は、細菌のＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするスピロヘータｒｐｏＢ遺伝子内の特別に定められた配列を使用することに基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、プローブまたはオリゴヌクレオチドプライマーを用いた検出および
／または増幅ならびに配列決定のための技術に関し、また、スピロヘータ目（ス
ピロヘータ）の細菌を検出または同定するためにこれらのプローブまたはプライ
マーを適用することに関する。
【０００２】 ある種の診断試験において、例えば、特に人または動物の神経系の感染検査、
あるいは節足動物に噛まれた後の検査の際には、試料中の細菌（詳しくはスピロ
ヘータ）の存在に関する迅速な反応を得なければならないことが多い。しかしな
がら、グラム染色や培養後の直接試験などの現在開発されている技術は、グラム
染色の欠如や培地中での増殖の欠如により失敗に終わることが多い。
【０００３】 髄膜脳炎などの感染症の原因となるレプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、
ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、および
セルプリーナ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ）の各種を含む細菌の科を形成するスピロヘ
ータの場合は、培養を行うことができない。したがって、スピロヘータの同定の
問題は未だ解決されていない。
【０００４】 ここ二十年に亘る感染性疾病の増加やこれらの感染性疾病の劇的な結果に鑑み
ると、スピロヘータなどの感染性病原体を検出するための迅速かつ特異的な方法
を開発することが必要とされている。
【０００５】 細菌の培養ができないことの緩和策として、生きている有機体、該有機体から
の細胞抽出物または試料中に、遺伝子、遺伝子の一部、またはヌクレオチド配列
が存在するかどうかを調べるために、核酸および遺伝子材料に関連した技術、特
にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることが考えられる。どんな遺伝子ま
たは遺伝子の一部も、ヌクレオチド塩基の特異的配列によってキャラクタライズ
されることから、ポリヌクレオチドの混合物を含む試料中の前記特異的配列の全
部または一部の存在を直接的に調べることができる。
【０００６】 核酸を検出するための種々のタイプの方法が文献に記載されている。そのよう
な方法は、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんにおける核酸相補鎖
間のプリン−ピリミジン対形成特性に基づいている。この対形成プロセスは、二
本鎖ＤＮＡのアデニン−チミン（Ａ−Ｔ）塩基間、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ
）塩基間に水素結合を形成することによって行われる。またＤＮＡ−ＲＮＡまた
はＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせんでは、水素結合によってアデニン−ウラシル（Ａ−
Ｕ）塩基の対も形成される。特定の核酸分子の有無を調べるための核酸の鎖の対
形成は、「核酸のハイブリッド形成」もしくは単に「ハイブリッド形成」と呼ば
れている。
【０００７】 ＰＣＲ法の一例としては、ＲＮＡｒ１６Ｓに基づいて配列を決定することが挙
げられる。しかしながらこの方法には、診断の妨げとなる潜在的なコンタミネー
ションの問題に起因する限界がある。
【０００８】 この欠点を埋め合わせるために、細菌培養の前段階を行うことなく、あらゆる
試料中でスピロヘータ目に属する細菌を特異的に検出するための新しい遺伝子マ
ーカーが探索されている。そのような新しいマーカーまたはオリゴヌクレオチド
が本発明の対象である。
【０００９】 これらの新しいマーカーの決定は、細菌ＲＮＡポリメラーゼ内のβサブユニッ
トをコードするスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子内の特別に定められた配列の使用
に依拠している。実際に、細菌の科によって異なるがスピロヘータ目の間では保
存されているように思われる領域が、細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット
をコードするＤＮＡ上で見つかっている。したがって、この細菌の科は、他の細
菌の科から区別することができる。スピロヘータ目に特異的なこれらのマーカー
の開発にあたっては、上記保存領域において、スピロヘータの特定種の間では小
さな配列の変化しか見られないという観察結果を用いた。
【００１０】 ラズカノ（Ｌａｚｃａｎｏ）ら［Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ．（１９８８）
２７：３６５〜３７６］によれば、ＲＮＡポリメラーゼは、その起源によって、
ウィルスＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって構成される群と
、真核生物または原核生物（古細菌および真正細菌）を起源とするＤＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼから構成される群との２つの群に分けられる。ＤＮＡ依存性
真正細菌ＲＮＡポリメラーゼは、αββ’で表される「コア酵素」またはαββ
’σで表される「ホロ酵素」と呼ばれる単純な保存された多量体構造を特徴とし
ている［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ），Ａｎｎ． Ｒ
ｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。
【００１１】 これまで数多くの研究によって、真正細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニッ
トの多量体酵素複合体内の機能的法則が明らかにされてきた。古細菌および真正
細菌ＲＮＡポリメラーゼは、１０個もしくは３０個ものサブユニットを含むこと
もあるさらに大きな複合体構造を与える［ピューラ（Ｐｕｈｌｅｒ）ら、Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８９） ８６：４５６
９〜４５７３］。
【００１２】 真正細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの種々のαββ’σサブユ
ニットをコードする遺伝子である、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣおよびｒｐｏ
Ｄの各遺伝子は、リボゾームサブユニットを構成するタンパク質をコードする遺
伝子、あるいはゲノムの複製および修復に関与する酵素をコードする遺伝子を含
む異なる群に分類される［ユラ（Ｙｕｒａ）およびイシハマ（Ｉｓｈｉｈａｍａ
）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．（１９７９） １３：５９〜９７］。
ある著者は、生物界を様々な枝や小枝を分離するための系統樹の作成に、ｒｐｏ
ＢおよびｒｐｏＣ遺伝子の核酸配列を用いることができることを実証している［
ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．
（１９９２） ２１：４０ｓ］。
【００１３】 本発明を詳細に説明する前に、明細書および請求の範囲で使用する種々の用語
について、次のように定義しておく。
【００１４】 − 「細菌から抽出された核酸」とは、全核酸、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャー
ＲＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤＮＡのいずれ
かのことをいう。 − 「ヌクレオチド断片」または「オリゴヌクレオチド」は、２つの同義語であ
り、所定の厳しいストリンジェンス条件下において、相補的またはほぼ相補的な
ヌクレオチド断片とハイブリッド形成する可能性のある、天然核酸などの、天然
の（または修飾された）核酸の情報配列によって特徴付けられるＤＮＡまたはＲ
ＮＡヌクレオチドモチーフの配列のことをいう。この配列は、天然核酸のものと
は異なる構造のヌクレオチドモチーフを含んでいてもよい。ヌクレオチド断片（
またはオリゴヌクレオチド）は、例えば、１００個までのヌクレオチドモチーフ
を含み得る。該ヌクレオチド断片は、少なくとも１０個、より詳細には少なくと
も１２個のヌクレオチドモチーフを含み、天然核酸分子から得られるものであっ
てもよいし、および／または、遺伝子組換え、および／または化学合成によって
得られるものであってもよい。
【００１５】 − 「ヌクレオチドモチーフ」は、糖、リン酸基、ならびに、窒素塩基（アデニ
ン、グアニン、ウラシル、シトシンおよびチミンから選択される）を構造的要素
とする天然の核酸のヌクレオチドであるモノマーから得られるものであるか、そ
うでなければ、該モノマーは前記３つの構造的要素のうちの少なくとも１つが修
飾されているヌクレオチドである。例を挙げると、修飾は塩基で起こり、その例
としては、Ａ，Ｔ，Ｕ，ＣまたはＧの任意の塩基とハイブリッド形成することが
できるイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチル
アミノ−５−デオキシウリジンなどの修飾塩基、またはハイブリッド形成のでき
る他の任意の塩基が挙げられる。あるいは、修飾は糖で起こり、例えば、少なく
とも１つのデオキシリボースをポリアミドで置換したものである［ＰＥ ニール
セン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９１） ２５４：１４９７
〜１５００］。あるいは、修飾はリン酸基で起こり、例えば、選択されたエステ
ル、特に二リン酸エステル、アルキルおよびアリールホスホン酸エステルおよび
モノチオリン酸エステルから選択されるエステルによる置換である。
【００１６】 − 「情報配列」とは、化学的性質および基準方向における順序が、天然の核酸
の配列によって提供される情報と類似の情報を構成するような、任意のヌクレオ
チドモチーフの規則配列のことをいう。
【００１７】 − 「ハイブリッド形成」とは、適当な条件下において、十分に相補的な配列を
有する２本のヌクレオチド断片が、安定かつ特異的な水素結合によって会合する
ことができ、２本鎖を形成する過程のことをいう。ハイブリッド形成のための条
件は、「ストリンジェンス」、すなわち操作条件の厳しさによって決定される。
ストリンジェンスが大きいほど、ハイブリッド形成の特異性は高くなる。ストリ
ンジェンスは、主にプローブ／標的二重らせんの塩基組成の関数であるが、２つ
の核酸間のミスマッチの程度にもよる。ストリンジェンスは、ハイブリッド形成
溶液中に見られるイオン種の濃度および種類、変性剤の種類および濃度、および
／または、ハイブリッド形成温度などの、ハイブリッド形成反応のパラメータの
関数でもありうる。ハイブリッド形成を行うべき条件のストリンジェンスは、主
として使用するプローブに依存している。そのようなデータのすべては周知であ
り、適当な条件は最終的には、それぞれの場合に応じて常套的実験によって決定
することができる。一般に、ハイブリッド形成反応のための温度は、使用するプ
ローブの長さに応じて、約０．８〜１Ｍの濃度の生理食塩水中、約２０〜６５℃
であり、より詳細には３５〜６５℃である。
【００１８】 − 「プローブ」は、本件においては、所定の条件下で、メッセンジャーＲＮＡ
、または転写産物である前記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られたＤ
ＮＡに含まれるヌクレオチド配列を有する核酸とハイブリッド複合体を形成する
ハイブリッド形成特異性を有する、例えば、１０〜１００個のヌクレオチドモチ
ーフ、より詳細には１２〜３５個のヌクレオチドモチーフを含むヌクレオチド断
片である。プローブは診断の目的（特に捕捉または検出プローブ）あるいは治療
の目的で使用することもできる。
【００１９】 − 「捕捉プローブ」は、例えば共有結合、吸着、または固体上への直接合成な
どの適当な手段によって固体支持体上に固定化されているか、固定化することが
できる。支持体の例としては、ミクロタイタープレートやＤＮＡチップなどが挙
げられる。
【００２０】 − 「検出プローブ」は、例えば放射性同位体、酵素、特に色素発生、蛍光発生
、発光性の基質と反応することのできる酵素（特に、ペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ）、発色化合物、色素発生、蛍光発生または発色性化合物
、ヌクレオチド塩基のアナログ、およびビオチンなどのリガンドの中から選択さ
れる標識物質によって標識してもよい。
【００２１】 − 「種プローブ」は、細菌の種を同定することのできるプローブである。 − 「属プローブ」は、細菌の属を同定することのできるプローブである。 − 「プライマー」は、例えば１０〜１００個のヌクレオチドモチーフを含み、
例えば、ＰＣＲなどの増幅技術、配列決定法、転写法などにおける酵素重合開始
のための所定の条件下においてハイブリッド形成特異性を有するプローブである
。
【００２２】 本発明の第１の目的は、明細書の最後のリストに記載の配列番号１〜配列番号
４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモ
チーフの配列を有するオリゴヌクレオチドの中からならびにそれらのオリゴヌク
レオチドの相補的オリゴヌクレオチドの中から選択される、一本鎖オリゴヌクレ
オチドである。
【００２３】 配列番号１〜配列番号４のそれぞれの配列において、明細書の最後の配列リス
トに示されているヌクレオチド「Ｎ」は、該ヌクレオチドが出現する３つの位置
のそれぞれにおいて同一でも異なっていてもよいヌクレオチドを表し、イノシン
か、あるいは、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧから、あるいは場合によってはＡ，Ｕ，Ｃお
よびＧから選択される４つの異なるヌクレオチドの等モル混合物かを表しうる。
【００２４】 「Ｎ」が、特定の位置におけるヌクレオチドの上記等モル混合物を表す場合、
前記位置におけるヌクレオチドは区別なくＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合
によっては、それぞれＡ，Ｕ，ＣまたはＧ）を表し、本発明のオリゴヌクレオチ
ドがより正確に４つのオリゴヌクレオチド群の等モル混合物からなり、その各群
において、前記特定位置において「Ｎ」は異なる意味を有し、４群のそれぞれに
おいてＡ，Ｔ，ＣおよびＧを表すことを意味する。
【００２５】 配列番号１〜４の配列のそれぞれにおいて、ヌクレオチド「Ｎ」が出現する３
位置において、Ｎが４つのヌクレオチドＡ，Ｔ，ＣまたはＧ（あるいは、場合に
よっては、ＮはＡ，Ｕ，ＣおよびＧ）の上記等モル混合物を表す。したがって、
前記配列を構成するオリゴヌクレオチドは、４3（６４）個のオリゴヌクレオチ
ドの混合物を表す。
【００２６】 定義において示したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシ
リボヌクレオチド（ＤＮＡ）であってもよいし、あるいは、オリゴリボヌクレオ
チド（ＲＮＡ）であってもよい。後者の場合、「Ｔ」の代わりに「Ｕ」である。
【００２７】 特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、上述のように１２個以上かつ５０個以
下のモチーフを有している。詳細には、本発明によれば、オリゴヌクレオチドは
１２〜３５個のモチーフを有する。
【００２８】 好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の配列、またはその相補配列
の中から選択される配列を有する。 プライマー１と呼ばれるプライマーからの配列である配列番号１の配列は、２
０個の核酸を有する。プライマー２と呼ばれるプライマーからの配列である配列
番号２の配列は、２１個の核酸を有する。プライマー３と呼ばれるプライマーか
らの配列である配列番号３の配列は、２０個の核酸を有する。プライマー４と呼
ばれるプライマーからの配列である配列番号４の配列は、１７個の核酸を有する
。
【００２９】 大腸菌（Ｅ．ＣＯＬＩ）中のｒｐｏＢ遺伝子を表す命名において、配列番号１
〜４の配列中の最初のヌクレオチドは以下の位置に相当する。 配列番号１：１７３０ 配列番号２：２９００ 配列番号３：３７００ 配列番号４：３８５０ 本願発明者らは、上で定義されるような配列番号１〜４の配列が、スピロヘー
タの間で共通であるということだけでなく、それらの配列が、スピロヘータの科
にも特異的であり、スピロヘータの種における種および属亜型（genus serovar
）に特異的な配列をした非常に可変領域を含むｒｐｏＢ遺伝子の断片を包含する
ことを発見、解明した。
【００３０】 実際に、相補的標的配列内の可変ヌクレオチドが、対象とする細菌種の関数と
して、配列番号１〜４の配列中のヌクレオチド「Ｎ」の位置と対応する位置に見
つかっている。しかしながら、その他のヌクレオチドは、スピロヘータ科内の全
ての細菌種において保存されている。「Ｎ」は任意の塩基とハイブリッド形成し
うるイノシン、またはＡ，Ｔ，ＣおよびＧの４塩基の等モル混合物を表すので、
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド混合物は、スピロヘータ
細菌の相補的標的配列とハイブリッド形成することのできるオリゴヌクレオチド
を常に含んでいる。
【００３１】 さらに、配列番号１〜４の配列は、その領域における配列がスピロヘータ科内
の細菌種のそれぞれに特異的である可変領域を包含しているので、配列番号１〜
４の配列によって、スピロヘータの科に対する特異的プローブの調製が可能にな
るだけでなく、前記配列をプライマーとして用いることにより、ＰＣＲ増幅によ
る前記細菌の種の検出および同定も可能になる。
【００３２】 本発明のオリゴヌクレオチド調製の一形態において、「Ｎ」は全ての位置にお
いてイノシンを表す。 調製の別の形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４の
配列のいずれか１つに含まれる配列を有するオリゴヌクレオチド（特に４Pオリ
ゴヌクレオチド）の混合物を表し、該配列において、「Ｎ」が出現する前記各位
置（特に、ｐ個の位置。「ｐ」は総数を表す）において、Ａ，Ｔ，ＣおよびＧの
全てのヌクレオチドが表される。
【００３３】 配列番号１〜４の配列は、例えばイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）Ｋ．らによる論
文［（１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３］に
記載されているような周知の技術を用いて化学合成によって調製することができ
る。
【００３４】 本発明によるオリゴヌクレオチドの第１の適用例は、該オリゴヌクレオチドを
、生体試料中の、配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１
２個の連続したヌクレオチドモチーフを有するヌクレオチド配列およびそれらの
相補的配列を含むスピロヘータ目に属する細菌を検出するためのプローブとして
使用することである。以後の説明において、このようなプローブのことを「属プ
ローブ」と呼ぶ。
【００３５】 本発明によれば、あらゆる公知のハイブリッド形成技術、特に、フィルタ上へ
の沈殿を伴ういわゆる「ドットブロット」技術［マニアチス（ｍａｎｉａｔｉｓ
）ら、（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ］、ＤＮＡの転移を伴ういわゆる「サザンブロット」技術
［サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）Ｅ．Ｍ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（１９７
５） ９８：５０３］、ＲＮＡの転移を伴ういわゆる「ノーザンブロット」技術
、あるいは、いわゆる「サンドイッチ」技術［ダン（Ｄｕｎｎ）Ａ．Ｒ．，ハッ
セル（Ｈａｓｓｅｌ）Ｊ．Ａ．（１９７７）Ｃｅｌｌ、１２：２３］に従って試
料中の標的核酸の有無を調べる検査において、プローブを診断の目的で使用する
こともできる。特に、「サンドイッチ」技術は、捕捉プローブおよび／または検
出プローブと一緒に用いられ、前記プローブは標的核酸の異なる２つの部位とハ
イブリッド形成することができ、捕捉プローブと検出プローブは少なくとも部分
的に異なるヌクレオチド配列を有していなければならないことを考慮すると、少
なくとも１つの前記プローブ（一般には検出プローブ）が、検査対象の種または
種の群に特異的な標的内の領域とハイブリッド形成することができる。
【００３６】 検出すべき核酸（標的）は、ＤＮＡとＲＮＡのいずれであってもよい（いずれ
か一方がＰＣＲ増幅後に得られる）。二本鎖核酸の標的を検出する場合、検出手
順を行う前に、標的二本鎖核酸を変性させておくとよい。標的核酸は、核酸用の
周知の方法に従って、試験試料からの抽出によって得られる。二本鎖核酸の変性
は、よく知られた化学的、物理的または酵素変性法によって、特に８０℃を超え
る適当な温度に加熱することによって、行うことができる。
【００３７】 前述のハイブリッド形成技術、特に「サンドイッチ」技術を使用するために、
捕捉プローブと呼ばれる本発明によるプローブを固体支持体上に固定化し、検出
プローブと呼ばれる本発明による他のプローブを試薬で標識する。
【００３８】 支持体および標識物質の例は上で定義した通りである。 本発明の別の目的は、少なくとも１つのスピロヘータが、少なくとも１つの当
該細菌に由来する核酸を含有しているか含有する可能性のある試料中に、存在す
るかどうかを調べる方法であって、前記試料を少なくとも１つの本発明による属
プローブと接触させてから、前記プローブと試料中の核酸との間にハイブリッド
複合体が形成されたかどうかを公知の方法で調べる工程から成る方法である。
【００３９】 前記プローブと核酸との間でハイブリッド複合体が形成されているか否かの検
出法の例としては、上述の技術、すなわち、「ドットブロット」、「サザンブロ
ット」および「サンドイッチ」技術が挙げられる。
【００４０】 スピロヘータの種または種の群が存在するかどうかを決定するための本手法の
１つの特定の用途において、本発明による属プローブと本発明による種プローブ
とが用いられる。当然ながら、該属および種プローブは、スピロヘータのｒｐｏ
Ｂ遺伝子に相当する核酸の非重複領域とハイブリッド形成することができる。
【００４１】 有益な態様において、属プローブは固体支持体上に固定化され、種プローブは
標識物質で標識される。 本発明は、特定のスピロヘータ種の存在を調べるために、本発明による手法を
適用することも包含する。
【００４２】 実際に、研究の結果、ＣＬＵＳＴＡＬアライメント法［ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉ
ｎｓ）Ｄ．Ｇ．とシャープ（Ｓｈａｒｐ）Ｐ．Ｍ．（１９８９）Ｇｅｎｅ、７３
：２３７〜２４４］により、スピロヘータ種内で保存されている配列のアライメ
ントが認められ、前記配列は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｒ
ｐｏＢ遺伝子ＡＴＣＣ２５２９０の番号付けを参照するとｒｐｏＢ遺伝子の位置
１７３０〜２９００の間に位置する１１７０塩基を有し、スピロヘータ目の中の
少なくとも１つの細菌を検出することができることが示された。特定の種（対照
種に対する、この場合はＥ．ｃｏｌｉ）に対する変異を施した領域を含むプロー
ブを用いることにより、当該種を直接的に検出することが可能になる。２つのプ
ローブの組み合わせ（捕捉プローブと検出プローブ）を用いるサンドイッチハイ
ブリッド形成技術では、例えばスピロヘータの科に特異的なプローブと対象種に
特異的なプローブとを組み合わせて用いる。上記の種に特異的な２つのプローブ
の組み合わせて用いることも可能である。そのような種がある場合には、それら
２つのプローブはｒｐｏＢ遺伝子の非重複領域に相補的である。
【００４３】 本発明におけるオリゴヌクレオチドの別の適用例は、該ヌクレオチドを、配列
番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる少なくとも１２個のヌクレオチドモ
チーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、一本鎖オリゴヌクレ
オチドを含むヌクレオチドプライマーとして用いることであり、該ヌクレオチド
プライマーは、ポリメラーゼの存在下での周知の手法による核酸合成、すなわち
、ポリメラーゼ存在下でのそのような合成を用いた増幅法（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣ
Ｒなど）において用いることができる。特に、本発明によるプライマーは、対応
する相補的ＤＮＡ配列を得るために、スピロヘータの少なくとも１つの種または
少なくとも１つの種の群のメッセンジャーＲＮＡの配列の特異的逆転写のために
用いることもできる。このような逆転写をＲＴ−ＰＣＲ技術における第一段階と
し、これに続く段階をＰＣＲによって得られた相補的ＤＮＡの増幅とすることが
できる。さらに、本発明によるプライマーを、スピロヘータの少なくとも１つの
種または少なくとも１つの種の群のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列の鎖重合反応に
よる特異的増幅のために用いることもできる。
【００４４】 特定の場合において、上記プライマーは本発明によるオリゴヌクレオチドから
成るので、該プライマーはＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータの
順方向または逆方向配列をも含んでいる（例えば、プロモータＴ７，Ｔ３，ＳＰ
６［スタディ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ＦＷ，ＢＡ モファット（Ｍｏｆｆａｔｔ）（
１９８６）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８９：１１３］）。このようなプラ
イマーは、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲなどの転写段階に関する核酸増幅方法におい
て使用することができる［ファン・ゲーメン（Ｖａｎ Ｇｅｍｅｎ）Ｂ．ら、ア
ブストラクトＭＡ１０９１、第７回国際エイズ会議（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ ＡＩＤＳ）（１９９１）、フィレンツェ、イ
タリア］。
【００４５】 本発明の別の目的は、任意のスピロヘータ種におけるｒｐｏＢ遺伝子の全また
は部分配列決定のために使用することができる、配列番号１〜４の配列のいずれ
か１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列を有
するオリゴヌクレオチドの中から選択される一本鎖オリゴヌクレオチドからなる
ヌクレオチドプライマーである。特に、このヌクレオチドプライマーは、増幅さ
れた核酸の配列決定に用いることができる。
【００４６】 実際に、本発明に係るオリゴヌクレオチドプライマーは、全てのスピロヘータ
におけるｒｐｏＢ遺伝子の増幅とその後の配列決定を可能にするとともに、この
配列のバイオデータ処理解析による任意のスピロヘータの同定、ならびに新規ま
たは未知のスピロヘータ種の認識を可能にする。配列決定は、よく知られた方法
、ジデオキシヌクレオチドを用いた吸着重合［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ．，
クイソン（Ｃｏｕｉｓｏｎ）Ａ．Ｒ．（１９７５）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ
． ９４：４４１］、またはＤＮＡチップを用いた多重ハイブリダイゼーション
によってｒｐｏＢ遺伝子の全または部分配列を得ることを包含する。
【００４７】 プライマー１〜３は５’プライマーとして、プライマー２〜４は３’プライマ
ーとして使用して、５’と３’の間に囲われたｒｐｏＢ遺伝子の断片を前記プラ
イマーによって増幅することができる。
【００４８】 １つの形態において、５’プライマーに対しては配列番号１〜３、３’プライ
マーに対しては配列番号２〜４の配列に含まれる、少なくとも１２個のヌクレオ
チドモチーフの配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される異なる２つのオ
リゴヌクレオチドからなる、２つのプライマーから成る組が用いられる。
【００４９】 また本発明は、前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片をまず本発明によるプライマ
ーで増幅し、次に、前記断片を本発明による前記細菌に由来するプローブと接触
させることを特徴とする方法も含んでいる。前記プローブと前記断片との間でハ
イブリッド複合体が形成されるかどうかが決定される。
【００５０】 また本発明は、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、そのような
細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存在するかどうか
を調べるための方法であって、前記試料を本発明のプライマーに接触させること
を特徴とする方法をも含む。その後、増幅が行われ、増幅産物が出現しているか
どうかが決定される。
【００５１】 １つの形態において、スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、その
ような細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある生物試料中に存在す
るかどうかを調べるための方法は、本発明によるプライマーを用いて前記試料中
の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅および配列決定を行い、得られた遺伝
子のｒｐｏＢ遺伝子断片の配列を、試料中の前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片の
既知の配列と比較して、得られた断片の配列が前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片
の既知の配列と一致するかどうかを調べることを特徴とする。
【００５２】 また本発明は、スピロヘータ目に属する細菌の種に特異的な、生物試料中の検
出プローブであって、本発明によるプライマーを用いた増幅によって得られるｒ
ｐｏＢ遺伝子の断片を含み、好ましくは５’プライマーとして配列番号１〜３の
配列のいずれか１つを有し、３’プライマーとして配列番号２〜４の配列のいず
れか１つを有することを特徴とする検出プローブも包含する。本発明のオリゴヌ
クレオチドによって囲まれる前記ｒｐｏＢ遺伝子の断片は、実際には、スピロヘ
ータ目に属する前記細菌の種に応じて大きく変化する領域であって、前記各種に
対して特異的な領域に相当する。
【００５３】 最後に、本発明は、スピロヘータの少なくとも１種または種の群によって誘起
される感染を治療するための、上で定義したオリゴヌクレオチドを含む遺伝子治
療プローブも包含する。前記細菌のメッセンジャーＲＮＡおよび／またはゲノム
ＤＮＡ上にハイブリッド形成することのできるこの遺伝子治療プローブは、翻訳
および／または転写および／または複製の現象を阻止することができる。
【００５４】 遺伝子治療法の原理は公知であり、主として逆方向鎖に相当するプローブを使
用することに基づいている。プローブと順方向鎖との間のハイブリッド形成によ
り、遺伝子情報解読における少なくとも１段階を混乱させることができる。これ
により、遺伝子治療プローブを、スピロヘータによって引き起こされる感染と闘
うための抗細菌薬として使用することができる。
【００５５】 以下の実験報告を用いて本発明を詳細に説明する。 以下の説明は、図１および図２を用いてよりよく理解される。 以下の実施例で使用するスピロヘータ菌株、すなわち、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂ
ｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｔｒｅｐ
ｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ ｓｅ
ｒｏｖａｒ ｐａｔｏｃ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａと呼ぶ
）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ｉｃｔ
ｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒ
ｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅと呼ぶ）およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅ
ｒｒｏｇａｎｓ ｓｅｒｏｖａｒ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（以下、Ｌｅｐｔｏｓｐ
ｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓと呼ぶ）は、パリのパスツール研究所（フランス）
のＣｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで入手可能なＢ
ｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓを除き、すべてＡＴＣＣコレクション
から得た。Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉのＡＴＣＣ番号は３５２１
０であり、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍのＡＴＣＣ番号は２７０８７
であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのＡＴＣＣ番号は２３５８２で
あり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅのＡＴ
ＣＣ番号は４３６４２であり、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓのＡ
ＴＣＣ番号は２３６０５である。
【００５６】 ＢｏｒｒｅｌｉａおよびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ株は、それぞれＢＳＫＩＩおよ
びＥＭＪＨ培地上で３０℃で培養した［バーバ（Ｂａｒｂｏｕｒ）Ａ．Ｇ．（１
９８４）Ｙａｌｅ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ５７：５２１］。Ｔ．ｐａｌ
ｌｉｄｕｍは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖できないため、この病原性細菌はウサギ
の精巣に注射することにより増殖させた。
【００５７】 他の使用細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃ
ｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕ
ｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａは、マルセイユの入
院患者より臨床的に単離した。
【００５８】実施例１：本発明によるプローブを用いたスピロヘータの特異的検出 本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った： Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉ
ｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃ
ｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌ
ｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびにＳｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ。
【００５９】 スピロヘータＤＮＡをＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの抽出物
と混合することにより、混合細菌懸濁液を調製した。 ＱＩＡａｍｐ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）およびＧｉｂｃｏポリメラーゼＴａ
ｑ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ＵＳＡ）を用いてＰＣＲ法を行った。最初の変性ステ
ップ（９４℃、２分間）の後、９４℃３０秒間、５２℃３０秒間、および７２℃
１分間の３ステップからなるサイクルを３５回繰り返し、ＰＣＲプログラムを終
了した。得られたアンプリコンを精製し上述のように配列決定を行った。
【００６０】 結果を図１に示す。同図において、 バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、 バンド２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独に相当し、 バンド３は、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し
、 バンド４は、Ｂ．ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し
、 バンド５は、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、 バンド６は、Ｌ．ｂｉｆｌｅｘａ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、 バンド７は、Ｌ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ ＋ Ｓ．ａｕｒｅｕｓに相当し、 バンド８は、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ ＋ Ｓ．ａｕ
ｒｅｕｓに相当する。
【００６１】 また、以下のプライマーを使用した。 パネルＡ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＦＤＩおよびＲＤ３［ウェイスブル
グ（Ｗｅｉｓｂｕｒｇ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９１）１７３：６
９７−７０３］。 パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよび２９００Ｒ。
【００６２】 プライマー１７３０Ｄの配列は配列番号１（５’ＣＴＴＧＧＮＣＣＮＧＧＮＧ
ＧＡＣＴＴＴＣ３’）において「Ｎ」がイノシンであり、プライマー２９００Ｒ
は、配列番号２の配列（５’ＡＧＡＡＡＴＮＡＡＮＡＴＮＧＣＡＴＣＣＴＣ３’
）を有し、該配列中「Ｎ」はイノシンである。
【００６３】 これらの結果は、本発明におけるプライマーは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単独のＤＮ
Ａを増幅できず、したがってこれを検出することができなかったが、Ｓ．ａｕｒ
ｅｕｓにおいてしかＤＮＡを増幅できなかったプライマー１６Ｓ（パネルＡ）と
は対照的に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在下でさえ、スピロヘータのＤＮＡを増幅し
、検出することができたことを示している（パネルＢ）。
【００６４】 実施例２：本発明によるプライマーを用いたｒｐｏＢ遺伝子の断片の特異的増幅 本実験は以下のスピロヘータ菌株を用いて行った： Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉ
ｄｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃ
ｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌ
ｉｓ、およびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、ならびに他の非スピ
ロヘータ菌株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ
およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ。
【００６５】 使用したＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍにおけるｒｐｏＢ遺伝子の配
列は、ワインストック（Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ）ら［（１９９８）Ｔｈｅ ｇｅｎ
ｏｍｅ ｏｆ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ：ｎｅｗ ｌｉｇｈｔ
ｏｎ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｓｙｐｈｉｌｉｓ． ＦＥＭ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｒｅｖ．２２：３２３−３３２］に記載の通りである。
【００６６】 使用したＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉにおけるｒｐｏＢ遺伝子
の配列は、アレクサン（Ａｌｅｋｓｈｕｎ）ら［（１９９７）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏ
ｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ ｒｐｏＢ、Ｇｅｎｅ １８６：２２７
−２３５］に記載の通りである。
【００６７】 Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒ
ｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓお
よびＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓのｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列
は、ＰＣＲにより以下のようにして得た。
【００６８】 Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａのゲノムＤＮＡを標準的な手法により
、フェノール／クロロホルムで抽出した［サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら
、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ， ＮＹ］。
この実験の第１段階において、プライマーＳＥＢ１（５’−ＡＡＣ ＣＡＧ Ｔ
ＴＣ ＣＧＣ ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ Ｇ−３’）およびＳＥＢ２（５’−Ｃ
ＣＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＡＣ ＧＣＴ ＣＧＧ Ａ−３’）（Ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＢｏ
ｒｒｅｌｉａ ｓｕｂｔｉｌｉｓに対するＳＥＢ）、およびＥｕｒｏｇｅｎｔｅ
ｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によるポリメラーゼＤＢＡ Ｔａｑを用
い、最終容積５０μＬに対して５μＬのＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅を行
った。第１ステップの変性（９５℃、１．５分間）後、９５℃２０秒間、５０℃
３０秒間、および７２℃１分間の３ステップから成るサイクルを３５回繰り返し
た。ＰＣＲプログラムは７２℃で３分間の伸展ステップを１回行って終了した（
ＰｅｌｔｉｅｒＰＴＣ２００熱サイクルモデル、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗａ
ｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）
【００６９】 電気泳動によって得られたアンプリコンを１％アガロースゲル上で分離し、臭
化エチジウム染色により可視化した。 次に、ＰＣＲ ＱＩＡ迅速精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）を用いて試料を精製し、該精製試料をｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒ
ｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔ
ｉｏｎバッファ（ＤＮＡシーケンシングキット、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と
反応させることにより、遺伝子の配列決定を行った。最後に、アプライドバイオ
システムズ自動ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３１０（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
を用いて反応性産物の電気泳動を行った。
【００７０】 ｒｐｏＢ遺伝子の５’末端の配列は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗ
ａｌｋｅｒ（商標登録）キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ
，ＵＳＡ）を用いて、以下のようにして得た。ゲノムウォーカー「バンク（Ｂａ
ｎｋｓ）」と呼ばれる５群のゲノムＤＮＡ断片を、ＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、Ｐｖ
ｕＩＩ、ＳｃａＩＩおよびＳｔｕＩ制限酵素を用いて構築した。これらのバンク
は、遺伝子の既知の５’末端にできる限り近い領域に相当する配列を有した該遺
伝子に対する特異的プライマーと、キットにより提供される適応プライマー（ad
aptation primer ）とを用いて、ゲノムＤＮＡの予備配列決定を行うために用い
た。
【００７１】 増幅された断片は精製し、ＤＮＡ供給源は２度目の閉鎖（enclosed）ＰＣＲの
ために用いた。得られたアンプリコンは、自動シーケンシングに供するために上
述のように処理した。
【００７２】 得られたＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配
列番号５の配列を有し、３８７６個の核酸を有していた。得られたＬｅｐｔｏｓ
ｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒａｇｉａ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列
番号６の配列を有し、９１４個の核酸を有していた。得られたＬａｐｔｏｓｐｉ
ｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号７の配列を有し、
９４９個の核酸を有していた。最後に、得られたＢｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒ
ｒｅｎｔｉｓ由来のｒｐｏＢ遺伝子は、配列番号８の配列を有し、８００個の核
酸を有していた。
【００７３】 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒ
ｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓおよびＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列は、文
献に記載されている（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）。
【００７４】 増幅するｒｐｏＢ遺伝子の断片は９４９ｐｂから成っていた。 ＰＣＲによるｒｐｏＢ遺伝子の断片の増幅は、各種を別々に用いたことを除い
ては、実施例３と同様にして実施した。
【００７５】 結果は図２に示した。同図において、 バンド１は、分子量マーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に相当し、 バンド２は、Ｂ． ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉに相当し、 バンド３は、Ｂ． Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓに相当し、 バンド４は、Ｔ． ｐａｌｌｉｄｕｍに相当し、 バンド５は、Ｌ． ｂｉｆｌｅｘａに相当し、 バンド６は、Ｌ． ａｕｓｔｒａｌｉｓに相当し、 バンド７は、Ｌ． ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｍｏｒｒａｇｉａｅに相当し、 バンド８は、Ｅ． ｃｏｌｉに相当し、 バンド９は、Ｓ． ａｕｒｅｕｓｉに相当し、 バンド１０は、Ｓｔｒ． ｓａｌｉｖａｒｉｕｓに相当し、 バンド１１は、Ｐｓ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに相当し、 バンド１２は、ＤＮＡを含まない陰性対照に相当する。
【００７６】 以下のプライマーを用いた。 パネルＡ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー２９００Ｒ
。 パネルＢ：本発明によるプライマー１７３０Ｄおよびプライマー３８００Ｒ
。 パネルＣ：ＲＮＡｒプライマー１６Ｓ ＲＤ１およびＦＤ３。 プライマー３８００Ｒは、配列番号４の配列（５’ＧＣＴＴＣＮＡＧＮＧＣＣ
ＣＡＮＡＣ３’）を有し、該配列中、「Ｎ」はイノシンである。
【００７７】 以上の結果は、プライマー１６Ｓは全てを増幅したが（パネルＣ）、本発明の
プライマーは、スピロヘータのＤＮＡ断片しか増幅することができなかったこと
を示している（パネルＡおよびＢ）。
【００７８】 プライマー配列番号３（５’ＧＧＧＴＧＮＡＴＴＴＴＮＴＣＡＴＣＮＡＣ３’
）もプライマーとして使用できる。本発明によるプライマー１〜３により、増幅
に次ぐ増幅産物の配列決定、ザイールで採集されたアフリカカズキダニ（Ａｆｒ
ｉｃａｎ ｔｉｃｋ）のｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ種および回
帰熱を示すザイールの患者の全血液中に含まれるＢｏｒｒｅｌｉａ ｄｕｔｔｏ
ｎｉｉ細菌の検出および同定を行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明におけるプローブを用いて混合細菌懸濁液中のスピロヘータ
を検出した結果を表す電気泳動ゲルの写真。
【図２】本発明におけるプライマーを用いてスピロヘータのｒｐｏＢ遺伝子
の断片をＰＣＲにより特異的に増幅した結果を示す電気泳動ゲルの写真。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドランクール、ミシェル フランス国 Ｆ−13012 マルセイユ ト ラヴェルス ドゥ ラ ポーリーヌ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 CA11 CA20 HA11 HA13 HA14 HA17 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ06 QQ42 QQ52 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR56 QR62 QR84 QS16 QS25 QS31 QS34 QX02 4C084 AA13 NA14 ZB352 4C086 AA01 AA03 EA16 NA14 ZB35

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１〜配列番号４（「Ｎ」は、イノシンか、もしくは
    、Ａ，Ｔ，ＣまたはＧの中から選択される４つの異なるヌクレオチドの等モル混
    合物から選択される同一でも異なってもよいヌクレオチドを示す）の配列のいず
    れか１つに含まれる少なくとも１２個の連続したヌクレオチドモチーフの配列か
    らなるオリゴヌクレオチドの中から、ならびに該オリゴヌクレオチドの相補的オ
    リゴヌクレオチドの中から選択される一本鎖オリゴヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 １２〜３５個のヌクレオチドモチーフを含むことを特徴とす
    る請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号１〜４の配列およびその相補的配列の中から選択さ
    れる配列を有することを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 「Ｎ」はイノシンを表すことを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 「Ｎ」が出現する各位置において全てのヌクレオチドＡ，Ｔ
    ，ＣおよびＧが表される配列番号１〜４の配列のいずれか１つに含まれる配列を
    有するオリゴヌクレオチドの混合物からなることを特徴とする請求項１〜３のい
    ずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のヌクレオチドを含むこ
    とを特徴とする、スピロヘータ目に属する細菌を生物試料中で検出するためのプ
    ローブ。
  7. 【請求項７】 固体支持体上に固定化されていることを特徴とする請求項６
    に記載のプローブ。
  8. 【請求項８】 追跡物質によって標識されていることを特徴とする請求項７
    に記載のプローブ。
  9. 【請求項９】 スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、少なくと
    も１つの当該細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存在
    するかどうかを決定するための方法であって、前記試料を請求項６〜８のいずれ
    か一項に記載の少なくとも１つのプローブと接触させ、プローブと試料中の核酸
    との間にハイブリッド複合体が形成されるかどうかを決定することを特徴とする
    方法。
  10. 【請求項１０】 スピロヘータ目に属する細菌種のいずれか１つの中のｒｐ
    ｏＢ遺伝子の、ポリメラーゼの存在下での合成ならびに全または部分配列決定の
    ために使用可能なヌクレオチドプライマーであって、請求項１〜５のいずれか一
    項に記載のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするヌクレオチドプライマー
    。
  11. 【請求項１１】 前記細菌のｒｐｏＢ遺伝子の断片を請求項１０に記載の少
    なくとも１つのプライマーで増幅し、前記断片を請求項６〜８のいずれか一項に
    記載の前記細菌のプローブと接触させ、前記プローブと前記断片との間にハイブ
    リッド複合体が形成されるかどうかを決定することを特徴とする請求項９に記載
    の方法。
  12. 【請求項１２】 スピロヘータ目に属する少なくとも１つの細菌が、少なく
    とも１つの当該細菌に由来する核酸を含んでいるか含む可能性のある試料中に存
    在するかどうかを決定するための方法であって、前記試料を請求項１０に記載の
    プライマーに接触させ、増幅を行い、増幅産物の有無を決定することを特徴とす
    る方法。
  13. 【請求項１３】 ｒｐｏＢ遺伝子の増幅された断片の配列決定を行い、得ら
    れた前記断片の配列を前記細菌の既知のｒｐｏＢ遺伝子配列と比較し、前記得ら
    れた断片の配列が既知の配列と一致する場合に前記細菌種が存在すると決定する
    ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 スピロヘータ目に属する細菌種に特異的な生物試料中にお
    ける検出プローブであって、請求項１０に記載のプライマーによる増幅によって
    得られるｒｐｏＢ遺伝子の断片を含むことを特徴とする検出プローブ。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド
    を含むことを特徴とする遺伝子治療プローブ。
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