JP2003501041A - 細胞特異的な感染およびゲノム組み込みのためのキメラファイバータンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクター - Google Patents
細胞特異的な感染およびゲノム組み込みのためのキメラファイバータンパク質を発現する組換えアデノウイルスベクターInfo
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Abstract
Description
A 80192−01およびR21 DK 55590−01)からの資金をも
ってなされた。従って、米国政府は本発明において特定の権利を有する。
に感染する新規のアデノウイルス(Ad)ベクター、および任意のアデノウイル
ス血清型の再標的化を可能にするファイバータンパク質の改変を含むAdベクタ
ーに関する。
定な会合、および関連する毒性または免疫学的な副作用のない適切な標的細胞に
おける適切な導入遺伝子発現を必要とする。現在利用可能なウイルスベクター系
(組換えレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含む)は
、多くの細胞型への効率よい遺伝子移入には適切ではない。レトロウイルスは、
安定な組み込みのために細胞分裂を必要とする。組換えアデノウイルスベクター
は、遺伝子治療のために重要な多くの細胞型に感染し得ない。これらの細胞には
、造血幹細胞、単球、Tリンパ球およびBリンパ球が含まれる。さらに、組換え
アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)は、低頻度で組み込まれる。
させる多数の特性を有する(Hitt,M.M.et al.1997 Ava
nces in Pharmacology 40:137−205)。これら
には、非分裂性細胞を含む多量の種々の細胞型へインビボで、8kbまでの長い
発現カセットの高度に効率的な遺伝子移入と共同して、高力価で精製されたウイ
ルスを生成する能力が含まれる。第一世代アデノウイルスの限定は、毒性および
ウイルスの排除を排除する、発現されたウイルスタンパク質に対する免疫応答の
発達を含む。形質導入された細胞内のアデノウイルスDNAのエピソーム状態は
、第一世代Adベクターの別の限定である。宿主ゲノムへのアデノウイルスDN
Aの安定な組み込みは、特定の亜型の野生型形態についてのみ報告されており、
そしてインビトロおよびインビボでの遺伝子移入のために広汎に使用されている
E1/E3欠損Ad5(アデノウイルス血清型5)ベクタでは検出可能な様式で
生じないようである[Hitt,M.M.et al.1997 Advanc
es in Pharmacology 40:137−205]。
低頻度で(およそ20,000ゲノムのうち約1ゲノム)組み込まれる(Rut
ledge,E.A.;Russel,D.W.1997 J.Virolog
y,71,8429−8436)。2つのAAV逆方向末端反復(ITR)およ
びまだ知られていない宿主細胞因子は、ベクター組み込みのために唯一の要件で
あるようである(Xiao,X.,et al,1997,J.Virolog
y,71,941−948;Balague,C.,et al.1997,J
.Virology,71,3299−3306;Yang,C.C.1997
,J.I irology,71,9231−9247)。大きなAAV Repタンパク
質の存在下で、AAVは、ヒト第19染色体のAAVSIと呼ばれる特定の部位
へと優先的に組み込まれる(Berns,K.I.,1996,Fields
Virology.Fields,B.N.et al.(ed)Vol.2,
Lippincott−Raven,Philadelphia,PA,217
3−2220)。このAAVキャプシドは、3つの皮膜タンパク質(VP1 3)によって形成され、これは、細胞表面の特定のヘパリン硫酸と相互作用し、
そしておそらく特定のレセプターと相互作用する。しかし、多くの細胞型(造血
幹細胞を含む)は、これらの構造を欠如し、その結果、AAV2に基づくrAA
Vベクターは、これらの細胞に感染も形質導入もし得ない(Malik P.e
t al.,1997,J.Virology,71,1776−1783;Q
uing,K.Y.,et al.1998,J.Virology,72,1
593−1599)。rAAVベクターの他の欠点としては、すべてのウイルス
遺伝子を欠如するrAAVベクターに収容され得る限定された挿入の大きさ(4
.5−5kb)、およびrAAV調製物の低い形質導入力価が挙げられる。 アデノウイルス感染は、そのファイバータンパク質を介して、Ad5の細胞表
面を付着させることによって開始する(概説について、以下を参照のこと:Sh
enk,T.1996 Fields Virology,Vol.2,Fie
lds,B.N.et al.(ed)Vol.2,Lippincott−R
aven,Philadelphia,PA,2111−2148)。三量体フ
ァイバー分子の遠位のC末端ドメインは、ノブ(knob)において終結し、こ
のノブは、コクサッキーアデノウイルスレセプター(CAR)として最近同定さ
れた特定の細胞レセプターに結合する(Bergelson,J.M.et a
l.Science,275,1320−1323)。結合後、ウイルス接着に
は依存しない事象において、ペントンベースにおいてArg−Gly−Asp(
RGD)モチーフは、α3およびβ5の細胞インテグリンと相互作用する。この
相互作用は、細胞インターナリゼーションを開始し、それによって、そのビリオ
ンは、エンドソーム内への局在化を達成する。このエンドソーム膜は、ペントン
ベースによって媒介されるプロセスにおいて溶解し、そのエンドソームの内容物
を細胞質へと放出する。これらのプロセスの間、このビリオンは徐々に皮膜が解
かれ、そしてそのアデノウイルスDNAが核へと輸送され、そこで複製が行われ
る。末端タンパク質(これは、ウイルスゲノムに共有結合される)およびコアタ
ンパク質V(これは、そのコアの表面上に局在化される)は、核局在化シグナル
(NLS)を有する(van der Vliet,B.1995,The M
olecular Repertoir−of Acenoviruses,V
ol.2,Doerfler,W.and Boehm,P.(ed.),Sp
ringer Verlag,Berlin,1−31)。これらのNLSは、
核へのアデノウイルスゲノムの指向において重要な役割を果たし、そしておそら
く、アデノウイルスが非分裂細胞に形質導入されることを可能にする構造要素を
表す。二本鎖の直鎖状のDNAが核に到達するとき、それは、その末端タンパク
質を介して核マトリクスに結合する。
ンテグリンの存在によって拘束されていることから、Adベクターの親和性を広
げるようにする試みがなされた。アデノウイルス被覆タンパク質の遺伝子改変を
して新規細胞表面レセプターを標的化することが、ファイバー(fiber)(
Krasnykh,V.et al.1998 J.Virology,72,
1844 1852,Krasnykh,V.et al.1996 J.Vi
rology,70,6839−6846,Stevenson,S.D.,e
t al.1997,J.Virology,71,4782−4790),ペ
ントン塩基(Wickham,T.J.,et al.1996,J.Viro
logy,70,6831−6838;Wickham,T.J.,et al
.1995,Gene Therapy,69,750−756)、およびヘキ
ソンタンパク質(Crompton,J.,et al.1994,J.Gen
.Virol.75,133−139)について報告されている。最も有望な改
変は、そのファイバータンパク質の機能的改変、またはより詳細にはその部分と
してファイバーノブ(これは、一次接着を媒介する)の機能的改変であるようで
ある。2つのグループがAd5テイル/シャフトおよびAd3のノブドメインか
らなるファイバーの生成を報告した(Krasnykh,V.et al.19
96 前出,Stevenson,S.D.,et al.1997,前出)。
最近、C末端ポリリジン、ガストリン放出ペプチド、ソマトスタチン、E−セレ
クチン結合タンパク質またはオリゴヒスチジンを含む組換えアデノウイルスが、
Ad5のネイティブの親和性変化させるために産生された。Krasnikhら
は、(Krasnykh,V.et al.1998 前出)は、異種ペプチド
リガンドがファイバーノブドメインのH1ループへと、そのファイバーの生物学
的機能に影響を与えることなく挿入され得ることを見出した。他のAd血清型で
の研究に基づけば、そのファイバーシャフトの長さが重要な要因であり、細胞表
面インテグリンとの相互作用の効率およびインターナリゼーションプロセスを決
定するようである。これまでは、特定の細胞型についてAd5の首尾よい再標的
化を実証するデータは報告されていない。
の最小限の抗原性を伴う宿主ゲノムに安定に組み込まれたままである、改良され
たアデノウイルスベクターに対する必要性が現在存在する。本発明は、ベクター
を特異的に標的化するためにそのキャプシド上に改変されたファイバータンパク
質を発現する、新規キメラアデノウイルス(Ad)Ad AAVベクターを開示
する。これらのベクターの作製方法、使用および利点が記載される。さらに、フ
ァイバータンパク質のノブおよびシャフトのドメインについて記載される偏向は
、細胞特異的感染のために、任意のアデノウイルス血清型を再標的化する新規ア
プローチを提供する。
び/またはανβ3/5に非依存的な様式で、多様な細胞型または組織への安定か
つ効率よい遺伝子移入のために導入遺伝子または導入遺伝子の一部を有する。ま
た、そのようなベクターを生成するための方法、およびそれを、特定の細胞型ま
たは組織へと遺伝子治療を標的化するための使用が提供される。
)アデノウイルスベクターの容易な産生および送達を可能にする。ここで、導入
遺伝子を異なる細胞型の宿主ゲノムへの安定な組み込みというさらなる利点が伴
う。記載されるアデノウイルスベクターは、複製およびビリオンキャプシド化に
必要な5’および3’のシスエレメントを除き、すべてのアデノウイルス配列を
欠く。5’側(右側)および3’側(左側)の逆方向末端反復(ITR)を含む
本発明のアデノ随伴ウイルス配列には、導入遺伝子カセットが隣接し、その結果
、このアデノ随伴ウイルス配列は、ウイルス複製の間の相同組換えおよび宿主ゲ
ノムへのウイルス組み込みを指示する。1つの実施形態において、AAV−IT
R隣接配列が使用される。このベクターはまた、選択された調節エレメントおよ
びポリアデニル化終止シグナルに作動可能に連結された(これには次いで、上記
隣接配列が隣接する)、選択された導入遺伝子を含む。選択された導入遺伝子は
、同じ調節エレメントの下または互いに同じ方向もしくは反対の方向で別個の調
節エレメントの下で連結され得る。選択された導入遺伝子は、任意の遺伝子(単
数または複数)であり、これは、治療、レポーターまたは選択の目的のために宿
主細胞または組織において発現される。このベクターは、宿主細胞への高力価導
入遺伝子送達および宿主ゲノムへの導入遺伝子の安定な組み込みの能力によって
特徴づけられる。また、組み込み頻度および部位特異的組み込みを、組換えハイ
ブリッドベクターへのAAVrepタンパク質の取り込みによって改良する方法
も提供される。
タンパク質は、天然に存在するファイバータンパク質を含み、ここでは、配列の
一部または複数の部分は、感染の細胞もしくは組織特異性を変更するように改変
されている。偏向されたファイバータンパク質配列は、他のまたは同じアデノウ
イルス血清型あるいはランダムに選択されたペプチドからの、ファイバータンパ
ク質ドメイン(ノブドメイン、シャフトドメインおよびテイルドメイン)を、含
み得る。キメラファイバータンパク質は、その全体が、天然に存在しない配列か
ら構成され得る。本発明はさらに、キメラファイバータンパク質をコードする核
酸配列に関する。これらの核酸配列は、天然に存在する配列、天然に存在する配
列と天然に存在しない配列との混合物、またはその全体が天然に存在しない配列
であってもよい。
含む、任意のアデノウイルスベースのベクターへと挿入され得、これにより、そ
のウイルスは、所定の細胞または組織に特異的に感染し得ることが付与される。
そのような異種ファイバー配列を有するアデノウイルスベクターを用いて、所望
の細胞への遺伝子移入を指示し得る。宿主ゲノムへの導入遺伝子カセットの安定
な組み込みのために、本発明において記載されるキメラAd−AAVベクターが
使用するベクターとして好ましい。本発明はまた、そのファイバーノブにおいて
ランダムペプチドを提示するアデノウイルスのライブラリーを含む。これは、イ
ンビトロおよびインビボで、特定の細胞型に対する親和性を有するアデノウイル
ス改変体についてスクリーニングするためのリガンドとして用いられ得る。
現される、改変されたファイバータンパク質を含むAd−AAVゲノムが挙げら
れる。これらのキメラベクターは、広汎な種々の細胞に感染するように設計され
、特に、一般に使用されるレトロウイルスAAVおよびアデノウイルスベクター
によってはほとんど形質導入され得ない細胞に感染するように設計される。これ
らの細胞としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない:造血幹細胞、肺
上皮細胞、樹状細胞、リンパ芽様細胞、および内皮細胞。造血幹細胞(例えば、
CD34+細胞)は、本明細書において記載されるベクターを用いて、鎌状赤血
球貧血およびサラセミアの遺伝子治療のために標的化され得る。遺伝子を内皮細
胞へと形質導入し得るキメラAd−AAVベクターは、冠状動脈手術の後に、ア
テローム性動脈硬化または狭窄のような血管疾患のための遺伝子治療において使
用され得る。
い限り、当該分野で通常使用される意味を有する。本明細書中で用いられる場合
、以下の用語または句は、特定された意味を有する。
が含まれるがこれらに限定されない。ベクター配列は、ウイルスの「基本ベクタ
ー」配列として指定され得る。基本ベクター配列は、その基本ベクターが由来し
た特定のウイルスの型および血清型に依存する。基本ベクター配列は、非ベクタ
ー配列または導入遺伝子配列(例えば、異種配列)と連結され得る。
配列を含み得、ここで適合性とは、宿主細胞中でのベクター複製に関する。従っ
て、導入遺伝子配列は、宿主中でのベクターの複製を指示するレプリコン配列で
あり得、これは、自己複製ベクターをもたらす。あるいは、導入遺伝子配列は、
宿主細胞の複製機構に依存するベクター複製を可能にし得る。
tRNA)をコードする導入遺伝子配列に作動可能に連結され得る。例えば、導
入遺伝子は、ポリペプチド(例えば、ウイルスキャプシドタンパク質またはウイ
ルスファイバータンパク質)をコードし得る。この導入遺伝子は、基本ベクター
配列と同じかまたは異なる血清型に由来し得る。
ー)として使用され得る遺伝子産物をコードするレポーター遺伝子が含まれる。
レポーター遺伝子は、例えば、光学顕微鏡、免疫化学的アッセイ、または酵素的
アッセイによって容易に検出され得る遺伝子産物をコードし得る。好ましいレポ
ーター遺伝子は、レポーター遺伝子を発現する細胞を破壊しない非破壊的方法に
よって検出され得る遺伝子産物をコードする。
発現された場合に、宿主細胞または宿主細胞を含む組織もしくは器官もしくは生
物に、治療的利点または所望の機能を提供する。治療的利点は、宿主ゲノムにお
いて遺伝子の機能を改変すること、または治療的なタンパク質、ポリペプチド、
またはRNAによって提供されるさらなる機能から生じ得る。
、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列)である導入遺伝子配列に連結され得
る。調節エレメントは、直接的な転写または翻訳によって、遺伝子産物をコード
する導入遺伝子配列の直接的発現を指示し得る。調節エレメントは、導入遺伝子
配列の発現の量またはタイミングを調節し得る。調節エレメントは、特定の宿主
細胞または組織における導入遺伝子の発現(例えば、宿主特異的発現または組織
特異的発現)を指示し得る。
可能にする導入遺伝子配列に連結され得る。この組み込み配列は、ベクター全体
またはベクターの一部の組み込みを指示し得る。この組み込み配列は、基本ベク
ター配列に関するかもしれないし、関しないかもしれない。例えば、組み込み配
列および基本ベクター配列は、同じウイルス血清型であり得るか、または異なる
ウイルス血清型であり得る。この組み込み配列は、アデノウイルス(Ad)、ア
デノ随伴ウイルス(AAV)、またはHIV由来の逆方向反復配列(ITR)で
あり得る。
導入遺伝子配列に連結され得る。このような導入遺伝子配列は、基本ベクター配
列と同じウイルス血清型であってもよいし、そうでなくてもよい。
用され得る。
アーゼ制限部位を含み得る。
異なるウイルス(例えば、アデノウイルスおよびAAV)から組み合わせた核酸
配列を含むベクターをいう。
わち、天然には存在しない配列、または異種配列を含むそれらの天然のバックグ
ラウンドにはない配列)を含むベクターをいう。本発明において用いられるキメ
ラベクターはまた、ハイブリッドベクターであり得る。キメラベクターの例は、
改変されたファイバータンパク質をそのキャプシド上に発現するAd,AAVで
ある。
主細胞中に導入する方法をいう。本明細書中のウイルスDNAは、組換えウイル
スの形態にあり、これは、遺伝子が機能的タンパク質として発現され得るような
方法で、目的のDNAのセグメントをウイルスゲノムに連結することによって生
成される。
る方法をいう。
ーまたは形質導入された細胞に対して内因性でない状況で、核酸配列またはペプ
チド配列が配置されることをいう。例えば、ペプチド配列は、1つのタンパク質
から別のタンパク質に移入され得、生じるタンパク質は、本明細書中では、異種
タンパク質と呼ばれる。キメラファイバータンパク質(例えば、血清型5テイル
ドメインおよび血清型35シャフトおよびノブドメイン)は、Ad5ベクターに
対して「異種」であるとみなされる。この用語はまた、アデノウイルスの1つの
種または血清型からアデノウイルスの異なる種に導入された核酸(例えば、コー
ド配列)を含む。
ル、ポリアデニル化配列、および他の発現制御配列を含むことが意図される。本
発明において言及される調節エレメントには、特定の宿主細胞のみにおいて核酸
配列の発現を指示するエレメント(例えば、組織特異的調節配列)が含まれるが
、これに限定されない。
列の転写または翻訳またはその両方を制御および調節するような方法で、ポリヌ
クレオチド配列(例えば、コード配列または遺伝子)がその制御エレメントに連
結されていることを示す。調節エレメントの方向は異なり得る(例えば、右側I
TRに対して逆方向)。この用語はまた、適切な開始シグナル(例えば、ATG
)を、発現されるポリヌクレオチド配列の前に有すること、および正しいリーデ
ィングフレームを維持して、発現制御配列の制御下でポリヌクレオチド配列の発
現および所望のポリペプチドまたはタンパク質の産生を可能にすることを含む。
制御配列はまた、正確な終結を保証する3’配列(例えば、ポリアデニル化停止
シグナル)を含み得る。
シピエント細胞に機能的改変を生じるような様式で、細胞への外因性核酸のセグ
メントを導入する方法をいう。外因性核酸は、コードされたタンパク質、ポリペ
プチド、またはRNAの発現が遺伝子のエラーに起因する細胞の機能不全を修正
するか、またはより一般的には、遺伝的疾患または後天性疾患と関連する任意の
所望されない機能を相殺するという点で、代表的には治療剤である。用語「外因
性核酸」とは、処理された形質転換された細胞において通常には発現されないD
NA配列またはRNA配列をいう。この用語はまた、処理されていない形質転換
されていない細胞におけるよりもより高いか、より低いか、または他の異なるパ
ターンにある処理された形質転換された細胞において発現される、DNA配列ま
たはRNA配列をいう。この非天然の発現もまた、異種発現と呼ばれ得る。
レシピエントまたは宿主細胞中へと導入するために、使用されるベクターをいう
。この外因性核酸は、レシピエントまたは宿主細胞において、一過性発現されて
もよいし、または組み込まれて安定に発現されてもよい。
複製し、高コピー数を維持し、かつクローニングの道具として使用され得る、任
意の核酸分子をいう。
スのDNA鎖の各々をいう。図面は、DNAの平行鎖上の特定のヌクレオチドの
位置を図示する。DNAの逆行鎖は、その二本のDNA鎖のうちのもう一方をい
い、図面に示されていない。ファイバータンパク質は、DANの逆行鎖上にコー
ドされる。ベクター図を簡単にするために、その遺伝子は逆行鎖上に位置するけ
れども、そのファイバー配列を平行鎖上に示す。
免疫化学的アッセイまたは酵素学的アッセイによって容易に検出され得るポリペ
プチドまたはタンパク質をコードする、任意の核酸配列をいう。好ましいレポー
ター遺伝子は、処理した形質転換細胞または組織を破壊しない非破壊的方法によ
って検出され得る、レポーター遺伝子である。
により形質転換された細胞であると示すためにその発現が使用される、ポリペプ
チドまたはタンパク質をコードする任意の核酸フラグメントをいう。
場合に、その宿主細胞またはその宿主細胞を含む器官もしくは生物に治療上の利
益または所望の機能を提供する、機能的ポリペプチド、タンパク質またはRNA
をコードするDNAフラグメントをいう。この治療上の利益は、宿主中の天然の
遺伝子の機能の改変から生じてもよいし、またはその治療タンパク質、ポリペプ
チドまたはRNAにより提供されるさらなる機能から生じてもよい。
療遺伝子がその組織または細胞の機能を改変するように発現される、組織または
細胞をいう。
することなくなされ得ることは、生物学分野において周知である。一般的には、
保存的アミノ酸置換または類似アミノ酸の置換は、タンパク質機能に影響するこ
となく許容される。類似アミノ酸は、サイズおよび/または電荷特性が類似する
アミノ酸であり得、例えば、アスパラギン酸とグルタミン酸、およびイソロイシ
ンとバリンは、両方とも類似アミノ酸の対である。アミノ酸対間の類似性は、多
数の様式で当該分野において評価されている。例えば、Dayhoffら(19
78)Atlas of Protein Sequence and Str
ucture、第5巻、補遺3、第22章、345〜352頁(本明細書中に参
考として援用される)は、アミノ酸類似性の尺度として使用され得るアミノ酸置
換についての頻度表を提供する。Dayhoffらの頻度表は、種々の進化的に
異なる供給源由来の同じ機能を有するタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づく
。従って、本発明の配列に対する(上記のような)アミノ酸配列における明らか
な任意の変化が、すでに意図される。
、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化により異なり得る。保存的アミノ酸
置換とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性をいう。例えば、脂肪族−ヒド
ロキシル側鎖を有するアミノ酸の脂肪族を有するアミノ酸の群はセリンおよびス
レオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン酸および
グルタミン酸であり;芳香族側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チ
ロシンおよびトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸の群はリジン
、アルギニンおよびヒスチジンであり;イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は
システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群としては、
バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アル
ギニン、アラニン−バリン、アスパラギン−グルタミン、およびアスパラギン酸
−グルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明に記載
されるアミノ酸配列に対する(上記のような)「実質的に類似」の配列のポリペ
プチド置換が、すでに意図される。
示す。
ヒクルを提供する。本発明は、左側および右側のAd ITR、Adパッケージ
ング配列、調節エレメントを伴う導入遺伝子カセット、およびその導入遺伝子カ
セットに隣接する一対のカセットITR(ウイルス複製の間に予測可能なウイル
スゲノム再配置を指示し、宿主細胞ゲノムへのその導入遺伝子カセットの組み込
みを指示する)を含む第一世代アデノウイルスベクターを記載する。
s)アデノウイルスベクター(本明細書中でΔAdとも呼ばれる)の生成であり
、このベクターは、左側および右側のAd ITR、Adパッケージング配列、
カセットITRが隣接する導入遺伝子カセットを含み、そしてこの弱活力ベクタ
ーは、他の免疫原性ウイルス遺伝子すべてを欠く。
る。本発明の実施形態において、導入遺伝子カセットの組み込みは、例えば、r
ep 78タンパク質を発現するAdベクターとの同時感染により指示されて、
例えば、ヒト第19染色体上のAAVS1部位での部位特異的組み込みが達成さ
れる。
ク質を改変することによって選択された細胞へとこれらの組換えアデノウイルス
ベクターを標的化する、新規な方法を記載する。ファイバーシャフトドメインお
よびファイバーノブドメインの両方への変化は、Adベクターを所望の細胞型へ
と首尾良く再標的化することを示した。さらに、ファイバーノブドメイン中のG
−Hループが、この組換えアデノウイルスベクターの結合親和性および特異性に
影響する新規な部位として同定された。このG−Hループへのペプチド配列の置
換は、この弱活力ベクターを所望の細胞型へと再標的化する。
ノウイルスディスプレイライブラリーが作製されている。この型のライブラリー
は、所望の細胞型に結合するアデノウイルスベクターについてスクリーニングす
るためのリガンドとして使用される。ファージディスプレイライブラリーに対す
るアデノウイルスディスプレイライブラリーを使用することの1つの利点は、一
旦所望の細胞へのアデノウイルスの親和性を同定すると、標的化されたアデノウ
イルスベクターは導入遺伝子カセットを受け入れる準備ができ、かつ、例えば、
遺伝子治療における使用のために、弱活力アデノウイルスベクターを作製するた
めに使用され得る。
にする改変型ファイバータンパク質をアデノウイルスのキャプシド中に含む。従
って、本発明によると、弱活力キメラΔAd−AAVベクターが、最も一般的に
使用される遺伝子治療ウイルスベクターに通常は抵抗性である任意の細胞または
組織中に任意の導入遺伝子を導入するために作製され得る。さらに、本発明のキ
メラΔAd.AAVベクターは、アデノウイルス遺伝子を欠き、かつ導入遺伝子
カセットに隣接するAAV ITR配列を含み、このAAV ITR配列が、宿
主ゲノム中での安定な導入遺伝子組み込みを指示し、その導入遺伝子の長期発現
を可能にする。
もしくはインビボ選択用のレポーター遺伝子、選択可能な遺伝子、または治療遺
伝子のいずれかである、導入遺伝子を保有し得る。本発明の1つの実施形態にお
いて、このレポーター導入遺伝子は、β−ガラクトシダーゼであり得るが、これ
に限定はされない。多くのレポーター遺伝子が当該分野で一般的に使用されてお
り、その任意のものが、本発明のAd.AAVベクターにおける導入遺伝子とし
て保有され得る。レポーター遺伝子の他の例は、GFPおよびアルカリホスファ
ターゼである。
ットを有する本発明の第一世代Adベクターの実施形態;(b)Adベクターを
再標的化するように改変されているファイバータンパク質;および(c)キメラ
ΔAdベクター(感染および導入遺伝子組み込みについて所望の細胞型への基本
ベクターを再標的化する、キャプシド上に発現される改変型ファイバータンパク
質を含む)の生成を可能にする両方の技術の組み合わせを記載する。
のウイルス遺伝子を欠く弱活力ベクターゲノムを生じる、予測可能なゲノム再配
置を媒介し得ることが、示されている。このようなIR媒介性再配置の特定の実
施形態が、Adeno−AAV(導入遺伝子カセットに隣接するAAV逆方向末
端反復(ITR)を含む、第一世代ハイブリッドアデノウイルスベクター)であ
る。このAAV ITRは、ΔAd.IRゲノムの形成と類似するゲノム形成を
媒介する(Steinwaerderら、2000 Journal of V
irology)。すべてのウイルス遺伝子を欠くΔAdベクターは、例えば、
rAAVベクターに匹敵する効率で、培養細胞に安定に組み込みそして形質導入
する。本実施例は、サザンブロット分析によって、ΔAdベクターが宿主ゲノム
中にランダムに組み込むことを示す。
置するアデノウイルスパッケージング配列、このパッケージング配列の3’側に
位置しかつ一対のカセットITRに隣接する導入遺伝子カセット(ポリアデニル
化シグナル、導入遺伝子、および異種プロモーターを含む)を含む。複製に使用
されるアデノウイルス遺伝子(例えば、E1、E2、E3、E4)は、この右側
カセットITRの3’側に位置し、そして右側Ad ITRが、この複製遺伝子
の3’側に位置する。本発明のベクターは、以下を処置するために特に適する:
遺伝的障害、癌、および感染性疾患(例えば、HIV、塞栓、またはマラリア)
。治療可能な遺伝的疾患(例えば、血友病Aおよび血友病B;嚢胞性線維症;筋
ジストロフィー、α1−抗トリプシン障害)が、本発明のベクターにより処置さ
れ得る遺伝的疾患の理想的候補である。遺伝的障害と闘うための治療遺伝子の特
定の例は、鎌状赤血球貧血を改善するためのγ−グロビンである。
徴付けるために、本発明の実施形態は、細菌の複製起点および選択可能な遺伝子
を含む配列の付加を含む。この実施形態は、導入遺伝子カセットに付加されたS
Nori配列である。これにより、このΔAdがヒト細胞および細菌細胞におい
て発現されることが可能になり、従って、形質導入された細胞の選択、および形
質導入された哺乳動物細胞のゲノムにおける組み込み部位の特徴づけが可能にな
る。
る。本発明の1つの実施形態において、ΔAd.AAVの組み込みは、293細
胞におけるrep 78タンパク質を発現するAd AAVとの同時感染により
指示され、ヒト第19染色体上のAAVS1部位での部位特異的組み込みが達成
される。この型の部位特異的組み込みが293細胞以外の細胞において生じるた
めに、E4 ORF6発現が必要である。ΔAd.AAV、ΔAd.rep78
、およびΔAd.E4−orf6の同時感染により、ΔAd.AAV導入遺伝子
カセットの部位特異的組み込みが可能である。ΔAd.rep 78ゲノムおよ
びΔAd.E4−orf6ゲノムは、形質導入後まもなく分解され、それにより
潜在的副作用が回避される。部位特異的組み込みは、rAAVおよびΔAd.A
AVを用いて観察されるランダムな組み込みよりも、挿入性変異誘発の危険を減
少するために好ましい。
は、導入遺伝子発現のサイレンシング(またはブロッキング)と関連し得る。導
入遺伝子のサイレンシングは、その導入遺伝子カセットに絶縁(insulat
or)エレメントを付加することにより克服され得る。例えば、ニワトリグロビ
ンLCR由来のHS−4絶縁エレメントが、アデノウイルスエンハンサーから異
種プロモーターを保護するように、Adベクター中にて機能し得る。HS−4絶
縁またはDrosophila Gypsy遺伝子もまた、導入遺伝子のサイレ
ンシングを防ぐために使用され得る。
分(各々が本発明の別の組換えアデノウイルスベクターに保有される)へと分割
することである。同じ導入遺伝子の各部分は、相同な重複領域を有する。両方の
ベクター(各々が、同じ導入遺伝子の異なるが重複する部分を保有する)での感
染の後、相同組換え事象が生じて、完全な導入遺伝子の再構成が生じ、次いでそ
れが発現される。この技術は、大きなインサート(鎌状赤血球貧血を改善するた
め(またはγ−グロビン変異を矯正(correct)するため)の13kbゲ
ノムhAAT遺伝子または12kb γ−グロビン LCRγ−グロビン発現カ
セットを含むが、これらに限定されない)を収容するハイブリッドアデノウイル
スベクターを生成するために使用される。ハイブリッドΔAdベクターゲノムの
形成は、2つのベクター間の組換えの後、その導入遺伝子内の相同な重複領域が
長いほどより効率がよい。
、ΔAd.AAVベクターまたはΔAd.AAVfxベクター)を迅速に単離する
ための方法である。第一世代ベクター(Adベクター)によるΔAdの混入を最
小にするために、ストラテジーが実施例I Hに記載される。これらのアプロー
チは同じ力価のΔAdベクターを生じるが、全長ゲノムベクターによる混入がよ
り少ないことが理解される。この改良されたベクター単離は、インビボ適用後の
毒性副作用を回避するために非常に重要である。
得る。50個を越えるヒトAd血清型(異なる組織選択性または親和性を有する
改変型を含む)が存在する(付表I)。異なるAd血清型は異なる細胞レセプタ
ーに結合し、そして異なる侵入機構を使用することが、当該分野において認識さ
れる。ほとんどの組換えアデノウイルスベクターは、アデノウイルス血清型5を
基本ベクター血清型5(Ad5)として使用する(Hitt,M.M.ら、19
97、Adv.in Pharmacology 40、137〜205)。A
d5感染は、主にCARへのそのファイバータンパク質結合により媒介され、第
2に、インテグリンへのそのペントンベースタンパク質結合により媒介される。
多くの細胞型および組織型におけるCARおよび/またはインテグリン発現の欠
失に起因して、Ad5媒介性遺伝子移入は、遺伝子治療についての重要な標的で
ある多数の組織(内皮、平滑筋、皮膚、上皮、分化した気道上皮、脳組織、末梢
血細胞、または骨髄)において効率的でない。以下は、ファイバータンパク質配
列を改変することの結果として、感染性および親和性の変化を有する、本発明の
Ad5ベクターを記載する。
よって、Ad5およびAd3が内皮細胞またはリンパ系細胞に感染および標的化
するために特に適切であることが明らかになったが、Ad9、Ad11およびA
d35は、ヒト骨髄細胞に効率的に感染した。従って、Ad9、Ad11および
Ad35のファイバータンパク質のノブドメインは、Ad5ベクターをヒト骨髄
細胞へと再標的化するための優秀な候補である。他の可能な血清型としては、A
d7が挙げられる。
ーノブドメインは、別のAd血清型ファイバーノブドメインで置換されている。
本発明の1つの実施形態は、改変型Ad5/35ファイバータンパク質(Ad5
のファイバーテイルドメイン、ならびにAd35のファイバーシャフトドメイン
およびノブドメインを含む、改変型ファイバータンパク質を発現する組換えAd
5ベクター)である。このAd5/35キメラファイバータンパク質は、CD3
4+細胞のサブセット(幹細胞活性を有するものを含む)に対する比較的広いス
ペクトルの感染を示す。このAd5/11キメラファイバータンパク質(Ad5
のファイバーテイルドメイン、ならびにAd11のファイバーシャフトドメイン
およびノブドメインを含む、改変型ファイバータンパク質を発現する組換えAd
5ベクター)は、類似の親和性を示した。
イバーノブドメインの両方を改変して短縮型ファイバータンパク質を作製する付
加的利点を記載する。ファイバーシャフトドメインの長さは、宿主細胞へのウイ
ルスベクター侵入に使用される宿主レセプターにおいて重要な役割を果たす。こ
れを示すために、Ad5改変体、Ad5/9改変体およびAd5/35改変体を
、長シャフト(22β−シート)ファイバーおよび短シャフト(7β−シート)
ファイバーを用いて構築した。これらの分析は、Ad5、Ad5/9についてC
ARを主要レセプターとして含む効率的ウイルス感染が長シャフトファイバータ
ンパク質を必要とするが、一方、Ad5/35(未だ特徴付けられていない非C
ARレセプターに結合する)の細胞侵入ストラテジーがシャフトの長さに依存し
ないことを示した(図3)。ファイバーシャフトドメインの長さ(5>10個の
間のβ−シート)およびファイバーノブドメイン(基本ベクターと異なるAd血
清型由来)の両方のおける改変が、Adベクター親和性を改変する新規なモデル
である。
ン内の特定の結合領域(G−Hループ)が、結合親和性および特異性を改善する
ことが、本明細書中で新たに同定された。この領域内での改変は、Adベクター
を所望の細胞型へ再方向付けする。例えば、本発明は、ファイバータンパク質ノ
ブドメイン内のG−Hループ配列を記載し、この配列は、そのベクターの結合親
和性および特異性を変更する同時に、Adファイバーノブドメインの機能的に重
要な3次構造に影響しないで、異種ペプチドリガンド配列で置換され得る(図6
、7)。このG−Hループ領域は、ノブ表面の中心部分に曝露され、そしてノブ
のC末端の末梢のH−Iループよりも異種リガンドの取り込みのための戦略上良
い部位であり得る(Krasnykh,V.ら、1998、J.Virol.7
2;1844〜62)(ノブのC末端は、他者により使用されている置換部位)
(Michael,S.I.ら、1995、Gene Ther.2:660〜
8、Wickham,T.J.ら、1996、Nat.Biotechnol.
14:1570〜3)。従って、ファイバーノブドメイン内のこれらのG−Hル
ープ改変は、Adベクターが所望の細胞型に感染するように再方向付けされるの
を可能にするが、それはこのG−Hループリガンド配列が所望の細胞型上の少な
くとも1つの表面タンパク質に結合する限りにおいてである。図7は、いくつか
の可能な置換を示す。実施例II Jは、ビリオンが、ノブ表面上の曝露を可能
にする制限された二次構造を有する環状ペプチド(12アミノ酸)の挿入を許容
することを示す。規定されたリガンド(RGD)は、CARおよびインテグリン
親和性のために除去されるAd5キャプシドのG−HループおよびH−Iループ
に挿入され得る。感染性研究は、この新規な挿入部位の潜在的利点を示す。
な目的は、遺伝子治療ベクターを肝臓に標的化することである。多くの方の変異
体タンパク質を遺伝的に矯正するために、肝細胞は、矯正された導入遺伝子を保
有する遺伝子治療ベクターに感染される必要がある。実施例II Jは、ファイ
バータンパク質のノブドメイン中のG−Hループを、短シャフトファイバータン
パク質中の(マラリアCS表面タンパク質の)RIおよびRII+の両方により
置換すること(これにより、このベクターは肝細胞に対する親和性および特異性
を有するように指示される)を記載する。
的化するペプチドを用いて、G−Hループ領域中でファイバーノブドメインを改
変する類似のプロトコルを適用する。本発明に記載されるベクターを再方向付け
するこれらの新規なアプローチは、より低用量の遺伝子治療ベクターが投与され
、より安全性プロフィールが高いことを可能にする。
ラリーを提示するためにファイバーノブタンパク質を使用する、アデノウイルス
ディスプレイライブラリーを調製するためのプロトコルが記載される。改変型フ
ァイバータンパク質を有するこのアデノウイルスライブラリーは、所望の細胞型
についての親和性および特異性についてスクリーニングされる。このアデノウイ
ルスディスプレイライブラリーを、所望の細胞型への結合を可能にする標的ペプ
チドについてスクリーニングするために使用することの、ファージディスプレイ
ライブラリー系を超える2つの大きな利点が存在する。第1に、一旦、その所望
の細胞型に結合するリガンドペプチドが同定されると、それはすでに、遺伝子治
療送達のための選り抜きのベクターである。そのペプチドは、ファージディスプ
レイライブアリーベクターについての場合必要であるように、別ベクター中に操
作される必要がない。これは、所望の細胞型について標的化されたファイバータ
ンパク質を同定するために必要な工程を減らす。この方法の第2の利点は、その
アデノウイルスが、そのキャプシド上に改変型ファイバータンパク質の複数のコ
ピーを提示し得る点である。これにより、宿主細胞レセプターとのファイバータ
ンパク質の二量体化および三量体化が可能である。ファイバータンパク質の多量
体化は、宿主細胞レセプターとの三量体ファイバータンパク質の現実的インビボ
相互作用である。対照的に、ファージベクターは、その表面上に1つのファイバ
ーペプチド配列しか提示し得ず、このことは、宿主細胞表面レセプターとの相互
作用能力を有意に限定する。
よびAd.fx。ここでfxは、改変されたファイバータンパク質(fiber
protein)を示す。血清型5の第一世代アデノウイルスベクターは、異
種ITRに隣接する導入遺伝子カセットを保有する基本ベクター(base v
ector)である。これらの特定の逆方向の末端反復配列(例えば、AAV
ITR)は、導入遺伝子カセットの宿主ゲノムへの安定な組み込みを方向付け、
そしてウイルス複製の間に生じる推定可能なゲノム再配置を制御する。このベク
ターはまた、(実施例IIに記載の)改変されたファイバー遺伝子を保有する。
複製の間に、推定可能なゲノム再配置が起こり、キャプシド上に改変されたファ
イバータンパク質を発現する弱活力(gutless)アデノウイルスベクター
(例えば、ΔAd.AAVfx)の生成を生じる。この改変されたファイバータン
パク質は、弱活力ベクターを選択された細胞型に標的化することを可能にする。
標的化されたベクターは、宿主細胞に導入遺伝子を組み込み得るアデノウイルス
遺伝子が全くない弱活力アデノウイルスベクターである。この導入遺伝子カセッ
トは、レポーター遺伝子、選択可能な遺伝子または治療遺伝子を保有し得る。
クトシダーゼのレポーター遺伝子を含む(ΔAd.AAVfx-BG)。ハイブリ
ッドAdベクターで形質導入されたヒトおよび細菌細胞のインビトロ選択を容易
にするために、複製起点のための細菌の配列がハイブリッドAdベクターに付加
され得る。この一例は、ΔAd.AAVfx−Snoriである。ΔAd.AAV fx −SnoriにおいてSNori配列は、導入遺伝子カセットに付加されてい
る。この部位は、ΔAd.AAVfx−Snoriに感染した細胞に対するG41
8選択を可能にする。このインビトロ選択は、導入遺伝子組み込みの部位および
隣接する染色体領域を分析するためのツールを提供する。蛍光インサイチュハイ
ブリダイゼーション(FISH)は、ベクター組み込みを確認するするための別
の方法である。
の収容能力より有意に大きな、例えば、22kbまでの大きな導入遺伝子カセッ
トの効率的かつ安定な組み込みである。これは、遺伝子治療には特に興味深い。
例えば、鎌状赤血球貧血を改善するために、ΔAd.AAVfx-γグロビン(標
的化し、そして組み込むγグロビン遺伝子を有する導入遺伝子カセット)は、γ
グロビン遺伝子の長期間発現のために骨髄幹細胞に挿入され得る。
S1部位に導入遺伝子を組み込むために使用する(実施例1Dに記載)。しかし
、これは、導入遺伝子発現をサイレントにし得る。組み込まれた導入遺伝子が宿
主細胞ゲノムエレメント(例えば、位置的効果または下流のエンハンサー)によ
りサイレントにされることを防止するために、LCRまたは絶縁エレメント(i
nsulator element)が導入遺伝子カセットに組み込まれる。
て使用する際に当業者の補助となる。この実施例は、本発明の範囲を制限すると
は如何様にも意図されない。
ターの組み込み) rAAVを用いたインビトロおよびインビボ研究により、rAAV組み込みに
必要な要件はAAV ITRのみであり、未だに知られていない宿主細胞因子で
あることが示される。AAV ITRに存在する特定の配列または二次構造が宿
主染色体DNAに組み込まれやすいと考えられる。アデノウイルスベクター(高
力価、高い感染性、大きな収容能力)の利点およびAAV ITRの組み込み能
力を組合わせるために、AAV ITRが隣接したAAVベクターDNAを、分
泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ(SEAP)とカセットにし、ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ(neo)レポーター遺伝子カセット(Alexa
nder,I.E.ら,1996.Gene Therapy,7,841−8
50)をE1/E3欠失アデノウイルスベクター(Ad.AAV1)のE1領域
に組み込む(図1の上部)。
カセットを、プラスミドpALSAPSN(Alexander,I.E.ら,
1996.Human Gene Therapy,7,841−50)のAs
eI/ScaI消化により得る。4.4kb AAVベクターフラグメントを、
NotIアダプターリンカーを介してpXJCL1(Mirobix,Tron
to,Canada)にクローニングする(pAd.AAV1)。AAV IT
Rを欠いた別のシャトルベクター(pAd.AAV1−Δ2ITR)を、pAL
SAPSNの3.7kb AflII/BsmIフラグメントをpXJCL1に
挿入することにより生成する。pAd.AAV1Δ1ITRに関しては、A領域
とA’領域との間の左側のAAV ITRにおける自発的欠失が生じた構築物を
用いる。第2のハイブリッドベクター(Ad.AAV2)を作製するために、E
.Rutledgeにより開発されたAAVSNoriカセットを用いる。AA
VベクターDNAを、3.4kb BsaI/ScaIフラグメントとしてpA
SNoriから得て(Rutledge,E.A,Russell,D.W.,
1997,Journal of Virology 71:8429−843
6)、そしてpXJCL1のEcoRV部位に挿入する。AAVベクタープラス
ミドに関して一般に公知であるように、AAV ITRは、再配置されやすい。
これらの機能的に重要な領域の欠失を最小限にするために、ハイブリッドベクタ
ーの生成に関する全ての構築物を、低コピー数プラスミド中に組み立てる。この
低コピー数プラスミドは、E.coli Top10、JC811、またはXL
1 Blue細胞(Stratagene,La Jolla,Calif.)
中で増殖される。さらに、各クローニング工程または大規模プラスミド増殖の後
、両方のAAV ITRを、ITR内部またはITRの隣接を切断する酵素を用
いた制限分析により注意深くマッピングする(BssHII、AhdI、Sma
I、BglI、BsmI、AflIIおよびScaI)。
スを、先に記載されたように(Lieber,A.ら、1996、J.of V
irology,70,8782−8791)、pΔE1aSpla由来または
pXJCL1由来のシャトルプラスミドとpJM17(Microbix)との
293細胞中での組換えにより生成する。各ウイルスについては、少なくとも2
0のプラークを拾い、増幅し、そして制限消化により分析する。2つのAAV
ITDRを含むウイルスは、他のアデノウイルス配列と、または293細胞ゲノ
ムに存在するアデノウイルス配列とITR内で再配置する傾向がある。インタク
トなITRを有するウイルスに由来するプラークのみが増幅され、CsClでバ
ンド形成され、そして先に記載のように力価測定される(Kay,M.A.ら、
1995,Hepatology 21:815−819;Lieber,A.
ら,1996,Journal of Virology 70:8944−8
960)。試験した全てのウイルス調製物は、RCAおよび細菌のエンドトキシ
ンに関して陰性であった(Lieber,A.ら,1997,Journal
of Virology 71:8798−8807)。ウイルスを、10mM
Tris−HCl(pH7.5)−1mM MgCl2−10%グリセロール
中で−80℃で保存する。
)でAd.AAV1に感染させ、そして感染させて40時間後に採取する。4回
の凍結/融解サイクルにより細胞をPBS中で溶解する。溶解物を遠心分離して
細胞細片を除去し、そして10mM MgCl2の存在下で500ユニット/m
lのDNaseAおよび200μg/mlのRNaseAを用いて37℃で30
分間消化する。5mlの溶解物をCsCl段階勾配(0.5ml−1.5g/c
m3、2.5ml−1.35g/cm3、4ml−1.25g/cm3)の上に重
層し、そして35,000rpmで2時間超遠心する(ローターSW41)。管
を穿刺することによりCsCl画分を回収し、そしてウイルスDNAについて分
析するか(Lieber,A.ら,1996,Journal of Viro
logy 70:8944−8960;Steinwaerder,D.S.ら
、1999.J Virol 73:9303−13)、または1.32g/c
m3 CsClを有する平衡勾配中で18時間、35,000rpmの超遠心に
供する。欠失したウイルスΔAd.AAVを含有するバンドを、全長Ad.AA
Vゲノムを含有する他のバンド形成されたウイルス粒子から明らかに分離する(
0.5cmの距離)。ΔAd.AAV1画分を10mM Tris−HCl(p
H7.5)−1mM MgCl2−10% グリセロールに対して透析し、そし
て−80℃で保存する。ΔAd.AAV1調製物のゲノム力価を、先に示したプ
ロトコル(Lieber,A.ら,1996,J.of Virology,7
0,8782−8791)に従ってpALSAPSNの4.4kb AseI/
ScaIフラグメントの種々の濃度と比較して、ウイルス粒子から精製したウイ
ルスDNAの定量的サザン分析に基づいて決定する。合計で、1×103ゲノム
粒子のΔAd.AAV1の生成には、3時間未満の実際の作業しか必要としない
。
ゲノムが1つのキャプシドにつきパッケージングされると仮定すると、ゲノム力
価は、粒子力価に等しい。Ad.AAV1を含有するレベルは、サザン分析によ
り決定された場合に0.1%未満である。これは、293細胞に対するプラーク
アッセイにより得られた結果と一致する(106の全ゲノムにつき5つのプラー
ク未満)。左側および右側のITRベクター接合部を配列決定するために使用し
たプライマーは、以下のとおりである: 5’GGCGTTACTTAAGCTAGAGCTTATCTG(配列番号1)
および 5’CTCTCTAGTTCTAGCCTCGATCTCAC(配列番号2)。
PSN[Alexander,I.E.ら、1996、Human Genom
e Therapy,7:481−50])を含む組換えAAVウイルスストッ
クをDusty Miller(FHCRC,Seatlle)から得た。この
ストックは夾雑する複製コンピテントAAV(50粒子/ml未満)および野生
型アデノウイルス(100粒子/ml未満)を含まない。このウイルスストック
のゲノム力価をRussellら(Russell,D.ら、1994 Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 91:8915−8919)により
記載された定量的サザンブロットにより得た。
されたように(Lieber,A.ら,1996,Journal of Vi
rology 70:8944−8960)、CsCl精製ビリオンをグルタル
アルデヒドで固定し、そして酢酸ウラニルを用いて染色する。
ゲノム(ΔAd.AAV1)を効率的に生成し、そしてアデノウイルス(Ad5
)キャプシドにパッケージングする。ΔAd.AAV1ゲノムは、左側のアデノ
ウイルスITRおよびパッケージングシグナル、続いてAAV−ベクターカセッ
ト、ならびに2つのアデノウイルスパッケージングシグナルおよびITRを逆配
向で含む(図1、下部)。ハイブリッドベクターは、全てのウイルス遺伝子を欠
き、従って、毒性効果および細胞免疫応答の誘発が排除される。小さなハイブリ
ッドベクターゲノムΔAd.AAV1の自発的生成は、2つのインタクトなAA
V ITRの存在を必要とし、そして部分的に欠失したITRに対しても、発現
カセットに隣接するオリゴ−dCおよびオリゴ−dGストレッチに対しても生じ
ない。
るために、Ad.AAV1中のSEAP/neo発現ユニットをE.coli
β−ガラクトシダーゼ遺伝子により置換する。このハイブリッドベクターをΔA
d.AAV1と名付ける。対応するプラスミド構築物の生成の間に、AAV I
TR配列は、再配置され、そしてそれらの機能的特性が破壊される傾向にある。
この問題は、全ての組換えタンパク質が欠失した細菌株(例えば、JC811)
で増殖させたクローニングベクターとして低コピー数のプラスミドを用いること
により回避され得る。さらに、各クローニング工程後に両方のAAV ITRが
インタクトであることを、特徴的なエンドヌクレアーゼ消化について試験し得る
。最近、別のハイブリッドベクターΔAd.AAV1Noriを生成した。これ
は、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーターならびにヒト細胞およ
び細菌細胞での発現のためのトランスポゾン5(Tn5)プロモーター両方の制
御下のneo遺伝子、ならびにpr15A細菌複製起点(リーディング鎖DNA
合成の方向は、neo遺伝子転写の方向と反対である)を含む。従って、SNo
riは、真核生物細胞中の組み込まれたベクターのG418選択ならびに組み込
み後の隣接宿主DNAとともにベクターのレスキューのために使用される。レト
ロウイルスプラスミドを、細菌複製起点およびneo遺伝子に起因して、カナマ
イシンでの選択下でE.coliにおいて増殖し得る。SNori含有ベクター
は、G418耐性コロニーの数に基づいて、全組み込み事象の迅速な予測を可能
にする。さらに、隣接する染色体DNAをともに有するベクターDNAを、単一
のG418クローン由来のプラスミドとしてレスキューし得、そして組み込み接
合部を決定するための配列決定を行うために使用し得る。両方のハイブリッドベ
クターを、約3×1012ゲノム/mlの力価で生成する。ゲノム力価 対 ΔA
d.AAVBGについての形質導入粒子の比は、β−Gal発現に基づくと、約
200:1である。
.AAV1形成の別のあり得る機構は、アデノウイルスがそのゲノムを複製する
ことによる独特の機構に基づいている(van der Vliet.B,19
95,w.Doerflerら(編)、第2巻、1〜31頁,Springer
−Verlag,Berlin)(図1を参照のこと)。Ad DNA複製を、
直鎖状ゲノムの両方の末端にあるITR内の特異的部位に結合し、そしてAd
polとの複合体で5’CTP(娘鎖の第1のヌクレオチド)の結合を触媒する
TP/pTP(末端タンパク質)により開始する。DNA合成はゲノムの他方の
末端に対して連続的な様式で進む(図1A)。DNA鎖のわずか1つが鋳型とし
て働く。複製産物のうちの1つは単鎖DNAであり、この単鎖DNAは、その自
己相補的ITRのアニーリングにより環状化する。得られた二重鎖の「取っ手(
panhandle)」は、二重鎖ウイルスゲノムの末端と同じ構造を有し、こ
の二重鎖ウイルスゲノムは、pTPの結合および鋳型として単鎖「取っ手」分子
を使用した相補鎖の合成の開始を可能にする(図1C)。Ad.AAV1の場合
、Ad polは、左側のAd ITRから開始して第2のAAV ITRに達
するまでアデノウイルスの単鎖を合成する。第2のAAV ITRの合成の間に
、特定の割合の単鎖分子が、早く複製された第1のAAV ITR内の相補領域
にハイブリダイズするループを形成し、このことにより、Ad polが左側の
ITRに戻って読むために同じウイルスDNA鎖を用いることを可能にする(図
1B)。得られた「取っ手」構造は、図1Cに示される全長中間体(Adビリオ
ンにパッケージングされ得る上記の構造を有する直鎖状分子)と同様の様式で分
離(resolved)されて、二重鎖を生成し得る。ウイルスDNA 対 精
製ΔAd.AAV1粒子中のタンパク質濃度の比は、Ad.AAV1粒子から得
られた比と匹敵する。このことは、サイズがより小さいにも拘わらず、わずか1
つのΔAd.AAV1ゲノムがパッケージングされ、わずかに上昇した密度(約
1.32g/cm3)を有する粒子を生じることを示す。電子顕微鏡により、Δ
Ad.AAV1粒子の二十面体形状が実証される(図2)。酢酸ウラニルで染色
すると、中心のウイルスコアの電子が濃く現れる。わずか1つの5.5kb ゲ
ノムが1つのキャプシドにつきパッケージングされたΔAd.AAVは、予測さ
れるように斑点状の明るい濃い染色のみを有する。
に、レポーター遺伝子カセットに隣接する2つのインタクトなAAV ITRの
存在は、ΔAd.AAVゲノムの効率的な形成に必要である。このプロセスは、
部分的に欠失したITRに対しても発現カセットに隣接するオリゴ−dCおよび
オリゴ−dGストレッチに対しても生じない。さらに、インビトロでの形質導入
研究を、種々のゲノム力価のΔAd.AAV1、Ad.AAV1およびAd.A
AV−Δ2ITR(2つのAAV ITRが欠如している)を用いて行う。これ
により、選択の4週間後に形成されたG418耐性コロニーの数を決定する(表
1)。
き104を超えるゲノムが生成された))かつ高純度で慣用的に生成する(組換
えアデノウイルスの増幅および精製に通常使用される技術により、0.1%未満
が全長Ad.AAV1ゲノムを含有する)。
ビトロ形質導入研究) ハイブリッドベクターが、鎌状細胞治療について標的化されねばならない細胞
型に対して遺伝子移入を可能にするか否かを試験するために、固定化末梢血およ
びヒト赤白血病細胞株K562から得られたCD34+富化骨髄細胞(εおよび
γグロビン遺伝子を発現する)を用いて、感染/形質導入研究を行う。
ンタイプカルチャーコレクション,Rockville,MD)[Heffel
finger,S.C.ら,1992,In vitro Cell Dev.
Biol.28A,136−142]を、高濃度グルコースのダルベッコ改変イ
ーグル培地(10%ウシ胎仔血清含有)において増殖させる。SKHep1細胞
を、プローブとしてpAAV/Ad(Samulski,R.J.ら、1989
,Journal of Virology 63:3822−3928)から
得られたAAV1野生型ゲノム(David Russell,Univers
ity of Washingtonからの贈与)を用いて、ゲノムDNAのサ
ザン分析により、組み込まれたAAVプロウイルスについて分析する。未消化の
SKHep1ゲノムDNAにも、HindIIIで消化した後のSKHep1ゲ
ノムにも特異的バンドは検出されない。ウイルス感染については、コンフルエン
トな細胞を、種々のウイルス用量で2時間インキュベートし、次いで、徹底的に
洗浄する。G418選択のために、ΔAd.AAV1で感染させて24時間後、
SKHep1細胞をトリプシン処理し、そしてG418の選択下で種々の希釈率
でプレートする(900μg/mlの活性化合物、Boehringer−Ma
nnheim,Gemany)。G418含有培養培地を3日ごとに交換する。
104を超える細胞を含有するコロニー数を選択の4週間後に計数し、そして最
初に播種した細胞数に分ける。この割合を用いて、ΔAd.AAV1の組み込み
頻度を表す。単一のコロニーを、96ウェルプレート中、感染した細胞の限界希
釈により得る。コロニーを、G418の存在下で1×106細胞に拡大させる。
感染3日後にSKHep1細胞において発現されたアデノウイルスタンパク質の
免疫蛍光分析を、先に記載したように行う[Lieber,A.ら、1996,
J.of Virology,70,8782−8791]。
の複製の間、小さなΔAd.AAVゲノムが自発的に形成し、そしてアデノウイ
ルスキャプシドにパッケージングされる。感染して36時間後に細胞を回収し、
そしてウイルスを数サイクルの凍結/融解により放出させる。次いで、細胞溶解
物中のAd.AAV1およびΔAd.AAV粒子の混合物を、CsCl段階勾配
の超遠心により分離する。そのより軽い浮遊性の密度に起因して、ΔAd.AA
V1粒子を含有するバンドは、全長ウイルスを含むバンドから明らかに分離され
る(0.8cmの距離)(Lieber,A.ら、1999.J Virol
73:9314−24)。ΔAd.AAV1をさらなるCsCl平衡勾配により
さらに精製し、そして10mM Tris(pH7.5)、10%グリセロール
、1mM MgCl2中、−80℃で保存する。合計で、2×1013(ゲノム)
粒子のAd.AAV1の生成には3時間未満の作業しか必要としない。ΔAd.
AAV1複製および粒子形成のための全ての機能を、同じ細胞において増幅され
たAd.AAV1ゲノムから提供する。ゲノム/細胞ベースに対して測定された
ベクター生成の効率は、AAV生成のための労働集約的なより新たな技術に匹敵
するか、またはこの技術より高いが、これは信頼性があるとは未だ証明されてい
ない。ΔAd.AAV1についての形質導入/ゲノム力価の予測された比は、1
:200である(感染して3日後のSEAP発現に基づく)。それに対して、平
均のrAAV調製物に関しては、1:103〜1:104の範囲である。1×10 5 のコンフルエントなSKHep1細胞を、100mlの容量で、種々のMOI
のrAAV1(ストック:1×1010ゲノム/ml)、ΔAd.AAV1(スト
ック:5×1012ゲノム/ml)、Ad.ADAV1(ストック:1×1013ゲ
ノム/ml)およびAdAAV1.2ITR(ストック:9×1012ゲノム/m
l)で感染させ、感染させて24時間後に、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、
そして種々の希釈倍率でプレートする。G418を、プレートしてから24時間
後に添加し、そして4週間にわたり選択を行う。G418耐性コロニーは、>5
×104細胞の平均で含まれる(少なくとも16回の細胞分裂)。有意な数の小
さなコロニー(感染して2週間後に視覚化可能)は、おそらく、エピソームベク
ター発現に起因して、連続した選択に生き残れない。1×104より大きなMO
Iで第一世代のアデノウイルスに感染した細胞は、選択の1週目の間にCPEを
発生する。rAAV力価は、104より大きなMOIを用いた感染研究を行うに
は十分高くない。コロニー形成を、選択のために最初に播種した細胞数に対する
選択後のコロニー数の割合として表す(表1)。 (表1)
細胞)で感染させる) 感染の3日後に、生存細胞の総数(トリパンブルー染色に基づく)および感染
された細胞のパーセンテージ(X−Gal染色に基づく)を、全てのMOIにつ
いて測定した。結果を、図4Aに示す。
のMOIでインキュベートし、そしてG418選択の4週間後に形成したコロニ
ーを、96ウェルプレート中で計数する。G418耐性コロニーは、平均>5×
104細胞上に含まれ、これは、元々の細胞が、少なくとも16回の細胞分裂を
起こしたことを意味する。
感染研究) CD34+に対する細胞感染は、K562細胞について記載したのと同様であ
る。CD34+細胞を、20%FCS、キットリガンド(幹細胞因子−SCF)
(100ng/ml)、IL−3(100ng/ml)を補充したIMDM中で
培養する。多くの報告が、幹細胞分化を誘導する特定のサイトカイン(GM−C
SFまたはM−CSFのような)がインテグリン発現を刺激し得、そして従って
、Ad5ベクターのインターナリゼーションに影響し得るということを示唆する
ので、GM−CSF(50ng/ml)またはM−CSF(50U/ml)で前
刺激するかまたは前刺激せずに培養したCD34+細胞について、Ad5ベース
のハイブリッドベクターを用いて感染率を比較する。感染された細胞数を、感染
の3日後にX−Gal染色に基づいて計数する。用量依存性の毒性について試験
するために、感染後3日目に生存細胞を計数する(トリパンブルー排除に基づい
て)。さらに、高いウイルス用量が、IL−3およびSCFの存在下でのメチル
セルロースコロニーアッセイにおける、CD34+細胞が分化する能力に影響す
るか否かを、分析する。これらの結果を、生存細胞/X−Gal陽性細胞 対
MOIとして表す(図4Bを参照のこと)。
細胞株を安定に形質導入するが、より大きいMOIのΔAd.AAV1を使用す
ることによって、形質導入率を100%にまでスケールアップし得、このΔAd
.AAV1は、rAAV1よりも高い力価で生成されることを実証する。第一世
代のベクターであるAd.AAV1での感染とは対照的に、ΔAd.AAV1で
の感染は、用量依存性の細胞傷害性に関連しない。なぜなら、ウイルスタンパク
質は、形質導入された細胞においてこれらのベクターから発現されないからであ
る。さらに、次のΔAd.AAV1粒子中に存在するウイルスタンパク質は、こ
の使用する用量範囲では問題にならない。AAV ITRを欠失するベクターA
d.AAV1−Δ2ITRとのΔAd.AAV1/Ad.AAV1の形質導入率
の比較は、この2つのインタクトなAAV ITRの存在が、ハイブリッドベク
ターの組み込みに重要であるという仮説を支持する。
I 2×105ゲノム/細胞でのAd5ベースハイブリッドベクターで、約90
%の効率で感染され得ることを実証する。しかし、この用量は、HeLa細胞、
肝癌(hepastoma)細胞、初代血液細胞およびAd5ベクター感染につ
いて許容性であると一般に考えられている他の細胞株を100%感染するのに必
要とされる用量よりも、依然約100倍高い。
におけるウイルスDNAは、7回の細胞分裂後に損失されるはずなので、観察し
たコロニーにおけるG418耐性細胞の存在は、ΔAd.AAVSNoriゲノ
ムが、この宿主ゲノム内に組み込まれるか、または安定に会合されることを示唆
する。G418耐性コロニー数に基づいて、25,000個のΔAd.AAVS
Noriゲノム中で1個のゲノムが、K562細胞に安定に組み込まれる。この
ことは、SK Hep1細胞において、ΔAd.AAV1を用いて先に得られた
結果と一致する。
/M−CSFに関係なく、約10%の細胞のみのX−Gal染色を生じる。これ
は、Ad5がCD34+細胞を感染する能力の明らかな欠失を実証し、これはお
そらく、細胞表面上の特定のレセプターおよび/またはインテグリンの非存在に
よって引き起こされる。CD34+細胞は、細胞生存性および総細胞数に明らか
な影響を伴うことなく、広範囲のウイルス用量(1〜107)に耐性である。こ
れは、驚くべくことではない。なぜなら、毒性副作用を発生するためには、アデ
ノウイルスは、細胞に侵入し、そしてウイルス遺伝子を発現しなければならない
からである。ハイブリッドベクターは、5×1012ゲノム/mlの力価で生成さ
れ得る。従って、(104細胞の)感染に使用され得る最大のMOIは、約5×
108(100μl保存緩衝液中)である。ΔAd.AAVBGでの感染研究に
基づいて、この用量は、CD34+細胞を効率的に形質導入するため、および適
切な数のG418耐性コロニーを得るために十分でないかもしれない。
ー取り込みをインサイチュで調査する。形質導入研究のために、コンフルエント
なSKHep1細胞(ヒト内皮細胞株)を、2000ゲノム/細胞のΔAd.A
AV1またはAd.AAV1で感染させる。BrdUタグ化ウイルスDNAは、
両方のウイルスについて、感染後3時間で100%の核において検出され、これ
は、ハイブリッドウイルスDNAの効率的な細胞および核の取り込みを示す。
/細胞のMOIでの感染後、それぞれ17%または58%の効率で、G418耐
性コロニーをインビトロで形成する細胞を形質導入する。約2×104ΔAd.
AAV1ゲノムが、1つの安定なトランスフェクタントを生じるために必要とさ
れる。全ての安定なコロニーは、組み込まれたΔAd.AAVベクターDNAを
含むので、この数は、SKHep1細胞におけるΔAd.AAV1の最小の組み
込み頻度を反映し、これは、rAAVでの組み込み頻度に匹敵する(Rutle
dge,E.A.ら、1997,Journal of Virology,7
1:8429−36)。G418耐性コロニーの数は、組み込み事象の総頻度を
必ずしも表さない。なぜなら、染色体での位置の影響または不完全な組み込みに
起因して、必ずしも全ての組み込まれたコピーが、ネオマイシンホスホトランス
フェラーゼを発現するとは限らないからである。
イルス遺伝子産物の非存在は、主要後期タンパク質(ヘキソン、ファイバー)お
よび初期タンパク質(DBP、E4−orf6)に対する抗体での免疫蛍光によ
って実証される。発現されるアデノウイルスタンパク質は、Ad.AAV1を感
染させた細胞においてのみ検出される。ΔAd.AAV1のみを感染させた細胞
が潜在的な細胞傷害性アデノウイルスタンパク質を発現しないというという事実
は、重要である。
染後3日目にSKHep1細胞において細胞変性効果を誘導するが、SKHep
1細胞を、1×108ゲノム/細胞までの用量でΔAd.AAV1を感染させる
場合には、毒性副作用は観察されない。形質導入効率は、明らかに用量依存性で
あるので、ΔAd.AAV1(>5×1012ゲノム/mlの力価で生成され得る
)は、関連する毒性を伴うことなく100%の効率で、Ad5許容性の細胞株ま
たは組織を安定に形質導入し得る。
胞ゲノム内にヘッド−テイル直列反復としてランダムに組み込まれることを示す
が、この染色体DNAとのもう一方の接合は可変性であり、この導入遺伝子カセ
ット内のどこかで生じる。ΔAd.AAV1 DNAの組み込まれた状態を確認
するために、高分子量染色体DNAを、パルスフィールドゲル電気泳動(PFG
E)によって分離し、その後、SEAP特異的プローブを用いてサザン分析を行
う(図3)。コントロールSKHep1細胞由来の未消化DNAは、ウェルの直
ぐ下にある染色体DNAと共に移動する内因性のSEAPシグナルを与える(レ
ーン1および5)。高分子量のエピソーム形態のΔAd.AAV1 DNAは、
全く検出されないが、別の35kbのバンドが、第一世代のアデノウイルスAd
.AAV1での感染後3日目に単離したSKHep1細胞由来のDNAにおいて
現れる(レーン4および13)。EcoRIでの消化は、4.4kbフラグメン
トを示し、このフラグメントは、AAVカセットの組み込まれた直列コピーに特
異的である(レーン8および12)。染色体DNAがウェル中に捕捉されている
可能性を排除するために、DNAサンプルを、それぞれ11bpまたは9bpを
超える配列特異性を有する、イントロンコード(intron−encoded
)エンドヌクレアーゼPI−SceIまたはI−CeuI(Gibco−BRL
,Grand Island,NY)で消化する。PI−SceIでの消化は、
SKHep1細胞において>2mbの内因性SEAPシグナル(レーン2)、お
よびΔAd.AAV1で形質導入したG418耐性コロニーにおいて約1mbの
範囲にあるさらなるシグナル(レーン7)を生じる。I−CeuI消化は、ΔA
d.AAV1形質導入SKHep1細胞において250〜1000kbの間にス
メアを生じるが(レーン10、11)(これは、ランダムな組み込みを示す)、
内因性SEAP遺伝子に特異的な高分子量バンドが、コントロールSKHep1
細胞において観察される(レーン9)。
入後1日目で、BrdU標識ベクターゲノムが、85%の肝細胞において検出さ
れ得る(Lieber,A.ら、1999.J.Virol 73:9314−
24)。注入後2ヶ月で行った肝細胞DNA分析は、ΔAd.AAV1 DNA
が、マウスゲノム中に平均0.5コピー/細胞で組み込まれていることを示す(
Lieber,A.ら、1999.J.Virol 73:9314−24)。
門脈内ΔAd.AAV1注入の潜在的な副作用を評価するために、血清グルタミ
ン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(SGPT)(肝細胞損傷についての高感度
マーカー)を、肝臓切片の組織学的分析と共に、注入後7日間連続で測定する。
1×1012または1×1013のΔAd.AAV1ゲノムの門脈内注入後に、SG
PTレベルの有意な上昇も、組織学的異常も、全く検出されず、対して、同じ用
量の全長Ad.AAV1ベクターは、重篤な肝細胞傷害性または致命的結果に関
連する。このことは、マウスに投与するΔAd.AAV1の用量を増加させて、
第一世代のアデノウイルスでは可能でなかった、有害な副作用を伴わないインビ
ボでのより高い形質導入効率を獲得し得ることを示唆する。重要なことに、ΔA
d.AAV1は、インビボで静止肝細胞を形質導入し、これは、ハイブリッドベ
クターDNAの組み込みが、細胞増殖を必要としないかもしれないことを示唆す
る。最近、Ad.AAV1およびΔAd.AAV1でのより詳細なインビボ形質
導入研究がBalb/cマウス中で行われ、ΔAd.AAV1を感染させた細胞
におけるアデノウイルス遺伝子発現の非存在が、抗ウイルス免疫応答を回避し得
、そしてベクターの持続性を延長し得るか否かが研究されている。このマウス系
統において、ベクターDNAは、第一世代のアデノウイルスの注入後4〜6週間
で肝臓から排除され、これは、形質導入された細胞において生成されたウイルス
タンパク質に対するCTL応答にほぼ起因する。ベクターDNAを、1×1012 ゲノムのAd.AAV1またはΔAd.AAV1の注入後12週間で、肝臓DN
Aのゲノムサザンブロットによって分析する。この時点で、ベクター特異的シグ
ナルは、第一世代ベクターAd.AAV1を注入したマウス由来の肝臓DNAに
おいて検出可能でないが、約0.3コピー/細胞のΔAd.AAV1ゲノムが、
ハイブリッドベクターを受けたマウスの肝臓中に存在し、これはまた、このハイ
ブリッドベクターの優れたインビボ特性を示す。
強するか否かを試験するために、一連のRep発現プラスミドを構築する。
/78(ヌクレオチド285〜2313)は、pAAV/Ad(Samulsk
i,R.J.ら、1991、B.N.Fieldsら(編)、Fields V
irology,第2巻、Lippincott−Raven Publish
er,Philadelphia)から、BsaI/BsrIでの消化によって
得られる。AAV p5プロモーターが欠失されたこのフラグメントを、pAd
.RSV内またはpAd.PGK内に、それぞれRSVプロモーター下またはP
GKプロモーター下の、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bPA)の
前に、アダプターリンカーを介してクローニングする(Liber,A.および
Kay,M.A.,1996,J.of Virology,70,3153−
3158;Lieber,A.ら、1995、Human Gene Ther
apy,6,5−11)。
はSKHep1細胞にトランスフェクトし、この異種プロモーター(RSVまた
はPGK)から発現されるRepタンパク質のほとんどが、Rep68およびR
ep78であり、一方、aP5プロモーター(pAAV/Ad)下でのrep遺
伝子のトランスフェクションは、優性なRep 52/40の発現を生じる。従
って、pRSVrepおよびpPGKrepのトランスフェクションが、より顕
著であり、これは、293細胞において産生されるElaによるAAVプロモー
ターの強力なトランス活性化を示唆する。この結果は、repタンパク質の最小
限の発現が、アデノウイルス複製の妨害を回避するために必要であることを示す
。
徴である。本発明の1つの実施形態において、ΔAd.AAVの組み込みは、ヒ
ト第19染色体上のAAVS1部位内への部位特異的組み込みを達成するための
、rep 78タンパク質を発現するAd.AAVとの同時感染によって指示さ
れる。この型の部位特異的組み込みが293細胞以外の細胞で生じるために、E
4 ORF6発現が必要とされる。ΔAd.AAV、ΔAd.rep 78およ
びΔAd.E4−orf6の同時感染は、このΔAd.AAV導入遺伝子カセッ
トの部位特異的組み込みを可能にする。ΔAd.rep78およびΔAd.E4
−orf6ゲノムは、形質導入のすぐ後で分解され、従って、潜在的な副作用を
回避する。部位特異的組み込みは、挿入性変異誘発の危険性を減少するために、
rAAVおよびΔAd.AAVで見い出されるランダムな組み込みよりも好まし
い。
SVrepから発現されるRep 68/78の機能的活性を確認し得る(図5
および6)。ヒトSKHep1細胞を、pRSVrepまたはコントロールプラ
スミド(pRSVbGal(Lieber,A.ら、1995、Human G
ene Therapy,6,5−11))でトランスフェクトし(トランスフ
ェクション効率は、約20%)、その後、ΔAd.AAV(2000ゲノム/細
胞)を感染させる。感染後3日で、細胞を、トリプシン処理し、アガロースで包
理し、インサイチュで溶解し、I−CeuI(10ヌクレオチドを超える認識配
列を有する、イントロンコードエンドヌクレアーゼ)で消化し、1%アガロース
ゲル中でのパルスフィールドゲル電気泳動に供し、そしてサザンブロットにより
分析する。AAVS1組み込み部位を含むプローブ(第19染色体座由来の1.
7kb EcoRI/BamHIフラグメント(Samulski,R.J.ら
、1991、B.N.Fieldsら(編)、Fields Virology
,第2巻、Lippincott−Raven Publisher,Phil
adelphia))でのハイブリダイゼーションは、コントロールプラスミド
トランスフェクション(pCo)+ΔAd.AAV1感染後の細胞由来のI−C
euI消化DNA中に、AAVS1に特異的なバンド(約240kb)を明らか
にする。280kbの範囲中のさらなるシグナルが、ΔAd.AAV1で感染し
たrep発現細胞(pRSVrep+VAd.AAV1)中に現れ、これは、特
定のパーセンテージの細胞におけるAAVS1部位への部位特異的挿入を示す。
この280kbバンドにおけるベクターDNAの存在は、導入遺伝子(SEAP
)特異的プローブでの同じフィルターの再ハイブリダイゼーションで確認される
。ランダムに組み込まれたΔAd.AAV1ベクターは、280〜680kbの
範囲の広がったシグナルとして現れる(pCo+ΔAd.AAV1、pRSVr
ep+ΔAd.AAV1)。SEAPプローブをハイブリダイズさせたブロット
上の特異的な約1.9mbのバンドは、内因性ヒトSEAP遺伝子を含むI−C
euIフラグメントを表す。
ベクターへのRep 68/78機能の組み込みは、アデノウイルスDNA複製
を阻害し、これは、従来のストラテジーを使用してのrep発現Adベクターの
生成を妨げる。この問題を解決するために、部位特異的組み込みを媒介するため
に標的細胞(HSC)において一過性のRep発現を維持しながら、ウイルスプ
ロデューサー(293)細胞におけるハイブリッドベクターからの有意なRep
68/78発現が、妨げられなければならない。本発明者らの仮説は、ΔAd
.AAVハイブリッドウイルスの特異的な構造を使用して、このrep遺伝子
68/78を、293細胞におけるウイルス複製の後期においてのみ、HSC特
異的プロモーターの制御下の転写活性位置にもたらし得るということである。こ
れは、この組み込まれたRep 68/78機能をHSCにおいてのみ活性化す
る高力価ウイルスを生成して、293細胞においてハイブリッドベクターを増幅
させる。Rep発現ハイブリッドベクターを生成するための本発明者らのストラ
テジーの一般的概略を、図7に例示する。rep/導入遺伝子カセットを、組換
えアデノウイルス生成のために使用されるレフトハンド(left−hand)
シャトルプラスミドに基づいて構築する。Rep 68/78をコードする遺伝
子を、AAV ITRが隣接する導入遺伝子発現カセットの前に3’から5’の
方向にクローニングする。この導入遺伝子カセットと右側AAV ITRとの間
に、HSC特異的プロモーターを、アデノウイルスE2、E3およびE4遺伝子
に対する方向で挿入する。組換えゲノムは、E.coli中での組換えによって
生成され、そして293細胞へのトランスフェクションにより、ウイルス(Ad
.AAV−rep)を生成する。AV ITRに隣接する2組の配列を有するΔ
Ad.AAVの特異的構造を使用して、このrep遺伝子を、293細胞におけ
るウイルスDNA複製の後期においてのみ、HSC特異的プロモーターの制御下
の転写活性位置にもたらす。Ad.AAV−repの増幅の間に、より小さいゲ
ノムΔAd.AAV−repが形成され、そして粒子にパッケージングされる。
この粒子は、CsCl勾配中での超遠心分離によって分離され得る。ΔAd.A
AV−repの特異的構造は、このrep遺伝子を、HSP特異的プロモーター
に対して5’から3’方向にもたらし、これは、標的細胞中でのrep転写を可
能にする。精製したΔAd.AAV−rep粒子でのHSCの形質導入後、re
p発現が達成され、そしてアデノウイルスベクター骨格からのAAV−ITR/
導入遺伝子カセットのレスキューおよび部位特異的組み込みを媒介する。この仮
説は、AAVS1へのRep媒介組み込みが、右側または両側のAAV/ITR
を介して生じ、このことが、このベクターが一旦組み込まれると、このrep遺
伝子を、肝細胞特異的プロモーターから離れるようにする(図7)。従って、r
pe発現は、この宿主細胞に対して重大な細胞傷害性副作用を伴うことなく、単
に一過性になるはずである。
ep発現を駆動するための潜在的な候補プロモーターは、イニシエーター(また
はHIV LTR)と組み合わせた、454ヌクレオチドのCD34プロモータ
ー(Krause,D.S.ら、1997、Experimental Hem
atology,25,1051−1061;Yamaguchia,Y.ら、
1997、Biochimica et Biophysica Acta.,
1350:141−6)、300ヌクレオチドのHS 40エンハンサー(Ch
en,H.L.ら、1997、Nucleic Acids Res.25,2
917−2922)または3kbのCD34エンハンサー(May,Gら、19
95、EMBO J.,14:564−74)である。最適なプロモーターは、
293細胞および肝細胞におけるプラスミドトランスフェクション後の一過性の
レポーター遺伝子発現の研究に基づいて選択される。試験される全てのプロモー
ターを、アデノウイルスシャトルプラスミドpCR2(pAd.−hAAT)内
へ、ヒトα1−抗トリプシン(hAAT)−ウシ成長ホルモンポリアデニル化シ
グナル(bPA)の前にクローニングする。プロモーター活性は、CD34+お
よび293細胞における一過性のプラスミドトランスフェクションアッセイにお
いて試験し得る。CD34+細胞またはK562細胞における最も高いhAAT
レベルおよび293細胞における最も低いhAAT発現を有するプロモーターを
、さらなる研究のために選択する。これらのプロモーターからの293細胞にお
ける高いバックグラウンド発現が見られる場合、Adシャトルプラスミドになお
存在するElaエンハンサーからHSC特異的プロモーターを遮蔽するインシュ
レーター(遮断因子)を使用する。
の媒介に十分である。Rep68およびRep78のORF内部に位置するAA
V p19プロモーターからの無秩序なRep52およびRep40の発現は、
妨げられるはずである。なぜなら、293細胞におけるこれらのより小さなRe
pタンパク質の産生が、細胞生存およびアデノウイルスDNA合成に影響を及ぼ
すからである。これを行うために、CMVプロモーターの下で個々にRep68
およびRep78を発現するための変異したRep52/40開始コドンを含む
、Suroskyらから得た構築物を使用し得る。これらの構築物からRep6
8またはRep78を一過性に発現する293細胞を、ΔAd.AAV1を用い
て同時感染し得る(MOI 2×105ゲノム/細胞でのpCMVRepトラン
スフェクションから24時間後の感染)。ΔAd.AAV1感染から3日後、細
胞性DNAを、上記のようなPCRおよびPFGEによって、AAVS1特異的
組み込み事象について分析する。効率的なRep媒介性のAAVカセットの切除
および隣接するアデノウイルス配列を伴わない部位特異的組み込みが期待され、
そしてプラスミドpCMVRep68またはpCMVRep78が、対応するr
ep遺伝子についての供給源として用いられ得、そしてこの遺伝子をハイブリッ
ドベクターにクローニングし得る。
to)に基づいて構築し得る。コントロールのハイブリッドベクターのセットを
、rep遺伝子のみ含まないAAV−ITR−導入遺伝子カセットを用いて作製
し得る。組換えAd.AAV−repゲノムを、pCD1、pBHG10(Mi
crobix、Toronto)誘導体との左側のシャトルプラスミドの組換え
によって作製し得る。これらの誘導体は、recA+E.coliにおけるE1
/E3領域について欠失したAd5ゲノムを含む(Chartier,C.,ら
、1996、J.of Virology,70,4805−4810)。29
3細胞におけるプラスミド組換えに基づいた標準的な技術と比較して、このアプ
ローチは、組換えウイルスを含むプラークが、3倍速いようであり、そして異常
な組換えの産生が最小化されるという利点を有する。これは、効率的なウイルス
DNAの増幅およびパッケージングの、Rep発現がアデノウイルス複製を潜在
的に抑制するレベルに達する前に生じることを可能にする。すべてのアデノウイ
ルスのウイルス性遺伝子について欠失したベクターのアウトプットの最大化にお
ける臨界変数は、感染の初期の多重度および収集の時間である。これらのパラメ
ータは、ΔAd.AAV−repハイブリッドベクターの産生について最適化さ
れ得る。rep遺伝子を組み込んだ多くのΔAd.AAVベクターが構築され得
る。アデノウイルスゲノムの5’−342ntに存在する隠れたプロモーターお
よびエンハンサーエレメントは、異種プロモーターからの導入遺伝子発現を干渉
し得る。これは、293細胞におけるΔAd.AAV−repゲノムからのre
p発現を回避する戦略のために重大である。効率的な導入遺伝子発現を確実にす
るために、インシュレーター(insulator)フラグメント(例えば、ニ
ワトリのβグロブリンインシュレーター)が、選択されたプロモーターとともに
、構成的または誘導可能に使用され得る。
して、Repタンパク質が、ΔAd.AAVキャプシドに同時パッケージングさ
れ得るか否か、そしてこれらの同時パッケージングされたRep分子が、レスキ
ューおよびAAV−ITR−導入遺伝子カセットの部位特異的組み込みを媒介す
るに十分であるか否かを確認するために研究を設計する。本発明者らの仮説は、
Rep68/78が、二本鎖のΔAd.AAVゲノムに存在するRep付着部位
(RBS)に付着し、そしてこの複合体が、余分なタンパク質を適応させるに十
分な広さを有するアデノウイルスキャプシドに同時パッケージングされるという
ことである。精製された粒子において以前に行われたタンパク質/DNA比分析
に基づいて、ただ1つの5.5kbのΔAd.AAV1ゲノムが、1キャプシド
あたりパッケージされる。これは、ΔAd.AAV1粒子の電子顕微鏡によって
確認され、これは、ウイルス性コアおよび伸長した遊離の管腔空間に付着したた
だ点状の電子の密集した染色を明らかにする(図2を参照のこと)。
スミドでトランスフェクトし、そしてrep発現の動力学を、トランスフェクシ
ョン後の異なる時点で収集した細胞溶解物を用いたウエスタンブロットによって
決定する。次に、これらの293細胞を、Rep発現動力学に依存したRepプ
ラスミドのトランスフェクション後の特定の時点(例えば、トランスフェクショ
ン後3、6、12、24−−−時間)に、Ad.AAV(MOI 1、10、1
00pfu/細胞)で感染する。Ad.AAV感染の時間設定を正確に行うこと
が重要である。なぜなら、Rep産生がピークレベルに達する前に、ウイルスD
NAの複製が生じるか、または終了するはずであるからである。一般的に、29
3細胞におけるアデノウイルスDNA複製(MOI 10で感染した)は、感染
後18時間で最大であり、その後、構造タンパク質が産生され、ウイルスゲノム
がパッケージングされ、そして細胞膜構造が破壊される(これは、〜36−48
時間のp.i.に終わる)(Shenk,T.,1996,B.N.Field
sら(編)、Fields Virology,第2巻、Lippincott
−Raven Publisher,Philadelphia;van de
r Vliet,B.,1995,W.Doerflerら(編)、第2巻、1
〜31頁、Springer−Verlag,Berlin)。ウイルスを、感
染から48時間後に収集し、そしてCsCl超遠心分離によって分離(band
)する。ΔAd.AAVに対応する精製されたバンド由来のウイルス性物質を溶
解し、DNAse処理し(DNA会合Repを解離するために)、そしてRep
特異的抗体を用いて免疫沈降−ウエスタンブロットに供し、同時パッケージング
されたRepを検出する。2つのRep分子が、1つのAdゲノム当たり付着す
ると仮定する理論上の計算に基づいて、〜1−10ngのRepタンパク質が、
1010粒子の溶解物由来であると期待される。これは、ウエスタンブロットによ
る検出の範囲内である。あるいは、同時パッケージングされたRepは、レスキ
ューおよびAAVITR導入遺伝子カセットの部位特異的組み込みを媒介する機
能的活性に基づいて検出され得る。機能的Repタンパク質が、ハイブリッドベ
クター粒子に同時パッケージングされるか否かを試験するために、Ad/AAV
1感染後にRepを同時発現する293細胞において産生されたCsCl精製Δ
Ad.AAV1粒子(ΔAd.AAV1+Rep)を、形質導入研究について使
用し得る。ヒト細胞株K562のΔAd.AAV1+Rep感染から3日後、細
胞性DNAを、PCRおよびPFGEによって、AAVS1特異的組み込み事象
について分析する。切除されたAAVカセットの効率的なRep媒介性部位特異
的組み込みが成功する場合、次いで、導入遺伝子としてβ−GalおよびSNo
riを含む他のΔAd.AAV+Repハイブリッドベクターが産生され得る。
る仮説は、以下の通りである:(1)ΔAd.AAV−repベクターからの一
過性のRep同時発現が、ヒト細胞における部位特異的ベクター組み込みを増大
し得る、そして(2)組み込みは、rep遺伝子を含まないAAV ITRを介
して生じ、これは、AAVカセットの外側に位置し、従って、ベクター組み込み
の際のrep発現を排除する。仮説1を試験するために、ΔAd.AAV/re
p対ΔAd.AAVベクターの形質導入頻度を、G418耐性コロニーの形成に
基づいて比較し得、そしてPFGEおよびPCRによるヒトおよびマウス細胞の
感染後の異なる時点の部位特異的組み込み事象を定量し得る。仮説2を試験する
ために、形質導入された細胞集団および単一のコロニーにおける組み込まれたベ
クター構造を、サザン分析およびベクター/染色体DNA接合点の配列決定によ
って正確に概説され得る。これらの研究を、ヒトK562またはHEL細胞株(
AAVS1組み込みについて)およびマウスMEL細胞株において、ΔAd.A
AV−rep、ΔAd.AAVおよびΔAd.AAV+Rep(同時パッケージ
ングされたタンパク質)を用いて行い得る。
Ad.AAV−Snori−repを用いて感染した細胞を、G418選択に供
し得る。G418耐性コロニー数を、最初に感染した細胞の数に関して、選択の
4週間後に決定した。潜在的なrep媒介性細胞傷害性またはエピソームのベク
ター発現に起因して、選択を継続された生存しないコロニーについての選択プロ
セスをモニターし得る。ΔAd.AAV−SNori repからのrep発現
は、細胞生存および増殖に影響を与えず、次いで、より多くのG418耐性コロ
ニーが、ΔAd.AAV−SNori−repおよびΔAd.AAV−Snor
i+Repにおいて出現するはずである。組み込まれたベクターの構造を、サザ
ンブロットおよび組み込まれた接合点の配列決定によって決定し得る。
み込み事象およびランダムベクター組み込み事象を用いた形質導入後の細胞を産
生するrepに対する偏りを、感染後の異なる時点(例えば、0.5日、1日、
3日、7日、14日)で細胞集団から単離した細胞性DNAにおいて定量化し得
る。これを行うために、PFGE−サザンに基づいた技術を利用し得る。ヒト細
胞を感染したΔAd.AAV/repにおけるAAVS1特異的組み込みについ
てのシグナルが、感染後1日の間に増加し、次いで、時が経過しても一定のまま
であることが予期される。
よって分析される)と、β−Galハイブリッドベクターを用いて形質導入され
た単一のクローンにおけるβ−ガラクトシダーゼの発現レベルを有する組み込ま
れたコピー数(サザンブロットによって分析される)(ΔAd.AAV−BG、
ΔAd.AAV−BG+RepまたはΔAd.AAV−BG−rep)を相関し
得る。明細書に記載される研究において得られたデータとともに、これは、転写
サイレンシングが、AAVS1部位への部位特異的ベクター組み込みに関連する
か否かを評価し得る。
n)および組み込みについての特定のRep機能が、非S期の細胞または非分裂
細胞において効率的に生じ得るか否かは明らかである。ΔAd.AAVfx、ΔA
d.AAVまたはΔAd.AAV−rep/+Repベクターが、非分裂細胞に
組み込まれ得るか否かを試験するために、細胞周期を阻止する細胞培養物におけ
る形質導入研究が、上記のように行われ得る。
であり、これは、rep媒介性細胞傷害性におそらく起因する。従って、異所性
のrep発現と組み合わせた長期の形質導入研究(例えば、単一のコロニーにお
けるG418選択または研究)を行うことは不可能である。さらに、アデノウイ
ルス複製に対するrepの阻害効果に起因して、現在、RSVまたはPGKプロ
モーターの下でrepを発現するアデノウイルスベクターを生成することは不可
能である。
みを刺激し得ることを示す。
細な研究) 赤血球細胞株へのハイブリッドベクターの形質導入および組み込み頻度を改善
するために、種々のハイブリッドベクターを比較する詳細な研究が、下記のよう
に行われなければならない。この形質導入研究を、赤血球への遺伝子転移ビヒク
ルを研究するための適切なモデルと考えられているK562細胞において行う(
Floch,V.,ら、1997、Blood Cells,Mol.and
Diseases.23,69〜87)。最適なベクターは、高い頻度で細胞ゲ
ノムへ組み込まれ得るはずであり、これは、実施例4に記載されるようなパルス
フィールドゲル電気泳動(PFGE)およびサザンブロットによって決定される
。さらに、以下の研究からの結果は、所定のハイブリッドベクターが、宿主ゲノ
ムにおける部位特異的組み込みについて改変される必要があるか否かを評価する
のに役立つ。
体DNAとの間の接合点の配列決定である。さらに、これは、AAV ITRが
、組み込みのための基質を提示するか否かという問題を明らかにする。特に、公
知のΔAd.AAVSNori組み込み構造を有する(サザンブロットによって
分析した)クローン由来のDNAを、EcoRIで消化した。EcoRIは、S
Noriカセットの内部で切断しない。得られたフラグメントを円形にし、そし
て特定のE.coli系統に形質転換する(RutledgeおよびRusse
llによって記載されるプロトコル(Rutledge,E.A.ら、1997
、Journal of Virology,71:8429−36)に従って
)。カナマイシン耐性細菌性クローンは、組み込まれたSNoriカセットを含
むはずである。レスキューされたプラスミドにおける隣接する染色体DNAを、
導入遺伝子に特異的なプライマーを用いて配列決定し得る。
ムDNAを抽出し、そしてEcoRIで消化する。EcoRIフラグメントを、
特定のプライマー結合部位を含むリンカーに連結し、次いで、NotIで消化し
、E.coli中で再連結しかつ増殖させる。代表的な数の細菌性クローン由来
のプラスミドDNAを配列決定し、ベクター/染色体DNA接合点を決定する。
クター(これは、あらゆるアデノウイルス遺伝子を欠失する)を使用して、より
高い用量で、初代アデノウイルスよりも少ない細胞傷害性で細胞を感染し得る。
K562細胞を、異なるMOI(1〜108)のΔAd.AAVBGおよび初代
ベクターAd.AAVBG(これは、同じβ−Gal発現カセットを含む)で感
染する。感染から4日後、細胞総数、生細胞のパーセンテージ(トリパンブルー
排除に基づく)およびX−Gal陽性細胞のパーセンテージを計数する。感染細
胞の画分を、Galacto−Lightキットを使用して、β−Gal発現に
ついて計量する。導入遺伝子発現のレベルを、2つのベクター間で比較できるこ
とが期待される。K562細胞は、ウイルス遺伝子を発現するAd.AAVBG
よりも良好なより高い用量のΔAd.AAVBGを許容すると推測される。
度) 異なるベクターの組み込み頻度を研究し、そして二本鎖アデノウイルスDNA
ゲノムに存在するAAV ITRが、rAAVベクターに匹敵する頻度で、ベク
ター組み込みを媒介し得ることを確認するために、組み込み研究を、細胞当たり
、2×105ゲノムおよび2×106ゲノムでの感染後に、ΔAd.AAVSNo
ri、AdSNori、Ad.SNoriITRおよびrAAVSNoriを含
むG418耐性コロニーの形成に基づいて行う(図8)。感染後、細胞を、限界
希釈の下で96ウェルプレートにプレーティングし、そしてG418を用いて選
択して、G418耐性コロニーの形成の頻度を概算する。別のセットの細胞を、
G418を用いずにプレーティングする。代表的な数のクローン(w/ G41
8選択およびw/o G418選択)を、106細胞を超えるまで拡張し(培養
の3〜4週間後)、そしてサザンブロットならびにPFGE分析によって、ウイ
ルスDNAの存在について分析し、エピソームベクターDNAと、染色体DNA
と安定に結合したベクターゲノムとの間を識別する。これは、本発明者らが、異
なるベクターの組み込み頻度を概算することを可能にし、組み込みについてのG
418選択の効果を評価し、そして総組み込み頻度の算出におけるneo発現に
対する位置効果を考慮する。少なくとも1×10-4の頻度で組み込まれたベクタ
ーコピーを、ΔAd.AAVSNoriおよびrAAVSNoriについてのみ
予測する。コロニーの総数は、発現されたアデノウイルスタンパク質の毒性効果
に起因して、初代ベクターであるAd.AAVSNoriITRおよびAd.S
Noriの両方においてより低いかもしれない;しかし、より高い組み込み頻度
が、AAV ITRを含むベクター(Ad.AAVSNoriITR)について
予測される。
するより強力な保護を提供する。さらに、一本鎖ゲノム由来の転写活性な二本鎖
中間体の合成(これは、rAAV形質導入における限定段階を考慮する)は、Δ
Ad.AAV形質導入に必要ではない。従って、rAAVベクターを用いて見ら
れた感染と発現との間の遅れた段階(lag phase)(これは、二本鎖合
成/組み込みに原因となって連結する)は、ΔAd.AAVベクターでの感染よ
り短いか、または存在しないかもしれない。さらに、アデノウイルス粒子にパッ
ケージングされた9kbのミニアデノウイルスゲノムが、感染から3日後までに
、ただ短命であり、そして完全に分解されることが以前に示された。対照的に、
5.5kbのΔAd.AAV1(図1)を用いた形質導入ゲノムは、長期の発現
を可能にし、このことは、どちらのAAV ITRも、組み込まれるかまたは組
み込みが感染直後に生じるまで、エピソームのようにウイルスゲノムを安定化し
得ることを示唆する。
.AAVSNoriITRまたはrAAVSNori(MOI 2×105)で
の感染後に、異なる時点でK562細胞において試験し得る。感染細胞を、感染
後1時間、5時間、1日、3日、7日および14日で収集し、そして染色体DN
Aを、PFGEによって分析し、その後、導入遺伝子特異的プローブを用いてハ
イブリダイゼーションする。この技術により、本発明者らは、明瞭な5.0kb
のバンドとして現れるエピソームベクターDNAと組み込まれたDNAとの間を
識別することが可能である。さらに、余分な染色体の高分子量ベクターコンカテ
マーが検出され得る。ランダム組み込みの場合、I−CeuIまたはPI−Sc
eIを用いた染色体DNAの消化後に、1〜2mbの範囲のベクター特異的シグ
ナルが観察されるはずである。エピソームおよび組み込まれたベクターシグナル
の強度を、ホスホイメージャー(phosphoimager)分析を使用して
、各々の時点について定量する。これは、感染したK562細胞の集団における
ハイブリッドベクターの組み込みの動力学についての情報およびハイブリッドベ
クターゲノムの細胞内安定性についての情報を与える。
) ΔAd.AAV1は、以前に示されるように、コンカテマーとして宿主DNA
にランダムに組み込む。どれくらい多くのベクターコピーが、1つのコンカテマ
ーに存在し、そしてタンデム形成の程度および動力学が、用量依存性であるか否
かは、いまだ不確かなままである。別の答えの出ていない疑問は、どのようにΔ
Ad.AAVが組み込むのか:1つまたは両方のITRが関与するのか否か、組
み込まれたITRが、なおインタクトであるか否か、そしてアデノウイルス配列
が、同様に組み込むのか否か、である。これらの問題は、ハイブリッドベクター
ゲノムへrep遺伝子を含める戦略に重要である。さらに、インタクトなAAV
ITRが、組み込まれたベクターコピー内に存在する場合、インビボでのヘル
パーウイルス(アデノウイルスまたはHSV)感染は、組み込まれたAAV−I
TRベクターカセットを起動し得、そして導入遺伝子発現の安定性に影響を及ぼ
し得る。
AdSNori、Ad.AAVSNoriITRおよびrAAVSNoriで、
細胞当たりMOI 2×105、2×106または2×107ゲノムで感染し得る
。感染細胞を、G418の存在または非存在下で、96ウェルプレートにプレー
ティングする。G418の非存在下でのプレーティングも含まれる。なぜなら、
G418は、組み込まれたベクターDNAの増幅を引き起こし得るからである(
Rutledge,E.A.ら、1997、Journal of Virol
ogy,71:8429−36)。単離されたクローン由来のゲノムDNAを、
実施例の節に記載されるように、通例のサザンブロットによって分析し、ベクタ
ーコンカテマーの存在を確認し得、そして組み込まれたベクターコピー数を算出
し得る。組み込まれたベクターコピーおよび染色体DNAとのその接合点の配列
決定がより有益である。組み込み接合点の構造は、ベクター組み込みにおけるA
AV ITRの役割および形質導入後の挿入的な変異誘発の程度を使用して、明
確にされ得る。このデータは、臨床試験に使用されるハイブリッドベクターの潜
在的な危険性についての情報を提供する。
性造血幹細胞である。本発明者らは、ΔAd.AAVゲノムの二本鎖の性質およ
び特定の核内移行機構は、非分裂細胞の形質導入を可能にし得るということを仮
定している。このことは、インビボでの静止性肝細胞におけるΔAd.AAV1
を用いる形質導入研究によって部分的に支持されている。このデータを確認する
ために、初期の線維芽細胞は、Russel(Russel,Dら、1995、
PNAS,92:5719−23)によって記載されるプロトコルに従ってハイ
ブリッドベクターを感染させる前の血清/増殖因子飢餓によってG0期に入るこ
とを余儀なくされ得る。細胞は、血清/増殖因子剥奪下で感染後3日間維持され
る。この時点において、ゲノムDNAを単離し、そして増殖細胞との比較におい
てPFGEにより組み込み事象について分析される。別系列の組み込み研究は、
アフィディコリン(以前に記載された組み込み反応速度論に依存するハイブリッ
ドベクターでの感染の1日前に添加し、そして感染後、数日間維持される)で細
胞周期のG1/S期で停止されているK562細胞について実施され得る。DN
A損傷薬剤が、ハイブリッドベクターの形質導入頻度が増加するか否かを調べる
ために、細胞周期停止K562細胞または初期の線維芽細胞を、Alexand
erおよびRussel(Alexander,I.E.ら、1994、J.V
irol.,68:8282−87;Russell,Dら、1995、PNA
S,92:5719−23)により記載されるプロトコルに従うウイルス感染の
前に、シスプラチンまたは3H−チミジンで処理し得る。さらに、ハイブリッド
ベクターの形質導入効率に対する染色体DNA脱圧縮(decondensat
ion)の効果は、ピューロマイシン、スタウロスポリン、ヘキスト3328、
ディストラマイシン(distramycin)またはバンデート(vanda
te)処理後の停止細胞において研究され得る。
形態(非パリンドローム18bp認識配列を有する酵母ミトコンドリアイントロ
ンエンドヌクレアーゼは、293細胞において発現される。哺乳動物細胞におけ
るこの酵素の構成的な発現は、おそらく、ゲノムにおけるI−Sce I部位の
欠如またはそれらの十分な修復いずれかに起因して、毒性ではない(Rouet
Pら、1994、PNAS.91:6064−8)。酵母I−Sce Iは、
SV−40抗原核局在化シグナルおよび最適なKozak配列で改変されて、哺
乳動物細胞におけるその機能を増強させる(Rouet Pら、1994.PN
AS.91:6064−8)。別の酵母エンドヌクレアーゼについて、形質導入
されたAdゲノム内の認識部位は、ヒトA549細胞内で発現された場合、有効
(全ての形質導入されたゲノムの30%)であったということが示された。重要
なことには、形質導入されたAdゲノムから発現されたE4 ORF6およびO
RF3の発現は、エンドヌクレアーゼにより媒介される二本鎖破壊修復を阻害し
た(Nicolas,A.Lら、2000、Virology、266:211
−24)。このことは、他のものによる観察と一致し、ここでこれらのE4タン
パク質は、ウイルスゲノムのコンカテマー化(concatemerizati
on)を防止する(Boyer,Jら、1999.Virology、263:
307−12)。このことに基くと、I−Sce I認識部位を含む全長ウイル
スのパッケージングは、I−Sce Iを構成的に発現する293細胞において
減少される。その18マーのI−SceI部位を、Ad.IRベクターのE3領
域内へ挿入する。これらのベクターは、293細胞において生成されて、そして
増幅され、次にI−SceIを発現する293細胞の大規模(large−sc
ale)感染が行われる。あるいは、エンドヌクレアーゼXhoIに対する発現
カセットを、Ad.IRまたはAd.AAVベクターのE3領域内に挿入する。
XhoI遺伝子は、哺乳動物細胞内で最適な機能について改変される。XhoI
を発現するベクターは、XhoIイソシゾマーPaeR 7メチルトランスフェ
ラーゼ(PMT)を発現する293細胞において、生成され、そして増幅される
(Nelson,J.Eら、1997、J.Virol.,71:8902−7
)。これは、XhoI部位(CTCGAG)のアデニン塩基のN6位上へのメチ
ル基の付加を媒介する。これは、XhoI切断から、ウイルスおよび細胞ゲノム
を保護する。メチル化Adベクターを高い力価において産生する。次いで、ΔA
d.AAVベクターを293細胞をAd.AAV−XhoIベクターで大規模感
染することによって得る。この段階において、ウイルスゲノムは、メチル化され
ず、そしてXhoI部位にて消化される。導入遺伝子カセット内に存在するXh
oI部位は、アミノ酸配列の変更を伴わずに、部位定方向突然変異誘発により検
出される。(XhoIは、ウイルス複製における後期段階においてのみ蓄積され
て、そして複製が終了した場合に、大部分のAd DNAに対してのみ作用する
はずである。さらに、超遠心分離は、ΔAd.IRとΔAd.IR粒子との間の
分離を最適化する(Blague,Cら、2000、Blood.95:820
−8)。
試験) ファイバーノブ領域のアミノ酸配列は、〜50の公知の血清型の中でかなり変
わるので、異なるアデノウイルス血清型は、異なる細胞レセプタータンパク質と
結合するか、または異なる侵入機構を使用するということが考えられる(She
nk,T.,1996,B.N.Fieldsら(編)、Fields Vir
ology,第2巻、Lippincott−Raven Publisher
,Philadelphia;Mathias.Pら、1994、Journa
l of Virology、68:6811−14;Defer,Mら、19
93、J.of Virology、64、3661−3673)。ほとんどの
アデノウイルスは、ペントン塩基タンパク質内にRGDモチーフを含むが、この
保存された配列を伴わない多数の血清型(例えば、Ad 40、41)が存在す
る。これらの型は、ウイルスのインターナリゼーションのためにインテグリン□
v−非依存性経路を使用し得る(Davison.A.Jら、1993、J.M
ol.Biol.,234、1308−1316;Mathias,Pら、19
94、Journal of Virology、68:6811−14)。ヒ
ト骨髄に存在する他のAd血清型が幹細胞亜集団に感染し得るか否かを試験する
ために、一連の異なるヒトAd血清型および動物ウイルスについての研究が実施
され得る(表IIを参照のこと)。Ad血清型を用いる効率的な形質導入を立証
するための手段として、ウイルスDNAを感染の前にタグ化し、そして形質導入
細胞の核内のウイルスゲノムの存在を調査する。さらに、ウイルスDNAが、形
質導入細胞内で複製されるか否かは、初期のウイルス遺伝子発現についての間接
的な証拠として分析され得る。発現されたウイルスタンパク質の直接検出は、本
研究において含まれる全ての血清型に対する抗体の利用不能性に起因して不可能
である。感染アッセイと同時に、形質導入されたヒト骨髄細胞を、HSCまたは
先祖亜集団に特徴的な形態学的特徴および免疫組織化学的特徴について分析し得
る。再び標的化するために、最も低いMOIにて骨髄細胞のCD34+サブセッ
トに感染し得る血清型を選択する。次の工程と同様に、ファイバー遺伝子が、潜
在的HSC/CD34+親和性を有する血清型からPCRクローン化し、そして
Ad5ベクター生成のための標準的なシャトルプラスミド内へ挿入し、E.co
li組換え系を使用して、Ad5遺伝子を複製する(図9)。
ムスター卵巣、ATCC CCL−61)、K562(ヒト造血、ATCC 4
5506)、HEp−2(ヒト喉頭癌、ATCC CCL−23)、293(ヒ
ト胚性腎臓、Microbix、Toronto Canada)細胞をDEM
E、10%FCS、2mMグルタミンおよびPen/Strep中に維持した。
CHO細胞のための培養培地を、200μMアスパラギンおよび200μMプロ
リンと共に補充した。ヒトCD34+富化(enriched)骨髄細胞を、製
造業者の指示に従って、MiniMACS VS+分離カラム(Milteny
i Biotec.Auburn,CA)を使用して可動化した後、末梢血から
精製した。アリコートを液体窒素中に保存した。実験の16時間前に、細胞を凍
結ストックから回収し、そして20%FCS、10-4M β−メルカプトエタノ
ール、100μg/ml DNAaseI、2mMグルタミン、10U/ml
IL−3、および50ng/mg幹細胞因子(SCF)または2ng/mlトロ
ンボポエチン(Tpo)を補充されたIMDM培地中で一晩インキュベートした
。CD34+調製物の純度を、フローサイトメトリーにより確認し、そしてその
純度は、一貫して90%よりも高かった。
Lakes,NJ)において増殖した接着細胞(CHO、Hela)を1mM
EDTAを用いて処理することによって剥離させ、そして1%FCSを補充され
たPBSからなる洗浄緩衝液(WB)で3回洗浄した。懸濁物(K562、CD
34+)中で増殖した細胞をWBを用いて3回洗浄した。洗浄後、細胞を2×1
06細胞/mlにてWB中に再懸濁した。2×104細胞を、37℃にて1時間、
αv−インテグリン[L230、ATCC:HB−8448.(Rodrigue
z,E.,Everitt,E.1999.Arch.Virol.144:7
87−795)(1/30最終希釈)、CAR[RmcB(Bergelson
,J.Mら、1997.Science.275:1320−1323;Hsu
,K.−H.,Lら、1988.J.Virology.62:1647−16
52)(1/400最終希釈)]、またはBrdU[(Amersham,Arl
ington Heights,IL)(1/100最終希釈)]に特異的なモ
ノクローナル抗体と共にWB中でインキュベートした。引き続き、細胞をWBで
洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識化ウマ抗マ
ウスIgG抗体[(Vector Labs.,Burlingame.CA)
(1/100最終希釈)]またはフィコエリトリン(PE)標識化ヤギ抗マウス
IgG抗体[(Calbiochem.La Jolla,CA)1:100希
釈]と共に4℃にて30分間インキュベートした。二次抗体を用いてインキュベ
ートした後、細胞をWBで2回洗浄し、そしてサンプル毎に104細胞を、フロ
ーサイトメトリーにより二連で分析した。
ならびに蛍光性活性化細胞分類(FACS)のために、精製されたヒトCD34
+細胞を、製造業者のプロトコルに従って、フィコエリトリン(PE)結合体化
抗CD34モノクローナル抗体(Becton−Dickinson Immu
nocytochemistry Systems,San Jose,CA)
またはPE標識化抗−CD117(c−kit)モノクローナル抗体(MAb
95C3、Immunotech,Beckman Coulter,Mars
eille,France)と共にインキュベーションし、次にフローサイトメ
トリー分析を行った。全ての分析および分類分けを、488nmアルゴンレーザ
ーおよび633nmHeNeレーザーを装備するFACStar Plus f
low cytometer(Becton Dickinson.Frank
lin Lakes.NJ)に対して行った。CD34+/c−kit+細胞の
c−kit発現およびFACS精製の分析のために、CD34+細胞の培養の間
SCFを培地に添加しなかった。
れている。従って、本発明者らは、HSC親和性を有するAd血清型を同定して
、そして新しいウイルスベクターを構築するために本発明者らの研究の標的とし
てヒトCD34+細胞を使用した。研究を、CD34+細胞を静止期に維持する
ことが公知である条件下で、動員されたCD34陽性の末梢血細胞(一人のドナ
ーに由来する)に対して実施した(Leiner,Aら、1996.Br.J.
Haematol.92:255−262;Roberts.A.W.,Met
calf.D.1995.Blood.86:1600−1605)。90%よ
りも多くの精製された細胞は、フローサイトメトリーによりCD34陽性であっ
た。さらに、本発明者らは、本発明者らのAd親和性研究に細胞株K562(こ
れは、ヒト造血細胞への遺伝子導入を研究するための適切なモデルであると考え
られている)を含めた(McGuckinら、1996.British Jo
urnal of Haematology,95:457−460)。HeL
a細胞(これは、Ad5により容易に感染可能である)およびCHO細胞(これ
は、Ad5感染に不応性である)(Antoniou,Mら、1998、Nuc
leic Acid Res.,26:721−9)をそれぞれ、陽性コントロ
ール細胞株および陰性コントロール細胞株として使用した。
ンの両方に結合することは、標的細胞の高い効率の感染のために重要である。試
験細胞上のCARおよびαvインテグリンの発現を、CAR(RmeB(Ber
gelson,J.Mら、1997.Science.275;1320−13
23;Hsu,K.−H.,Lら、1988.J.Virology.62:1
647−1652))およびαvインテグリン(L230(Roelvink.
P.Wら、1996.J.virology.70:7614−7621))に
対するモノクローナル抗体を使用してフローサイトメトリーにより分析した(図
10)。予期されるように、ほとんど全てのHeLa細胞は、高いレベルのCA
Rおよびαv−インテグリンを発現したが、CHO細胞は、有意なCARおよび
αv−インテグリン発現を欠如した。15%および77%のK562細胞は、そ
れぞれCARおよびαv−インテグリンを発現した。本発明者らの研究において
使用された〜6%のCD34+細胞のみが、CARを発現し、そして17%が、
αv−インテグリンについて陽性であった。特に、CD34+細胞の調製は、異
なる細胞型の混合物を示す。非細胞周期性(non−cycling)ヒトCD
34+細胞上の一次Ad5レセプターおよび二次Ad5レセプターの非存在また
は少ない発現は、以前の報告と一致している(Huang,Sら、1996.J
.Virology.70:4502−4508;Neering,S.Jら、
1996..Blood.88:1147−1155;Tomko,R.Pら、
1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:3352−
3356)。
ターナリゼーション、および核輸送を実証するための間接的な手段である。ウイ
ルスゲノムの核限局化は、導入遺伝子転写および組み込みのために必須である。
2つの技術を利用して、インサイチュ分析のためにウイルスDNAをタグ化する
。感染アッセイを最適化するために、野生型Ad5ウイルスおよびAd5感染を
許容するK562細胞を使用し得る。第1のプロトコル(Chalberg,S
.S.およびKetner,S.1981、Virology 114、196
−209)は、ウイルスDNAの32P標識に基いている。野生型Ad5およびA
549細胞の増幅の間、32P−ホスフェート(40μCi/ml)をホスフェー
トを含まない培地に添加する。CPEの発生後、32P−タグ化ウイルスを収集し
、CsCl勾配において帯状(band)にし、標準的なプロトコルに従ってH
eLa細胞に対して力価を測定した。ヒト骨髄細胞の感染のための状態を刺激す
るために、K562細胞を、37℃における攪拌下で2、4、6または8時間、
1、10または100の32P−Ad5のMOIを有する懸濁物においてインキュ
ベートする。これは、吸収、インターナリゼーションおよび核輸送のために必要
な期間をカバーする。洗浄後、細胞を、サイトスピン(cytospin)を使
用して顕微鏡スライドに移すか、またはパラフィン中に包理するかのいずれかに
よって固定し、そして切片にする(VECTOR実験室、Burlingham
,CAに由来するプロトコルに従って)。後者は、同じ細胞の複数の連続切片(
5μm)を、異なる方法により分析し得る(例えば、32Pタグ化ウイルスDNA
について、特定の組織学的染色について、免疫蛍光法について)という潜在的な
利点を有し、これは感染を骨髄に存在する特定の細胞型に相関させることを可能
にする。細胞をオートラジオグラフィーのためにKodak NTB−2写真乳
剤中でインキュベートする。露光時間(exposure time)を最適化
して、バックグランドまたは非核局在化シグナルを最小にする。核の銀色粒子の
線量(dose)および時間依存性の出現は、最適化された条件下で予期される
。32P−ホスフェートは、ウイルスタンパク質を同様に標識するので、細胞質バ
ックグランドシグナルが出現し得る。検出を促進ために、切片についてHSC特
異的抗体で免疫蛍光を実施し得る。代替的方法として、ウイルスDNAについて
BrdU−標識技術を使用し得る(Lieber,Aら、1999.J Vir
ol 73:9314−24;Lieber,Aら、1996、Journal
of Virology、70:8944−60)。この場合において、wt
Ad5ウイルス増殖の間、異なる量のBrdUをA549培養培地に添加する。
BrdU標識化ウイルスDNAは、BrdUに対して特異的なモノクローナル抗
体を用いて検出され得る。そのシグナルは、ビオチン/アビジンおよび蛍光マー
カーを組み合わせて、種特異的ポリクローナル抗体の層を使用して増強され得る
。BrdUタグ化ウイルスDNAは、2重または3重の免疫蛍光によって、細胞
表面マーカーと一緒に骨髄細胞のサイトスピン上に検出され得る。
ーニングの結果として、本発明者らは、第一世代(Ad35に由来するファイバ
ーで置換されたAd5ベースのベクター)を構築した。本発明者らは、このカプ
シド改変が、対応するキメラAdベクターによる潜在的なHSCの効率的ウイル
ス形質導入を可能にしたことを実証した。
(non−cycling)CD34+細胞を用いて実施した。動員血液から精
製した静止期のCD34+細胞は重要である。なぜなら、細胞増殖の誘導は、造
血を再構成する能力の欠如および細胞レセプターのスペクトル変化に関連するか
らである(Becker,P.Sら、1999.Exp.Hematol.27
:533−541)。サイトカインまたは増殖因子を用いる造血細胞の処理が、
αv−インテグリンを含む特定のインテグリン(これは、Ad感染に対する細胞
の感受性を最終的に変更するか、または感染細胞の生存に影響を及ぼし得る)の
発現を変えるということが公知である(Gonzalez,Rら、1999.G
ene Therapy.6:314−320;Hang,Sら、1995、J
.Virology.69:2257−2263)。形質導入研究の解釈を複雑
にする別の事実は、形態学および機能に関してCD34+細胞の異常な不均一性
である。
ーニング) ATCCは、70よりも多くのヒトアデノウイルスまたは動物アデノウイルス
を提供する(付録(Appendix)Iを参照のこと)。15ヒト血清型およ
び6動物アデノウイルスの収集(表II参照のこと)は、以下の判定基準に基い
て選択される:(i)NIH遺伝子バンク(bank)に由来する完全ゲノム配
列またはファイバー配列の有効性(ii)CARレセプター使用が非存在または
未知であること(iii)異なるサブグループ、および(iv)中程度または低
い腫瘍形成能(Shenk,T.,1996,B.N.Fieldら、(編)、
Fields Virology、第2巻、Lippincott−Raven
Publisher、Philadelphia)。しかし、この点に関して
、付録において示される任意の血清型を、記載される本発明のために使用し得る
。動物ウイルスは、感染性アッセイに含まれる。なぜなら、これは、ヒトAd5
ファイバーに対する予め存在している体液性免疫(これはAdベクターを用いる
臨床試験について重大な障害を表わす)を回避する手段を提供し得るからである
。
081)、5(VR−5)、9(VR1086)、35(VR−716)および
41(VR−930)から購入した。アデノウイルス番号VR−716を血清型
34と標識されたATCCから購入した。しかしファイバー領域を配列決定する
際に、血清型35であることが見出された。増幅のために、対応するAdsを、
相互汚染(cross−contamination)を予防した条件下で、H
eLa細胞、293細胞、またはHEp−2細胞に感染させた。ウイルスを、C
sCl勾配において帯状にし、透析し、そして他で記載されるようなアリコート
において貯蔵した(Lieber,A.,C−Yら、1996.Journal
of Virology.70:8944−8960)。プラーク力価測定を
以下のように実施した:6ウェルプレートにプレートされたコンフルエントな2
93細胞を総容量1mlにおいてウイルスと共に24時間インキュベートした。
感染させてから2週間後、1%アガロース/MEM/10%FCS.0をオーバ
ーレイ(overlay)した培地上でプラークを計数した。
ルタルアルデヒドで希釈した。グリッド(grid)を以前に記載されたように
調製した(Mittereder,Nら、1996.J.Virology.7
0:7498−7509)。2%タングステン酸メチルアミン(Nanopro
bes,Stony Brook,NY)で染色後、カーボンコートしたグリッ
ドをPhillips410電子顕微鏡で調べて、そして顕微鏡写真を撮った(
80kVにて操作した(最終倍率85,000×))。各々の特定のAd血清型
について、100粒子当たりの形態学的に欠損しているウイルス粒子の数を、5
つの無作為な視野(field)において計数した。
い。ウイルス粒子の完全性(intactness)は、比較相互作用研究のた
めに非常に重要であったという理由で、上記の特定の血清型に由来するビリオン
を、電子顕微鏡(EM)より分析した。陰性コントラスト(negative
contrast)染色したAd懸濁物のEM研究は、不完全粒子の割合(正二
十面体形状またはルミナル(luminal)染色の欠如)は、5%を超えなか
ったということを実証し、これは、血清型調製物が、同等の性質を有したことを
示した。代表的なEM写真は、Ads5、9、および35(図11)について示
される。
機構を使用すると考えられる(Defer,Cら、P.1990.J.Viro
logy.64:3661−3673;Mathias.Pら、1994.Jo
urnal of Virology.68:6811−6814)。ヒトアデ
ノウイルスのセットを、CD34+細胞に対する親和性について試験されるべき
ATCCから入手した。これらは、異なるサブタイプを表わす血清型3、4、5
、9、35および41を含んだ(表1)。本発明者らは、これらの血清型は、フ
ァイバーシャフト(fiber shaft)の異なる長さ(Chrobocz
ek,Jら、1995.Adenovirus fiber,P.163−20
0.a.P.B.W.Doerfler(編)、The molecular
repertoire of adenovirus、第1巻、Spring
Verlag、Berlin;Roelvink,P.Wら、1998.J.V
irology.72:7909−7915)、ペントン塩基内のRGDモチー
フの存在もしくは非存在、および異なる組織親和性に起因して異なる細胞接着お
よびインターナリゼーションストラテジーを有すると考えた。相対的にほとんど
特徴付けられていないAd35を選択した。なぜなら、それは免疫無防備状態の
宿主(特に、骨髄レシピエントにおいて)において見出されていたからである(
Flomenberg,Pら、1994.Journal of Infect
ious Diseases.169:775−781;Flomenberg
,P.Rら、1987.Journal of Infectious Dis
eases.155:1127−1134;Shields,A.Fら、198
5 New England Journal of Medicine.31
2:529−533)。後者の知見は、本発明者らが、骨髄細胞はAd35につ
いての天然レザバー(reservoir)の中にあると考えることを促した。
において処理され、そしてHepaフィルター濾過されたビン、優先的に、相互
汚染を避けるために別個のCO2インキュベーターにおいて培養されるように、
対応するアデノウイルスストックをHeLa細胞またはA549細胞に感染させ
得る。増殖の間、ウイルスDNAを、以前に記載された技術の1つを使用してタ
グ化する。ウイルスDNAは、精製された粒子から単離され得る。XhoI制限
パターンを、放射性プローブとして対応するウイルス型の完全なゲノムを使用す
るサザンブロットによって、メチル化されたウイルスDNAおよび非メチル化さ
れたウイルスDNAについて分析する。
スロットブロットアッセイによってより早くに報告されたが(Roelvink
,P.W.ら、1988,J.Virology.72:7909−7915)
、この結合が、生理学的に関連性がある親和性を用いて生じるのか否か、および
この付着が、細胞侵入を付与するのか否かが明らかではない。さらに、ペントン
とインテグリンとの間のAd5相互作用について示されたように、第2のレセプ
ターが、ウイルスのインターナリゼーションを誘導するのに必要である。本発明
者らは、異なる血清型が、K562標的細胞またはCD34+標的細胞と異なっ
て相互作用したことを実証した。Ad5、Ad4、およびAd41は、K562
細胞およびCD34+細胞に効率的に付着し得ず、そしてこれらの細胞によって
インターナリゼーションし得なかった。Ad4は、別個のサブグループ(E)に
属するが、Ad4は、Ad5に関連するファイバーを有するサブグループBウイ
ルスとCウイルスとの間の天然の雑種を示す(Gruber,W.C.ら、19
93,Virology.196:603−611)。従って、Ad4がAd5
に類似の付着特性を有することは、驚くべきことではなかった。サブグループF
のAd41の血清型は、異なるファイバー(長ファイバーおよび短ファイバー)
を含むことが示された。これらのファイバーは、異なる細胞侵入経路を可能にす
る(Tiemessen,C.T.,Kidd,A.H.1995,J.Gen
.Virol.76:481−497)。Ad41ペントン塩基は、RGDモチ
ーフを含まない。このことは、このウイルスが、細胞侵入のためのαv−インテ
グリン独立性経路を使用し得ることを示唆する。しかし、これらの特徴は、CD
34+細胞との相互作用を改善しなかった。Ad9、Ad3、およびAd35は
、Ad5よりも効率的にCD34+細胞と相互作用した。試験した全ての血清型
以外に、Ad35は、最も効率的な付着およびK562細胞およびCD34+細
胞とのインターナリゼーションを実証した。短Ad9は、CARに付着し得るが
、細胞侵入のためにαv−インテグリンを優先的に使用する(Roelvink
,P.W.ら、1996,J.Virology.70:7614−7621)
。従って、CD34+細胞の特定のサブセットでの低レベルのαv−インテグリ
ン発現は、Ad9に対する観察された感受性について説明し得る。
ーナリゼーション) (方法) (Adの[3H]−メチルチミジンでの標識) 血清型は、他に詳細に記載のように[3H]−メチルチミジンで標識した(R
oelvink,P.W.ら、1996,J.Virology.70:761
4−7621)。簡潔には、5×107HeLa細胞または293細胞を、15
ml DMEM/10% FCSを含む175sq.cmのフラスコにおいて増
殖し、そして50以上のMOIで野生型アデノウイルスで感染した。感染から1
2時間後、1mCiの[3H]−メチルチミジン(Amersham,Arli
ngton Heights,IL)を、この培地に添加し、そして細胞をさら
に完全なCPEが観察されるまで37℃でインキュベートした。次いで、細胞を
、収集し、ペレット化し、冷PBSで1回洗浄し、そして5mlのPBS中に再
懸濁した。ウイルスを、4回の凍結融解サイクルによってこの細胞から放出した
。細胞の破片を、遠心分離によって除去し、そしてウイルス物質をCsCl勾配
における超遠心分離に供し、かつその後、以前に記載のような透析に供した(L
ieber,A.,C.−Y.ら、1996,Journal of Viro
logy.70:8944−8960)。ウイルス精製および透析により、取り
込まれなかった放射能を除去した。野生型のAd粒子濃度を、野生型Ad5につ
いての吸光係数 ε260=9.09×10-13ODml cm ビリオン-1を利用
して)OD260を測定することによって分光光学的に決定した。(Maizel
,J.V.ら、1968.Virology.36:115−125)。ビリオ
ン特異的放射能活性を、液体シンチレーションカウンターによって測定し、そし
て常に1×10-5〜1×10-4cpm/ビリオンの範囲であった。選択された改
変体について、ファイバー遺伝子を、PCR増幅し、そして配列決定して、交差
汚染(cross−contamination)の同定および非存在を確実に
した。
る複製のための試験) 形質導入を最終的に確認するために、感染細胞においてアデノウイルス複製を
検出するためのプロトコルを、確立し得る。ウイルスDNA合成は、アデノウイ
ルス早期遺伝子のデノボでの発現後のみ生じ得る。部位特異的メチル化ストラテ
ジーを、感染細胞内でのウイルスDNA複製をモニターするために利用する(N
elson,J.ら、1997、Journal of Virology、7
1:8902−07)。メチル化で印を付けられたアデノウイルスは、XhoI
部位(CTCGAG)のアデニン塩基のN6部位上のメチル基の付加により、X
hoIイソシゾマーPaeR7メチルトランスフェラーゼ(PMT)を発現する
HeLa細胞またはA549細胞におけるウイルスの伝播によって作製され得る
(Kwoh,T.J.ら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 83,7713−7717)。メチル化は、ベクター作製に影響しない
が、XhoIによる切断を妨げることは、公知である。ウイルス複製を介するメ
チル化の欠失は、XhoI切断を回復し、そしてネイティブな非メチル化ウイル
スゲノムとの比較において感染細胞由来のゲノムDNAのサザンブロットによっ
て検出され得る。
ham,T.J.ら、1993,Cell.73:309−319)。予備実験
において、本発明者らは、標識したAd5ビリオンが、細胞あたり400pfu
のMOIで4℃で45分間後にHeLa細胞への結合において平衡に達した。結
合研究について、3.5×105細胞を、100μlの氷冷接着緩衝液(2mM
MaCl2、1% BSA、および20mM HEPESで補充したダルベッ
コ改変イーグル培地)においてAd5について400pfu/cellのMOI
に相当する等量の[3H]−標識化アデノウイルスOD粒子とともに氷上で1時
間インキュベートした。次に、この細胞を、1000×gで4分間遠心分離によ
ってペレット化し、そして0.5mlの氷冷PBSで2回洗浄した。最後の洗浄
後、この細胞を、1500×gでペレット化し、上清を除去し、そして細胞に結
合した放射能を、シンチレーションカウンターによって決定した。細胞あたりに
結合したウイルス粒子の数を、ビリオン特異的放射能および細胞数を用いて算定
した。インターナリゼーション[3H]−標識アデノウイルス粒子の画分を決定
するために、細胞を、上記のように対応するウイルスとともに氷上で1時間イン
キュベートし、PBSで洗浄し、100μlの接着緩衝液中に再懸濁し、次いで
37℃で30分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞を、冷
0.05%トリプシン−0.5mM EDTA溶液で3倍に希釈し、そしてさら
に5〜10分間37℃でインキュベートした。この処置は、99%の結合した放
射能を除去した。最後に、この細胞を、1500×gで5分間ペレット化し、上
清を除去し、そして1分あたりのプロテアーゼ耐性数を測定した。このプロトコ
ルは、インターナリゼーションデータがレセプター再生により影響された可能性
を最小化する(Rodriguez,E.,Everitt.E.1999,A
rch.Virol.144:787−795)。氷上でのAd粒子の細胞への
非特異的結合を、100倍過剰の未標識ウイルスの存在下で決定した。この値は
、0.1%未満のウイルス負荷を慣用的に示した。
−チミジンは、複製の間にウイルスDNAに取り込まれる。付着およびインター
ナリゼーションは、低温(0〜4℃)では、ウイルス細胞付着のみが起るが、こ
れに対して、インターナリゼーションはより高温でのインキュベーションが必要
であるという観察の利点を利用することによって実験的に分離し得る。細胞あた
りの付着またはインターナリゼーションされた粒子数を、ビリオン特異的放射能
を使用して算定し、そしてAd3、4、5、9、35、および41の、CD34
+細胞、K562細胞、HeLa細胞およびCHO細胞との相互作用を定量する
ために用いた(図12)。この血清型は、その異なる細胞株に付着する能力およ
びその異なる細胞株によってインターナリゼーションされる能力において有意に
改変した。Ad5について、試験された細胞株への付着の程度は、CAR発現の
レベルと相関した。Ad5感染に対して無反応性を以前に示したCHO細胞にお
いて、付着およびインターナリゼーションのレベルは、細胞あたり約50〜70
ウイルス粒子であった。この数を以後、所定の細胞型のAd5についての感受性
に関して陰性と仮定した。他の血清型のCHO細胞との相互作用は、有意により
高くなかった。これは、対応するレセプターが、CHO細胞上に非存在であるこ
とを示した。試験した全ての血清型は、HeLa細胞と相互作用し、Ad3およ
びAd35が最も効果的な改変体であった。HeLa細胞上の明白なAd3レセ
プターおよびA35レセプターの存在は、以前に実証された(Stevenso
n,S.C.ら、1995,J.Virology.69:2850−2857
)。Ad4、5、および41は、K562細胞に付着しなかった。対照的に、A
d9ならびにサブグループBのメンバー(Ad3およびAd35)は、K562
細胞と効率的に相互作用し、Ad35が、最も多い付着粒子およびインターナリ
ゼーション粒子を有した。Ad5と比較して、約25倍多いAd35粒子が付着
し、これらの3/4が、K562細胞によってインターナリゼーションされた。
CD34+細胞とのウイルス相互作用は、一般的により弱い。試験した血清型中
、Ad9およびAd35のみが、非循環CD34+細胞によって有意にインター
ナリゼーションされた。Ad9およびAd35のインターナリゼーションを、そ
れぞれ、Ad5粒子についてよりも4倍および8倍効率的であった。CD34+
細胞によってインターナリゼーションされたAd35ビリオンの数は、Ad5ベ
ースのベクターで容易に感染され得るHeLa細胞におけるAd5について見ら
れた数のほとんど半分であった。
3細胞およびCHO細胞への付着およびインターナリゼーション) ヒトアデノウイルスのための第1レセプターおよび第2レセプターを高レベル
で発現するHela細胞および293細胞を、ウイルス付着およびインターナリ
ゼーションのための陽性コントロールとして用いる。陰性コントロールとして、
CHO細胞を用いる。CHO細胞は、検出可能なレベルで第1のアデノウイルス
レセプターを発現せず、従って、アデノウイルス感染に対して無反応性である。
付着研究のために、これらの接着細胞株を、PBS−EDTA溶液(Ca2+お
よびMg2+を含まない)を用いて10cm皿から離し、氷冷PBSを用いて3
回洗浄し、接着緩衝液中に再懸濁し、そして実施例の節において上記のようにウ
イルスとインキュベートする。予期したように、試験した全てのアデノウイルス
血清型は、Hela細胞に効率的に付着され、そしてインターナリゼーションさ
れる(表III)(図13)。アデノウイルス血清型3、5、35、41は、2
93細胞により効率的に付着し、そしてインターナリゼーションされるが、アデ
ノウイルス血清型9では、このようにならない。対照的に、ほとんどのアデノウ
イルス血清型の乏しい付着およびインターナリゼーションが、CHO細胞で観察
される。CHOに対する付着のレベルは、アデノウイルス血清型5および41に
ついて細胞あたり約50〜70ウイルス粒子であり、アデノウイルス血清型3に
ついては、細胞あたり115ウイルス粒子であり、そしてアデノウイルス血清型
9および35については細胞あたり約180粒子である。さらなる分析について
、効率的なアデノウイルスの形質導入のための特定の細胞株の感受性に関して、
細胞あたり300より多い数のウイルス粒子は、陽性として仮定され、そして細
胞あたり70未満の数のウイルス粒子は、陰性として仮定される。
細胞およびK562赤白血病細胞株への付着およびインターナリゼーション) 以前の研究は、ヒト赤白血病細胞株K562が非常に高いMOIでAd5ベー
スのアデノウイルスベクターで形質導入され得ることを示した。図14において
示されるように、400のMOIでアデノウイルス血清型5の細胞あたり約60
のウイルス粒子のみがこれらの細胞に付着し、さらにより少ない粒子がこれらの
細胞にインターナリゼーションされる。Ad5とは対照的に、Ad9の細胞あた
り約320のウイルス粒子およびAd35の細胞あたり1500のウイルス粒子
が、K562細胞に付着し、そしてそれらの約2/3がインターナリゼーション
される(図14B)。凍結ストックから得られたヒト未刺激CD34+富化骨髄
細胞を、サイトカイン刺激なしで増殖培地において一晩インキュベートする。次
の日、生存可能な細胞数を、算定する。付着研究のために、細胞を、氷冷PBS
で3回洗浄し、接着緩衝液中に再懸濁し、そしてアデノウイルスとともにインキ
ュベートする。試験したアデノウイルス血清型中、Ad9のアデノウイルス粒子
(細胞あたり約150のウイルス粒子)およびAd35(細胞あたり約320の
ウイルス粒子)のみが、Ad5(細胞あたり60のウイルス粒子のみ)と比較し
てこのレベルで未刺激CD34+細胞に付着し得る。これらのうち4/5のウイ
ルス粒子が、この細胞によってインターナリゼーションされ得る。興味深いとに
、CD34+細胞のGM−CSFおよびEPO/TPOでの2週間の刺激におい
て、Ad9ウイルス粒子の付着およびインターナリゼーションは、有意に増加す
る(細胞あたり300粒子まで)。同時に、細胞のGM−CSFでの2日間の一
過性の刺激は、この細胞へのウイルスの付着のレベルを上昇し得なかった。
に付着し、そしてインターナリゼーションし得るという上記の発見に基づいて、
血清型Ad35を、さらなる研究のために選択した。添付物IIに記載のように
、Ad5キャプシド中に短Ad35ファイバー配列を含むキメラベクター(Ad
5 GFP/F35)は、CAR/インテグリン非依存性様式で広範囲のCD3
4+細胞を標的化し得た。
K562細胞およびCD34+細胞との最も効率的な付着およびインターナリゼ
ーションを実証した。付着/インターナリゼーションデータに基づいて、サブグ
ループDおよびBの代表としてAd9およびAd35を、さらなる親和性研究の
ために選択した。
け) Ad5、ならびにAd9およびAd34の、293細胞、K562細胞および
CD34+細胞における感染および複製のための比較分析。Ad9ファイバーノ
ブドメインが比較可能な親和性を有するAd5として細胞表面上の同一の主要な
レセプターを認識する能力が以前に記載された。従って、Ad9ウイルス粒子が
、293細胞に弱く付着し得るだけという発見は、むしろ予期されない。どのよ
うに付着およびインターナリゼーションデータが異なる血清型のアデノウイルス
の生物学的活性を反映するかを見出すために、Ad5、Ad9およびAd35の
ストックを、293細胞に対する電子顕微鏡、プラークアッセイ、ならびにK5
62細胞およびCD34+細胞における定量的複製アッセイによってより詳細に
特徴付ける。
ランスフェラーゼイソシゾマーPaeR7を発現する293細胞において増幅さ
れた異なるMOIのAd5、9、35を含む100μlの増殖培地において感染
した(Nelson,J.,Kay,M.A.1997,Journal of
Virology.71:8902−8907)。37℃でのインキュベーシ
ョンの2時間後、この細胞を、1000×gで5分間遠心分離し、このウイルス
含有培地を、除去した。この細胞を、100μlの新鮮な培地に再懸濁し、次い
でそれらを収集するまで37℃でインキュベートした。K562細胞について感
染から16時間後、またはCD34+細胞について感染から36時間後に、5μ
gのpBS(Stratagene,La Jolla,CA)プラスミドDN
Aを、キャリアとして添加した。このキャリアはまた、負荷コントロールとして
も使用され得る。ゲノムDNAを、以前に記載のように抽出した(Lieber
,A.,C.−Y.ら、1996,Journal of Virology.
70:8944−8960)。精製した細胞性DNAの1/4(2.5×104
細胞に相当する)を、HindIII、XhoIを用いて、またはHindII
IおよびXhoIを一緒に用いて37℃で一晩消化し、その後、1%アガロース
ゲルにおいて分離し、続いてキメラAd5/9DNAプローブまたはAd5/3
5DNAプローブを用いてサザンブロットを行った。Ad5およびAd9(Ad
5/9)またはAd5およびAd35(Ad5/35)の配列を含むこのキメラ
プローブを、Pfu−Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene
,La Jolla,CA)および鋳型として精製した粒子由来のウイルスDN
Aを用いる2段階PCR増幅によって作製した。以下のプライマーを、PCRの
ために使用した(Ad5配列およびヌクレオチド番号には、下線を付した):
73260/M29978、Ad9についてはX74659、およびAd35に
ついてはU10272)から入手した配列に従って与える。第1の増幅の後、フ
ァイバー遺伝子に対応する968bp長のAd9 DNAフラグメント、859
bp長のAd35 DNAフラグメント、ならびにAd5 E4領域(Ad5フ
ァイバー遺伝子の直ぐ下流に位置する)に対応する876bp長のAd5フラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動によって精製した。キメラDNAプローブを
作製するために、増幅されたAd5DNAを、第1段階のPCR中に得られたA
d9フラグメントまたはAd35フラグメントと混合し、Ad5/9FまたはA
d5/35FプライマーおよびAd5R1プライマーを用いて第2のPCR増幅
に供した。得られるAd5/9キメラDNAフラグメントまたはAd5/35キ
メラDNAフラグメント(図15を参照のこと)を、精製し、そしてそれらの濃
度を、分光光学的に測定した。対応するキメラDNAフラグメントを、濃度標準
としてアガロースゲルにロードするか、または[32P]−dCTPで標識し、そ
してサザン分析のためのプローブとして使用した。DNAサンプルあたりのウイ
ルスゲノムの数を定量的Phospho−imager分析後に算定した。予備
実験において、キメラDNAプローブの、任意の特定のウイルス血清型のDNA
への優先的ハイブリダイゼーションを、検出しなかった。
または異種遺伝子発現を可能にするウイルス形質導入(遺伝子移入としてしばし
ば定義されるプロセス)を最終的に証明しない。エンドソーム溶解、核への輸送
、およびウイルスゲノムの核の取り込みを含む細胞内トラフィッキングは、構造
キャプシドタンパク質に依存し、従って異なる血清型間で変化する(Defer
,C.ら、P.1990,J.Virology,64:3661−3673;
Miyazawaら、1999,J.Virology,73:6056−60
65)。本発明者らは、ウイルス遺伝子発現の分析がウイルスゲノムの首尾よい
核の取り込みを証明することを意味し、そしてこれは、本発明者らの標的細胞を
効率的に感染し得る血清型の選択のための優れた基準であると考えた。この分析
を行うために、本発明者らは、感染細胞におけるAd複製の検出を可能にするプ
ロトコルを使用した。ウイルスDNA合成は、アデノウイルス初期遺伝子のデノ
ボでの発現後に生じ得るのみである。本発明者らは、感染細胞におけるウイルス
DNA複製をモニターするために部位特的メチル化ストラテジーを利用した(N
elson,J.,Kay,M.A.1997,Journal of Vir
ology.71:8902−8907)。メチル化Ad血清型を、XhoIイ
ソシゾマーPaeR7メチルトランスフェラーゼ(PMT)を発現する293細
胞(Kwoh,T.J.ら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA 83,7713−7717)(293 PMT細胞)におけるウイル
スの伝播の間、XhoI部位(CTCGAG)のアデニン塩基のN6位上へのメ
チル基の付加によって産生した。ウイルス複製を介するメチル化の欠失は、Xh
oI切断を回復し、そして感染細胞由来のXhoI消化したゲノムDNAのサザ
ンブロットによって検出され得る。
62細胞およびCD34+細胞において行った。複製研究について、感染力価(
pfu/ml)およびゲノム力価(ゲノム/ml)を、メチル化および非メチル
化のAd5、Ad9、およびAd35について(それぞれ、293細胞における
プラークアッセイによってか、または定量的サザンブロットによって)決定した
(表2)。ゲノム力価に対するpfuの比は、メチル化および非メチル化したウ
イルスについて比較可能であった。このことにより、DNAのメチル化が形質導
入特性を改変しなかったことを実証した。感染に使用される(Ad5、9、およ
び35)ウイルスの約85%を、ウイルス負荷において存在するメチル化および
非メチル化したウイルスDNAに特異的なフラグメントの強度に基づいて算定し
たとおりメチル化した(図15)。付着(1時間、0℃)またはインターナリゼ
ーション(2時間、37℃)後に検出されたゲノム数は、図12に示される研究
と十分に相関した。Ad9およびAd35は、K562細胞およびCD34+細
胞と、Ad5より効率的に相互作用した。K562細胞およびCD34+細胞に
おける用量依存性複製研究を、同一のゲノム数のAd5、9、および35を用い
て行った(図15)。複製率を、異なるMOI(細胞あたり2100、420、
および105のゲノム)で感染後の、ウイルスDNAのメチル化から脱メチル化
への速度に基づいて測定した。K562細胞において、効率的な複製(メチル化
DNAから非メチル化DNAへの100%の変換)を、MOI>/=2100で
Ad5について、MOI>/=420でAd9について、およびMOI>/=1
05でAd35について検出した。これは、Ad35が、最も高い効率でK56
2細胞に形質導入することを実証した。CD34+細胞において、複製率は、M
OI420で感染後、Ad5について100%およびAd9について31%であ
った。メチル化したAd35ウイルスDNAがCD34+細胞において存在する
が、ウイルスの複製は、Ad35について検出されなかった。要約すると、K5
62細胞におけるウイルス複製研究は、Ad5、9、ならびに35の付着および
インターナリゼーションについて得られたデータを確認する一方、以前の結果と
CD34+細胞におけるAd9および特にAd35の乏しい複製との間に矛盾が
存在した。以下で概説するように、異種細胞集団(CD34+細胞のような)に
おける複製分析は、特定の血清型の親和性に対する決定的な結果を与え得ない。
562細胞およびCD34+細胞について強力な親和性を有する改変体として現
れる。Ad9はCARに付着し得るが、細胞侵入のためにαv−インテグリンを
優先的に用いる(Roelvink,P.W.ら、1996,J.Virolo
gy.70:7614−7621)。この侵入ストラテジーは、CD34+細胞
の効率的な感染のために最適であり得ない。なぜなら、その細胞の17%未満だ
けがαv−インテグリンを発現するからである(図10)。従って、本発明者ら
は、Ad5骨格に基づくキメラベクターの構築のために用いられる異種ファイバ
ーのための供給源としてAd35に焦点をあわせることを決定した。
付着およびインターナリゼーションについて得たデータを確認した。しかし、C
D34+細胞における相互作用データと複製データとの間には矛盾が存在した。
ここでは、Ad9は、ほんのわずかにしか複製されず、そしてAd35について
は、複製は全く見られなかった。Ad複製は、初期ウイルスタンパク質の重要な
開始の産物によってのみ開始され、次には、感染した細胞の核に存在するウイル
スゲノムの数に直接依存する。従って、複製研究の結果は、ウイルスゲノムの核
輸送の速度により、ウイルスプロモーターの活性により、および/またはウイル
スDNA/RNAの細胞内安定性により、影響され得る。これらのパラメーター
は、一方では、CD34+の異なるサブセットの間で、および/または、他方で
は、異なるAd血清型の間で、変化し得る。結論として、CD34+細胞におけ
る異なるAd血清型を用いて実施したウイルス複製分析では、Ad5骨格に基く
キメラベクターの実際の形質導入特性を予測できない。このことは、Ad5以外
のAdゲノムに基いて遺伝子移入ベクターを産生する試みは慎重に行われるべき
であるということを意味する。
S皮質細胞またはヒト臍帯静脈内皮細胞に対して親和性を有する改変体が同定さ
れている。感染後48時間のヘキソン産生についての免疫組織化学に基いて、至
適の血清型(Ad17)を選択した(Chillon,Mら、1999.J.V
irology.73:2537〜2540)。しかし、このアプローチは、問
題がある。なぜなら、少なくとも本発明者らの場合は、Ad5ヘキソンに対して
生じた抗体は、他の血清型と交差反応しなかったからである。また、ヘキソンは
、複製の開始後にのみ発現する。上記に概説したように、細胞内移動の動態、ウ
イルス遺伝子発現、および複製は、血清型の間で有意に異なる(Defer,C
ら、P.1990.J.Virology.64:3661〜3673;Miy
azawaら、1999.J.Virology.73:6056〜6065)
。
、Ad35はまた、興味深い。なぜなら、AD35は、Ad5およびAd3とは
異なるレセプターと相互作用するからである。Ad35およびAd5GFP/F
35付着は、Ad5または抗CAR抗体によって阻害されなかった。このことは
、Ad35付着がCARに依存しないことを示唆する。第1に、Ad5は、イン
ターナリゼーションおよび感染の間、Ad35およびAd5GFP/F35と競
合しなかった。このことは、αωβ3/5インテグリンがウイルス進入に関与しな
いことを示す。第2に、αvインテグリンに対する機能ブロッキング抗体は、K
562細胞へのインターナリゼーションについて、Ad35およびAd5GFP
/F35と競合しないが、これらの抗体はAd5インターナリゼーションを阻害
する。そして第3に、Ad5に基くベクターと比較して、Ad5GFP/F35
での感染後のGFP発現は、αvインテグリン発現CD34+細胞に限定されな
い。これらの事実から、本発明者らは、Ad35およびキメラAd5GFP/F
35ベクターでの感染がαvインテグリンに関与しないと結論する。この文脈に
おいて、Ad35ペントンベース内のRGDモチーフの存在または非存在は、対
応するゲノム領域を配列決定することにより決定されねばならないままである。
交差競合(cross−competition)アッセイは、Ad35および
Ad5GFP/F35が、Ad3レセプターとは異なるレセプターに付着するこ
とを実証した。Ad3およびAd35は同じサブグループに属するが、このサブ
グループは、2つのDNA相同なクラスターであるB1およびB2に分けられて
いる;それらのファイバーを構成するアミノ酸は、相同性が60%しかない。さ
らに、両方のウイルスについての標的組織は、異なる;Ad3は、急性呼吸器感
染を生じ得るが、Ad35は、腎臓感染と関連している(Horwitz,M.
S.1996.Adenoviruses,p2149〜2171.、B.N.
Fields,Knipe.D.M.,Howley,P.M.(編),Vir
ology、第2巻,Lippincott−Raven Publisher
s Inc.,Philadelphia)。従って、Ad3およびAd5が異
なるレセプターを認識することが見られても驚くことではない。
グリン非依存性径路により細胞に侵入する。本発明者らは、Ad35およびキメ
ラベクターは、主にそのファイバーレセプターに付着し、そしてこの相互作用は
、インターナリゼーションを誘発するのに十分であると考えている。他方では、
Ad35インターナリゼーションは、αvインテグリン以外の細胞性タンパク質
に関与し得る。これらの膜タンパク質は、Ad3インターナリゼーションのため
のタンパク質および代表的β2インテグリン(αvインテグリンよりも細胞表面
から突出する)と重複し得る(Huang、Sら、1996.J.Virolo
gy.70:4502〜4508)。
全てのアデノウイルス血清型についての不完全粒子のパーセンテージは、5%を
超えなかった。しかし、プラークアッセイにより、293細胞中でプラークを形
成する能力が、試験した血清型については有意に異なることが示される。得られ
た光学粒子対PFU(OPU/PFU)の比は、Ad5について13である。こ
の値は、このアデノウイルス血清型について以前に見積もられた比と良好に一致
する。重要なことに、この比は、アデノウイルス血清型35については約3倍高
く、そしてアデノウイルス血清型9については150倍高い。さらに、キメラA
d5/9DNAプローブおよびAd5/35DNAプローブを用いる定量的サザ
ンブロットを用いて、ゲノムと形質転換力価との間の比を決定する。この研究に
より、プラーアッセイにより得られたデータを確認する。K562細胞およびC
D34+細胞におけるこれらのアデノウイルスの定量的複製アッセイによっても
、Ad9およびAD34がこれらの細胞型により効率的に付着する能力を確認す
る。ウイルスゲノムの複製が、Ad9およびAD34について、Ad5に比べて
、低い感染MOIで観察される。結論として、付着およびインターナリゼーショ
ンについて異なる血清型で得られたデータは、標的細胞における感染性データと
良好に一致している。
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーション) 原理的には、Ad5感染に不応性である他の重要な標的細胞については、血清
型スクリーニングストラテジーを用い得る。
目的とするアプローチのための標的となるべき内皮細胞である。MCF−7細胞
は、肝臓転移から単離された乳癌細胞であり、腫瘍の遺伝子治療についての重要
な標的である。ヒトアデノウイルス血清型3、5、9、35および41を試験し
て、それぞれの血清型が、マウス初代樹状細胞、JAWSII細胞、MCF−7
ヒト乳癌細胞およびREVC内皮細胞に付着し得るか、そしてインターナリゼー
ションし得るか否かを確認する。試験したいずれのアデノウイルス血清型も、初
代樹状細胞には効率的に付着し得ない。アデノウイルス血清型3は、REVC内
皮細胞に効率的に付着し得る(1細胞あたり約400ウイルスが付着し、そして
約300ウイルスがインターナリゼーションする)。対照的に、Ad5粒子は、
わずか50しか付着し得ず、そしてこれらのREVCにはなおわずかしかインタ
ーナリゼーションしない。ヒト乳癌細胞(MCF−7)は、低MOIでの、AD
5感染に対しては不応性であることが以前に示されている。しかし、Ad3は、
そしてAd35は、より効率的に、MCF−7細胞に付着し、そしてインターナ
リゼーションする。
細胞レセプターを認識し、従って、Ad5感染に対して不応性である細胞型に感
染し得ることを示す。ヒトCD34+細胞、REVC、K562およびMCF−
7細胞に対して、Ad5よりも効率的に付着し、そしてインターナリゼーション
し得るアデノウイルス血清型が存在する。この知見は、Ad5ベクターが他の血
清型に由来するレセプターリガンドを含む、キメラアデノウイルスベクターの構
築についての基礎を提供する。
るために患者において標的とされるべき、最終的な造血幹細胞についての適切な
モデルを示さないので、最初の感染/再標的化研究のためには、正常な初代ヒト
骨髄細胞を用いる。
いて、骨髄細胞懸濁物全体が事前選択なしに用いられ得る。これは利点である。
なぜなら、種々のアデノウイルス血清型または遺伝子再標的化ベクターの親和性
は、骨髄系列、赤血球系列、巨核球系列、リンパ球系列、樹状細胞系列および単
球系列を意味する広範なスペクトルの前駆体小集団上で分析され得るからである
。短期間(<5時間)の感染研究のために、細胞の生存度を保証するため、10
%FCS、βメルカプトエタノールおよび10u/mlのIL−3を補充した、
IMDM中で骨髄懸濁物を培養する。
細胞の種々のアデノウイルス型とともに、短時間インキュベートし得る。感染し
た骨髄細胞のパラフィン切片またはサイトスピン(cytospin)を、核局
在化、標識ウイルスDNAについて分析し得る。BrdU標識は、抗−BrdU
抗体での免疫蛍光により可視化され得る;32P−標的化ウイルスDNAは、光−
エマルジョンでのインキュベーションにより検出され得る。さらに、特異的組織
染色(例えば、Wright−Hemo3染色)後、小細胞物質を形態学的に分
析し得る。所望の場合、異なる蛍光色素(FITC(緑)、TRIT、RPE(
赤)、RPE−Vy5、AMCA(青))に直接付着体化した特定の細胞表面マ
ーカーに対して、市販の抗体を用い、感染した骨髄小集団を完全に特徴付け得る
。特定の細胞型のメンブレンマーカー表示感染(membrane marke
r signifying infection)を用いたBrdU標識ウイル
スDNAのコロニー化(例えば、FITCシグナルとして)が実証され得る;例
えば、潜在的な幹細胞/早期前駆体(CD34+,CD38+)、巨核球(CD
4la+)、赤血球系細胞(グリコホリンA+)、樹状細胞(CDla+)、単
球(CD14+)、または骨髄細胞(CD15+)など。感染骨髄サブセットの
形態学的分析により、特定のアデノウイルス血清型が最初の細胞型を標的し得る
か否かに関する最初の情報を得る。
いないので、そして、タグ化ウイルスDNAの検出は、生きた細胞上では行われ
得ないので、この時点で、クローン原性能力または再増殖能力について感染細胞
を特徴付けることは不可能である。従って、再標的化研究のためのアデノウイル
ス血清型を、各血清型が低MOIで、精製したCD34+細胞にインビトロで感
染する能力に基いて選択する。骨髄細胞のこのサブセットは、長期再構成する細
胞を含むことが公知である。異なるアデノウイルス血清型での感染研究は、上記
のように、精製されたCD34+細胞(IMDM+10% FCS,βメルカプ
トエタノールおよび10単位/ml IL−3において培養した)で繰り返され
得る。CD34+細胞の精製は、Papyannopoulou(Papyan
nopoulou Tら、1996、Experimental Hemato
logy,24:660−69;Papyannopoulou,Tら、199
3,Blood.81:229)に記載のように、抗CD34モノクローナル抗
体被覆化プレート上での、またはMiniMacsカラム上での直接免疫結合に
より実施され得る。単離されたCDC34+細胞の純度は、通常、80〜95%
にわたる。アナログ感染研究を、CD34+/CD38−サブセット上で選択し
たアデノウイルス型を用いて反復し得る。
、精製したCD34+細胞を感染させ、そしてウイルスDNA複製を分析し得る
。精製したヒト骨髄CD34+細胞の培養物を、HSCについてのモデルとして
、形質導入研究およびインテグリン研究に用い得る。
最近、実証された(Bathia,Mら、1998,Nature Medic
ine,4:1038〜45;Osawa,Mら、1996.Science.
273:242〜5;Goodell,Mら,1997,Nature Med
icine.3:1337〜45:Zanjani、E.D.ら、1998,E
xp.Hematology,26:353〜60)。Lin-CD34-38-
細胞を、SCID−NODマウスにおける再増殖アッセイと組合せて、再標的化
研究および形質導入研究において試験し得る。
対応するファイバー遺伝子のPCRクローニングおよび挿入) CD34+または他のHSC含有集団に対する親和性を有する1つまたはいくつ
かのアデノウイルスを、本明細書に記載のさらなる研究のために選択する。ファ
イバーについての完全なコード領域は、ウイルス型に依存して、1〜2kbの間
で変化する。配列をコードするファイバーは、選択されたウイルス型の精製され
た粒子から単離されたウイルスDNA由来のPfuポリメラーゼでのPCRによ
り得られ得る。対応するプライマーは、EMBL遺伝子バンクから入手可能なフ
ァイバー配列に基いて設計され得る。PCR産物をPacI−BAlIフラグメ
ントとしてpCD4(RecA+E.coliの組換えのためのシャトルベクタ
ー)にクローニングする(図10)。pCD4において、異種ファイバー遺伝子
は、Ad5配列と両側で隣接している。Ad5配列は、Ad5においてファイバ
ー読み取りフレームに直接隣接する領域に相同である。組換えのためのAd5(
シャトルベクター)誘導テンプレートとして、pBHG10(Microbix
,Toronto,Canada)誘導体であるpCD1を用い得る。組換えア
デノウイルス生成に慣用的に用いられるプロトコールに従って、組換え手順を実
施する(Chartier,Cら、1996,J.of Virology,7
0,4805〜4810)。慣用的に、得られたプラスミドの90%が、正確に
組み替えられる。異種ファイバー(X)とAd5配列との間の接合を配列決定し
て、組み込みの正確性を確認し得る。得られたプラスミドを、pAd5fibe
rX(pAd5fx)と名付ける。得られた産物を用いて、異種ファイバー遺伝子
を含む、pAd5fxに基くAd.AAVを生成する。
よびAd5GFP/F35(キメラAd5/35ファイバー遺伝子を含む)。両
方のアデノウイルスベクターは、Ad5のE3領域に挿入された、2.3kbの
CMVプロモーター誘導EGFP遺伝子[pEGFP−1(Clontech.
Palo Alto.CA)から誘導]を含んだ。EGFP発現カセットを、シ
ャトルプラスミド中のAd5配列25,191−28,191と30,818−
32,507との間にクローニングした。このシャトルプラスミドは、pBHG
10(Microbix,Toronto,Canada)について記載された
E3欠失を含んだ。得られたプラスミドをpAdGFPと名付けた。キメラベク
ターのために、pAdGFP中のAd5ファイバー遺伝子を、上記に概説した2
段階PCRプロトコールにより生成したAd5/35キメラファイバー遺伝子で
置換した。最初のPCR工程において、以下:i)Ad5ファイバー5’−非翻
訳領域およびファイバーテイルドメインの最初の132bp(ヌクレオチド30
,818−31,174)、ii)Ad35シャフトおよびノブドメイン(ヌク
レオチド132−991)、およびiii)Ad5ファイバーポリアデニル化シ
グナルを含むAd5 E4領域(ヌクレオチド32,775−33,651)に
相当する3つのDNAフラグメントをPfu−Turbo DNAポリメラーゼ
により増幅した。以下のプライマーを用いた:Ad5テイルについて、Ad5F
−2(ヌクレオチド30,798−30,825)5’−CGC GAT AT
C GAT TGG ATC CAT TAA CTA−3’(配列番号9)お
よびAd5R−2(ヌクレオチド31,174−31,153)5’−CAG
GGG GAC TCT CTT GAA ACC CAT T−3’(配列番
号10);Ad35シャフトおよびノブについて、プライマーAd5/35Fお
よびAd5/35R(上記参照);Ad5E4およびポリAについて、プライマ
ーAd5F−1およびAd5R−1(上記参照)。10のPCRサイクル後、ア
ガロースゲル電気泳動によりこの生成物を精製し、合わせて、次いで、プライマ
ーAd5F−2およびAd5R−1とともに第2のPCRに供した。得られた2
115bp長のキメラファイバー遺伝子は、Ad5テイルおよびAd35シャフ
トおよびノブドメインを含んだ。この生成物をpAdGFP中にフラグメントを
含むSalI/XbaI Ad5ファイバー遺伝子のための置換物として用いた
。得られたプラスミドをpAdGFP/F35と名付けた。全長E1/E3ベク
ターゲノムを生成するために、pAdGFPおよびpAdGFP/F35を、E
.coli中の組換えにより、pADHM4(Mizuguchi,H.,Ka
y,M.A.1998.Human Gene Therapy,9:2577
〜2538)に挿入した(Chartier,C.E.ら、1996.Jour
nal of Virology.70:4805〜4810)。これを行うた
めに、RecA+E.coli.株BJ5183を、XbaIフラグメントと混
合した、SrfIにより直線化したpAdHM4を用いて同時形質転換した。こ
のフラグメントはGFP遺伝子、Ad5またはAd5/35のファイバー遺伝子
、およびAd5相同領域を含む。得られた組換え体を制限分析により分析した。
正しい組換え体をE.coli HB101中で増幅し、そして2重CsCl勾
配結合により精製した。このプラスミドをpAD5GFPおよびpAd5GFP
/F35と名付けた。Ad5/35キメラファイバー遺伝子の正しい構造を、p
Ad5GFP/F35の一部をエンドヌクレアーゼ消化しそして配列決定するこ
とにより確認した。対応するウイルスを生成するため、記載(Lieber,A
,C.Y.ら,1996.Journal of Virology.70:8
944〜8960)のように、pAd5GFPおよびpAd5GFP/F35を
PacIで消化し、ウイルスゲノムを遊離し、そして293細胞に形質転換した
。プラークは、重層された培養物中で、トランスフェクション後、7〜10日発
達した。組換えウイルスを293細胞中で増殖させ、そして他に記載の標準的方
法(Lieber,A.C.−Yら、1996.Journal of Vir
ology.70:8944〜8960)により精製した。
釈した、Ad5、Ad35またはキメラAd5GFP/F35ビリオンの各25
μlを、96ウェルプレートにロードした。各稀釈に、25μlの1%サル赤血
球懸濁液(McIlvaine−NaCl緩衝液)を添加した。37℃1時間の
インキュベーション後、沈降パターンを決定した。全ての試験を、少なくとも2
つの独立した実験において4連で実行した。
ョンを、前記のように実施した(Lieber,A.,C−Y.ら、1996.
Journal of Virology,70:8944〜8960)。
更するのに十分であることが示されている(Chillon,Mら、1999.
J.Virology.73:2537〜2540;Krasnykh,V.,
ら、1998.J.Virology.72:1844〜1852;Steve
nson,S.C.ら、1997.J.Virology.71:4782〜4
790)。上記で概説したように、ファイバーシャフトの長さは、特定の血清型
の進入ストラテジーを決定的に決し得る。従って、本発明者らは、Ad5ファイ
バーノブだけでなく、シャフトも置換することを決めた。このキメラAd5/3
5ファイバーは、7βシートおよびノブとともにシャフトを含む、Ad35由来
の279アミノ酸に結合したAd5ペントン塩基との相互作用に必要なAd5テ
イル(アミノ酸:1〜44)を含んだ(図16A)。内因性Ad5ファイバーポ
リAシグナルを用いて、キメラファイバーRNAの転写を終止した。ペントン塩
基を含むRGDモチーフを含むAd5カプシドと短シャフト化ファイバーの組合
せは、危険であり得る。なぜなら、ファイバーノブとRGDモチーフとの間の自
然な距離は妨害されているからである。E1/E3欠失Adベクターに基くキメ
ラファイバー配列でAd5ファイバーを置換した。このベクターは、挿入された
CNVプロモーター−GFPレポーター遺伝子カセットをE3領域に運んだ。対
応するキメラウイルス(Ad5GFP/F35)を、1mlあたり2×1012ゲ
ノムの力価で、293細胞において産生した。比較のために、もともとのAd5
ファイバー遺伝子およびGFP発現カセットを含むE1/E3欠失Adベクター
を作成した(Ad5GFP)。自然の粒子対感染粒子の力価および比は、Ad5
GFPとAd5GFP/F35との間で類似であり、このことは、ファイバー改
変が、キメラベクターの安定性および/または増殖特性を有意に変更しなかった
ことを示す。ファイバー改変の正確さを、Ad5GFP/F35ウイルスゲノム
の制限分析により、続いて、サザンブロットハイブリダイゼーション(図16B
)、ファイバーコーディング領域の直接配列決定、およびサル赤血球の血球凝集
反応(HA)についての機能試験により確認した。赤血球の凝集は、ファイバー
ノブ媒介である:AD5は、サル赤血球を凝集しないが、Ad35は効果的に凝
集することが公知である(Pring−Akerblom.Pら、1998.J
.Virology.72:2297〜2304)。HA試験において、Ad5
GFP/F35は、1:512までの稀釈で、Ad35と同じ効率でサル赤血球
を凝集した。対照的に、Ad5の等価の稀釈では血球凝集反応は観察されなかっ
た。このことは、Ad5カプシドに組み込まれたキメラAd5/35ファイバー
の機能的活性を明確に確認した。
能であり、そして高力価で産生され得る(Krasnykh,Vら、1996,
J.of Virology,70,6839〜6846;Stevenson
,S.C.ら、1997.J.Virology.71:4782〜90)。本
明細書において記載されるファイバー置換物がアデノウイルスの産生または安定
性に影響するか否かを試験するため、2つのE1欠失第1生成物であるアデノウ
イルスベクターを、標準的プロトコールを用い、293細胞におけるAAVβg
alカセットを用いて生成する。このベクターを、pCD1(内因性Ad5ファ
イバーを含む)を用いたpAd.AAV−BG(図17)の組換えにより生成す
る;他のベクター(異種ファイバーを有する)は、pAd.AAVβGalおよ
びpAd5fiberX(pAd5fx)の組換え産物である。単一のプラークに
由来するウイルスを、293細胞で増幅する。1つの293細胞についての産生
収率は、293細胞溶解物のプラーク滴定(plaque−titering)
により決定し得る。ファイバー改変は、キメラベクターの安定性に深刻な影響は
しないことが理解される。結局、骨髄細胞は、再標的化ベクターで感染され得る
。感染の2日後、基質としてフルオレセインジ−D−ガラクトピラノシド(FD
G)を用いて、β−gal発現について、生細胞サイトメトリーを実施し(Ca
ntwell,M.J.ら、1996 Blood 88,4676〜4683
;Neering,Sら、1996,Blood 88:1147〜55;Fi
ering,S.N.ら、1991,Cytometry,12:291;Mo
hler,Wら、1996.PNAS,93:57)、そして、感染した細胞を
形態学および表面マーカーについて特徴付ける。感染の前および感染の間、HS
Cの生存を支持する、トロンボポエチン(Tpo)を補充したIMDM/FCS
中で、骨髄細胞を培養し得る(Matsunaga,Tら、1998,Bloo
d,92:452〜61;Papayannopoulou,Tら、1996,
Experimental Hematology,24:660〜69)。あ
るいは、再標的化したベクターは、AAv−GFP(グリーン蛍光タンパク質)
カセットで生成され得、そしてGFPおよび表面マーカー発現に基いて、形質導
入された細胞上でFACS分析を実施し得る。
/F35との間の交差競合研究(図18)を行い、標的細胞を感染するためにキ
メラベクターによって使用される経路をより詳細に研究した。野生型Ad35お
よびキメラベクターAd5GFP/F35は、K562細胞への付着について互
いに競合する場合、同じ第1のレセプターを認識し得る(図19A、上のパネル
)。この第1のレセプターは、Ad5によって使用されるレセプターとは異なる
。なぜなら、Ad5ウイルス粒子も抗CARモノクローナル抗体も(図19B、
上のパネル)、Ad35もAd5GFP/F35の付着も抑止し得ないからであ
る。インターナリゼーションについての競合研究において、Ad35およびAd
5GFP/F35は、互いに等しい効率で競合した。Ad5および抗αV−イン
テグリンモノクローナル抗体(L230)(図19C、D;下のパネル)は、A
d35およびキメラウイルスのインターナリゼーションを阻害しなかった。この
データを強固にするために、抗CARまたは抗αV−インテグリンモノクローナ
ル抗体を用いた細胞の前培養後に、K562細胞を、Ad5GFPおよびAd5
FGP/F35で感染し、続いてGFP発現細胞を分析した。この形質導入デー
タは、付着/インターナリゼーション研究において得られた結果を反映する。要
約すれば、これは以下のことを実証する:Ad35およびAd5GFP/F35
は、K562細胞の感染のためにCARおよびαV−インテグリン−依存性経路
を使用する;これらの特異的な特徴の原因となる構造的エレメントは、Ad35
ファイバー内に位置し、そしてファイバーの置換によってAd5へ移植され得る
。
35は、同じサブグループ(B)に属するが、これらのファイバーのアミノ酸配
列間の相同性は、約60%のみである。従って、本発明者らは、Ad3が付着お
よびインターナリゼーションについてAd35およびAd5GFP/F35と競
合し得るかどうかを試験することを決定した(図20)。これらの研究は、Ad
35の付着が、Ad3によって阻害されなかったことを実証し、異なるレセプタ
ーの使用を示す。興味深いことに、Ad3は、Ad5GFP/F35の付着をわ
ずかに阻害した(図20A、左のパネル)。Ad35およびAd5GFP/F3
5ファイバーのための共通するレセプターへの付着に加えて、キメラカプシド(
例えば、Ad5ペントンRGDモチーフ)はまた、Ad3の付着に関連するエレ
メントンと重複する第2の細胞性レセプターと相互作用し得る。インターナリゼ
ーションについての交差競合において、Ad35およびキメラウイルスとの37
℃での細胞の前培養は、[3H]標識Ad3のインターナリゼーションを有意に
減少した(図20D、右のパネル)。逆の実験において、競合者としてのAd3
は、Ad35およびキメラウイルスの両方についてインターナリゼーションのレ
ベルを30%減少した(図20B、右のパネル)。予想どおりに、Ad5および
Ad3は、付着およびインターナリゼーションについて競合しなかった。上に示
されるように(図19B)、抗CARおよび抗αV−インテグリン抗体は、K6
52細胞とのAd3のインターナリゼーションをブロックしなかった。要約すれ
ば、本発明者らは以下のことを結論した:Ad35およびAdGFP/F35は
、Ad3のレセプターとは異なるレセプターに付着するが、それらは、インター
ナリゼーションに共通の構造的エレメント(αV−インテグリンとは異なる)を
使用し得る。
細胞を感染することが確立された。以下のことが可能である:この特性は、CA
RおよびαV−インテグリンをほとんど発現しない非サイクリング(cycli
ng)CD34+細胞の効率的な形質導入を可能にする。これを試験するために
、Ad5GFPおよびAd5GFP/F35ベクターの形質導入の特性を、CD
34+細胞、K562およびHeLa細胞について分析した。図21は、感染に
使用されたMOIに依存する形質導入されたGFP発現細胞のパーセントを示す
。およそ100%のHeLa細胞を、25以上のMOIでAd5GFPおよびA
d5GFP/F35を用いて形質導入した。95%より多くのK562細胞を、
100以上のMOIでAd5GFP/F35で形質導入したが、形質導入率は、
Ad5で有意により低かった。ここで400のMOIでの感染後、形質導入率は
増加し、約70%のGFP−陽性細胞でMOIはプラトーに達した。CD34+
細胞の形質導入は、Ad5GFP/F35で、Ad5GFPよりも、分析された
すべてのMOIで約3倍より効果的であった。興味深いことに、より高いMOI
で、形質導入率は、ウイルス用量に伴い比例的に増加せず、そしてすぐにプラト
ーに達した。このことは、両方の場合において、CD34+細胞の特定のサブセ
ットのみが感染を許容したことを示した。これらの特性をより詳細に特徴付ける
ために、許容的なサブセットのさらなる形質導入研究を行った。第1に、GFP
発現細胞のパーセントを、αV−インテグリンまたはCARについて染色された
CD34+画分で決定した(図22)。小数のCAR陽性CD34+細胞は、正
確な同時標識研究を複雑にし、そしてCAR発現と、Ad5GFPまたはAd5
GFP/F35で感染されたCD34+細胞のうちの形質導入された細胞の割合
との間の相関は存在しなかった。興味深いことに、Ad5GFPについては、す
べてのGFP発現細胞の65%が、αV−インテグリンについて陽性であったが
、キメラウイルスで感染されたGFP陽性細胞の22%以下は、□V−インテグ
リン発現について陽性に染色された。全体のCD34+集団の17%のみが、A
d5GFPの感染後にGFPを発現しが、CD34+/□V−インテグリン陽性
画分におけるGFP発現細胞のパーセントは、50%であった。これは、以下の
ことを示す:Ad5GFPベクター媒介性GFP発現は、αV−インテグリン陽
性CD34+サブセットに優先的に局在化したが、Ad5GFP/F35ベクタ
ーでの感染後、GFPはCD34+細胞の広い領域に発現し、それらのほとんど
はαV−インテグリン−陰性であった。
カーについて同時に分析した。上記のように、本分析で使用されたすべての細胞
の約90%のみが、感染時にはCD34について陽性であった。それ故、D34
およびGFPについて多パラメーターをC分析した。CD34+細胞の集団は、
形態学および幹細胞の能力において異常に不均一であった。CD34+およびC
D117+細胞の亜集団は、非常に原始的な造血性細胞と似ている(Ikuta
,K.,Weissman,I.L.1992 Proc.Natl.Acad
.Sci.USA.89:1502−1506;Simmons,P.J.ら、
1994.Expl.Hematology.22:157−165)。図23
は、これらの特異的幹細胞マーカーと相関するGFP発現の分析を要約する。キ
メラベクターで感染された細胞の54%はGFPおよびCD34+について陽性
であったが、Ad5GFPで感染された細胞の25%のみが、導入遺伝子および
CD34+マーカーを発現した(図23A、下のパネル)。より重要には、GF
Pの発現に基づいて、キメラウイルスは、c−kit陽性細胞の80%を形質導
入したが、Ad5に基づくベクターは、36%のみを形質導入した(図23A、
中間のパネル)。さらなる実験において、CD34+細胞を、Ad5GFPまた
はAd5GFP/F35での感染の前に、CD117発現について分類し、そし
て感染の24時間後、この特異的な画分においてGFP発現を分析した(図23
B)。この分析より、キメラベクターが、Ad5FGPベクターよりも4倍より
高いCD34+/CD117を形質導入したことが明らかとなった。
5ベクターは、CD34+細胞の標的化および形質導入においてAd5GFPベ
クターに明らかに優れた。さらに、このデータは以下のことを示唆する:Ad感
染を許容するCD34+細胞サブセットの領域は、Ad5ベクターよりもキメラ
ベクターについて有意に異なった。
ムの分析) 従来、CD34+細胞の形質導入率を、Ad5GFPおよびAd5GFP/F
35での感染後のGFP発現に基づいて測定した。形態学的および機能的パラメ
ーターにおけるCD34+の異常な不均一性を考慮すると、GFPは、効率的に
感染されたすべての細胞型において発現されなくともよい。これについての理由
としては、以下のことが挙げられる:CMVプロモーターはすべての細胞型にお
いて活性でなくてもよいか、または導入遺伝子発現の調節は、転写後または翻訳
後レベルにおいて、サブセット間で異なり得る。これを試験するために、本発明
者らは、Ad5GFPおよびAd5GFP/F35で感染されたCD34+細胞
のGFP陽性およびGFP陰性画分内の細胞内(形質導入された)ウイルスゲノ
ムの数を定量した。これを行うために、感染の24時間後、CD34+細胞をG
FP陽性およびGFP陰性画分ついて分類し、引き続いて形質導入されたウイル
スDNAと一緒に、ゲノムDNAを単離するために使用した。ウイルスゲノムの
数を、図15に記載される定量的サザンブロットによって決定した。GFP陽性
CD34+細胞あたり、約270コピーのAd5GFP/F35ウイルスゲノム
を検出した。興味深いことに、注目すべき200コピーのAd5GFP/F35
ウイルスゲノムを見出した(GFP陰性CD34+細胞あたりに)(図24Aお
よび25)。これは、以下のことを実証する:すべての感染された細胞が、GF
Pを発現するわけではない。そして以下のことを意味する:実際の形質導入率は
、54%よりも高かった(GFP陽性細胞)。本発明者らは、以下のことを結論
する:CMVプロモーターは、すべての形質導入されたCD34+サブセットに
おいて活性ではなかった。Ad5GFPベクター特異的シグナルを、感染された
CD34+(GFP陽性または陰性)画分内で、サザンブロット(細胞あたり1
4ウイルスゲノムの検出限界を有する)によって検出した。これより、本発明者
らは、以下のことを結論し得る:形質導入された細胞あたりのベクターDNA濃
度は、Ad5GFP/F35について、Ad5GFPよりも少なくとも20倍高
い。
の、感染されたCD34+細胞由来のDNAサンプルにおいてのみ、サザンブロ
ットによって検出可能である(図24Bおよび25)。これは以下のことを示す
:複製欠損Ad5ベクターは存在するが、非常に低コピー数であり、細胞内ゲノ
ムの安定性によって限定され得る。PCRサザン検出方法を使用して、Ad5ベ
クターDNAをまた、GFP陰性細胞において検出した。このことは、以下のこ
とを支持する:CMVプロモーターが、形質導入研究の最適な選択であった必要
はない。Ad5ベクターを用いたCD34+細胞の感染後のウイルスゲノムの分
析における他による研究が、前PCR増幅後にのみ行われたことに注目すべきで
ある(Mitani,K.ら、1994、Human Gene Therap
y,5:941−948;Neering,S.J.ら、1996.、Bloo
d,88:1147−1155)。
ーナリゼーション特性を有する。従って、ファイバー置換は、Ad5からAd3
5へ、細胞の親和性を交換するのに十分であった。Ad5GFP/F35カプシ
ドキメラは、天然に生じる長くシャフトしたAd5ファイバーの代わりに、Ad
5カプシドに取り込まれた短シャフト(short−shafted)Ad35
ファイバーを含んだ。Ad5の感染の間、ペントン塩基とインテグリンとの間の
相互作用は、ウイルスインターナリゼーションを誘導するために必要とされる。
この相互作用について、ファイバーシャフトの長さおよびノブおよびRGDモチ
ーフの正確な空間配置は、ウイルスの侵入ストラテジーに重要である。天然の空
間配置は、短くシャフトした異種のファイバーが、Ad5カプシドに挿入された
場合に妨害される。興味深いことに、Ad5/35カプシドキメラは、効率的な
感染を可能にする。このことは以下のことを示す:Ad5ペントン塩基において
突出するRGDモチーフは、第1のAd35レセプターとの相互作用に影響しな
い。従来、ほとんどのキメラウイルスは、長Ad5ファイバーシャフトを維持す
る間、Ad5ノブのみの置換によって産生された(Chillon,M.ら、1
999.J.Virology.72:2537−2540;Krasnykh
,V.N.ら、1996.J.Virology.70:6839−6846;
Stevenson,S.C.ら、1995.J.Virology.69:2
850−2857;Stevenson,S.C.ら、1997 J.Viro
logy.71:4782−4790)。例外は、Ad5/7キメラウイルスで
あり(Gall,J.ら、1996.J.Virology.70;2116−
2123)、ここで全体のAd5ファイバーは、短くシャフトしたAd7ファイ
バーによって置換された。しかし、親のAd5と同様に、Ad5/7キメラは、
なおαV−インテグリンを感染に必要とされる。
ン内のRGDモチーフの存在にも関わらず、キメラウイルスは、短くシャフトし
た異種ファイバーのレセプター特異性によって、主に決定された細胞侵入経路を
使用する。これは、第2のレセプターとの相互作用が付着親和異性を増加し得る
ことを排除しない。後者は、以下の観察によって支持される:Ad35およびA
d5GFP/F35は、付着について、Ad5またはAd3と競合する能力にお
いてわずかに異なる。Ad5/35の付着は、高親和性のファイバー付着に加え
てAd3およびAd5によって使用されるレセプターと重複するAd5カプシド
タンパク質(例えば、RGDモチーフ)と第2のレセプターとの間の相互作用に
関与することは可能である。
サブセットに制限されることを示す。CD34+細胞のAd5GFP感染後のG
FP発現細胞のパーセントは、100より高いMOIでプラトーに達した。この
ことは以下のことを示す:CD34+細胞の限定された画分のみが、Ad5に対
して許容的であった。また、感染されたCD34+細胞における野生型Ad5の
強力な複製は、ウイルスの複製を開始するのに十分なレベルで、初期ウイルス遺
伝子の発現を生じるCD34+の特定の亜集団の優先的な形質導入の結果であり
得る。Ad5ベクター感染に対して許容的なCD34+細胞の特異的な亜集団の
存在は、他(Byk,T.ら、1998.Human Gene Therap
y.9:2493−2502;Neering,S.J.ら.1996、Blo
od.88:1147−1155)によって示唆された。このレポートにおいて
、本発明者らはさらに、この亜集団を特徴付け、そして以下のことを実証した:
Ad5に基づくベクターは、αV−インテグリン陽性CD34+細胞を優先的に
感染した。インテグリン(αVを含む)は、移植された造血細胞のホーミングお
よび輸送に重要であると考えらるが、しかし、αV−インテグリン発現と造血細
胞の分化状態との間の相関についてはほとんどしられていない(Papayan
nopoulou,T.,Craddock.C.1997.Acta Hae
matol.97:97−104;Roy,V.,Verfaillie,C.
M.1999.Exp.Hematol.27:302−312)。CARとG
FP発現との間には明白は相関は存在せず、このことは以下のことを実証する:
Ad5GFPは、第1のレセプターとして別の膜タンパク質を使用し得る。ある
いは、200〜400のMOIで観察されたAd5GFP形質導入は、CARの
存在しない好ましい経路であり得るウイルスとαV−インテグリン誘発性インタ
ーナリゼーションとの間の直接の相互作用の結果であり得る(Legrand,
V.ら、1999.J.Virology.73:907−919)。重要なこ
とに、キメラAd5GFP/F35ベクターでの感染は、αV−陽性CD34+
亜集団に制限されなかった。
んに原始的な造血細胞に類似である(Ikuta,K.,Weissman,I
.L.1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:15
02−1506;Simmons.P.J.ら、1994.Expl.Hema
tology.22:157−165)。幹細胞因子についてのレセプター、C
D117(c−kit)は、チロシンキナーゼファミリーに属する。以下のこと
は以前に示された:c−kit+、CD34+臍帯血細胞は、造血先祖の高い画
分(16%)を含む(Neu,S.ら、1996.Leukemia Rese
ach.20:960−971)。個体発生の初期に、34+/CD117+細
胞は、長期の再増殖活性を有する(Sanchez,M.J.ら、1996.I
mmunity.5:513−525)。平均して、CD34+細胞の50〜6
0%が、CD117陽性であることが報告された(Ikuta.K.,Weis
sman,I.L.1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA
.89:1502−1506;Neu,S.ら、1996.Leukemia
Research.20:960−971;Simmons,P.J.ら、19
94.Expl.Hematology.22:157−165)。本研究にお
いて、キメラベクターは、54%のCD34+細胞および80%のCD34+/
c−kit+細胞においてGFPを発現した。実際のウイルス形質導入率はさら
に高くなり得る。なぜなら、形質導入されたAd5GFP/F35ベクターDN
Aはまた、感染された細胞のGFP陰性画分において見出されたからである。こ
れは以下のことを示す:本発明のベクターにおいてGFP発現を駆動するのに使
用されたCMVプロモーターは、形質導入された細胞のすべてにおいて活性でな
かった。本発明者らは、公開されたデータに基づいて導入遺伝子発現のためのC
MVプロモーターを選択した。このデータは、PGKおよびCMVプロモーター
は、CD34+細胞における効率的な導入遺伝子発現を可能にするが、HTLV
−1およびRSVプロモーターはほとんど活性でなかったことを実証する(By
k,T.ら、1998.Human Gene Therapy.9:2493
−2502;Case,S.S.ら、1999.Proc.Natl.Acad
.Sci.USA.96:2988−2993)。一方で、Watanabeら
による研究(Watanabe,Tら、1996.Blood.87:5032
−5039)は、以下のことを示唆する:CMVプロモーターは、特定のCD3
4+サブセットにおいて、活性でないか、または容易に停止する。本発明者らの
データは、この知見を強調する。レトロウイルス形質導入研究を考慮すると、レ
トロウイルスMLVプロモーターは、造血細胞における形質導入研究の優れた候
補であり得た(Bregni,M.ら1998.Gene Therapy.5
:465−472)。
効率的に形質導入したことを実証した後、次の論理的なステップは、予め分類さ
れたGFP陽性/陰性細胞を用いてコロニーアッセイを行うことである。しかし
、このアッセイは以下の事実によって複雑にされる;第一世代のAdベクターで
の感染は、細胞毒性であり、そしてMC−培養における先祖コロニーの形成およ
び増殖に影響する(Mitani,K.ら、1994.Human Gene
Therapy.5:941−948;Watanabe,T.ら、1996.
Blood.87:5032−5039)。この副作用は、形質導入された細胞
内のAdタンパク質の発現によって引き起こされる(Lieber,A.C.−
Y.ら1996.Jounal of Virlogy.70:8944−89
60:Schiedner,G.ら、1998.Nature Genetic
s.18:180−183;Yang,Y.ら、1994.Proc.Natl
.Acad.Sci.USA.91:4407−4411)。これらのタンパク
質のいくつか(例えば、E4−orf4、pTP、またはE3−11.6k)は
、プロアポトーシス活性を有する(Langer,S.J.,Schaak.J
.1996.Virology.221:172−179;Lieber.A.
ら、1998.J.Virology.72:9267−9277;Shtri
chmann.R.,Kleinberger,T.1998.J.Virlo
gy.72:2975−2983;Tollefson、A.E.,Aら、19
96 J.Virology.70:2296−2306)。明瞭に、これはA
d5GFP/F35での形質導入研究の結果を影響し、ウイルスタンパク質の有
意な発現を暗示するウイルスゲノムのCD34+細胞への効率的な移転を可能に
する。さらに、最近公開されたデータは、以下のことを示す:短期のコロニーア
ッセイは、ほとんど、成熟先祖を測定し、そして潜在的な幹細胞の形質導入につ
いての厳密な試験を示さない。
白な照明は、コロニーアッセイ、または好ましくは、SCID−NODマウスに
おける再増殖アッセイを必要とする。本発明者らは、Ad5GFP/F35キメ
ラカプシドに基づいて作製された弱活力(gutless)ベクターを用いて(
Steinwaerder,D.S.ら、1999.J Virol 73:9
303−13)、およびすべてのウイルス遺伝子を欠く□Ad.AAVベクター
を組み込んで(Lieber,A.ら、1999.J Virol 73:93
14−24)、これらの研究を行い得る。あるいは、弱活力再標的化ベクターは
、CD34+細胞でレトロウイルスレセプターを過渡的に発現するために使用さ
れ、本発明者らが先に公開したアプローチ(Lieber,A.ら、1995.
Human Gene Therapy.6:5−11)に基づくレトロウイル
スベクターを用いた感染に対するそれらの感受性を増加し得る。
形質導入し得るというこの知見は、以下を示す:HSCへの安定な遺伝子転移へ
の重要なステップおよび血液障害の遺伝子治療。さらに、本発明のウイルス学の
局面は、アデノウイルス細胞相互作用のよりよい理解に寄与する。
変されたファイバーを有するAd5に基づくベクターの再標的化) HSC遺伝子治療のために、Ad5−カプシドに基づくベクターを作製する別
の代替法は、Ad5ファイバー遺伝子のH1ループ領域に、HSC特異的ペプチ
ドのコード配列を組み込むことである。H1ループの改変を、7のアミノ酸長の
FLAGペプチド(DYDDDDK)(配列番号11)を用いて、Krasny
khらによって連続して行った。ファージペプチドライブラリーを使用して(P
ascqualini,R.ら、1996、Nature,380:364−6
6)、Renata Pasqualini(La Jolla Cancer
Reseach Center)は、Americcan Society
for Gene TherapyのFirst Meetingで、骨髄細胞
に特異的な小ペプチドリガンドの同定を最近報告した。これらのペプチドをコー
ドする対応する配列は、部位特異的変異誘導を使用するためにH1ループ配列を
改変するために添加され得る。最適には、リガンドは、CARおよびインテグリ
ン独立性経路に基づくアデノウイルス粒子の効率的なインターナリゼーションを
可能にする。AAVBGカセットを含む改変されたアデノウイルスベクターは、
産生され、そして上記のようにHSC親和性について試験され得る。
テジーを提供する。このストラテジーは、リガンドとして、それらのファイバー
ノブにおいて、アデノウイルスディスプレイランダムペプチドのライブラリーを
作製する工程、およびインビトロならびに潜在的にインビボで特定の細胞型に対
する親和性を有するアデノウイルス変異体についてこのライブラリーをスクリー
ニングする工程を包含する。
i)Ad5ファイバーノブの立体構造は既知であるが、どのドメインがレセプタ
ー付着に関与するのかは明瞭でないままである。レセプター付着ドメインが、赤
血球凝集反応ドメインと部分的に重複し、このドメインは多くの血清型について
優れて特徴付けられることを示唆するデータが存在する。従って、潜在的なレセ
プター付着部位を表す3つの細胞内ループ領域が、ランダムペプチドライブラリ
ーによって置換され得る。GFまたはGHループの中心の8のアミノ酸残基は、
八量体ランダムペプチドによって置換され得る(図26および27)。これらの
置換は、CAR親和性を置換し、そして無反応性の細胞型の感染を可能にする。
(ii)ペプチドライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドを合成するため
に、すべての20のアミノ酸についてのコドンを表す、予め合成されたトリヌク
レオチドを構築するための、新規の技術を使用する。これは、末端コドンを避け
、そしてヒト細胞における最適なコドン使用および翻訳を保証する。完全なラン
ダム化ライブラリーの合成は、同じ確率で組み込まれるすべての20アミノ酸で
可能であり、そしてランダムな位置で、八量体あたりランダムなアミノ酸の、3
(平均して)のランダムアミノ酸置換のみを有する部分的にランダム化されたラ
イブラリーであり、形質導入変動性の間、3次ノブ構造の特定の重要な特徴を維
持する。最近のモデルは、免疫グロブリンの超可変CDR1または2領域に存在
するアミノ酸の分布に基づく。(iii)改変されたループあたり、約1010の
異なる八量体の代表的なライブラリーサイズを維持するために、新しいクローニ
ングストラテジーを使用し、置換部位にさらなるアミノ酸の導入なしに、そして
細菌における形質転換なしに、野生型Ad5ゲノムへのライブラリーの挿入を可
能にする。このストラテジーは、Stratagenより利用可能な「継ぎ目の
ない(seamless)」クローニング技術に基づく。(iv)ウイルスのラ
イブラリーを産生するために、改変ファイバー配列を含むウイルスゲノムDNA
を、ライブラリーサイズを減少しないで、293細胞にトランスフェクトする。
この重要なステップは、ウイルスライブラリーDNAを、キャリアAD5に基づ
くアデノウイルスに、ポリリジンを介して付着することによってなし、100%
のトランスフェクション効率を確実にする。この技術は、約1μgのプラスミド
DNA(または約1×1010アデノウイルスゲノム)の1010のウイルス粒子へ
の付着を可能にする。このウイルス粒子は、10〜100のMOIで293/c
re細胞を感染するために使用され得る。重要なことに、キャリアアデノウイル
スゲノムは、リコンビナーゼ(293/cre)を発現する293細胞の感染後
に、キャリアウイルスDNAのパッケージングを妨げるlox部位に隣接したパ
ッケージングシグナルを有する。このヘルパーウイルス系は、従来的に使用され
、弱活力アデノウイルスと呼ばれるものを産生する。従って、このウイルス子孫
は、好ましくはAd5ファイバーを含むカプシドにパッケージングされたライブ
ラリーゲノムを表す。これは、ファイバーがパッケージングされたゲノムによっ
てコードされるカプシドに基づく同種のファイバー集団を確実にするために1の
MOIでの293細胞への次の感染ステップのために重要である。
) 肝細胞にAd5を標的化するためのG−Hループ置換の例は成功した。予備試
験は、RIおよびRII+と呼ばれるマラリアスポロゾイト周囲表面タンパク質
(CS)内の2つの進化的に保存された領域が肝細胞との特異的な相互作用を媒
介するが、他の器官(脾臓、肺、心臓および脳を含む)との特異的な相互作用は
、媒介しないで、またクップファー細胞、肝臓内皮細胞または肝細胞膜のほかの
領域との特異的な相互作用も媒介しないことを実証した(Cerami.C.ら
、1992,Cell,70:1021−33;Shakibaei,M.およ
びU.Frevert,1996.J.Exp.Med.,184:1699−
711)。これらの領域は、Plasmodium berghei、P.cy
nomogli、およびP.falciparum(それぞれ、マウス、サルお
よびヒトの肝細胞に感染する)を含む異なる種間で保存されている(Ceram
i,C.ら、1992,Cell,70:1021−33;Chatterje
e,S.ら、1995,Infect Immun.,63:4375−81)
。RI(KLKQPG)(配列番号12)またはRII(EWSPCSVTCG
NGIQVRIK)(配列番号13)由来のペプチドは、肝細胞へのCS付着お
よびインビボでスポロゾイトによる感染をブロックした(Cerami,C.ら
、1992,Cell,70:1021−33;Chatterjee,S.ら
、1995,Infect Immun,63:4375−81)。RIペプチ
ドおよびRII+ペプチドを、CARインテグリンおよびαv−インテグリンへ
の付着をなくす変異を含むAd5−ファイバーノブ(H−IおよびG−Hループ
)に別個に挿入した(Kirby,L.ら、2000,J.Virol.,74
:2804−13;Wickham,T.J.ら、1995,Gene The
r.,2:750−6)。予備データに基づいて、短ファイバーを使用し、これ
によりウイルス侵入ストラテジーは、優先的に第1(肝細胞特異的レセプター)
との相互作用に依存する。肝細胞特異的リガンドは、フレキシビリティーを提供
する短いグリシンストレッチに隣接され、そして2つのシステインによって形成
されるループに組み込まれる。これは、リガンドをタンパク質の足場(scaf
fold)に組み込むため(Doi,N.およびH.Yanagawa,199
8,Cell Mol.Life Sci.,54:394−404;Koiv
unen,E.ら、1995,Biotechnology(NY),13:2
65−70)およびタンパク質表面におけるリガンドの提示を保証するための古
典的なストラテジーの1つである。最良の改変体の生体分布を、異なる器官にお
いてベクターDNAのためのサザンブロットまたはPCRに基づいてC57B1
/6マウスにおいてインビボで試験する。このマウス系統は、P.berghe
iでの感染に感受性であることが公知である(Chatterjee,Sら、1
995,Infect Immun.,63:4375−81)。
製) 同様のストラテジーは、繊維状ファージ上のランダムペプチドを示すことによ
る腫瘍親和性のための選択後に得られる2つのペプチドを挿入することである。
第1の二重サイクリックペプチド(RGD−4)は、腫瘍脈管構造上に存在する
インテグリンへの特異的な付着を提供する(Ellerby H.M.ら、19
99,Nat.Med,5:1032−8)。第2のペプチドは、乳癌細胞株M
DA−MB−435について示されたように転移性腫瘍細胞に付着する特異的な
マトリックス金属付着プロテイナーゼを標的化する(Koivunen,E.ら
、1999,Nat.Biotechnol,17:768−74)。親和性改
変ベクターを、MDA−MB−435細胞由来の肝性転移を有する動物モデルに
おいて試験する(図28)。
ランダムペプチドを発現することを可能にする合成ペプチドライブラリーを、記
載する。ファージディスプレイライブラリーの技術を最適化し、これらのファイ
バーノブにおいて、ランダムペプチドをディスプレイするアデノウイルスのライ
ブラリーを作製する。次いで、アデノウイルス改変体のこのライブラリーを、イ
ンビトロ、および潜在的にインビボで、特定の細胞型に対する親和性についてス
クリーニングする。ペプチドライブラリーをコードするオリゴヌクレオチドは、
新規の技術を使用して、全部で20個のアミノ酸についてのコドンを示す、予め
合成されたトリヌクレオチドを会合する。これは、終止コドンをやめそして最適
なコドンの使用およびヒト細胞における翻訳を保証する。代表的なライブラリー
サイズを維持するために、新たな「シームレス(seamless)」クローニ
ングストラテジーは、このライブラリーの野生型Ad5ゲノムへの挿入を、置換
部位におけるさらなるアミノ酸の導入および細菌への形質転換なしで可能にする
。293細胞へのトランスフェクションを、ウイルスライブラリーDNAをポリ
リジンを介してキャリアAd5−ベースのアデノウイルスに結合体化することに
よって行い、100%のトランスフェクション効率を保証する。重要なことに、
このキャリアアデノウイルスゲノムは、lox部位に隣接するそのパッケージン
グシグナルを有する。lox部位は、Creレコンビナーゼを発現する293細
胞(293/cre)の感染後のキャリアウイルスDNAのパッケージングを防
ぐ。CARおよびインテグリン親和性が枯渇されたE1陽性イルスを有するライ
ブラリーを産生する。目的の細胞型に首尾よく感染した改変体のみが複製し、デ
ノボで産生されたウイルス生じる。次いで、特定の親和性が付与されたペプチド
リガンドの配列を、デノボで産生されたウイルスにおいて分析する。
せ) 本実施例は、全てのアデノウイルス遺伝子を欠失するアデノウイルスベクター
の組み込み技術を、静止性のHSCに対してベクターを再標的化する改変ファイ
バータンパク質とを組み合わせる以下の研究を記述する。
されたΔAd.AAVfxベクターを、レポーター遺伝子発現、およびそれらの腫
瘍細胞感受性(clonogenic)能力を分析する一方、同時にベクター組
み込みについて試験する。改変ΔAd.AAVfxハイブリッドベクターは、全て
のアデノウイルス遺伝子を欠失するゲノムを含み(「弱活力(gutless)
」アデノウイルスベクター)、これは、改変されたファイバーを有するAd5キ
ャプシドにパッケージングされる。Repは、これらのΔAd.AAVfxベクタ
ーに取り込まれ、AAVS1への部位特異的組み込みを可能にし得る。
細胞を、異なる用量のΔAd.AAVfx−BG(細胞あたり1〜107ゲノム)
で感染する。ΔAd.AAVfx−βGalで感染されたCD34+細胞を、懸濁
液の状態で2日間培養し、基質としてFDGを用いるFACSによってβ−Ga
l+細胞を選別する。これは、感染効率を決定する。次いで、β−gal発現細
胞を、多数のサイトカイン(IL−3、SCF、Epo、G−CSF、GM−C
SF、IL−7、Tpo)の存在下で半固体培養(MOIあたり2つの皿)にお
いて試験管内腫瘍細胞感受性試験にかける。半固体培養の第1のセットを、7日
後に評価し得る;別のセットは、14日後に分析し得る。半固体培養において形
成されたコロニーを、光学顕微鏡によって特徴付け得、そしてその後、X−Ga
l染色で染色した。ほとんどのベクターゲノムは、エピソームのままであり、そ
して連続的な細胞分裂により失われ得る。従って、ほとんどの細胞は、感染から
2日または7日後にX−Gal陽性であり得るが、より大きなコロニーのほとん
ど(感染後14日で分析された)は、β−Galについて均一に染色し得ない。
代表的な数のX−Gal陽性コロニーおよびX−Gal陰性コロニーを拾い、そ
してエピソームおよび組み込まれたベクターDNAについて分析した。この結果
は、感染に用いたMOIおよびベクターの組み込み状況に依存する。これらの研
究は、ハイブリッドベクターが、初代始原細胞を感染し得るか否かを決定する。
感染し得、そしてメチルセルロース(MC)培養において増殖因子(IL−3お
よびSCF)の存在下でG418選択に供し得る。得られるコロニーは、主に骨
髄性細胞の混合物である。G418耐性コロニーの数および形態学を、選択から
2週間後に決定し得る。このストラテジーでは、用いた特定の培養条件下で、適
切な幹細胞が分裂し得ず、かつG418耐性コロニーを形成し得ないという不都
合があり得る。さらに、このストラテジーは、異種細胞の集団に対してG418
選択を実行することが困難であり得、これは、G418に対するこれらの細胞の
感受性において変化する。従って、ΔAd.AAVfx−SNori感染CD34
+細胞の別のセットを、G418選択なしでメチルセルロース(+IL−3、S
CF)において培養し得る。2〜3週間後、単一コロニーを、両方(w/および
w/o G418)のMC培養物から拾い、形態学的に特徴付け、そして少数の
細胞における組み込み研究のために開発された改変プロトコルを用いて組み込み
ベクターについて分析し得る(図8を参照のこと)。このストラテジーは、ハイ
ブリッドベクターが増殖因子の存在下で培養されたCD34+細胞のゲノムに組
み込まれているか否かの評価を可能にする。この研究は、本発明者に組み込みベ
クターのコピー由来のneoまたはβgal発現に影響する潜在的な位置効果に
ついて、および組み込みベクターおよび隣接する染色体領域の構造についてのア
イデアを与える。
由来の個々の細胞において実施し得る。CD34+細胞を、増殖因子の存在下で
MCにおいて培養して細胞分裂を誘導し、引き続いてコルヒチンを用いて処理し
た。中期染色体の拡散を、βGalまたはSNori遺伝子に特異的なビオチン
ATP標識プローブおよび内部コントロールとしてヒトX染色体に対するジゴキ
シゲニン−UTP標識プローブを用いて分析する(Christine Dis
teche,University of Washingtonにより提供さ
れる)。特異的なハイブリダイゼーションを、異なる蛍光色素(例えば、FIT
CおよびTexas Red)を用いて標識される、対応する抗ビオチンまたは
抗DIG抗体を用いて可視化し得る。ハイブリッドベクターDNAは、コンカテ
マーとして組み込み得、これは、FISHによる検出を容易にする。この技術は
、ハイブリッドベクターの染色体組み込み部位を局在化することを可能にするも
のである。
に形質導入され得るか否かを理解するかを調べるために試験し得る。有意な細胞
増殖を避けるために、精製されたCD34+細胞をトロンボポイエチン(Tpo
)を補充したIMDMを含まない血清中で培養する。Tpoは、単独で、幹細胞
の活性な細胞増殖を刺激することなく、幹細胞の生存を補助し得る(Matsu
naga, T.ら,1998,Blood,92:452−61;Papay
annopoulou,T.ら,1996,Experimental Hem
atology,24:660−69)。ハイブリッドベクターΔAd.AAV fx BGを用いた感染時点で、CD34+細胞の増殖状態を分析するために、Br
dUを、感染の2時間前に培養培地へ添加する。1組の細胞を、2日間、Tpo
のみを含むIDAMにおいて懸濁培養として維持する。別の組の細胞を、複数の
サイトカインを用いて補充されたIDAM+Tpoにおいて増殖する。感染48
時間後、CD34+細胞を、FDGを用いてβGal発現についてFACSによ
り分類し得る。FDG陽性細胞を、BrdUの組み込みに基づいて細胞性DNA
複製についてさらに分析し得る。これをするために、FDG+細胞由来のサイト
スピン(cytospin)を、および特異的なCD34+サブセットマーカー
について、BrdU特異的抗体を用いて、かつ特異的細胞表面マーカー(例えば
、CD38、CD41)に対する抗体を用いて、免疫蛍光にかけ得る。あるいは
、同じ細胞の連続パラフィン切片を、以下について分析し得る:(a)X−Ga
l染色による導入遺伝子発現、(b)BrdUの組み込みに基づくDNA合成、
および(c)特異的表面マーカー。これは、Tpoを単独で含む培養条件が有意
なゲノムDNA複製およびそれに続く細胞増殖を妨げることを確認し、ならびに
静止性のCD34+細胞に、BrdU標識が存在しない細胞におけるβGal発
現に基づいて、感染し得るか否かを決定することを可能にするものである。
感染された細胞の第1のセットを、サイトカインの存在下で5〜7日間培養し;
他方のセットをサイトカインなしで培養する。この期間、サイトカインなしでC
D34+細胞を生育可能に維持するために、細胞を、Tpoの存在下で培養する
か、または下に間質細胞株(AFT024)を置いた(Moore,K.ら,1
997,Blood 89:4337−47)。これにより、4〜7週間生存可
能なHSCを維持し得る。この特定の期間の後、両方のセットを、G418選択
と組み合わせてか、または選択なしのいずれかで、試験管内腫瘍細胞感受性試験
(複数のサイトカインの存在下)にかける。単一のコロニーを、形態学的に分析
し、かつゲノムDNA分析(図8)に供して、ベクター組み込み状態を決定する
。幹細胞の形質導入についての最終試験は、インビボ生存アッセイ/増殖アッセ
イである。これを行うために、βGalを発現するCD34+細胞を、移植実験
のために使用する。FDG+細胞の数が不十分である場合、総ΔAd.AAVfx BG感染細胞ならびに全てのΔAd.AAVfxSNori感染細胞を、選択なし
に直接使用し得る。移植を、致死量以下で照射されたSCID NODマウスに
、尾静脈注射を介して実施し得る(Dao,M.A.ら,1998,Blood
,4,1243−1255;Matsunaga,T.ら,1998,Bloo
d,92:452−61)。移植後の異なる時点(4〜8週)で、マウスを、骨
髄細胞を得るために屠殺し得る。次いで、この骨髄細胞を、以前に記載されるよ
うなX−Galおよび細胞マーカーについての種々のアッセイを実施するまで、
懸濁中で培養し得る。これらの細胞をまた、SCID NODマウスへのMCま
たは2次移植において、2次コロニーアッセイにかけ得る。さらに、これらの細
胞由来のMCコロニーを、図8において例示される方法により、組み込まれたベ
クターの存在について分析し得る。この発現データおよび組み込みデータと合わ
せて、再増殖(repopulation)効果についておよび潜在的な位置効
果についての結論を可能にする。
クターの最適化) 本発明の1つの特定の実施形態は、(a)赤血球系細胞特異的プロモーターの
制御下の導入遺伝子としてのγ−グロビンを有する再標的化ハイブリッドベクタ
ーを構築すること、(b)インビトロアッセイおよびインビボアッセイにおいて
ハイブリッドベクターでの形質導入の後のγ−グロビン発現のレベルおよび動態
(kinetics)を分析すること、(c)必要な場合、ハイブリッドベクタ
ーに組み込まれたγ−グロビンLCRまたはインシュレーター(insulat
or)を用いて、位置効果から遺伝子発現を保護すること、および(d)γ−グ
ロビンイントロンまたは異種イントロンが、γ−グロビン発現を上昇し得るか否
かを研究することである。
ウイルスよりもより大きな導入遺伝子に適応し得ることを実証することである。
これらのベクターの挿入サイズの制限は、5kbである。8kbまでの導入遺伝
子カセットを、記載のようにハイブリッドベクターに挿入し得る。ハイブリッド
ベクターを、対応するパッケージング細胞株におけるE2aおよび/またはE4
欠失rAdベクターに基づいて作製する場合、最大の挿入サイズは、約14kb
であり得る。ハイブリッドベクターにおける最大の挿入サイズは、ラージスケー
ルでのハイブリッドウイルスの作製のために必要な中間体である第1の作製ベク
ター(Ad.AAV)(<36kb)のパッケージング制限によって決定される
。8kbのグロビン遺伝子カセットを有するAd.AAVベクターの安定性およ
び力価は、Ad.AAVBG、Ad.AAV1、およびAD.AAVSNori
において使用される2.5〜3.5kbのカセットを含むベクターに相当する。
以下の実施例の実験は、これらの問題に取り組む。
レベルは、各内因性β遺伝子の少なくとも50%でなければならない。これらの
導入遺伝子の発現レベルを、γ遺伝子を含む伸張したLCRおよびイントロンを
含む最適な発現カセットを用いることによってのみ達成し得る。(Forres
ter,W.C.ら、1986,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 83,1359−1363;Fraser,P.ら、1998,Curr.
Opinion in Cell Bio.、10,361−365;Gros
veld,F.ら、1998,Seminars in Hematology
,35,105−111;Martin,D.ら、1996,Current
Opinion in Genetics and Development,
6:488−95)。現在までに、γ−グロビン発現カセットのほとんどが、レ
トロウイルスベクターおよびrAAVベクターのために設計され、従って5kb
未満であり、かつ内部スプライシング部位またはポリアデニル化シグナルを欠失
していなければならない。本明細書中に記載の組み込みベクターにおいて、この
サイズの制限を超えることが可能である。これは、適切な発現レベルかつ長期間
の持続性に関して骨髄細胞におけるγ−グロビン発現を改善することを可能にす
る。この目的のために、Liら(Emery,D.W.ら、1999 Hum
Gene Ther 10:877−88;Li、Q.ら、1999,Bloo
d 93:2208−16)によって開発されたγ−グロビン構築物またはEl
lisら(Ellis,Jら、1996,EMBO J.15,562−568
;Ellis,Jら、1997,Nucleic Acids Res.25,
1296−1302)によって開発されたγ−グロビン構築物を選択する。
ロビン発現単位を含む。これは、2つの系の間の直接の比較を可能にする。この
構築物は、βプロモーター(−127からβ開始コドンまで)を含み、このプロ
モーターは、γコード領域とインフレームで連結される。このβプロモーターは
、ヒトαグロビン遺伝子座(これは、グロビン発現のための強力なエンハンサー
として作用する)由来の300bpのHS40と結合される。このグロビン遺伝
子は、イントロン1および部分的に欠失したイントロン2を有する1.1kbバ
ージョンである。完全な3.3kbのγグロビン遺伝子を有するHS40βプロ
モーターおよびγグロビン遺伝子を含む第2のカッセトを作製する。
、優性のクロマチンオープニング(opening)活性およびトランスジェニ
ックマウスにおけるγグロビン発現の適切なレベルを付与する。このLCRは、
短い1.1kbバージョンのγグロビン遺伝子または完全な3.3kbのγ遺伝
子に連結される。
ー由来の導入遺伝子の発現またはトランスジェニック動物における導入遺伝子の
発現を改善し得る他のエレメント(HPRT遺伝子またはhGH遺伝子由来のイ
ントロンのような)を含むさらなるグロビン発現カセットを作製し得る(Chu
ng,J.H.ら、1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
94,575−580;Dunaway,M.ら、1993,Mol.Cel
l.Biol.,17,182−189;Felsenfeld,G.ら、19
96,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,93840−9
388;Klehr,D.ら、1991,Biochemistry,30,1
264−1270)。
実行する(Steinwaerder,D.S.ら、1999,J Virol
73:9303−13)。形質導入したCD34+細胞は、コロニーアッセイ
において分化を受けるか、またはSCID−NODマウスにおいてインビボ増殖
アッセイで分析される。実験マウス由来のMCコロニーまたは骨髄細胞を、グロ
ビン発現について分析する。γグロビン発現を、蛍光抗γグロビン抗体を用いて
測定する。RNAase保護研究を行い、グロビンRNAと比較してγグロビン
mRNAを特異的に定量し得る。これらの研究について、およそ104〜105細
胞が、試験1回あたり必要である。
白血病株に移入する場合、グロビン遺伝子は、強力な位置効果に供される(Fr
aser,P.ら、1998,Curr.Opinion in Cell B
io.,10,361−365;Grosveld,F.ら、1998,Sem
inars in Hematology,35,105−111)。別の問題
は、AAVS1への、ΔAd.AAV/repベクターの部位特異的組み込みが
、導入遺伝子発現を封じ込め(silence)得るということである。封じ込
めが起る場合、6.5kbのγグロビンμLCR(Ellis,Jら、1996
,EMBO J.15,562−568;Grosveld,F.ら、1998
,Seminars in Hematology,35,105−111)の
ようなLCRまたはインシュレーターのΔAd.AAVベースの発現単位への組
み込みによって克服され得る。インシュレーターは、染色体位置効果から組み込
まれたレポーター遺伝子を保護するか、または下流のプロモーターからエンハン
サー活性化転写をブロックするDNAエレメントである。インシュレーターエレ
メントは、Drosophila melanogaster遺伝子(Gyps
y,Hairy wingのサプレッサー、scs、scs’、Fab−7)に
ついて、ニワトリβグロビン遺伝子(HS4)について、およびT細胞レセプタ
ー(BEAD1;14,21.25)について公知である。詳細には、Dros
ophila gypsyまたはβグロビンインシュレーターを、グロビン発現
カッセトに隣接する2つのコピーとしてハイブリッドベクターに挿入し得る。こ
の位置効果を、組み込まれたベクターDNAの分析(図29を参照のこと)およ
びγグロビンmRNAの定量化に基づいて、形質導入されたMCコロニーにおい
て試験し得る。類似の研究を、感染したCD34+細胞のSCID−NODマウ
スへの移植後に得られた形質導入されたヒト骨髄細胞対して実行し得る。
ントロンの欠失が、グロビンmRNAの安定性(従って発現レベル)を減少させ
ることを示す(Antoniou,Mら、1998,Nucleic Acid
Res.,26:721−9)。RNAウイルス(例えば、オンコレトロウイ
ルス、レンチウイルス、およびホーミー(foami)ウイルス)は、イントロ
ン含有導入遺伝子のためのビヒクルとして問題がある。ΔAd.AAVは、DN
Aウイルスであるので、必要な場合、これは、力価の減少およびレトロウイルス
ベクターとともに観察される再配列なしにグロビンイントロンおよびLCRをパ
ッケージングするべきである。
culture collection)から入手可能な、ヒトおよび動物のア
デノウイルス)
示する。
2Aは、Ad.AAV1を示し、そして図2Bは、ΔAd.AAV1を示す。
示す。パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)。1×106コントロールS
k Hep1細胞(SKHep1)(レーン1〜3、5、9)、G418耐性プ
ールからのSKHep1細胞(ΔAd.AAV1)(hAd.AAV1に感染さ
せ、そして4週間にわたり選択した)(レーン6−8、10−12)、またはS
KHep1細胞を、2000ゲノムのAd.AAV1(Ad)での感染後4日で
収集した(レーン4、13))は、インサイチュで溶解され、そして制限エンド
ヌクレアーゼでの消化のあるなしでPFGEに供されるアガロースプラークに封
入される。サザンブロットを、SEAP特異的プローブで行う。U=消化せず、
P=PI−SceIで消化する、I=I−CeuI、E=EcoREI。
およびCD34+の応答を示す。細胞を、振盪下でウイルスと6時間にわたりイ
ンキュベートする。感染後3日目に、形質導入頻度をX−Gal陽性細胞の数に
基づいて算出する。生存率をトリパンブルー排除により試験する。N=3、SE
M<10%。
ョン後のRep発現を示す。5×105細胞を、リン酸カルシウムとの共沈によ
りpAAV/Ad.、pRSVrep、またはpPGKrepでトランスフェク
トする。トランスフェクション後3日で、細胞を採取する。溶解物を10%PA
ゲル上で分離し、続いてRep特異的抗体(03−65169、America
n Research Products)でウェスタンブロットし、そしてE
CL(Amersham)で発色させる。
を作製するための戦略を示す。矢印は、プロモーターを示す。(PA)=ポリア
デニル化シグナル。T=アデノウイルスパッケージングシグナル。
クター、および少数の細胞数からのDNAゲノムにおけるベクター組み込みの分
析を示す。類似のベクターのセットは、β−ガラクトシダーゼ(BG)または緑
色蛍光タンパク質(GFP)をレポーター遺伝子を用いて生成し得る。
Ad5ファイバーを置換するための戦略を示す。
す。フローサイトメトリー分析のために、HeLa、CHO、K562、および
CD34+ の細胞をモノクローナル抗CAR(RmcB、1:400希釈)ま
たは抗αVインテグリン抗体(L230、1:30希釈)とともにインキュベー
トした。陰性コントロールとして、細胞は、無関係なモノクローナル抗体(抗B
rdU1:100希釈)とともにインキュベートした。一次抗体の結合を、抗マ
ウスIgG FITC標識された結合体(1:100希釈).を用いて発色した
。示すデータは、104細胞で行われた4連の分析の平均の結果を示す。
5から精製された粒子は、陰性のコントラストで染色され、そして85,000
倍で分析した。欠損粒子は、矢印で強調する。
なる血清型の付着およびインターナリゼーションの分析を示す。Ad3、Ad4
,Ad5、Ad9、Ad35およびAd41の、等量の[3H]チミジン標識し
たビリオン(OD260によって測定され、Ad5について1細胞あたり400
pfuのMOIと等価である)を、材料および方法に記載されるように氷上で1
時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして1細胞あたりに付着し
た、標識されたビリオンの数を、決定した。インターナリゼーション研究につい
て、ビリオンをまず、氷上で細胞に1時間付着させる。次いで、付着していない
ウイルス粒子を洗浄して出す。次いで細胞を37℃で30分間インキュベートし
、次いでトリプシン−EDTAで処理し、そして洗浄してインターナリゼーショ
ン化していないウイルス粒子を取り除く。そのデータは、3連で行った2〜4の
独立した実験から得た。CD34+細胞についてのY軸における異なるスケール
に留意のこと。
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
る異なるアデノウイルス血清型の付着およびインターナリゼーションを示す。
よる、K562細胞およびCD34+細胞におけるウイルス複製の分析を示す。
複製研究を、メチル化Ad5、AD9またはAd35に感染させた、1×105
のK562細胞(A)またはCD34+細胞(B)を用いて行った。「ロード」
と標識されたレーンは、指定されたウイルス用量を細胞に添加した直後に培地/
細胞混合物から抽出されたDNAを示す。メチル化およびメチル化されていない
ウイルスDNAに対応するバンドの強度は、入力したウイルスの約85%がメチ
ル化されたことを示す。吸収およびインターナリゼーションを定量するために、
0℃(吸収)または37℃(インターナリゼーション)で細胞とウイルスとのイ
ンキュベーションの前に、DNA分析を行った。用量依存複製研究のために、イ
ンキュベートされたウイルス用量(ゲノム数として表す)をその細胞へと添加し
、そして細胞ゲノムDNAをウイルスDNAとともに、感染後16時間または3
6時間、それぞれK562およびCD34+細胞について抽出した。同一量のサ
ンプルDNAをサザンブロットによって分析した。定量の目的のために、Ad9
複製を、両方の血清型のDNAとハイブリダイズする、Ad5/9キメラプロー
ブを用いて、Ad5とともに分析した(C)。Ad5対Ad35複製の分析を、
対応するAd5/35キメラプローブを用いて行った。Ad5/35およびAd
5/9プローブとの別個のハイブリダイゼーションは、Ad5 DNAについて
同一のシグナル強度を与えた。1つのみのパネルを試験細胞におけるAd5複製
のために示す。ウイルスゲノムのメチル化された状態またはメチル化されていな
い状態について特異的な識別可能なフラグメントを生成するために、Ad5 D
NAをXhoIおよびHindIIIとともに消化した。メチル化された(複製
されていない)ウイルスDNAについて特異的なバンドは、Ad9について約1
2kbであり、Ad5について約35kbであり、そしてAd35について約1
2kbであった。メチル化されていないDNAについて特異的なフラグメントは
、Ad9について5.8kbであり、Ad5について6.1kbであり、そして
Ad35について9.5kbであった。キメラAd5/9およびAd5/35の
DNAフラグメント(1.8kb)を、定量標準として用いて、そしてウイルス
/細胞DNAとともにゲル上に適用した(図の左部に示す)。
35ベクターの構造を示す。A)GFP発現カセットがE3領域に挿入された(
Ad5GFP)もとのE1/E3欠失Ad5ベースのベクターおよびAd5/3
5ファイバー遺伝子を含むキメラベクターAd5GFP/F35の模式図。2.
2kbのAd5ファイバー遺伝子は、PCRクローニングおよびE.coliに
おける組換えを含む技術によって、Ad35の短シャフトおよびノブをコードす
る0.9kbキメラファイバー遺伝子によって置換される。ファイバー遺伝子内
または周りに配置されるKpnI(K)およびHindIII(H)部位が示さ
れる。下のパネルは、キメラファイバー領域の詳細な構造を示す。Ad5ファイ
バーテイル(アミノ酸(aa):1−44)を、その最初の2アミノ酸(GV)
から始まるAd35ファイバーシャフトに対してインフレームで連結した。これ
は、多くの血清型の間で保存される。保存されたストレッチのアミノ酸TLWT
は、Ad35シャフトの最後のβシートと、球状ノブとの間の境界を示す。この
Ad35ファイバー鎖末端コドンのに続き、Ad5ファイバーポリアデニル化シ
グナルが存在する。キメラファイバーをコードするAd5GFP/F35の領域
は、Ad5特異的プライマー(材料および方法を参照のこと)を用いて完全に配
列決定した。B)ウイルスゲノムの制限分析。ウイルスDNAを、精製されたA
dGFP粒子およびAdGFP/F35粒子から他の場所に記載されるように単
離した。1μgのDNAをHindIIIまたはKpnIを用いて消化し、そし
てエチジウムブロミド染色したアガロースゲル(左のパネル)中で分離し、これ
を次いでブロットし、そしてAd5 E4特異的プローブ(nt32.7775
−33.651)を用いてサザンブロットにより分析した(右のパネル)。特異
的なパターン(これは両方のウイルスベクターについて正しい構造を示す)が検
出された。Ad5GFPおよびAd5GFP/F35に対して特異的なHind
IIIフラグメントは、それぞれ2.9kbおよび4.9kbであった。正しい
Ad5GFP/F35構造を確認したKpnIフラグメントは、7.6kb A
d5GFPフラグメントに対して1.6kbであった。M−1kbラダー(Gi
bco−BRL、Grand Island、NY)。
成を示す。1つのAd.AAVベクター中に存在する2つの逆方向反復(IR)
。第一世代のAd.AAVベクター(約34kb)は、導入カセットに隣接する
、2つの1.2kb逆方向相同性エレメントを含む。1つのAAV−ITRは、
Adパッケージングシグナル(Ψ)と左側のIRとの間に挿入される。Ad複製
の間、Irの間の組換えは、Irに隣接する導入遺伝子、AAVITR、Adパ
ッケージングシグナルおよびAd ITRを含むΔAd.AAVゲノムの形成を
媒介する。これらのゲノムは、Adキャプシドへと効率よくパッケージングされ
る。
Er領域に挿入された、もとのE1/E3欠損Ad50ベースのベクター(Ad
5GFP)およびAd5/35ファイバー遺伝子を含むキメラベクターAd5G
FP/F35の模式図。2.2kb Adファイバー遺伝子を、PCRクローニ
ングおよびE.coliにおける組換えを含む技術によって、Ad35の短シャ
フトおよびノブをコードする0.9kbのキメラファイバー遺伝子により置き換
える。ファイバー遺伝子内またはその周りに局在化するKpnI(K)およびH
indIII(H)部位を示す。下のパネルは、キメラファイバー領域の詳細な
構造を示す。Ad5ファイバーテイル(アミノ酸(aa):1−44)を、その
最初の2アミノ酸(GV)で始まるAd35ファイバーシャフトにインフレーム
で連結した。これは、多くの血清型で保存される。保存されたストレッチのアミ
ノ酸TLWTは、Ad35シャフトの最後のβシートと、球状ノブとの間の境界
を示す。このAd35ファイバー鎖末端コドンのに続き、Ad5ファイバーポリ
アデニル化シグナルが存在する。
ラAd5GFP/F35ビリオンの、標識されていないウイルス、および抗CA
Rまたは抗αv−インテグリンMabとの付着およびインターナリゼーションに
ついての交差競合を示す。(A)付着研究のために、105のK562細胞を、
100倍過剰の標識されていない競合物ウイルスとともに4℃で1時間プレイン
キュベートした。次いで、等量の[3H]標識ウイルスを、Ad5GFPについ
て決定された、細胞当たり100pfuのMOIに等価な用量で細胞に加えて、
その後4℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷したPBSで洗
浄し、ペレット化し、そして付着したウイルスのパーセンテージ(1分間あたり
に細胞に接着した数)を決定した。インターナリゼーションについての交差競合
の分析のために、細胞を、100倍過剰の競合物ウイルスとともに37℃で30
分間インキュベーションし、その後ウイルスを添加する。37℃で30分間のさ
らなるインキュベーションの後、細胞を、トリプシン−EDTAで5分間37℃
で処理し、氷冷したPBSで洗浄し、ペレット化し、そしてインターナリゼーシ
ョンしたウイルスのパーセンテージを決定した。コントロールのために、細胞を
、いかなるインヒビターをも含まない標識したウイルスとともにインキュベート
した。予備的は実験は、競合研究のために選択された条件が、すべての標識され
ていない競合物について、K562細胞上の付着/インターナリゼーションにお
いて飽和を可能にすることを示した。(B)105のK562細胞を、抗CAR
MAb(RmcB、1:100希釈)または抗αvインテグリン MAb(L
230、1:30希釈)とともに4℃で1時間プレインキュベートし、続いて、
上記のように、付着のためのプロトコルまたはインターナリゼーションのための
プロトコルに従って、標識したウイルスとともにインキュベートした。各特定の
血清型について、付着/インターナリゼーションウイルスのパーセンテージを、
コントロールの設定と比較した。ここでは、細胞を、1:100希釈の関連しな
い抗体(抗BrdU Mab)を用いる同じ条件下でプレインキュベートし、そ
の後、標識したウイルスを添加する。特定の競合物は、公開されたデータ(59
)と一致する程度まで有意にAd5インターナリゼーションを阻害したが、対応
するコントロールは阻害しなかったことに注目のこと。N>/=4。
びキメラAd5GFP/F35ビリオンの、標識されていないAd3ウイルスに
ついての付着およびインターナリゼーションについての交差競合(A)、ならび
に[3H]標識したAd3ビリオンの、標識されていないウイルスについての付
着およびインターナリゼーションについての交差競合(B)を示す。105のK
562細胞を、図6に記載される付着のためのプロトコルまたはインターナリゼ
ーションのためのプロトコルに従って、100倍過剰の未標識のウイルス粒子と
ともにプレインキュベートした。等量の[3H]標識したAd5GFP、Ad5
GFP/F35、およびAd35(A)または[3H]標識したAd3(B)を
、Ad5GFPについての細胞あたり100pfuのMOIに等価な用量で細胞
に添加した。コントロールの設定において、細胞をいかなる競合物も伴わない標
識したウイルスとともにインキュベートした。N=4。
での、CD34+、K562、およびHeLa細胞への形質導入を示す。1×1
05の細胞に、異なるMOI(pfu/細胞)のウイルスを、100μlの培地
中、37℃で6時間感染させた。次いで、ウイルスを含有する培地を取り除き、
そして細胞を新鮮な培地に再懸濁し、続いて37℃で18時間インキュベートし
た。GFP発現細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定し
た。N=3。
集団中のGFP陽性細胞の分布を示す。1×105CD34+細胞にAd5GF
PまたはAd5GFP/F35を、図8について記載されたように、200pf
u/細胞のMOIで感染させた。トランスフェクションの24時間後、細胞を、
抗CAR一次MAb(1:100最終希釈)または抗αvインテグリン一次MA
b(1:30最終希釈)とともに37℃で1時間インキュベートした。一次抗体
の結合を、抗マウスIgG−PE標識二次抗体(1:100最終希釈)で、4℃
で30分間発色させた。各改変体について、104細胞をフローサイトメトリー
によって分析した。偽性感染改変体は、ウイルス希釈緩衝液のみとともにインキ
ュベートした細胞を表す。象限の境界は、GFPに一致する陰性コンロトールお
よびPEに一致する陰性コントロールの両方を用いて得られたバックグラウンド
に基づいて設定した。各象限において見出された染色された細胞のパーセンテー
ジが示される。示されるデータは、3つの独立した実験を表した。
トCD34+細胞の亜集団におけるGFP陽性細胞の分布を示す。(A)GFP
発現のCD34またはCD117との同時局在化:CD34+細胞にAd5GF
PまたはAd5GFP/F35を、図8について記載された条件下で、200p
fu/細胞のMOIで感染させた。感染24時間後、細胞を、抗CD34 PE
結合体化MAb(最終希釈1:2)または抗CD117 PE結合体化MAb(
最終希釈1:5)とともに、氷上で30分間インキュベートし、そして改変体あ
たり104細胞を、二色フローサイトメトリー分析に供した。陰性コントロール
染色のために、分析の前には細胞に抗体を添加しない。偽性感染改変体は、ウイ
ルス希釈緩衝液のみとインキュベートした細胞を表す。象限の境界は、GFPに
一致する陰性コンロトールおよびPEに一致する陰性コントロールの両方を用い
て得られたバックグラウンドに基づいて設定された。各象限において見出された
染色された細胞のパーセンテージが示される。実験は、2回、3連で行われ、そ
して代表的に得られた結果を示す。SEMは、統計的平均の10%未満であった
。
トCD34+細胞の亜集団におけるGFP陽性細胞の分布を示す。(B)CD3
4+/CD117+細胞の、Ad5GFPおよびキメラAd5GFP/F35ウ
イルスベクターでの形質転換:SCFを有さない培地中での染色の前に一晩培養
したCD34+細胞を、PE標識した抗CD117 MAbと氷上で30分間イ
ンキュベートした。CD117陽性細胞の画分をFACSによって分別した。分
別した細胞の97%より多くがCD117について陽性であった。1×105
CD117+/CD34+細胞に、Ad5GFPまたはAd5GFP/F35を
、図8と同様に、細胞あたり200pfuのMOIで感染させた。感染24時間
後、GFP陽性のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって決定した。
偽性感染については、CD117+/CD34+細胞を、ウイルス希釈緩衝液の
みとともにインキュベートした。感染を3連で行い、対応するヒストグラム上に
GFP発現細胞の平均パーセンテージを示した。SEMは、統計的平均の10%
未満であった。
に感染したCD34+細胞のGFP陽性画分およびGFP陰性画分におけるウイ
ルスゲノムのサザン分析を示す。CD34+細胞に、図21について記載されよ
うに、ウイルスを100のMOIで感染させた。感染24時間後、細胞をGFP
陽性画分およびGFP陰性画分についてFACSによって分別した。各画分から
の105細胞を使用して、ウイルスDNAと一緒にゲノムDNAを単離した。細
胞溶解の前に、トリプシンおよびDNaseを用いて厳しい処理を行い、その後
洗浄を実行して、細胞外ウイルスDNAによって混入したゲノムDNAサンプル
を排除した。A)上のパネルは、同様の量のゲノムDNAがロードされたことを
示す、ブロッティング前のエチジウムブロミド染色した1%アガロースゲルを示
す。この量は、約25,000 GFP+細胞またはGFP−細胞から単離され
たDNAに対応する。Aload@と標識したレーンは、キャリアとしてpBl
uescriptプラスミドDNA(Stratagene)を混合した、Ad
5GFPビリオンまたはAd5GFP/F35ビリオンから精製され、そして2
5,000細胞を感染させるために実際に使用された量でゲルに適用されたウイ
ルスDNAを表す。濃度の標準として、Ad5GFPゲノムの段階希釈をゲル上
にロードした(左側)。サザン分析(下のパネル)のために、Ad5のE2領域
に対応する8kb長のHindIIIフラグメントを、標識したプローブとして
使用した。ハイブリダイズされたフィルターを、PhospholImager
分析に供し、次いで、Kodak−X−OMATフィルムに、B70℃で48時
間さらした。細胞/ウイルスゲノムDNAを矢印で示す。(B)形質転換させた
細胞中でAd5GFPゲノムを検出するために、サザンブロットハイブリダイゼ
ーションの前にPCR増幅を同じサンプル上で実行し、これを(A)における定
量的サザンブロットハイブリダイゼーションのために使用した。約2,500細
胞から精製したDNAをPCR(95℃B1分間、53℃−1分間、72℃B
1分間、20サイクル、プライマーAd5−F1およびAd5−R1を使用)に
供した。PCR反応物の1/5をアガロースゲル電気泳動に供した(上のパネル
)。Ad5のE4領域に特異的な0.9kb長のDNAフラグメントを、形質転
換されたAd5GFP/F35ゲノムについて検出した。次いで、DNAを、N
ybond−N+メンブレンにブロットし、そして、Ad5 E4特異的DNA
プローブを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーション(下のパネル)を
実行した。PCRプライマーは、0.9kb DNAフラグメントに加えて、こ
れもまたE4領域プローブとハイブリダイズするより小さな0.5kb長フラグ
メントを生成する。
示す。CAR付着(Ad5およびAD9)改変体およびAd35(これは、非C
ARレセプターと相互作用する)を、CAR発現細胞(293、Y79)および
K562細胞(これは、有意なCAR量を発現しない)上で分析した。すべての
ベクターは、改変されたファイバーを有するAd5キャプシドにパッケージされ
たGFp発現カセットを含む。
−Hループの位置を示す
ンターナリゼーションを示す。
Rep78の生成を示す。(A)rep78を導入遺伝子として用いるベクター
について、図15に概説されているのと同じストラテジーを使用した。Ad5’
repベクターもまた、HS−4絶縁物(insulator)によってシール
ドされているApoEhAATプロモーターを含んだ。rep78遺伝子の2つ
のフラグメント間の相同性の領域は、658nt長であった。Rep78 OR
Fは、p5プロモーターについて検出された。内部のRep40/52開始コド
ン(993位)を変異させて、小さなRepタンパク質の産生を破壊した。さら
に、nt1905のスプライシング部位を欠失させ、Rep68の産生を除去し
た。Rep78の個々の発現を実証した。(B)ΔAd.rep78ゲノムの形
成。サザンによって実証されるように、Ad5’repおよびAd3’repの
両方の293細胞への同時感染の際に、予測された5.8kb ΔAdrep7
8ゲノムのみを観察した。(C)pCMVrep78およびΔAd.rep78
から発現されるRep78によって、プラスミドDNAからの組換えAAVゲノ
ムのレスキューのためのサザンブロット分析。予測されたレスキュー産物は3.
8kb(R−プラスミド)である。(D)Ad.AVVウイルスベクターゲノム
からの組換えAAVゲノムのレスキューについてのサザンブロット分析。
Claims (62)
- 【請求項1】 第一世代の組換えアデノウイルスベクターであって、以下: a)左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列; b)該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して3’側にあるアデノ
ウイルスパッケージング配列; c)該アデノウイルスパッケージング配列に対して3’側にある第1の逆方向
反復配列; d)該第1の逆方向反復配列に対して3’側にある導入遺伝子カセット配列; e)該導入遺伝子カセットに対して3’側にある、(c)におけるような第2
の逆方向反復配列; f)右側の逆方向反復に対して3’側にある、アデノウイルスの複製を指示す
る、少なくとも1つのアデノウイルス配列;および g)該アデノウイルス複製遺伝子に対して3’側にある右側のアデノウイルス
逆方向末端反復配列、 を含む、第一世代の組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項2】 前記左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列および前記右
側のアデノウイルス逆方向末端反復配列、ならびに前記パッケージング配列が、
同一のアデノウイルス血清型由来である、請求項1に記載のアデノウイルスベク
ター。 - 【請求項3】 前記第1の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列で
あり、そして前記第2の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である、
請求項1に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項4】 前記第1の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側の
逆方向末端反復配列を含み、そして前記第2の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウ
イルス右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項1に記載のアデノウイルスベク
ター。 - 【請求項5】 アデノウイルス親和性を指示する配列が、逆行鎖上に、ファ
イバーテイル、ファイバーシャフト、およびファイバーノブを含む、アデノウイ
ルスファイバータンパク質をコードする配列を含み、ここで該ファイバーノブが
G−Hループ領域を含む、請求項1に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項6】 アンチセンス鎖上で、前記ファイバーテイルをコードする配
列が、アデノウイルス逆方向反復配列と同じ血清型由来である、請求項5に記載
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項7】 前記導入遺伝子カセット配列が、目的の遺伝子の5’部分を
含む、請求項1に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項8】 前記導入遺伝子カセット配列が、目的の遺伝子の3’部分を
含む、請求項1に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項9】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)ポリアデニル化配列; b)該ポリアデニル化配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)該導入遺伝子配列に対して3’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項1に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項10】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)プロモーター配列; b)該プロモーター配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)該導入遺伝子配列に対して3’側にあるポリアデニル化配列 を含む、請求項1に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項11】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項9または10に記載の
アデノウイルスベクター。 - 【請求項12】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−1抗トリ
プシンからなる群から選択される、請求項11に記載のアデノウイルスベクター
。 - 【請求項13】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
、請求項11に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項14】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項11に
記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項15】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項9または10に記載
の導入遺伝子カセット。 - 【請求項16】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項9または10に記載
の導入遺伝子カセット。 - 【請求項17】 アデノウイルスの複製を指示するアデノウイルス配列が、
E2およびE4;E1、E2、およびE4;E2およびE4;ならびにE2、E
3、およびE4、からなる群から選択される、請求項1に記載のアデノウイルス
ベクター。 - 【請求項18】 目的の宿主細胞を標的化する第一世代の組換えアデノウイ
ルスベクター、およびそのように標的化された宿主細胞のゲノム中に組み込むそ
の部分であって、2つのDNA鎖を含み、各鎖は互いに対して逆行しており、第
1鎖は、以下: a)左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列; b)該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して3’側にあるアデノ
ウイルスパッケージング配列; c)該アデノウイルスパッケージング配列に対して3’側にある第1の逆方向
反復配列; d)該アデノウイルスパッケージング配列に対して3’側にある導入遺伝子カ
セット配列; e)該導入遺伝子カセットに対して3’側にある、第2の逆方向反復配列; f)該第2の逆方向反復配列に対して3’側にアデノウイルスの複製を指示す
る、少なくとも1つのアデノウイルス配列;および g)複製を指示する該アデノウイルス配列に対して3’側にある右側のアデノ
ウイルス逆方向末端反復配列、 を含み、ここで該左側の末端反復配列および該右側の末端反復配列は、該導入遺
伝子カセット配列が該宿主細胞ゲノム中に組み込まれることを可能にし、そして
ここで、第2鎖が、目的の宿主細胞中に該ベクターを標的化することを可能にす
るアデノウイルスファイバータンパク質をコードする配列を含む、第一世代の組
換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項19】 前記アデノウイルスタンパク質が、ファイバーテイル、フ
ァイバーシャフト、およびファイバーノブを含み、ここで該ファイバーノブが、
G−Hループ領域を含む、請求項18に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項20】 前記左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列および前記
右側のアデノウイルス逆方向末端反復配列、ならびに前記パッケージング配列が
、同一のアデノウイルス血清型由来である、請求項18に記載のアデノウイルス
ベクター。 - 【請求項21】 前記ファイバーテイルが、前記左側のアデノウイルス逆方
向反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列と同じ血清型由来で
ある、請求項19に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項22】 前記ファイバーシャフトが、前記左側のアデノウイルス逆
方向反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列とは異なる血清型
由来である、請求項19に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項23】 前記ファイバーシャフトが、血清型3、血清型7、血清型
9、血清型11、および血清型35からなる群から選択される血清型由来である
、請求項22に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項24】 前記ファイバーシャフトが、短縮化された長さを含む、請
求項19に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項25】 前記ファイバーノブが、前記左側のアデノウイルス逆方向
反復配列および前記右側のアデノウイルス逆方向反復配列とは異なる血清型由来
である、請求項19に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項26】 前記ファイバーノブが、血清型3、血清型7、血清型9、
血清型11、および血清型35からなる群から選択される血清型由来である、請
求項25に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項27】 前記ファイバーノブが、目的の宿主細胞上の少なくとも1
つの表面タンパク質に結合する異種ペプチドリガンド配列で置換されたG−Hル
ープを含む、改変型ファイバーノブタンパク質である、請求項19に記載のアデ
ノウイルスベクター。 - 【請求項28】 前記第1の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列
であり、そして前記第2の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である
、請求項18に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項29】 前記第1の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側
の逆方向末端反復配列を含み、そして前記第2の逆方向反復配列が、アデノ随伴
ウイルスの右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項18に記載のアデノウイル
スベクター。 - 【請求項30】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)ポリアデニル化配列; b)該ポリアデニル化配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)該ポリアデニル化配列に対して3’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項18に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項31】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)プロモーター配列; b)該プロモーター配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)ポリアデニル化配列 を含む、請求項18に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項32】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項30または31に記載
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項33】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−1抗トリ
プシンからなる群から選択される、請求項32に記載のアデノウイルスベクター
。 - 【請求項34】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
、請求項32に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項35】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項32に
記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項36】 前記左側の逆方向末端反復配列に対して3’側に位置付け
られる逆方向反復配列または前記右側の逆方向末端反復配列に対して5’側に位
置付けられる逆方向反復配列をさらに含む、請求項30または31に記載の導入
遺伝子カセット。 - 【請求項37】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項30または31に記
載の導入遺伝子カセット。 - 【請求項38】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項30または31に記
載の導入遺伝子カセット。 - 【請求項39】 アデノウイルスの複製を指示するアデノウイルス配列が、
E2およびE4;E1、E2、およびE4;E2およびE4;ならびにE2、E
3、およびE4、からなる群から選択される、請求項18に記載のアデノウイル
スベクター。 - 【請求項40】 一部分が宿主細胞ゲノム中に組み込まれる、組換え弱活力
アデノウイルスベクターであって、以下: a)左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列; b)該左側のアデノウイルス逆方向末端反復配列に対して3’側にある第1の
アデノウイルスパッケージング配列; c)該アデノウイルスパッケージング配列に対して3’側にある第1の逆方向
反復配列; d)該第1の逆方向反復配列に対して3’側にある導入遺伝子カセット配列; e)該導入遺伝子カセットに対して3’側にある第2の逆方向反復配列;およ
び f)該第2の逆方向反復配列に対して3’側にある第2のアデノウイルスパッ
ケージング配列;および g)該第2のアデノウイルスパッケージング配列に対して3’側にある右側の
アデノウイルス逆方向末端反復配列、 を含み、ここで該左側の末端反復配列および該右側の末端反復配列は、該導入遺
伝子カセット配列が該宿主細胞ゲノム中に組み込まれることを可能にする、組換
え弱活力アデノウイルスベクター。 - 【請求項41】 前記左側のアデノウイルス逆方向反復配列および前記右側
のアデノウイルス逆方向反復配列、ならびに前記パッケージング配列が、同一の
アデノウイルス血清型由来である、請求項40に記載のアデノウイルスベクター
。 - 【請求項42】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)ポリアデニル化配列; b)該ポリアデニル化配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)該ポリアデニル化配列に対して3’側にあるプロモーター配列 を含む、請求項40に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項43】 前記導入遺伝子カセット配列が、以下: a)プロモーター配列; b)該プロモーター配列に対して3’側にある導入遺伝子配列;および c)該導入遺伝子カセットに対して3’側にあるポリアデニル化配列 を含む、請求項40に記載のアデノウイルスベクター。
- 【請求項44】 前記第1の逆方向反復配列が、左側の逆方向末端反復配列
であり、そして前記第2の逆方向反復配列が、右側の逆方向末端反復配列である
、請求項40に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項45】 前記第1の逆方向反復配列が、アデノ随伴ウイルスの左側
の逆方向末端反復配列を含み、そして前記第2の逆方向反復配列が、アデノ随伴
ウイルスの右側の逆方向末端反復配列を含む、請求項40に記載のアデノウイル
スベクター。 - 【請求項46】 前記導入遺伝子配列が、治療遺伝子、選択可能遺伝子、お
よびレポーター遺伝子からなる群から選択される、請求項42または43に記載
のアデノウイルスベクター。 - 【請求項47】 前記治療遺伝子が、γグロビン、およびヒトα−1抗トリ
プシンからなる群から選択される、請求項46に記載のアデノウイルスベクター
。 - 【請求項48】 前記選択可能遺伝子が、ネオマイシン、アンピシリン、ペ
ニシリン、テトラサイクリン、およびゲンタマイシンからなる群から選択される
、請求項46に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項49】 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、βガラク
トシダーゼ、アルカリホスファターゼからなる群から選択される、請求項46に
記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項50】 絶縁エレメントをさらに含む、請求項42または43に記
載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項51】 細菌の複製起点をさらに含む、請求項42または43に記
載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項52】 適切な細胞において分離された弱活力アデノウイルスベク
ターを生成する方法であって、該方法は、適切な条件下で、請求項1または18
に記載の第1のアデノウイルスベクターゲノムおよび第2のアデノウイルスベク
ターゲノムを、該細胞内に導入し、その結果、該組換えアデノウイルスベクター
が相同組換えを受けることによって、分離された弱活力アデノウイルスベクター
を生成する工程を包含する、方法。 - 【請求項53】 請求項52に記載の方法によって生成された、分離された
弱活力アデノウイルスベクター。 - 【請求項54】 前記第1のアデノウイルスベクターが、目的の遺伝子の5
’部分を有する導入遺伝子カセットを含み、そして前記第2のアデノウイルスベ
クターが、目的の遺伝子の3’部分を有する導入遺伝子カセットを含み、そして
該5’部分の一部が該3’部分の一部と重複し、その結果相同組換えが生じる、
請求項52に記載の方法。 - 【請求項55】 適切な細胞において、相同組換えによって分離された弱活
力組換えAdベクターを生成する方法であって、該方法は、2つの親の組換えA
dベクターを接触させる工程を包含し、各々は、重複する相同な領域を有する選
択された導入遺伝子の一部を含む導入遺伝子カセットを含み、その結果、第1お
よび第2の親の組換えAdベクターは、該重複する相同な領域で相同組換えを受
けて、選択された導入遺伝子の両方の部分を有する、分離された組換え弱活力A
dベクターを生じ、そしてここで該選択された導入遺伝子は、一対のITRによ
って隣接される導入遺伝子カセット内にある、方法。 - 【請求項56】 請求項55に記載の方法によって生成された、分離された
弱活力アデノウイルスベクター。 - 【請求項57】 無作為なペプチドの挿入によって提示され、そして改変さ
れたファイバータンパク質を発現する、請求項1、18、または40に記載の複
数のアデノウイルスベクターを含む、アデノウイルスライブラリー。 - 【請求項58】 上記のように提示された前記ファイバータンパク質が、フ
ァイバータンパク質ノブドメインのG−Hループ内において置換された無作為ペ
プチドを含む、請求項57に記載のライブラリー。 - 【請求項59】 遺伝子治療のための標的化アデノウイルスベクターをスク
リーニングする方法であって、請求項57に記載のアデノウイルスライブラリー
を、複数の細胞と接触させる工程であって、その結果、該細胞は、形質導入の生
じるアデノウイルスライブラリーのアデノウイルスベクターで形質導入される、
工程、およびそのように形質導入された細胞を検出する工程、を包含する、方法
。 - 【請求項60】 rep78タンパク質をコードするヌクレオチド配列をさ
らに含む、請求項9、10、30、31、42、または43に記載のアデノウイ
ルスベクター。 - 【請求項61】 前記逆方向末端反復配列が、同一のアデノウイルス血清型
由来である、請求項3、28、および44に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項62】 前記左側の逆方向末端反復配列に対して3’側に位置付け
られた逆方向反復配列または前記右側の逆方向末端反復配列に対して5’側に位
置付けられた逆方向反復配列をさらに含む、請求項42または43に記載のアデ
ノウイルス。
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