JP2002530112A - テルペン類を酸化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非環式もしくは環式テルペンまたはシクロアルケンである物質またはそれらの置換誘導体を酸化するプロセス。このプロセスには、これらの化合物を突然変異ヘム含有酵素で酸化することが含まれ、この突然変異体には、活性部位のアミノ酸のより極性の低い側鎖を有するアミノ酸による置換が含まれる。この酵素は、典型的はP450_camまたはP450_BM-3である。このほか、このプロセスを実施することができるかまたは有利な突然変異酵素を選択するのに使用できる細胞または細胞のライブラリーが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、テルペンおよびシクロアルケンを酵素的に酸化する方法に関する。

【０００２】 テルペノイド化合物は生物系に広く分布しており、天然物の最も大きなクラス
の一つをなしている。それらは精油の主要成分であり、中には香味料および香料
工業において極めて価値の高いものがある。また、多くのテルペノイドは生物学
的活性である。中には抗細菌剤や抗真菌剤であるものがあり、従って、製薬業界
での関心が高い。実際に、テルペノイドは、最も付加価値の高い薬品の一部を占
めている。

【０００３】 商業的な関心の対象となるテルペノイドは、通常、テルペンそのものではなく
、むしろ、親テルペンのアリル性および非活性炭素-水素結合における立体選択
的官能化が一般に必要となる誘導体である。このタイプの化学変換は、従来の化
学合成法により行うことが最も困難な反応の一つである。この場合、所要の高反
応性化学酸化剤は非選択性であることを要し、典型的には、それらは、より活性
な炭素-水素結合や反応性の官能基、例えば、テルペン中に一般に存在するオレ
フィン性二重結合を優先的に攻撃するであろう。

【０００４】 本発明は、テルペンおよびシクロアルケンの酵素的酸化に関する。この技術に
より、多くの場合、単一ステップでヒドロキシル化テルペン(およびシクロアル
ケン)を合成することが可能であり、しかも、基質と酵素との対応が正しければ
、この酸化反応は、高度に化学選択性(何らかの他の反応性官能基ではなく非活
性C-H結合のような特定の官能基を攻撃する)かつ立体選択性でありうる。従来の
試薬を用いた場合、基質酸化に対する基質特異性および選択性を微調整したり改
変したりすることは非常に困難である。

【０００５】 本発明は、非環式もしくは環式テルペンもしくはシクロアルケンである物質ま
たはそれらの置換誘導体を酸化する方法を提供する。この方法には、これらの化
合物を突然変異ヘム含有酵素で酸化することが含まれ、この突然変異体には、よ
り極性の低い側鎖を有するアミノ酸による活性部位のアミノ酸の置換が含まれる
。

【０００６】 本発明に使用されるテルペンは、一般的には、式(C₅H₈)_n〔式中、nは、2以上
、特に、2、3、または4である。〕を有するであろうが、「テルペン」という用
語は、一般にメチル基であるフラグメントの欠失またはシフトを含めて厳密には
「テルペノイド」と呼ばれる化合物にまで拡張されるものと解釈すべきである。
従って、例えば、本発明に使用可能なセスキテルペン(nが3である場合)は、15個
ではなく例えば単に14個の炭素原子を含むものであってよい。一般的には、テル
ペンとは、イソプレン単位から構成可能なテルペンである。テルペンは、環式で
あっても非環式であってもよい。

【０００７】 モノテルペン(nが2である場合)は、一般的には10個の炭素原子を有すると共に
、典型的には1〜3個の二重結合、特に1または2個の環二重結合、および典型的に
は0〜2個の環を有するであろう。これらの環のうちの1個は、典型的には0または
1個の炭素原子を含有する架橋として形成可能である。言い換えれば、存在する
環の2個の炭素原子間を直接連結するかまたは中間のメチレン基で連結すること
によって形成可能である。テルペンが非環式である場合、一般に、少なくとも2
個、通常は3個の二重結合が含まれるであろう。

【０００８】 セスキテルペンは、普通は14または15個の炭素原子を含有すると共に、典型的
には0〜2個の二重結合、ならびに縮合環および／または架橋環の可能性がある典
型的には1〜3個の環を有するであろう。

【０００９】 テルペン中に存在しうる環は、典型的には3〜9個の炭素原子、特に5または6個
の炭素原子を有するであろう。従って、特に、テルペンは、シクロヘキサン環ま
たはシクロヘキサジエン環を含有するであろう。

【００１０】 テルペンは、一般的には、合計で3または4個の環外のメチル基またはメチレン
基、例えば、モノテルペンの場合、2個のメチル基と1個のメチレン基、または3
個のメチル基、セスキテルペンの場合、3個のメチル基と1個のメチレン基、また
は4個のメチル基を含有するであろう。

【００１１】 モノテルペンは、典型的には、リモネン、ピネン、テルピネン、サビネン、ツ
ジェン、ミルセン(mercene)、オシメン(ocimeme)、ネロール、またはゲラニオー
ルであり、例えば、表1に示される通りである。

【００１２】 セスキテルペンは、一般的には、3個のイソプレン単位を頭-尾配置することに
よって形成される。セスキテルペンは、典型的には、アロマデンドレン、カリオ
フィレン、ロンギフォレン、バレンセン、イソバッザネン、シルフィネン、イシ
ュワラン、イソパトククラ-3-エン(isopatchchoul-3-ene)、またはイソセスキカ
レンであり、例えば、表2に示される通りである。

【００１３】 ジテルペン(nが4である場合)は、典型的には、カスベン、レチナール、アビエ
チン酸、またはジベレリンである。

【００１４】 シクロアルケンは、一般的には、9個までの環員を含み、具体的には、5、6、7
、8、9員、またはそれ以上の環である。シクロアルケンは、典型的には、シクロ
ヘキセンである。

【００１５】 任意の上記テルペンまたはシクロアルケンの置換誘導体を使用してもよい。典
型的には、1、2、3個、またはそれ以上の置換基が存在する。以下の置換基の任
意の組み合わせが存在してよい。置換基は、典型的には、ハロゲン原子であるか
、あるいは一般に1〜6個の炭素を有するアルキル基またはアルケニル基であり、
場合により、置換基は、1個以上のハロゲンで置換されている。それは一般的に
はフェニルシクロヘキセンではない。実際には、本発明で使用されるすべての基
質に対して、フェニルのような芳香環の存在は回避される。

【００１６】 置換基は、典型的には、式C_nH_kX_m〔式中、Xはハロゲンであり、nは、1、2、3
、またはそれ以上であり、mは、1、2、3、4、またはそれ以上であり、そしてkは
、置換基C_nH_kX_mの原子価が満足されるように適切な値を有する整数である。〕を
有する。アルキル置換基の場合、k+m=2n+1である。典型的には、kは、1、2、3、
4、またはそれ以上であり、0であってもよい。すなわち、置換基がペルハロアル
キル基であってもよい。ハロゲンは、典型的には、フッ素、塩素、または臭素で
ある。

【００１７】 また、置換基は、1、2個、またはそれ以上の酸素原子を含んでいてもよく、例
えば、アルコール基、アルデヒド基、ケトン基、またはエポキシド基であっても
よい。

【００１８】 酸化が起こると、一般的には炭素-水素結合の酸化によりヒドロキシドとしてC
-O結合が化合物中に形成されるが、C=C結合の酸化によりエポキシドを形成し得
る。従って、酸化により、ヒドロキシ基、アルデヒド基、ケトン基、またはエポ
キシド基を導入することが可能である。このほか、酸化により、酸素含有基の更
なる酸化、例えば、ヒドロキシ基からアルデヒド基またはケトン基への変換を起
こすことも可能である。同一基質分子中において、1、2個、またはそれ以上の炭
素原子を攻撃してもよい。

【００１９】 酸化が起こると、典型的には、1、2種、またはそれ以上の酸化生成物が形成さ
れる。これらの異なる生成物は、異なる炭素原子を攻撃することによりおよび／
または所定の炭素原子において異なる度合いで酸化を行うことにより得ることが
可能である。

【００２０】 酸化は、環炭素原子または置換基炭素原子のいずれか一方あるいはそれらの両
方で行うことが可能である。少なくとも、初期の酸化には、活性化されていても
活性化されていなくてもよいC-H結合の攻撃または炭素-炭素二重結合の攻撃(典
型的には、エポキシドが得られる)が関与するであろう。一般的には、活性C-H結
合は、炭素原子がベンジル位またはアリル位に存在する場合に生じる。芳香環お
よびオレフィン性二重結合は、ラジカル中間体の安定化または反応経路中で発生
する電荷の任意の蓄積を行うことによって、攻撃対象のC-H結合を活性化する。C
-H結合の炭素は、第一級、第二級、または第三級の炭素であってよい。

【００２１】 酸化の際、典型的には、立体異性が保存される。従って、基質が単一の立体異
性体から構成されている場合、生成物は、典型的には、単一の対応する立体異性
体から構成されているか、または対応する立体異性体を多く含有する可能性があ
る。

【００２２】 この方法で使用される酵素は、一般的には、P450酵素、典型的には、真核生物
または原核生物に由来するP450酵素である。酵素は、一般的には、細菌、真菌、
酵母、植物、または動物に由来するものであり、従って、Pseudomonas属の細菌
に由来するものであってよい。酵素は、典型的には、モノオキシゲナーゼである
。酵素の非突然変異形態は、テルペンおよび／またはシクロアルケンを酸化でき
るものであってもできないものであってもよい。

【００２３】 本明細書中に論じられている突然変異は、一般的には、酵素の部位特異的突然
変異誘発法、PCR法、および遺伝子シャフリング法のような当技術分野で周知の
方法を用いて、または部位特異的突然変異誘発のサイクル中で複数種の突然変異
誘発性オリゴヌクレオチドを用いて、酵素中に導入される。この場合、特定方向
にまたはランダムに突然変異を導入することが可能である。こうして、突然変異
誘発法を用いると、1種以上の異なる突然変異体をコードする1種以上のポリヌク
レオチドが産生される。典型的には、突然変異酵素のライブラリーを作製するの
に使用可能な突然変異オリゴヌクレオチドのライブラリーが作製される。

【００２４】 「活性部位の」アミノ酸とは、触媒作用中に基質が結合する部位に並ぶ（line
）かまたは該部位を規定するアミノ酸、あるいは基質が触媒部位に達する前に通
過しなければならない部位に並ぶかまたは該部位を規定するアミノ酸である。従
って、このようなアミノ酸は、典型的には、触媒部位への進入時または触媒作用
時に基質と相互作用する。このような相互作用は、典型的には、静電的相互作用
(荷電基または極性基の間)、疎水的相互作用、水素結合、またはファンデルワー
ルス力によって生じる。

【００２５】 活性部位のアミノ酸は、当業者にはごく普通の方法により同定可能である。こ
うした方法としては、基質に接触するアミノ酸を改変(「標識」)する基質に酵素
を結合させる標識付け研究が挙げられる。このほか、活性部位のアミノ酸を推定
するために、結合した基質を有する酵素の結晶構造を取得することもできる。

【００２６】 酵素は、置換、挿入、または欠失のような他の突然変異を、1、2、3、4、5〜1
0、10〜20個、またはそれ以上有していてもよい。他の突然変異は、活性部位に
あってもよいし活性部位の外部にあってもよい。典型的には、突然変異は、活性
部位の1個以上のアミノ酸の位置または配向に影響または接触する「第２範囲」
残基に存在する。挿入は、典型的には、Nおよび／またはC末端に存在し、従って
、酵素は、融合タンパク質の一部分であってよい。欠失には、一般に、触媒作用
に関与しないアミノ酸、例えば、活性部位の外部のアミノ酸の欠失が包含される
(この場合、酵素は、天然に存在する酵素の突然変異断片である。)。従って、酵
素は、酸化活性に必要なアミノ酸だけを含むものであってよい。

【００２７】 活性部位の他の突然変異は、典型的には、活性部位に結合したときの基質の位
置および／または立体配座を変化させる。突然変異により、酸化させるべき基質
上の部位が更にヘム基に接近できるようになる。この場合、突然変異は、大きさ
がより小さいかもしくはより大きい側鎖または極性がより大きいかもしくはより
小さい側鎖を有するアミノ酸との置換であってよい。

【００２８】 他の突然変異は、典型的には、タンパク質の安定性を増大させるかまたはタン
パク質の精製をより容易にする。典型的には、こうした突然変異は、典型的には
タンパク質からシステイン残基を除去することによって(例えば、P450_camの334
位または相同体中の等価な位置にあるシステインを好ましくはアラニンと置換す
ることによって)、タンパク質の二量化を防止する。突然変異を用いると、例え
ば、欠失またはポリヒスチジンタグの導入によって、またはN末端膜アンカー配
列の突然変異によって、可溶性形態でタンパク質を調製することが可能になる。
突然変異は、典型的には、タンパク質表面上の疎水性パッチ間の接触により生じ
るオリゴマー化のようなタンパク質のオリゴマー化を防止する。

【００２９】 かくして、突然変異酵素は、典型的には、アミノ酸同一性に基づいて、天然に
存在するヘム含有酵素に対して少なくとも70%の相同性を有する。

【００３０】 本明細書中に記載の相同性タンパク質(すなわち、他のタンパク質に対して相
同性があると記載されたタンパク質)はいずれも、典型的には、関連タンパク質
に対して、少なくとも20個、好ましくは少なくとも30個、例えば、少なくとも40
、60、もしくは100個、またはそれ以上の連続するアミノ酸にわたり、少なくと
も70%または少なくとも80もしくは90%の相同性を有し、より好ましくは少なくと
も95%、97%、または99%の相同性を有する。連続するアミノ酸には、活性部位が
含まれていてもよい。この相同性は、連続するアミノ酸にわたって測定するので
はなく、そのかわりに、活性部位のアミノ酸だけについて測定してもよい。

【００３１】 相同性は、周知の方法により測定可能である。例えば、UWGCGパッケージには
、相同性を計算するのに使用できる(例えば、そのデフォルト設定で使用できる)
BESTFITプログラムが用意されている(Devereuxら(1984) Nucleic Acids Resear
ch 12, p387-395)。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムを用いると、相同性の計算
または配列の整列を行うことができる(典型的には、該プログラムのデフォルト
設定が用いられる)。これについては、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol E
vol 36:290-300; Altschul, S. Fら(1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されて
いる。

【００３２】 BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology
Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である
。このアルゴリズムには、データベース配列中の同一長の文字列とのアライメン
トを行ったときに、いくらか正の値をとる閾値スコアTと一致するかまたはそれ
を満たす長さWの短い文字列を問合せ配列中で同定することによって、高スコア
配列対(HSP)を最初に同定することが含まれる。Tは、検索対象（neibourhood）
文字列スコア閾値と呼ばれる(Altschulら, 前掲)。こうした初期の検索対象文字
列ヒットは、検索を開始するためのシードとして機能し、これを用いて、シード
を含有するHSPの探索が行われる。文字列ヒットは、累積アライメントスコアが
増大可能である限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積アライメントス
コアがその最大到達値から数量Xだけ離れた位置にくる場合、1個以上の負スコア
残基アライメントの累積により累積スコアがゼロもしくはそれ以下になる場合、
またはいずれかの配列の末端に達した場合に、各方向における文字列ヒットの伸
長を停止させる。BLASTアルゴリズムのパラメーターW、T、およびXによって、ア
ライメントの感度および速度が決定される。BLASTプログラムでは、デフォルト
として、文字列の長さ(W) 11、BLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoffお
よびHenikoff (1992) Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89: 10915-10919を参照され
たい)アライメント(B) 50、期待値(E) 10、M=5、N=4、および両方の鎖の比較が
用いられる。

【００３３】 BLASTアルゴリズムでは、2個の配列間の類似性について統計解析が行われる。
例えば、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-
5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の一
つは、2個のヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間での一致が偶然に起こり
うる確率の指標となる最小合計確率(P(N))である。例えば、第一の配列と第二の
配列との比較において最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ま
しくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、配列はもう一方の
配列と類似しているとみなされる。

【００３４】 典型的には、相同タンパク質は、タンパク質全体または先に記載の連続するア
ミノ酸の任意の長さにわたって比較した場合、少なくとも1、2、5、または10個
の突然変異(置換、挿入、もしくは欠失)が存在する点で関連タンパク質と異なっ
ている。

【００３５】 本発明の方法に使用される酵素は、好ましくは、P450_camの突然変異体(例えば
、表7に示されている配列の突然変異体)またはP450_camの天然に存在する相同体
の突然変異体、典型的には、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
由来のP450_BM-3の突然変異体(例えば、表8に示されている配列の突然変異体)、
シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp）由来のP450_terpの突然変異体、お
よびサッカロポリスポラ・エリスレア（Saccharopollyspora erythraea）由来の
P450_eryFの突然変異体、更にまたストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyc
es griseus）株由来のP450 105 D1 (CYP105)の突然変異体である。P450_BM-3に対
して表8に示されているアミノ酸の番号付けは、この酵素中の突然変異を示すた
めの説明に使用されている番号付けと対応していないことに留意されたい。表8
に示されている配列には、追加の１アミノ酸がN末端に含まれている。これは通
常in vivoで切断される。従って、表に示されている各アミノ酸番号は、常に、
慣例的な番号付けで使用される(本説明に使用されているような)番号よりも1大
きい。

【００３６】 P450_cam(例えば、P450_BM-3)の天然に存在する相同体は、P450_camまたはP450_{BM -3} と実質的に同じ活性を有していることもある。相同体は、シュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）由来のP450_cam、またはP450_BM-3の種相同体であっ
てもよいし対立遺伝子変異体であってもよい。相同体の活性部位のアミノ酸は、
P450_camまたはP450_BM-3の活性部位のものと同じであってよい。典型的には、該
相同体において、P450_camの96位に等価な位置にあるアミノ酸はチロシンである
。

【００３７】 P450_camの突然変異体またはP450_camの相同体の突然変異体は、典型的には、ア
ミノ酸96または相同体中の等価なアミノ酸が、より極性の低い側鎖を有するアミ
ノ酸に変更されたものである。相同体がP450_BM-3である場合、突然変異体は、典
型的には、47および／または51および／または42および／または75および／また
は354および／または264および／または263および／または181位に置換(より極
性の低いアミノ酸への置換)を有し、そして典型的には、P450_camの96に等価な部
位に突然変異を有していない(P450_BM-3の好ましい突然変異体は、少なくとも、4
7および51位または相同体中の等価な部位に突然変異を有している)。

【００３８】 この場合、典型的には、置換は、表3中の元のアミノ酸よりも上に記載される
アミノ酸への置換であり、具体的には、表4および表5に示されている好ましい突
然変異が挙げられる。

【００３９】 相同体中の「等価な」側鎖とは、相同な位置にある側鎖である。これは、2種
の配列間の相同性に基づいてP450_camまたはP450_BM-3の配列および相同体の配列
を整列させることによって推定可能である。配列を整列させるために、PILEUPお
よびBLASTアルゴリズムを使用することができる。等価なアミノ酸は、一般的に
は、相同体の活性部位中の位置のうち、本明細書中に記載の特定のアミノ酸のい
ずれか、例えば、P450_camのアミノ酸96と同様の位置に存在するであろう。

【００４０】 以下の説明では、P450_camおよびP450_BM-3で置換を行いうる位置の例を示す。
相同体中の等価な位置で同じ置換を行うことが可能である。標準的な命名法を用
いて突然変異を表す。天然の形態で存在するアミノ酸の文字に続いて位置が記さ
れ、次に、突然変異体中のアミノ酸が記される(これらの位置は、表8のアミノ酸
の番号付けに関する先に記載の但し書きを考慮して、表7および8に示されている
番号付けと対応させることができる)。同一タンパク質中の複数の突然変異を表
すために、各突然変異は、ハイフンで分離させて列挙されている。この命名法を
用いて以下で論じられている突然変異は、P450_camまたはP450_BM-3中の天然アミ
ノ酸を特定するものであるが、等価な位置に異なるアミノ酸を有する相同体に対
しても(同じ)突然変異を起こすことが可能であるものと解釈しなければならない
。

【００４１】 追加の突然変異は、典型的には、P450_camのアミノ酸87、98、101、185、244、
247、248、296、395、396(またはこれらの組み合わせ、例えば、表4に示されて
いる組み合わせ)におけるアミノ酸置換である。

【００４２】 P450_camの場合、以下の組み合わせの置換が好ましい。 (i) 異なる側鎖体積を有するアミノ酸への87位における置換、例えば、A、L、
I、およびWへの置換(典型的にはFの置換)と、(典型的にはYから) A、L、F、およ
びWのような異なる側鎖体積を有するアミノ酸への96位における置換との組み合
わせ。こうした組み合わせを用いると、野生型酵素と比較して、例えば、Y96W-F
87W (空間が少ない)からY96A-F87A (空間がより多い)へ、基質ポケットの上部の
利用可能な空間が変化し、更に、例えば、Y96F-F87A中の一方の側からY96A-F87W
中の他方の側へ、空間の位置が変化する。

【００４３】 (ii) 96位におけるFへの置換と185位および395位における置換との組み合わせ
。T185およびI395はいずれも基質ポケットの上部に存在し、Aで置換すると、よ
り多くの空間が形成され、Fで置換すると、利用可能な空間が減少し、基質がヘ
ムの近くに追いやられるであろう。

【００４４】 (iii) 96位におけるA、L、F、およびWへの置換と、101、244、247、295、296
、および396位を含むヘムにより近い残基におけるA、L、F、またはWへの置換と
の組み合わせ。こうした組み合わせを用いると、様々な側鎖の領域で空間が形成
または削減され、様々なサイズを有する基質が、様々な結合配向をとるようにな
るであろう。例えば、組み合わせY96W-L244AおよびY96L-V247Wを用いると、R-リ
モネンの結合に対して非常に異なる基質ポケットが提供されるであろう。

【００４５】 (iv) 87、96、244、247、295、296、395、および396位を組み合わせた位置に
おけるA、L、F、およびWを組み合わせた3個の置換。この目的は、疎水性基質結
合ポケットのサイズおよび形状を変化させることである。例えば、Y96A-F87A-L2
44Aの組み合わせを用いると、Y96F-F87W-V396Lの組み合わせと比較して、より多
くの空間が形成されるので、より大きなテルペンが前者に結合できるようなるが
、後者の場合には、より小さなテルペンの利用可能な結合配向が制限される。組
み合わせY96F-F87W-V247LおよびY96F-F87W-V295Iは、同様の基質ポケット体積を
有するが、基質結合に利用しうる空間の位置は、非常に異なっている。組み合わ
せY96F-F87L-V247Aは、96位において、組み合わせY96L-F87L-V247Aよりも僅かに
大きな側鎖体積を有するが、96位のL側鎖は、より一層フレキシビリティーが大
きいので、これらの2種の三重突然変異体に対する基質結合配向は、異なるであ
ろう。

【００４６】 (v) 基質酸化の選択性に変化を生じさせるべく、基質体積、種々の側鎖の様々
なフレキシビリティー、およびテルペン結合に対する基質ポケット中の利用可能
な空間の位置を操作する類似の原理を用いて、4または5個の置換を有する突然変
異体を設計した。

【００４７】 本発明はまた、突然変異：F87A-Y96G-F193A、F87A-Y96G-F193A-C334A、または
T101M-T185F-V247Mだけを有するP450_camの突然変異体を除いて、先に論じたよう
に、P450_camの突然変異体またはP450_camの相同体(例えば、P450_BM-3)の突然変異
体を提供する。

【００４８】 突然変異酵素は、実質的に単離された形態および／または実質的に精製された
形態であってよく、この場合、酵素には一般に、その調製時、タンパク質が、(
例えば、およそまたは少なくとも)90%、具体的には、(例えば、およそまたは少
なくとも) 95%、98%、または99%含まれるであろう。

【００４９】 本発明はまた、本発明の突然変異酵素をコードする配列を含むポリヌクレオチ
ドを提供する。ポリヌクレオチドは、典型的には、DNAまたはRNAであり、一本鎖
であっても二本鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、本明細書中で論じられ
ている任意の突然変異体の天然に存在する形態をコードするポリヌクレオチド(
それぞれ、表7または8に示されているポリヌクレオチド)とハイブリダイズする
ことのできるものでありうる。それは、典型的には、バックグラウンドよりも顕
著に高いレベルで関連ポリヌクレオチドとハイブリダイズする。相互作用により
生成するシグナルレベルは、典型的には、「バックグラウンド」ハイブリダイゼ
ーションの少なくとも10倍、好ましくは少なくとも100倍の強度である。相互作
用の強度は、例えばプローブを³²Pなどで放射性標識することによって測定可能
である。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中程度〜高度のストリ
ンジェンシー条件(例えば、0.03M塩化ナトリウムおよび0.03Mクエン酸ナトリウ
ム、約50℃〜約60℃)を用いて行われる。

【００５０】 本発明のポリヌクレオチドは、組換え複製ベクター中に組み込むことができる
。このベクターを用いて適合宿主細胞中で核酸を複製することが可能である。こ
の場合、本発明のポリヌクレオチドを作製する一つの方法には、本発明のポリヌ
クレオチドを複製ベクター中に導入すること、ベクターを適合宿主細胞中に導入
すること、およびベクターの複製を引き起こす条件下で宿主細胞を増殖させるこ
とが含まれる。ベクターは、宿主細胞から回収可能である。好適な宿主細胞につ
いては、発現ベクターと関連させて以下で説明する。

【００５１】 好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコー
ド配列の発現を提供しうる調節配列に機能しうる形で連結されている。すなわち
、このベクターは発現ベクターである。

【００５２】 「機能しうる形で連結される」という用語は、記載の構成要素が、意図される
ように機能できる関係で存在する並置状態を意味する。コード配列に「機能しう
る形で連結された」調節配列は、調節配列と適合する条件下でコード配列の発現
が行われるようにライゲートされる。

【００５３】 このようなベクターは、突然変異酵素の発現を提供するのに好適な宿主細胞中
に形質転換することが可能である。

【００５４】 ベクターは、例えば、複製起点、場合により該ポリヌクレオチドを発現させる
ためのプロモーター、および場合によりプロモーターのレギュレーターを備えた
プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはファージベクターであってよい
。ベクターには、1種以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミ
ドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、哺乳動物ベクターの場合にはネオマイシ
ン耐性遺伝子が含まれる。ベクターは、例えば、RNAの産生のために、in vitro
で使用してもよいし、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使
用してもよい。

【００５５】 プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現ベクターの設計を合わせた
宿主細胞に適合するように選択することが可能である。例えば、大腸菌（E.Coli
）プロモーターとしては、lac、tac、trc、trp、およびT7プロモーターが挙げら
れ、酵母プロモーターとしては、S.セレビシエ（S. cerevistiae）GAL4およびAD
Hプロモーター、S.ポンブ（S. pombe）nmtlおよびadhプロモーターが挙げられる
。哺乳動物プロモーターとしては、カドミウムのような重金属に応答して誘導さ
れるメタロチオネインプロモーターが挙げられる。発現ベクターは、昆虫または
哺乳動物の細胞中での使用が可能である。昆虫細胞中で使用するためには、ポリ
ヘドリンプロモーターのような強力なバキュロウイルスプロモーターが好ましい
。哺乳動物細胞中で発現させるために、SV40ラージT抗原プロモーター、CMVプロ
モーター、またはアデノウイルスプロモーターのような強力なウイルスプロモー
ターを使用してもよい。これらのプロモーターはいずれも、当技術分野で容易に
入手可能である。

【００５６】 本発明の発現ベクターは、典型的には、リン酸カルシウム沈降法、DEAE-デキ
ストラントランスフェクション法、またはエレクトロポレーション法を含む、慣
例の技法を用いて宿主細胞中に導入される。

【００５７】 発現ベクターは、選択可能なマーカーを含有してもよく、および／またはこの
ような選択可能なマーカーは、発現ベクターと共トランスフェクトして安定なト
ランスフェクト細胞を選択してもよい。

【００５８】 好適な細胞としては、上記のベクターを発現しうる細胞が挙げられる。このよ
うな細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。こうした細胞には、
微生物細胞、典型的には細菌、例えば、大腸菌（好ましくはDH_5α、JM109、NM52
2、およびBL21DE3株）、またはシュードモナス属（Pseudomonas）（典型的には
プチダ種（putida）、哺乳動物細胞（例えば、CHO細胞、COS7細胞、またはHeLa
細胞）、昆虫細胞、あるいは酵母（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces
））が包含される。バキュロウイルスまたはワクシニア発現系を使用してもよい
。

【００５９】 細胞培養は、標準的な条件下で行うことができる。一般的には、細胞は、同化
可能な炭素および窒素の供給源の存在下で培養される。細胞培養用の市販の培養
培地は、広く入手可能であり、製造業者の取扱い説明書に従って使用可能である
。

【００６０】 典型的には、本発明の方法は、in vitroで、例えば、無細胞系で、行われる。
本発明の方法は、細胞中においてin vivoで行ってもよい。

【００６１】 典型的には、酵素(a)および基質に加えて、電子伝達レダクターゼ(b)、電子伝
達レドキシン(c)、酵素の補因子、および酸素供与体の存在下で、本発明の方法
が行われる。この系では、電子の流れは、典型的には、補因子→(b)→(c)→(a)
である。しかしながら、P450_BM-3のように、特定の酵素は、電子伝達レダクター
ゼ（electron reductase）および電子伝達レドキシンの存在を必要としない。以
下の論述は、特にレダクターゼまたはレドキシンを必要とする酵素に関するもの
であるが、これらを必要としない酵素についても当てはまる(例えば、種々の濃
度、条件、および速度は、これらの酵素にも適している)。

【００６２】 間違いなくレダクターゼおよびレドキシンを必要とする酵素の場合、(b)は、
一般的には、補因子から(c)への電子の伝達を媒介しうる電子伝達レダクターゼ
、例えば、天然に存在するレダクターゼ、または天然に存在するレダクターゼに
対して相同性、例えば、少なくとも70%の相同性を有するタンパク質であるか、
あるいはこうしたレダクターゼまたは相同体の断片である。この場合、(b)は、
ヘム含有酵素の起源でありうる上記の微生物のいずれからの由来であってよい。
(b)は、典型的には、プチダレドキシンレダクターゼのようなフラビン依存性レ
ダクターゼである。

【００６３】 (c)は、一般的には、(b)を介して補因子から(a)への電子の伝達を媒介しうる
電子伝達レドキシンである。(c)は、典型的には、天然に存在する電子伝達レド
キシン、または天然に存在する電子伝達レドキシンに対して相同性、例えば、少
なくとも70%の相同性を有するタンパク質であるか、あるいはこうしたレドキシ
ンまたは相同体の断片である。この場合、(c)は、ヘム含有酵素の起源でありう
る上記の微生物のいずれからの由来であってよい。(c)は、典型的には、プチダ
レドキシンのような二鉄/二硫黄レドキシンである。

【００６４】 補因子は、電子を(b)に供与しうる任意の化合物、例えば、NADHである。酸素
供与体は、酸素を(a)に供与しうる任意の化合物、例えば、ジオキシゲンである
。

【００６５】 本発明の方法において、(a)、(b)または(c)の濃度は、典型的には10^-8〜10^-2
Ｍ、好ましくは10^-6〜10^-4Ｍである。典型的には、(a)：(b)および／または(a)
：(c)の濃度の比は、１：0.1（0.1：01）〜１：10、好ましくは１：0.5〜１：２
、または１：0.8〜１：1.2である。通常、該方法は、該酵素が機能できる（例え
ば該酵素が少なくとも20％、50％、80％またはそれ以上のピーク活性を有する場
合などの）温度および／またはpHで行う。典型的には、該pHは３〜11、例えば５
〜９または６〜８、好ましくは７〜7.8または7.4である。典型的には、該温度は
15〜90℃、例えば25〜75℃または30〜60℃である。１つの実施形態では、該方法
は、過酸化水素副生成物を除去できる物質（例えばカタラーゼ）の存在下で行う
。

【００６６】 あるいはまた、本発明の方法は、酵素、基質および酸素原子供与体（例えば過
酸化水素またはt-ブチルヒドロペルオキシド）の存在下で行うことができる。し
たがって、該方法は、ペルオキシドシャントを用いて行ってもよい。

【００６７】 典型的には、該方法において、少なくとも20ターンオーバー／分が起こり、例
えば少なくとも50、100、200、300、500またはそれ以上のターンオーバーである
（ターンオーバーは、酵素１ナノモル当たり形成される生成物のナノモルとして
測定される）。

【００６８】 本発明はまた、幾つかのタイプの細胞を提供する。第1のタイプは、 該方法において用い得る酵素であって、その天然に存在する形態において電子
伝達レダクターゼドメインを有する該酵素を発現するか、あるいは (a)本発明の方法で用いられる突然変異型ヘム含有酵素； (b)電子伝達レダクターゼ；および (c)電子伝達レドキシン を発現する。

【００６９】 第2のタイプの細胞は、 (a) (i)P450_camもしくはその断片；または (ii)P450_camの天然に存在する相同体もしくはその断片；または (iii) P450_camの突然変異体；または (iii)(i)もしくは(ii)と少なくとも70％のアミノ酸相同性を有し、かつ場合
によっては本明細書中で述べる突然変異の組合せのいずれかを有するポリペプチ
ド；ならびに (b)電子伝達レダクターゼ；および (c)電子伝達レドキシン を発現するが、但し、発現されるP450_camの突然変異体が以下の中に包含される
大腸菌DH5α細胞は除外する： H₂N-P450_cam-TDGTSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキ
シン-COOH、 H₂N-P450_cam-TDGTRPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プ
チダレドキシン-COOH、 H₂N-P450_cam-TDGTRPGPGPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS
-プチダレドキシン-COOH、 H₂N-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-PLEL- P450_{ca m} -COOH。

【００７０】 しかし、除外された大腸菌DH5α細胞は、後記で述べるライブラリーの作製に
は用いることができると理解されたい。

【００７１】 好ましい細胞（第２のタイプ）は、以下を発現する細胞である： (a) (i)P450_BM-3もしくはその断片；または (ii)P450_BM-3の天然に存在する相同体もしくはその断片；または (iii)突然変異型P450_BM-3もしくはその突然変異型相同体。

【００７２】 本発明により提供される細胞は、典型的には、本発明のヌクレオチドが発現さ
れ得る、上記の種からの細胞である。該細胞は、ミューテーター細胞であっても
よい。そのような細胞は通常、主要なDNA修復経路（例えば、大腸菌経路mutS、m
utDもしくはmutT、または他の生物におけるそれらの等価物）の１つ以上に欠陥
があり、そのために、高い突然変異率を有している。そのような細胞を単に培養
することにより、(a)をコードするDNAが突然変異を起こすようになる。該細胞は
、大腸菌XL1 Redミューテーター株のものであってもよい。

【００７３】 本発明の細胞は、実質的に単離された形態および／または実質的に精製された
形態のものであってもよく、その場合、それは通常、該細胞または調製物の質量
（通常は乾燥質量として測定される）の（例えば、少なくとも、または約）90％
、（例えば、少なくとも、または約）95％、98％または99％を含む。

【００７４】 該細胞は、天然では(a)、(b)または(c)を発現しないものであってもよい。該
細胞は、(a)、(b)または(c)が天然に存在する細胞におけるよりも高いレベルで
発現されるものであってもよい。(a)は(b)または(c)と同じ生物から生じるもの
であってもよい。

【００７５】 該細胞において、(a)、(b)および(c)は、同じベクターから発現されてもよい
し、あるいは異なるベクターから発現されてもよい。それらは、３種の異なるポ
リペプチドとして発現されてもよい。あるいはまた、それらは融合タンパク質の
形態で発現されてもよい。典型的には、構成要素 (a)、(b)および(c)は全て、同
じ融合タンパク質中に存在する。あるいはまた、それら構成要素の中の２つだけ
が、好ましくは(b)と(c)が融合タンパク質中に存在してもよい。典型的には、そ
れらの構成要素は、融合タンパク質中で連続しており、リンカーペプチドは存在
しない。

【００７６】 あるいはまた、リンカーがそれら構成要素の間に存在してもよい。該リンカー
は通常、バルキーな側鎖を有さず、そのために該タンパク質のサブユニットのフ
ォールディングを妨げないアミノ酸を含む。好ましくは、該リンカー中のアミノ
酸は荷電していない。該リンカー中の好ましいアミノ酸は、グリシン、セリン、
アラニンまたはトレオニンである。１つの実施形態において、該リンカーは、配
列N-Thr-Asp-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser-Cを含む。該リンカーは典型的には、少なく
とも５個のアミノ酸長、例えば少なくとも10、30もしくは50またはそれ以上のア
ミノ酸長である。

【００７７】 第1のタイプの細胞は、宿主細胞を本発明のポリヌクレオチドまたはベクター
で形質転換またはトランスフェクトすることにより得ることができる。

【００７８】 本発明の突然変異酵素は、第1のタイプの細胞を、該突然変異酵素の発現をも
たらす条件下で培養すること、および場合により発現した突然変異酵素を回収す
ること、を含む方法により調製することができる。

【００７９】 本発明の方法は、本発明の第1のタイプの細胞内または第2のタイプの細胞内で
行うことができるが、但しこれは、それが該基質またはそれを含む培地を酸化で
きる場合である。通常、そのような方法は、該細胞内に該基質を提供すること、
該基質を本発明の方法で酸化させること、および場合により酸化生成物をそこか
ら（例えば抽出により）得ること、を含む。該基質は、典型的には、該基質を該
細胞の外側に添加して、それを該細胞へ侵入させることにより、該細胞に提供さ
れる。あるいはまた、該基質は、該細胞内で前駆体から合成することができる。

【００８０】 本発明はまた、P450_camの突然変異体またはP450_camの相同体の突然変異体のラ
イブラリーを作製するための方法であって、第2のタイプの細胞を突然変異原と
接触させること、および／または、該細胞がミューテーター細胞である場合、該
細胞を突然変異体が生じる条件下で培養すること、を含んでなる該方法を提供す
る。該突然変異原は、該細胞と、該細胞を培養する前に接触させてもよいし、ま
たは培養の間に接触させてもよい。したがって、該突然変異原は、該細胞の複製
または該細胞のゲノムの複製の間に存在させることができる。

【００８１】 該突然変異原は通常、(a)をコードするポリヌクレオチド配列中でランダム突
然変異を引き起こす。該突然変異原は、典型的には化学的突然変異原であり、例
えばニトロソメチルグアニジン、メチル-またはエチルメタンスルホン酸、ニト
リル、ヒドロキシルアミン、DNA塩基類似体、およびアクリジン色素（例えばプ
ロフラビン）が挙げられる。それは、典型的には、260nm（DNAの吸収極大）での
紫外線放射およびＸ線のような電磁波である。それは典型的にはイオン化放射で
ある。

【００８２】 典型的には、該ライブラリーは、突然変異誘発により本発明の細胞から誘導さ
れる細胞の形態であり、該細胞は、突然変異酵素を含んでいる。通常、各細胞は
、１つの特定の突然変異酵素だけを発現する。該ライブラリーは、典型的には、
少なくとも500の突然変異体、例えば少なくとも1,000または5,000の突然変異体
、好ましくは少なくとも10,000の異なる突然変異体を含む。

【００８３】 該ライブラリーは、典型的には、ランダムな突然変異体の集団を含む。該ライ
ブラリーは、作製されながら１ラウンド以上の選択を受けてもよく、したがって
、ランダムな集団を含んでいなくてもよい。選択のラウンドの間に、該ライブラ
リー中の細胞を複製させてもよく、またそれらは突然変異原と接触させてもよい
。

【００８４】 突然変異体は、該ライブラリーから、該突然変異体の特定の特性に基づいて選
択できる。その特性は、次の特徴の１つ以上を含み得る： (i)特定の基質を（場合によっては特定の酸化生成物または特定の活性を有する
生成物へと）酸化する能力、 (ii) 増大した速度で基質の酸化を行う能力、 (iii)特定の基質に対する酸化活性の低下、 (iv)特定の基質の生成の低下。

【００８５】 典型的には、(i)における生成物の活性は、該ライブラリーの細胞にとって致
死的である物質（agent）の作用の遮断である。これは、該ライブラリーを該物
質の存在下で増殖させることにより選択できる。該物質は、典型的には、該ライ
ブラリーの細胞内で発現される。

【００８６】 その活性は、特定の物質（例えばタンパク質）への該生成物の結合であっても
よい。その物質は、典型的には該ライブラリーの細胞内に存在し、および／また
は、典型的には疾患を引き起こす標的もしくは治療的な標的である。典型的には
該物質に結合する指示物質（indicator）を用いて、該物質への該生成物の結合
を検出する。１つの実施形態では、該指示物質は、該物質に結合でき、かつ結合
すると変化する特性（例えば色の変化）を有する。したがって、該指示物質を該
物質から移動させる生成物は、その特性の変化を測定することにより検出できる
。

【００８７】 本発明はまた、酸化生成物のライブラリーを作製する方法であって、基質を突
然変異酵素のライブラリーに提供すること、および該基質を酸化させること、を
含む該方法を提供する。

【００８８】 本発明の方法において生産される生成物、または該ライブラリーを用いて同定
、選択、作製もしくは設計される生成物は、治療または診断に用いることができ
る。したがって、本発明は、疾患に罹患している宿主を治療する方法であって、
該宿主に治療上有効な量の該生成物を投与することを含む該方法を提供する。し
たがって、該疾患に罹患しており、かつ該生成物を必要とする患者の症状は、該
生成物の投与により改善できる。該生成物はまた、典型的には該疾患の危険があ
る、または該疾患に罹患しやすい宿主に予防薬として与えることもできる。

【００８９】 本発明は、治療によるヒトまたは動物の体の処置方法における使用のための該
生成物を提供する。本発明はまた、ヒトまたは動物の体について実施される診断
方法における使用のための該生成物を提供する。本発明はまた、疾患を治療する
ための医薬の製造における該生成物の使用を提供する。

【００９０】 生物による感染症の予防または治療において用いるための該生成物の処方は、
同定される生成物の性質、薬学的な使用を意図しているのかまたは獣医学的な使
用を意図しているのか、などの要因に応じて決まる。患者に投与するためには、
該化合物は、該生成物および製剤学上許容される担体もしくは希釈剤を含有する
医薬組成物の形態で提供される。好適な担体および希釈剤としては、リン酸緩衝
化食塩水のような等張塩溶液が挙げられる。典型的な経口投与組成物としては、
錠剤、カプセル剤、溶液剤（liquid solutions）および液状懸濁剤が挙げられる
。例えば、それは、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮または経口投与のため
に処方され得る。

【００９１】 生成物の投与量は、種々のパラメーターにしたがって、特に用いられる物質；
治療しようとする患者の年齢、体重および症状；投与の経路；ならびに必要とさ
れるレジュメにしたがって決定できる。医師であれば、任意の特定の患者につい
て必要な投与経路および投与量を決定できる。しかし、好適な用量は、体重kg当
たり0.1から100mg、例えば体重kg当たり１から40mgを、例えば1日当たり１から
３回摂取するものであり得る。

【００９２】 本発明を、添付の図面により説明するが、該図面は各種の酸化反応についての
ガスクロマトグラフィーの結果を示している。図面において、特記しない限り、
ｙ軸はmVを示し、ｘ軸は時間（分）を示す。

【００９３】 本発明を実施例によっても説明する。

【００９４】実施例１ in vitro研究のための突然変異体の発現 P450_cam酵素は、ベクターpRH1091（Baldwin, J.E., Blackburn, J.M., Heath,
R.J.,およびSutherland, J.D. Bioorg. Med. Chem. Letts., 1992, 2, 663-668
）を用いて発現させた。このベクターはtrcプロモーター（trpおよびlacプロモ
ーターの融合体）を利用するものであった。このベクターには強力なリボゾーム
結合部位（RBS）が組み込まれており、発現させようとする遺伝子は該遺伝子の
５′末端にあるNdeI部位を用いてクローニングする。本発明者らは、camC遺伝子
の３′末端でのクローニング部位としてHindIIIを用いた。タンパク質発現のた
めの手順は次のとおりである：細胞を30℃で、OD_600nmが1.0〜1.2に達するまで
増殖させ、温度を37℃まで上昇させ、樟脳を１Ｍストック（エタノール溶液）と
して最終濃度１mMまで添加する。培養物を37℃でさらに６時間インキュベートす
る。P450_camタンパク質は細胞質内で高レベルまで発現されると、その細胞は赤
色から赤橙色を帯びる。

【００９５】 本発明者らはまたpRH1091の変異体を（PCRにより）調製した。この変異体はRB
SとNdeI部位との間に追加のXbaI部位を有する。このことは、M13においてNdeIが
ユニークではないので重要であり、この制限部位は、レダクターゼ遺伝子ならび
にin vivo系のために用いられるpGLW11ベクターのバックボーンにも存在する。X
baIはM13のポリリンカー領域においてはユニークであるが、P450_cam系における
全３種のタンパク質の遺伝子および発現ベクターには存在しない。したがって、
それにより、camC遺伝子が突然変異ベクターと発現ベクターとの間で移動可能と
なる。

【００９６】 バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由来のP450_BM-3酵素はpGLW1
1ベクターまたはpCWベクターを用いて発現させた。P450_BM-3遺伝子がこれらのベ
クターのいずれかに挿入されている組換えプラスミドを大腸菌DH5α株に形質転
換し、アンピシリン選択下で増殖させた。次に、シングルコロニーを30℃にてア
ンピシリンを加えたLB培地中で、600nmにおけるODが約１に達するまで増殖させ
、１ＭストックからのIPTGを最終濃度１mMまで添加することによりタンパク質発
現を誘導した。６〜８時間後、遠心分離により細胞を収集したところ、発現レベ
ルは高かった（これは該細胞の赤橙色の着色により示された）。

【００９７】突然変異体の作製方法 オリゴヌクレオチドに対する部位特異的突然変異誘発を、Kunkel法（Kunkel,
T.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 488-492）によりBio-Rad突然変異
キットを用いて、またPCRによりStratagene社製のQuikChangeキットを用いて行
った。Kunkel法の推奨手順をまとめると以下のようになる。P450_camをコードす
るcamC遺伝子のM13 mp19サブクローンを、大腸菌CJ236株内で増殖させた。この
株はdut^-ung^-表現型を有しており、そのためにDNA分子中でチミジンの代わりに
ウラシルが含まれることを許容する。３サイクル感染させた後で、ウラシル含有
一本鎖（USS）M13 DNAは、増殖培地に排出された成熟M13ファージ粒子のフェノ
ール抽出により容易に単離された。１種または複数の突然変異オリゴヌクレオチ
ドをT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、次に該USS鋳型にアニーリング
した。４種のヌクレオチド、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、ATPおよび他の化
学的構成要素を添加し、第2の鎖をin vitroで合成した。こうして得た二本鎖形
態のものでdut⁺ung⁺大腸菌MV1190株を形質転換した。この大腸菌株は、ウラシル
含有鋳型鎖を分解し、in vitroで合成された突然変異鎖を増やすはずである。プ
ラークを拾い、突然変異体である可能性のあるファージを大腸菌MV1190株または
TG1株で増殖させた。これらからの一本鎖DNAを配列決定して、突然変異誘発反応
がうまくいったか否かを判定した。突然変異の効率は50〜80％であった。NdeIお
よびHindIIIを用いた制限消化により突然変異camC遺伝子をM13サブクローンから
切り出し、適切な大きさの断片を、同様のNdeI／HindIII消化により調製した発
現ベクターのバックボーンに連結する。

【００９８】 QuikChangeキットは、メチル化されたDNAを選択的に切断するDpnI制限酵素の
特性に基づくものである。突然変異は、PCRにより、二本鎖プラスミドDNAを用い
て導入し、したがって、一本鎖鋳型調製物は必要ない。このPCR反応は、２つの
オリゴヌクレオチドを用いて行う。その一方はコード鎖に結合し、他方はセンス
鎖に結合する。各オリゴヌクレオチドは、突然変異部位のいずれかの側に相補性
であるポリヌクレオチドの短いストレッチを含んでいる。非メチル化dNTPを用い
たPCRによるin vitro合成の後、各鎖に重複しているニックを有するプラスミドD
NAをDpnIで消化して、出発点である鋳型を選択的に除去した − 大部分の大腸菌
株から単離されるプラスミドDNAはメチル化された塩基を含むが、新たに合成さ
れたDNAはメチル化された塩基を有しない。消化の後、該DNAを超コンピーテント
な大腸菌XL1 Blue細胞に形質転換し、増殖させた。突然変異体である可能性のあ
るもの（これは抗生物質選択下で寒天プレート上で増殖する）からプラスミドDN
Aを単離し、配列決定して突然変異誘発を確認した。この新たな突然変異体の全
配列を確認して偽突然変異がないことが確証されたら、この細胞は次にタンパク
質発現に用いることができる。

【００９９】 複数の突然変異体を、さらなる突然変異誘発、そしてまたKunkel法により、あ
るいは該配列中での該部位の配置が許す場合には単純なクローニングステップに
より調製した。camC遺伝子内には２つのユニークな制限部位が存在するが、これ
らは発現ベクターには存在しない。１つは残基121〜123にわたっているSphIであ
り、もう１つは残基338〜339にわたっているSalIである。したがって、全ての突
然変異（例えば残基87、96、98および101におけるもの）は、突然変異型camC遺
伝子のNdeI／SphIおよびSphI／HindIIIによる制限消化物からの適切な断片を発
現ベクターのNdeI／SphI消化物のバックボーン断片と連結することにより、それ
より多い番号の残基における突然変異と容易に組み合わされる。例えば395およ
び396における突然変異は、SphIがSalIで置き換えられている消化物により同様
に組み込むことができる。

【０１００】 ユニークなXbaI部位を導入するための基本原理は現在では明らかになっている
：複数の突然変異を有する多くの突然変異体を上記のクローニング法により調製
した。もしXbaI部位がなければ、これらの複数の突然変異体についての遺伝子を
、さらなるラウンドの突然変異誘発のために発現ベクターからM13にクローニン
グすることは不可能であろう。もちろん、これらの問題は、例えばPCRにより突
然変異誘発を行うことにより克服できる。

【０１０１】実施例２ 基質酸化のプロトコール：in vitro反応 構成要素 最終濃度 P450_cam酵素 １μM プチダレドキシン 10μM プチダレドキシンレダクターゼ １μM ウシ肝カタラーゼ 20μg/ml KCl 200mM 基質 典型的には１mM NADH 250〜400μM ＊50mM Tris-HCl緩衝液（pH7.4）を添加して、容量を調整する。 ＊場合により温度は30℃に調節した。 ＊NADHターンオーバー速度は、340nmにおける吸光度を経時的にモニターするこ
とにより求めることができた。 ＊カタラーゼは、基質の酸化反応を触媒しないが、それは、P450_camを変性させ
る可能性があるあらゆる過酸化水素副生成物を除去するために存在する。

【０１０２】 該方法は、分光法による特性決定のためのHPLCによる十分な生成物の精製を可
能にするために、規模を、例えば全インキュベーション容量20mlまで拡大するこ
とができる。全反応時間（典型的には３時間）において、新しい基質（１mM）お
よびNADH（１〜２mM）を一定間隔で（例えば20分毎に）添加する。

【０１０３】実施例３ in vivo系 in vivo系は、プラスミドpKK223（Brosuis, J.およびHoly, A. Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 1984, 81, 6929-6933）の誘導体であるベクターpGLW11を用いて
発現させた。発現はtacプロモーターにより指令し、該ベクターには抗生物質ア
ンピシリンに対する耐性を付与する遺伝子が組み込まれている。

【０１０４】 ２つの系を構築した。第1のものは、電子伝達タンパク質プチダレドキシンレ
ダクターゼ（camA遺伝子）およびプチダレドキシン（camB遺伝子）を、７個のア
ミノ酸からなるペプチドリンカーを有する融合タンパク質として発現し、P450_{ca m} 酵素（camC遺伝子）は同じベクターにより発現されたが、それは電子タンパク
質には融合されていなかった。第２の系は、大腸菌宿主内でそれら３種のタンパ
ク質を別々のものとして発現した。両者の系は、in vivoにおける基質の酸化に
対して触媒的にコンピーテントであった。

【０１０５】 一般的な戦略は次のとおりとした。該３種のタンパク質の遺伝子を、隣接部位
としてEcoRIおよびHindIIIを用いてクローニングした（この場合、EcoRIは５′
末端にある）。両者のin vivo系では、融合構築物においてレダクターゼ遺伝子
とレドキシン遺伝子との間を含む遺伝子間に制限部位が存在する。これらの制限
部位は、以下に詳細に説明するように、PCRにより導入した。しかし、第1の作業
は、サイレント突然変異を行ってレダクターゼのcamA遺伝子内のHindIII部位を
取り除くことであった。camA遺伝子内のAAGCTTというHindIII認識配列をAAGCCT
に変えた。GCTとGCCは共にアラニンをコードするので、これはサイレント突然変
異である。この遺伝子を完全に配列決定して、偽突然変異がないことを確証した
。

【０１０６】１．融合タンパク質系 1.a PCRによるcamA遺伝子の操作 camA遺伝子について、下記のプライマーを該遺伝子の５′末端において用いて
、EcoRIクローニング部位を導入し、かつ最初のコドンをGTGから強力な開始コド
ンATGへと変えた。

【０１０７】 camAの３′末端において、該プライマーは、15個の塩基がcamAの最後の５個の
アミノ酸残基のヌクレオチド配列と相同になるように設計した。最後のアミノ酸
についてのGCCコドンの直ぐ後ろの停止コドンを取り除き、次に、BamHIクローニ
ング部位（GGATCC＝Gly Ser）を含む７個のアミノ酸からなるリンカー（Thr Asp
Gly Gly Ser Ser Ser）の一部を導入した。したがって、コード配列は次のとお
りであった。

【０１０８】 以下に示すプライマー配列はPCRに用いられる逆相補体（reverse complement
）である。

【０１０９】 1.b PCRによるcamB遺伝子の操作 camB遺伝子について、５′末端におけるプライマーには、レダクターゼタンパ
ク質とレドキシンタンパク質との間にペプチドリンカーの後ろ半分と、それら２
つの増幅遺伝子を共に結合させるための制限部位BamHIとが組み込まれていた。

【０１１０】 camBの３′末端において、該プライマーには、camBの末端に相補的な12個のヌ
クレオチドと、それに続く停止コドンTAAと、GGAGリボゾーム結合部位の前に６
個のヌクレオチドからなるスペーサーとが組み込まれている。次に、XbaI部位お
よびHindIII部位を付加して、必要があればcamC遺伝子のクローニングができる
ようにした。したがって、コード鎖の配列は以下のとおりであった。

【０１１１】 以下に示すプライマーは、PCRに用いるための逆相補体である。

【０１１２】 1.c 全融合構築物の調製 camA遺伝子およびcamB遺伝子をPCRにより上記のプライマーを用いて増幅した
。この新たなcamAはEcoRIおよびBamHIで消化し、この新たなcamBはBamHIおよびH
indIIIで消化した。pGLW11発現ベクターをEcoRIおよびHindIIIで消化した。全３
種をアガロースゲル電気泳動により精製し、該ゲルからそれぞれの断片を含む３
つのゲルスライスを切り出し、共に連結し、次に大腸菌DF5αに形質転換した。
該断片の全てがうまく連結されたこと、特に新しいユニークなXbaI部位の存在を
、一連の制限消化実験により確認した。該インサートのEcoRI部位からHindIII部
位までの全配列を決定して、該配列の全てが正しいものであることを確証した。

【０１１３】 この新たなプラスミド（pSGB^Fと命名）を大腸菌に形質転換し、レダクターゼ
タンパク質およびレドキシンタンパク質の発現をIPTGにより誘導した。精製され
たP450_cam酵素を無細胞抽出物に添加した場合、各種の基質について基質の酸化
が見られた。

【０１１４】 camC遺伝子をXbaIおよびHindIII制限部位を用いてpSGB^Fプラスミドにクローニ
ングすると、こうして作製された新たな組換えプラスミドは同じmRNA分子から、
レダクターゼとレドキシンとを融合タンパク質として、そしてP450cam酵素をオ
ペレート部分（operate entity）として発現する。このin vivo系は、全細胞に
おけるテルペン酸化に対して触媒的にコンピーテントである。

【０１１５】２．別個に発現されるタンパク質を有するin vivo系 2.a 基本的戦略 in vivo系におけるこの調製の出発点は、プチダレドキシンレダクターゼのcam
A遺伝子の発現に用いられた組換えプラスミドであった。camA遺伝子は、pGLW11
プラスミドにEcoRIおよびBamHI制限部位を用いてクローニングし、この場合、Ec
oRIは該遺伝子の５′末端にあった。便利なことに、pGLW11ベクターのポリリン
カー領域は、BamHI部位の下流にHindIII部位を有している。したがって、camB遺
伝子をPCRにより操作して、該遺伝子をBamHIおよびHindIII部位を用いてpGLW11
にクローニングできるようにした。この新たなプラスミドは、レダクターゼおよ
びレドキシンを別個のタンパク質として発現する。

【０１１６】 本発明者らの概略的なin vitro基質酸化の研究のために、camB遺伝子を、BamH
IおよびHindIIIクローニング部位によりpUC118にクローニングして、プチダレド
キシンを発現させた。したがって、camB遺伝子の３′末端におけるPCRプライマ
ーは、リボゾーム結合部位およびXbaI制限部位をHindIII部位の上流に導入して
、camC遺伝子をXbaIおよびHindIII部位を用いてcamBの下流に挿入できるように
設計した。したがって、これら３種の遺伝子は、融合せずにpGLW11発現ベクター
にクローニングされ、5’-camA-camB-camC-3’の順序で配置され、各遺伝子はタ
ンパク質合成を開始するためにそれ自体のRBSを有する。

【０１１７】 2.b camB遺伝子の操作 本発明者らは、camB遺伝子内の内部のユニークな制限部位MluI（認識配列ACGC
GT）を開始点として用いて、PCR産物がPCR鋳型断片とは異なる大きさを有するよ
うにした。プライマーは以下のとおりであった。 但し、配列中、MluI部位は太字で示す。

【０１１８】 camB遺伝子の３′末端にある所望のコード配列は以下のとおりであった。

【０１１９】 停止コドンの後ろには、P450_cam酵素の合成を開始するのに用いられるRBSの前
に35塩基のスペーサーがある。そのスペーサーの中には、RBSとcamC遺伝子の開
始コドン（このプライマー中ではない）との間にXbaIクローニング部位が位置す
る。用いたPCRプライマーは上記の配列の逆相補体であった。PCRを行い、適切な
大きさの増幅断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、ゲルスライスを切り
出した。

【０１２０】 この新たなプラスミドの構築を完成させるためには、１つの追加のステップが
必要であった。融合タンパク質in vivo系のためのプラスミドをMluIおよびHindI
II制限酵素を用いて消化し、アガロースゲル電気泳動により精製し、小さなcamB
断片についてのゲルスライスを切り出した。camB発現のためのpUC118プラスミド
を同様に消化し、バックボーンについてのゲルスライスを切り出した。これら２
つの断片を共に連結することにより、camBの停止コドンの下流にXbaI部位とそれ
に続くHindIII部位とを有する新たなpUC118ベースのプラスミドを調製した。こ
の新たなプラスミドをMluIおよびXbaI酵素で消化し、バックボーンを上記の新た
なcamB断片と連結して、基本構成要素（key components）が以下のように並んで
いるプラスミドを作製した。 ・・lacプロモーター・・BamHI・・camB遺伝子・・スペーサー・・RBS・・XbaI
・・HindIII・・

【０１２１】 2.c in vivo系プラスミドの調製 XbaIおよびHindIII制限部位ならびに適切なスペーサーを有する改変camBを調
製したら、これをcamA遺伝子（レダクターゼタンパク質）を発現させるのに用い
たpGLW11ベースのプラスミドに、BamHIおよびHindIII部位を用いてクローニング
することによりin vivo系を構築した。この新たなin vivo系ベクターでは、基本
構成要素が以下のように並んでいる。

【０１２２】 ・・tacプロモーター・・EcoIRI・・RBS・・camA遺伝子・・スペーサー・・BamH
I・・RBS・・camB遺伝子・・スペーサー・・RBS・・XbaI・・HindIII・・。

【０１２３】 この新たなプラスミド（pSGB^＋と命名）を大腸菌に形質転換し、レダクターゼ
タンパク質およびレドキシンタンパク質の発現をIPTGにより誘導した。精製した
P450_cam酵素を無細胞抽出物に添加し、各種の基質について基質の酸化を観察し
た。

【０１２４】 camC遺伝子をXbaIおよびHindIII制限部位を用いてこのpSGC^＋プラスミドにク
ローニングすると、こうして作製された新たな組換えプラスミドは３種のタンパ
ク質を別々に、各々それ自体のRBSの指令下で、しかし同じmRNAから発現する。
こうして、本発明者らのテルペン酸化の研究の大部分において用いられるin viv
o系を構築する。

【０１２５】 ３．pRH1091へのXbaI部位の導入 これは、２つのクローニング部位XbaIおよびHindIIIを用いてcamC遺伝子をin
vivo系にクローニングできるようにするための最終ステップである。XbaI部位は
、２つのプライマーを用いた全pRH1091プラスミドのPCRにより付加した。これら
２つの部位の存在はまた、camC遺伝子のM13へのクローニングも可能にする。何
故ならば、XbaIおよびHindIIIは共にcamCおよびM13においてユニークなものだか
らである。

【０１２６】 以下に示すプライマーは、HindIIIクローニング部位AAGCTTを保持している。

【０１２７】 他方の末端において、所望のコード配列は以下のものであった。

【０１２８】 この配列は、NdeIおよびHindIII部位を保持していたが、新たなXbaI部位がNde
I部位の上流に導入されていた。用いたPCRプライマーは上記所望の配列の逆相補
体であった。

【０１２９】 次に、PCR産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、HindIIIで消化し、T4
DNAリガーゼで環化した。PCR法の成功は、形質転換体から単離したプラスミドD
NA中に新らしくユニークなXbaI部位が存在することにより示された。

【０１３０】 ４．camCのin vivo系へのクローニング 全ての既存のcamC突然変異体を、pRH1091ベースの発現プラスミドからNdeIお
よびHindIIIで切り出した。新たなベクターを同じ制限酵素で同様に切断し、T4
DNAリガーゼを用いてcamC遺伝子をこのプラスミドにクローニングした。このDNA
を大腸菌JM109に形質転換し、次いでこれを増殖させてP450_camを発現させること
ができる。

【０１３１】 camC遺伝子は、この新たなベクターからXbaIおよびHindIII制限酵素を用いて
切り出し、突然変異誘発のためにin vivoベクター系またはM13mp19のいずれかに
クローニングした。

【０１３２】 ５．in vivo発現および基質ターンオーバー タンパク質の発現のために、細胞をLBamp培地（トリプトン10g/リッター、酵
母エキス５g/リッター、NaCl 10g/リッター、50μg/mlアンピシリン）で30℃に
て、OD_600nmが1.0〜1.2に達するまで増殖させる。IPTG（イソプロピル-β-D-チ
オガラクトピラノシド）を（H₂O中での１Ｍストックから）最終濃度１μMまで添
加し、培養物を30℃で一夜インキュベートした。

【０１３３】 簡単にスクリーニングするために、基質を該培養物に添加することができ、イ
ンキュベーションを継続した。しかし、培養培地からの不純物のため、細胞は通
常、0.5容量の緩衝液Ｐ（KH₂PO₄ 6.4ｇ、K₂HPO₄・3H₂O 25.8ｇ、H₂Oで４リッター
とする、pH7.4）で２回洗浄し、24mMのグルコースを含有する0.25容量の酸素飽
和緩衝液Ｐに再懸濁した。基質を１mMまで添加し、インキュベーションを30℃で
継続した。反応は、基質およびグルコースを一定間隔毎に添加しながら24時間行
った。

【０１３４】 この反応は、１mlのインキュベーション混合物を250μlの酢酸エチルで抽出す
ることにより分析した。微量遠心分離機で13,000ｇで２分間遠心分離した後、２
μlの有機抽出物をFisons GC8000シリーズのガスクロマトグラフの0.25mm×30m
のDB-1ガスクロマトグラフィーカラムに注入した。サンプルはヘリウムキャリア
ガスを用いて該カラムに通塔し、存在する化合物は化学炎イオン化検出器を用い
て検出した。

【０１３５】 各種の基質について種々の温度プログラムを用いて、ターンオーバー生成物を
分解した。

【０１３６】 モノテルペン類 注入器の温度 150℃ 検出器の温度 250℃ オーブンの温度 120℃で15分間→25℃／分で200℃に上昇させ、200℃で１分
間。

【０１３７】 セスキテルペン類 注入器の温度 250℃ 検出器の温度 250℃ オーブンの温度 150℃→５℃／分で230℃に上昇させ、230℃で１分間。

【０１３８】 特定の酸化反応についての結果を表６および図に示す。 図１は、樟脳を用いた酸化反応の結果を示す。5-ケト樟脳は、5-エキソ-ヒド
ロキシ樟脳をさらに酸化することにより生じる。見てわかるように、驚くべきこ
とに、樟脳の存在下でさらなる酸化はほとんど起こっていない。

【０１３９】実施例４ 第2のin vivo発現系 実施例３に記載のP450_cam系の３種のタンパク質の発現のための遺伝子のクラ
スターは、pCWベクターを用いて全大腸菌細胞内でも発現させた。このベクター
は、タンパク質の発現を増大させるために、並んで配置されている２つのtacプ
ロモーターを利用する。それは、RBSを有し、かつ抗生物質アンピシリンに対す
る耐性を付与した遺伝子（Barnes, H.J. Methods Enzymol. 1996, 272, 3-14）
を含んでいる。

【０１４０】 実施例３に記載の触媒的にコンピーテントなP450_cam系を発現させる両者の方
法は、pCWベクターを用いて成功した。したがって、融合系では、プチダレドキ
シンレダクターゼおよびプチダレドキシンはオリゴペプチドリンカーを有する融
合タンパク質として発現されたが、P450_camモノオキシゲナーゼは発現されたも
のの、電子伝達タンパク質には融合されていなかった。この第2の系は、同じ大
腸菌宿主内で全３種のタンパク質を別個のものとして発現した。

【０１４１】 １．融合タンパク質系 新たなプラスミドを、電子伝達タンパク質の融合のための遺伝子をpCWにクロ
ーニングすることにより構築して、異なるP450_cam突然変異体がクローニングに
より該系に導入できるようにした。camA遺伝子のPCR増幅のために用いた５′末
端のオリゴヌクレオチドは、pGLW11ベクターへのクローニングのためのEcoRI部
位だけでなく、該遺伝子のATG開始コドンに及ぶNdeI部位も導入した（実施例３
、第1a節を参照）。pCWベクターでは、発現させようとする遺伝子のクローニン
グのためのRBSの下流に位置するNdeI部位が存在する。camA-camB融合遺伝子を含
むpGLW11ベクターをNdeIおよびHindIIIで消化し、インサートをアガロースゲル
電気泳動により精製した。pCWベクター系もまた、これらの２種の酵素で消化し
、線状化したベクターを同じ方法により精製した。これら２つの断片をDNAリガ
ーゼで連結して、pCWベクターに基づく新たなpCWSGB_Fプラスミドを作製した。こ
れは電子伝達タンパク質の融合体を発現した。pGLW11ベースのプラスミドから切
り出されたインサートは、既にタンパク質発現のためのRBSとHindIII部位の直ぐ
上流のXbaI部位とを含んでおり（実施例３、第2.c節を参照）、そのために、P45
0_cam突然変異体をコードするcamC遺伝子がこれら２つの部位を用いてクローニン
グされて、RBSを用いずに発現できるようになっていた。したがって、P450_cam突
然変異体をコードする遺伝子は、この改変pRH系から切り出され、XbaI部位およ
びHindIII部位を用いて該新たなpCWSGB_Fプラスミドにクローニングできる。

【０１４２】 ２．別個に発現される３種のタンパク質 この系は、融合系と全く同じ方法で作製した。つまり、pSGB+プラスミドをNde
IおよびHindIII制限酵素で消化し、このインサートをpCWベクターにクローニン
グした。この新たなプラスミドpCWSGB+は、プチダレドキシンレダクターゼおよ
びプチダレドキシンを、pCWベクターの１対のtacプロモーターを用いずに別個の
ものとして発現した。このP450_cam突然変異体を、XbaIおよびHindIII部位を用い
てこのベクターに導入した。

【０１４３】 ３．in vivo発現および基質ターンオーバー 下記の条件を、実験室における振盪フラスコ中での試験の目的で用い、それは
最適化しなかった。より高い発現およびバイオマスを有する適切な発酵装置の条
件下では、生成物の最終収量は非常に増大するだろう。

【０１４４】 触媒的にコンピーテントなP450cam系のいずれか一方を保有する大腸菌DH5α細
胞を、１LのLBamp培地中で寒天プレート上での単一コロニーから、OD_600nmが約
１に達するまで30℃で増殖させた。IPTGを（水中での１Ｍストックから）最終濃
度１mMまで添加し、培養物をさらに６時間増殖させた。最終のOD_600nmは2.0〜2.
5の範囲であった。細胞を、5000gでの遠心分離により収集し、40mMリン酸緩衝液
（pH 7.4）で一回洗浄した。細胞ペレットを500mlの40mMリン酸緩衝液（pH 7.4
）に再懸濁した。グルコースを２Ｍストックとして最終濃度100mMまで添加し、
１mLの基質（α-ピネンまたはR-リモネン）を添加して反応を開始した。この混
合物を、軌道インキュベーター（orbital incubator）内の開口した２L容の三角
フラスコ中で200rpmで振盪した。24時間毎にさらにグルコースを添加し（500mL
容量に対して最終濃度が100mM、２Ｍストックから）、12時間毎にさらに基質（
１mL）を添加した。反応の進行をGCによりモニターしたところ、全細胞系は周囲
温度において少なくとも５日間にわたって活性であり、第５日目が終わった時点
での最小収量（反応培地のクロロホルムによる抽出およびGCによる分析によりア
ッセイしたもの）は、生成物の大気への揮発および液体レベルを超えるフラスコ
への凝集を考慮に入れなければ、生成物100mgであった。さらに、基質が存在す
る場合、別の炭素原子におけるさらなるヒドロキシル化から生じる化合物は見ら
れなかった。

【０１４５】実施例５ P450_BM-3によるin vitroおよびin vivo基質酸化 in vitro(任意で30℃での温度調節)における典型的な反応では、1.5mLのイン
キューベーション混合物は、40mMリン酸緩衝液（pH8.0）、１μM P450_BM-3、50
μg/mLのカタラーゼを含むものとし、テルペン基質を１Ｍストック（エタノール
溶液）として最終濃度２mMまで添加した。NADPHを典型的には最終濃度400μMま
で添加し、反応速度は340nmでモニターできた。全てのNADPHが消費された後、該
混合物を0.5mLのクロロホルムでボルテックスすることにより抽出し、遠心分離
により相を分離し、有機相は実施例３に記載のプログラムを用いてGCにより分析
できた。

【０１４６】 カタラーゼは、この基質の酸化反応を触媒しないが、該酵素を変性させる可能
性があるあらゆる水素副生成物を除去するために存在する。この方法は、規模を
、例えば全インキュベーション容量20mLまで拡大して、分光法による特性決定の
ためのHPLCによる十分な生成物の精製を可能にするようにできる。新しい基質（
１mM）およびNADPH（１〜２mM）は、全反応時間（典型的には３時間）において
、一定間隔で（例えば20分毎に）添加する。

【０１４７】 P450_BM-3酵素は触媒的に自給自足型（self-sufficient）であるので（すなわ
ち、モノオキシゲナーゼと電子伝達ドメインとが１つのポリペプチド中にあるの
で）、大腸菌内で発現された酵素は、全細胞性のin vivo基質酸化に用いること
ができる。P450_cam酵素によるin vivo基質酸化について実施例３で記載した手順
は、P450_BM-3酵素の場合にも用いることができる。

【０１４８】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、P450_camのC334A突然変異体（プラスミドSGB++から発現される）によ
る樟脳の酸化を示す。線Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、２分、10分、20分、40分お
よび100分における樟脳のターンオーバーを表わす。5.28のピークは樟脳、11.82
は5-エキソ-ヒドロキシ樟脳、7.45は5-ケト樟脳、そして16.07のピークは内部標
準である。

【図２】 図２は、野性型P450_BM-3を用いたR-およびS-リモネンを示す。

【図３】 図３は、野性型および突然変異型P450_BM-3によるNADH消費を示す。

【図４】 図４は、プラスミドpCWSGB+により発現されるY96F-F87W-V247L突然変異体によ
るα-ピネンの全細胞大腸菌酸化を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｂ０６５ 1/19 1/21 ４Ｃ０８４ 1/21 9/02 ＺＣＣ ４Ｃ０８６ 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/02 ４Ｃ２０６ 9/02 ＺＣＣ 17/02 15/01 Ｃ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｐ 7/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 17/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/26 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｒ 1:19） 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｘ Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベル、ステフェン、グラハム イギリス国 オーエックス１ ３キューア ール オックスフォード、サウス パーク ス ロード、デパートメント オブ ケミ ストリー、ユニバーシティー オブ オッ クスフォード (72)発明者 カーマイケル、アンガス、ビショップ イギリス国 オーエックス１ ３キューア ール オックスフォード、サウス パーク ス ロード、デパートメント オブ ケミ ストリー、ユニバーシティー オブ オッ クスフォード Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA80 FB01 4B024 AA01 BA08 CA02 CA07 DA06 EA04 GA11 GA25 HA01 4B050 CC04 DD02 EE10 LL01 LL05 4B063 QA05 QA17 QQ12 QQ22 QR41 QR57 4B064 AC09 AC13 AC14 CA21 CB11 CD04 CD05 CD06 DA01 4B065 AA17Y AA26X AA41Y AA50Y AA72Y AB01 AC14 BA02 BA16 BC50 CA26 CA44 4C084 AA17 MA02 NA14 ZB311 4C086 AA01 AA04 BA02 MA01 MA04 NA14 ZB31 4C206 AA01 AA04 CA09 CA13 CA14 MA01 MA04 NA14 ZB31

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非環式もしくは環式テルペンまたはシクロアルケンである物
   質、またはそれらの置換誘導体を酸化する方法であって、該化合物を突然変異ヘ
   ム含有酵素で酸化することを含んでなり、該突然変異体が、活性部位のアミノ酸
   のより極性の低い側鎖を有するアミノ酸による置換を含む、方法。
2. 【請求項２】 前記酵素が、P450_camもしくはP450_BM-3の突然変異体または
   これらの酵素のいずれか一方の天然に存在する相同体の突然変異体である、請求
   項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記酵素が、P450_BM-3のアミノ酸47および／もしくは51、ま
   たはP450_camのアミノ酸96、または前記相同体中の等価なアミノ酸がより極性の
   低い側鎖を有するアミノ酸に変更された酵素である、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記活性部位に1個以上の他のアミノ酸置換が存在する、請
   求項１、２、または３に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記酵素が、(i) P450_camでありかつ次の突然変異: F87W、F
   87I、F87L、T185L、T185F、V247A、V247L、またはF87A-I395Fを1個以上含むか、
   または(ii) P450_BM-3でありかつ突然変異R47L-Y51Fを含む、請求項１〜４のいず
   れか1項に記載の方法。
6. 【請求項６】 突然変異F87A-Y96G-F193A、F87A-Y96G-F193A-C334A、または
   T101M-T185F-V247Mだけを有するP450_camの突然変異体を除いた、請求項４または
   ５に記載の酵素。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の酵素をコードする配列を含んでなるポリヌ
   クレオチド。
8. 【請求項８】 (i) 天然に存在する形態で電子伝達レダクターゼドメインを
   有する、請求項２〜６のいずれか1項に記載の酵素、あるいは (ii) (a) 請求項１〜５のいずれか1項に記載の酵素、 (b) 電子伝達レダクターゼ、および (c) 電子伝達レドキシン、 を発現する細胞。
9. 【請求項９】 (a) (i) P450_camもしくはその断片、または (ii) P450_camの天然に存在する相同体もしくはその断片、または (iii) 請求項２〜５のいずれか1項に記載の突然変異P450_camもしくはその突
   然変異相同体、または (iv) (i)、(ii)、もしくは(iii)に対して少なくとも70%のアミノ酸相同性を
   有し、場合により、請求項３〜５のいずれか1項に記載の突然変異を有するP450_{c am} 、および (b) 電子伝達レダクターゼ、および (c) 電子伝達レドキシン、 を発現する細胞のうち、 発現されるP450_camの突然変異体だけが下記: H₂N-P450_cam-TDGTSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキ
   シン-COOH H₂N-P450_cam-TDGTRPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プ
   チダレドキシン-COOH H₂N-P450_cam-TDGTRPGPGPGPGPGPGPSST-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS
   -プチダレドキシン-COOH H₂N-プチダレドキシンレダクターゼ-TDGASSS-プチダレドキシン-PLEL-P450_cam -COOH の中に包含されるE.Coli DH5α細胞を除いた細胞。
10. 【請求項１０】 (a)、(b)、および(c)、または(b)および(c)が、同一の融
    合タンパク質中で一緒に発現される、請求項８または９に記載の細胞。
11. 【請求項１１】 (b) がプチダレトキシンレダクターゼもしくはその断片で
    あること、および／または (c) がプチダレトキシンまたはその断片であること、 を特徴とする、請求項８〜１０のいずれか1項に記載の細胞。
12. 【請求項１２】 (a) (i) P450_BM-3もしくはその断片、または (ii) P450_BM-3の天然に存在する相同体もしくはその断片、または (iii) 請求項２〜５のいずれか1項に記載の突然変異P450_BM-3もしくはその
    突然変異相同体、 を発現する細胞。
13. 【請求項１３】 前記化合物が、請求項８〜１２のいずれか1項に記載の細
    胞中で酸化される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 P450_camもしくはP450_BM-3の突然変異体またはこれらの酵
    素のいずれか一方の相同体の突然変異体のライブラリーを作製する方法であって
    、請求項９ならびに請求項９に従属する請求項１０および１１のいずれか1項に
    記載または請求項１２に記載の細胞もしくは請求項９に記載のE.Coli DH5α細胞
    を突然変異原に接触させること、ならびに／またはそのとき該細胞がミューテー
    ター細胞である場合には突然変異体が産生される条件で該細胞を培養することを
    含む、方法。
15. 【請求項１５】 特定の基質を酸化する能力に関してP450_camもしくはP450_{B M-3} またはそれらの相同体の突然変異体を選択する方法であって、該特定の基質
    に及ぼす酸化作用に関して該突然変異体のグループをスクリーニングすることを
    含む、方法。
16. 【請求項１６】 前記特定の化合物を特定の酸化生成物に酸化する能力に関
    して前記突然変異体が更に選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記スクリーニングが、請求項１４に記載の方法で作製さ
    れたライブラリーに対して行われる、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 酸化生成物のライブラリーを作製する方法であって、請求
    項１に記載の基質を請求項１４に記載の方法で作製されたライブラリーに提供す
    ることおよび該基質を酸化させることを含む、方法。
19. 【請求項１９】 場合により前記酵素が人体または動物体の治療方法に使用
    すべく請求項１５、１６、または１７に記載の方法で選択された酵素であること
    を特徴とする請求項１〜５および１３のいずれか1項に記載の方法によって得ら
    れる酸化生成物。
20. 【請求項２０】 場合により前記酵素が請求項１５、１６、または１７に記
    載の方法で選択された酵素であることを特徴とする請求項１〜５および１３のい
    ずれか1項に記載の方法によって得られる酸化生成物と、医薬上許容される担体
    または希釈剤とを含んでなる医薬組成物。