JP2002528123A - 遺伝子免疫のための核酸構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組換え核酸分子が記載される。この分子は、Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第１の配列、およびこの第１の配列中に挿入された、少なくとも１つのＴ細胞エピトープをコードする第２の配列を有する。ここで、このＢ型肝炎ウイルスコア抗原は主イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）領域を含むか、またはこのＢ型肝炎ウイルスコア抗原から該ＩＣＥ領域のうちのすべてまたは一部が除去されている。これらの分子を含むベクターおよび組成物もまた、記載される。これらの分子を使用して免疫応答を惹起する方法もまた、記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、分子生物学および免疫学の一般的分野に関し、そして概して核酸免
疫技術において有用な試薬に関する。より詳細には、本発明は、ハイブリッド抗
原／キャリア核酸構築物、このような構築物を含む発現ベクター、およびこのよ
うな試薬を使用する核酸免疫ストラテジーに関する。

【０００２】 （背景） 発現産物に対する免疫化の目的のための哺乳動物組織へのＤＮＡおよびｍＲＮ
Ａの注入のための技術は、当該分野において記載されている。例えば、欧州特許
明細書ＥＰ ０ ５００ ７９９および米国特許第５，５８９，４６６号を参照
のこと。本明細書において「核酸免疫」と名付けられる技術は体液性免疫応答お
よび細胞媒介性免疫応答の両方を惹起することが示されている。例えば、エンベ
ロープ糖タンパク質であるｇｐ１６０をコードするＤＮＡ構築物で免疫されたマ
ウス由来の血清は、イムノアッセイにおいて組換えｇｐ１６０と反応することが
示されており、そして注射されたマウス由来のリンパ球は組換えｇｐ１２０に応
答して増殖することが示された。Ｗａｎｇら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：４１５６〜４１６０。同様に、ヒト成長ホルモ
ン（ｈＧＨ）遺伝子で免疫したマウスは抗体に基づく免疫応答を実証した。Ｔａ
ｎｇら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２〜１５４。哺乳動物プロモー
ターにより駆動されたインフルエンザ核タンパク質をコードするＤＮＡの筋肉内
注射が、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を惹起することが示されており、この応答はウイル
スによる引き続く致死的なチャレンジからマウスを防御し得た。Ｕｌｍｅｒら（
１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５〜１７４９。注入部位の免疫組織
化学的研究は、このＤＮＡが骨髄芽球に取りこまれ、そしてウイルスタンパク質
の細胞質の産生が少なくとも６ヶ月間示され得ることを示した。

【０００３】 （発明の要旨） Ｂ型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする配列およ
び目的のＴ細胞エピトープをコードする配列を含む組換え核酸分子を提供するこ
とが本発明の主な目的である。Ｔ細胞エピトープは、細胞溶解性Ｔリンパ球（Ｃ
ＴＬ）エピトープであることが好ましい。このエピトープをコードする配列は、
ＨＢｃＡｇ分子の外部から接触可能なループ領域に存在するイムノドミナントな
コアエピトープ（ＩＣＥ）へ挿入され、そしてこの組換え核酸分子は、種々の核
酸免疫ストラテジーにおける試薬として用いられる。この挿入された配列はまた
、目的の１つ以上のＢ細胞エピトープを含み得る。

【０００４】 ＨＢｃＡｇ発現産物は、ヒトにおいておよび実験的動物モデル系において高度
に免疫原性の粒子中で自己アセンブルする（Ｍｉｌｉｃｈ，Ｄ．Ｒ．（１９８８
）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ９：３８０）。この理由のために、ＨＢｃＡｇ
粒子は、化学的に結合されたかまたは組換えの翻訳的に融合されたペプチドエピ
トープのためのキャリア部分として用いられてきた（Ｃｌａｒｋｅら（１９８７
）Ｎａｔｕｒｅ ３３０：３８１）。これに関して、Ｎ末端または内部ペプチド
エピトープ挿入を含むハイブリッドＨＢｃＡｇ分子が構築されてきた。これらの
アプローチの両方は、コア抗原が粒子を形成する能力を妨害しない。Ｉｓａｇｕ
ｌｉａｎｔｓら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５２：３
７〜４４；Ｓｃｏｅｄｅｌら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１８０：１
０３７〜１０４６。得られたハイブリッドペプチド粒子は、目的の抗原に対する
抗体応答を特に惹起するため、成功程度の異なるサブユニットワクチン試薬とし
て用いられてきた。

【０００５】 本発明は、これらの以前の労力とは有意な離脱を示す。すなわち、驚くべきこ
とに、ハイブリッドＨＢｃＡｇ分子をコードする核酸試薬は、特にこの試薬がＤ
ＮＡプライム、組換えウイルスベクターブースト免疫スキームにおいて用いられ
る場合、ハイブリッド分子内に含まれた目的の１つ以上のＣＴＬエピトープに対
して非常に高い頻度の細胞性免疫応答を提供する。また驚くべきことに、この高
頻度の細胞性応答は、ハイブリッドＨＢｃＡｇ核酸構築物自体により駆動され、
従って他の核酸試薬で再現可能でないことが見出された。

【０００６】 従って、本発明の１つの局面において、組換え核酸分子が提供される。この分
子は、主イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）ループ領域を含むＨＢｃＡ
ｇキャリア分子をコードする第１の核酸配列、および目的の抗原をコードする第
２の核酸配列を有し、ここでこの抗原は、好ましくは、少なくとも１つの細胞溶
解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。この第２の核酸配列は、第１の核
酸配列に対して異種であり、そして（この第１の核酸配列中の）ＩＣＥループ領
域をコードする配列に挿入される。第２の配列をＩＣＥループコード領域に直接
に配置することは、イムノドミナントコアエピトープを破壊すると考えられる。
これは可能性として、被験体が、得られたハイブリッド分子発現産物のＨＢｃＡ
ｇキャリア成分に対する免疫応答をマウントする能力を減じる。本発明の組換え
核酸分子は、核酸免疫における使用のために特に優れた試薬であり、そして免疫
された被験体において目的の抗原に対して高頻度のＣＴＬ応答を惹起するために
用いられ得る。

【０００７】 この分子がＩＣＥループ領域（Ｂ細胞イムノドミナントエピトープ領域）内に
配置された抗原に対して高頻度のＣＴＬ応答を惹起するのに非常に効果的である
という事実は本質的に明らかではない（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ）
。この理由は、体液性応答については、効果的なＢ細胞エピトープが、抗原分子
の外部から接触可能な位置（例えば、ＨＢｃＡｇのＩＣＥループ領域）に一般に
見出され、これが応答するＢ細胞への適切な曝露を可能にするということが当該
分野においてよく受け入れられていることによる。一方では、細胞性応答につい
ては、ペプチド抗原は、宿主の被験体の細胞内で小フラグメント（エピトープ）
へとプロセシングされているにちがいない。次いで、これらのプロセシングされ
たフラグメントは、細胞表面上のクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合
するための古典的な主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）経路へ入り得、これはそ
れぞれＣＤ８⁺Ｔリンパ球およびＣＤ４⁺Ｔリンパ球への適切な提示を可能にする
。次いで、この理由により、ドミナントＴ細胞エピトープは、抗原分子において
どこでも見出され得（必ずしも外部から接触可能な位置ではない）、そしてその
同じ分子におけるドミナントＢ細胞エピトープとは全く異なる位置でしばしば生
じることが、一般に受け入れられる。

【０００８】 本発明の関連の局面において、ＩＣＥ領域が除去されたＨＢｃＡｇキャリア分
子をコードする第１の核酸配列を含む組換え核酸分子が、提供される。この組換
え核酸分子はまた、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくはＣＴＬエピ
トープを含む目的の抗原をコードする第２の核酸配列を含む。この第２の核酸配
列は、第１の核酸配列に対して異種であり、そしてこの第１および第２の核酸配
列は一緒に連結されて、ハイブリッド配列を形成する。特定の実施形態において
、ＩＣＥループ領域をコードする配列は、目的の抗原が、発現されたハイブリッ
ドＨｂｃＡｇキャリア分子のループ部分内に配列されるように、第２の核酸配列
で置換される。他の実施形態では、この第２の核酸配列は、それが得られたハイ
ブリッドコアキャリア分子のＮ末端部分、Ｃ末端部分または内部部分において終
結するように核酸分子内に配置される。これらの種々の実施形態において、この
第２の配列は、それが発現産物の粒子形成を妨害しない位置において分子内に配
列されることが好ましい。本明細書においてまた、組換え核酸分子が、粒子抗原
中に自己アセンブルするハイブリッドＨＢｃＡｇキャリアをコードするという選
択（優先度）は、ほとんど明らかではない（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｎｔｕｉｔｉｖ
ｅ）。なぜなら目的の抗原に対する高頻度のＣＴＬ応答がペプチドフラグメント
の細胞内プロセシングおよびＭＨＣクラスＩ提示により駆動されるからである。
いかなる特定の理論によっても束縛されることを望まないが、粒子を形成する能
力を保持するこれらのハイブリッド分子を支持する可能性のある理由は、この粒
子が宿主細胞によってより効率的に分泌され、宿主の免疫プロセシング細胞に対
する抗原のより広範でかつより持続的な曝露を可能にすることである。別の可能
性のある理由は、合理的に安定なハイブリッド粒子が外因性クラスＩ経路に接触
するということである。

【０００９】 本発明のなおさらなる関連の局面において、本発明の組換え核酸分子は、ペプ
チドリーダー配列をコードする第３の核酸配列を含む。この第３の配列は、第２
のおよび第３の核酸配列に対して５’上流位置において分子中に配列されており
、そしてこれらの他の配列に連結されてハイブリッド配列を形成する。このコー
ドされたリーダー配列は、本発明の組換え核酸分子でトランスフェクトされた細
胞からのコードされたハイブリッドＨＢｃＡｇキャリア分子の効率的な分泌を提
供する。本発明のなお別の関連の局面では、組換え核酸分子は、Ｃ末端アルギニ
ン富化領域が除去されたＨＢｃＡｇをコードする第１の配列を含む。本発明の全
ての組換え核酸分子は、代表的に、この核酸分子の発現を制御するために必須の
配列を含む発現カセットの形態で提供される。次に、これらの発現カセットは、
代表的に、核酸免疫のための試薬としての用途に適切なベクター（例えば、プラ
スミドまたは組換えウイルスベクター）内に提供される。

【００１０】 免疫された被験体において目的の抗原に対する細胞性免疫応答を惹起する方法
を提供することもまた、本発明の主な目的である。本方法は、ＨＢｃＡＧキャリ
ア成分および標的抗原成分（少なくとも１つの目的のＴ細胞エピトープ、好まし
くは細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む）を有するハイブリッド
分子をコードする組換え核酸分子を用いて被験体の細胞をトランスフェクトする
１つ以上の工程を包含する一次免疫工程を必要とする。本発明の組換え核酸分子
のいずれか１つを含む発現カセットおよび／またはベクターが用いられ、細胞を
トランスフェクトし得、そしてトランスフェクションは、この被験体内のハイブ
リッド分子の発現を可能にする条件下で実行される。この方法は、さらに、被験
体に二次組成物を投与する１つ以上の工程を包含する二次（すなわちブースター
）免疫工程を必要とする。ここでこの二次組成物は、標的抗原由来の少なくとも
１つのエピトープを含む。この一次免疫工程および二次免疫工程の組み合わせは
、標的抗原に対する細胞性応答を惹起するのに十分である。

【００１１】 一次免疫工程の間に実行されるトランスフェクション手順は、インビボまたは
エクスビボのいずれかで実施され得る（例えば、二次免疫工程を実行する前に被
験体に引き続いて導入されるトランスフェクト細胞を得るため）。インビボトラ
ンスフェクションが用いられれば、核酸分子はプラスミドＤＮＡの筋肉内注射ま
たは皮内注射により被験体に投与され得るか、または好ましくは粒子媒介送達技
術を用いて被験体に投与され得る。この二次組成物は、任意の適切なワクチン組
成物の形態、例えば、ペプチドサブユニットワクチン組成物の形態、ハイブリッ
ドＨＢｃＡｇ粒子の形態、さらなる核酸ワクチン組成物の形態（例えば、抗原の
みを含有するか、または抗原を含む全遺伝子配列を含有する）、または目的の抗
原のコード配列を含む組換えウイルスベクターの形態で目的の抗原を含み得る。
特定の実施形態では、この二次組成物は、組換えワクシニアウイルスベクター、
例えば改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスベクター（標的抗原由来
の少なくとも１つのＣＴＬエピトープをコードする配列を含む）を含む。

【００１２】 ＨＢｃＡｇキャリア成分および標的抗原成分（少なくとも１つの目的のＴ細胞
エピトープ（好ましくはＣＴＬエピトープ）を含む）を有するハイブリッド分子
をコードする組換え核酸はまた、ブースト化剤として、例えば、個体が、目的の
抗原を含む任意の適切なワクチン組成物（例えば、核酸ワクチン組成物、組換え
ウイルスワクチン組成物などの形態で、ペプチドサブユニットワクチン組成物、
全生物体のワクチン組成物もしくは分割した生物体のワクチン組成物（例えば、
全ウイルス、弱毒化ウイルスまたは不活化ウイルス、など））でプライムされる
ワクチン接種ストラテジーにおいて用いられ得る。

【００１３】 組換え核酸分子が、核酸免疫ストラテジーにおける試薬として用いられ、目的
の１つ以上の抗原に対する高頻度のＣＴＬ応答を達成し得ることは本発明の利点
である。これらの高頻度のＣＴＬ応答が予防用ワクチンおよび治療用ワクチンの
両方の状況において有用であることが、本発明のさらなる利点である。

【００１４】 本発明のこれらおよび他の目的、局面、実施形態ならびに利点は、本明細書に
おける開示の観点から、当業者に容易に理解される。

【００１５】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特に例証された分子またはプロセス
パラメーター（そのようなものは、当然、変化し得るので）に限定されないこと
が理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は、本発明の特定の実
施形態を記載する目的のみのためであり、そして限定を意味しないこともまた、
理解されるべきである。さらに、本発明の実施は、別に示されない限りは、ウイ
ルス学、微生物学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の伝統的な方
法を利用し、これらのすべては、当業者の範囲内である。このような技術は、文
献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９
８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ
，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；
ならびにＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版、第Ｉ巻および第
ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ、Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。

【００１６】 本明細書中で引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、前出であ
るかまたは下記であるかに関わらす、その全体が参考として本明細書によって援
用される。

【００１７】 本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」
「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その文脈が明確に他のことを指示しない限りは、
複数形の言及を含むことが注意されなければならない。従って、「ＣＴＬエピト
ープ」という言及は、２つ以上のそのようなエピトープを含み、「抗原」という
言及は、２つ以上のそのような抗原を含む、などである。

【００１８】 （Ａ．定義） 他に規定されない限りは、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科
学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されるのと同
じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと類似または等価な多くの方法およ
び材料が、本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法が本
明細書中に記載される。

【００１９】 本発明の記載において、以下の用語が利用され、そして以下に示されるように
定義されることが意図される。

【００２０】 用語「核酸免疫」とは、抗原のインビボ発現のための、宿主細胞への、選択さ
れた１つ以上の抗原をコードする核酸分子の導入をいうために使用される。この
核酸分子は、例えば、標準的な筋肉内注射または皮内注射；経皮粒子送達；吸入
によって；局所的にまたは、経口的、鼻内、もしくは粘膜の投与の様式によって
、レシピエント被験体に直接導入され得る。この分子は、代替的には、被験体か
ら取り出された細胞中にエキソビボで導入され得る。この後者の場合、目的の核
酸分子を含む細胞は、この被験体に導入され、その結果、この核酸分子によって
コードされる抗原に対する免疫応答が開始し得る。

【００２１】 「抗原」とは、個体における免疫学的応答を誘発し得る任意の因子（一般的に
は高分子）をいう。この用語は、個々の高分子をいうため、または抗原性高分子
の均質の集団もしくは不均質の集団をいうために使用され得る。本明細書中で使
用される場合、「抗原」とは、一般的に１つ以上のエピトープを含むタンパク質
分子またはその部分をいうために使用され得る。本発明の目的のために、抗原は
、任意の公知のウイルス、細菌、寄生生物、または真菌の病原体から得られ得る
か、またはそれに由来し得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍特異的抗原、
および自己免疫疾患に関連する抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために
、「抗原」は、タンパク質が十分な免疫原性を維持する限り、ネイティブな配列
に対する改変（例えば、欠失、付加、および置換（一般的に天然において保存的
である））を有するタンパク質を含む。これらの改変は、意図的（例えば、部位
特異的変異誘発を通して）であり得るか、または、偶発的（例えば、抗原を産生
する宿主の変異を通して）であり得る。

【００２２】 本発明の種々の局面において、抗原は、１つ以上のＴ細胞エピトープを含む。
「Ｔ細胞エピトープ」とは、一般的に、Ｔ細胞応答を誘導し得るペプチド構造を
特徴とするエピトープをいう。この点において、Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣ分
子のペプチド結合の裂け目（ｃｌｅｆｔ）で長いコンホメーションをとる、直鎖
状のペプチド決定基を含むことは、当該分野において受容されている。Ｕｎａｎ
ｕｅら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：５５１−５５７。本明細書中で使
用される場合、Ｔ細胞エピトープは、一般的に、少なくとも３−５アミノ酸残基
、好ましくは、少なくとも５〜１０またはそれ以上のアミノ酸残基を有するペプ
チドである。この用語は、任意のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたはＭＨＣクラ
スＩＩ拘束ペプチドを含む。細胞媒介性免疫学的応答を刺激する特定のエピトー
プの能力は、多数の周知のアッセイによって（例えば、リンパ増殖（リンパ球活
性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイによって、または感作した被験
体においてこのエピトープについて特異的なＴリンパ球についてアッセイするこ
とによって）決定され得る。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９３）Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１５１：４１８９−４１９９；およびＤｏｅら（１９９４）Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２３６９−２３７６を参照のこと。

【００２３】 本発明の他の局面において、この抗原は、１つ以上のＢ細胞エピトープを含む
。「Ｂ細胞エピトープ」とは、一般的に、特定の抗体分子が結合する抗原上の部
位をいう。抗体応答を誘発し得るエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を
使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２（所定の抗原に
おける免疫学的エピトープの位置を決定するためにペプチドを迅速に合成する一
般的方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定および
化学合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９−７１５（所定の抗体について高い
親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照のこと。

【００２４】 目的の抗原に対する「免疫応答」とは、その抗原に対する体液性免疫応答およ
び／または細胞性免疫応答の個体における発生である。本発明の目的のために、
「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、
「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介され
るものである。

【００２５】 個体が複数の決定基（エピトープ）を有する複合体タンパク質抗原で免疫され
る場合、多くの例において、応答するＴリンパ球の大多数は、その抗原からの１
または数個の直鎖状のアミノ酸配列（エピトープ）について特異的であるか、そ
して／または応答するＢリンパ球の大多数はその抗原からの１または数個の直鎖
状のエピトープまたは立体構造的なエピトープについて特異的である。本発明の
目的のために、次いで、このようなエピトープは、「イムノドミナントエピトー
プ」といわれる。いくつかのイムノドミナントエピトープを有する抗原において
、単一のエピトープが、特定のＴ細胞応答またはＢ細胞応答を指揮することにつ
いて最も優勢であり得る。従って、本発明の目的のために、用語「主（ｐｒｉｍ
ａｒｙ）イムノドミナントエピトープ」が、複数のこのようなエピトープを有す
る抗原からの最も優勢なイムノドミナントエピトープをいうために使用され、そ
して残りのイムノドミナントエピトープは、「副（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）イムノ
ドミナントエピトープ」といわれる。Ｂ型肝炎ウイルスヌクレオキャプシド抗原
（ＨＢｃＡｇ）は、野生型アミノ酸配列の残基およそ１８〜２７に存在するＮ末
端イムノドミナントＣＴＬエピトープを含む。ＨＢｃＡｇはまた、ＨＢｃＡｇ粒
子中の内部位置に存在するドミナントＢ細胞エピトープを有する（野生型アミノ
酸配列の残基およそ７４〜８１に存在する）。このドミナントＨＢｃＡｇ Ｂ細
胞エピトープは、本明細書中で、「イムノドミナントコアエピトープ」ループ領
域、または「ＩＣＥ」ループ領域といわれる。なぜなら、それは、形成したコア
抗原粒子中で表面のアクセス可能なループ構造（「溶媒アクセス可能なループ」
）として曝されるからである。

【００２６】 コード配列、すなわち選択された抗原を「コードする」配列は、適切な調節配
列の制御下に配置された場合に、インビボで、転写され（ＤＮＡの場合）、そし
てポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の
境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳
終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、コード配列には、ウイ
ルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核
生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえもが含まれ得
るがこれらに限定されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置し
得る。

【００２７】 「核酸」分子には、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ、真核生物ｍＲＮＡから
のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、お
よび合成ＤＮＡ配列さえもが含まれ得るが、これらに限定されない。この用語は
また、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列を含む。

【００２８】 「作動可能に結合される」とは、そのように記載された成分が、それらの通常
の機能を実行するために構成される、エレメントの配列をいう。従って、コード
配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合
に、そのコード配列の発現をもたらし得る。このプロモーターは、そのプロモー
ターがコード配列の発現を指示するように機能する限りは、そのコード配列と連
続している必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列は
、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配
列は、なおコード配列に「作動可能に連結されている」と見なされ得る。

【００２９】 「組換え（体）」は、本明細書中で、その起源または操作によって、天然にお
いて連結しているポリヌクレオチドのすべてまたは一部と結合しないか、そして
／または天然において連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドと
連結している、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源の核酸分子（ポリヌ
クレオチド）を記載するために使用される。単一の組換え体核酸分子中に含まれ
る２つの核酸配列は、天然において通常互いに付随していない場合には、互いに
対して「異種」である。

【００３０】 ２つの核酸配列は、そのヌクレオチドのうちの少なくとも約７０％、好ましく
は少なくとも約８０〜９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％が、そ
の分子の規定された長さにわたって一致する場合に「実質的に相同である」。本
明細書中で使用される場合、実質的に相同とはまた、特定の核酸に対して同一性
を示す配列をいう。実質的に相同である核酸配列は、その特定の系について規定
されるような、例えば、ストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイ
ゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規
定することは、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前
出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出を参照のこと。このような配列は
また、ＰＣＲ産物の直接配列決定によって、確認されそしてさらに特徴付けされ
得る。

【００３１】 用語「個体」および「被験体」を本明細書中で交換可能に使用して、脊索動物
門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーをいう。これらは
、非限定的に、ヒトおよび他の霊長類、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーな
らびに他のサル（ａｐｅ）の種およびサル（ｍｏｎｋｅｙ）の種）を含む；家畜
（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびウマ）；家畜
（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ）（例えば、イヌおよびネコ）；実験用動物
（齧歯動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモット）を含む）；鳥類（家
畜用鳥類、野生の鳥類、および競技用鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ
および他の家禽類、アヒル、ガチョウなど）を含む）を含む。この用語は、特定
の年齢を示さない。従って、成体および新生個体の両方が網羅されることが意図
される。本明細書中に記載される方法は、上記の脊椎動物種のいずれかにおける
使用について意図される。なぜなら、これらの脊椎動物のすべての免疫系が同様
に作動するからである。

【００３２】 （Ｂ．一般的方法） １つの実施形態において、組換え核酸分子が、提供される。この組換え分子は
、Ｂ型肝炎ウイルスヌクレオカプシド抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする配列およ
び目的の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする配列を含む。
ＣＴＬエピトープをコードする配列は、ＨＢｃＡｇ分子の免疫優性コアエピトー
プ（ＩＣＥ）ループ領域に挿入され得る。あるいは、このＩＣＥ領域は、この分
子から欠失され得、そしてこのＣＴＬエピトープをコードする配列は、このＩＣ
Ｅ領域の代わりに挿入され得るか、またはこの分子のＨＢｃＡｇ部分の任意の他
のＮ末端位置、Ｃ末端位置または内部位置に挿入され得る。このＣＴＬエピトー
プをコードする配列の、このハイブリッド分子のＨＢｃＡｇ部分への挿入が、こ
の発現産物がハイブリッドコアキャリア粒子へ自己構築する能力を干渉しないこ
とが、好ましい。適切な宿主細胞にトランスフェクトされる場合、この組換え核
酸分子は、ハイブリッドＨＢｃＡｇキャリア部分をコードし、ここで、このＨＢ
ｃＡｇ部分は、キャリアとして作用し、そしてこのＣＴＬエピトープ部分は、免
疫原として作用する。本発明の組換え核酸分子は、種々の核酸免疫ストラテジー
における試薬として使用され得る。

【００３３】 組換え核酸分子のＨＢｃＡｇ部分は、公知の供給源から得られ得る。この点に
おいて、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、二本鎖ＤＮＡゲノムを有する、小さな
エンベロープウイルスである。このＨＢＶゲノムの配列（特に、サブタイプａｄ
ｗおよびａｙｗの配列）は、公知であり、そして十分に特徴付けられている。Ｔ
ｉｏｌｌａｉｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４８９、Ｃｈｉｓａｒｉ
ら（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．６：３１１。このＨＢｃＡｇは、
１８０アミノ酸残基から構成されるポリペプチドであり、そして非常に研究され
ているいくつかの免疫優性部分（例えば、ＩＣＥループ領域）を有する。ＨＢｃ
Ａｇは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび他の原核生物中で容易に発現
され得、ここで、ＨＢｃＡｇは粒子へと自己構築する。この理由のために、多く
のペプチド抗原は、ＨＢｃＡｇに融合されて、増強されたＢ細胞免疫原性を示す
ハイブリッドコアキャリア粒子を提供してきた。Ｓｃｈｏｅｄｅｌら（１９９４
）Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１８０：１０３７；Ｃｌａｒｋｅら（１９８７）Ｎ
ａｔｕｒｅ ３３０：３８１；Ｂｏｒｉｓｏｖａら（１９８９）ＦＥＢＳ Ｌｅ
ｔｔ．２５９：１２１；Ｓｔａｈｌら（１９８９）Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２８３。ＨＢｃＡｇをコードする核酸配列はまた
、公知であり、そしてＨＢｃＡｇ配列を含むプラスミド構築物が、記載されてい
る。Ｓｃｈｏｅｄｅｌら（前出）。この発現産物において、免疫優性ループ領域
は、１８０残基のＨＢｃＡｇ分子の残基７２〜８５にわたり、ＩＣＥは、ほぼ残
基７４〜８１で生じる。

【００３４】 同様の様式において、目的の抗原をコードする核酸配列は、既知の供給源から
得られ得る。この点において、目的の抗原は、好ましくは、病原体（例えば、ウ
イルス病原体、細菌病原体または寄生生物病原体）と関連し得るか、あるいはこ
の抗原は、腫瘍特異的抗原または自己免疫障害において（例えば、糖尿病、狼瘡
、関節炎、ＭＳにおいて、およびアレルギーにおいて）自己寛容を破壊すること
に有用である抗原であり得る。

【００３５】 腫瘍特異的抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:任意
の種々のＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）（ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３
（ＨＬＡ−Ａ１ペプチド）、ＭＡＧＥ４などを含む）；任意の種々のチロシナー
ゼ（ＨＬＡ−Ａ２ペプチド）；変異体ｒａｓ；変異体ｐ５３；およびｐ９７黒色
腫抗原。他の腫瘍特異的抗原としては、進行性の癌に関連するＲａｓペプチドお
よびｐ５３ペプチド、頸部癌に関連するＨＰＶ１６／１８抗原およびＥ６／Ｅ７
抗原、乳癌に関連するＭＵＣ１−ＫＬＨ抗原、結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌
胎児抗原）、黒色腫に関連するｇｐ１００抗原またはＭＡＲＴ１抗原、ならびに
前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原が挙げられる。ｐ５３遺伝子配列は、公知であり
（例えば、Ｈａｒｒｉｓら（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６
５０〜４６５６を参照のこと）、例えば、ＧｅｎＢａｎｋで登録番号Ｍ１４６９
４の下で寄託されている。

【００３６】 適切なウイルス抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
肝炎ファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（
ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ
型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗
原をコードするポリヌクレオチド配列。本発明において例示のために、そして限
定せずに、ＨＣＶのゲノム配列ならびにこの配列を得る方法は、公知である。例
えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ
９０／１４４３６を参照のこと。同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原のコード配列は、
公知である（例えば、米国特許第５、３７８、８１４号を参照のこと）。

【００３７】 ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質抗原をコードする
配列もまた、本発明の実施において使用され得、この抗原としては、単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来の抗原（例えば、ＨＳＶ−１およびＨ
ＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺ
Ｖ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス由来
の抗原（ＣＭＶ）（ＣＭＶ ｇＢおよびＣＭＶ ｇＨを含む）；ならびに他のヒ
トヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原が挙げられ
る（例えば、Ｃｈｅｅら（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｇａｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ
．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１２５〜１６
９頁；ＭｃＧｅｏｃｈら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１５３１
〜１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら（１９８４）Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１０：２０７〜２１１；およびＤａｖｉｓｏｎら（１９８６）Ｊ．Ｇ
ｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。

【００３８】 ＨＩＶ抗原（例えば、多数のＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２単離物についてのｇ
ｐ１２０配列）（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）は、公知
であり、そして報告されており（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ
Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；および
Ｍｏｄｒｏｗら（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５７０〜５７８）、そして
任意のこれらの単離物由来の抗原は、本発明の方法における使用を見出す。さら
に、本発明は、種々のＨＩＶ単離物（任意の種々のエンベロープタンパク質（例
えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよび
ｐ５５ｇａｇ）、ならびにＨＩＶのｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｖｉｆ、ｒｅｖ、
ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびＬＴＲ領域由来のタンパク質を含む）由来の他の
免疫原性部分に対して等価に利用可能である。

【００３９】 インフルエンザウイルス抗原、特に、インフルエンザＡのエンベロープ糖タン
パク質ＨＡおよびＮＡはまた、周知であり、そして広く特徴付けられている。こ
の点において、インフルエンザＡの多くのＨＡサブタイプは、同定されている（
Ｋａｗａｏｋａら（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：７５９；Ｗｅｂｓｅ
ｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ
Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」１２７〜１６８頁：Ｐ．Ｐａｌｅ
ｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎ
ｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ）。

【００４０】 他のウイルス由来の抗原または他のウイルスから得られる抗原コードする配列
はまた、本発明の実施における使用を見出し、以下を含むが、これらに限定され
ない：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、ＦＭＤＶなど）；カリチ
ウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）
；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；
ラブドウイルス（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）科（例えば、狂犬病ウイルス
など）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウ
イルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイル
ス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−１；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１
（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる））（こ
れは、単離物ＨＩＶ_IIIb、ＨＩＶ_SF2、ＨＩＶ_LAV、ＨＩＶ_LA1、ＨＩＶ_MN；ＨＩ
Ｖ−１_CM235、ＨＩＶ−１_US4；ＨＩＶ−２など由来の抗原を含むが、これらに限
定されない）。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ
ａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉ
ｐｅ編、１９９１）を参照のこと。

【００４１】 適切な細菌抗原および寄生生物抗原をコードする配列は、以下のような疾患の
原因である公知の原因因子から得られる得かまたは由来され得る：ジフテリア（
Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）、百日咳、破傷風、結核、細菌性肺炎または真菌性肺炎、
コレラ、腸チフス、ペスト、細菌性赤痢またはサルモネラ症、レジオネラ疾患（
Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、ライム病、らい病、マラリア、
鉤虫、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症（Ｌ
ｅｓｍａｎｉａｓｉｓ）、ジアルジア属、アメーバ症（ａｍｏｅｂｉａｓｉｓ）
、フィラリア症、ボレリア属（Ｂｏｒｅｌｉａ）、およびトリパノソーマ症。な
おさらなる抗原配列は、従来にはないウイルスまたはプリオン（例えば、クール
ー、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、スクラピー、ミンクの伝染性脳
症および慢性消耗病の原因因子）、あるいは狂牛病に関連するプリオンのような
タンパク質様感染粒子から得られ得るか，またはそれらに由来し得る。

【００４２】 選択された抗原配列は、離散性抗原として（例えば、短いペプチドをコードす
る配列として）使用され得るか、あるいは問い合わせ中の分子もしくはゲノムの
ミニ遺伝子（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）（Ｙｕら）またはより大きな部分は、例えば、
プロウイルスＤＮＡ（これは、特定のウイルスゲノムのほぼすべてを含む）とし
て使用され得る。複数の抗原はまた、同じ実体からかまたは全体的に無関連な実
体からのいずれかから使用され得る。しかし、本発明の組換え核酸分子内に含ま
れる目的の各抗原は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、好ましくは、ＣＴＬ
エピトープを含む。特定の抗原配列中のＴ細胞エピトープの存在は、当業者によ
って容易に決定され得る。例えば、通常のコンピュータソフトウェアパッケージ
およびペプチドシミュレーション技術は、理想的な対立遺伝子特異的ＭＨＣ結合
モチーフの存在について所定の配列をスキャンするために使用され得る。Ｒｏｔ
ｈｂａｒｄら（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：５２７；Ｒｏ
ｔｚｓｃｈｋｅら（１９９１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １２：４４７；Ｂ
ｅｒｔｏｌｅｔｔｉら （１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２３７６；Ｆｌａ
ｋら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：２９０。

【００４３】 いくつかの分子において、哺乳動物細胞からの結合されたハイブリッドＨＢｃ
Ａｇ−抗原分子の分泌を提供する、第３の付属的な配列が、含まれ得る。このよ
うな分泌リーダー配列は、当業者に公知であり、そして例えば、組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター（ｔｐａ）リーダーシグナル配列を含む。

【００４４】 目的のＨＢｃＡｇキャリア、付属的リーダー、および抗原についての配列は、
公知の方法を使用して得られ得るかおよび／または調製され得る。例えば、実質
的に純粋な抗原調製物は、標準的な分子生物学的手段を使用して得られ得る。す
なわち、上記の部分についてコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法（
例えば、抗原を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリ
ーニングすることによるか、またはＨＢｃＡｇについてのコード配列を含むこと
が公知であるベクターからこの配列をを誘導することによる）を使用して得られ
得る。さらに、所望の配列は、これらの配列を含む細胞および組織から、標準的
な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェノール抽出およびＰＣＲ）
を使用して、直接単離され得る。ＤＮＡを得るためおよび単離するために使用さ
れる技術の説明については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと。
ポリヌクレオチド配列はまた、クローニングされるよりもむしろ合成的に産生さ
れ得る。

【００４５】 特定の核酸分子を単離するためのなお別の簡便な方法は、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）によるものである。Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５−３５０。この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ（
通常、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して、ＤＮＡの所望の領域を複製す
る。複製されるべきＤＮＡの領域は、複製反応をプライムするための所望のＤＮ
Ａの反対の末端および反対の鎖に相補的な指定された配列のオリゴヌクレオチド
により同定される。初回の複製の産物は、それ自身が、引き続く複製のための鋳
型であり、従って繰り返される連続複製サイクルは、使用されるプライマー対に
より範囲を定められるＤＮＡフラグメントの相乗的増殖を生じる。

【００４６】 一旦、ＨＢｃＡｇキャリアおよび本目的の抗原についての配列が得られると、
これらはお互いに連結されて、標準的なクローニングまたは分子生物学の技術を
用いて、核酸分子を提供する。より詳細には、ＨＢｃＡｇキャリアについての配
列情報が得られた後に、目的の抗原をコードする配列が、キャリア配列と組み合
わされて、ハイブリッド分子を形成する。本明細書中で上記に記載されるように
、抗原配列は、ＩＣＥループ領域内に単に配置されて、それによってこの領域を
破壊し得るか、あるいはＩＣＥループ領域は、分子のキャリア部分から欠失され
、そして抗原配列で置換され得るか、または抗原配列がＨＢｃＡｇ配列内の異な
る位置に配置され得るかのいずれかである。少なくとも１つのＴ細胞エピトープ
（例えば、ＣＴＬエピトープ）をコードする抗原配列は、一般に、最小限約５つ
のアミノ酸、より代表的には最小限約８のアミノ酸、そしてよりさらに代表的に
は最小限約９〜１０アミノ酸をコードする。１を超えるエピトープが存在する場
合、抗原配列は、少なくともエピトープの組み合わせた配列と同じくらい大きい
。しかし、Ｔ細胞エピトープは重複し得るので、抗原配列に対する最小限のアミ
ノ酸配列は、個々のエピトープの合計未満であり得る。

【００４７】 多数の慣用的分子生物学的技術を用いて、このような組換え核酸分子を構築し
得るが、ある簡便な方法は、ＨＢｃＡｇ配列における１つ以上の独特な制限部位
を用いること（またはＨＢｃＡｇ配列へ１つ以上の独特な制限部位を挿入するこ
と）およびキャリア配列内の特定の標的位置へと抗原配列を指向させるための標
準的なクローニング技術を必要とする。この点において、独特の制限部位の設計
は、既存の制限部位についてのＨＢｃＡｇ配列を分析することによってか、また
はＨＢｃＡｇ配列を一連の異なる制限エンドヌクレアーゼに供し、そしてどの酵
素がこの配列を切断するか、および各切断部位を決定することによってのいずれ
かで、容易に達成される。特定の標的化挿入部位に隣接するＨＢｃＡｇ分子にす
でに存在する配列を変異させて、独特の制限部位を生成し得る。多の点で適切な
制限部位は、ＨＢｃＡｇ配列へと容易に挿入されて（例えば、操作されて）、１
つ以上の標的挿入部位を提供し得る。抗原配列は、このようにして、当然、ＨＢ
ｃＡｇ配列における標的部位と対応する隣接する制限部位を有するように操作さ
れる。この様式において、抗原配列は、ＨＢｃＡｇ配列の内外において容易にシ
ャッフルされ得る。

【００４８】 あるいは、ハイブリッドキャリア／抗原配列は、クローン化されるよりもむし
ろ合成的に生成され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対
する適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、配列が発現される意図した宿
主に好ましいコドンを選択する。次いで、完全配列は、標準的な方法によって調
製された重複するオリゴヌクレオチドから構築され得、そして完全なコード配列
へと構築され得る。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５
６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９
９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照の
こと。

【００４９】 組換え核酸分子が調製されるどのような様式においても、抗原配列のＨＢｃＡ
ｇキャリアへの挿入は、粒子へと自己構築するハイブリットコアキャリア発現産
物の能力を破壊しないことが好ましい。粒子を形成するハイブリッドＨＢｃＡｇ
抗原分子発現産物の能力は、公知の技術を用いて評価され得る（例えば、Ｓｃｈ
ｏｅｄｅｌら、前出、ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ ｏｆ ｆｉ
ｘｅｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ｎａｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎを参照のこと）。

【００５０】 一旦抗原配列が、組換え核酸分子を得るためにＨＢｃＡｇ配列へと挿入される
と、このハイブリッドコード配列は、挿入された配列に作動可能に連結された制
御配列を含むベクターへと挿入され得、従って標的とされる対象の種において、
インビボでのハイブリッドＨＢｃＡｇ抗原分子の発現を可能にする。例えば、哺
乳動物細胞発現について代表的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモー
ター、ＣＭＶ前初期プロモーターのようなＣＭＶプロモーター、マウス乳腺癌ウ
イルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期（ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ）
プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および他の適切に効率的なプロモーター系が挙
げられる。非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由
来のプロモーター）もまた、哺乳動物発現に用いられ得る。代表的には、翻訳停
止コドンに対して３’側に配置される、転写ターミネーターおよびポリアデニル
化配列もまた存在する。好ましくは、コード配列に対して５’側に配置される、
翻訳の開始の最適化のための配列もまた、存在する。転写ターミネーター／ポリ
アデニル化シグナルの例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、に記載されるよ
うなＳＶ４０由来のもの、およびウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げら
れる。スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位を含む、イント
ロンもまた、発現カセット中に設計され得る。

【００５１】 さらに、エンハンサーエレメントは、発現レベルを増加させるために発現カセ
ット内に含まれ得る。適切なエンハンサーの例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エ
ンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１）、ラウ
ス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）由来のエンハンサー／プロモーター
（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７９：６７７７）、およびヒトＣＭＶまたはマウスＣＭＶ由来のエレメント（
Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイン
トロンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。

【００５２】 一旦完了すると、これらの構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いる
核酸免疫に用いられる。遺伝子送達の方法は、当該分野で公知である。例えば、
米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９
，４６６号を参照のこと。遺伝子は、被験体に直接的に送達されるか、または被
験体由来の細胞へとエキソビボで送達され、その後この細胞が、その被験体に再
移植されているかのいずれかであり得る。

【００５３】 ウイルスに基づく多数の系が、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために開
発されている。例えば、選択された組換え核酸分子は、ベクターに挿入され、そ
して当該分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子にパッケージされ得る。
次いで、組換えウイルスは単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれ
かで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されている（
米国特許第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕ
ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４；およびＢｕｒｎｓら（１９
９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−８０
３７）。

【００５４】 多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ
ら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９
９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１７−７２９；およびＲ
ｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４
７６）。さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が開発されて
いる。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。
例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国
際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ９３
／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）
Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら
（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５
３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉ
ｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−
１２９；およびＫｏｔｉｎ、Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈ
ｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１を参照のこと。本発明の組換え核酸分子を送達
するための用途を見出している、さらなるウイルスベクターとしては、ワクシニ
アウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含む、ポックスファミリーのウイルス
由来のウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

【００５５】 ウイルスベクターが必要とされない場合、リポソーム調製物を代替的に使用し
て、本発明の核酸分子を送達し得る。有用なリポソーム調製物としては、カチオ
ン性調製物（正に荷電した）、アニオン性調製物（負に荷電した）、および中性
調製物が挙げられる（カチオン性リポソームが特に好ましい）。カチオン性リポ
ソームは、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を媒介することが示されている（Ｆｅ
ｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
４：７４１３−７４１６）およびｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６０７７−６０８１）。

【００５６】 ウイルスベクター系に対するなお別の代替物として、本発明の核酸分子が、粒
子状キャリアに、カプセル化され得るか、吸着され得るか、または会合され得る
。適切な粒子状キャリアとしては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導
されるキャリア、およびポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリ
ド）から誘導されるＰＬＧ微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら（１
９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：３６２−３６８を参照のこと。他の粒子系
およびポリマーもまた用いられ得る（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポ
リオルニチン、スペルミン、スペルミジンのようなポリマー、およびこれらの分
子の結合体）。

【００５７】 上記の組換え核酸分子を含む組成物の処方は、標準的な薬学的処方の化学およ
び方法論を用いて実行され得、そしてこれらの全ては、当業者に容易に利用可能
である。例えば、１つ以上の核酸分子を含む組成物は、１つ以上の薬学的に受容
可能な賦形剤またはビヒクルと組み合わされ得る。補助物質（例えば、湿潤剤ま
たは乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）は、賦形剤またはビヒクルに存在し得る。これ
らの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、組成物を受ける個体において免疫応答
を誘導しない一般的な薬剤であり、そして過度の毒性なしに投与され得る。薬学
的に受容可能な賦形剤としては、液体（例えば、水、生理食塩水、ポリエチレン
グリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、およびエタノール）が挙げられるが
、これらに限定されない。薬学的に受容可能な塩（例えば、無機酸塩（例えば、
塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、
酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など））もまた、その中に含
まれ得る。核酸の取込みおよび／または発現の特定の促進剤（例えば、促進剤（
例えば、ブピバカイン、心臓毒素（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）、およびスクロー
ス））もまた、この組成物に含まれ得る。薬学的に受容可能な賦形剤、ビヒクル
および補助物質の徹底的な議論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥ
ＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９
１）（本明細書中で参考として援用される）において利用可能である。

【００５８】 処方された組成物は、上記に規定のような、免疫学的応答を開始させるに十分
な量の目的の抗原を含む。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る
。このような量は、慣用試験によって決定され得る、比較的広い範囲に入る。組
成物は、約０．１％〜約９９．９％の抗原を含み得、そして被験体に直接投与さ
れ得るか、あるいは被験体由来の細胞に当業者に公知の方法を用いてエキソビボ
で送達され得る。例えば、エキソビボ送達および形質転換細胞の被験体への再移
植のための方法（例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カル
シウム沈澱、エレクトロポレーション、および核の直接マイクロインジェクショ
ン）は公知である。インビボ送達のための方法は、従来のシリンジを用いた注射
を伴い得る。構築物は、皮下、皮膚、皮内、粘膜内（例えば、鼻内、直腸、およ
び膣）、腹腔内、経口的または筋肉内のいずれかで注射され得る。他の投与形態
としては、経口投与および肺投与、坐剤、および経皮適用が挙げられる。

【００５９】 しかし、核酸分子が、核酸でコーティングされた微粒子を標的組織へと発射す
るかまたは粒子状核酸組成物を経皮送達する、粒子加速デバイスを用いて送達さ
れることが好ましい。これに関して、遺伝子銃に基づく核酸免疫は、体液性およ
び細胞傷害性のＴリンパ球免疫応答を、ナノグラム量のＤＮＡの皮膚送達後に惹
起することが示されている。Ｐｅｒｔｍｅｒら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １
３：１４２７−１４３０。粒子媒介送達技術は、他の型の核酸接種と比較されて
おり、そして著しく優れていることが見出されている。Ｆｙｎａｎら（１９９５
）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７：７９−８３、Ｆ
ｙｎａｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：１１４７８−１１４８２、およびＲａｚら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５１９−９５２３。このような研究は、表
面の皮膚および筋肉組織の両方に対する、核酸に基づくワクチンの粒子媒介送達
を調べた。

【００６０】 核酸調製物を送達するための粒子媒介方法は、当該分野で公知である。従って
、一旦調製され、そして適切に精製されると、上記の核酸分子は、当該分野で公
知の種々の技術を用いてキャリア粒子上にコーティングされ得る。キャリア粒子
は、遺伝子銃デバイスからの細胞内送達のために代表的に用いられる粒子サイズ
の範囲の、適切な密度を有する材料から選択される。最適なキャリア粒子のサイ
ズはもちろん、標的細胞の直径に依存する。

【００６１】 本発明の目的のために、タングステン、金、プラチナおよびイリジウムのキャ
リア粒子が用いられ得る。タングステン粒子および金粒子が好ましい。タングス
テン粒子は、０．５〜２．０μｍ直径の平均サイズで容易に入手可能である。金
粒子または微結晶金（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｎ
ｅｗａｒｋ，ＮＪから入手可能な、金粉末Ａ１５７０）もまた、本発明での用途
を見出す。金粒子は、サイズの均一性を提供する（Ａｌｐｈａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓから、１〜３μｍの粒子サイズにおいて利用可能、またはＤｅｇｕｓｓａ，
Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪから、０．９５μｍを含む粒子サイズ
の範囲で入手可能）。微結晶金は、多様な粒子サイズ分布（代表的には、０．５
〜５μｍの範囲）を提供する。しかし、微結晶金の不規則な表面積は、核酸での
高度に効率的なコーティングを提供する。

【００６２】 多数の方法が公知であり、そしてＤＮＡまたはＲＮＡの金粒子またはタングス
テン粒子へのコーティングまたは沈澱について記載されている。大部分のこのよ
うな方法は一般に、所定量の金またはタングステンと、プラスミドＤＮＡ、Ｃａ
Ｃｌ₂およびスペルミジンを組み合わせる。得られる溶液は、反応混合物の均一
性を確実にするために、コーティング手順の間に連続的にボルテックスされる。
核酸の沈澱後、コーティングされた粒子は、適切なメンブレンに移入され得、そ
して使用前に乾燥させ得、サンプルモジュールまたはカセットの表面上にコーテ
ィングされ得、または特定の遺伝子銃装置において使用される送達カセット中に
装填され得る。

【００６３】 粒子媒介送達に適切な種々の粒子加速デバイスは、当該分野で公知であり、そ
して本発明の実施において用いるために全ての適切である。現在のデバイスの設
計は、爆発的な、電気的または気体的発射を用いて、コーティングされたキャリ
ア粒子を標的細胞に向けて推進する。コーティングされたキャリア粒子それ自体
を、移動可能なキャリアシートに放出可能に付着させ得るか、または気流が通過
する表面に取り外し可能に付着させ得、粒子をこの表面から持ち上げ、そしてこ
れらを標的に向けて加速する。気体発射デバイスの例は、米国特許第５，２０４
，２５３号に記載される。爆発型デバイスは、米国特許第４，９４９，０５０号
に記載される。ヘリウム発射型粒子加速装置の一例は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ
ＸＲ（登録商標）装置（ＰｏｅｄｅｒＪｅｃｔ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｎｃ．，
Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）であり、この装置は、米国特許第５，１２０，６５７号
に記載される。本明細書中での使用に適切な電気的発射装置は、米国特許第５，
１４９，６５５号に記載される。これらの特許の全ての開示は、本明細書中に参
考として援用される。

【００６４】 あるいは、粒子状核酸組成物は、針のないシリンジデバイスを用いて経皮投与
され得る。例えば、本発明の核酸分子を含む粒子状組成物は、単純エバポレーシ
ョン（結晶化）、減圧乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥のような一般的な薬学的方
法を用いて入手され得る。所望される場合、この粒子は、本明細書中に参考とし
て援用される、共有に係る国際公開番号ＷＯ９７／４８４８５に記載される技術
を用いてさらに緻密にされ得る。次いで、これらの粒子状組成物は、針なしのシ
リンジシステム（例えば、共有に係る国際公開番号ＷＯ９４／２４２６３、ＷＯ
９６／０４９４７、ＷＯ９６／１２５１３およびＷＯ９６／２００２２（これら
の全ては本明細書中に参考として援用される）に記載されるシリンジ系）から送
達され得る。

【００６５】 上記に引用した針なしのシリンジ系からの抗原またはアレルゲンを含む粒子の
送達は、一般に０．１μｍ〜２５０μｍの範囲、好ましくは約１０μｍ〜７０μ
ｍの範囲のおよそのサイズを有する粒子について実施される。約２５０μｍより
も大きな粒子もまた、このデバイスから送達され得、上限は、粒子のサイズが皮
膚細胞に対して都合の悪い損傷を引き起こす点である。送達された粒子が標的表
面を貫通する実際の距離は、粒子サイズ（例えば、ほぼ球形の粒子外形とみなし
た名目粒子直径）、粒子密度、粒子が表面に衝突する初速度、ならびに標的とさ
れた皮膚組織の密度および動粘性率に依存する。このことに関して、針なしの注
射に使用するための最適粒子密度は一般に、約０．１ｇ／ｃｍ³と２５ｇ／ｃｍ³ との間、好ましくは約０．９ｇ／ｃｍ³と１．５ｇ／ｃｍ³との間の範囲であり、
そして注射速度は一般に約１００ｍ／秒と３，０００ｍ／秒との間の範囲である
。適切な気体圧力を用いて、１０μｍ〜７０μｍの平均直径を有する粒子は、駆
動気体流の超音波速度に近づく速度でノズルを通して加速され得る。

【００６６】 粒子組成物またはコーティングされた粒子は、投薬処方物と適合性の様式で、
そして本発明の目的のために有効である量で個体に投与される。送達されるべき
組成物の量（例えば、約０．１μｇ〜１ｍｇ、より好ましくは１μｇ〜５０μｇ
の抗原またはアレルゲン）は、試験される個体に依存する。正確な量は、必ず、
処置されるべき個体の年齢および一般的状態に依存して変化し、そして適切な有
効量は、本明細書をよめば、当業者によって容易に決定され得る。

【００６７】 本発明の別の実施形態では、被験体において細胞免疫応答を惹起するための方
法が提供される。この方法は、被験体の細胞を、本発明のうちの１つの分子のを
用いて（本明細書中上記に記載のように）開始工程において組換えハイブリッド
ＨＢｃＡｇ抗原コード配列でトランスフェクトする工程、次いでブースト工程に
おいて二次組成物を被験体に投与する工程を伴い、ここで二次組成物は、組換え
ハイブリッドＨＢｃＡｇ抗原分子におけるのと同じ抗原を含むかまたはコードす
る。二次組成物は、目的の抗原をコードする核酸分子を含む任意の適切なワクチ
ン組成物、またはペプチドまたはタンパク質形態の目的の抗原を含む組成物であ
り得る。二次組成物のインビボでの直接送達は一般に、上記のようなウイルスベ
クター（例えば、改変されたワクチンベクター）を用いてまたは用いずに、従来
のシリンジを用いる注射によって、または上記にも記載したような粒子媒介送達
系を用いるかのいずれかで達成される。注射は代表的に、皮下、皮膚、皮内、粘
膜内（例えば、鼻内、直腸および／または膣）、腹腔内、静脈内、経口または筋
肉内のいずれかである。他の投与形態としては、経口投与および肺投与、坐剤な
らびに経皮適用が挙げられる。投薬処置は、単一用量スケジュールまたは多回用
量スケジュールであり得る。

【００６８】 （Ｃ．実験） 以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実
施例は、例示の目的にのみ提供され、そして本発明の範囲を限定することを決し
て意図しない。

【００６９】 用いた数（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力を行
ったが、いくつかの実験誤差および偏差が許容されるべきである。

【００７０】 （実施例１ ハイブリッドＨＢｃＡｇ抗原分子の構築） Ｃ末端アルギニンリッチ領域が除去された（この欠失は、粒子の形成を妨害し
ない）ＨＢｃＡｇ粒子をコードする配列を入手した。次いで、独特の制限部位（
ＢＳＰ１２０Ｉ部位）を、ＩＣＥに挿入して、目的の抗原についての挿入点を提
供した。得られる配列を、以下に配列番号１として示し、ここで、ＢＳＰ１２０
Ｉ部位は、四角で囲まれた配列領域によって示される。

【００７１】

【化１】 配列番号１の組換え核酸分子から翻訳されるタンパク質を、以下で配列番号２
として示す。ここでさらに、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含む抗原配列
についての挿入点（ＢＳＰ１２０Ｉ部位）が四角で囲まれた残基によって示され
る。

【００７２】

【化２】 次いで、隣接するＢＳＰ１２０Ｉ部位を有する、ＳＩＶ ＣＴＬエピトープ（
ｍａｍｕ Ａ^*０１制限処理されたｇａｇ配列：ＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ、Ａｌｌ
ｅｎら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；Ｋｕｒｏｄａら（１９８８）Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３７３−１３８１）をコードする抗原配列を、配列番
号１のＢＳＰ１２０Ｉ部位に挿入して、ハイブリッドＨＢｃＡｇ抗原分子をコー
ドする組換え分子を得た。得られる構築物を、以下に配列番号３として示す。挿
入された抗原配列を、四角で囲まれた配列領域として示す。

【００７３】

【化３】 配列番号３の組換え核酸分子の翻訳物を、以下で配列番号４として示し、ここ
で、挿入された抗原配列（ＣＴＬエピトープを含む）＋隣接配列を四角で囲んだ
残基として示す。

【００７４】

【化４】 次いで、分泌シグナルペプチドについてのコード配列を含む第３の配列を、こ
の組換え配列に連結した。 この第３の配列コードは、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｐａ）シグ
ナルペプチドについてのコード配列であり、そして以下で配列番号５として示さ
れる。

【００７５】

【化５】 このｔｐａシグナルペプチドについてのタンパク質配列を以下に配列番号６と
して示す。

【００７６】

【化６】 次いで、得られた組換え分子を、ＣＭＶ初期プロモーターおよびイントロンＡ
領域を含むプラスミド骨格に挿入して、発現カセットを得た。得られた構築物を
ｐ７２６２と名づけ、そしてこの構築物のマップを図１に示す。

【００７７】 （実施例２） （ｐ７２６２構築物での免疫） 本発明の組換え分子が、免疫された被験体において高頻度のＴ細胞応答を誘発
する能力を評価するために、以下の研究を行った。

【００７８】 ３匹のアカゲザル被験体を、キャリア部分を含まないｍａｍｕＡ^*０１制限ｇ
ａｇ配列（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ）をコードする発現ベクターでプライムした。
これらの被験体のうち２匹（サル９５０４５および９５０５８）は、全６．０μ
ｇ ＤＮＡ（各１２部位に０．５μｇが送達される）を受けた。第３の被験体（
サル９６０３１）は、全１６．０μｇ ＤＮＡ（各８部位に２．０μｇが送達さ
れる）を受けた。このＤＮＡは、公知の送達方法論に従って、ＰｏｗｄｅｒＪｅ
ｃｔ ＸＲ（登録商標）遺伝銃デバイスを使用して、金粒子上で投与した。引き
続いて、これらの被験体のうち２匹（サル９５０４５および９５０５８）は、ｐ
７２６２構築物を含む組成物を使用する、４回のさらなる核酸免疫プライムを受
けた。これらのさらなるプライムの最初のプライムは、開始プライム後１３週目
に行い、その後、各４〜６週間隔で投与した。全１６μｇのｐ７２６２構築物を
、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ（登録商標）遺伝銃デバイスを再度使用して、各
さらなるプライムに際して投与した（各８部位に対して２μｇ）。第３の被験体
（サル９６０３１）は、ｐ７２６２構築物を含む組成物を使用する、２回のさら
なる核酸免疫プライムを受けた。これらのさらなるプライムの最初のプライムは
、開始プライム後６週目に行い、第２のプライムを、４〜６週間後に投与した。
全１６μｇのｐ７２６２構築物を、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ（登録商標）デ
バイスを使用して、各さらなるプライムに際して投与した（各８部位に対して２
μｇ）。

【００７９】 上記のプライム免疫レジームの後、血液サンプルを採取し、そして末梢血単核
細胞（ＰＢＭＣ）を単離して、そしてペプチドパルスされたＥＢＶで形質転換さ
れた自己Ｂ細胞で、２週間インビトロで刺激した。ＳＩＶエピトープ（ＣＴＰＹ
ＤＩＮＱＭＬ）に特異的なＣＤ８⁺細胞のパーセンテージを、公知の技術を使用
するＦＩＴＣ結合テトラマーＳＩＶエピトープ（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ）を用い
るフローサイトメトリーを使用して、各被験体について測定した。Ｋｕｒｏｄａ
ら、（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：１３７３−１３８１。さらに、
ＳＩＶエピトープ（ＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ）特異的細胞溶解活性を、ペプチドパ
ルスされた自己Ｂ細胞に対する溶解を、⁵¹Ｃｒ放出アッセイにおいて測定するこ
とによって決定した。これらの結果を、図２Ａおよび２Ｂとして、それぞれ示す
。理解され得るように、開始プライムは、検出可能なＣＴＬ応答を生じる。しか
し、その後のｐ７２６２構築物（ハイブリッドＨＢｃＡｇ抗原をコードする組換
え核酸分子を含む）の接種は、このＣＴＬ応答における有意な増加を生じた。こ
れらの被験体のうち２匹（サル９５０５８および９６０３１）において、このＣ
ＴＬ応答は、ＳＩＶ感染サル（コントロール）に検出されるレベルを超えるレベ
ルに増加された。

【００８０】 次いで、これらの３匹全てのプライムした被験体を、同じＳＩＶエピトープ（
ＣＴＰＹＤＩＮＱＭＬ）をコードする組換え改変型ワクシニアＡｎｋａｒａベク
ターを用いてブーストした。Ｈａｎｋｅら、（１９９８） Ｖａｃｃｉｎｅ １
６：４３９−４４５。より詳細には、このＳＩＶエピトープをコードする、５×
１０⁸粒子形成単位（ｐｆｕ）の組換えＭＶＡベクターを含む二次ワクチン組成
物を、各被験体に投与した。ペプチドパルスされた自己標的のテトラマー染色お
よび殺傷を、各被験体において再度評価した。その結果を、以下の表１に報告す
る（新鮮な、または凍結させた再刺激していないＰＢＭＣからのテトラマー染色
および細胞溶解活性）。ＰＢＭＣを、ＭＶＡブースト後１週間でアッセイした。

【００８１】

【表１】 理解される得るように、非常に高頻度のＣＴＬ応答が、被験体の２／３（サル
９５０５８および９６０３１）で観察され、それぞれ、ＳＩＶエピトープに特異
的な全ＣＤ８⁺細胞の１８％および８．３％である。これらのレベルは、急性の
ＳＩＶ感染によって誘導されたレベルを超え、２用量のＭＶＡワクチン組成物（
Ｓｅｔｈ＆Ｌｅｔｖｉｎ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ）でプライムおよびブーストしたサルにおいて検出されたレベルを超え、
そして非ＨＢｃＡｇキャリアベースのＳＩＶエピトープの２回のＤＮＡ免疫でプ
ライムしたサルにおいて検出されたレベルを超える。さらに、本発明者らは、本
発明の組換え核酸分子で誘発されたこの高頻度のＣＴＬ応答が、非ヒト霊長類モ
デルにおいて今までに検出された中で、最も高いレベルのワクチン誘導性ＣＴＬ
であり得ると考える。

【００８２】 以下の一般的方法を使用して、以下の実施例３〜７に記載される研究を実行し
た。各研究において、ＨＢｃＡｇハイブリッド配列を含むＤＮＡ分子を、金粒子
上にコートして、本発明に従う例示的組成物を提供した。このコートした粒子を
、動物被験体に投与し、そしてこの組成物が、抗原特異的なＴｈ、ＣＴｌおよび
／または抗体応答を誘発する能力を、評価した。

【００８３】 （コアキャリア粒子のコーティング）：適切な重量の金粒子を、１．５ｍＬ
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内に直接加えた。次いで、４００〜５００μＬの０
．０５Ｍスペルミジンを添加し、そして金／スペルミジン溶液中の金の凝集塊を
、水浴超音波処理器を使用して、３〜５秒間で破砕した。ＤＮＡストック溶液（
関連するＤＮＡプラスミド分子を含む）を、この金／スペルミジン溶液に添加し
て、２．０μｇ ＤＮＡ／ｍｇ Ａｕのビーズ負荷比率を生じ、そしてこのチュ
ーブを、キャップして、そして反転させて混合し、次いで、手短にボルテックス
した。ボルテックス機（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）を速度を下げるよう調整した後、穏
やかにボルテックスしながら、ある容量の１０％ＣａＣｌ₂を、その乾燥状態の
金に添加したスペルミジンの容量に等しい量まで滴下した。一旦、全容量のＣａ
Ｃｌ₂が添加されると、この得られた溶液を、高速で約５秒間ボルテックスした
。次いで、この溶液を、少なくとも１０分間、室温で沈殿させた。一方で、ポリ
ビニルピロリドン（ＰＶＰ）／エタノールストック溶液を、０．０３ｍｇ ＰＶ
Ｐ／ｍＬ ＥｔＯＨの濃度で形成した。その１０分間の沈殿後、チューブを、手
短に（１０〜１５秒）遠心分離し、全ての金をペレット化した。この上清を吸引
し、そしてチューブを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆラックにわたって「傾斜（ｒａｋｅ
ｄ）」させて、この金ペレットを緩やかにした。８００μｌのＥｔＯＨを添加し
、そしてチューブを数回反転させて、このＤＮＡコートした金を洗浄する。この
工程を２回繰り返し、その後、チューブを再度遠心分離し、そして上清を吸引し
た。次いで、この洗浄した、ＤＮＡコートした金粒子をＰＶＰストック溶液に添
加し、そして５０μｇのＱｕｉｌ Ａを、このＰＶＰ−ＤＮＡコートした金粒子
の溶液に、３秒間の超音波処理を伴って、添加した。この得られた粒子は、ＤＮ
Ａ＋Ｑｕｉｌ Ａワクチン組成物でコートされ、次いで、以前に記載されたよう
なＴｅｆｚｅｌ^TMチュービングの長さ内にロードした。例えば、ＰＴＣ特許出願
ＰＣＴ／ＵＳ９５／００７８０および米国特許第５，７３３，６００号；同第５
，７８０，１００号；同第５，８６５，７９６号および同第５，５８４，８０７
号（これらの開示は、参考として本明細書によって援用される）を参照のこと。

【００８４】 （マウスＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）材料および試薬は、以下のとおりであった
。コーティング抗体（Ｒａｔ抗マウスＩＦＮ−γ Ａｂ、ラット抗マウスＩＬ−
４ ＡＢまたはラット抗マウスＩＬ−５ Ａｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を含む
）；検出試薬（ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γ、ビオチン化ラット抗マウ
スＩＬ−４またはビオチン化ラット抗マウスＩＬ−５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
を含む）；濾過滅菌した炭酸緩衝液（ｐＨ ９．６）（Ｐｉｅｒｃｅ）、９６ウ
ェルＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、滅菌１×リン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ
結合体（Ｍａｂｔｅｃｈ）；アルカリホスファターゼ気質キット（ＢｉｏＲａｄ
）、およびＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ細胞培養培地（Ｓｉｇｍａ）。細胞刺激を、
以下のように行った。Ｔ細胞ヘルパーサイトカイン放出について、ワクチン接種
した動物由来の脾細胞を、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸を補充し
たＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中、６×１０⁶細胞／ｍＬで培養した。１ｍＬの細胞
を、２４ウェルプレートの各ウェルに移し、そして、各被験体について、１ウェ
ル＝培地のみ（バックグラウンドコントロール）、および１ウェル＝選り抜きの
抗原または選り抜きのクラスＩＩペプチド。次いで、プレートを、組織培養イン
キュベーター中で、３日間インキュベートした。ＣＴＬ前駆体ＩＦＮ−γ放出に
ついて、ワクチン接種した動物由来の脾細胞を、ピルビン酸ナトリウムおよび非
必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中、６×１０⁶細胞／ｍＬで培
養した。１ｍＬの細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに移し、そしてこのプ
レートを、２日間インキュベートし、その後、ＣＴＬペプチドをペプチドウェル
に添加した。各被験体について、１ウェル＝培地のみ、１ウェル＝１０^-5Ｍの選
り抜きのＣＴＬペプチド、および１ウェル＝無関係のＣＴＬペプチド。次いで、
プレートを、ペプチドの添加後で、かつＥＬＩＳＰＯＴプレート中への細胞のプ
レート前に、さらに２４時間インキュベートした。

【００８５】 ＥＬＩＳＰＯＴプレートのコーティングおよびブロッキングを、以下のように
行った。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ウェルあたり５０μｌの、滅菌炭酸緩衝液
（ｐＨ ９．６）中の１５μｇ／ｍＬのコーティング抗体を使用して、細胞をプ
レートする１日前にコートした。このコートしたプレートを、４℃で一晩インキ
ュベートし、その後、これらを、１００μＬ ＰＢＳで６回洗浄して、結合され
ないコーティングＡｂを除去し、次いで、穏やかにブロットした。各ウェルを、
２００μＬ ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳを使用して、組織培養インキュベーターに
おいて、１〜２時間、室温でブロックした。全てのブロッキング培地を、細胞を
プレートする直前に除去した。これらの細胞は、以下のようにプレートした。３
日後、細胞および上清を、各ウェルから収集し、そして１５ｍＬのコニカルチュ
ーブに移した。これらの細胞を、遠心分離でスピンダウンして上清を収集し、次
いで、この上清を、サイトカインＥＬＩＳＡ分析における使用まで−８０℃で保
存した。このペレット化された細胞を、２〜５ｍＬの培地中に再懸濁させ、次い
で、最終濃度１×１０⁷／ｍＬにした。この細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴウェルに１
×１０⁶／ウェルで添加した。

【００８６】 このＥＬＩＳＰＯＴプレートは、以下のように開発した。これらの細胞を、は
き飛ばして（ｆｌｉｃｋｅｄ ｏｕｔ）、プレートを、噴射ボトルを使用してＰ
ＢＳで２回洗浄した。このウェルを、ＤＩ水（この水をウェル中に数分間残して
、残存する細胞を溶解する）で洗浄し、そしてプレートを、さらに２回洗浄した
。検出抗体を、滅菌ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬに希釈し、次いで、５０μＬ／ウェ
ルに添加して、そして室温で２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳで
５回洗浄し、そして５０μＬのストレプトアビジンアルカリホスファターゼ結合
体（ＰＢＳ中、１：１０００希釈した）を用いて５回洗浄し、そしてプレートを
、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを、ＰＢＳで５回洗浄し
、そして５０μＬの色素生産性アルカリホスファターゼ基質を添加し、そしてプ
レートを、ダークスポットが現れるまで、室温でインキュベートした（約２時間
）。色の反応を、２００μＬのタップ水を用いで３回洗浄することによって停止
し、プレートを風乾させ、そしてスポットを、解剖顕微鏡（４０×）下で計数し
た。

【００８７】 （マウスペプチドをパルスしたＣＴＬアッセイ） 材料および試薬は、以下のとおりであった。ＲＰＭＩ−１０培地（Ｌ−グルタ
ミンおよびＨｅｐｅｓを含有する５００ｍｌ ＲＰＭＩ １６４０、５５ｍｌ熱
非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．５ｍｌ ゲンタマイシン、５．５ｍｌ 抗
生物質ａｎｔｉｍｙｃｏｌｉｃ溶液）；ＩＬ−２を含有しない感作培地（「ＳＭ
」）（５００ｍｌ ＲＰＭＩ−１０、５．０ｍｌの１００ｍＭ ピルビン酸Ｎａ
、５．０ｍｌ １００×可欠アミノ酸）；およびＩＬ−２含有ＳＭ（２０Ｕ／ｍ
ｌ 組換えラットＩＬ−２の最終濃度を含有するＳＭ）；ＣＴＬエピトープペプ
チド（１０^-2Ｍのストック濃度まで組織培養グレードのＤＭＳＯ中に溶解したペ
プチド）；ＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）；組換えラットＩＬ
−２（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ）；マイトマイシンＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ、５
００μｇ／ｍｌのストック濃度を得るために滅菌ＰＢＳに溶解する；５０ｍｌコ
ニカルチューブ（Ｆａｌｃｏｎ）、ナイロンメッシュ濾過カップ挿入物（Ｆａｌ
ｃｏｎ）；⁵¹クロムおよびＬｕｍａｐｌａｔｅ（Ｐａｃｋａｒｄ）。

【００８８】 ペプチドパルスしたスティミュレーターについては、未処理の同系の脾臓を、
脾臓を採取し、そして２つのオートクレーブした冷凍したスライドの間で押しつ
ぶすことによってすりつぶして、嚢をばらばらにし、そして細胞を小さなペトリ
皿に放出することにより提供する（約１．２×１０⁷スティミュレーター／マウ
ス）。細胞塊を３ｍｌのトランスファーピペットを用いて細胞を上下にピペッテ
ィングすることによりばらばらにし、そして得られた細胞懸濁液を、５〜１０ｍ
ｌのＲＰＭＩ−１０培地を用いて５０ｍｌのコニカルチューブに７０μｍナイロ
ン細胞濾過器を通過させて、細胞を洗浄する。回収した脾細胞を１５００ｒｐｍ
で５分間遠心分離して、ペレットにし、そして上清を廃棄する。ＲＢＣを、５ｍ
ｌのＡＣＫ溶解緩衝液中で１〜２分間脾細胞を再懸濁することにより溶解した。
その後、細胞を２０ｍｌの補充物なしのＲＰＭＩで２回、およびＲＰＭＩ−１０
で１回洗浄した。次いで、細胞を約１×１０⁷細胞／ｍｌで再懸濁した。Ｈｂｓ
Ａｇ ＣＴＬアッセイについては、Ｐ８１５細胞株を、ＨｂｓＡｇ配列で形質転
換し、そしてスティミュレーター細胞として用いた。スティミュレーターを、マ
イトマイシンＣ（１０ｍｌの細胞各々について、５００μＬの０．５ｍｇ／ｍｌ
のマイトマイシンＣを添加した）で処理し、そして細胞をマイトマイシンＣとと
もに３７℃、５％ＣＯ₂で２５〜４５分間インキュベートした。処理後、細胞を
補充物なしのＲＰＭＩで２回およびＲＰＭＩ−１０で１回洗浄した。洗浄した細
胞を、２０Ｕ／ｍｌのラットＩＬ−２を含有するＳＭ中で２×１０⁶細胞／ｍｌ
に再懸濁し、そしてストックＣＴＬエピトープペプチドを添加した。スティミュ
レーター細胞を３／１のレスポンダー／スティミュレーター比で２４ウェルプレ
ートに分配し、そして３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。

【００８９】 レスポンダー細胞のインビトロ刺激を、以下のように行った。脾臓をワクチン
接種したマウスおよびコントロールマウスから採取し、そしてレスポンダー脾細
胞を、上記のように脾臓をすりつぶすことにより単離した。ＲＢＣを、５ｍｌの
ＡＣＫ溶解緩衝液中で２〜３分間溶解し、細胞を２０ｍｌの補充物なしのＲＰＭ
Ｉで２回、およびＲＰＭＩ−１０で１回洗浄した。次いで、脾細胞を、ＩＬ−２
を含有しないＳＭ中で６×１０⁶細胞／ｍｌに再懸濁した。各マウスについて、
１ｍｌの脾細胞を、ＩＬ−２（ＩＬ−２の最終濃度は１０Ｕ／ｍｌであった）を
含有するＳＭ中の、２×１０⁶細胞／ｍｌのペプチドパルスした上記のスティミ
ュレーター細胞１ｍｌを含む２４ウェルプレートの各ウェルに分配し、そしてプ
レートを、３７℃、５％ＣＯ₂で５〜７日間インキュベートした。

【００９０】 （ＣＴＬ⁵¹クロム放出アッセイ） ペプチド特異的溶解については、以下の技術を使用した。対数増殖期の同系標
的細胞を９６ウェルプレートに約３０，０００標的/ウェルでプレートした。お
よその量の標的細胞を、コニカルチューブ中でペレットにし、そして２０μＬの
熱非働化ＦＢＣ中に再懸濁した。１００〜２００μｌの⁵¹Ｃｒ（クロム酸ナトリ
ウム）を各ペレットに添加し、十分に混合し、次いで、３７℃で1時間インキュ
ベートした。次いで、細胞を１ペレットあたり６〜１０ｍｌのＲＰＭＩ−１０で
４回洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ−１０中に３×１０⁵細胞/ｍｌで再懸濁した。ペ
プチドパルスした標的については、適切な量のストックＣｔｌエピトープペプチ
ドを、最終的な最適ペプチド濃度（約１０^-5Ｍ）に達するまで添加した。標的細
胞を、エフェクター細胞をプレートする前に、ペプチドで少なくとも３０分間（
３７℃で）パルスした。あるいは、ｐ８１５/ＨＢｓＡｇ細胞株を標的として使
用した。

【００９１】 インビトロ刺激の５〜７日後、エフェクター脾細胞を２４ウェルプレートから
採取し、そして各マウスからの細胞を１５ｍｌのコニカルチューブにプールし、
次いで、１．５×１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁した。プレートすることについては
、各マウスからの脾細胞を、５０、１７、５．６および１．９のエフェクター／
標的比でプレートした。希釈後、１００μｌの⁵¹Ｃｒ標識した標的を、各ウェル
に添加した。このプレートを、短時間遠心分離し、次いで、３７℃で４〜６時間
インキュベートした。溶解を、ペプチドパルスした標的およびパルスしていない
コントロール標的両方に対して各マウスについて測定した。

【００９２】 非特異的溶解については、１００μＬのパルスしていない標的もまたプレート
したことを除いて、同じプロトコルに従った。４〜６時間のインキュベーション
後に、プレートを遠心分離して細胞をペレットにし、そして溶解した。次いで、
４０μＬの上清を、各ウェル２００μＬのシンチレーション溶液を含有する９６
ウェルプレートに移し、そしてこのプレートを２時間または一晩乾燥させた。こ
のプレートをシールし、そして⁵¹Ｃｒ液体について標準プログラムを用いて計数
した。溶解％を計算するために、（試験ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）を、（最大ｃｐ
ｍ−自発的ｃｐｍ）で割り、そして１００を掛けた。特異的溶解％を得るために
、パルスしていない標的の溶解％を、ペプチドパルスした標的の溶解％から差し
引いた。

【００９３】 （ＥＬＩＳＡ） 種々のワクチン組成物に対する抗体応答を、標準的なＥＬＩＳＡ手順により決
定した。より具体的には、高親和性結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、８μｇ／
ｍＬの抗原ストック溶液（ＰＢＳ中）を用いて５０μＬ／ウェルでコーティング
し、そして４℃で一晩インキュベートした。抗原溶液を吸引し、そしてこのプレ
ートを２％ ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて少なくとも室温で１時間ブロッキングした
。このプレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０２５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３
回洗浄し、そして５０μＬのサンプル血清を添加し、そして室温で２時間インキ
ュベートした（希釈溶液：２％ＢＳＡ／ＰＢＳ）。このプレートを３回洗浄し、
そしてマウス免疫グロブリンＩｇＧに特異的な、またはＩｇＧサブクラスに特異
的な、結合体化標識ヤギ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。３回さ
らに洗浄した後、ＥＬＩＳＡプレートを、室温で１時間標識結合体とともにイン
キュベートした。最終的に、プレートを洗浄し、そして適切な基質（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡからのＨＲＰ、アルカリホスファターゼなどのキ
ット）で発色させ、そして３０分間発色させた。反応を、１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄または
０．４Ｍ ＮａＯＨで停止し、そして用いた標識に依存して、プレートをＡ₄₅₀
またはＡ₄₀₅で読み取った。平均バックグラウンド吸光度を、試験血清を除いて
全ての試薬を与えたウェルにより決定した。エンドポイント力価を、バックグラ
ウンド吸光度に対して５０％の吸光度読み取りを生じる最も高い希釈度として決
定した。

【００９４】 （実施例３：ハイブリッドＨＢｃＡｇ／Ｔ細胞エピトープＤＮＡワクチンを用
いた、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）特異的ＣＴＬの誘導） 発現ベクターｐＷＲＧ７０８６を、Ｂ型肝炎表面抗原（ＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴ
ＳＬ、Ｌｕｃａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３
７６４−６８）についてのマウスＨ２−ｄクラスＩ拘束最小ＣＴＬエピトープを
ＨＢｃＡｇのＩＣＥループ領域に挿入することにより構築した。ＨＢｃＡｇ／Ｃ
ＴＬエピトープ融合物を初期ＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡ領域を含む
発現カセットに挿入した。このベクターを、上記のように金粒子上にコーティン
グした。

【００９５】 ５匹のマウスに、４週間の間隔をあけて、２回ＤＮＡ免疫し（ＰｏｗｄｅｒＪ
ｅｃｔ ＸＲ遺伝子銃デバイスを介して）、各免疫は、ｐＷＲＧ７０８６または
ｐＷＲＧ７０３１（ポジティブコントロール）またはコントロールＤＮＡのいず
れか０．５μｇからなった。

【００９６】 脾細胞を、Ｐ８１５細胞株を用いた２回目の免疫の６ヵ月後に収集し、インビ
トロで再刺激し、そして上記の標準的⁵¹Ｃｒ放出アッセイを用いて細胞溶解活性
についてアッセイした。結果を以下の表２に報告する。認められるように、エピ
トープ特異的Ｔ細胞応答が、免疫ストラテジーにおいて誘導された。

【００９７】

【表２】 （実施例４：ハイブリッドＨＢｃＡｇ／抗原ＤＮＡワクチンを用いたＨＩＶ特
異的抗体応答の誘導） 発現ベクターｐＷＲＧ７０９４を、ＨＩＶ_SF33のエンベロープ遺伝子由来のＶ
３超可変性ループの免疫優性配列（ＲＲＩＴＳＧＰＧＫＶＬＹＴＴＧＥＩＩ）を
ＨＢｃＡｇのＩＣＥ領域に挿入することにより構築した。ＨＢｃＡｇ／ＨＩＶ_{SF 33} Ｂ細胞エピトープ融合物を、初期ＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡ領
域を含む発現カセットに挿入した。このベクターを、上記のように金粒子上にコ
ーティングした。

【００９８】 ４匹のマウスに、２〜４週間の間隔をあけて、３回ＤＮＡ免疫し（Ｐｏｗｄｅ
ｒＪｅｃｔ ＸＲ遺伝子銃デバイスを介して）、各免疫は、０．５μｇのｐＷＲ
Ｇ７０９４からなった。これらのマウスを、各免疫の２週間後に採血した。血清
抗ＨＩＶ ｇｐ１２０_SF33応答を、標準的ＥＬＩＳＡにおける捕捉抗原として、
組換えＨＩＶ ｇｐ１２０_SF33（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌ
ｌｅ，ＣＡ）を用いて評価した（付録ＩＩを参照のこと）。ｐＷＲＧ７０９４で
免疫した後の血清抗ＨＩＶ ｇｐ１２０_SF33応答（相互のエンドポイント力価）
を、以下の表３で報告する。認められるように、抗原特異的抗体応答は、本発明
のハイブリッドＨＢｃＡｇ／エピトープ分子を用いて誘導された。

【００９９】

【表３】 （実施例５） （ハイブリッドＨＢｃＡｇ／抗原ＤＮＡワクチンを使用する、マラリア特異的
抗体応答の誘導） 発現ベクターｐＷＲＧ７１０８を、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ（
ＤＰＰＰＰＮＰＮＤＰＰＰＰＮＰＮ）のｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（Ｃ
Ｓ）遺伝子由来の２つのタンデムコピーのイムノドミナントＢ細胞エピトープを
、ＨＢｃＡｇのＩＣＥ領域に挿入することによって構築した。ＨＢｃＡｇ／ｂｅ
ｒｇｈｅｉエピトープ融合物を、初期ＣＭＶプロモーターおよびイントロンＡ領
域を含む発現カセット中に挿入した。このベクターを、上記のように金粒子上に
コーティングした。

【０１００】 ４匹のマウスは、（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ遺伝子銃デバイスを通して）
３つのＤＮＡ免疫を受けた（各々の免疫は、０．５μｇ ｐＷＲＧ７１１０から
なり、２〜４週間間隔を空けた）。マウスを、各免疫の後に２週間飼育した。血
清の抗Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ応答を、上記の標準的なＥＬＩＳＡにおいて、精製し
たＰ．ｂｅｒｇｈｅｉ ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（１ウェルあたり１０００）を補
足抗原として使用して、評価した。

【０１０１】 これらのマウスにおける抗体応答を、全長Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ ＣＳ遺伝子（
ｐＷＲＧ６５１８）を発現するＤＮＡで免疫したマウスにおいて誘導された抗体
応答と比較した。

【０１０２】 これらの結果は、以下の表４において報告される。理解され得るように、本発
明のハイブリッドＨＢｃ／Ａｇ抗原構築物は、全長Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ遺伝子内
のその天然の状況において、エピトープをコードするＤＮＡで免疫するより高い
力価の抗体応答を誘導する。

【０１０３】

【表４】 （実施例６） （ハイブリッドＨＢｃＡｇ／抗原ＤＮＡワクチンを使用する、ＦＭＤＶ特異的
中和抗体応答の誘導） ２つの発現ベクターを構築した。発現ベクターｐＷＲＧ７１５９を、口蹄疫ウ
イルス（ＦＭＤＶ）由来のエンベロープ遺伝子１コピーの中和エピトープ（ＧＳ
ＧＶＲＧＤＦＧＳＬＡＰＲＶＡＲＱＬＰ）を、ＨＢｃＡｇのＩＣＥおよびカルボ
キシル領域の各々に挿入することによって構築した。発現ベクターｐＷＲＧ７１
６５は、ＨＢｃＡｇのＩＣＥ領域に挿入された、１コピーの中和エピトープを含
む。ベクターを、上記のように、別々のロットの金粒子上にコーティングした。

【０１０４】 ８匹のマウスは、（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ遺伝子銃デバイスを通して）
３つのＤＮＡ免疫を受けた（各々の免疫は、０．５μｇまたはｐＷＲＧ７１５９
ＤＮＡもしくはｐＷＲＧ７１６５ ＤＮＡのいずれかからなり、ここでこの免
疫を、２〜４週間間隔を空けた。マウスを、各免疫の後に２週間飼育し、そして
血清を、補足抗原としてＩＤＲを表すペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡによって
ＦＭＤＶ特異的抗体についてアッセイした。血清抗体をまた、ウイルス中和アッ
セイ（Ｆ．Ｂｒｏｗｎ、Ｐｌｕｍ Ｉｓｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）におい
て、ＦＭＤＶを中和する能力について試験した。

【０１０５】 結果を、以下の表５に報告する。理解され得るように、本発明のハイブリッド
ＤＮＡ構築物は、目的の抗原に対して中和抗体応答を誘導し得る。

【０１０６】

【表５】 （実施例７） （ハイブリッドＨＢｃＡｇ／抗原ＤＮＡワクチンを使用する免疫研究） 本発明のハイブリッドＨＢｃＡｇ分子を使用するＤＮＡ免疫の優位性を実証す
るために、以下の研究を行う。本研究は、ＨＢｃＡｇ／エピトープ融合物をコー
ドするＤＮＡの投与が既存の方法論に対する利点を提供することを確認する。詳
細には、ＨＢｃＡｇ／エピトープＤＮＡ免疫は、以下：（１）エピトープのＤＮ
Ａベースの免疫の免疫原性を増強し；そして（２）その天然のコンホメーション
において、宿主細胞における融合産物の発現を提供し、そしてさらに、細胞内発
現を通して、ＣＤ⁸⁺およびＣＤ⁴⁺の両方の免疫応答の優れた誘導のために、クラ
スＩ経路およびクラスＩＩ経路の両方へのアクセスを提供する。

【０１０７】 ＨＩＶ_LAIｇｐ１２０のマウスＨ２−ｄ−クラスＩ制限最小ＣＴＬエピトープ
（ＲＧＰＧＲＡＦＶＴ１、Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｔ．ら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１５４：１９７３〜８６）を含む以下のワクチンを構築し、そしてマ
ウスにおけるエピトープ特異的ＣＴＬ応答の誘導について比較する。

【０１０８】 （ａ）従来のプラスミドにコードされるＨＩＶｇｐ１２０ ＣＴＬエピトープ
：ＣＭＶ−イントロンＡ−ＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩ（Ｒ＞Ｉ）−ｐａｌ。

【０１０９】 （ｂ）ＨＢｃＡｇに対する融合物としてコードされるＨＩＶｇｐ１２０ ＣＴ
Ｌエピトープ：ＣＭＶ−イントロンＡ−ＨＢｃＡｇ／Ｒ＞Ｉ−ｐａｌ。

【０１１０】 （ｃ）哺乳動物細胞において発現され、そして組換えタンパク質として精製さ
れる、ＨＢｃＡｇに対する融合物としてコードされるＨＩＶｇｐ１２０ ＣＴＬ
エピトープ（ｒＨＢｃＡｇ／Ｒ＞Ｉ）。

【０１１１】 （ｄ）従来のプラスミドＣＭＶ−イントロンＡ−ＨＩＶｇｐ１２０−ｐａｌに
おいて発現されるＨＩＶｇｐ１２０遺伝子全体。

【０１１２】 ワクチン調製物： 群（ａ）および（ｂ）についての発現ベクターを、以前に確立された方法によ
って構築する。（ａ）からの発現ベクターを、Ｂａｌｂ／Ｃ細胞株または酵母に
おいて発現させ、そして先に記載されるように精製する。群（ｄ）についての発
現ベクターを、構築した（Ｆｕｌｌｅｒら（１９９４）ＡＩＤＳ Ｒｅｓ．ａｎ
ｄ Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）。

【０１１３】 免疫： マウスを、少なくとも２回、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ ＸＲ遺伝子銃デバイスを
用いて、０．５ｍｇの金ビーズ上の０．５μｇのＤＮＡで免疫するか、あるいは
４週間間隔を空けて、１用量あたりＰＢＳ中の１〜５μｇのＨＢｃＡｇ／Ｒ＞Ｉ
タンパク質を２用量注射する。

【０１１４】 アッセイ： 脾細胞および血液を、第１または第２の免疫の２週間後に、２セットのマウス
から回収した。ＣＤ⁸⁺Ｔ細胞応答の頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴ分析（上記を参照の
こと）によって、そして⁵¹Ｃｒ放出アッセイ（上記を参照のこと）によって比較
する。

【０１１５】 ＨＢｃＡｇおよびＨＩＶｇｐ１２０に対する抗体応答を、首尾のよい免疫を確
認するために測定する。

【０１１６】 従って、新規な組換え核酸分子、これらの分子を含む組成物、および核酸免疫
技術が、記載されている。本発明の好ましい実施形態がいくらか詳細に記載され
ているが、自明なバリエーションが、添付の特許請求の範囲によって定義される
ような、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明に従って構築されたプラスミドベクターの主要な成分を同定す
るプラスミド地図を示す。四角は、出現する順番に、ＣＭＶプロモーター；イン
トロンＡ；ＴＰＡシグナルペプチド；Ｎ−末端コア；エピトープインサート；お
よびＣ−末端コアである。

【図２】 図２Ａおよび図２Ｂは、実施例２において実行されたアッセイの結果を示し、
そしてＳＩＶ感染したサルおよび３匹のＤＮＡ−ワクチン投与したサルにおける
エピトープ特異的なＣＤ８＋Ｔリンパ球の誘導を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、
サル９５０５８およびサル９５０４５については各５回のＤＮＡ接種の後に測定
し、そしてサル９６０３１については各３回のＤＮＡ接種の後に測定した。ＰＢ
ＭＣを、インビトロで２週間刺激し、次いで四量体複合体（パネルＡ）を用いて
染色するか、または標準的な⁵¹Ｃｒ放出アッセイ（パネルＢ）において試験した
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フレア， ジェームズ ティー． アメリカ合衆国 ウエスト インディア 53711， マディソン， サイエンス ド ライブ 585 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA33 CA04 CA07 FA02 HA17 4C076 BB11 CC31 CC34 CC35 EE59 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB322 ZB332 ZB352 ZB372 4C086 AA01 AA02 EA16 MA02 MA05 NA14 ZB32 ZB33 ZB35 ZB37 4C087 AA01 AA02 BC83 MA01 NA03 ZB32 ZB33 ZB35 ZB37

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーター配列および該プロモーター配列に作動可能に連
   結された組換え核酸配列を含む発現ベクターの使用であって、該使用は核酸免疫
   における使用のための医薬の製造においてであり、該組換え配列は以下： Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第１の核酸配列であって、該抗原は主
   イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）領域を含むか、または該抗原から該
   ＩＣＥ領域のうちのすべてまたは一部が除去されている、核酸配列；ならびに 目的の抗原由来のＴ細胞エピトープをコードする異種の第２の核酸配列であっ
   て、該第２の核酸配列は、該第１の核酸配列のＩＣＥ領域に挿入されているか、
   または除去された該第１の核酸配列の該ＩＣＥ領域またはその一部を置換してい
   る、核酸配列 を含む、使用。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の使用であって、前記組換え核酸配列がさら
   に第３の核酸配列を含み、該第３の核酸配列は前記第１の配列および前記第２の
   配列と比較して５’上流の位置にあり、そして該第１の配列および該第２の配列
   によりコードされるポリペプチドの哺乳動物細胞からの分泌を提供する、ペプチ
   ドリーダー配列をコードする、使用。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の使用であって、前記目的の抗原が
   、ウイルス病原体の抗原、細菌病原体の抗原、寄生生物病原体の抗原または真菌
   病原体の抗原である、使用。
4. 【請求項４】 請求項１または２に記載の使用であって、前記第２の核酸配
   列が前記Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレオチドから本質的になる、使用。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の使用であって、
   前記Ｔ細胞エピトープが細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープである、使
   用。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の使用であって、
   前記第１の核酸配列がＢ型肝炎ウイルスコア抗原をコードし、該Ｂ型肝炎ウイル
   スコア抗原からＣ末端アルギニンリッチ領域が除去されている、使用。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の使用であって、
   前記組換え核酸配列がＤＮＡ配列である、使用。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の使用であって、
   前記発現ベクターがキャリア粒子上にコートされている、使用。
9. 【請求項９】 粒子媒介性核酸免疫における使用に適切なコートされた粒子
   であって、該粒子が請求項１〜７のうちのいずれか１項において規定されるよう
   な発現ベクターを用いてコートされたキャリア粒子を含む、粒子。
10. 【請求項１０】 粒子媒介性核酸免疫に適切な粒子加速デバイスであって、
    該デバイスは、請求項９において規定されるようなコートされた粒子を搭載され
    ている、デバイス。
11. 【請求項１１】 プロモーター配列および該プロモーター配列に作動可能に
    連結された組換え核酸配列を含む発現ベクターであって、該組換え配列は以下： Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第１の核酸配列であって、該抗原は主
    イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）領域を含むか、または該抗原から該
    ＩＣＥ領域のうちのすべてまたは一部が除去されている、核酸配列；ならびに 目的の抗原由来のＴ細胞エピトープをコードする異種の第２の核酸配列であっ
    て、該第２の核酸配列は、該第１の核酸配列のＩＣＥ領域に挿入されているか、
    または除去された該第１の核酸配列の該ＩＣＥ領域またはその一部を置換してい
    る、核酸配列、 を含み、その使用が治療によるヒトまたは動物の身体の処置の方法における、発
    現ベクター。
12. 【請求項１２】 核酸免疫における使用のための、請求項１１に記載の発現
    ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項１１または１２に記載の発現ベクターであって、第
    ３の核酸配列をさらに含み、該第３の核酸配列は前記第１の配列および前記第２
    の配列と比較して５’上流の位置にあり、そして該第１の配列および該第２の配
    列によりコードされるポリペプチドの哺乳動物細胞からの分泌を提供するペプチ
    ドリーダー配列をコードする、発現ベクター。
14. 【請求項１４】 請求項１１〜１３のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記目的の抗原が、ウイルス病原体の抗原、細菌病原体の抗原、
    寄生生物病原体の抗原または真菌病原体の抗原である、発現ベクター。
15. 【請求項１５】 請求項１１〜１４のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記第２の核酸配列が前記Ｔ細胞エピトープをコードするヌクレ
    オチドから本質的になる、発現ベクター。
16. 【請求項１６】 請求項１１〜１５のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記Ｔ細胞エピトープが細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピト
    ープである、発現ベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１１〜１６のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記第１の核酸配列がＢ型肝炎ウイルスコア抗原をコードし、該
    Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原からＣ末端アルギニンリッチ領域が除去されている、
    発現ベクター。
18. 【請求項１８】 請求項１１〜１７のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記組換え核酸配列がＤＮＡ配列である、発現ベクター。
19. 【請求項１９】 プロモーター配列および該プロモーター配列に作動可能に
    連結された組換え核酸配列を含む発現ベクターであって、該組換え配列は以下： Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第１の核酸配列であって、該抗原は主
    イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）領域を含むか、または該抗原から該
    ＩＣＥ領域のうちのすべてまたは一部が除去されている、核酸配列；ならびに 目的の抗原由来の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする異
    種の第２の核酸配列であって、該第２の核酸配列は、該第１の核酸配列のＩＣＥ
    領域に挿入されているか、または除去された該第１の核酸配列の該ＩＣＥ領域ま
    たはその一部を置換している、核酸配列、 を含む、発現ベクター。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の発現ベクターであって、第３の核酸配
    列をさらに含み、該第３の核酸配列は前記第１の配列および前記第２の配列と比
    較して５’上流の位置にあり、そして該第１の配列および該第２の配列によりコ
    ードされるポリペプチドの哺乳動物細胞からの分泌を提供するペプチドリーダー
    配列をコードする、発現ベクター。
21. 【請求項２１】 請求項１９または２０に記載の発現ベクターであって、前
    記目的の抗原が、ウイルス病原体の抗原、細菌病原体の抗原、寄生生物病原体の
    抗原または真菌病原体の抗原である、発現ベクター。
22. 【請求項２２】 請求項１９〜２１のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記第２の核酸配列が前記細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピ
    トープをコードするヌクレオチドから本質的になる、発現ベクター。
23. 【請求項２３】 請求項１９〜２２のうちのいずれか１項に記載の発現ベク
    ターであって、前記組換え核酸配列がＤＮＡ配列である、発現ベクター。
24. 【請求項２４】 組換え核酸分子であって、以下： Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原をコードする第１の核酸配列であって、該抗原は主
    イムノドミナントコアエピトープ（ＩＣＥ）領域を含むか、または該抗原から該
    ＩＣＥ領域のうちのすべてまたは一部が除去されている、核酸配列；ならびに 目的の抗原由来の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープをコードする異
    種の第２の核酸配列であって、該第２の核酸配列は、該第１の核酸配列のＩＣＥ
    領域に挿入されているか、または除去された該第１の核酸配列の該ＩＣＥ領域ま
    たはその一部を置換している、核酸配列、 を含む、組換え核酸分子。
25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の組換え核酸分子であって、第３の核酸
    配列をさらに含み、該第３の核酸配列は前記第１の配列および前記第２の配列と
    比較して５’上流の位置にあり、そして該第１の配列および該第２の配列により
    コードされるポリペプチドの哺乳動物細胞からの分泌を提供するペプチドリーダ
    ー配列をコードする、核酸分子。
26. 【請求項２６】 請求項２４または２５に記載の組換え核酸分子であって、
    前記目的の抗原が、ウイルス病原体の抗原、細菌病原体の抗原、寄生生物病原体
    の抗原または真菌病原体の抗原である、核酸分子。
27. 【請求項２７】 請求項２４〜２６のうちのいずれか１項に記載の組換え核
    酸分子であって、前記第２の核酸配列が細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピト
    ープをコードするヌクレオチドから本質的になる、核酸分子。
28. 【請求項２８】 ＤＮＡ分子である、請求項２４〜２７のうちのいずれか１
    項に記載の組換え核酸分子。
29. 【請求項２９】 核酸免疫の方法であって、該方法は、免疫の必要がある被
    験体に、請求項１〜７のうちのいずれか１項において規定される発現ベクターを
    投与する工程を包含する、方法。
30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法であって、前記ベクターでコート
    された粒子を粒子加速デバイスにより前記被験体に送達する、方法。
31. 【請求項３１】 被験体において細胞性免疫応答を惹起する方法であって、
    該方法は、以下： （ａ）該被験体の細胞を、Ｂ型肝炎コア抗原キャリア成分および少なくとも１
    つの目的の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む標的抗原成分を有
    するハイブリッド分子をコードする組換え核酸分子を用いてトランスフェクトす
    る工程であって、該トランスフェクトする工程を、該被験体内で該ハイブリッド
    分子の発現が可能な条件下で実行する、工程；および （ｂ）該被験体に二次組成物を投与する工程であって、該二次組成物は該標的
    抗原由来の該少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含み、そして工程（ａ）およ
    び（ｂ）の組み合わせが該標的抗原に対する細胞性応答を惹起するに十分である
    、工程、 を包含する、方法。
32. 【請求項３２】 請求項３０に記載の方法であって、前記ハイブリッド分子
    は、Ｂ型肝炎コア抗原キャリア成分中の主イムノドミナントコアエピトープ（Ｉ
    ＣＥ）領域内に挿入された、少なくとも１つの目的の細胞溶解性Ｔリンパ球（Ｃ
    ＴＬ）エピトープを含む、方法。
33. 【請求項３３】 請求項３１または３２に記載の方法であって、前記組換え
    核酸分子は、Ｂ型肝炎コア抗原キャリア成分、少なくとも１つの目的の細胞溶解
    性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む標的抗原成分、および哺乳動物細胞由
    来の付属されたペプチド配列の分泌を提供するペプチドリーダー配列を有するハ
    イブリッド分子をコードする、方法。
34. 【請求項３４】 請求項３１〜３３のうちのいずれか１項に記載の方法であ
    って、前記二次組成物が組換えウイルスベクターを含み、該組換えウイルスベク
    ターは、前記標的抗原由来の前記少なくとも１つのＣＴＬエピトープをコードす
    る核酸配列を含む、方法。
35. 【請求項３５】 請求項３１〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法であ
    って、前記組換えウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターである、方法
    。
36. 【請求項３６】 請求項３１〜３５のうちのいずれか１項に記載の方法であ
    って、前記トランスフェクトする工程を、粒子媒介性トランスフェクション技術
    を使用してインビボにて実行する、方法。
37. 【請求項３７】 請求項３１〜３６のうちのいずれか１項に記載の方法であ
    って、前記トランスフェクトする工程を、エキソビボにて実行してトランスフェ
    クトされた細胞を得、続いて該トランスフェクトされた細胞を工程（ｂ）の前に
    前記被験体に導入する、方法。
38. 【請求項３８】 請求項３１〜３７のうちのいずれか１項に記載の方法であ
    って、前記被験体がヒトである、方法。