JP2002521034A - 三重らせん形成による核酸検出方法 - Google Patents
三重らせん形成による核酸検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
サンプル中の標的核酸配列の検出方法が開示される。本方法は、（ａ）増幅反応生成物がプリン富裕領域を含むように前記標的核酸を増幅し、（ｂ）前記標的核酸の少なくとも一部分と結合することができるペプチド核酸と前記サンプルを接触させ、さらに（ｃ）三重複合体ＤＮＡ構造物の存在を検出することを含む。本検出は、適切には、例えば表面プラズモン共鳴検出装置を用いて直接実施される。
Description
【０００１】 本発明は、特異的な標的ＤＮＡ配列を検出する方法、および特に増幅反応生成
物、並びに前記方法で使用する試薬および装置に関する。 サンプル中の特定の標的ＤＮＡ配列の有無を検出する多くの方法が知られてい
る。これらの方法のうち相当な割合のものが、ＤＮＡを一本鎖形に変性させ、続
いてこの配列をハイブリダイズさせるか、そうでなければ配列特異的標識プロー
ブと結合させることを必要とする。 標的配列は、検出可能レベルまで標的配列の量を増加させるためにしばしば増
幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応に付される。 他の配列検出方法は増幅反応時に配列に取り込まれる挿入染料の使用を含む。
しかしながら、そのような方法は、非特異的増幅反応の結果であるとしても染料
が任意の増幅生成物に挿入されるので比較的非特異的である。
物、並びに前記方法で使用する試薬および装置に関する。 サンプル中の特定の標的ＤＮＡ配列の有無を検出する多くの方法が知られてい
る。これらの方法のうち相当な割合のものが、ＤＮＡを一本鎖形に変性させ、続
いてこの配列をハイブリダイズさせるか、そうでなければ配列特異的標識プロー
ブと結合させることを必要とする。 標的配列は、検出可能レベルまで標的配列の量を増加させるためにしばしば増
幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応またはリガーゼ連鎖反応に付される。 他の配列検出方法は増幅反応時に配列に取り込まれる挿入染料の使用を含む。
しかしながら、そのような方法は、非特異的増幅反応の結果であるとしても染料
が任意の増幅生成物に挿入されるので比較的非特異的である。
【０００２】 他のアッセイ（例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ）は、レポーターお
よびクェンチャー部分を含む複雑なプローブを増幅反応工程で利用する。これら
のプローブは、増幅反応時に一本鎖標的配列とハイブリダイズし、続いて反応を
起こしている酵素によって消化される。プローブのクェンチャーとレポーター分
子との間の関係によってモニター可能なシグナルが発生する。この場合に用いら
れるプローブはしかしながら複雑で高価である。 ペプチド核酸はＤＮＡ鎖のプリン富裕部位に侵入して三重複合体（トリプレッ
クス）構造物を形成することが知られている（P.E. Nielson et al., Science 2
54:1497-1506(1991); D.Y. Turney, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1667-167
0(1993))。この現象をもたらすメカニズムは、以下の図１に模式的に示されてい
る。
よびクェンチャー部分を含む複雑なプローブを増幅反応工程で利用する。これら
のプローブは、増幅反応時に一本鎖標的配列とハイブリダイズし、続いて反応を
起こしている酵素によって消化される。プローブのクェンチャーとレポーター分
子との間の関係によってモニター可能なシグナルが発生する。この場合に用いら
れるプローブはしかしながら複雑で高価である。 ペプチド核酸はＤＮＡ鎖のプリン富裕部位に侵入して三重複合体（トリプレッ
クス）構造物を形成することが知られている（P.E. Nielson et al., Science 2
54:1497-1506(1991); D.Y. Turney, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1667-167
0(1993))。この現象をもたらすメカニズムは、以下の図１に模式的に示されてい
る。
【０００３】 出願人らは、この現象を標的ＤＮＡ配列の検出に用いることができることを見
いだした。 サンプル中の標的核酸配列の存在を検出する方法は以下の工程を含む： （ａ）前記標的核酸をその増幅反応生成物がプリン富裕領域を含むように増幅
させ、 （ｂ）前記標的配列の少なくとも一部分と結合することができるペプチド核酸
とサンプルを接触させ、 （ｃ）三重複合体ＤＮＡ構造物の存在を検出する。 通常の変性工程なしに標的配列（例えば増幅生成物）の直接的検出を可能にす
る本方法は、核酸プローブとの二重複合体（デュープレックス）形成を必要とす
る。
いだした。 サンプル中の標的核酸配列の存在を検出する方法は以下の工程を含む： （ａ）前記標的核酸をその増幅反応生成物がプリン富裕領域を含むように増幅
させ、 （ｂ）前記標的配列の少なくとも一部分と結合することができるペプチド核酸
とサンプルを接触させ、 （ｃ）三重複合体ＤＮＡ構造物の存在を検出する。 通常の変性工程なしに標的配列（例えば増幅生成物）の直接的検出を可能にす
る本方法は、核酸プローブとの二重複合体（デュープレックス）形成を必要とす
る。
【０００４】 "プリン富裕領域"という表現は、当該配列がペプチド核酸（ＰＮＡ）の鎖内侵
入に適していることを意味する。そのような領域は、適切には少なくとも４つの
連続したプリン残基を含む。 上記の工程（ａ）の反応は、適切には緩衝液の存在下で実施されるが、この緩
衝液は好ましくは低塩緩衝液で、例えば５０ｍＭまたはそれ未満の塩を含む。な
ぜならばこれはＤＮＡ：ＤＮＡ二重複合体よりも三重複合体形成に有利であるか
らである。さらにまた、使用される緩衝液のｐＨは、用いられるＰＮＡの正確な
性質に依存するであろう。二重複合体ＤＮＡ上でＧの鎖に侵入するためＰＮＡ中
のＣが用いられる場合は、緩衝液のｐＨは慎重に考慮されねばならない。なぜな
らば、フーグスティーン塩基対形成に必要なＣはプロトンが付加されねばならず
、これには低ｐＨ（例えば４．５未満）の緩衝液が要求されるからである。
入に適していることを意味する。そのような領域は、適切には少なくとも４つの
連続したプリン残基を含む。 上記の工程（ａ）の反応は、適切には緩衝液の存在下で実施されるが、この緩
衝液は好ましくは低塩緩衝液で、例えば５０ｍＭまたはそれ未満の塩を含む。な
ぜならばこれはＤＮＡ：ＤＮＡ二重複合体よりも三重複合体形成に有利であるか
らである。さらにまた、使用される緩衝液のｐＨは、用いられるＰＮＡの正確な
性質に依存するであろう。二重複合体ＤＮＡ上でＧの鎖に侵入するためＰＮＡ中
のＣが用いられる場合は、緩衝液のｐＨは慎重に考慮されねばならない。なぜな
らば、フーグスティーン塩基対形成に必要なＣはプロトンが付加されねばならず
、これには低ｐＨ（例えば４．５未満）の緩衝液が要求されるからである。
【０００５】 本発明の方法で使用されるペプチド核酸は一本鎖でも、またはビス−ＰＮＡで
もよい。好ましくは本方法で用いられるペプチド核酸はビス−ＰＮＡである。な
ぜならば、これは、より速い鎖内侵入プロセスおよびより安定な三重複合体生成
物を生じるからである。 ビス−ＰＮＡは、親水性リンカーによって結合した２つのアンチパラレル鎖で
構成されている。一方の鎖は、標的配列内でのＤＮＡのワトソン＝クリック認識
のためにデザインされ、他方の鎖は、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重複合体のフーグスティ
ーン認識のためにデザインされる。そのような酸はＰＮＡ2ＤＮＡ三重複合体の
安定性のために最適で、したがって二本鎖ＤＮＡとの鎖置換結合を強化するであ
ろう。
もよい。好ましくは本方法で用いられるペプチド核酸はビス−ＰＮＡである。な
ぜならば、これは、より速い鎖内侵入プロセスおよびより安定な三重複合体生成
物を生じるからである。 ビス−ＰＮＡは、親水性リンカーによって結合した２つのアンチパラレル鎖で
構成されている。一方の鎖は、標的配列内でのＤＮＡのワトソン＝クリック認識
のためにデザインされ、他方の鎖は、ＰＮＡ−ＤＮＡ二重複合体のフーグスティ
ーン認識のためにデザインされる。そのような酸はＰＮＡ2ＤＮＡ三重複合体の
安定性のために最適で、したがって二本鎖ＤＮＡとの鎖置換結合を強化するであ
ろう。
【０００６】 使用されるペプチド核酸は適切にはポリ−Ｔまたはポリ−Ｃ配列を含むであろ
う。 標的核酸は先ず最初に増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）また
はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、好ましくはＰＣＲに付される。生成物は、増幅
反応中または反応後にペプチド核酸に暴露されるが、好ましくは増幅反応の完了
後にペプチド核酸に暴露される。
う。 標的核酸は先ず最初に増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）また
はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、好ましくはＰＣＲに付される。生成物は、増幅
反応中または反応後にペプチド核酸に暴露されるが、好ましくは増幅反応の完了
後にペプチド核酸に暴露される。
【０００７】 標的ヌクレオチド配列がプリン富裕領域を含むか、またはプリン富裕領域を含
むように選択された場合は、本方法はすぐに実施することができる。そのような
領域が標的配列に存在しない場合は、そのような領域は増幅反応時に導入するこ
とができる。このような場合には、増幅は、複数のピリミジンを、適切にはその
５'末端に含む１つまたは２つ以上のプライマーを用いて実施されるであろう。
この領域は、増幅の伸長段階で連鎖伸長されるであろう（以下の図２で説明する
とおり）。これらのプライマーを用いて得られた増幅物の両方の増幅鎖の３'末
端は今やプリン富裕部位を含む。実際のところ、（上記のようにしてタグを付加
された）ＰＣＲ生成物をクローニングして配列を決定し、その３'末端にポリプ
リン連続物が取り込まれていることが分かった。これによって、適切なＰＮＡ結
合プリン富裕領域は増幅生成物内に含まれることが確認される。
むように選択された場合は、本方法はすぐに実施することができる。そのような
領域が標的配列に存在しない場合は、そのような領域は増幅反応時に導入するこ
とができる。このような場合には、増幅は、複数のピリミジンを、適切にはその
５'末端に含む１つまたは２つ以上のプライマーを用いて実施されるであろう。
この領域は、増幅の伸長段階で連鎖伸長されるであろう（以下の図２で説明する
とおり）。これらのプライマーを用いて得られた増幅物の両方の増幅鎖の３'末
端は今やプリン富裕部位を含む。実際のところ、（上記のようにしてタグを付加
された）ＰＣＲ生成物をクローニングして配列を決定し、その３'末端にポリプ
リン連続物が取り込まれていることが分かった。これによって、適切なＰＮＡ結
合プリン富裕領域は増幅生成物内に含まれることが確認される。
【０００８】 この種のプライマーは本発明の別の特徴を構成する。 形成された三重複合体は工程（ｂ）で多様な方法を用いて検出できる。例えば
、ゲル遅滞法を用いることができる。生成物をゲル電気泳動（例えば非変性ポリ
アクリルアミドゲル）に付し、続いて通常の試薬（例えば臭化エチジウム）を用
いて染色した場合、三重複合体分画の遅滞を観察できる。 本方法はしかしながら相対的に速度が遅い。さらにまた、三重複合体形ではな
い類似の配列との比較がスタンダードとして要求される。
、ゲル遅滞法を用いることができる。生成物をゲル電気泳動（例えば非変性ポリ
アクリルアミドゲル）に付し、続いて通常の試薬（例えば臭化エチジウム）を用
いて染色した場合、三重複合体分画の遅滞を観察できる。 本方法はしかしながら相対的に速度が遅い。さらにまた、三重複合体形ではな
い類似の配列との比較がスタンダードとして要求される。
【０００９】 したがって、好ましくは検出は捕捉アッセイを用いて実施される。この場合の
捕捉薬剤は、適切には支持体に固定されたＰＮＡ配列である。続いてサンプルを
支持体と接触させる。存在する一切の標的配列はこの支持体表面のＰＮＡと結合
し、既知の技術のいずれかを用いて検出することができる。 特に好ましい実施態様では、支持体は無限小波検出を用いて作動される検出装
置の導波管である。そのような装置の例は表面プラズモン共鳴検出装置である。
これはサンプル内の標的ヌクレオチド配列の直接的で迅速な検出を可能にする。 したがって、増幅反応生成物は、簡単にそのような検出装置の導波管上を簡単
に流れることが可能で、アンプリコンの存在は、"リアルタイム"に近いものとし
て検出できる。
捕捉薬剤は、適切には支持体に固定されたＰＮＡ配列である。続いてサンプルを
支持体と接触させる。存在する一切の標的配列はこの支持体表面のＰＮＡと結合
し、既知の技術のいずれかを用いて検出することができる。 特に好ましい実施態様では、支持体は無限小波検出を用いて作動される検出装
置の導波管である。そのような装置の例は表面プラズモン共鳴検出装置である。
これはサンプル内の標的ヌクレオチド配列の直接的で迅速な検出を可能にする。 したがって、増幅反応生成物は、簡単にそのような検出装置の導波管上を簡単
に流れることが可能で、アンプリコンの存在は、"リアルタイム"に近いものとし
て検出できる。
【００１０】 本発明のまた別の特徴では、本発明の方法で使用するキットが提供される。こ
れらのキットは、標的ＤＮＡと三重複合体を形成するようにデザインしたＰＮＡ
を含む。場合によってはまた、前記キットは、標的ＤＮＡの増幅で用いることが
できるプライマー、特に５'にピリミジンタグが付加されたプライマーを含むで
あろう。 このキットはまた、無限小波検出装置の導波管、および特にその上に保持され
た表面プラズモン共鳴検出装置、標的ＤＮＡ配列と特異的に結合するペプチド核
酸を含むであろう。
れらのキットは、標的ＤＮＡと三重複合体を形成するようにデザインしたＰＮＡ
を含む。場合によってはまた、前記キットは、標的ＤＮＡの増幅で用いることが
できるプライマー、特に５'にピリミジンタグが付加されたプライマーを含むで
あろう。 このキットはまた、無限小波検出装置の導波管、および特にその上に保持され
た表面プラズモン共鳴検出装置、標的ＤＮＡ配列と特異的に結合するペプチド核
酸を含むであろう。
【００１１】実施例 これから本発明を添付の図表を参考に実施例によって説明しよう。 実施例１：三重複合体形成 ＰＣＲ生成物と三重複合体構造物を形成するＰＮＡの能力はゲル遅滞実験を用
いて示された。２つのＰＣＲ生成物を実験のために選んだ。１つはＰＮＡプロー
ブと三重複合体を形成することができる配列、すなわちポリ−Ａ部位を有する。 ＰＣＲ８２ ５'ＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＴＡＡＡ
ＡＴＴＧＴＡＴＡＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴ
ＡＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴ３'（配列番号：１） 他方はポリ−Ａ部位を含まず、陰性コントロールとして機能する。 ＰＣＲ１７５ ５'ＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴ
ＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＧＧＡＧＴＴＡ
ＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴ
ＣＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＡＡＣＴＴ
ＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣ
ＡＣＧＴＧＡＡＡ３'（配列番号：２） ２つのタイプのＰＮＡプローブを用いた。１つは直鎖状配列でポリ−Ｔ配列を
含んでいる。 ＰＮＡ０５７ Ｎ ＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴ Ｃ（配列番号：３） 他方は同じ直鎖状配列のビス−ＰＮＡであるが、親水性リンカーによって結合
した２つのアンチパラレル鎖で構成されている。一方の鎖はＤＮＡのワトソン＝
クリック認識のためにデゼインされており、他方の鎖はＰＮＡ−ＤＮＡ二重複合
体のフーグスティーン認識のためにデザインされており、ＰＮＡ2ＤＮＡ三重複
合体の安定性のために最適で、したがって二本鎖ＤＮＡとの鎖置換結合を強化す
るはずである。 ＰＮＡ０５８ Ｎ ＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴ ＬＬＬ ＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴ Ｃ（配列番号：４）
いて示された。２つのＰＣＲ生成物を実験のために選んだ。１つはＰＮＡプロー
ブと三重複合体を形成することができる配列、すなわちポリ−Ａ部位を有する。 ＰＣＲ８２ ５'ＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＧＴＣＡＴＡＡＡ
ＡＴＴＧＴＡＴＡＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＡＣＣＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴ
ＡＡＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴ３'（配列番号：１） 他方はポリ−Ａ部位を含まず、陰性コントロールとして機能する。 ＰＣＲ１７５ ５'ＧＣＧＡＡＡＣＧＧＡＡＣＡＴＡＧＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴ
ＧＣＣＴＣＴＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＡＣＡＴＴＣＴＡＴＡＣＧＧＡＧＴＴＡ
ＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧＴＡＧＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＴ
ＣＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＡＡＣＴＴ
ＣＧＴＴＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＴＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣ
ＡＣＧＴＧＡＡＡ３'（配列番号：２） ２つのタイプのＰＮＡプローブを用いた。１つは直鎖状配列でポリ−Ｔ配列を
含んでいる。 ＰＮＡ０５７ Ｎ ＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＴ Ｃ（配列番号：３） 他方は同じ直鎖状配列のビス−ＰＮＡであるが、親水性リンカーによって結合
した２つのアンチパラレル鎖で構成されている。一方の鎖はＤＮＡのワトソン＝
クリック認識のためにデゼインされており、他方の鎖はＰＮＡ−ＤＮＡ二重複合
体のフーグスティーン認識のためにデザインされており、ＰＮＡ2ＤＮＡ三重複
合体の安定性のために最適で、したがって二本鎖ＤＮＡとの鎖置換結合を強化す
るはずである。 ＰＮＡ０５８ Ｎ ＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＴ ＬＬＬ ＴＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴ
ＴＴ Ｃ（配列番号：４）
【００１２】 各ＰＣＲ生成物（５μｇ／ｍｌ）を各ＰＮＡプローブ（１０μｇ／ｍｌ）と０
．５ｘＴＥ緩衝液（１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＮ
ａＣｌ、ｐＨ８．０）中で３７℃で種々の時間間隔で保温した後、氷上で１５０
ｍＭのＨＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して反応を終了させた。サンプルを非変性１
２％ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。ＰＮＡ2ＤＮＡ三重複合体の電気泳
動移動度を対応するＰＣＲ生成物の二重複合体ＤＮＡと比較し臭化エチジウム染
色で可視化した。三重複合体構造物が観察され、ＰＮＡは二本鎖ＰＣＲ生成物を
直接検出することができることを示した。 ゲル遅滞実験の結果は、一本鎖ＰＮＡは最初の６０分以内にはＰＣＲ生成物の
鎖に侵入しないことを示した。（これは文献でも支持されたが、この文献では、
ビス−ＰＮＡと一本鎖のホモプリンＤＮＡとの結合は、より有利な反応エントロ
ピーのために２つの単一ＰＮＡ鎖で形成された複合体よりも極めて安定な複合体
を生じることが示された。） ビス−ＰＮＡは、しかしながら最初の１０分以内の反応で三重複合体を形成し
た。
．５ｘＴＥ緩衝液（１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＮ
ａＣｌ、ｐＨ８．０）中で３７℃で種々の時間間隔で保温した後、氷上で１５０
ｍＭのＨＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して反応を終了させた。サンプルを非変性１
２％ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。ＰＮＡ2ＤＮＡ三重複合体の電気泳
動移動度を対応するＰＣＲ生成物の二重複合体ＤＮＡと比較し臭化エチジウム染
色で可視化した。三重複合体構造物が観察され、ＰＮＡは二本鎖ＰＣＲ生成物を
直接検出することができることを示した。 ゲル遅滞実験の結果は、一本鎖ＰＮＡは最初の６０分以内にはＰＣＲ生成物の
鎖に侵入しないことを示した。（これは文献でも支持されたが、この文献では、
ビス−ＰＮＡと一本鎖のホモプリンＤＮＡとの結合は、より有利な反応エントロ
ピーのために２つの単一ＰＮＡ鎖で形成された複合体よりも極めて安定な複合体
を生じることが示された。） ビス−ＰＮＡは、しかしながら最初の１０分以内の反応で三重複合体を形成し
た。
【００１３】 実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）表面での三重複合体の検出 ストレプトアビジン−ビオチン相互反応を介して、デキストラン表面にビオチ
ン標識ビス−ＰＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を連結した。両ＰＣＲ生成物のサンプル
（１０μｇ／ｍｌ）を水の中でこのセンサー表面に流し、屈折率の変化によって
検出した。ＳＰＲシステムはプリン富裕ＰＣＲ生成物とプリン非富裕ＰＣＲ生成
物とをほぼリアルタイムで識別した（図３参照）。
ン標識ビス−ＰＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を連結した。両ＰＣＲ生成物のサンプル
（１０μｇ／ｍｌ）を水の中でこのセンサー表面に流し、屈折率の変化によって
検出した。ＳＰＲシステムはプリン富裕ＰＣＲ生成物とプリン非富裕ＰＣＲ生成
物とをほぼリアルタイムで識別した（図３参照）。
【図１】 図１は、ＰＮＡ：ＤＮＡ三重複合体の形成を示す模式図である。
【図２】 図２は、ポリピリミジン配列をもつプライマーの５'タグ付加による、増幅生
成物へのプリン富裕領域の取り込みを示す模式図である。
成物へのプリン富裕領域の取り込みを示す模式図である。
【図３】 図３は、表面プラズモン共鳴検出装置の表面での三重複合体形成を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/27 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５ 27/447 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/543 ５９５ Ａ 33/566 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ドルー リーザ ジョアン イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズベリー シービー ディー ポートン ダウン （番地なし) (72)発明者 ブライトウェル ゲイル イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズベリー シービー ディー ポートン ダウン （番地なし) (72)発明者 ホール エリザベス アン ハウレット イギリス ウィルシャー エスピー４ ０ ジェイキュー ソールズベリー シービー ディー ポートン ダウン （番地なし) Ｆターム(参考） 2G059 AA01 BB04 BB12 CC16 EE02 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 HA12 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 FA15 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR48 QR56 QR62 QR82 QS25 QS34 QS36 QS39 QX10
Claims (18)
- 【請求項１】 以下の工程を含む、サンプル中の標的核酸配列の存在を検出
する方法： （ａ）前記標的核酸をその増幅反応生成物がプリン富裕領域を含むように増幅
させ、 （ｂ）前記標的配列の少なくとも一部分と結合することができるペプチド核酸
とサンプルを接触させ、さらに （ｃ）三重体ＤＮＡ構造物の存在を検出する。 - 【請求項２】 前記ペプチド核酸がビス−ＰＮＡである請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 前記増幅生成物が増幅反応時または増幅反応後にペプチド核
酸に暴露される請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記増幅生成物が増幅反応完了後にペプチド核酸に暴露され
る請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、先行する請求
項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】 前記標的核酸がプリン富裕領域を含む、先行する請求項のい
ずれか１項に記載の方法。 - 【請求項７】 プリン富裕領域が増幅反応時に増幅生成物に導入される、先
行する請求項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】 増幅に用いられるプライマーが、その５'末端に複数のピリ
ミジンを含む請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記ペプチド核酸が支持体に固定されている、先行する請求
項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記支持体が検出装置の導波管である請求項９に記載の方
法。 - 【請求項１１】 前記検出装置が表面プラズモン共鳴検出装置である請求項
１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 三重複合体構造物がゲル遅延法によって検出される請求項
１から８のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１３】 標的核酸配列の末端領域とハイブリダイズする配列、およ
びその５'領域に複数のピリミジン残基を含むプライマー。 - 【請求項１４】 標的ヌクレオチド配列に特異的なペプチド核酸配列を含む
、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。 - 【請求項１５】 前記ペプチド核酸が無限小波検出装置の導波管上に固定さ
れる請求項１４に記載のキット。 - 【請求項１６】 前記無限小波検出装置が表面プラズモン共鳴検出装置であ
る請求項１４に記載のキット。 - 【請求項１７】 さらに請求項１３に記載のプライマーを含む、請求項１４
から１６のいずれか１項に記載のキット。 - 【請求項１８】 実質的に以上に記載したような、請求項１に記載のヌクレ
オチド配列の検出方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9815933.8 | 1998-07-23 | ||
| GBGB9815933.8A GB9815933D0 (en) | 1998-07-23 | 1998-07-23 | Detection method |
| PCT/GB1999/002317 WO2000005408A1 (en) | 1998-07-23 | 1999-07-19 | Nucleic acid detection method by triple helix formation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002521034A true JP2002521034A (ja) | 2002-07-16 |
| JP2002521034A5 JP2002521034A5 (ja) | 2006-09-14 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000561354A Pending JP2002521034A (ja) | 1998-07-23 | 1999-07-19 | 三重らせん形成による核酸検出方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP1098992B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002521034A (ja) |
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| AU (1) | AU5051499A (ja) |
| CA (1) | CA2335276A1 (ja) |
| DE (1) | DE69941391D1 (ja) |
| GB (1) | GB9815933D0 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007026823A1 (ja) * | 2005-08-31 | 2007-03-08 | Osaka University | 人工核酸プローブを用いた三重鎖核酸形成を基盤とした標的核酸の検出 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6136541A (en) | 1999-02-22 | 2000-10-24 | Vialogy Corporation | Method and apparatus for analyzing hybridized biochip patterns using resonance interactions employing quantum expressor functions |
| ATE474932T1 (de) | 2000-10-25 | 2010-08-15 | Fujifilm Corp | Methode zur analyse doppelsträngiger dna |
| US20030215864A1 (en) * | 2002-04-23 | 2003-11-20 | U.S. Genomics, Inc. | Compositions and methods related to two-arm nucleic acid probes |
| EP1792263A2 (en) | 2004-09-02 | 2007-06-06 | Vialogy Corporation | Detecting events of interest using quantum resonance interferometry |
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|---|---|---|---|---|
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| US5641625A (en) * | 1992-05-22 | 1997-06-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Cleaving double-stranded DNA with peptide nucleic acids |
| US6451968B1 (en) * | 1991-05-24 | 2002-09-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Peptide nucleic acids |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
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-
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- 1999-07-19 DE DE69941391T patent/DE69941391D1/de not_active Expired - Fee Related
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- 1999-07-19 US US09/744,489 patent/US7531302B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-07-19 WO PCT/GB1999/002317 patent/WO2000005408A1/en active Application Filing
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