JP2002518354A

JP2002518354A - 糖硫酸ペプチド、その合成方法および使用方法

Info

Publication number: JP2002518354A
Application number: JP2000554568A
Authority: JP
Inventors: カミングス，リチャード，ディー．; マクエヴァー，ロジャー，ピー．
Original assignee: ザボードオブリージェンツオブザユニヴァーシティーオブオクラホマ
Priority date: 1998-06-16
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2002-06-25
Also published as: US6545123B2; EP1087996B1; WO1999065712A2; US6569998B2; MXPA00012586A; US20020042102A1; EP1087996A2; AU4567399A; WO1999065712A3; DE69934890D1; CA2332563A1; US20030144183A1; US20020026033A1; US6593459B1; AU773542B2

Abstract

(57)【要約】ペプチドに結合した1個またはそれ以上の硫酸チロシン残基およびグリカンを有する新規クラスの合成糖硫酸ペプチド類（ＧＳＰ）であって、グリカンはシアリルルイス^X基またはシアリルルイス^a基を含むのが好ましい。好ましい態様ではＧＳＰはＧａｌＮＡｃに対するβ１，６結合を含んでなるＯ−グリカンを有する。本発明はさらに細胞を用いないでこれらのＧＳＰをインビトロで合成する方法および強力な抗炎症性抗血栓症薬または転移抑制物質としてインビボで使用する方法を意図する。本発明はまたＧＳＰからグリカンを切断することによりオリゴ糖を合成する方法をも意図する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（背景技術）本発明は糖硫酸ペプチド、その合成方法および炎症の処置におけるその使用方
法に関する。

【０００２】炎症は局所的な傷害に対する血管新生組織の反応である。この傷害には感染お
よび直接的な物理的傷害などの種々の原因がある。炎症性の応答は有益であると
考えられている。なぜならば、炎症性応答がなければ感染は阻止されることなく
進行し、傷は決して治癒せず、組織および器官は永続的に損傷をうけ、結果的に
死に至るであろう。しかしながら、炎症性応答はまた有害である可能性をも秘め
ている。炎症によりリウマチ性関節炎、心筋梗塞、虚血性再灌留傷害、過敏性反
応およびある種の腎臓病に関連する病態が生じ得る。炎症性疾患の広範な問題は
多くの「抗炎症性」薬物の開発を促進してきた。理想的な薬物は炎症性応答から
得られる良好な影響を増強し、同時に有害になり得るこの応答の副作用を妨げる
薬物であろう。

【０００３】炎症性応答は血液細胞に関して血液中で最も豊富にある食細胞である循環好中
球の接着を伴い、脈管に並び脈管壁を作り上げる内皮細胞を活性化する。接着し
た好中球は引き続き活性化され、血管外遊出と称する過程で活性化された好中球
が血液から周辺組織へ移出する。ついで食作用と称する過程で細胞は微生物を飲
み込み始め、また脱顆粒化してタンパク質溶解酵素および酸化酵素などの種々分
解酵素を周辺の細胞外環境に放出する。好中球が接着することにより活性化され
、血液から移出する機構は現在全世界的に研究の主要な題材となっている。これ
らの機構の基礎的な理解が進むことにより新たな抗および前−炎症薬および処置
が現れることが望まれる。

【０００４】循環白血球の炎症部位への最初の誘引は、セレクチンと称する接着分子のクラ
スに細胞が結合することによる。現在同定されている３種のセレクチンは、全て
の循環白血球の表面に構造的に発現するＬ−セレクチン；内皮細胞の表面に誘導
されて発現するＥ−セレクチン；および血小板および内皮細胞の表面に誘導され
て発現するＰ−セレクチンである。セレクチンは別の細胞上の対合レセプターを
認識し、それにより細胞と細胞の接着性の接触を媒介する。たとえば、Ｐ−セレ
クチンはＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）と称する好
中球上の構造的に発現したムチン様糖タンパク質対合レセプターに結合する。Ｐ
−セレクチンおよびＰＳＧＬ−１間の相互作用は脈管壁上の好中球の接着をつな
ぎ留め、その進行を促進し、好中球の活性化ならびに実際の緻密な接着およびイ
ンテグリンおよび対合レセプターを介する血管外遊出を導く。セレクチンに媒介
される接着が炎症性応答中の好中球の活性化および移出に不可欠な先導であるこ
とは明らかであるので、好中球の接着を阻止する化合物を同定するために非常に
多くの研究がなされてきた。

【０００５】シアリルルイス^X(Lewis^X)擬似物質を用いてセレクチン媒介の接着の阻止を介
して炎症性応答を調節または制御する試みがなされている[Lowe、「インビボに
おける糖質−タンパク質相互作用の治療的阻止」J. Clin. Invest. 100 (11補）
：S47-51 (1997))]。シアリルルイス^Xまたはシアリルルイス^a抗原を含む修飾さ
れた単純な糖質（＜２０００ダルトン）がある[Varki、「認識現象におけるリガ
ンドとしてのシアル酸」、FASEB Journal, 11(4) : 248-55(1997)]。シアリルル
イス^X擬似物質を糖質不含物として、または糖質および脂質間の付加生成物とし
て作り、溶解特性を変化させている。これらの擬似物質を二つのルートのうちの
一つにより合成している。周知の一つの方法では一般に入手可能な前駆体および
有機化学的方法で始める全く化学的な工程により糖質擬似物質を製造している。
もう一つの周知の方法では、最初に組換えまたはある程度精製したグリコシルト
ランスフェラーゼ、たとえばシアリルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラン
スフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼならびにシアル酸シトシンモノホス
フェート、ウリジンジホスホガラクトースおよびグアノシンジホスホフコースの
ような糖ヌクレオチド供与体を用いてシアリルルイス^X擬似物質の糖質部分を合
成している。全例でこれらのシアリルルイス^X擬似物質の効率は悪く、高量の化
合物（＞０．５ｍＭ）が必要とされる。なぜならば、適当なセレクチン対合レセ
プター（たとえばＰ−セレクチンに対してＰＳＧＬ−１）の構造を正確に反映し
ていないからである。

【０００６】ヒト白血球上のＰＳＧＬ−１は硫酸化され得る先端のアミノ末端チロシン残基
ならびにＮ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトー
ス、フコースおよびシアリルルイスＸ抗原の配列を有するシアル酸を含むＯ−グ
リカンが付く結合部位になり得るスレオニン残基を含有する(McEverら、「セレ
クチン−糖質相互作用により媒介される白血球の往来」、J. of Biol. Chem., 2
70 : 11025-8 (1995) ; McEverら、「白血球補充におけるセレクチンへのＰＳＧ
Ｌ−１の結合の役割」、J. of Clin. Invest., 100 : 485-491 (1997))。硫酸化チロシン残基およびＯ−グリカンの同時発現は、ＰＳＧＬ−１およびＰ−
セレクチン間の相互作用が高い親和性をもつのに必要であると考えられる。しか
しながら、天然に発生する量のＰＳＧＬ−１は限られており、ヒト好中球から抗
炎症性物質として投与するのに適した形態でＰＳＧＬ−１を製造するのは不可能
である。さらに、ＰＳＧＬ−１の組換え合成法は時間と費用がかかり、動物細胞
の培養が必要であり、結果的に問題を生じ、ＰＳＧＬ−１ペプチドバックボーン
の適当な翻訳後修飾、たとえば硫酸チロシンおよびＯ−グリカンの付加などの不
確実性を伴う。これらの問題を打破する、化合物の処方および製造を可能にする
方法があるのが望ましい。

【０００７】（発明の記述）本発明は、ここで１つ以上の硫酸チロシン残基およびシアリルルイス^X基また
はシアリルルイス^a基を含む多糖を含むようなＰＳＧＬ−１の端アミノ末端を模
倣した合成糖硫酸ペプチド（ＧＳＰ）の新規種を意図する。好ましい実施形態に
おいて、ＧＳＰはさらにＧａｌＮＡｃへのβ１，６結合を含むＯ−型糖鎖を含む
。本発明はさらに、細胞を用いないこれらのＧＳＰの合成のインビトロ方法およ
び細胞のセレクチン仲介接着を阻害することのできる強力な抗炎症抗血栓症性ま
たは抗転移性化合物としてのインビボでのそれらの使用の方法を意図する。[Kim
ら、「Ｐ−セレクチン欠損は腫瘍増殖および転移を減衰させる（"P-Selectin De
ficiency Attenuates Tumor Growth and Metastasis"），Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA，95(16) : 9325-30, 1998］。

【０００８】本明細書で合成した糖硫酸ペプチドは組換え体タンパク質の発現によって簡単
に得ることはできなかった。糖構造の本来の異質性およびチロシン硫酸化の変化
効率のために、組み換え体糖タンパク質での糖付加およびチロシン硫酸化の正確
な定義はきわめて難しい。さらに、α−ＧａｌＮＡｃＴによるＯ−型糖付加の細
胞内開始は複雑である。このファミリーの多くの異なる酵素が、細胞でのＯ−型
糖付加の開始のためにわずかに異なるペプチドモチーフを必要としうる。糖硫酸
ペプチドの合成について本明細書で意図された新規技術は、Ｏ−型糖付加モチー
フにかまわずにＯ−糖部位および構造の完全な制御を可能にする。本明細書で意
図したようなこれらの糖硫酸ペプチドのインビトロ合成はまた、たとえばシアル
酸派生物のような修飾された単糖、糖構造の正確な改変、およびペプチドの長さ
の改変を可能にする。

【０００９】本発明はここで、その観点がさらに完全に理解され、評価されるであろうよう
に以下の実施例での特定の実施形態に関連して記述する一方、本発明をこれらの
特定の実施形態に限定する意図はない。それどころか、付属する請求項によって
定義されたように、本発明の意図の範囲内に含まれるようなすべての変更、改変
および同等物を包むつもりである。したがって、好ましい実施形態を含む以下の
実施例は本発明の実施を例示するのに役に立ち、示された詳細が、例としておよ
び本発明の好ましい実施形態の実例となる討議の目的のためにのみであり、処方
手順の、そして本発明の原理および原則的な観点のもっとも有用で簡単に理解さ
れる記述であると信じられる。

【００１０】（実施例）実施例１図１Ａおよび１Ｂにて表した１つの実施形態において、本発明は糖硫酸ペプチ
ドと、少なくとも１つのチロシン残基および少なくとも１つのＯ−グリコシド結
合を提供することのできる天然または人工のアミノ酸残基（たとえばセリン、ス
レオニン、ヒドロキシプロリン、チロシン、ヒドロキシリシン、メチオニンなど
）を含んでいる前合成したペプチドに、酵素的に糖および硫酸基を付け加えるこ
とによる、その合成の方法を意図する。ペプチドは好ましくは２アミノ酸から３
０アミノ酸までからなり、さらに好ましくは３から２９アミノ酸残基、４から２
８アミノ酸残基、５から２７アミノ酸残基、６から２６アミノ酸残基、７から２
５アミノ酸残基、８から２４アミノ酸残基、９から２３アミノ酸残基、１０から
２２アミノ酸残基、１１から２１アミノ酸残基、１２から２０アミノ酸残基、１
３から１９アミノ酸残基、１４から１８アミノ酸残基、１５から１７アミノ酸残
基または１８アミノ酸残基である。図１〜４、１０および１１に示した典型的な
ペプチドにおいて、アミノ酸配列は、残基４２のＮ末端に加えた追加的なグリシ
ン残基を除いてＰＳＧＬ−１のアミノ酸４２〜６３と同一である。

【００１１】糖硫酸ペプチドは好ましくは少なくとも１つの硫酸チロシン残基を含み、さら
に好ましくは２つの硫酸チロシン残基、最も好ましくは３つの硫酸チロシン残基
を含む。それぞれのチロシン残基は好ましくは少なくとも１つの追加的なアミノ
酸残基によって分離される。

【００１２】本実施形態において、ペプチドは、Ｏ−結合残基のヒドロキシル基へのα結合
でのテトラアセチル化ＧａｌＮＡｃのｆ−ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ派生物を用い
て市販のペプチド合成機上で合成する。Ｏ−結合アミノ酸のこのα−結合派生物
は、ペプチドの合成中にペプチドの望ましい部位で挿入し、したがってＯ−結合
残基によってテトラアセチル化ＧａｌＮＡｃを加える。

【００１３】テトラアセチル化ＧａｌＮＡｃは次いで、ナトリウムメトキシドなどの有機溶
媒中の弱塩基での脱アセチル化による工程（１）で「脱保護した（ｕｎｂｌｏｃ
ｋｅｄ）」。望ましい部位へのＧａｌＮＡｃ残基の特異的な導入は、糖鎖結合ア
ミノ酸が定量的および化学量論的レベルで存在していること、およびペプチドの
他の部位の他のＯ−結合残基が修飾されていないことを確実にする。

【００１４】次の工程（２）において、ＧａｌがＵＤＰＧａｌの存在下でβ１，３−Ｇａｌ
Ｔを介してＧａｌＮＡｃへβ−結合する。次の工程（３）において、ＧｌｃＮＡ
ｃがＵＤＰＧｌｃＮＡｃの存在下でβ１，６−ＧｌｃＮＡｃＴを介してＧａｌＮ
Ａｃへβ−結合する。次の工程（４）において、ＧａｌがＵＤＰＧａｌの存在下
でβ１，４−ＧａｌＴを介してＧｌｃＮＡｃへβ−結合する。次の工程（５）に
おいて、ＮｅｕＡｃがＣＭＰＮｅｕＡｃの存在下でα２，３−ＳＴを介してＧａ
ｌにα−結合する。次の工程（６）において、フコースがＧＤＰフコースの存在
下でα１，３−ＦＴを介してＧｌｃＮＡｃへα−結合する。合成の最終工程（７
）において、硫酸基がＰＡＰ硫酸の存在下で組換え体、または少なくとも部分的
に精製されたＴＰＳＴを介してペプチドの１つ以上のチロシン残基のそれぞれに
加わる。これらの工程は以下の実験的手順項でより詳細に記述される。本実施形
態での合成工程の結果、硫酸化チロシンと、セリンまたはスレオニン（または同
様にＯ−結合可能なアミノ酸）へのＯ−結合でのＧａｌＮＡｃ残基へのβ１，６
結合を持っているシアリルイス^X部分をもつペプチドができる。上述したように
、本実施形態において、（ペプチドに１つ以上ある場合）ＧａｌＮＡｃを特定の
チロシン（またはセリン）残基へ好ましく結合させることは可能ではない。さら
に、Ｎ−アセチルノイラミン酸は使用する好ましいシアル酸であるが、同様の様
式で機能する他のシアル酸も、本明細書で請求した糖硫酸ペプチドで使用される
ために意図される。これらの他のシアル酸には、酵素α２，３−ＳＴを介して転
移することのできる他のシアル酸が含まれ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−
アセチルノイラミン酸、９−Ｏ−アセチル−Ｎ−グリコリルノイラミン酸、９−
Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸および本明細書で参考文献として組み
込まれているＶａｒｋｉら、「認識現象でのリガンドとしてのシアル酸("Sialic
Acids As Ligands In Recognition Phenomena"）」、FASEB Journal, 11 (4) :
248-55，1997に記載の他のシアル酸が含まれる。

【００１５】本実施形態において、ペプチドが１つ以上のチロシンを含む場合、特定のチロ
シン残基のみ特異的に硫酸化することは不可能である。特定のチロシン残基を特
異的に硫酸化することが可能である実施形態を以下に記述する。

【００１６】本明細書で使用した略語への解答を以下に提供する。

【００１７】（詳細な実験的手順）（実施例１の糖硫酸ペプチドの合成）粗製糖ペプチド１（ＧＰ−１）をオクラホマ州立大学のProtein Resource Fac
ilityにて合成した。トリ−Ｏ−アセチル化ＧａｌＮＡｃを、トリ−Ｏ−アセチ
ル−ＧａｌＮＡｃαＦｍｏｃＴｈｒ派生物(Oxford GlycoSciences, Oxford, UK
）を用いた固相合成の間にペプチド内に組み込んだ。粗製ＧＰ−１（２ｍｇ）を
、Medalら、Int. J. Peptide Protein Res., 43:529-536, 1994に記述されたよ
うに６ｍＭメタノール化ナトリウムメチレートにて脱Ｏ−アセチル化した。脱ア
セチル化したペプチドを逆相ＨＰＬＣにて精製した。脱アセチル化ＧＰ−１の保
持時間（３４．６分）は明らかにトリ−Ｏ−アセチル化ＧＰ−１（４５．３分）
とは異なった。精製ＧＰ−１の収量は１．１〜１．５ｍｇであった。マトリック
ス関連レーザー吸着イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルに
おいて、［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対する観察されたｍ／ｚは２９５２．９（ｃ
ａｌｃｍ／ｚ２９５３．２）であった。さらに、酸化ＧＰ−１の［Ｍ−Ｈ］^-
分子イオン（ｍ／ｚ２９６９．５）がメチオニン残基が酸化されていた場合に
存在した。

【００１８】ＧＰ−１を、全容量１００μｌの５０ｍＭＭＥＳ，ｐＨ６．５、２ｍＭＡＴ
Ｐ、１５ｍＭＭｎＣｌ₂、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で３〜４倍のモ
ル過剰ＵＤＰＧａｌ（Ｓｉｇｍａ）および１３ｎｍｏｌ／ｈの精製コア−１ β
１，３−ＧａｌＴ（コア−１ β１，３−ガラクトシル転移酵素）を用いること
によって１００〜２００ｎｍｏｌアリコート内で３７℃にて一晩ガラクトシル化
した。コア−１ β１，３−ＧａｌＴの完全なアミノ酸配列は配列番号：１に示
す。タンパク質およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００をクロロホルム−メタノール（
２：１）抽出（脱タンパク化）によって取り除いた後、反応混合液をＨＰＬＣに
て解析した。ガラクトシル化産生物ＧＰ−２の保持時間は３２．９分であり、ガ
ラクトシル化の程度は＞９５％であった。ＧＰ−２のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析は
［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対してｍ／ｚ３１１５．４を表した（ｃａｌｃ．ｍ／
ｚ３１１５．３）。

【００１９】ＧＰ−２（０．４〜０．６ｍＭ）を、５０ｍＭカコジル酸Ｎａ，ｐＨ７．０
１００μｌの総容量での１〜２ｍＭのＵＤＰＧｌｃＮＡｃ（Ｓｉｇｍａ）および
アフィニティ精製した組換え体コア−２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴ（１００ｎ
ｍｏｌ／ｈ）と一緒に３７℃でインキュベートした。コア−２ β１，６−Ｇｌ
ｃＮＡｃＴを得るための方法を以下に記述する。２４時間インキュベーションの
後、反応混合液の少量部分をＨＰＬＣで解析した。ＧＰ−２は定量的により速く
移動する産生物、ＧＰ−３（保持時間３１．３分）へ変換した。ＧＰ−３のＭ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルは［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対してｍ／ｚ３３
１８．２を示した（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ３３１８．５）。反応混合液を直接β１
，４−ＧａｌＴ反応へかけた。あるいは、ＵＤＰ［³Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ(American
Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, MO)（１２，０００ｃｐｍ／ｎｍｏ
ｌ）をコア−２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴ反応でのドナーとして使用し、［³Ｈ
］ＧＰ−３を得た。

【００２０】ＧＰ−３（０．４ｍＭ）（コア−２ β１，６ＧｌｃＮＡｃＴ反応混合液）を
、総容量１６０μｌの４０ｍＭカコジル酸Ｎａ，ｐＨ７．０、２０ｍＭＭｎＣ
ｌ₂および０．０２％ＮａＮ₃中のウシミルクβ１，４−ＧａｌＴ（Ｓｉｇｍａ
）およびＵＤＰＧａｌ（１．５ｍＭ）を用いてガラクトシル化した。３７℃での
２０時間のインキュベーション後、反応混合液からの試料をＨＰＬＣで解析し、
すべてのＧＰ−３がより速く移動する産生物ＧＰ−４（保持時間３０．４分）に
変換されたことが示された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析において、観察されたＧＰ
−４の［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対するｍ／ｚは３４８０．４（ｃａｌｃ．ｍ／
ｚ３４８０．７）であった。糖ペプチド試料を、溶出液として水または２５ｍ
ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃を使用したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム（１０ｍｌ、０．
７×２５ｃｍ）で脱タンパク化および脱塩した。０．５ｍｌ分画を回収し、糖ペ
プチドを２１５ｎｍでのＵＶ吸収または分画の放射活性のどちらかを測定するこ
とで検出した。脱塩および脱タンパク化の後、試料を直接α２，３−シアリルＴ
反応にかけた。放射標識化［³Ｈ］ＧＰ−３をドナーとしてＵＤＰ［³Ｈ］Ｇａｌ
(Amersham, Buckinhamshire, England)（１０，０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）を用
いてガラクトシル化した。

【００２１】ＧＰ−４（１ｍＭ）を、総容量５０μｌの５０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．４、
０．１％ＢＳＡおよび０．０２％ＮａＮ₃中の２０ｍＵ α２，３−（Ｎ）−シ
アリルＴ(Calbiochem, La Jolla, CA)および３ｍＭＣＭＰＮｅｕＡｃ（Ｓｉｇ
ｍａ）を用いてシアル酸化した。３７℃での１４時間インキュベーション後、１
μｇ試料をＨＰＬＣで解析し、ＧＰ−４が完全により速く移動する産生物、ＧＰ
−５（保持時間２９．７分）に変換されたことが示された。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
解析において、観察されたＧＰ−５の［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対するｍ／ｚは
３７７０．６（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ３７７１．９）であった。反応混合液を直接
α１，３−ＦｕｃＴ反応に使用した。放射標識化［³Ｈ］ＧＰ−４（０．１ｍＭ
）をまたドナーＣＭＰ［³Ｈ］ＮｅｕＡｃ（０．２ｍＭ、３１，５００ｃｐｍ／
ｎｍｏｌ）（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いてシアル酸化した。

【００２２】ＧＰ−５（０．４ｍＭ）を、総容量１２０μｌの５０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．
４、２０mM ＭｎＣｌ₂および０．０２％ＮａＮ₃中、２ｍＵのα１、３−Ｆｕｃ
Ｔ−IV(Calbiochem, La Jolla, CA)およびＧＤＰＦｕｃ（０．８ｍＭ）(C
albiochem, La Jolla, CA)を用いて３７℃にて１６時間でα１，３−フコース化
した。脱タンパクおよび脱塩した試料をＨＰＬＣにて解析し、ＧＰ−５が完全に
産生物ＧＰ−６（保持時間２９．１分）に変換したことを示した。ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ解析において、観察されたＧＰ−６の［Ｍ−Ｈ］^-分子イオンに対するｍ
／ｚは３９１７．５（ｃａｌｃ．ｍ／ｚ３９１８．１）であった。１８５μｇ
のＧＰ−２からはじめるとＧＰ−６の全回収は、ＨＰＬＣを行っている間の２７
５ｎｍでのＵＶ吸収によって決定したように、８８μｇであった。放射標識化［
³Ｈ］ＧＰ−４をドナーとしてＧＤＰ［¹⁴Ｃ］Ｆｕｃ（８３，０００ｃｐｍ／ｎ
ｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてフコース化した。

【００２３】ＧＰ−６（０．０２ｍＭ）のいくつかの部分を、０．１５ｍＭＰＡＰＳ（Ｓ
ｉｇｍａ）または［³⁵Ｓ］ＰＡＰＳ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）（特異的活
性３０３００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）および０．８５ｎｍｏｌ／ｈの組換え体ヒトＴ
ＰＳＴ−１（配列番号：２）を用いて３７℃にて３５時間で硫酸化した。あるい
は、ｈＴＰＳＴ−２（配列番号：３）が使用でき、または任意の他の機能的なチ
ロシン化タンパク質硫酸転移酵素が使用できた。総反応容量は、４０ｍＭＰＩ
ＰＥＳ，ｐＨ７．０、０．０５ＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０および５ｍＭＥＤＴＡ中のアリコートあたり１００μｌであった。タンパク
質および界面活性剤を取り除くためのクロロホルム−メタノール（２：１）抽出
後、反応混合液をゲル濾過にて脱塩し、ＨＰＬＣにかけた。産生物ＧＳＰ−６の
保持時間は１５．６分であり、ＧＰ−６のＧＳＰ−６への変換は＞９５％であっ
た。電子噴霧重量スペクトル解析は４１５８．０のＧＳＰ−６の分子量を示し（
ｃａｌｃ．４１５９．２）、３つの硫酸機が存在することを確かにした。

【００２４】あるいは、ＧＳＰ−６の放射標識化型を、ＧＰ−６（０．０１ｍＭ）を１４〜
１７時間、総容量５０μｌ中の０．０６ｍＭ［³⁵Ｓ］ＰＡＰＳ（１０７，００
０〜５５９．０００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）および０．３６ｎｍｏｌ／ｈのＴＰＳＴ
−１と一緒にインキュベートすることで合成した。ＧＰ−６の³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ
−６への変換は＞８５％であった。ＧＰ−２（０．０８ｍＭ）を総反応容量４０
０μｌ中０．６ｍＭＰＡＰＳ（Ｓｉｇｍａ）および４．８ｎｍｏｌ／ｈのアフ
ィニティ精製組換え体ＴＰＳＴ−１を用いることで３７℃にて３５時間硫酸化し
た。脱タンパクおよび脱塩後、試料をＨＰＬＣにて解析した。産生物の保持時間
は２１．４分であり、ＧＰ−２のＧＳＰ−２への変換は９８％であった。ＧＳＰ
−２の電子噴霧重量スペクトルは３３５６．０（ｃａｌｃ．３３５６．５）とし
ての分子量を示し、これは３つの硫酸機が存在することを確かにした。あるいは
、ＧＰ−２（０．０４ｍＭ）を、総容量５６μｌ中の［³⁵Ｓ］ＰＡＰＳ（０．２
ｍＭ、３０３００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａ）およびＴＰＳＴ−１（０．
７ｎｍｏｌ／ｈ）を用いて３７℃にて１８時間で硫酸化した。ＧＰ−２の³⁵ＳＯ
₃−ＧＳＰ−２への変換は＞９５％であった。ＧＰ−５を、ドナーとして［³⁵Ｓ
］ＰＡＰＳ（３０３００ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）を用いてＧＰ−６と同様の形式で硫
酸化した。ＧＰ−５の³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−５への変換は＞９０％であった。ＨＰ
ＬＣでの³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−５の保持時間は１７．５分であった（示していない
）。

【００２５】（逆相高性能液体クロマトグラフィー）糖ペプチド試料をＳｐｉｎ−Ｘ膜(Corning Costar, Cambridge, MA)上で濾過
し、続いてBeckman System Gold HPLC上で逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラム(Vydac,
Hesperia, CA)で解析した。以下の溶媒系を１ｍｌ／分の流速で用いた。すなわ
ち、１〜１０分、２０％アセトニトリル−８０％水−０．１％ＴＦＡ、１０−７
０分、水−０．１％ＴＦＡ中２０％から４５％までの直線アセトニトリル勾配、
１０〜７０分、水−０．１％ＴＦＡ中２０％−４５％直線アセトニトリル勾配で
ある。２１５ｎｍまたは２７５ｎｍでのＵＶ吸光度をモニタし、および／または
回収した画分の放射活性を測定した。プールされた画分を真空下乾燥させた。

【００２６】（平衡ゲル濾過クロマトグラフィー）平衡ゲル濾過実験を、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、２ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂、０．０２％ＮａＮ₃を含む４ｍｌの２０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．５（緩
衝液Ａ）および³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６（１０，０００ｃｐｍ／ｍｌ、特異的活性
１７００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５カラム（
０．５×１０ｃｍ、２ｍｌ）で行った。異なった量の可溶性Ｐ−セレクチン（ｓ
ＰＳ）（２５〜１０００ｐｍｏｌ）(Ushiyamaら、J. Biol. Chem., 268:15229-1
5237, 1993)を³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６を含む緩衝液Ａ１２０μｌ中で３０〜６０分
間プレインキュベートし、カラムに載せた。試料を（³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６含有
）緩衝液Ａで溶出し、１４０μｌ画分を７０μ／分の流速で回収した。画分の放
射活性を液体シンチレーション計数管にて測定した。ｓＰＳおよびＧＳＰ−６の
間の結合の阻害剤を試験する対照実験を、４００ｐｍｏｌのｓＰＳおよび５，０
００ｃｐｍ／ｍｌの³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６を用いて行った。ＥＤＴＡ濃度は、２
０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃中で
１ｍＭであった。坑Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体（Ｇ１およびＳ１２）（
各８００ｐｍｏｌ）を³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６を加える前に緩衝液Ａ中でｓＰＳに
て３０分間プレインキュベートした。溶出は³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６を含む緩衝液
Ａを用いることで行った。

【００２７】（Ｐ−セレクチンアフィニティクロマトグラフィー）可溶性Ｐ−セレクチンを取扱説明書にしたがってUltralink（登録商標） Bios
upport Medium (Pierce, Rockford, IL)に結合させた。異なる濃度（０、１．０
、１．３、１．６、２．０ｍｇ／ｍｌ）のＰ−セレクチンカラムを２５ｍｌの緩
衝液Ａで平衡化した。放射標識化糖（硫酸）ペプチド（８００〜１０００ｃｐｍ
、１〜１０ｃｐｍ、１〜１０ｐｍｏｌ）を２００μｌの緩衝液Ａ中に溶解させ、
ｓＰＳ−カラムにかけた。結合物質を緩衝液Ｂ（１０ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍ
ＭＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ₃を含む２０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．５）で溶
出した。画分の量は０．５ｍｌであり、流速は２００〜２５０μｌ／分であった
。すべての画分を放射活性について計数した。

【００２８】（質量分光計解析）マトリックス関連レーザー吸着／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質
量分光計を、３３７ｎｍの窒素レーザー操作を備えたBiflex（登録商標）飛行時
間機械(Bruker-Franzen Analytik, Germany)で直線陰イオン遅延抽出モードで行
った。ＧＳＰ−２およびＧＳＰ−６を除くＨＰＬＣ精製糖ペプチド試料を３０％
水和アセトニトリルに溶解し、０．５μｌアリコート（約２．５ｐｍｏｌ）を０
．５μｌの２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノンマトリックス（アセトニ
トリル／２０ｍＭ水和クエン酸二アンモニウム、容量比１：１中３ｍｇ／ｍｌ）
と混合させ、すぐに減圧下乾燥させた。スペクトルをインスリン［Ｍ−Ｈ］^- お
よび［Ｍ−２Ｈ］^2- シグナルで外較正した。電子噴霧イオン化（ＥＳＩ）質量
スペクトルをＱ−ＴＯＦハイブリッド四極子／直交加速飛行時間質量分光計(Mic
romass Ltd., UK)を用いた陰イオンモードで回収した。ＧＳＰ−２およびＧＳＰ
−６を５０％水和アセトニトリル中に溶解し、ナノ電子噴霧イオン源を持つ質量
分光計中に注入した。器具較正をトリフルオロ酢酸ナトリウムイオンクラスター
にて行った。

【００２９】（ＧＳＰ−６の脱シアル酸化） ³⁵ＳＯ₃−ＧＳＰ−６（６，０００ｃｐｍ）を、１００μｌの０．１Ｍ酢酸ナ
トリウムｐＨ５．５中、Arthrobacter ureafaciensノイラミダーゼ(Sigma) ８．
４ｍＵにて３７℃、１３時間処理することで脱シアル酸化した。反応混合液をｓ
ＰＳ−カラム上のクロマトグラフィーによる解析前に脱塩および脱タンパク質し
た。

【００３０】（組換え体可溶性コア−２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴの構築、発現および精
製）融合タンパク質を、Ｎ−およびＣ−末端両方で１２アミノ酸ＨＰＣ４エピトー
プをもつヒトコア２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴの触媒および基部領域を含むよ
うに構築した。エピトープはモノクローナル抗体ＨＰＣ４がＣａ²⁺依存様式で結
合する[Rezaiら、Prot. Exp. Purif., 3:453-460, 1992]。コア２ β１，６−Ｇ
ｌｃＮＡｃＴの触媒および基部領域を、鋳型としてヒトコア２ β１，６−Ｇｌ
ｃＮＡｃＴ（Ｌ型）の全長ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３プラスミドを用いてＰＣ
Ｒによって増幅した(Bierhizenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9326-9330
, 1992)。以下のプライマーを増幅に使用した。

【００３１】ＢａｍＨＩ開裂部位を含む５’プライマー、５’−ＧＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＡＡＧＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴ
ＴＧＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＴＣＣ−３’（配列番号：４）およびＥｃｏＲＩ部位およびＨＰＣ４エピトープを含む３’−プライマー、５’−ＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＧＣＣＴ
ＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＡ
ＡＧＣ−３’（配列番号：５）ＰＣＲ産生物（１．２ｋｂ）をｐＣＲ−ＴＯＰＯ２．１ベクター（インビト
ロｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローン化し、プラスミド調整のため
に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０９に形質転換するために使用した。この構
造物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化することでｐＣＲ−ＴＯＰＯ２．１
ベクターより放出させ、アガロースゲル電気泳動で精製した。この構造物（１．
２ｋｂ）を、ＮＨ₂−末端トランスフェリンシグナル配列およびＨＰＣ４エピト
ープを含む改変ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｔ
Ｈ）(Ouyangら、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95:2896-2901, 1988)のＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＶ部位にライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに形質転換するのに使用した。得られたプラスミド、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ＴＨ−ｓＣ
２（６．７ｋｂ）を単離し、配列決定してリポフェクタミン(Life Technologies
, Inc.)を用いてＣＨＯ／ｄｈｆｒ^-細胞にトランスフェクトするのに用いた。ク
ロ−ン化選別をネオマイシン耐性下で行い、細胞を１０％ウシ胎児血清およびＧ
４１８（６００μｇ／ｍｌ）を含む低塩ＤＭＥ(Cellgro, Herndon, Virginia)で
維持した。培養液中でコア２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴ活性を発現している（
５０ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｌ）細胞の安定クローンを選別し、１００％コンフレント
まで増殖させた。培養液を２％ウシ胎児血清を含む低塩ＤＭＥに交換し、２〜３
日間インキュベートした。培養液を回収し、１ｍＭＣａＣｌ₂および５ｍＭベン
ズアミジンに調整した。ＨＰＣ４エピトープタグを含む可溶性コア−２ β１，
６−ＧｌｃＮＡｃＴを、Mehtaら、Blood, 90:2381-2389, 1997に記述のように４
℃で、ＨＰＣ４−ｍＡｂアフィニティカラム（Ultralink（登録商標）Biosuppor
t Mediumに結合した５ｍｇ／ｍｌのＨＰＣ４−ｍＡｂの３．５ｍｌカラム）を用
いて条件培養液（６０ｍｌ）から精製した。精製した酵素を０．１％ＢＳＡを加
えることで安定化させ、この酵素をCentricon−３０超遠心管(Amicon, Beverly,
MA)を用いて濃縮した。精製した酵素を直接またはその一部を使用し、−２０℃
で保存した。この活性（８．２μｍｏｌ／ｈ／ｍｌ）は、少なくとも２ヶ月間、
−２０℃にて安定であった。コア−２ β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴアッセイを１
ｍＭＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（Toronto Research Chemicals In
c., Canada）および１ｍＭＵＤＰ−［³Ｈ］ＧｌｃＮＡｃ（特異的活性１０００
ｃｐｍ／ｎｍｏｌ）を用いて行った。このアッセイを３７℃にて、総容量５０μ
ｌの５０ｍＭカコジル酸Ｎａ，ｐＨ７．０中の２．５〜１０μｌの精製酵素で３
０分間、または２５μｌの細胞培養液で２〜３時間行った。放射標識化反応産生
物をＳｅｐＰａｋカートリッジ(Waters, Milford, MA)を用いて放射標識化ドナ
ーから分離した。

【００３２】（好中球単離および標識化）ヒト好中球をZimmermanら、J. Clin. Invest., 76:2235-2246, 1985に記述の
ように健康なボランティアより単離し、取扱説明書にしたがってCalcein-AM (Mo
lecular Probes, Inc., Eugene, OR)にて標識化した。

【００３３】（好中球接着アッセイ）接着アッセイを以下の改良を行って、本質的にUshiyamaら、J. Biol. Chem.,
268-15229-15237, 1993に記述のように行った。Calcein−標識化好中球を使用し
た。ｓＰＳを、４℃で一晩、０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中の２μｇ／ｍｌ
ｓＰＳでウェルをインキュベートすることで（１００μｌ／ウェル）Ｉｍｍｕｌ
ｏｎ１マイクロタイタープレート上に直接コートした。ＧＳＰ−６インキュベ
ーションについては、ウェルを１５分間室温で、０．１％ＨＳＡを含むＨＢＳＳ
中のＧＳＰ−６の異なる希釈液５０μｌでプレインキュベートした。対照実験に
おいて、ウェルをＰ−セレクチンに対するｍＡｂｓでプレインキュベートした。
他の対照において、坑ＰＳＧＬ−１ｍＡｂｓまたは流体相ｓＰＳを２５μｌの
細胞浮遊液で室温にて１５分間プレインキュベートした。ついで好中球（２５μ
ｌ）をｓＰＳ−コートウェルに加えた。接着細胞の数をｆｍａｘ蛍光プレートリ
ーダー(Molecular Devices)を用いて定量した。

【００３４】実施例２第二実施形態において、連続した合成工程は、最初の工程を除いて実施例１と
同様である。図２Ａおよび２Ｂに表記した本発明のこの実施形態において、（少
なくとも１つのチロシンおよび少なくとも１つの糖が結合しうるアミノ酸残基を
含む）前合成したペプチドを用意する。本実施形態の最初に用意したペプチドは
硫酸化されているチロシン残基を欠き、そこに結合するＧａｌＮＡｃを欠く。市
販のペプチド合成機によって産出されうるペプチドをついで糖ドナーの連続系列
および相当する糖転移酵素にさらし、ペプチドのＯ−結合型残基に結合したオリ
ゴサッカライド群を合成した。本実施例において、工程（１）は、セリンまたは
スレオニン残基（または他のＯ−結合型アミノ酸）へα−結合でＧａｌＮＡｃに
加えるためにα−ＧａｌＮＡｃＴの存在下でＵＤＰＧａｌＮＡｃへペプチドを曝
露することを含む。ペプチドが１つ以上のＯ−結合型残基を含む場合、本方法で
は、ＧａｌＮＡｃがただ１つのＯ−結合型残基に入るかもしれないし、入らない
かもしれない。続く工程は実施例１でのものと同様である。

【００３５】実施例３図３Ａおよび３Ｂで表した他の実施形態において、ペプチドを硫酸化工程を除
いて実施例１でのペプチドと同様の様式で合成した。本実施形態では、ペプチド
を市販のペプチド合成機上で合成する時、１つ以上の硫酸化ｆ−ｍｏｃまたはｔ
−ｂｏｃチロシン派生物を好ましい段階で合成サイクル中に導入し、チロシン残
基を特定の位置でペプチドに挿入する。したがって、オリゴサッカライド合成工
程がおこる前に、ペプチドはすでに１つ以上のチロシン残基で硫酸化されている
。１つ以上の硫酸チロシン残基を持つ合成ペプチドを穏やかな酸条件下で放出し
、硫酸チロシン残基の完全性を保護した。テトラアセチル化ＧａｌＮＡｃを上述
のように脱保護した。ペプチド内の特定の位置でのテトラアセチル化ＧａｌＮＡ
ｃ残基の導入は、ペプチド内の他のＯ−結合型残基が修飾されていないことを確
かにする。１つ以上の指定した位置でのペプチドへの硫酸化チロシンの特異的導
入は、１つ以上の硫酸化チロシンが定量的および化学量論的レベルで存在するこ
とを確実にする。

【００３６】実施例４図４で示した他の実施形態において、糖硫酸ペプチドを、ペプチドがテトラア
セチル化ＧａｌＮＡｃの派生物ではなく、テトラアセチル化ＧｌｃＮＡｃのｆ−
ｍｏｃまたはｔ−ｂｏｃ派生物を用いて最初に合成されうることを除いて、実施
例３での糖硫酸ペプチドと同様の様式で構築してよい。本実施形態では、Ｏ−型
糖鎖を、ナトリウムメトキシドのような有機溶媒中の弱塩基によってペプチドを
脱アセチル化し、つづいてペプチドに結合しているＯ−型糖鎖を作製するために
ＧｌｃＮＡｃへＧａｌ、ＮｅｕＡｃおよびＦｕｃを加える実施例１の工程４〜６
を行うことで構築する。本実施形態において、Ｏ−型糖鎖は、ペプチドのＯ−結
合可能アミノ残残基へ直接Ｏ−結合したシアリルルイス^X基である。

【００３７】実施例５他の実施形態において、硫酸を特定のチロシン残基に加えることができる。図
１Ａおよび１Ｂに示し、実施例１で記述した工程を最初と最後の工程を除いて繰
り返す。本実施形態において、ペプチドを最初に、１つ以上のリン酸化チロシン
残基（Ｔｙｒ−ＰＯ₃ ^-）を、たとえば４６、４８または５１位置で用いて合成す
る。ペプチドを少なくとも１つの非リン酸化チロシン基、たとえば４６、４８ま
たは５１位置を用いて合成する。したがってこのペプチドは少なくとも１つのリ
ン酸化チロシン残基と少なくとも１つの非リン酸化チロシン残基を持つ。

【００３８】このペプチドを実施例１で記述した同様の工程を用いて処理し、これは占有さ
れていないチロシン残基へ硫酸基（ＳＯ₃ ^-）を加えるためにチロシンタンパク質
硫酸化酵素にて糖リン酸ペプチドを処理することを含む。得られた糖硫酸リン酸
ペプチドをついで本技術分野でよく公知の様式でアルキンホスファターゼで処理
した。この処理によりチロシンからリン酸基が取り除かれ、したがってチロシン
上の硫酸が残り最終産生物、糖硫酸ペプチドが提供される。

【００３９】実施例６本発明の合成糖硫酸ペプチドがＰ−セレクチンと相互作用するかどうかを調べ
るために、異なる結合濃度での組換え体可溶性Ｐ−セレクチン（ｓＰＳ）を含む
アフィニティークロマトグラフィーの組を調製した。異なるカラム濃度はＰ−セ
レクチンに対する合成糖硫酸ペプチドの相対的親和性を見積もることを可能にす
る。図１での糖硫酸ペプチド−６（ＧＳＰ−６）と同様の構造を持っている放射
標識化糖硫酸ペプチドを、Ｃａ²⁺含有緩衝液中の固定化ｓＰＳへ載せた（図５）
。ＧＳＰ−６の溶出は１．３および１．６ｍｇ／ｍｌｓＰＳを含むカラム上で
リタードされた(retarded)。ＧＳＰ−６は２．０ｍｇ／ｍｌｓＰＳを含むカラム
に結合し、ＥＤＴＡで溶出しうる。チロシン上の硫酸を欠く他の糖ペプチドまた
はｓＬｅ^X決定基を欠く糖硫酸ペプチドはｓＰＳに対する検出可能な親和性を持
たない。この結果は、結合に対する硫酸化チロシンとｓＬｅ^Xの二重の重要性を
示している。フコース残基を欠く糖硫酸ペプチドもまた固定化ｓＰＳに検出可能
には結合しなかった。これらの結果は、ｓＬｅ^X基のシアル酸とフコース両方が
ＧＳＰ−６の固定化ｓＰＳへの高親和性結合に必要であることを示している。

【００４０】ＧＳＰ−６の可溶性ｓＰＳへの解離定数（Ｋ_d）を平衡ゲル濾過技術を用いて
決定した。異なる量の流体相ｓＰＳ（２５〜１０００ｐｍｏｌ）を、Ｃａ²⁺含有
緩衝液中の³⁵ＳＯ₃−糖硫酸ペプチド−６で平衡化した小さなゲル濾過化カラム
に載せた。結合データをプロットし、平衡結合定数を導き、約３５０ｎＭのＫ_d
を見積もった。ＧＳＰ−６のｓＰＳへの結合をＥＤＴＡおよびＰ−セレクチンの
レクチン領域に結合する阻害剤坑Ｐ−セレクチンｍＡｂＧ１で阻害した。結合
は、Ｐ−セレクチンの共通配列繰り返しの１つに結合する坑−Ｐ−セレクチンｍ
Ａｂｓ１２では阻害されない。これらの結果は、ＧＳＰ−６がＣａ²⁺依存様式
でｓＰＳに比較的高い親和性で結合することを示している。

【００４１】ＧＳＰ−６の、好中球のＰ−セレクチンへの接着を阻害する能力を、ｓＰＳを
コートしたマイクロタイタープレートで試験した（図５）。接着の特異性をまず
確認した。接着はＥＤＴＡおよび坑−Ｐ−セレクチンｍＡｂＧ１によって阻害
されるが、坑−Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体Ｓ１２では阻害されなかった
。接着はまた、ＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチンへの結合を阻害するＰＳＧＬ−１
のＮ−末端エピトープに対するｍＡｂであるＰＬ１によっても阻害された。一方
、ＰＳＧＬ−１のムチンデカペプチド繰り返し内のエピトープを認識するＰＬ２
は接着を阻害しなかった。これらの結果は、本アッセイの接着がＰＳＧＬ−１の
ｓＰＳへの結合を必要とすることを示している。低濃度の流体相ｓＰＳ（５．６
７μＭ）は好中球接着を阻害する。同様の濃度のＧＳＰ−６（４．７μＭ）もま
た有意に好中球の固定化ｓＰＳへの接着を阻害する。明らかに逆に、精製ｓＬｅ
^X含有テトラサッカライド（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−
３］ＧｌｃＮＡｃ）はとても高濃度（５．３ｍＭ）においてさえも好中球接着を
最小限にしか阻害しない。まとめると、これらの結果は、ＧＳＰ−６はＰ−セレ
クチンに特異的に結合し、Ｐ−セレクチンへのＰＳＧＬ−１依存好中球接着を強
く阻害することを示している。

【００４２】実施例７本明細書で意図した糖硫酸ペプチドのＯ−型糖鎖を含みうるさまざまなオリゴ
サッカライドＲ基の例を図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示す。たとえば、図６Ａで示
したＲ₁は実施例１で記述した工程を用いて合成してよい。

【００４３】Ｒ₂はＮｅｕＡｃ基がＣＭＰＮｅｕＡｃの存在下でα２，３−ＳＴを介してα
２，３結合で、ＧａｌＮＡｃへ結合しているＧａｌへ加えられる以外Ｒ₁と類似
である。

【００４４】Ｒ₃はＧａｌがβ１，３−ＧａｌＴを介してβ１，３結合でＧｌｃＮＡｃへ結
合しており、Ｆｕｃがα１，４−ＦＴを介してα１，４結合でＧｌｃＮＡｃへ結
合している以外Ｒ₁と類似である。

【００４５】Ｒ₄は、ＮｅｕＡｃ基がＣＭＰＮｅｕＡｃの存在下でα２，３−ＳＴを介して
α２，３結合で、ＧａｌＮＡｃへ結合しているＧａｌへ加えられる以外Ｒ₃と類
似である。

【００４６】Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇およびＲ₈は、硫酸基がＧｌｃＮＡｃへ結合している以外それぞ
れＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、およびＲ₄と類似である。

【００４７】Ｒ₉およびＲ₁₁は、ＧａｌＮＡｃに対するβ１，３結合でのＧａｌを欠いてい
る以外、それぞれＲ₁およびＲ₇と類似である。

【００４８】Ｒ₁₀はＲ₉と類似であるが、硫酸基がＧｌｃＮＡｃに結合している。

【００４９】Ｒ₁₂はＲ₂と類似であるが、末端Ｇａｌ基へのβ１，３結合でのシアリルルイ
ス^X基を持つ。

【００５０】Ｒ₁₃はＲ₁₂と類似であるが、ＧａｌＮＡｃに結合するＧａｌへのα２，３結合
でＮｅｕＡｃを持つ。

【００５１】Ｒ₁₄はＲ₁₂と類似であるが、末端ＮｅｕＡｃが末端Ｇａｌ基へのβ１，３結合
でのシアリルルイス^X基で置換されている。

【００５２】Ｒ₁₅はＲ₁₄と類似であるが、ＧａｌＮＡｃに結合しているＧａｌへのα２，３
結合でＮｅｕＡｃを持つ。

【００５３】基Ｒ₁〜Ｒ₁₅は本明細書で意図した糖硫酸ペプチドを含みうるＯ−型糖鎖の例
である。当業者によって、これらのＲ基が本発明の糖硫酸ペプチドを合成するの
に使用可能である多くのＯ−型糖鎖の単なる見本であることが理解されるであろ
う。

【００５４】実施例８上述したように、その最も基本的な形態での本発明は、ジペプチドの最初のア
ミノ酸へ結合している硫酸基および第二アミノ酸に結合している糖を含んでいる
ジアペプチドを意図し、そこで糖はシアリルルイス^X基であるか、またはその一
部分としてシアリルルイス^X基を含む。好ましくは、多糖はペプチドへＯ−型結
合しているＯ−型糖鎖である。硫酸が結合している最初のアミノ酸はチロシン（
Ｔｙｒ）である。Ｏ−型糖鎖が結合している第二アミノ酸は、好ましくはスレオ
ニン（Ｔｈｒ）またはセリン（Ｓｅｒ）残基であり、しかしＯ−型糖鎖がＯ−結
合で結合できる任意の他のアミノ酸残基であってよい（たとえばチロシン、ヒド
ロキシプロリンまたはヒドロキシリシン）。

【００５５】本発明はさらに糖鎖がアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタ
ミン、アルギニン、リシン、システインなどのアミノ酸を介してペプチドにＮ−
型結合で結合してよいことを意図する。本発明は、ペプチドが糖を含むように共
有的に派生されてよいことを意図する。本明細書で定義したそのようなジペプチ
ドの例を、式中Ｘ_Aがスレオニン、セリンまたは糖が結合してよい他の残基を表
し、Ｒが実施例７にて定義した（そして図６Ａ〜６Ｃで示した）Ｒ基Ｒ₁〜Ｒ₁₅
を表す式ＡおよびＢとして図７に示す。ペプチドが本発明にしたがった機能持つ
、すなわちＰ−セレクチンへ高い親和性で結合することが可能である場合、Ｒは
もちろん図６Ａ〜６Ｃで示さなかった他のＯ−型糖鎖であってよい。

【００５６】本発明はさらに図８で式ＡおよびＢとして表されたようなペプチドを意図する
。図８での糖硫酸ペプチドは［Ｘ_B］_kで表現した１つ以上のアミノ酸残基を、硫
酸結合残基（チロシン）およびＯ−型糖鎖結合残基Ｘ_A（すなわち、Ｓｅｒ、Ｔ
ｈｒまたは他のＯ−結合可能残基、天然または派生物）の間においてよいことを
除いて図７で示した糖硫酸ペプチドと同一である。Ｘ_Bは任意のアミノ酸を表し
、ｋは配列中のアミノ酸残基Ｘ_Bの数を表し、好ましい実施形態で０〜１２であ
り得る。ｋ＝０の場合、ペプチドは図７に示したものである。ｋ＝２以上の場合
、Ｘ_Bを含む２または２以上の残基が同じアミノ酸であるか違うアミノ酸であっ
てよい。

【００５７】本発明の特に好ましい実施形態を以下に化合物Ｉとして示し、式中糖硫酸ペプ
チドはこのペプチドのＮ−末端に硫酸チロシン残基、Ｃ−末端にＯ−型糖鎖化結
合残基（ＴｈｒまたはＳｅｒなど）をもつ硫酸チロシン残基をもつヘプタペプチ
ドを含む。ＧＳＰは以下に示すようなＸ₁、Ｘ₂，Ｘ₃、Ｘ₄およびＸ₅として表し
た５つの中間アミノ酸を含む。１つの実施形態において、Ｘ₁はアスパラギン酸
、Ｘ₂はフェニルアラニン、Ｘ₃はロイシン、Ｘ₄はプロリン、Ｘ₅はグルタミン酸
である。好ましくは、ヘプタペプチドには、天然に存在するか組換え体として発
現した型のＰＳＧＬ−１の断片、すなわちＰＳＧＬ−１の分解から得ることがで
きない断片からそれを区別する成分（アミノ酸またはグリコシル成分）が含まれ
る。

【００５８】たとえば、ＧＳＰは１つ以上のＸ₁〜Ｘ₅が存在しない７つより少ないアミノ酸
残基が含まれてよい。あるいは、任意の１つ以上のＸ₁〜Ｘ₅が異なるアミノ酸で
置換され、好ましくは１つは置換されているアミノ酸と同様の機能特性を持って
いてよい。あるいは、Ｘ₁〜Ｘ₅は同じアミノ酸の繰り返し、たとえば５つのグリ
シン残基を含んでよい。とりわけ好ましい場合においてはペプチドはチロシンと
糖鎖が結合するＯ−結合残基の間の部分で１つのプロリン残基を含む。

【００５９】

【化２】

【００６０】実施例９図９で式ＡおよびＢとして表した糖硫酸ペプチドは、それぞれのペプチドがそ
れぞれｊまたはｎ追加アミノ残残基［Ｘ_C］および／または［Ｘ_D］によってＮ−
末端および／またはＣ−末端方向で（それぞれ図９Ａ、Ｂ）伸張してよいことを
除いて図８での糖硫酸ペプチドと本質的に同様であり、式中ｊおよびｎは本発明
の好ましい場合において０〜１２であってよく、［Ｘ_C］および［Ｘ_D］は任意の
アミノ酸を表すである。たとえばＸ_CまたはＸ_Dはそれぞれ同一であるか、または
異なるアミノ酸を含んでよい１つ以上のアミノ酸を含んでよい。

【００６１】さらに、本明細書で糖硫酸ペプチドは図１０Ａおよび１０Ｂで示したような１
つ以上の硫酸チロシン残基を含んでよいことを意図する。図１０Ａ〜Ｂは、１つ
、２つまたは３つの硫酸チロシン残基を持っている多くの好ましい糖硫酸ペプチ
ドＡ−Ｎを示す。たとえば糖硫酸ペプチドＡおよびＨは、それぞれそこに結合し
ている硫酸基を持っている３つのチロシン残基を含む。糖硫酸ペプチドＢ、Ｃ、
Ｄ、Ｉ、ＪおよびＫはそれぞれ２つの硫酸チロシン残基を持っている。糖硫酸ペ
プチドＥ、Ｆ、Ｇ、Ｌ、ＭおよびＮはそれぞれ１つの硫酸化チロシン基を持って
いる。図１０Ａおよび１０Ｂに表した糖硫酸ペプチドは、当業者によって評価さ
れるであろうように本明細書で意図した化合物のただ１つのサブセットであり、
より多いかより少ないアミノ酸残基を持っていてよい。

【００６２】好ましくは、糖硫酸ペプチドは、ＧａｌＮＡｃへのβ１，６結合を含んでいる
Ｏ−型糖鎖を含む。本発明のとりわけ好まし実施形態において、糖硫酸ペプチド
のＯ−型糖鎖はコア−２基礎である。

【００６３】実施例１０特定の型のＧａｌＮＡｃへの結合が固定化ｓＰＳへのＧＳＰ−６の結合に重要
であるかどうかを調べるために、構造がＧＳＰ−６に対して異性体である新規糖
硫酸ペプチドを合成した。コア−１ＧＳＰ−６と称する（図１１）この糖硫酸
ペプチドは、コア−２基礎（β１，６結合）Ｏ−型糖鎖上よりも伸張したコア−
１基礎Ｏ−型糖鎖上にｓＬｅ^Xをもつ（Ｃ１−Ｏ−ｓＬｅ^X）。コア−１−ＧＳＰ
−６の合成での鍵となる工程は、Neisseria meningitidis IgtAからの組換え体
β１，３−ＧｌｃＮＡｃＴ(Blixtら、Glycobiology, In Press, 1999)によるコ
ア−１Ｏ−型糖鎖中のＧａｌ残基へのβ１−３結合でのＧｌｃＮＡｃの添加で
ある。この糖ペプチドを続いてβ１，４−ＧａｌＴ、α２，３−シアリルＴおよ
びα１，３−ＦｕｃＴの活性によって修飾し、伸張したコア−１Ｏ−型糖鎖上
にｓＬｅ^Xを持つ糖ペプチドを合成した。この化合物をＴＰＳＴ−１の活性によ
ってコア−１ＧＳＰ−６へ変換した。質量スペクトル解析により最終産生物の
予測される大きさを確認した。

【００６４】予想外に、コア−１ＧＳＰ−６は固定化ｓＰＳに結合しなかった。伸張した
コア−１Ｏ−型糖鎖上のｓＬｅ^Xの存在を確認するために、ＥＬＩＳＡをｓＬｅ
^X決定基を認識するモノクローナル抗体、２Ｈ５(Sawadaら、Biochem. Biophys.
Res. Commun., 193:337-347, 1993)を用いて行った。２Ｈ５は固定化ＧＰ−６お
よびコア−１ＧＰ−６に結合するが、ｓＬｅ^Xを欠いている対照糖ペプチドＧＰ
−２には結合しなかった（データは示していない）。このことはコア−１ＧＰ
−６上のｓＬｅ^X決定基の発現を確証している。これらの結果は、好ましくは固
定化ｓＰＳへの糖硫酸ペプチド−６の結合に関して、ｓＬｅ^X糖鎖がβ１，６結
合していることを示している。

【００６５】有用性本発明は炎症疾患に悩んでいる患者の処置のための方法を提供し、そのような
疾患状態はその必要性において患者へ本発明の化合物の効果量を投与することで
処置してよい。本発明はさらに、効果量の本発明の化合物で患者を処理すること
によって、炎症応答を促進するために患者を処置する方法を提供する。

【００６６】治療的に効果量の本発明の化合物は、炎症応答を制御し、減少させまたは促進
するのに効果的である量を言う。用語「制御する」は、疾患の進行を遅くさせ、
遮り、阻止し、または停止させるようなすべての工程を意味することを意図し、
しかし必ずしもすべての疾患症状の全除去を示さない。

【００６７】用語「治療的に効果量」はさらに、結果として炎症応答の任意のパラメータま
たは臨床症状特性の改善となるような量を定義することを意味する。実際の投与
量はさまざまな特定の分子に対して異なり、患者のすべての状態、症状の深刻さ
および反対刺激で変化するであろう。

【００６８】本明細書で使用したように、用語「対象」または「患者」は、特定の炎症疾患
状態に悩んでいる哺乳動物のような温血動物を意味する。ギニーブタ、イヌ、ネ
コ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヒトがこの用語の意味の範囲内
の動物の例であることが理解される。

【００６９】本明細書で記述した処置で使用した治療的に効果量の化合物は、従来の技術の
使用によっておよび類似状況下で得られた観察結果によって、当業者のような担
当診断医によって容易に決定されうる。治療的に効果的な量を決定することにお
いて、多くの因子が担当診断医によって熟考され、哺乳動物の種、その大きさ、
年齢および一般的な健康、含まれる特定の疾患、含有または疾患のひどさの程度
、個々の患者の応答、投与した特定の化合物、投与形態、投与した調製品のバイ
オアベイラビリティー特性、選択した投与管理、付随薬物の使用および他の関連
する状況が含まれるが、限定はしない。

【００７０】治療的に効果量の本発明の組成物は一般的に、約０．１μｇ／ｋｇから約５０
ｍｇ／ｋｇ（活性成分の重量／患者の体重）を伝送するのに十分な活性成分を含
む。好ましくは、組成物が少なくとも０．５から１０ｍｇ／ｋｇ伝送され、より
好ましくは少なくとも１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇである。

【００７１】本発明の方法の実施には治療的に効果量の活性成分を、任意の適切な全身また
は局所処方で、以上に列記した投与量を伝送するのに効果的な量で患者に投与す
ることが含まれる。活性化された好中球を本質的に阻害するための効果的な、と
りわけ好ましい糖硫酸ペプチド（たとえばＧＳＰ−６）の投与量は、１μｇ／ｋ
ｇから１ｍｇ／ｋｇである。投与量は１回主薬で投与でき、または（たとえば）
１日あたり１から５回投与できる。

【００７２】投与の好ましい量および形態は当業者によって決定されうる。処方を調製する
技術分野の当業者は、処置すべき疾患状態を選択した化合物、疾患の段階、およ
び例えばRemigton's Pharmaceutical Science, lastest, edition, Mack Publis
hing Co.に記述された本技術分野で公知の処方技術を用いた他の関連状況に依存
して投与の適切な形および形態を容易に選択できる。

【００７３】薬理学的組成物は本技術分野で公知の技術を用いて製造されうる。一般的に治
療的効果量の化合物は薬理学的に許容可能な担体と混ぜられる。

【００７４】本発明の化合物または組成物はさまざまな経路、たとえば経口または非経口（
すなわち皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内または気管内）によって投与してよい。

【００７５】経口投与に対して、化合物を、カプセル、丸剤、錠剤、トローチ剤、溶解剤、
粉末、懸濁液またはエマルションのような固体または液体調製品内に処方する。
固体ユニット投与形態はたとえば界面活性剤、潤滑剤およびラクトース、スクロ
ースおよびコーンデンプンのような内部充填剤を含む通常のゼラチン型のカプセ
ルであってよく、これらは放出調製品を支持しうる。

【００７６】他の実施形態において、本発明の化合物は、アカシアゴム、コーンデンプンま
たはゼラチンのような結合材、ジャガイモデンプンまたはアルギニン酸のような
分離剤、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤との組合
せで、ラクトース、スクローズおよびコーンデンプンのような従来の錠剤主薬で
錠剤化しうる。液体調製品は活性成分を、本技術分野で公知の懸濁剤、甘味剤、
芳香剤、および保存剤を含んでもよい水様または非水様性薬理学的に許容可能な
溶媒に溶解することで調製する。

【００７７】非経口投与に関して、化合物を薬理学的に許容可能な薬理学的担体内に溶解し
てよく、溶液としてまたは懸濁液としていずれかで投与してよい。好ましい薬理
学的担体の実例は水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エ
タノールまたは動物、植物または合成起源の油である。薬理学的担体はまた保存
剤および本技術分野で公知のような緩衝液も含んでよい。

【００７８】本発明の化合物はまた局所的に投与することもできる。このことは、好ましく
は他の賦形剤と一緒またはなしで、エタノールまたはジメチルスルフォキシド（
ＤＭＳＯ）のような経皮吸収を促進することが知られている溶媒を用いた、投与
すべき化合物の溶液の簡単な準備によって行ってよい。好ましくは局所投与は貯
蔵および多孔性膜型の、または固体マトリックス種類のどちらかのパッチを用い
て行いうる。

【００７９】上述するように、化合物はまた適切な担体をも含む。局所使用に対して、任意
の従来の賦形剤が、ローション、軟膏、粉末、クリームまたはエアゾル内に活性
成分を処方するために加えてよい。外科的移植に対して、活性成分は、ポリ乳酸
およびコラーゲン処方のような任意のよく公知の生物分解性および生物腐食性担
体と混合してよい。そのような物質は固体埋没物、縫合糸、スポンジ、傷包帯な
どの形状でよい。とにかく、物質の局所使用に関して、活性成分は、約１：１０
００から１：２０，０００の重量比で通常担体または賦形剤中に存在し、しかし
この範囲内の比には限定されない。局所投与のための組成物の調製は、Remingto
n's Pharmaceutical Science, lastest edition, (Mack Publishing)に詳述され
ている。

【００８０】さらなる薬理学的方法を活性の持続時間を制御するように使用してよい。制御
放出調製品はポリマーの使用を通して、本明細書で記述した糖硫酸ペプチドを複
合化または吸収するために成し遂げられてよい。制御された伝送は、放出を制御
するために、適切な高分子（たとえば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニ
ル、ピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメ
チルセルロースまたはプロタミン、硫酸）および適切な高分子濃度、および組み
込みの方法を選択することで成し遂げられてよい。

【００８１】制御放出調製品による活性持続時間の制御に有用な他の可能性のある方法は、
糖硫酸ペプチド分子またはその機能的派生物の、ポリエステル、ポリアミノ酸、
ハイドロゲル、ポリ（乳酸）のような重合化物質またはエチレンビニルアセテー
トコポリマーの粒子内への組み込みである。

【００８２】あるいは、ＧＳＰの重合化粒子内への組み込みの代わりに、これらの物質を、
コロイド薬物伝送系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロカプセル、ミク
ロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）で、またはマクロエマルション
で、たとえばコアセルベーション技術によって、または界面重合化によって（た
とえば、それぞれヒドロオキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプ
セルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）によって調製し
たミクロカプセル内に閉じこめることが可能である。このような技術はRemingto
n's Pharmaceutical Scienceの最新板で開示されている。

【００８３】薬学米国特許第４，７８９，７３４号はリポソーム内に生物学的物質を包む方法を
記述している。本質的に、物質を水様溶液に溶解させ、適切なリン脂質および脂
質を必要なら界面活性剤と共に加え、必要なように、物質を透析または音波処理
する。公知の方法の良い概論が、G. Gregoriadis，１４章、「リポソーム(Lipos
omes)」，Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341(Academic Pre
ss, 1979)によってされている。ポリマーまたはタンパク質から形成するミクロ
スフェアが当業者によく公知であり、消化管を通して直接血流への通過をするよ
うにできる。あるいは、薬剤を組み込み、ミクロスフェアまたはミクロスフェア
の混合物を、日から月の範囲の期間を超えてゆっくり放出するように埋め込むこ
とができる。たとえば、米国特許第４，９０６，４７４号、第４，９２５，６７
３号、第３，６２５，２１４号を参照のこと。

【００８４】組成物が注射可能物質として使用すべき場合、従来の注射可能な担体内に処方
できる。好ましい担体には、生体適合性および薬理学的に許容可能なリン酸緩衝
生理食塩水が含まれ、これは好ましくは等張である。

【００８５】用語「炎症」は特異的および非特異的防御系両方の反応を含むことを意味する
。特異的防御系反応は、抗原に対する特異的免疫系反応応答である。特異的防御
系反応の例には風疹ウイルスのような抗原に対する抗体反応および（たとえばマ
ントー（Ｍａｎｔａｕｘ）試験での「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」と判断された
個人で見られるような）Ｔ細胞によって仲介される遅延型過敏症応答が含まれる
。

【００８６】非特異的防御応答は、免疫学的記憶がない白血球によって仲介される炎症反応
である。そのような細胞には顆粒球、マクロファージ、好中球などが含まれる。
非特異的防御反応の例には、蜂に刺された部位での即効性膨張、やけどの部位誘
導される赤化および細胞浸潤および細菌感染部位でのＰＭＮ好中球の集積（たと
えば細菌性肺炎での肺浸潤、膿瘍での膿形成）が含まれる。

【００８７】本発明はとりわけ急性炎症の場合に好適であるけれども、慢性炎症に対しても
使用される。本発明で処置しうる炎症の型には拡散炎症、外傷性炎症、免疫抑制
、毒性炎症、特異的炎症、反応性炎症、実質炎症、閉塞性炎症、腸管炎症、クル
ープ性炎症および焦点炎症が含まれる。

【００８８】本発明がリウマチ様関節炎、急性および慢性炎症、貧血後（再灌流）白血球仲
介組織障害、急性白血球仲介肺損傷（たとえば成人呼吸促進症候群）および急性
炎症の他の組織または器官特異的型（たとえば糸球体腎炎）のような炎症疾患工
程の診断、モニタリングおよび治療に容易に適応するであろうことが評価される
であろう。

【００８９】本発明にしたがった凍結乾燥産生物の還元に対して、滅菌希釈液を使用してよ
く、これには一般的に生理学的条件に近づけるためにおよび／または政府の規制
によって要求されたように許容された物質を含んでよい。この観点において、滅
菌希釈液は生理学的に許容可能なｐＨを得るための緩衝剤、たとえば塩化ナトリ
ウム、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、および／または生理学的に許容可能
および／または使用に対して安全な他の基質を含んでよい。一般的に、ヒトでの
静脈内注射のための物質は、米国食品医薬品局保健によって設定された制限に適
応しなければならず、当業者に対して利用可能である。

【００９０】薬理学的組成物はまた、多くの凍結乾燥産生物の還元について上で記述された
のと同様の基質を含む水溶液の形状でもあってよい。

【００９１】物質はまた薬理学的に許容可能な酸−または塩基−添加塩として投与すること
もでき、塩化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸および
リン酸のような無機塩、およびギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸
、ピルビン酸、蓚酸、マロン酸、琥珀酸、マレイン酸、フマル酸のような有機酸
との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリ
ウムのような無機塩基およびモノ−、ジ−およびトリアルキルおよびアリールア
ミンおよび置換エタノールアミンのような有機塩基との反応によって形成される
。

【００９２】以上で言及したように、本発明の産生物は、治療的目的で使用してよい薬理学
的調製品内へ組み込んでよい。しかしながら、用語「薬理学的調製品(pharmaceu
tical preparation)」は、本明細書の広い意味において、本発明による糖硫酸ペ
プチド組成物を含んでいる調製品を含むことを意図し、治療的目的に対してだけ
ではなく、本技術分野で公知のような試薬または診断目的に対して、または組織
培養に対しても使用することを意味する。治療的使用に対して意図した薬理学的
調製品は「薬理学的に許容可能(pharmaceutical acceptable)」なまたは「治療
的に効果量(therapeutically effective amount)」のＧＳＰ、すなわち保護また
は治療の健康測定のために必要な量を含むべきである。薬理学的調製品が薬剤ま
たは診断的に利用される場合、薬剤または診断量のＧＳＰを含むべきである。

【００９３】他の有用性本発明はさらにオリゴサッカライドの産出の方法を含む。本方法において、糖
ペプチドは本明細書ですでに記述したように合成する。糖ペプチドを、糖が結合
しているペプチド上の糖とアミノ酸残基間の結合の開裂を引き起こすβ−脱離に
かけ、したがって遊離オリゴサッカライドまたは糖を産出する。たとえば１つの
場合、β−脱離反応には糖ペプチドを５０ｍＭＮａＯＨおよび１Ｍホウ化水素
ナトリウムで５０℃にて１６時間処理することが含まれる。これらのオリゴサッ
カライドはたとえば他の解析の標準物として使用しうる。

【００９４】本明細書で産出した糖硫酸ペプチドの他の有用性は、コア−２シアリルルイス
^X基に反応するモノクローナル抗体とコア−１シアリルルイス^X基と反応するもの
との間の区別を可能にするためのＥＬＩＳＡ技術での特異的ＧＳＰの使用である
。

【００９５】したがって、同定された、モノクローナル抗体を糖タンパク質のエピトープを
特性化するために、たとえばコア−２ＳＬｅ^X基を持つ糖タンパク質と、コア−
１ｓＬｅ^Xを持つものとを定義するために使用できる。

【００９６】本明細書で合成したＧＳＰの他の有用性は、ＧＳＰが特異的な糖転移酵素に対
する優れたアクセプターであることである。このことは、特異的な糖転移酵素ま
たは硫酸転移酵素が存在するかについて組織をアッセイすることを可能にする。

【００９７】本明細書で合成したＧＳＰの他の有用性は、グリコシルまたは硫酸基の放出を
引き起こす特異的なグリコシダーゼについて組織をアッセイすることである。Ｈ
ＰＬＣを特異的ＧＳＰがアッセイ中で変化するかどうかを決定するために、した
がって組織試料中にグリコシダーゼが存在するかしないかを指し示すために使用
する。

【００９８】本発明はさらに、セレクチン上の細胞結合部位へ結合するのに十分な量で、本
明細書での記述した糖硫酸ペプチド化合物へセレクチンをさらすことを含む、セ
レクチンへの細胞の結合の阻害の方法を含む。

【００９９】本明細書で列記したすべてのアッセイ方法は、よく本明細書で提供された技術
を与える分野の当業者の能力の範囲内である。

【０１００】本明細書で引用されたすべての参考文献はそのすべてが参考文献としてここに
組み込まれる。

【０１０１】そのような実施形態は、本発明の１つの観点の単独の例示として意図しており
、任意の機能的に同等の実施形態は本発明の意図の範囲内であるので、本発明は
、本明細書で記述した特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。
さらに、本明細書で示し、記述したようなものに加えて本発明のさまざまな修飾
が先の記述および付随する図面より当業者に対して明らかになるであろう。その
ような修飾は付属する請求項の意図の範囲内に落ち着くことを意図している。

【０１０２】処方においておよび本明細書で記述したさまざまな組成物の使用または本明細
書で記述した方法の工程または連続した工程において、以下の請求項で定義され
たような本発明の意図から逸脱することなしに変更が行われてよい。

【０１０３】（略語一覧）ＵＤＰＧａｌＮＡｃ＝ウリジンジホスホＮ−アセチルガラクトサミン α−ＧａｌＮＡｃＴ＝ＵＤＰＧａｌＮＡｃ：Ｓｅｒ／Ｔｈｒ αＮ−アセチル−
ガラクトサミニルトランスフェラーゼＵＤＰＧａｌ＝ウリジンジホスホガラクトース β１，３−ＧａｌＴ＝ＵＤＰＧａｌ：ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ β１
，３−ガラクトシルトランスフェラーゼＵＤＰＧｌｃＮＡｃ＝ウリジンホスホＮ−アセチルガラクトサミン β１，６−ＧｌｃＮＡｃＴ＝ＵＤＰＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ
α１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＧｌｃＮＡｃへのＧａｌＮＡｃ）β１，６−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニルトランスフェラーゼ β１，４−ＧａｌＴ＝ＵＤＰＧａｌ：ＧｌｃＮＡｃ β１，４−ガラクトシルト
ランスフェラーゼＣＭＰＮｅｕＡｃ＝シトシンモノホスホＮ−アセチルノイラミン酸 α２，３−ＳＴ＝ＣＭＰＮｅｕＡｃ：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌへの
ＮｅｕＡｃ）α２，３−シアリルトランスフェラーゼＧＤＰＦｕｃ＝グアノシンジホスホフコース α１，３−ＦＴ＝ＧＤＰＦｕｃ：（＋／−ＮｅｕＡｃα１−３）Ｇａｌβ１−４
ＧｌｃＮＡｃ（ＧｌｃＮＡｃへのＦｕｃ）α１，３−フコシルトランスフェラー
ゼＰＡＰ硫酸＝ホスホアデノシンホスホ硫酸ＴＰＳＴ＝チロシルタンパク質硫酸トランスフェラーゼ

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】

【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは本発明による糖硫酸ペプチドの合成の方法を記述した概略
図である。図１Ａおよび１Ｂにおいて、糖硫酸ペプチドＡｃＧＰ−１は配列番号：６によ
って表し、ＧＰ−１は配列番号：７で、ＧＰ−２は配列番号：８で、ＧＰ−３は
配列番号：９で、ＧＰ−４は配列番号：１０で、ＧＰ−５は配列番号：１１で、
ＧＰ−６は配列番号：１２で、ＧＳＰ−６は配列番号：１３で表す。

【図２Ａ】

【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、本発明による糖硫酸ペプチドの合成の代替方法を記述し
た概略図である。図２Ａおよび２Ｂにおいて、硫酸ペプチドＰ−１は配列番号：１４によって表
し、ＧＰ−１は配列番号：７で、ＧＰ−２は配列番号：８で、ＧＰ−３は配列番
号：９で、ＧＰ−４は配列番号：１０で、ＧＰ−５は配列番号：１１で、ＧＰ−
６は配列番号：１２で、ＧＳＰ−６は配列番号：１３で表す。

【図３Ａ】

【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは本発明による糖硫酸ペプチドの合成の他の代替方法を記述
した概略図である。図３Ａおよび３Ｂにおいて、糖硫酸ペプチドＡｃＧＳＰ−１は配列番号：１５
によって表し、ＧＳＰ−１は配列番号：１６で、ＧＳＰ−２は配列番号：１７で
、ＧＳＰ−３は配列番号：１８で、ＧＳＰ−４は配列番号：１９で、ＧＳＰ−５
は配列番号：２０で、ＧＰ−６は配列番号：１２で、ＧＳＰ−６は配列番号：１
３で表す。

【図４】図４は本発明による糖硫酸ペプチドの合成の他の代替方法を記述した概略図で
ある。図４において、糖硫酸ペプチドＡｃＧＳＰ−２−１は配列番号：２１によって
表し、ＧＳＰ−２−１は配列番号：２２で、ＧＳＰ−２−２は配列番号：２３で
、ＧＳＰ−２−３は配列番号：２４で、ＧＳＰ−２−４は配列番号：２５で表す
。

【図５】図５は好中球の固定した可溶性Ｐ−セレクチンへの接着におけるさまざまな化
合物の効果を示しているグラフである。

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、本発明によって意図された糖硫酸ペプチドのＯ−
型糖結合部位を含むであろうものの中の多くのＲ基の化学的構造を示す。

【図７】図７は本発明で意図された糖硫酸ペプチドの式を表し、式中Ｒ基は図６でのも
のを表す。

【図８】図８は本発明によって意図された糖硫酸ペプチドの他の実施形態の式を示し、
式中Ｒ基は図６Ａ−６Ｃで表したものである。

【図９】図９は本発明によって意図された糖硫酸ペプチドのさらに他の実施形態の式を
示し、式中Ｒ基は図６Ａ−６Ｃで表したものである。

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは本明細書で意図された多くの糖硫酸ペプチドに対する
特定のアミノ酸配列を示し、この糖硫酸ペプチドは１つから３つの硫酸を含んで
よく、Ｒ基は図６Ａ〜６Ｃで定義したようなＲ₁〜Ｒ₁₅である。図１０Ａおよび１０Ｂにおいて、糖硫酸ペプチドＡは配列番号：２６によって
表し、Ｂは配列番号：２７によって、Ｃは配列番号：２８によって、Ｄは配列番
号：２９によって、Ｅは配列番号：３０によって、Ｆは配列番号：３１によって
、Ｇは配列番号：３２によって、Ｈは配列番号：３３によって、Ｉは配列番号：
３４によって、Ｊは配列番号：３５によって、Ｋは配列番号：３６によって、Ｌ
は配列番号：３７によって、Ｍは配列番号：３８によって、Ｎは配列番号：３９
によって表す。

【図１１】図１１はコア−１Ｏ−結合型糖鎖を含む糖硫酸ペプチドの式を示す。コア−
１−糖硫酸ペプチド−６は配列番号：４０によって表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月１４日（２０００．１．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３９】実施例６本発明の合成糖硫酸ペプチドがＰ−セレクチンと相互作用するかどうかを調べ
るために、異なる結合濃度での組換え体可溶性Ｐ−セレクチン（ｓＰＳ）を含む
アフィニティークロマトグラフィーの組を調製した。異なるカラム濃度はＰ−セ
レクチンに対する合成糖硫酸ペプチドの相対的親和性を見積もることを可能にす
る。図１での糖硫酸ペプチド−６（ＧＳＰ−６）と同様の構造を持っている放射
標識化糖硫酸ペプチドを、Ｃａ²⁺含有緩衝液中の固定化ｓＰＳへ載せた。ＧＳＰ
−６の溶出は１．３および１．６ｍｇ／ｍｌｓＰＳを含むカラム上でリタード
された(retarded)。ＧＳＰ−６は２．０ｍｇ／ｍｌｓＰＳを含むカラムに結合し
、ＥＤＴＡで溶出しうる。チロシン上の硫酸を欠く他の糖ペプチドまたはｓＬｅ ^X 決定基を欠く糖硫酸ペプチドはｓＰＳに対する検出可能な親和性を持たない。
この結果は、結合に対する硫酸化チロシンとｓＬｅ^Xの二重の重要性を示してい
る。フコース残基を欠く糖硫酸ペプチドもまた固定化ｓＰＳに検出可能には結合
しなかった。これらの結果は、ｓＬｅ^X基のシアル酸とフコース両方がＧＳＰ−
６の固定化ｓＰＳへの高親和性結合に必要であることを示している。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６５】有用性本発明は炎症疾患に悩んでいる患者の処置のための方法を提供し、そのような
疾患状態はその必要性において患者へ本発明の化合物の効果量を投与することで
処置してよい。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６６】治療的に効果量の本発明の化合物は、炎症応答を制御しまたは減少させるのに
効果的である量を言う。用語「制御する」は、疾患の進行を遅くさせ、遮り、阻
止し、または停止させるようなすべての工程を意味することを意図し、しかし必
ずしもすべての疾患症状の全除去を示さない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者マクエヴァー，ロジャー，ピー．アメリカ合衆国，73120 オクラホマ州，オクラホマシティー，ガイルフォードレイン 1716 Ｆターム(参考） 4H045 AA10 BA17 BA53 EA22 FA30 FA70 FA74 GA22 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式：【化１】（式中：Ｔｙｒはチロシン残基であり；ＳＯ₃ ^-はチロシン残基に結合した硫酸基であり；Ｘ_AはＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基であり；ＲはＸ_AにＯ−またはＮ−結合しているシアル酸付加、フコース付加したＮ−ア
セチルラクトースアミノグリカンであり；Ｘ_B、Ｘ_CおよびＸ_Dはアミノ酸残基であり；ならびにｊ、ｋおよびｎはおのおの０から１２であり、ここで各々のアミノ酸配列［Ｘ_B
］_j、［Ｘ_C］_kまたは［Ｘ_D］_nは０から１２個のアミノ酸を有し、ただしこの化
合物はアミノ酸３８個以下である化合物、を有する化合物。
【請求項２】Ｘ_Cが１または２個の硫酸チロシン残基を有してなる請求項
１に記載の化合物。
【請求項３】ｊ＝０から１０、ｋ＝０から５およびｎ＝０から１０である
請求項１に記載の化合物。
【請求項４】ＲをＲ₁からＲ₁₅からなる群から選択する請求項１に記載の
化合物。
【請求項５】ｊ＝０、ｋ＝０から５およびｎ＝０である請求項１に記載の
化合物。
【請求項６】Ｘ_Bがプロリンを含んでなる請求項１に記載の化合物。
【請求項７】Ｘ_Cがチロシンを含んでなる請求項１に記載の化合物。
【請求項８】図１０のＡからＮの１個を含んでなる請求項１に記載の化合
物。
【請求項９】少なくとも１個のさらにシアル酸付加、フコース付加したア
ミノ酸残基に結合したＯ−グリカンを含んでなる請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】Ｘ_AがＯ−結合アミノ酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】Ｏ−結合アミノ酸残基がセリンまたはスレオニンである請
求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】Ｘ_AがＮ−結合アミノ酸である請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】ＲがＧＡｌＮＡｃに対するβ１，６結合を含んでなる請求
項１に記載の化合物。
【請求項１４】Ｒがコア−２をベースとしている請求項１に記載の化合物
。
【請求項１５】（ａ）少なくとも１個のチロシン残基および側鎖が各々Ｎ
−またはＯ−結合を介して結合できる少なくとも１個のＮ−またはＯ−結合アミ
ノ酸残基を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）各々Ｎ−またはＯ−結合を介して結合できるＮ−またはＯ−結合アミノ
酸残基にＧａｌＮＡｃを結合すること；（ｃ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｄ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｅ）第２のＧａｌをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｆ）シアル酸を第２のＧａｌに酵素的に結合すること；（ｇ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；および（ｈ）硫酸塩をチロシン残基に酵素的に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項１６】側鎖が付くアミノ酸がＯ−結合アミノ酸である請求項１５
に記載の方法。
【請求項１７】Ｏ−結合アミノ酸がセリンまたはスレオニンである請求項
１６に記載の方法。
【請求項１８】側鎖が付くアミノ酸がＮ−結合アミノ酸である請求項１５
に記載の方法。
【請求項１９】工程（ｂ）でＧａｌＮＡｃが酵素的に結合する請求項１５
に記載の方法。
【請求項２０】アセチル化ＧａｌＮＡｃがそこに化学的に結合することに
よりＧａｌＮＡｃのＯ−結合アミノ酸残基への結合の工程が実施され、続いて脱
アセチル化工程が実施される請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】工程（ａ）から（ｇ）のいずれか一つの前または後に工程
（ｈ）が実施される請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】コア−１ β１，３−ＧａｌＴを介してＧａｌがＧａｌＮ
Ａｃに結合する請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】シアル酸がノイラミン酸である請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】工程（ｄ）でβ１，６結合を介してＧｌｃＮＡｃがＧａｌ
ＮＡｃに結合する請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】（ａ）少なくとも１個の硫酸チロシン残基および少なくと
も１個のＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基を含んでなるペプチドを提供すること
；（ｂ）各々Ｎ−またはＯ−結合を介してＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基にＧ
ａｌＮＡｃを結合すること；（ｃ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｄ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｅ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｆ）シアル酸をＧａｌに酵素的に結合すること；および（ｇ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項２６】工程（ａ）のＮ−またはＯ−結合アミノ酸がＯ−結合アミ
ノ酸である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】Ｏ−結合アミノ酸がセリンまたはスレオニンである請求項
２５に記載の方法。
【請求項２８】工程（ａ）のＮ−またはＯ−結合アミノ酸がＮ−結合アミ
ノ酸である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】ＧａｌＮＡｃがアミノ酸残基に結合する工程（ｂ）におい
て、ＧａｌＮＡｃが酵素的に結合する請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】工程（ｂ）においてアセチル化ＧａｌＮＡｃがそこに化学
的に結合することによりＧａｌＮＡｃのアミノ酸残基への結合を実施し、ついで
脱アセチル化工程を実施する請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】コア−β１，３−ＧａｌＴを介してＧａｌがＧａｌＮＡｃ
に結合する請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】シアル酸がノイラミン酸である請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】（ａ）少なくとも１個のチロシン残基、Ｎ−またはＯ−結
合しているＧｌｃＮＡｃを有する少なくとも１個のＮ−またはＯ−結合アミノ酸
残基を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｃ）シアル酸をＧａｌに酵素的に結合すること；（ｄ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；および（ｅ）硫酸塩をチロシン残基に酵素的に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項３４】アセチル化ＧｌｃＮＡｃをそこに化学的に結合することに
よりＧｌｃＮＡｃをスレオニンまたはセリンに結合し、ついでＧｌｃＮＡｃにＧ
ａｌを付ける前に脱アセチル化工程を実施する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】工程（ａ）から（ｄ）のいずれか一つの前または後に工程
（ｅ）を実施する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】シアル酸がノイラミン酸である請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】（ａ）少なくとも１個の硫酸チロシン残基、およびＯ−結
合しているＧｌｃＮＡｃを有する少なくとも１個のスレオニンまたはセリン残基
を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｃ）シアル酸をＧａｌに酵素的に結合すること；および（ｄ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項３８】アセチル化ＧｌｃＮＡｃをそこに化学的に結合することに
よりＧｌｃＮＡｃをスレオニンまたはセリンに結合し、ついでＧｌｃＮＡｃにＧ
ａｌを付ける前に脱アセチル化の工程を実施する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】シアル酸がノイラミン酸である請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】（ａ）ペプチドのＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基に結合
するＧａｌＮＡｃを有するペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｃ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｄ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；（ｅ）シアル酸をＧａｌに酵素的に結合すること；（ｆ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに酵素的に結合すること；およびペプチドからオリゴ糖を切断すること；により結合するオリゴ糖を有するペプチドを合成することを含むオリゴ糖を製造
する方法。
【請求項４１】工程（ａ）のＮ−またはＯ−結合アミノ酸がＯ−結合アミ
ノ酸である請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】Ｏ−結合アミノ酸がセリンまたはスレオニンである請求項
４１に記載の方法。
【請求項４３】工程（ａ）のＮ−またはＯ−結合アミノ酸がＮ−結合アミ
ノ酸である請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】工程（ｂ）においてコア−β１，３−ＧａｌＴを介してＧ
ａｌＶＡｃにＧａｌが結合する請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】シアル酸がノイラミン酸である請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】（ａ）少なくとも１個のチロシン残基および側鎖が各々Ｎ
−またはＯ−結合を介して結合できる少なくとも１個のＮ−またはＯ−結合アミ
ノ酸残基を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）各々Ｎ−またはＯ−結合を介して結合できるＮ−またはＯ−結合アミノ
酸残基にＧａｌＮＡｃを結合すること；（ｃ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｄ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｅ）第２のＧａｌをＧｌｃＮＡｃに結合すること；（ｆ）シアル酸を第２のＧａｌに結合すること；（ｇ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに結合すること；および（ｈ）硫酸塩をチロシン残基に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項４７】（ａ）少なくとも１個の硫酸チロシン残基および少なくと
も１個のＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基を含んでなるペプチドを提供すること
；（ｂ）各々Ｎ−またはＯ−結合を介してＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基にＧ
ａｌＮＡｃを結合すること；（ｃ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｄ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｅ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに結合すること；（ｆ）シアル酸をＧａｌに結合すること；および（ｇ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項４８】（ａ）少なくとも１個のチロシン残基、Ｎ−またはＯ−結
合しているＧｌｃＮＡｃを有する少なくとも１個のＮ−またはＯ−結合アミノ酸
残基を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに結合すること；（ｃ）シアル酸をＧａｌに結合すること；（ｄ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに結合すること；および（ｅ）硫酸塩をチロシン残基に結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項４９】（ａ）少なくとも１個の硫酸チロシン残基、およびＯ−結
合しているＧｌｃＮＡｃを有する少なくとも１個のスレオニンまたはセリン残基
を含んでなるペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに結合すること；（ｃ）シアル酸をＧａｌに結合すること；および（ｄ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに結合すること；を含む糖硫酸ペプチド化合物を製造する方法。
【請求項５０】（ａ）ペプチドのＮ−またはＯ−結合アミノ酸残基に結合
するＧａｌＮＡｃを有するペプチドを提供すること；（ｂ）ＧａｌをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｃ）ＧｌｃＮＡｃをＧａｌＮＡｃに結合すること；（ｄ）ＧａｌをＧｌｃＮＡｃに結合すること；（ｅ）シアル酸をＧａｌに結合すること；（ｆ）ＦｕｃをＧｌｃＮＡｃに結合すること；およびペプチドからオリゴ糖を切断すること；により結合するオリゴ糖を有するペプチドを合成することを含むオリゴ糖を製造
する方法。