JP2002515044A - ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーを配列し合成する迅速方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 均一な大きさのビーズの混合物を、各々接着性の小滴またはマスクの孔を通して暴露される連続した接着層からなる分離した整列領域を確立することにより配列中に付着させる。固着領域に捉えられたビーズを、真空マニホルド上溶媒により、または接着剤の蒸発、好ましくは真空遠心手段により、リリースさせる。ビーズをキャピラリー中にリリースさせ、そこで固着化合物の切断または新たな化合物の合成を行うことができる。本発明を行うための装置を図に示し、これは、側壁を有するマスク(１０)、接着剤被覆フィルム(１２)、キャピラリー配列(１６)、ガスケット（１７）および化学的に耐性なウェルプレート（１８）を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーを配列し合成する迅速方法発明の分野 本発明は、一般に、ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーの取り扱 いに、より詳細には、２次元配列にてビーズを付着するための改良法および装置 に関する。本発明はまた、アレイフォーマットにおけるコンビナトリアルライブ ラリーを合成する改良手段にも関する。発明の背景 ビーズ支持体上のコンビナトリアル化合物ライブラリーの合成は、薬理学的関 連の標的をスクリーニングするための化学的多様性を作成するために、十分に確 立された方法である。かかるライブラリーは、デコンヴォルーションのための識 別タグと共にまたははしで、バルク集団または別々のサブライブラリーとして合 成されてもよい。ほとんどの場合、各ビーズは、単一の独特な化合物を坦持し、 他の化合物を含むビーズの混合物中に存在する。薬理学的標的に対する活性につ いてビーズを試験するため、各ビーズを１またはそれ以上の標的に対して個々に アッセイできるように、ビーズを分離することが望ましい。活性化合物を坦持す るビーズを同定し、化合物の構造を解明することもできる。例えば、１２×８配 列または３８４または１５３６−ウェル構成などの他のフォーマットなどのロボ ットスクリーニングシステムに幾何学的に適合する配列中にビーズを分離するこ ともまた望ましい。ビーズ−ベースのライブラリーの合成および評価への別法は 、ライブラリー成分の合成前にビーズを配列することである。この方法は、各成 分の合成ヒストリーがその配列における位置からわかるという利点を有するが、 特に大きなライブラリーでは、合成方法それ自体が容易でないという欠点を有す る。いずれの方法にも用いることのできる方法および装置は、現在の方法よりも 実質的な改良を示すであろう。 ビーズを配列する現行法は、マニュアルピッキング、および、ビーズを孔を通 して流し、一旦検出されたビーズをアッセイウェル中に付着させる、流体力学ソ ーティングを包含する。マニュアルピッキングは、極端に遅く単調である。流体 力学法は、いくつかの様式に分類し、それゆえ、遅く、流れが滞りやすい．さら に、ビーズライブラリー内の浮力変化が問題を引き起こすことが知られる。それ ゆえ、単一のビーズまたは所定の所望の数のビーズを配列の各ポイントに確実に デリバリーし、ビーズ上の化合物の存在により影響を受けず、いかなる所望のフ ォーマットにも適するように形成できる、ビーズを配列するための、単純な、迅 速方法が必要とされている。 前記に基づいて、ビーズ配列装置および方法における改良が当該分野において 必要とされていることが理解できる。それゆえ、本発明の第一の目的は、ビーズ に固着する化合物の有無にかかわらず、ビーズを配列するための改良方法を提供 することである。本発明の他の目的は、所望の幾何学配列へビーズをデリバリー するための改良法を提供することである。高価でなく、使用が容易で、ビーズ上 の化合物の存在および性質とは無関係に、ビーズを配列するための改良装置を提 供することもまた、本発明の目的である。さらに、配列フォーマットにおけるビ ーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーを合成するための改良装置であっ て、かかる装置が化合物をすでに有するビーズの操作に適合する装置を提供する ことも、本発明の目的である。発明の概要 本発明によれば、ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーに関するビ ーズを配列することは、２つの成分：各々、均一な大きさの限定数のビーズの保 持能を有する一のパターンの別個のビーズ固着領域；およびビーズが自由に分離 し、別個のビーズ固着領域が相互に一定間隔にあるようにする領域を含む、ビー ズ受け取り表面を確立することにより行われる。各ビーズ固着領域が保持できる ビーズの限定数は、１またはそれ以上とすることができ、好ましくは、パターン 中のすべての他のビーズ固着領域に対する数と同じである。均一な大きさのビー ズの混合物を、ビーズ−受け取り表面上に置き、好ましくは、ビーズ混合物を撹 拌することにより、その混合物から所定の数のビーズを別個のビーズ固着領域の 各々に固着させる。別個のビーズ固着領域に結合していないビーズを除去する。 ついで、ビーズ固着領域のパターンに対応するパターンの固着したビーズをリリ ースさせ、配列中に付着させる。 本発明の一具体例において、各別個のビーズ固着領域は、マスク中の孔を通し て暴露される連続した接着層の一部である。ビーズが自由に分離する領域は、マ スクの表面である。もう一つ別の具体例において、ビーズ−受け取り表面を確立 する工程を、一のパターンの基体に微小の接着性小滴を塗布することにより行う 。 固着したビーズをリリースする工程は、好ましくは、ビーズ固着領域のパター ンに対応する配列において固着したビーズをレセプタクルと整列させる工程によ りなされ、次に付着工程をビーズが整列するレセプタクル中にビーズを付着させ ることにより行う。 多孔性基体を用い、ビーズ固着領域が該基体上の接着剤の領域である場合、基 体を溶媒で洗浄することにより固着ビーズをリリースさせ、それにより、ビーズ 固着領域を溶解できる。 コンビナトリアルライブラリーを表す固着化合物を有するビーズの場合、付着 工程の後、好ましくは、ビーズをレセプタクルに残したまま、試薬を用いて各ビ ーズから化合物を切り離す工程を行う。レセプタクルは、好ましくは、付着工程 を行った後にウェルプレートのウェル中にて試薬に同時に浸すことができるよう に整列されたガラスキャピラリーの形態である。ビーズをキャピラリー中に残し たまま、化合物をウェルにて試薬によりビーズから切り離すことができ、その切 り離した化合物を、ついで医薬活性について試験できる。 ビーズ配列上の化合物の合成を、同様な方法を用いて行うことができる。本発 明の事前に配列させたライブラリーの合成の方法を、ブランクビーズをキャピラ リー中に整列させることによって行う。ビーズを含むキャピラリーを、各ウェル が異なる化学試薬を含むマルチウェル容器中に浸す。キャピラリー配列を適当な 試薬プレート中に連続的に移すことにより、化合物をビーズ上に集合させる。一 度完了したら、キャピラリー配列を切断試薬を含むレセプタクル中に移すことに より、化合物をビーズからリリースさせる。 本発明の合成方法は：各々、均一な大きさの限定数のビーズの保持能を有する 一のパターンの別個のビーズ固着領域、および、ビーズが自由に分離し、別個の ビーズ固着領域が相互に一定間隔にあるようにする領域を含む、ビーズ−受け取 り表面を確立する工程を含む。ここではまた、各ビーズ固着領域のビーズの制限 数は、好ましくは、パターン中のすべての他のビーズ固着領域に対する数と同じ である。均一な大きさのビーズの混合物を、ビーズ−受け取り表面に置き、混合 物からの所定の数のビーズを、別個のビーズ固着領域の各々に固着させる。固着 していないビーズを除去し、固着したビーズを、ビーズ固着領域のパターンに対 応するキャピラリーの配列において、キャピラリーと整列させる。固着したビー ズを、ついで、リリースさせ、キャピラリーの配列中に付着させる。配列のキャ ピラリーを、所望の合成工程用の試薬を含むウェル中に同時に導入し、ビーズを キャピラリーに残したまま、合成をビーズ上で行う。合成についで、キャピラリ ー中のビーズを洗浄し、結合しなかった試薬を除去し、合成化合物を切り離す。 本発明の他の特徴は、ビーズ固着領域が連続接着層の部分である場合において 用いる装置の構造にある。該装置は、マスクおよび基体を含む。好ましくは、マ スクはトレイのフロアであり、平行な、第一および第二の面、ならびに、孔の配 列を有し、各孔は、第一の面から第二の面に伸びている。孔は、各孔中に並んで 位置できるビーズの数が所定の数に限定されるように、均一な大きさである。少 なくとも、各孔が１つのビーズのみを受け取るような場合、孔は好ましくは円形 である。好ましくは、基体は、マスクから着脱可能なニトロセルロースの多孔性 シートであり、マスクの第二の面に対向して位置する、第二の面の孔の開口部を 被覆する、接着層、好ましくはエチレングリコールの面を有する。それゆえ、各 孔にて、所定の数のビーズが、接着層上に付着し、粘着することができる。好ま しくは、基体の接着層上のマスクの孔を介して付着されるビーズが、容易にレセ プタクルと整列できるように、レセプタクルの配列との固定された関係にてマス クの保持するための手段を備える。 種々の他の目的、本発明の詳細および利点は、図面と合わせて読む場合、以下 の詳細な記載から明らかになるであろう。図面の簡単な説明 図１は、本発明の第１の具体例を示す分解斜視図である。 図２は、配列方法における工程を示す、マスクおよび接着剤被覆フィルムから なるアセンブリーの部分断面図である。 図３は、配列方法におけるさらなる工程を示す、接着層に粘着したビーズを有 する接着剤被覆フィルムからなるアセンブリーの部分断面図である。 図４は、配列方法におけるさらなる工程を示す、フィルム、および、フィルム 上の接着層からリリースされるビーズのレセプタクルとして用いるキャピラリー チューブの配列からなるアセンブリーの部分断面図である。 図５は、ビーズに坦持される化合物の切断のためのウェルプレート中のウェル に挿入されたキャピラリーチューブを示す部分断面図である。 図６は、本発明の別の具体例を示す分解斜視図である。 図７は、本発明のさらに別の具体例による、基体上への微細な接着性小滴の付 着を示す部分断面図である。 図８は、ビーズのいくつかが、付着した接着性小滴と接触している、基体上の 多数のビーズを示す部分断面図である。 図９は、過剰なビーズを除去した後の、同じ基体の部分断面図である。 図１０は、図９の基体からキャピラリーの配列にビーズを付着させるための、 および、キャピラリー中でビーズを試薬含有ウェルに浸すためのアセンブリーを 示す、分解図である。 図１１は、基体からキャピラリー中へビーズをリリースするのに用いる、真空 遠心機中の図１０のキャピラリー配列を示す部分断面図である。 図１２は、試薬含有ウェル中に浸した、ビーズを含有するキャピラリーを示す 、もう一つ別の部分断面図である。 図１３は、マスクの別の形態を示す斜視図である。 図１４は、図１３のマスクの下面を示す斜視図である。詳細な説明 図１は、本発明の第１の態様にしたがって配列方法を行うのに必要ないくつか の部品を示す。これらの部品には、側壁を有するマスク１０、接着剤被覆フィル ム１２、キャピラリー配列１６、ガスケット１７、および化学的に耐性なウェル プレート１８が包含される。 マスク１０は、剛性エレメントであり、好ましくは、化学的に不活性であり、 ビーズに誘引的または反発的な作用を有する静電気的電荷の蓄積を避けるように 、電気的に接地できるような、ステンレススチールから作成される。好ましくは 、マスクはフロア２０およびフロア２０の上表面上に伸びる側壁２２、２４、２ ６および２８を有するトレイの形態である。トレイのフロアは、頂部面（トレイ の内側）から底面（トレイの下側）に伸びる、円形シリンダー状の孔３０を備え る。図示したマスクでは、１２の縦列と８の横行を有する規則的なパターンにお いて、９６個のかかる孔が設けられる。このパターンは、慣用の９６ウェルのマ イクロタイタープレートのパターンに対応する。隣接する孔の中心は、互いに同 じ距離で離れていて、これにより、隣接するウェルの中心は、互いに、典型的に は０．９ｃｍ離れている。孔の他のパターンを用いることができる。例えば、３ ８４個の孔を１６×２４配列において整列させることができ、８６４個の孔を２ ４×３６配列において整列させることができ、１５３６個の孔を３２×４８配列 において整列させることができる。 配列される所定の混合物中のビーズは、実質的に大きさが均一でなければなら ず、好ましくは、公称ビーズ直径の±２０％の範囲内である。好ましくは、孔は 円形であり、均一な大きさである。その直径は、配列されるビーズの大きさによ る。配列装置に対して、単一のビーズを適切に付着させるために、孔径は、ビー ズ直径の約１．１ないし１．９倍の範囲とすべきである。孔径がビーズ直径の１ ．２５ないし１．７５倍の範囲内である場合に、顕著に改良された結果が得られ る。孔の大きさ、断面の幾何的形態および配列の幾何的形態の最適化を、各配列 ポイ ントにて、単一のビーズの確かな付着の達成を目的として経験的に行ってもよい 。ほとんどの適用において、最適孔径は、ビーズ直径の約１．３倍である。 マスクの各孔にビーズが確かに入ることを確実にするため、孔をマスクの頂部 面と面一にすることが重要である。さもなければ、頂部面から上方に伸びるばり および他の不規則なものが、ビーズの１またはそれ以上の孔中への動きを干渉し 得る。単一ビーズを配列するためのマスクを作成する場合、孔の開口部が規則的 な円となるように、孔を機械工作することも重要である。複数のビーズについて のマスクを作成する場合、孔は例えば長円形などの円形以外の種々の形状であり 得る。マスクの下面における孔の開口部もまた、底面と面一にし、接着層のマス クの下面への塗布、または、ビーズの接着層への最初の付着を干渉するばりまた は他の不規則なものがないようにするべきである。典型的には、２７０μｍの大 きさのビーズに対して３５０μｍ（０．３５ｍｍ）の直径である、孔を精密な穴 あけ、またはレーザー穴あけ、エッチングなどを含む、種々の公知のマイクロ機 械化技術のいずれかにより、形成できる。 接着剤被覆フィルム１２を、マスクの底部表面および各孔の底部開口部の境界 線と、気密接触が得られるように、マスクの下面に当てる。フィルムの好ましい 材料はニトロセルロースであり、これは多孔性であり、ビーズを接着層から取り 除くための溶媒を容易に通すことができるという、利点を有する。フィルムは、 剛性でも可撓性のいずれであってもよい。フィルム１２を方形の中央の開口部３ ２を有するフレーム１４により、マスクの下面に機械的に押し付けることができ る。フレームは、フレームの下面から突出する突起３６中に伸びる、ガイド穴３ ４を備える。ガイド穴は、マスクの下面に取り付けられるピン３８を受け入れる 。ガイド穴およびピンは、フィルムをマスクから取り外した場合、フィルム上の 接着層に粘着するビーズがキャピラリーの開口部と整列するように、フレームが 確実にキャピラリー配列１６と関係して位置するようにする。剛性フィルムの場 合、フレームを削除でき、剛性フィルムの角にガイド穴を設け、フィルムとキャ ピラリー配列との整列を容易にできる。図６を参照して記載される他の具体例に おいて、マスクおよび接着層は互いに固着したままであり、マスクの孔がキャピ ラリ ーの上端と正確に整列できるように、マスクの側壁はキャピラリー配列の側面上 に気密嵌合する。 図１に示すように、接着剤被覆フィルム１２の上側は、適当な接着剤で被覆さ れ、ビーズが結合する粘着性の表面を提供する。接着剤は、ビーズ−相溶性溶媒 中に容易に溶解するものであり、ビーズから容易に除去されるものでなければな らない。ポリスチレンビーズおよびニトロヤルロースフィルムの場合、エチレン グリコールが、メタノールで洗浄することにより容易に除去できるので適当な接 着剤であることが見出され、エチレングリコールおよびメタノールの両者は、質 量分析法を用いる分析法と融和的である。 接着剤を、ビーズが固着するフィルムの面上に暴露しなければならない。しか しながら、接着層は別々の層である必要はない。例えば、多孔性ニトロセルロー スフィルム上のエチレングリコールの場合、ニトロセルロースフィルムは、エチ レングリコールで少なくとも飽和されていなければならない。すなわち、エチレ ングリコールは、フィルムを浸漬し、その後、フィルムを吸湿性の表面に対して プレスすることにより過量のエチレングリコールを除去するか、または、過量を フィルムから流出させるかまたは蒸発させるかまたは遠心分離を用いて、除去す ることにより、フィルム全体に浸透させることができる。 キャピラリー配列１６は、ＰＴＦＥ支持ブロック４２中に固定されたガラスキ ャピラリー４０の一群を含む。所望により、キャピラリーの頂部をフレア状とし てもよく、キャピラリーを着脱可能にブロック４２中に位置させてもよい。キャ ピラリーをマスク中の孔に対応する横行および縦列の配列に配置させる。これら はブロック４２の上表面に開口部４４を有する。これらの開口部は、ビーズがキ ャピラリー中に入るのに十分な大きさがある。開口部はまたキャピラリーの下端 においても設けられるが、下端の開口部は、ビーズがキャピラリーを通過できな いように十分に小さな大きさである。キャピラリーの下部は、ブロック４２の下 面から下方へ突出している。ガイドピン４５は、ブロックの角から上方へ伸びる 。 ウェルプレート１８は、慣用的なＰＴＦＥのウェルプレートであるかまたは他 の適当な化学的に耐性な材料であり、マスクおよびキャピラリーの開口部の配列 に対応するウェル４６の配列を備える。ウェルは、キャピラリーの下部を受け入 れることができる。好ましくは、キャピラリーはブロック４２より下に伸び、ブ ロック４２がウェルプレート１８の頂部にある場合、キャピラリーはウェルの底 部よりブロック４２の下方に伸びる。 ビーズライブラリーを配列するため、マスク１０および接着剤被覆フィルムを 備えるフレーム１４を、図２において示すように、マスクの下面にある調節ピン ３８を突起３６中のガイド穴に挿入して、組み立てる。乾燥ビーズ４８をマスク のフロア２０の頂面上に注ぐ。ついで、マスク、フレームおよび接着剤被覆フィ ルムからなるアセンブリーを、ビーズがマスクフロアの頂部表面全体を覆うよう に、軽く揺り動かす。ビーズはマスクの孔３０中に落ちる。例えば、図２中のビ ーズ５０、５２および５４は、孔３０中に示される。孔径は、ビーズの直径の２ 倍よりも小さいので、各孔中には１つのビーズのみが入る；所定の孔中に２また はそれ以上のビーズが互いに並んで入る可能性はない。 マスクの孔中に落ちたビーズは、フィルム１２上の接着層５６と接触する。ビ ーズが接着剤と接触すると、それらは捕らえられるようになる。マスクは、１つ のビーズだけが各孔で接着剤と接触できるようにする。 接着剤被覆フィルム１２をマスクに固着させたままで、マスクを逆さまにして 、過量のビーズを注ぎ出す。孔中でなくマスクに固着して残るビーズはマスクを 軽くたたくことで除去される。 接着剤被覆フィルムおよびそれに粘着するビーズと共にフレーム１４をマスク から引き離し、図３に示すように逆さまにし、図４に示すように、キャピラリー ブロックのピン４５を穴３４中に嵌合させ、固着ビーズを確実にキャピラリーと 整列させ、キャピラリー支持ブロック４２に固着する。 例えば５０％メタノールおよび５０％水からなる混合物などの溶媒を、フィル ム１２の上表面に塗布する。溶媒はフィルムの孔を通り、接着剤を溶解し、それ により図４に示すようにキャピラリー中にビーズをリリースする。キャピラリー の底の開口部５８はビーズよりも小さいので、ビーズはキャピラリー中に残る。 所望により、リリースプロセスをアセンブリー全体の遠心分離により促進しても よい。 目的とする化合物のビーズからの切り離しを、図５に示すようにキャピラリー がウェルに入るようにキャピラリーブロックをウェルプレート上に置くことで行 う。ガスケットをキャピラリーブロックに組み入れることでシールが得られる。 各ウェル４６は、切断試薬、例えばトリフルオロ酢酸などの酸切断試薬、または 、トリエチルアミンまたはヒドラジンなどの塩基切断試薬を含む。塩化メチレン またはメタノールなどの溶媒を含め、ビーズを膨潤させ、それによりビーズの細 孔を開かせてもよい。これらの付加剤はまた切断試薬によりリリースされる化合 物を溶解するのに供する。ジメチルスルファイドもまた、カルボカチオンスカベ ンチャーとして含め、化合物がビーズへ再び固着するのを妨げてもよい。切断試 薬の蒸発を遅延するため、化学的に耐性なガスケットおよびガラスプレート（図 ５中には図示せず）をキャピラリーの上端上に置いてもよい。 ウェル４６中の液体は、キャピラリーの下端にて開口部５８を通り、ビーズと 接触するようになる。この後、ビーズから切り離された化合物は、ウェル中の液 体中に分散する。ついで、ウェル中の化合物について試験を行うことができるよ うに、キャピラリーブロックを取り外すことができる。 キャピラリーを使用するのは、ビーズが切断試薬と長期間接触したままである 場合、切り離された化合物が、それ自体ビーズに再固着する傾向があるためであ る。キャピラリーは、ビーズを切断試薬から除去することを可能にし、それによ り再固着を妨げる。ビーズに固着したまま化合物を試験することが可能な場合、 または、再固着が他の技術により防げられる場合、ビーズをウェルプレートのウ ェル中へ直接接着剤被覆フィルムからリリースできる。 キャピラリーは化合物合成のための装置の使用のさらなるオプションを提供す る。合成はブランクビーズ、または、共通の前駆体化合物を担持するビーズを、 上記した方法を用いてキャピラリー中に配列することにより行うことができる。 合成用の試薬は好ましくはロボットディスペンサーにより、一連のマルチ−ウェ ルプレート中に分配される。化合物はビーズを含有するキャピラリー配列を試薬 プレート中に挿入することにより組み立てられる。所望により、試薬プレートを 加熱または冷却し、反応温度を調節できる。化学的に耐性なプレートを配列の頂 部に押し付けることにより、キャピラリーを頂部にてシールし、蒸発を妨げても よい。所望により、プレートにガス出入り口を設け、ガス状試薬または不活性雰 囲気をキャピラリーを介してビーズに導入してもよい。試薬プレートは、所望に より、プレート上でキャピラリー配列の配置の間にキャピラリーにより穴をあけ ることのできる、化学的に耐性な膜でシールされてもよい。連続反応工程を、所 望の洗浄工程を途中に入れながら、１つの試薬プレートから別のものへとキャピ ラリー配列を移動させることにより行う。 ビーズを配列し、続いて切断するために、図６に示す具体例において、マスク ６０は孔６４の配列を有するフロア６２を含む。側壁６６は、フロア６２の上方 および下方の両方に伸びる。側壁の上方に伸びる部分はフロア６２と一緒になっ て、トレイを形成し、接着剤、例えばエチレングリコールで被覆される多孔性ニ トロセルロースフィルムのシート６８を受け取る。このトレイはまた、接着剤を 溶解するための溶媒を保持するようにも供する。側壁の下方に伸びる部分もまた 、マスクのフロアと共同し、ビーズを保持するためのトレイを形成する。これら の同じ下方に伸びる側壁部分は、ウェルプレート７２の上部７０を受け入れる凹 部を形成する。この凹部は、ウェルプレートの部分７０と適合し、マスクの孔６ ４がウェル７４と確実に整列するようにする。 図６の孔を用いてビーズを配列する際、接着剤被覆フィルムのシート６８は、 マスクの上表面上に置かれ、接着剤が上表面と接触するようにする。ついでマス クを逆さまにし、ビーズをマスク上へ置く。ビーズおよび／またはマスクを揺り 動かすことにより、ビーズは孔に入りこみ、接着層と接触するようになる。つい でマスクを再度逆さまにし、過量のビーズを除去する。過量のビーズを除去した 後、マスクをウェルプレート上に固定し、５０％メタノールおよび５０％水から なる混合物などの溶媒をマスク上部中のフィルム上へ注ぐ。溶媒はフィルムの穴 を通り、接着剤を溶解し、それによりビーズをウェル７４中にリリースする。多 孔性フィルムを通しての溶媒の通りを促進するため、マスク６０、シート６８お よびウェルプレートからなるアセンブリーを真空マニホールド上または遠心機中 に置いてもよい。ビーズはウェルプレートのウェル中にリリースされ、ビーズに 坦持される化合物の切断および続く試験工程をウェル中にて行ってもよい。 別の具体例（図示せず）において、マスク６０を図４および５に示したような 種類のキャピラリーブロックと組みあわせて用いることができる。この具体例に おいて、下方に伸びるマスクの壁はまたマスクをキャピラリーブロックと整列さ せるように供する。 上記した方法の効果を決定するために行う実験において、２７０μｍの直径を 有するポリスチレンビーズを９６孔の、直径３５０μｍの孔を有するステンレス スチールマスクを用いて配列した。ビーズは確かにすべての孔中に受け取られた 。接着剤被覆フィルムを除去する際、９４個の配列ポイントは１個のビーズを有 し、１個は２個のビーズを有し、１個はビーズを有さなかった。 上記したように、接着剤ビーズ固着領域のパターンを確立するために孔のある マスクを使う代わりに、例えば、インク−ジェット印刷において用いる型のディ スペンサーを用いることにより、接着性の個々の小滴を基体に適用することによ り同じ目的を達成することが可能である。 図７に示すように、ここではステンレススチールトレイ７６が基体として作用 し、エチレングリコールなどの接着性の小滴７８は、圧電ディスペンサー８０に より所定のパターンで付着される。ディスペンサー８０は、慣用のｘ−ｙプロッ タードライブまたは同様の機構によりトレイ７６の表面上を水平に２次元に動く ことができる。ディスペンサーヘッドは、インクジェット印刷において用いる種 類のヘッドであり、詳細に示していないが、結合したセラミックカラーを有する ガラスキャピラリーチューブを典型的に含む。圧力がカラーにかけられると、カ ラーは収縮し、ガラスキャピラリーから非常に小さな小滴を排出する。０．２ナ ノリットル程度に小さな小滴が容易に分配される。この発明の目的のためには、 約１ナノリットルの典型的な接着性小滴が個々のビーズを捕らえるために一般に 十分である。 接着性小滴のパターンがトレイ７６の表面上に確立された後、多数のビーズ８ ２を図８に示すようにトレイの表面上に置く。トレイを動かすことにより、また は、例えば、空気流などの他の手段により、ビーズを揺り動かす。振動は、各接 着性小滴が１つのビーズ、または、小滴がより大きい場合、所定の１よりも大き な数のビーズが、それに固着すること確実にする。図８に示すように、ビーズ８ ４、８６、８８および９０は、それぞれ小滴９２、９４、９６および９８に固着 する。トレイの側壁１００は、ビーズを保持する。 ビーズが整列し、各接着性小滴が所望の数のビーズを固着した後、トレイを図 ９に示すように逆さまにし、過量のビーズを注ぎ出し、小滴が陳列するパターン に対応するパターンにて固着したビーズのみが残る。 図１０に示すように、トレイ７８を一連のガラスキャピラリーチューブ１０４ を支持するＰＴＦＥブロック１０２上に嵌合させる。キャピラリーチューブの上 端１０６を、ブロックの上表面１０８と面一にし、図７中のトレイ上の接着性小 滴のパターンに対応するパターンに配列する。一連のキャピラリーの上端を、ト レイ７８がブロック上に置かれた場合にトレイと接触する化学的に耐性なエラス トマーのシール１１０で囲む。 ブロック１０２を、その内壁の周りに伸びる棚板１１４を有する、方形の支持 フレーム１１２中に置く。棚板の上表面を、キャピラリーチューブがブロック１ ０２の下面の下に突き出すよりも大きな距離で、フレームの下端１１６から離す 。かくして、ブロックがフレーム中に受け入れられた場合、キャピラリーは損傷 から保護される。 図１１において示すように、キャピラリーチューブ１０４の上端は、ブロック １０２中に保持されるように、そして、キャピラリーチューブとのビーズ（例え ば８４および８６）の整列においていくらか耐性となるように、フレア状とする 。キャピラリーチューブの下端は、ビーズより小さな開口部１１８を有する。 ブロック１０２、トレイ７８およびフレーム１１６を含むアセンブリーを、ホ ルダーがトラニオン（そのうちの１つが１２２に見られる）によりピボット上に 支持される、真空遠心機のホルダー１２０上に置く。好ましくは、他の類似する アセンブリーをバランスのため、遠心機の他のホルダー上に置く。遠心操作によ り、接着性小滴が蒸発し、ビーズがキャピラリーチューブの下端に動く。トレイ からビーズを除去するのに溶媒が必要でなく、結果としてトレイが必ずしも多孔 性でなくてよい。接着性小滴からのビーズの除去を、高温（例えば６５℃）にて 高真空を用いることにより数分で行える。遠心のこれらの条件下、ビーズをキャ ピラリーチューブ内に直接移動できる。もちろん、溶媒を用いることにより接着 性小滴からビーズを除去することも可能であり、この場合、多孔性のフロアを有 するトレイを用いてもよい。 図１２に示すように、それぞれビーズを含むキャピラリーチューブを有するブ ロック１０２を、キャピラリーチューブの下端がウェル１２６中の試薬に浸され るように、ウェルプレート１２４上に置く。ウェルプレートを図１０にも示す。 フレーム１１６の壁の下方に伸びる部分は、ブロックとウェルプレートを、キャ ピラリーチューブがウェルに入るように並べるように働く。ビーズと接触するた めに、キャピラリーの開口部１１８を通ってキャピラリーに試薬が入る。 ビーズから化合物を切り離すために、通常キャピラリーをシールすることは必 要ではないが、ビーズ上で化合物を合成する場合、シールをして、反応を互いに 分離する。それゆえ、図１２に示すように、エラストマーのシート１２８を、ブ ロックの下面およびウェルプレートの上表面間に備える。好ましくは、シート１ ２８は、登録商標ＶＩＴＯＮとして利用可能な材料などの化学的に耐性なフルオ ロエラストマーである。シート１２８は、キャピラリーチューブがウェルに入る 際にキャピラリーチューブにより貫通される穿孔を備える。穿孔の端はキャピラ リーチューブを引き込み、シールを提供し、液体および蒸気が各ウェルから隣接 するウェルに入るのを妨げる。ブロック１０２の上表面にて、ＶＩＴＯＮガスケ ット１３０がガラスプレート１３２の下に備えられ、これもまたシール１１０を かける。ガスケットおよびガラスプレートがキャピラリーチューブの上端を互い に分離する。所望の場合、起こる反応の性質に応じて、アセンブリーを加熱でき る。出入り口（図示しない）を、ガスまたは不活性雰囲気の導入のためにガラス プレート１３２中に備えてもよい。 化合物を切り離す場合、ウェルおよびキャピラリーチューブの分離が通常必要 でなく、そのため、ガラスプレートおよびＶＩＴＯＮシートを図１０に示すよう にブロック１０２およびウェルプレート１２４間で省略できる。 単一のビーズを捕らえるために接着剤の小滴を用いる場合、小滴は、典型的に は、１−２ナノリットルの範囲にあり、各接着性小滴の直径がビーズの直径より も小さくなるようにする。かくして、ただ１つのビーズのみが、配列内にて、所 定の位置にて捕らえられる。配列位置にて１より多くのビーズが所望される場合 、分配される接着剤の量を増加できる。 図１３および１４は、孔１３８のパターンを有するステンレススチールフロア １３６が１つの面から垂直に伸び、孔１３８をキャピラリーチューブの上端にて 開口部と整列させるように、ブロック１０２（図１０）上に置くのに適合する側 壁１４０を有するマスクの別の形態を示す。フロアのもう一方の側で、壁１４２ は、多孔性接着剤被覆シートを受け入れ、シートからビーズをリリースするため に、例えば５０％メタノールおよび５０％の水からなる混合物などの溶媒を保持 するように設けられる。 上の記載から明らかなように、本発明はビーズを所望の幾何学的配列に迅速か つ確実に付着できる。これは、特に、一般により複雑で、遅く、より不確かであ る従来の技術と比較して、使用するのに単純で、高価でなく、容易である。本発 明により、配列フォーマットにて化合物が合成でき、評価のためにリリースでき 、それゆえ、バルクビーズを用いるスピリット−合成プロトコールまたは公知の 合成経歴の化合物の指向された配列のいずれにも適合する。 種々の修飾を記載した装置および方法に行うことができる。 例えば、多孔性のニトロセルロースフィルムが好ましいが、ＰＴＦＥ(ポリテ トラフルオロエチレン)、多孔性ナイロンおよびＰＶＤＦ（ポリビニルジフルオ ライド）フィルムなどの他の材料を用いてもよい。 少なくともエチレングリコールで飽和された多孔性ニトロセルロースフィルム が好ましいが、多孔性または非多孔性フィルム上の別の層に接着剤を設けること も可能である。 ＤＭＳＯおよびグリセロールなどの種々の他の接着剤を用いてもよいが、グリ セロールは、溶解性であるためあまり満足できるものではない。 トリフルオロ酢酸、トリエチルアミンまたはヒドラジンなどの切断試薬を用い る代わりに、光切断などの他の方法を用いて目的の化合物をビーズから除去でき る。 配列プロセスを行う場合、ビーズが固着する表面の側に溶媒を直接適用して、 接着層または小滴からビーズをリリースすることが可能である。表面を、それに 結合するビーズと共に、ウェルが溶媒を含むウェルプレートの頂部表面に対して 置き、ついで、ウェルプレートおよびフィルムを共に逆さまにし、溶媒が接着剤 と接触し、それによりビーズがリリースできるようにすることにより、行っても よい。他の修飾において、配列の各位置において複数のビーズを付着することが 所望される場合、マスク中の孔を、それぞれが１より多くの所定の数の並んだビ ーズに適合するような大きさとすることができる。孔は例えば長円形などの円形 以外の種々の形態であることができる。 本明細書において記載した具体例は平面のビーズ固着表面を用いたが、円筒状 のマスクなどの非−平面状の表面を用いることが可能である。例えば、回転ドラ ム中に形成される円筒状表面は、連続的な、自動化操作に向いている。異なるサ ブライブラリーが配列の別の領域に位置できるように、仕切りにより表面を区分 することもまた可能である。 本発明のさらなる修飾において、マスクは、配列する最も小さいビーズの大き さよりも小さい大きさの孔を備え、真空が空気圧により孔に対してビーズを引い てトラップするプレナムチャンバーに結合することもできる。孔のもっとも小さ な直径がもっとも小さなビーズの直径よりも小さく、入り口がもっとも大きなビ ーズよりも大きいように、テンパーを付すことができる。この方法を用い、範囲 のあるビーズの大きさを適合することができる。真空をリリースすることにより ビーズをレセプタクル中に配置し、それにより、マスクの両側で圧力を等しくす る。 さらに他の修飾を、以下の請求の範囲において記載する本発明の範囲から逸脱 することなく記載した装置および方法に行うことができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ６０／０４９，３３９ (32)優先日 平成９年６月10日(1997．6．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ， ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 テイラー，ポール・ジェイ アメリカ合衆国19342ペンシルベニア州グ レン・ミルズ、ウエスト・フォージ・ロー ド233番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーに関するビーズの配列方 法であって： ビーズ固着領域が均一な大きさの限定数のビーズの保持能を有する一定のパタ ーンの別個のビーズ固着領域と、ビーズが自由に分離し、その別個のビーズ固着 領域が相互に一定間隔にあるようにする領域とを含むビーズ受け取り表面を確立 し、ここで、各ビーズ固着領域についてのビーズの限定数は、一のパターンのそ の他すべてのビーズ固着領域に対する数と同じであり； 均一な大きさのビーズの混合物をその表面に置き； 該混合物から所定の数のビーズを別個のビーズ固着領域の各々に固着させ； その別個のビーズ固着領域に固着していないビーズをその表面から除去し； その後、固着ビーズを別個のビーズ固着領域からリリースさせ、そのビーズを 配列に付着させる ことを含む方法。 ２． ビーズ固着領域の各々の大きさが、そこに固着するビーズの数が１に限定 される大きさである、請求項１記載の方法。 ３． 別個のビーズ固着領域が、各々、マスク中の孔を通して暴露され、ビーズ が自由に分離できる領域が、マスクの表面である、請求項１記載の方法。 ４． 別個のビーズ固着領域が、各々、接着剤の領域であり、ビーズが自由に分 離できる領域が、実質的に接着剤不含領域である、請求項１記載の方法。 ５． 別個のビーズ固着領域が、各々、接着剤の領域であり、ビーズが自由に分 離できる領域が、実質的に接着剤不含領域であり、別個のビーズ固着領域のパタ ーンが連続する接着層の別個の領域をマスク中の一のパターンの孔を通して暴露 することにより確立され、実質的に接着剤不含領域がマスクの表面である、請求 項１記載の方法。 ６． 接着性小滴を一定のパターンの基体に塗布することによりビーズ受け取り 表面を確立する工程を行い、そのパターンの接着性小滴が、各々、ビーズ固着領 域の１つを構成する請求項１記載の方法。 ７． 別個のビーズ固着領域が、各々、多孔性基体上の接着剤の領域であり、固 着したビーズをリリースする工程が溶媒で多孔性基体を洗浄し、それによりビー ズ固着領域を溶解することにより行われる、請求項１記載の方法。 ８． 固着したビーズをリリースする工程を、固着したビーズをレセプタクルと 、ビーズ固着領域のパターンに対応するレセプタクルの配列にて整列させ、付着 工程をビーズをそれらが整列するレセプタクル中に付着させることにより行う、 請求項１記載の方法。 ９． 固着したビーズをリリースする工程を、固着したビーズをレセプタクルと 、ビーズ固着領域のパターンに対応するレセプタクルの配列にて整列させ、付着 工程をビーズをそれらが整列するレセプタクル中に洗浄することにより行い、そ の付着工程の後に、ビーズをレセプタクルに残したまま、試薬を用いて各ビーズ から化合物を切り離す、請求項１記載の方法。 １０． 固着したビーズをリリースする工程を、固着したビーズをキャピラリー と、ビーズ固着領域のパターンに対応するキャピラリーの配列にて整列する工程 にて行い、付着工程をビーズをそれらが整列するキャピラリー中に洗浄すること により行い、その付着工程の後にビーズを含むキャピラリーを試薬を含むウェル に導入し、ビーズをキャピラリーに残したまま、ウェル中において試薬を用いて ビーズから化合物を切り離す、請求項１記載の方法。 １１． 混合物から所定の数のビーズを別個のビーズ固着領域に固着させる工程 を、ビーズの振動により行う、請求項１記載の方法。 １２． 付着工程の後に、ビーズを洗浄し、ビーズから化合物を切り離す工程を 行う、請求項１記載の方法。 １３． 付着工程の後に、ビーズを洗浄し、ビーズから化合物を切り離す工程を 行い、さらに切り離した化合物を薬剤活性について試験することを含む、請求項 １記載の方法。 １４． 請求項１３記載の方法により薬剤活性を有すると同定される化合物。 １５． 化合物の配列を合成する方法であって： ビーズ固着領域が均一な大きさの限定数のビーズの保持能を有する一定のパタ ーンの別個のビーズ固着領域と、ビーズが自由に分離し、その別個のビーズ固着 領域が相互に一定間隔にあるようにする領域とを含むビーズ受け取り表面を確立 し、ここで、各ビーズ固着領域についてのビーズの限定数は、一のパターンのそ の他すべてのビーズ固着領域に対する数と同じであり； 均一な大きさのビーズの混合物をその表面上に置き； 該混合物から所定の数のビーズを別個のビーズ固着領域の各々に固着させ； 別個のビーズ固着領域に固着していないビーズをその表面から除去し； 固着したビーズを、ビーズ固着領域のパターンに対応するキャピラリーの配列 にてキャピラリーと整列させ； 別個のビーズ固着領域から固着したビーズをリリースさせ、それをキャピラリ ーの配列中に付着させ； キャピラリーの配列を所望の合成工程の試薬を含むウェル中に導入し、ビーズ をキャピラリーに入れたまま、ビーズ上で合成を行う ことを含む方法。 １６． ビーズ上で合成を行う工程に続き、キャピラリー中のビーズを洗浄し、 結合していない試薬を除去し、合成した化合物を切り離す、請求項１５記載の方 法。 １７． ビーズ−ベースのコンビナトリアルライブラリーを配列するための装置 であって： 平行な第１および第２の面ならびに孔の配列を有するマスク（ここで、各孔は 第１の面から第２の面に伸び、各孔中に並んで位置可能なビーズの数が所定の数 に限定されるように孔は均一な大きさである）； 面上に接着層の面を有する基体（ここで、接着層はマスクの第２の面に対向し て位置しており、第２の面の孔の開口部を覆い、これにより各孔中の所定の数の ビーズが接着層上に付着され、粘着される） を含む装置。 １８． マスクがトレイのフロアの少なくとも一部を構成する請求項１７記載の 装置。 １９． 基体がマスクの第２の面から着脱可能である請求項１７記載の装置。 ２０． 各孔が、マスクの第１の面上に円形縁の第１の開口部、および、マスク の第２の面上に円形縁の第２の開口部を有し、第１および第２の開口部の縁が、 マスクの第１および第２の面と、各々、面一である請求項１７記載の装置。 ２１． 基体が多孔性シートである請求項１７記載の装置。 ２２． 基体がニトロセルロースのシートであり、接着剤がエチレングリコール である請求項１７記載の装置。 ２３． レセプタクルの配列を提供する手段およびレセプタクルの配列と固定さ れた関係にてマスクを保持するためにマスクに固着する手段を含み、これにより 基体の接着層上にマスクの孔を介して付着されるビーズが容易にレセプタクルと 整列することができる、請求項１７記載の装置。