JP2002514893A

JP2002514893A - 生物学的事象のラパマイシンに基づく調節

Info

Publication number: JP2002514893A
Application number: JP50324497A
Authority: JP
Inventors: クラックソン，ティモシー; ホルト，デニス・エイ; ギルマン，マイケル・ゼット
Original assignee: アリアド・ジーン・セラピューティクス・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2002-05-21
Also published as: ATE404663T1; AU714904B2; DE69637641D1; AU714904C; AU6270696A

Abstract

(57)【要約】本発明は生物スイッチのための新規な配置形態に関し、動物細胞における生物学的事象を調節するのに有用な新規な方法および材料を提供する。本発明は、FKBP：ラパマイシンに結合しうるタンパク質、FRAP、Tor1、Tor2およびその他のタンパク質をコードする配列から誘導したＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ構築物、FKBPタンパク質の一部または全部をコードするＤＮＡ配列を含むその他の組み換えＤＮＡ構築物、これらの構築物によりコードされるタンパク質、１または２以上の構築物で形質転換された細胞（特に動物細胞）、キメラタンパク質に結合し、その多量体化を誘導しうる小分子（多価多量体化剤）並びにこれらを製造する方法および利用する方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的事象のラパマイシンに基づく調節発明の背景ラパマイシン(I)は、FK506結合性タンパク質（FKBP）に高い親和性で結合してラパマイシン：FKBP複合体を形成する天然タンパク質である。この相互作用に対して報告されたKd値は200pM程度と低い。ラパマイシン：FKBP複合体は、高い親和性で大きな細胞タンパク質のFRAPに結合して三成分体(tripartite)の[FKBP:ラパマイシン]:[FRAP]複合体を形成する。この三成分複合体において、ラパマイシンはFKBPをFRAPに結合させるための二量体化剤またはアダプターとして作用する。FRAPタンパク質の中のFKBP：ラパマイシン複合体と相互作用する部分はFRBドメインと呼ばれ、これについては後で詳しく述べる。FRAP、RAFT1もしくはRAPT1 と命名された大きな哺乳動物性タンパク質またはその酵母同族体であるDRRおよびTORとのFKBP12のラパマイシン依存性の会合は、いくつかの研究グループにより報告されてきた。例えば、Brown et al，1994，Nature 369:756-758;Sabatini et al，1994，Cell 78:35-43;Chiu et al，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:12574-12578;Chen et al，1994，Biochem．Biophys．Res．Comm．203:1-7;K unz et al，1993，Cell 73:585-596;およびCafferkey et al，1993，Mol．Cell ．Biol．13:6012-6023を参照。Chiu et alの同上論文およびStan et al，1994， J．Biol．Chem．269:32027-32030は、FRBドメインを含むFRAPのより小さいサブユニットへのFKBP12のラパマイシン依存性結合について述べている。FRAP、RAFT 、RAPTおよびその他のTORタンパク質はそれぞれ相同のFRBドメインを含み、本書の目的にとってはこれらをFRAPタンパク質と考える。数多くの天然のFK506結合性タンパク質（FKBP類）が知られている。例えば、K ay，1996，Biochem．J．314.361-385（レビュー）を参照。FKBPタンパク質類は、Spencer et al，1993，Science 262:1019-1024およびPCT/US94/01617に開示されているように、それらのリガンド結合性のために、イムノフィリン系組換えタンパク質のリガンド媒介多量体化に基づく生物スイッチ(biological switch)に使用されてきた。FK506の強力な免疫抑制活性のため、特に動物において二量体化剤としてのその利用は制限されるかもしれないが、FK506(および関連化合物) の二量体はそのような免疫抑制活性を失っており、FKBPに由来するリガンド結合性ドメインを含むキメラタンパク質の二量体化に有効であることが示された。ラパマイシンは、FK506と同様に、タンパク質の天然の二量体化剤であって、適当に設計されたキメラタンパク質を二量体化することができるが、強力な免疫抑制活性を始めとするその顕著な生物学的活性により、遺伝子工学処理された生物スイッチにおけるその使用は、特に動物での使用について、さらに厳重に制限される。本発明は、ラパマイシン（および関連化合物）の二量体化剤としての可能性を、その固有の根深い制限を避けながら引き出すものである。発明の要約本発明は生物スイッチの新規な配置形態に関し、特に動物細胞内での生物学的事象を調節するための新規な方法および材料を提供する。その種の生物学的事象の例としては、遺伝子転写、例えば遺伝子発現またはアポトーシス(apoptosis) による細胞死に至る細胞内シグナル伝達経路の活性化、遺伝子ノックアウト、遺伝子の発現の阻止、および遺伝子産物の機能の阻害が挙げられる。本発明は、２種類のキメラタンパク質を利用したものであり、これらのキメラタンパク質は、１つの共通のリガンドへの相互結合を経て複合体化させた時に、直接または間接に所望の事象を作動させることができる。本発明は、上述した２種類のキメラタンパク質をコードする組換えDNA構築物( constructs)；それら構築物を１種もしくは２種以上含むDNAベクター；前記構築物によりコードされる融合タンパク質(fusion proteins)；本書に述べるDNA構築物の１種もしくは２種以上で形質転換された（即ち、これら構築物を含み、発現することができる）細胞、特に動物細胞；上記キメラタンパク質分子に結合し、その多量体化を誘導することができる小分子（２価または多価多量体化剤）；ならびにこれらの作製および使用方法を包含する。より具体的には、本発明は、ラパマイシンの存在またはラパマイシンの構造類似体(analog)、模擬体(mimic)もしくは誘導体（ラパログ<rapalog>と総称）の存在に応答性の遺伝子工学処理された細胞の作製および使用方法および材料を提供する。本発明はラパマイシンまたはラパログの存在下で互いに複合体化することができる一組の融合タンパク質をコードする組換えDNAの細胞への導入を利用する。このような遺伝子工学処理された細胞がラパマイシンまたは適当なラパログと接触すると、融合タンパク質の複合体化と生物学的応答の開始が起こる。融合タンパク質の一方は、FKBP：ラパマイシン結合性(FKBP:rapamycin binding)(=FR B)ドメインの１または２以上のコピーと少なくとも１つの異種(heterologous)タンパク質ドメインとを含んでいる。もう１つの第２の融合タンパク質は、ラパマイシンまたはラパログに結合することができ、かつFRB含有タンパク質と複合体を形成することができるFKBPタンパク質に由来するドメインの１または２以上のコピーを含んでいる。第２の融合タンパク質はまた、最初の融合タンパク質の異種ドメインと同一でも異なっていてもよい少なくとも１つの異種ドメインを含んでいる。本発明の融合タンパク質に使用するためのFRBおよびFKBPドメインは、天然タンパク質から選んでもよく、また後で詳しく説明するようにさまざまに修飾してもよい。多様な種(species)に由来するFRB、FKBPおよび異種ドメインを使用することができるが、ヒトの遺伝子治療の用途に対してはヒトのペプチド配列またはその変異型が好ましい。操作的には、FRBまたはFKBPドメインはレセプター（または「リガンド結合性」）ドメインとして作用し、ラパマイシンまたはラパログ分子の媒介下で融合タンパク質の複合体化を指令する。ラパマイシンまたはラパログで媒介される複合体化により始動(trigger)される生物学的応答の性質は、融合タンパク質の異種ドメインにより決まる。従って、この異種ドメインは「作用(action)」ドメインとも呼ばれる。これらの融合タンパク質には多様な異種タンパク質ドメインを使用することができる。本発明の１側面では、２つの融合タンパク質（その一方は少なくとも１つのFRBドメインを含み、もう一方は少なくとも１つのFKBPドメインを含む）は、それぞれ少なくとも１つの異なる異種ドメイン、即ち、他方の融合タンパク質に含まれていない異種ドメインを含んでいる。例えば、ある態様においては、融合タンパク質の一方は少なくとも１つのDNA結合性ドメインを含み、他方の融合タンパク質は少なくとも１つの転写活性化ドメインを含む。２つの融合タンパク質のリガンドで媒介される会合は、転写因子複合体の形成を発現し、一方の融合タンパク質上のDNA結合性ドメインで認識された(即ち、このドメインと結合することができる)DNA配列に結合した標的遺伝子の転写の開始を生ずる。別の態様では、融合タンパク質の一方が、その融合タンパク質を細胞膜、核などの特定の細胞内位置に向かわせることができる少なくとも１つのドメインを含んでいる。細胞膜を標的とする局在化ドメインには、ミリストイル化部位またはレセプタータンパク質もしくは膜にわたる他のタンパク質の貫膜(transmembrane)領域といったドメインが含まれる。もう一方の融合タンパク質は、膜局在化および／またはクラスター化(clustering)した後に、細胞シグナル伝達経路を活性化することができるシグナル化ドメインを含んでいる。シグナル化ドメインの例には、成長因子もしくはサイトカインレセプターの細胞内ドメイン、FASまたはTNF-R1の細胞内ドメインのようなアポトーシスを引き起こすドメイン、ならびにSOS，Raf，lc k，ZAP-70等の他の細胞内シグナル化タンパク質に由来するドメインが含まれる。多数のシグナル化タンパク質が、PCT/US94/01617（例、23〜26頁を参照）に開示されている。さらに別の態様では、２つの融合タンパク質のそれぞれが、少なくとも１つのFRBドメインおよび少なくとも１つのFKBPドメイン、ならびに１または２以上の異種ドメインを含んでいる。このような融合タンパク質は、ラパマイシンまたはラパログの存在下でホモ二量体化することができる。一般に、宿主細胞に内生のペプチド配列を含むドメインが好ましい。例えば、ヒトの遺伝子治療に対してはヒト起源のドメインが特に有利である。融合タンパク質をコードする組換えDNA分子も、特に真核細胞（その中でも酵母および動物細胞が特に有利である）内でそれらの発現を指令するベクターと同様に提供される。融合タンパク質の構成成分を考慮すると、これらをコードする組換えDNA分子は、（a）融合タンパク質の所定のリガンド結合性ドメイン（FRB ドメインまたはFKBPドメイン）もしくはこの種のドメインを含むタンパク質をコードするDNA分子、ならびに(b)上記の異種ドメインもしくはこの異種タンパク質ドメインが誘導されるタンパク質をコードするDNA分子、に選択的にハイブリッド形成することができる。遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能であるDNAも包含される。本発明のキメラタンパク質をコードするDNA配列と、真核細胞内でのそれらの発現を指令することができるベクターとを用いて、多数の重要な用途に対して細胞を遺伝子工学処理することができる。それには、まず所望のキメラタンパク質の真核細胞（好ましくは動物の）内での発現を指令するために発現ベクターまたはDNA構築物を用意し、次いで該細胞内に組換えDNAを、細胞の少なくとも一部で DNA取り込みおよび導入されたDNAの発現が可能となるように導入する。DNAを異種遺伝子発現のために細胞内に導入するための各種の方法および材料のいずれも使用でき、多様なこの種の方法および材料が周知であるか、および／または市販されている。かくして、本発明の目的の１つは、本書に説明するように２つの融合タンパク質をコードする組換えDNAを含む動物細胞を提供することである。この融合タンパク質の一方はラパマイシンもしくはラパログに結合することができ、かつ少なくとも１つのFKBPドメインとこれとは異種の少なくとも１つのドメインとを含んでいる。第２の融合タンパク質は、少なくとも１つのFRBドメインとこれとは異種の少なくとも１つのドメインとを含んでいて、第１の融合タンパク質ならびにラパマイシンもしくはラパログの１もしくは２以上の分子と一緒に三成分複合体を形成することができる。一部の態様では、融合タンパク質の一方に存在する１または２以上の異種ドメインが、他方の融合タンパク質にも存在する。即ち、２つの融合タンパク質は１または２以上の共通異種ドメインを有している。別の態様では、融合タンパク質がいずれも１または２以上の異なる異種ドメインを含んでいる。本発明の具体的目的は、細胞をラパマイシンまたはラパログと接触させると標的遺伝子の転写を生ずるように遺伝子工学処理された動物細胞を提供することである。このような細胞は、２つの融合タンパク質をコードする組換えDNAに加えて、融合タンパク質とラパマイシンまたはラパログとの複合体の存在に応答性の DNA配列に標的遺伝子を操縦可能に連結させてなる標的遺伝子構築物を含んでいる。ある態様では、この細胞は、宿主細胞の内生のFKBPもしくはFRB含有タンパク質への結合に対して検出可能な優先度でFKBP融合タンパク質およびFRB融合タンパク質に結合するラパログとの接触に対して応答する。本発明の別の具体的目的は、細胞をラパマイシンまたはラパログと接触させると細胞死滅の開始を生ずるように遺伝子工学処理された動物細胞を提供することである。このような細胞では、融合タンパク質の少なくとも一方に存在する異種ドメインの少なくとも１つが、FASまたはTNF-R1の細胞内ドメインのような、クラスター化によりその細胞のアポトーシスを発動するドメインである。本発明の別の具体的目的は、細胞をラパマイシンまたはラパログと接触させると細胞の成長(growth)、分化または増殖(proliferation)を刺激するように遺伝子工学処理された動物細胞を提供することである。このような細胞では、融合タンパク質の少なくとも一方に存在する異種ドメインの少なくとも１つが、ホルモンのレセプターの細胞内ドメインのような、細胞の成長、分化または増殖を媒介するドメインである。細胞の成長、分化および／または増殖は、レセプターの細胞内シグナル化ドメインのクラスター化に続いて生ずる。このようなクラスター化は、本質的にホルモン結合の後に、本発明の遺伝子工学処理された細胞内ではラパマイシンまたはラパログとの接触の後に起こる。ヒトの遺伝子治療の用途に対してはヒト起源の細胞が好ましいが、多様な起源（ヒトまたは他の種）の細胞型を使用することもでき、所望によりこれをヒト被験者用の生体適合性の材料の中に封入（カプセル化）してもよい。本発明の別の目的は、前述した遺伝子工学処理された細胞の作製用の材料および方法を提供することである。この目的は、融合タンパク質をコードする組換え DNAを、標的遺伝子構築物のような任意の補助の組換えDNAと一緒に用意し、これらの組換えDNAを宿主細胞内に、該細胞によるDNA取り込みが可能な条件下で導入することにより達成される。このようなトランスフェクションは、培養状態に保持された宿主細胞を用いてex vivo(生体外)で行ってもよい。培養液態で遺伝子工学処理された細胞は、その後に例えばex vivo遺伝子治療用途において、宿主生体内に導入することができる。即ち、そのようにすると、ラパマイシンまたはラパログの存在に応答性（本書に説明した意味で）のある宿主生体、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物、を提供する方法を構成する。或いは、ヒトまたはヒト以外の宿主生体内に存在する宿主細胞を用いて、トランスフェクションを in vivo(生体内)で行ってもよい。この場合には、宿主生体の１種もしくは２種以上の細胞によりDNAの取り込みが可能な条件下で、DNA分子は宿主生体内に直接導入される。従って、この手法は、ラパマイシンまたはラパログの存在に応答性（本書に説明した意味で）のある宿主生体、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物、を提供する別の方法を構成する。培養中の細胞内または完全な生体内に DNAを導入するための各種の材料および方法が当該技術分野で既知であり、これらを本発明の実施において採用することができる。本書に説明する遺伝子工学処理された細胞を用いて他の目的が達成される。例えば、本書に説明する遺伝子工学処理された細胞を有効量のラパマイシンまたは適当なラパログと接触させ、ラパマイシンまたはラパログを融合タンパク質との複合体形成が可能になるようにすることにより、本発明の融合タンパク質を多量体化する方法が提供される。融合タンパク質の多量体化が標的遺伝子の転写を発動する態様では、これは標的遺伝子の発現を活性化する方法となるる。融合タンパク質が１または２以上のシグナル化ドメインを含む態様では、これは細胞シグナル伝達経路を活性化する方法となる。融合タンパク質が、クラスター化によりアポトーシス性の細胞死を発動することができる１または２以上のドメインを含む態様では、これは細胞死滅を作動させる方法となる。これらの方法は、細胞培養物中でも、またはヒトの患者を包含する完全な生体内でも実施できる。前者の場合には、ラパマイシンまたはラパログを培地に加える。後者の場合には、その完全な生体にラパマイシンまたはラパログ（これは医薬または獣医薬組成物の形態でもよい）を、例えば、経口、非経口等で投与する。好ましくは動物へのラパマイシンまたはラパログの投与量は、受容体内での不当な免疫抑制を生ずる恐れのある投与量水準より少なくする。本発明の別の目的は、ヒトまたはヒト以外に動物の細胞を本書に説明するように遺伝子工学処理する際に用いるためのキットを提供することである。このようなキットの１つは、本発明の一対の融合タンパク質をコードする組換えDNA構築物を含んでいる。この組換えDNA構築物は一般に、動物細胞への導入に適した真核性発現ベクターの形態をとり、その中で融合タンパク質の発現を指令することができる。このキットはまた、コードされた融合タンパク質と複合体を形成することができるラパマイシンまたはラパログのサンプルを含んでいてもよい。このキットはさらに、FK506または融合タンパク質の一方には結合することができるが、両方との複合体を形成することができない何らかの他の化合物のような多量体化拮抗剤を含んでいてもよい。ある態様では、融合タンパク質をコードする組換えDNA構築物は、１または２以上の異種ドメインをコードするDNAの代わりにクローン化部位を含んでおり、それにより実施者が特定の異種ドメインをコードするDNAを導入することが可能となる。別のある態様では、キットは、後でより詳しく説明するように、複合体を形成した融合タンパク質の存在に応答性のDNA配列に連結した標的遺伝子またはクローン化部位を含有する標的遺伝子構築物をさらに含有していてもよい。図面の簡単な説明図１（Ａ）DNA結合性ドメインを含有するFKBPキメラの転写活性化ドメインを含有するFRAPキメラとのラパマイシン依存性二量体化を示す。（Ｂ）実験例のいくつかに用いた代表的プラスミドの模式図。転写因子融合タンパク質は、ヒト部位メガロウイルス(hCMV)即時型プロモーターおよびエンハンサーの制御下に作製した。「Ｅ」はエピトープタグを意味し、「Ｎ」はSV40 T抗原核局在化配列を意味し、どちらも転写因子のＮ末端に融合している。リポーター遺伝子は、ZFHD1 の12縦列反復結合部位に隣接する、エンハンサー配列が欠如した最小hCMVプロモーターからなるものであった。図２は、本発明の融合タンパク質の多様なFRAP由来およびFKBP由来ドメインをラパマイシンおよびラパマイシン類似体と一緒に模式的に示す。図３は、各種の多量体とFRAPおよびFKBPドメインの配置形態を用いた転写検定において得られた結果を比較する。図４は、一時的にトランスフェクションされた細胞(A，B)および安定的にトランスフェクションされた細胞(C，D)における各種ラパマイシン濃度での分泌アルカリ性ホスファターゼ活性の生成により測定したラパマイシン依存性遺伝子転写の用量応答曲線を示す。（Ａ）ZFHD1-3FKBPおよび1FRB-p65(361-450)をコードするプラスミドは、pZHWTx12-CMV-SEAPリポーター遺伝子によりHT1080細胞中にトランスフェクションした。増殖培地中に分泌されたSEAP活性は、表示濃度のラパマイシンと一緒にインキュベーションした後で測定した。（Ｂ）表示のプラスミド(-)を省略し、空の発現ベクターだけと置き換えた。SEAP活性は、表示のように10nMラパマイシンの存在または不存在下でインキュベーションした後に測定した。トランスフェクションは４回行い、平均値（相対単位）±標準偏差をプロットした。安定細胞系でのラパマイシン調節遺伝子発現。（Ｃ）pLH-ZHWTx12-IL2- SEAPリポーター遺伝子、ZFHD1-3FKBP DNA結合性ドメイン、およびIFRB-p65(361- 550)活性化ドメインを、３工程でHT1080細胞中に安定に組み込んでクローン性細胞系HT20-6を作製した。増殖培地中に分泌されたSEAP活性を、表示濃度のラパマイシンと一緒にHT20-6細胞をインキュベーションした後に測定した。検定は３回行い、平均値（相対単位）±標準偏差をプロットした。（Ｄ）上図：単一転写物からIFRB-p65(361-550)およびZFHD1-3FKBPの両方の発現に用いたIRES含有プラスミドの模式図。下図：安定に組み込まれたpLH-ZHWTx12-IL2-SEAPリポーター遺伝子を既に含んでいるHT1080細胞中に、ゼオシンに対する耐性を付与するプラスミドと一緒に、pCGNN-1FRB-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBPをトランスフェクションした。ゼオシン耐性クローンであるHT23細胞のプールを表示濃度のラパマイシンと一緒にインキュベーションし、増殖培地中に分泌されたSEAP活性を測定した。図５は、各種配置形態の転写因子融合タンパク質を用いたラパマイシン依存性遺伝子転写実験の結果を示す。実験は、この系におけるラパマイシン結合性ドメインの最適な配置形態を決定する目的で行った。HT1080細胞を表示のZFHD1-FKBP およびFRB-p65(450-550)融合タンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を10nMラパマイシンを含有する培地でインキュベーションし、SEAP活性を測定した。トランスフェクションは３回行い、平均値（相対単位）±標準偏差をプロットした。イムノブロット分析の結果は、より高水準で発現を生じたZFHD1-1FKBPを除いて、全ての融合物が同程度の水準で発現したことを示している。トランスフェクションした各プラスミドの量を広範囲に変更した場合にも同様の結果が得られた。結果は、４回の別々の実験の表示である。図６は、遺伝子工学処理された細胞を予め移植しておいた動物への二量体化剤のin vivo投与が、調節された遺伝子発現ならびに遺伝子産物の産生および分泌を生じたことを示す。トランスフェクションされたHT1080細胞（異なる４個所に計２×10⁶個／動物）を、雄性nu/nuラットに筋肉内注射した。約１時間後、動物は表示濃度のラパマイシンの静脈内投与を受けた。ラパマイシン投与の17時間後に血液試料を採取し、hGH濃度について検定した。ラパマイシン処置は、血清hGH 濃度（Ｘ±SEM;ｎ＝用量ごとに最低５）の用量依存性の増大を生じた。*はそれぞれより低いラパマイシン用量からの統計学的有意性を意味し、+は10倍またはそれ以上低いラパマイシン用量からの統計学的有意性を意味する（ｐ＜0.05、分散およびターキー・クラマー多数回比較検定<Turkey-Kramerm ultiple comparis on testing>の１方向解析）。図７は、実施例４に記載（図６も参照）のように遺伝子工学処理し、マウスに移植したHT1080細胞が、ラパマイシンの静脈内投与後に長時間にわたってhGHを産生することができる能力を示す。各マウスは、トランスフェクションされたHT 1080細胞の移植後に10.0mg/kgのラパマイシンで処置した。ラパマイシン投与の４、８、17、24、および42時間後に血液試料を採取し、血清hGH濃度を測定した（Ｘ±SEM;ｎ＝地点ごとに最低４）。hGH応答の最終的な半減期は11.4時間であると算出された。図８は、移植された遺伝子工学処理細胞が、最初の投与の作用が消失した後に２回目のラパマイシン投与により再刺激される能力を示す。ラパマイシン（10.0 mg/kg）を多数の時点（矢印）で投与した。データは、Ｘ±SEM(ｎ＝地点ごとに４〜９マウス)としてプロットした（実線）。実験の時間中を通して循環していると推定されるラパマイシンの濃度もプロットした（破線）。図中に「推定トラフ(trough)ラパマイシン濃度」として示す平らな水平の線は、ラパマイシンの薬物速度論およびこの試験で採用した16時間の投与間隔から算出したラパマイシンの定常状態トラフ濃度を表す。80時間から始まる下降線は、推定循環ラパマイシン濃度を表し、これは4.6時間の消失半減期を示している。図９は、実施例６に記載した競合的FP検定を用いたFKBP結合親和性に対する各種のラパマイシンC24オキシム（実施例５に記載のようにして調製）の分析結果を示す。結果は、２つの別個の実験の平均値±SDで示す(C24メチルオキシムのプロットは１回の実験を示す)。図10は、表示化合物の存在下にHis6標識FKBPと一緒にインキュベーションした後、Ni-NTAアガロースでの捕捉および溶離した場合の、FRAP(アミノ酸2015-2114 )を表示（発現）するファージミド(phagemids)の特異的集積(enrichment)を示す。結果は、非表示の対照ファージミドに対するFRAPファージミドの比として示し、ソート前の比＝１である。実験の詳細は実施例７。図11：実施例７に記載のようにしてFKBP表示ファージを調製し、その結合性を ELISAにより分析した。一定量のFKBPファージ粒子を異なる濃度のFK506と一緒にインキュベーションした後、ストレプタビジン(streptavidin)に結合させたビオチニル化FK506を塗布したウェルに適用した。ファージ結合は、HRPに複合した抗ファージポリクローナル抗体により視覚化された。エラー棒線は、三回の測定の SDを示す。結果は、ファージ上に表示されたFKBPが、可溶性タンパク質（IC50=5 0nM）と本質的に同一の値でFK506と相互作用することを示している。図12は、シグナル伝達プロセスのラパマイシン依存性制御に有用な配列形態の代表例を示す。M/Eは、キメラ構築物を膜に位置させるミリストイル化モチーフまたは細胞外レセプタードメインを意味し；EFFはオリゴマー化により細胞性応答を誘起させるエフェクタードメイン（例えば、FASの死滅ドメインを含むポリペプチド）を意味する。どちらの配置形態を使用しても、エフェクタードメインをホモ二量体化またはヘテロ二量体化（ヘテロ二量体化は(a)においてEFFおよび EFF'なる表示により示される）することができる。多くの他の配置形態も実現可能であり、特に各ドメインの順序および数は適宜変更することができる。図13は、実施例８に記載したように、ミリストイル化ドメイン、ヒトFRAPからのFRBドメイン、hFKBP12からのFKBPドメイン、およびFasの細胞内ドメインの一部からなる混合キメラタンパク質を発現する細胞の生存の減少(a，b)を示す。(c )は、AP1428の存在下では二量体化するが、ラパマイシンの存在下ではしないように設計した、ミリストイル化ドメイン、２つのFKBPドメインおよびFas細胞内ドメインからなるキメラを用いた対照実験を示す。図14は、Lex結合部位を含むDNAと一緒にインキュベーションしたほぼ同量のLe x-FKBPおよびLex-FRAPタンパク質を含有する結合反応のゲル移動度シフト検定を示す。ラパマイシンの不存在下では、特異的結合は全く検出されない（図14、列１）。結合反応中のラパマイシンの混入量が増えると、同時に移動度シフトゲル中に特異的複合体の出現を生ずる（列２〜４）。この結果は、LexA標的配列を含むDNAに結合することができるLex-FKBP／Lex-FRAPヘテロ二量体の生成をラパマイシンが促進するという結論を支持する。それ以上の詳細については実施例９を参照。発明の詳細な説明次の定義および説明情報は本発明の開示の完全な理解に役立つであろう。 FRB ドメインは、典型的には少なくとも約89のアミノ酸残基からなるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）であり、FKBPタンパク質およびラパマイシン（またはラパログ）との三成分複合体を形成することができる。FRBドメインは、ヒトおよび他の種からのFRAPタンパク質（文献によっては"RAPT1"または"RA FT"とも呼ばれる）；Tor1およびTor2を包含する酵母タンパク質；ならびにカンジダFRAP同族体を始めとする多数の天然タンパク質中に存在している。これらのタンパク質のヌクレオチド配列、クローニング、および他の特徴に関する情報は当該技術分野では既に公知であり、例えば周知の方法および公表された配列に基くPCRプライマーを用いて、所望のFRBペプチド配列をコードするDNAの合成またはクローニングが可能である。本発明に用いるFRBドメインは、一般に少なくとも約89〜100のアミノ酸残基を含有する。Chiu et alの同上文献の図２は、保存されたFRB領域を包含するヒトF RAP、ネズミFRAP、S．cerevisiae(サッカロミセス・セレビシエ)Tor1およびS．c erevisiae Tor2の160アミノ酸範囲を表示している。典型的には、本発明の融合タンパク質に使用するために選ばれたFRB配列は、上記の図の配列番号で、Glu-3 9からLys/Arg-127までの少なくとも89のアミノ酸配列に及んでいよう。因みに、 Chen et alまたはSabitini et alの配列番号を使用すると、この89のアミノ酸配列の番号は、ヒトFRAPの場合でGlu-2025からLys-2113まで、Tor2の場合でGlu-19 65からLys-2053まで、Tor1の場合でGlu-1962からLys-2050までになる。本発明の融合タンパク質に用いるFRBペプチド配列は、ラパマイシンまたはラパログに結合されたFKBPタンパク質の複合体に結合することができ（このような結合を検出するための任意の手段により直接的または間接的に決定して）、かつ上述したタンパク質の指定された89のアミノ酸領域または相同タンパク質の対応領域にまたがる天然のペプチド配列を含んでいてもよく；この天然配列に対してその領域内に約10個まで（好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでいてもよく；天然FRB領域をコードするDNA分子と選択的にハイブリッド形成することができるDNA配列によりコードされるペプチド配列であってもよく；或いは遺伝暗号の縮重がなければ天然のFRB領域をコードするDNA分子と選択的にハイブリッド形成することができるDNA配列によりコードされるものであってもよい。 FKBP（FK506結合性タンパク質）は、FK506、FK520およびラパマイシンのようなマクロライド(macrolide)の細胞質ゾル（サイトゾル）性レセプターであり、種の主系統にわたり高度に保存されている。本発明の開示の目的にとって、FKBP は、本発明のラパマイシンまたはラパログに結合することができ、さらにFRB含有タンパク質と三成分複合体を形成することができる、タンパク質またはタンパク質ドメインである。各種のFKBP種のヌクレオチド配列、クローニング、および他の特徴に関する情報は当該技術分野では既に公知であり、例えば周知の方法および公表された配列に基づいたPCRプライマーを用いて、所望のFKBPペプチド配列をコードするDNAの合成またはクローニングが可能である。例えば、Staendart et al，1990，Nature 346，671-674(ヒトFKBP12)；Kay，1996，Biochem．J．31 4，361-385(レビュー)を参照。他の哺乳動物種、酵母、および他の生体内の相同 FKBPタンパク質も当該技術分野で公知であり、本書に開示する融合タンパク質に使用することができる。例えば、Kay，1996，Biochem．J．314，361-385(レビュー)を参照。本発明に使用するFKBPドメインのサイズは、どのFKBPタンパク質を使用するかに応じて変わってくる。本発明の融合タンパク質に用いるFKBPペプチド配列は、ラパマイシンまたはラパログに結合して、FRB含有タンパク質との三成分複合体の形成に関与することができ（このような結合を検出するための任意の手段により直接的または間接的に決定して）、かつヒトFKBP12タンパク質（後で例示）に由来する天然のペプチド配列、または他のヒトFKBP、ネズミその他の哺乳動物のFKBP、もしくは何らかの他の動物、酵母もしくは真菌のFKBPに由来するペプチド配列を含んでいてもよく；この天然配列に対してその領域内に約 10個まで（好ましくは１〜５個）のアミノ酸の置換、挿入または欠失を含んでいてもよく；天然のFKBPをコードするDNA分子と選択的にハイブリッド形成することができるDNA配列によりコードされるペプチド配列であるか或いは遺伝暗号の縮重がなければ天然のFKBPをコードするDNA分子と選択的にハイブリッド形成することができるDNA配列によりコードされるものであってもよい。本書で使用した「選択的にハイブリッド形成することができる」なる語句は、２つのDNA分子が、ハイブリッド形成条件（これは当該技術分野の通常の知識をもつ実施者により経験的に選択ないし容易に決定することができる）下で、他の DNA分子の存在にもかかわらず、相互にハイブリッド形成し易いことを意味する。このような処置としては、0.2〜6xSSCおよび／または0.1〜1% SDSを含有する緩衝液により室温ないし65〜75℃の範囲の温度で強く洗浄するといった、高緊縮度の条件を含む。例えば、F.M．Ausubel et al編，Short Protocols in Molecul ar Biology，Units 6.3および6.4（John Wiley and Sons，New York，第３版，1 995）を参照。本書で用いた「組換え」、「キメラ」および「融合」なる用語は、各種の成分ドメイン又は配列が、これらが本来は同じ配置内に一緒に存在しないという意味で互いに異種であるということを意味する。より具体的には、これらの成分部分は、本来は同じ連続ポリペプチドもしくはヌクレオチド配列または分子内で、少なくとも本発明のキメラタンパク質または組換えDNA分子に存在するのと同じ順序もしくは向きまたは同じ間隔では見出されない。「二量体化」、「オリゴマー化」および「多量体化」は、本発明の実施において、２またはそれ以上のタンパク質が、１つの共通のリガンドへの各タンパク質の結合を経て会合することを意味する。FRBドメインを含むタンパク質、FKBPドメインを含むタンパク質、およびラパマイシン分子からなる三成分複合体の形成は、二量体化の例である。本発明のある態様では、融合タンパク質はFRAPおよび／またはFRBドメインの複数のコピーを含んでいる。このようなタンパク質の複合体は、２分子以上のラパマイシンまたはラパログと、成分タンパク質の１または２以上の２コピー以上を含有することがある。このような多量体複合体も、１または２以上の成分が複数コピーで有するとしても、３種類の成分分子の存在を表すために本書ではなお三成分複合体と称することにする。ラパログは、FKBP融合タンパク質と結合することができ、かつFKBP融合タンパク質およびFRB融合タンパク質との複合体を形成することができる、ラパマイシン以外の化合物であり、好ましくは分子量が５kD以下、より好ましくは2.5kD以下である。特に興味あるラパログとしては、次式で示される、ラパマイシンそれ自体以外の化合物が挙げられ、上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-OC(O)R¹，-OC(O)NHR¹，-SR¹，-NHR¹，-NHC(O)R¹，-N H-SO₂-R¹または-R²であり；Ｖは-OR³または（=O）であり；Ｗは=O，=NR⁴，=NOR⁴ ，=NNHR⁴，=NHOR⁴，-NHNHR⁴，-OR⁴，-OC(O)R⁴，-OC(O)NR⁴，または-Hであり；Ｙは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵であり；Ｚは=O，-OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶ ，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり；R²は置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリール（例、ベンジルまたは置換ベンジル）であり；R³はH，-R⁷，-C (O)R⁷，-C(O)NHR⁷,またはC-28／C-30環式カーボネートであり：R¹，R⁴，R⁵，R⁶ およびR⁷は、H,アルキル，アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれ、上記化合物は個々の分割された立体異性体ならびにそれらの混合物を包含する。特に興味あるラパログは、天然のヒトFKBPおよびFRBドメインからなるタンパク質と、レセプタードメインの一方または両方が少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または付加を含んでいる対応するFKBPおよびFRBドメインを含むタンパク質と比べた場合に、測定可能により低い親和性で複合体を形成する。・・・・上述したように、キメラタンパク質は、FRAPまたはFKBPタンパク質に由来するペプチド配列を含んでいる少なくとも１つの「レセプター」または「リガンド結合性」ドメインと、このレセプタードメインに対して異種であるが、キメラタンパク質分子のオリゴマー化により細胞性または生物学的な応答を発動することができる少なくとも１つの「作用」ドメインとを含んでいる。このキメラタンパク質の作用ドメインは、キメラタンパク質のオリゴマー化またはクラスター化により所望の生物学的結果を達成することができる広範囲の多様なタンパク質ドメインから選択しうる。例えば、ある作用ドメインは、特定の細胞位置（膜、核、他のオルガネラ等）にキメラタンパク質を向かわせることができる局在化ドメイン、または例えば成長因子レセプターもしくはサイトカインレセプターの細胞内ドメインに由来し、クラスター化または多量体化により、細胞成長もしくは増殖、所望遺伝子の転写、細胞死または他の何らかの所望の結果に至る細胞内シグナル伝達経路を開始させることができるシグナル化ドメインから構成しうる。例えば、Ｔ細胞レセプターCD3ゼータドメインの細胞内部分に由来する作用ドメインを含んでいるキメラタンパク質のクラスター化は、IL-2プロモーターまたはその誘導体の転写制御下で遺伝子の転写を発動する。別の態様では、作用ドメインはFA S抗原またはTNF-アルファレセプター(TNFアルファ-R1)のようなタンパク質に由来するドメインからなり、これはオリゴマー化により細胞のアポトーシスを発動することができる。さらに別の態様では、作用ドメインは、キメラタンパク質のオリゴマー化が、DNA結合性ドメインにより認識される（このドメインと特異的結合相互作用をすることができる）DNA配列に連結された遺伝子の転写を生じる転写因子複合体を組立てるように対を選択した、GAL4のようなDNA結合性ドメインとVP16のような転写活性化ドメインとからなる。これらのキメラタンパク質の発現をコードするDNA構築物質（および標的遺伝子をコードするDNA構築物のような補助構築物）を、宿主細胞の遺伝子操作に使用するために用意する。本発明の遺伝子工学処理された細胞を作製するには、前述したDNA構築物を含み、かつ所望のキメラの発現を指令することができる組換えDNA分子を宿主細胞内に導入する。任意の所望の補助構築物も導入する。これは慣用の方法および材料（多様なその例が市販されている）を用いて行うことができる。所望により、修飾された細胞をその後に選択し、他の細胞から分離し、培養してもよく、これらも常法により実施できる。本発明の遺伝子工学処理された細胞は、このようなキメラタンパク質をコードする少なくとも１つのDNA構築物を含み、かつこれを発現させることができる。ある態様では、この細胞は、適当なリガンドの存在下で多量体化することができる一対の本発明のキメラタンパク質をコードするDNA構築物を含み、かつこれを発現させることができる。別の態様では、細胞は、多量体化されたキメラタンパク質に応答性のDNA要素の発現制御下で標的遺伝子を含有する標的遺伝子構築物をさらに含んでいる。遺伝子工学処理された細胞は、１または２以上の導入されたDNA分子により一時的にトランスフェクションされたものでも、安定的に形質転換されたものでもよい。有用な多量体化用のリガンドとしては、本発明のFRBおよびFKBPドメインを二量体化することができるラパマイシンおよびラパログが挙げられる。このような化合物は２価リガンドである、即ち、それぞれFRAPおよびFRBドメインを含有する２またはそれ以上のキメラタンパク質分子に結合して多量体化することができる。本発明の多くの態様が、一対の異なるキメラタンパク質をコードする２つの組換えDNA分子（または同じDNA分子内の少なくとも２つの組換えDNA配列）に関連する。第１の組換えDNA分子は、（i）ラパマイシンまたはラパログに結合することができる少なくとも１つのFKBPドメインと、(ii)このようなFKBPドメインの少なくとも１つに対して異種の少なくとも１つのタンパク質("作用")ドメインとからなるキメラタンパク質をコードする。この種のキメラタンパク質を単に「FKBP キメラ」と称するが、これはラパマイシンまたはラパログに結合して、FKBP12のような天然のFKBPタンパク質のラパマイシンへの結合により形成される複合体に類似した複合体を形成することができる。第２の組換えDNA分子は、（i）第１のキメラタンパク質とラパマイシンまたはラパログとにより形成された複合体に結合することができる少なくとも１つのFRBドメインと、(ii)このようなFRBドメインの少なくとも１つに対して異種の１つのタンパク質("作用")ドメインとを含んでいるキメラタンパク質をコードする。この種のキメラタンパク質を、単に「FR APキメラ」と称する。FKBPキメラとFRAPキメラの対は、例えば共免疫沈降を始めとする多用な手段により検出できる、ラパマイシンまたはラパログと一緒に三成分複合体を形成することができる。１キメラ当たりに複数のFKBPおよび／またはFRBドメインを包含する態様は、ラパマイシンまたはラパログの存在下で、より高次の多量体を形成することができる。一部の態様は、１もしくは２以上の FRBドメインおよび少なくとも１つのレセプタードメインに対して異種の１もしくは２以上のFKBPドメイン、１もしくは２以上作用ドメインを含有する「混合」キメラタンパク質をコードする組換えDNA分子に関連する。混合キメラは、混合キメラタンパク質分子のラパマイシンまたはラパログへの相互結合により、タンパク質ホモ二量体またはホモ多量体を形成することができる。１または２以上のリガンド結合性（即ち、レセプター）ドメインと、例えば、標的遺伝子の転写活性化、細胞死もしくは他のシグナル伝達経路の発動、細胞局在化等のための、１または２以上の作用ドメインとを含むキメラタンパク質は、 PCT/US94/01617、PCT/US94/08008、およびSpencer et al同上論文に開示されている。リガンドが媒介する遺伝子ノックアウト、またはリガンドが媒介する遺伝子発現の阻止もしくは遺伝子産物の機能阻害のためのこの種のキメラタンパク質の設計および使用は、PCT/US95/10591に開示されている。標的遺伝子の調節された転写を包含する態様に有用な新規なDNA結合性ドメインとこれが結合するDNA配列は、例えば、Pomeranz et al，1995，Science 267:93-96に開示されている。これらの文献は、本発明の実施者に有用かも知れない類似のキメラをコードする DNA構築物、標的遺伝子構築物、多価リガンド、および他の要素の設計、構築、および使用に関する実質的な情報、指針および実例を提供する。PCT/US95/06722 (Mitotix，Inc.)も参照。以上の文献の全内容をここに参考文献として援用する。キメラタンパク質を適切に選択すると、本発明により、PCT/US94/01617および PCT/US94/08008ならびに上に引用した他の文献に記載の系と同様に、ラパマイシンまたはラパログに依存して、遺伝子工学処理された細胞内での所望遺伝子の転写の活性化、アポトーシスの作動、または他の生物学的事象の発動が可能となる。遺伝子工学処理された細胞、好ましくは動物細胞は、培養状態の増殖中または保持されたものでもよく、或いはヒトの遺伝子治療、形質転換動物、および他のこの種の用途の場合のように、完全な生体内に存在していてもよい。ラパマイシンまたはラパログ多量体化剤は、対応するリガンド結合性ドメインを含有するキメラタンパク質を多量体化させるのに有効な量で（投与により発動された標的遺伝子の転写、アポトーシスまたは他の生物学的プロセスを監視することにより間接的に観察しうる）、細胞培養物または遺伝子工学処理された細胞を含んでいる生体（場合に応じて）に投与される。完全な生体に投与する場合、ラパマイシンまたはラパログは、その多量体化剤と１種もしくは２種以上の許容される獣医学用もしくは薬剤用希釈剤および／もしくは賦形剤とを含有する組成物の形態で投与してもよい。キメラタンパク質の一方には結合するが、両方のキメラタンパク質と三成分複合体を形成することのない化合物を、多量体化拮抗剤として使用してもよい。その場合、この化合物は、多量体化剤の効果を阻止または逆転させる、即ち、キメラの多量体化を防止、阻害または止める、のに有効な量で、遺伝子工学処理された細胞またはそれを含む生体に（好ましくは完全な動物に投与する場合には上述した組成物の形態で）投与される。例えば、ラパマイシンが多量体化剤として作用しうる場合には、FK506、FK520またはその他のFKBPおよびFRAPとの三成分複合体を形成しない多くの合成FKBPリガンドのいずれかを拮抗剤として使用することができる。本発明の１側面によれば、所望遺伝子の転写のリガンド依存性の直接活性化のための材料および方法が提供される。かかる１態様において、２以上の異なるキメラタンパク質と、それらの発現を指令することができる対応するDNA構築物とからなる１セットが提供される。このようなキメラタンパク質の１つはその作用ドメインとして１または２以上の転写活性化ドメインを含んでいる。他方のキメラタンパク質はその作用ドメインとして１または２以上のDNA結合性ドメインを含んでいる（図１）。本発明のラパマイシンまたはラパログは両方のキメラと結合して二量体または多量体複合体を形成することができ、この複合体はかくして少なくとも１つのDNA結合性ドメインと少なくとも１つの転写活性化ドメインとを含んでいる。このような複合体の形成は、標的遺伝子産物の存在または濃度を直接的または間接的に監視することにより観察されうるように、前記DNA結合性ドメインが結合することができるDNA配列にこのDNA配列の転写制御下で連結された標的遺伝子の転写の活性化を生ずる。好ましくは、DNA結合性ドメインと、これを含有するキメラは、他のDNA配列、たいていは非常に多くの他のDNA配列が共存していても選択されたDNA配列への結合が観察されうる（直接的または間接的に）ような十分な選択性で、その認識されたDNA配列に結合する。選択されたDNA配列へのDNA結合性ドメインを含むキメラの結合は、in vitro結合試験により測定するか、または選択されたDNA配列に連結する遺伝子の転写の速度または水準を任意の別のDNA配列による場合と比べて相対的に測定して、任意の別のDNA配列への結合より少なくとも２桁、より好ましくは少なくとも３桁、さらにより好ましくは４桁以上も大きくなることが好ましい。１セットの構築物を任意の所望の補助構築物と一緒に含有するように遺伝子工学処理された細胞は、所望の生物学的事象のリガンド媒介による調節された作動、所望遺伝子の調節された転写、アポトーシスの発動のようなシグナル伝達経路の調節された発動、または他の事象を包含する用途に使用しうる。例えば、標的遺伝子の調節可能な発現のために遺伝子工学処理された細胞は、標的遺伝子によりコードされる所望のタンパク質（または他の遺伝子産物）の調節された産生に使用することができる。このような細胞は、慣用手段により培養により増殖させてもよい。この細胞を含む培地にリガンドを添加すると、細胞による標的遺伝子の発現とその遺伝子によりコードされるタンパク質の産生を生ずる。遺伝子の発現とタンパク質の産生は、培地にそれ以上の多量体化剤を加えないか、培地から残留多量体化剤を除去するか、または培地に多量体化拮抗剤を添加することにより停止させることができる。本発明の遺伝子工学処理された細胞は、完全な生体、好ましくは動物、特にヒトを、例えば細胞がこれを含む動物内で所望のタンパク質または他の結果を生ずるように変えるために、in vivoで作製および／または使用することもできる。このような用途は遺伝子治療への応用を包含する。アポトーシスの調節可能な作動を包含する態様は、リガンドで誘導可能な細胞死に感受性のある遺伝子工学処理された細胞を提供する。このような遺伝子工学処理細胞は、これをその意図した用途（例、所望のタンパク質または他の産物の産生）に供した後、これが望ましくない特性を持つか作り出す場合、またはこれがもはや有用、安全または望ましいものではなくなった場合、細胞培養物または宿主生体から消去することができる。消去は、ラパマイシンまたはラパログを培地に添加するか、または宿主生体に投与することにより行われる。この場合、キメラの作用ドメインは、オリゴマー化によりアポトーシスを発動するFAS抗原またはTNF-R1の細胞内ドメインのようなタンパク質ドメインである。従って、本発明は多量体化リガンドの添加に応答して細胞内に生物学的効果を達成するための材料および方法を提供する。この方法は、ここに説明したように遺伝子工学処理された細胞を用意し、この細胞をリガンドに暴露することを包含する。例えば、本発明は、細胞内の標的遺伝子の転写を活性化する方法を提供する。この方法は、（a）リガンド媒介多量体化により標的遺伝子の転写を開始させることができる本発明の１組のキメラタンパク質をコードするDNA構築物と、（b）多量体化事象に応答性の関連の同族(cognate)のDNA配列に結合した標的遺伝子（例、前記の１つのキメラタンパク質のDNA結合性ドメインで認識される、即ち、これと結合することができる、DNA配列）を含有する細胞を用意することを含む。この方法は、この細胞を、標的遺伝子の発現を生ずるのに有効な量のキメラタンパク質に結合することができる多量体化リガンドに暴露することを含む。細胞が培養状態で増殖中の場合、細胞のリガンドへの暴露は、培地にリガンドを添加することにより達成されうる。細胞が宿主生体内に存在する場合には、そのリガンドへの暴露は、宿主生体にリガンドを投与することにより達成される。例えば、宿主生体がヒトまたはヒト以外である場合、宿主生体へのリガンドの投与は、そのための適当なビヒクルを用いて、経口、バッカル、舌下、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、関節内または吸入投与により行うことができる。この場合も、キメラタンパク質に対する構築物および任意の補助構築物の設計に応じて、リガンド媒介生物学的事象は、細胞成長、細胞増殖、遺伝子転写、もしくはアポトーシスを生ずるシグナル伝達のような細胞機能の活性化；対象遺伝子の欠失、対象遺伝子の発現の阻止、もしくは対象遺伝子産物の機能の阻害；対象遺伝子の直接転写などでよい。本発明はさらに、本発明のラパマイシンまたはラパログを、薬剤に許容される担体および場合により１種もしくは２種以上の薬剤に許容される賦形剤と混和してなる薬剤組成物も包含する。このような薬剤組成物を使用して、例えば本書に開示した目的のいずれかを達成するためのヒトの遺伝子治療用途において、完全な動物内の遺伝子工学処理された細胞内で本発明のキメラの多量体化を促進させることができる。換言すると、本発明は、前述した目的、例えば、標的遺伝子（典型的には治療用タンパク質のための異種遺伝子）の転写の活性化、細胞の成長もしくは増殖、細胞死または他の何らかの選択された生物学的事象、の何れかを、これを必要とし、本発明の遺伝子工学処理された細胞を含んでいる動物、好ましくはヒトの患者において達成するための方法を提供する。その方法は、ラパマイシンまたはラパログを含有する薬剤組成物を、遺伝子工学処理された細胞の少なくとも一部においてキメラタンパク質の多量体化を生じさせるのに有効な投与経路および量で該動物に投与することを包含する。多量体化は、遺伝子発現の出現；細胞の成長、増殖もしくは死；またはキメラを設計し、細胞を遺伝子工学処理した他の目的を検出することにより間接的に検出しうる。本発明はさらに、本発明の多量体化拮抗剤を、薬剤に許容される担体および場合により１種もしくは２種以上の薬剤に許容される賦形剤と混和してなる、被験者における本発明の遺伝子工学処理された細胞内のキメラタンパク質の多量体化の程度を、全体的または部分的に、阻害ないし軽減し、こうして、例えば標的遺伝子の転写を失活させ、または別の本発明の生物学的作用を停止させるための薬剤組成物も包含する。即ち、本発明は、多量体化試薬を使用した薬剤組成物と、多量体化拮抗剤の試薬を使用した薬剤組成物の両方を調製し、それらの薬理学的作用を達成することを包含するものである。本発明はまた、本発明の多量体化リガンドに応答性である宿主生体、好ましくは動物、典型的にはヒト以外の哺乳動物またはヒトを供与する方法も提供する。この方法は、本発明に従って予め遺伝子工学処理された細胞、即ち、キメラタンパク質をコードする１または２以上のDNA構築物を含有する細胞等を生体に導入することを包含する。遺伝子工学処理された細胞は、宿主生体に導入する前に、多様な材料および方法のいずれかを用いてカプセル化してもよい。或いは、本発明のDNA構築物を例えば哺乳動物といった宿主生体に、例えばウイルスベクターを用いた宿主哺乳動物の１または２以上の細胞中へのDNAの取り込み、注射もしくはカテーテルによるDNAの導入等が可能な条件下で導入することができる。本発明のラパマイシンまたはラパログに応答性の細胞を作製するためのキットもまた提供される。このようなキットの１つは、リガンドが媒介するオリゴマー化により所望の生物学的応答を発動するキメラをコードし、その発現を指令することができる１または２以上のDNA構築物を含んでいる。このキットはまた、キットのDNA構築物によりコードされるキメラタンパク質分子を多量体化することができる、ある量のオリゴマー化リガンド（ラパマイシンまたはラパログ）を含んでいてもよく、さらにある量の多量体化拮抗剤を含んでいてもよい。このキットはさらに、二量体化されたキメラタンパク質により認識される同族のDNA配列に連結した標的遺伝子（またはクローン化部位）をコードするDNA構築物を含んでいてもよい。それにより、多量体化されたキメラタンパク質分子の存在下でその同族DNA配列に連結した遺伝子の転写が可能となる。DNA構築物には、トランスフェクタントの選択の便宜のための１または２以上の選択マーカー、ならびに原核生物中での複製、真核生物中での発現などに有用な他の慣用のベクター要素が付属していることが好ましい。選択マーカーは、異なるDNA構築物ごとに同じでも、または異なっていてもよく、このような各DNA構築物を含む細胞の選択が可能になる。細胞内に同族DNA配列と一緒に標的遺伝子を導入するための補助構築物は、標的遺伝子の代わりにクローン化部位を含んでいてもよい。このような構築物を含むキットは、遺伝子の調節可能な発現のための細胞の遺伝子工学処理を実施者が提供することを可能にする。本発明の別のキットは、キメラタンパク質のための１または２（またはそれ以上）のDNA構築物を含んでいてもよく、その１または２以上が転写活性化剤またはDNA結合性タンパク質の代わりにクローン化部位を含んでいて、このようなドメインのうち使用者が望むどのドメインも挿入することが可能である。このようなキッットは任意に、上述したような他の要素、例えば、予め選択したDNA結合性ドメイン用の同族のDNA配列を伴うか、伴わない標的遺伝子用のDNA構築物、を含んでいてもよい。キットのどれも、リガンドへの細胞の暴露に応答してリポーター遺伝子（CAT では、β−ガラクトシダーゼまたは任意の検出の容易な遺伝子産物）を発現するように本発明の構築物で安定に形質転換された陽性対照(positive control)細胞をさらに含有していてもよい。リポーター遺伝子の発現の検出および／または定量のための試薬もまた提供しうる。FKBP キメラ FKBPキメラタンパク質は、FKBPのペプチド配列の全部または一部を含む少なくとも１つのリガンド結合性ドメインと、少なくとも１つの異種の作用ドメインとからなる。このキメラタンパク質は、直接結合測定（例、蛍光消光）、競合結合測定(例、対FK506)、FKBP酵素活性（ロタマーゼ）の阻害、または他の検定方法により測定して、好ましくは約100nM以下、より好ましくは約10nM以下、さらにより好ましくは約１nM以下のKd値で、ラパマイシンまたはラパログに結合可能でなければならない。典型的には、このキメラタンパク質は、例えば、国際特許出願PCT/US94/01617に記載されているような、FKBP12のそれに対応するペプチド配列からなる１または２以上のタンパク質ドメインを含有していよう。そのペプチド配列は、通常は10個以下、好ましくは５個以下のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失により結合特異性を調整するように修飾されていてもよい。このような修飾は、ある態様では、下記(a)または(b)の結合プロフィールの一方または両方を生ずるように選択される：(a)FKBP12または遺伝子工学処理すべき宿主細胞に内生するFKBPに比べて、修飾されたFKBPドメインまたはこれを含むキメラへのラパログの結合が、好ましくは少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁、さらにより好ましくは３〜４桁またはそれ以上の大きさで良好である（いずれかの測定法で）；および(b)遺伝子工学処理すべき宿主細胞に内生するFRAPまたは他のFRB含有タンパク質に比べて、第２のキメラ（これは、後述するように少なくとも１つのFRBドメインを含んでいる）へのラパマイシンまたはラパログとFKB Pキメラから形成された複合体の結合が、好ましくは少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁、さらにより好ましくは少なくとも３桁の大きさで良好である（いずれかの測定法で）。 FKBPキメラは、少なくとも１つの異種の作用ドメイン、即ち、非FKBPペプチド配列を含むタンパク質ドメインも含んでいる。この作用ドメインは、本明細書の別の個所、またはPCT/US94/01617もしくは他の引用文献に記載されているように、DNA結合性ドメイン、転写活性化ドメイン、細胞局在化ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメインなどでよい。一般的に言って、作用ドメインは、他の作用ドメインとの会合または凝集により（例えば、同一もしくは異なる作用ドメインを含むタンパク質の多量体化により）、キメラタンパク質を選択された特定の細胞位置に向かわせるか、または生物学的作用を開始させることができる。このようなタンパク質をコードする組換えDNAは、元のFKBPタンパク質、例えば、ヒトFKBP12をコードするDNAと選択的にハイブリッド形成することができるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能となろう。これらのキメラタンパク質は、別のタンパク質、例えば、Ga14，VP16，FAS ，CD3ゼータ鎖等、に由来する作用ドメインを含んでいるので、このキメラタンパク質をコードする組換えDNAも、そのような他のタンパク質をコードするDNAと選択的にハイブリッド形成することができるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能となろう。本発明のFKBPキメラタンパク質、ならびに後で詳述するFRAPキメラタンパク質は、１もしくは２以上の異なるリガンド結合性ドメインの１もしくは２以上のコピーと、１もしくは２以上の作用ドメインの１もしくは２以上のコピーとを含んでいてもよい。リガンド結合性ドメインは、作用ドメインに対してＮ末端、Ｃ末端、または散在のいずれでもよい。複数コピーのレセプタードメインを含む態様では、そのコピー数は通常は２、３または４である。例えば、FKBPキメラは、２、３または４個のFKBPドメインを含有しうる。FKBPキメラ（および後述するFRAP キメラ）の各種ドメインは、場合により結合ペプチド領域（これは隣接するドメインの１つに由来するものでもよく、または異種でもよい）により離されていてもよい。本発明の実施に有用なFKBPキメラの例示としては、PCT/US94/01617(Stanford & Harvard)，PCT/US94/08008(Stanford & Harvard)，Spencer et al(同上)， PCT/US95/10591（ARIAD）およびPCT/US95/06722（Miotix，Inc.）に開示されたF KBP融合タンパク質；後述する実施例に開示されたFKBP融合タンパク質；１もしくは２以上のFKBPドメインに10個まで（好ましくは１〜５個）のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換を含むが、ラパマイシンまたはラパログになお結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異体；天然のFKBPドメインをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成することができるDNA配列によりコードされたFKBPドメインの１もしくは２以上のコピーを含み、かつラパマイシンまたはラパログになお結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異体；１もしくは２以上の異種作用ドメインが欠失しているか、または別の異なる異種作用ドメインで置換もしくは追補されている前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異体；ヒト以外の供給源に由来するFKBPを含んでいて、ラパマイシンまたはラパログに結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異体；ならびにヒトFKBP12のTyr26，Phe36，Asp37，Arg42， Phe46，Phe48，Glu54，Va155，もしくはPhe99に対応する１もしくは２以上のアミノ酸残基を含み、これらのアミノ酸残基の１もしくは２以上が別の異なるアミノ酸で置換されているが、ラパマイシンまたはラパログに結合することができる、前記のFKBP融合タンパク質のいずれかの変異体、が挙げられる。例えば、多くの場合、FKBP融合タンパク質は、ヒトFKBP12のアミノ酸1-107を含むFKBPドメインの複数コピーからなり、各コピー間が、制限エンドヌクレアーゼSpeIおよびXbaIでそれぞれ消化されたDNAの連結用産物であるACTAGAでコードされる2-アミノ酸リンカーのThr-Argにより離された構造を持つ。次の表は前記F KBP12配列に基づく変異FKBPドメインのサブセットを示す。変異FKBPの例示注：記入は、本来のアミノ酸を１文字記号と配列位置で表記し、その後に変異体の置換アミノ酸を示す。例えば、Ｆ３６Ｖは、36位置のフェニルアラニンがバリンで置換されたヒトFKBP12配列を表示する。Ｆ３６Ｖ／Ｆ９９Ａは、36および99位置のフェニルアラニンがそれぞれバリンおよびアラニンで置換された二重変異を意味する。FRAP キメラタンパク質「FRAPキメラタンパク質」と称する第２の種類のキメラタンパク質は、少なくとも１つのFRBドメイン（これは、いずれかで説明するように、FRAPタンパク質またはその変異体のペプチド配列の全部または一部からなるものでもよい）と、少なくとも１つの異種タンパク質("作用")ドメインとからなる。一般的に言って、FRBドメインまたはこれを含むキメラタンパク質は、天然のF RBドメインからなるタンパク質をコードするDNA分子、例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物のFRAPタンパク質または酵母タンパク質Tor1もしくはTor2の一方または前述したカンジダFRB含有タンパク質をコードするDNA分子、と選択的にハイブリッド形成することができるDNA分子によりコードされる。本発明のFRBドメインには、FKBPタンパク質とラパマイシンまたはラパログとの複合体に結合することができるものが包含される。ここにより詳しく開示するように、ラパログは次式で示される化合物を包含する。上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-OC(O)R¹，-OC(O)NHR¹，-SR¹，-NHR¹，-NHC(O)R¹，-N H-SO₂-R¹または-R²であり、ここでR²＝置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリール（例、ベンジルまたは置換ベンジル）；Ｖは-OR³または(=O)であり；Ｗは=O，=NR⁴，=NOR⁴，=NNHR⁴，=NHOR⁴，-NHNHR⁴，-OR⁴，-OC(O)R⁴，-OC(O) NR⁴，または-Hであり；Ｙは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵であり；Ｚは=O，- OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり；ここでR³はH，-R⁷ ，-C(O)R⁷，-C(O)NHR⁷，またはC-28／C-30環式カーボネートであり、R⁴はHまたはアルキルであり、そしてR¹，R⁴，R⁵，R⁶およびR⁷は、別個にH，アルキル，アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれる。 FRAPキメラタンパク質は、FKBPキメラとラパマイシンまたはラパログとにより形成された複合体に結合することができなければならない。好ましくは、FRAPキメラはその複合体に、慣用の方法で測定して200μM以下、より好ましくは10μM 以下のKd値で結合する。FRBドメインは、ラパマイシンまたはラパログとFKBPキメラとの複合体に対して高い親和性を保持するのに十分な長さおよび組成のものであろう。ある態様では、FRBドメインは約150アミノ酸より少ない長さであり、別の態様では約100アミノ酸より少ない長さである。この種の領域の１例は、ヒトFRAPのVal²⁰¹²ないしTyr²¹⁴⁴に及ぶ133アミノ酸領域からなる。Chiu et al，1 994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:12574-12578を参照。特に興味あるFRB領域は、ヒトFRAPのGlu²⁰²⁵ないしGln²¹¹⁴の間の領域であり、FKBP12−ラパマイシン複合体に対する親和性を保持している。一部の態様では、この90アミノ酸の配列からQ2214が取り除かれ、これが89アミノ酸のFRBドメインになっている。FRBペプチド配列は、結合特異性を調整するため、通常は10個まで、好ましくは５個以下のアミノ酸の置換、挿入もしくは欠失により修飾されていてもよい。このような修飾は、一部の態様において、内生のFKBPおよびFRAPタンパク質とラパマイシンまたはラパログとの複合体の形成より、１または２分子以上のFKBP キメラ、FRAPキメラならびにラパマイシンもしくはラパログからなる複合体の形成が優先的となるように選択される。好ましくは、この優先性は、少なくとも１桁、より好ましくは少なくとも２桁、さらにより好ましくは少なくとも３桁の大きさ（任意の測定法で）である。このようなタンパク質をコードする組換えDNAは、FRAP種をコードするDNAと選択的にハイブリッド形成することができるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能となろう。また、これらのキメラタンパク質は、別のタンパク質、例えば、Ga14，VP16，FAS，CD3ゼータ鎖等、に由来する作用ドメインを含んでいるので、このキメラタンパク質をコードする組換えDNAも、そのような他のタンパク質をコードするDNAと選択的にハイブリッド形成することができるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能となろう。本発明の実施に有用なFRBキメラを例示すると、後述する実施例に開示したもの、１または２以上の異種ドメインを別の異種ドメインで置換したか、別の１または２以上の異種ドメインを追補したその変異体、１または２以上のFRBドメインがヒト以外のペプチド配列起源のドメイン（例えば、Tor2またはカンジダのような）である変異体、ならびにFRBドメインがここに述べるようにアミノ酸の置換もしくは挿入により修飾されている変異体（但し、変異キメラは、FKBPタンパク質とラパマイシンまたはラパログとにより形成された複合体に結合することができる）が挙げられる。代表的なFRB融合タンパク質は、ヒトFRAPの2025-2113残基を含む89アミノ酸FRBドメインを１または２以上含有し、これが前述したようにSpeI-XbaI部位の連結により生成したThr-Argリンカーにより離された構造を持つ。本発明のどの融合タンパク質においても、このような制限部位またはリンカーは、部位特異性突然変異誘発のような慣用技術を用いて欠失、置換または延長させてもよいことは理解されるべきである。混合キメラタンパク質第３の種類のキメラタンパク質は、１または２以上にFKBP由来リガンド結合性（即ち、「レセプター」）ドメインと１または２以上の異種作用ドメインとからなるが、FRAPキメラについて説明したように、さらに１または２以上のFRBドメインを含んでいる。混合キメラタンパク質分子は、これが結合するラパマイシンまたはラパログの存在下で、ホモ二量体またはホモ多量体タンパク質複合体を形成することができる。混合キメラを利用した態様は、そうしないとFKBPキメラとFRAPキメラの両方の発現を指令するのに必要となる２種類の組換えDNA構築物の代わりに、単一の組換えDNA構築物の細胞内に導入するだけでよいという利点がある。混合キメラタンパク質をコードする組換えDNAは、FKBPタンパク質をコードするDNA、FRAPをコードするDNA、ならびに１もしくは２以上の作用ドメインの起源であるタンパク質（例、Ga14，VP16，FAS，CD3ゼータ鎖等）をコードする異種DN A配列と選択的にハイブリッド形成することができるか、または遺伝暗号の縮重がなければこのようなハイブリッド形成が可能となろう。異種ドメイン上述したように、FKBPおよびFRAPキメラの異種の作用ドメインは、これらを保有するキメラタンパク質の相互の会合により、DNA結合および／もしくは標的遺伝子の転写の発動（もしくは阻害）、細胞の成長、分化、増殖もしくはアポトーシスの作動、タンパク質の特定の細胞位置への誘導、または他の生物学的事象の作動を可能にするタンパク質ドメインである。調節可能な遺伝子転写に関連する態様は、第１および第２のキメラタンパク質の異種ドメインの会合または多量体化に応答性のDNA配列による転写制御下で、標的遺伝子（これは対象となるポリペプチド、アンチセンスRNA、リボチーム等をコードする）を含む標的遺伝子構築物を使用することを包含する。転写の直接的な活性化を行う本発明の態様では、第１および第２のキメラタンパク質の異種ドメインは、それぞれ、Ga14のようなDNA結合性ドメインまたは後述するZFHD1のようなキメラDNA結合性ドメイン、およびVP16またはp65に由来するもののような転写活性化ドメインからなる。このような転写活性化ドメインを含むキメラタンパク質が、DNA結合性ドメインを含むキメラタンパク質と多量体化すると、転写活性化剤は、DNA結合性ドメインが結合しているプロモーター要素を標的にするため、そのプロモーター要素に結合した標的遺伝子の転写を活性化させる。転写活性化ドメインを先にするか、または転写活性化ドメインの代わりにリプレッサードメイン（PCT/US94/01617を参照）を使用すると、標的遺伝子の転写を阻害するのに有用な類似のキメラが得られる。複合DNA結合性ドメインおよびこれが結合するDNA配列は、Pomerantz et al，1995，同上，に開示されており、その内容を参考のためにここに援用する。このような複合DNA結合性ドメインも、本発明を実施する際にDNA結合性ドメインとして、複合DBDが結合する同族DNA配列を含む標的遺伝子構築物と一緒に使用しうる。転写の間接的な活性化を行う態様では、キメラの異種ドメインは、凝集または多量体化により、応答性プロモーターの制御下で転写の活性化を発動するシグナル化タンパク質のエフェクタードメインである。例えば、このシグナル化ドメインはＴ細胞レセプターのゼータ・サブユニットの細胞内ドメインでよく、このドメインは凝集すると、IL-2プロモーターまたはその誘導体（例、反復NF-AT結合部位）に結合した遺伝子の転写を発動する。本発明の別の側面では、異種ドメインは、相互に会合すると細胞の死を引きおこすことができるタンパク質ドメインである。この種のドメインの例は、Fas抗原またはTNF R1の細胞内ドメインである。Fasドメインを含むキメラタンパク質はPCT/US94/01617の開示と同様にして設計および調製することができる。遺伝子工学処理されたレセプタードメイン既述したように、FKBPおよびFRBドメインは、天然のFKBPおよびFRBドメインのペプチド配列から選択されたペプチド配列を含有しうる。天然の配列は、ヒトFK BP12の配列およびヒトFRAPのFRBドメインの配列を含む。或いは、このペプチド配列は、このような天然のペプチド配列から誘導されるが、これらのペプチド配列の一方または両方に一般には10まで、好ましくは１〜５の変異を含んでいるものでもよい。本書でより詳しく開示し、図２に示すように、かかる変異は多くの重要な特徴を付与することができる。例えば、FKBPドメインは、これがあるラパログを優先的に、即ち、修飾していないFKBPドメインと比べて少なくとも１桁、好ましくは２桁，さらにより好ましくは３〜４桁もより効果的に、結合することができるように修飾してもよい。FRBドメインは、これがある(修飾もしくは非修飾)FKBP:ラパログ複合体を優先的に、即ち、修飾していないFRBドメインと比べて少なくとも１桁、好ましくは２桁，さらにより好ましくは３桁もより効果的に、結合することができるように修飾してもよい。FKBPおよびFRBドメインは、これらがラパログとの、またはラパマイシンとの三成分複合体を優先的に、即ち、修飾していないFKBPおよびFRBドメインと比べて少なくとも１桁、好ましくは２桁，さらにより好ましくは３桁もより効果的に、形成することができるように修飾してもよい。図２Ａ〜Ｅは、例示だけの目的で提示するものであり、代償的変異(compensatory mutation)を保有する多様に修飾されたラパログとレセプタードメインの他の関連する組合わせも本発明に包含され、各種の用途に適用することができる。 (a) FKBP 各種の置換基("バンプ")を含んでいるFK506の誘導体を結合させる高い能力を付与するFKBP変異を同定する方法が、PCT/US94/01617に開示されている。同様の手法は、バンプを持つラパマイシン誘導体、即ち、ラパログを優先的に結合させる修飾したFKBPを得るのにも使用できる。ラパマイシンとFKBP12との複合体の構造は既知である（例えば、Van Duyne et al，J．Am．Chem．Soc．(1991)113，74 33-7434を参照）。このようなデータを使用して、各種のラパログ置換基と衝突する可能性のあるアミノ酸置換基を明らかにすることができる。この手法では、分子モデルを用いてラパログ置換基に合うかもしれないFKBPドメイン中のアミノ酸置換基の候補を同定し、次いで部位特異的突然変異を用いて、こうして同定されたタンパク質変異を遺伝子工学処理してもよい。変異体を標準的な方法によって発現させ、変異体が適当な活性／親和性を保持している場合には、そのラパログに対する結合親和性を、例えばロタマーゼ活性の阻害またはFK506のような分子との結合に対する競合により測定する。より具体的には、C-13またはC-14に修飾のあるラパマイシン誘導体（即ち、Ｙが-OH以外の置換基であり、および／またはＺが=O以外であるラパログ）が、残基Tyr26，Phe36，Asp37，Tyr82およびPhe99のうちの１または２以上が、より小さな側鎖を持つアミノ酸（Gly，Ala，Val，MetおよびSerなど）で置換されたFKB Pに優先的に結合することを我々は考えている。26または36位に修飾のあるFKBP 変異体の例は、上掲の「変異FKBPの例」の表に示されている。同様に、C20に修飾のあるラパログ（即ち、R⁴が-H以外であるラパログ）は、Tyr82および／またはIle56が他のアミノ酸、特により小さな側鎖を持つアミノ酸で置換されたFKBP に優先的に結合することも考えられる。さらに別の例では、C24に修飾を持つラパログ（即ち、Ｗが=O以外であるラパログ）は、Phe46，Phe48およびVa155の１または２以上が他のアミノ酸、やはり特により小さな側鎖を持つアミノ酸、で置換されたFKBPに優先的に結合することも考えられる。さらに、C28および／またはC30に修飾のあるラパログ（即ち、R³がＨ以外、および／またはＶが=O以外）は、Glu54が他のアミノ酸、特により小さな側鎖を持つもので置換されたFKBPに優先的に結合することも考えられる。上記のすべての例で、単一または複数のアミノ酸の置換をなしうる。やはり、具体例は前記の表に示されている。単一または複数の変異の遺伝子工学処理と試験の反復という手法に代わる方法は、１または２以上のラパログまたはラパマイシン置換基と接触した、またはその近くにあるか、またはその可能性がある、構造が同定された残基を共ランダム化(co-randomination)する手法である。同定された位置（前節で述べたような）でランダム化されたFKBPドメインを含有するポリペプチドのコレクションを、例えば慣用の合成方法または遺伝学的方法により準備する。このようなコレクションは、かかる位置の１または２以上で置換アミノ酸を含有するFKBPドメインからなる１セットを意味する。このコレクションをスクリーニングして、所望のラパログ結合性を有するFKBP変異体を選び出す。一般に、数個の残基を同時にランダム化すると、これが側鎖間の有益な協同的相互作用の見込みを最大限にするため、所定のバンプを持つラパログに対してより高い親和性および特異性を持つ補償性変異体(compensating mutant)を生ずることが予想される。不連続な位置でランダム化されたライブラリを調製する技法は公知であり、縮重オリゴヌクレオチドを用いたプライマー特異性(primer-directed)変異誘発、縮重オリゴヌクレオチドを用いたPCR、および縮重オリゴヌクレオチドを用いたカセット変異誘発等を包含する（例えば、Lowman，H.B.，and Wells，J.A.，Methods:Comp．Methods E nzylmol．1991，3，205-216;Dennis，M.S．and Lazarus，R.A.，1994，J．Biol ．Chem．268，22129-22136;ならびにこれらの中の参考文献を参照）。多くの場合、ラパマイシンの所定位置に直接接触しているか、その付近の数個の残基だけのランダム化では、ラパログ置換基（バンプ）に最適に適合する可能性のあるFKBP配置形態の可能な変更例のすべてを探査することができないかも知れないことを我々はさらに考えている。即ち、バンプのあるラパログへの優先的結合性を付与する微妙な変異または組合わせを確定するには、構造上の考察に基づかないランダム置換基を持つ偏りのないライブラリーからも構成を考慮する。アラニン走査変異誘発(Cunningham and Wells（1989）Science 244，1081-1085) 、PCR誤取込み(misincorporation)変異誘発（Cadwell and Joyce，1992，PCR Me th．Applic．2，28-33を参照）、および「DNAシャフリング(DNA shuffling)」(S temmer，1994，Nature 370，389-391およびCrameri et al，1996，Nature Medic ine 2，100-103)を始めとするいくつかの適当な変異誘発スキームがこれまでに説明されている。これらの方法は、ランダム変異体または単一変異体（single m utants）のセットのライブラリーを製造でき、これをその後でスクリーニングまたは選択手法によりサーチする。多くの場合、所定バンプの優先的結合性に対する最良の変異体を確定するための効果的な方策は、構造に基づく偏りのない手法の組合わせである。Clackson a nd Wells，1994，Trends Biotechnology 12，173-184（review）を参照。例えば、重要な接触残基を、縮重オリゴヌクレオチドによるPCR法により、但しランダム位置にさらに変異を導入するためにエラー促進条件を用いて増幅を実施しながらランダム化するライブラリーの構築を我々は考えている。別の例は、DNAシャフリングを用いた構造に基づく偏りのないランダムライブラリーからの成分DNA 断片の組合わせである。所望の変異に対するライブラリーのスクリーニングは、酵母2-ハイブリッド方式（Fields and Song（1989）Nature 340，245-246）を用いて行うことができる。例えば、１つのベクターにFRB-VP16融合物を導入し、ランダム化したFKBP配列のライブラリーを別のGAL4融合ベクター中にクローン化する。酵母の共形質転換体をバンプのあるラパマイシン（即ち、ラパログ）で処理し、相補的FKBP変異体を保有するものを、使用したベクターに応じて、例えばβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ産生（スクリーン）、または必須栄養素を欠いたプレート上での生存（選択）により確定する。バンプ付きラパマイシンがFKBP−FRAP相互作用の架橋に必要なことは、間違いの陽性(false positives)を消去する有用なスクリーンである。 FKBP(またはFRB)変異体のライブラリーから修飾されたリガンド結合性ドメインを分離するための別の方策は、Huらにより報告された機能性(functional)二量体形成に対する遺伝的選択(Hu，J.C．et al，1990，Science 250:1400-1403;レビューについてはHu J.C．1995 Structure 3:431-433を参照）を利用する。この方策は、バクテリオファージλリプレッサーcIが二量体としてDNAに結合し、このようなホモ二量体のオペレーターDNAへの結合がファージの生活環の溶菌経路に含まれるファージ遺伝子の転写を防止することに基づいている。即ち、機能性 λリプレッサーを発現する細菌細胞は、ファージλを重感染させることにより溶菌に対して免疫性となる。リプレッサータンパク質は、アミノ末端DNA結合性ドメイン（アミノ酸1-92）が、カルボキシ末端二量体化ドメインに40アミノ酸可変性リンカーにより結合したものからなる。分離されたＮ末端ドメインは、非効率的な二量体形成のために低い親和性でしかDNAに結合しない。高親和性のDNA結合性は、GCN4「ロイシンジッパー(leucine zipper)」のような異種二量体化ドメインで回復させることができる。Huらは、大集団の配列からλリプレッサー二量体形成を媒介することができるGCN4ロイシンジッパー変異体を分離ための遺伝的選択としてファージ免疫を使用する方式について説明している（Hu et al，1990）。例えば、バンプ付きラパログに相補的なFRAP変異体を確定するためにλリプレッサー方式を使用するには、変異型FRAP配列を有するλリプレッサー−FRAPライブラリーを、野生型λリプレッサー−FKBPタンパク質を発現するE．Coli細胞中に形質転換する。高力価のλファージと「バンプ付き」ラパマイシン化合物を含有する細菌プレート上での溶菌に対して生存するコロニーからFRAP変異体を発現するプラスミドを分離する。或いは、FKBP変異体を分離するには、野生型λリプレッサー−FRAPタンパク質を発現するE．Coll細胞中に形質転換された変異FKBP 配列を有するλリプレッサー−FKBPライブラリーを用いて上記手法を反復する。別の変更例は、ファージ表示(display)のためのベクター中にランダム化されたFKBP配列をクローン化して、ラパログに最もよく結合する変異型のin vitro選択を可能にすることである。in vitro親和性選択は多くの方法で実施することができる。例えば、ラパログを親和性ハンドル(例えば、ヘキサヒスチジン・タグまたはGST)で標識された組換えFRAPの存在下で溶液状態のライブラリーファージプールと混合し、生成した複合体を、相補性変異を保有するFKBPを表わすファージを富化するように適当な親和性マトリックス上で捕捉する。ファージ表示の手法は、既に文献に記載されており、他のin vitro選択方式（例えば、λファージ上での表示、プラスミド上での表示、バクロウイルス(bacurovirus)上での表示）も考慮することができる。さらに、in vivo安定性の向上といった本発明の用途に有利な他の性質を改善するための選択およびスクリーニング手法を使用することもできる。レビューについてはClackson，T．and Wells，J.A．1994，Trend s Biotechnol．12，173-184を参照。 (b) FRAP FRAP結合性エフェクタードメイン中でラパマイシンに対する修飾を含む（即ち、バンプ付き）ラパログに優先的に結合する変異型FRBドメインの製造にも同様の考えを用いる。例えば、C7位に-OMe以外の置換基を有するラパログを用いて、ヒトFRAP FRBペプチド配列に基づくが、Tyr2038，Phe2039，Thr2098，Gln2099， Trp2101およびAsp2102残基の１種もしくは２種以上に対するアミノ酸置換を持つ FRBとの優先的結合を得ることができる。変異の例としては、Y2038H，Y2038L，Y 2038V，Y2038A，F2039H，F2039L，F2039A，F2039V，D2102A，T2098A，T2098N，およびT2098Sが挙げられる。C28に-OH以外の置換基を有するか、および／または C30に=O以外の置換基を有するラパログを用いて、Glu2032に対するアミノ酸置換を持つFRAPタンパク質との優先的結合を得ることもできる。変異の例としては、 E2032AおよびE2032Sが挙げられる。前述した位置で１または２以上のアミノ酸置換を含むFRBからなるタンパク質、それらの位置でランダム化された（即ち、それらの残基に各種の置換アミノ酸を含む）タンパク質もしくはペプチドのライブラリー、タンパク質ドメイン全体をランダム化するライブラリー、またはこれらの変異体のセットの組合わせは、バンプ付きラパログに優先的に結合する変異 FRAPを確定するための上述した方法を用いて作製される。ラパログと複合体化したFKBPタンパク質の複合体に対する変異FRB候補の親和性は、例えば、薬剤の存在下でGST-FKBPへのin vitro翻訳FRB変異体の結合（Che n et al．1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92，4947-4951）または酵母の２ −ハイブリッド検定で適当なFKBP融合タンパク質とのラパログ依存性転写活性複合体に関与する能力、といった多くの方法により検定することができる。所望の結合性を持ったFRB変異体を、多様な分類手法を用いてファージ上に表わされたライブラリーから分離することができる。例えば、ラパログを親和性ハンドル(例えば、ヘキサヒスチジン・タグまたはGST)で標識された組換えFKBPの存在下で溶液状態のライブラリーファージプールと混合し、生成した複合体を、相補性変異を保有するFRAPを表わすファージを富化するように適当な親和性マトリックス上で捕捉する。本発明の各種態様において変化しうるFRB融合タンパク質の別の特徴は、使用するFRBドメインの正確な配列である。ある用途では、最小（89アミノ酸）FRBドメインより大きなFRBの部分を使用することが好ましいかも知れない。これらは、Glu2025残基までＮ末端の延長（好ましくは、少なくともArg2018またはIle202 1までの延長）、ならびに2113位を超えるＣ末端延長（例、2113，2141もしくは2 174またはそれ以上への延長）を包含し、これは場合により折り畳まれたFRBドメインの安定性および／または発現の効率を改善することがある。異なるFRB配列末端を使用するかも知れない別の用途には、例えば細胞膜での又はDNA上でのFRB が媒介するタンパク質−タンパク質会合に必要なポリペプチド鎖の歪み（ねじれ）に合うように、FRBドメインの片側または両側での立体的理由により長いリンカーが、望ましい用途もある。逆に、別の用途では、異種の作用ドメインを生物学的機能に対して適切に与えるためにFRBドメインの片側または両側で短いリンカーが好ましいか、または必要となることがある。ヒトの遺伝子治療用途では、このようなリンカーに対して天然のヒトFRAP配列を使用することが、異種配列の導入にとって、または宿主生体内での免疫応答を刺激する危険性を低減させるために、一般に好ましいであろう。或る種のラパログ、特にFKBP結合性ドメインとFRAP結合性ドメインとの境界付近にあると考えられる位置、例えば、C28，C30，C7およびC24といった位置に修飾または置換基（ラパマイシンに対して）を有するラパログは、哺乳動物のFKBP ドメインとFRBドメインの両方、特に天然のヒトペプチド配列を含むこれらのドメインとの複合体形成能力が、ラパマイシンに比べて低い。この低い能力は、本書で述べたいずれかの直接的または間接的検定法で測定した結合親和性の低さ、またはＴ細胞増殖検定のような適当な検定で測定して免疫抑制活性の低さとして現れることがある。このような場合、反復手法を用いて、天然のヒトペプチド配列を含む対応するドメインより効果的にラパログとの複合体を形成することができる変異FKBPと変異FRBとの対を確定することができる。例えば、まずラパログに結合することができる相補的修飾FKBPドメインを、先に説明したようにして確定し、次いでこの変異FKBPドメインをラパログとの複合体における親和性マトリックスとして使用して、この複合体と会合することができる相補的修飾FRBドメインを選択するとができる。かかる変異誘発およびスクリーニングを数サイクル実施して、タンパク質の対を最適化することができる。ある態様では、タンパク質−タンパク質相互作用（図２Ｅ参照）に影響しうる変異を含むFRBおよび／またはFKBPドメインを使用することが望ましいであろう。例えば、ラパマイシンまたは所定のラパログに結合させた時に、変異FRBに比べて測定可能なより小さな有効性でしか内生FRBと複合体を形成できない変異FKB Pドメインが特に興味がある。やはり興味があるのが、ラパマイシンとの内生FKB Pの複合体に比べて、測定可能なより大きな有効性でラパマイシンまたは所定のラパログと変異FKBPの複合体と会合することができる変異FRBドメインである。既に説明したものに類似の選択およびスクリーニング法も、（i）ラパマイシンもしくはラパログならびに内生FRBとの三成分複合体を形成するFKBPドメインの能力を測定可能に減少させるFKBPドメインへのアミノ酸置換、欠失または挿入を確定するため、(ii)ラパマイシンもしくはラパログならびに内生FKBPとの三成分複合体を形成するFRBドメインの能力を測定可能に減少させるFRBドメインへのアミノ酸置換、欠失または挿入を確定するため、ならびに(iii)バートナータンパク質中の補償用変異を選択および／または確定するため、に使用することができる。三成分複合体形成の有効性が減少した適当な変異FKBPの例として、His87およびIle90の一方または両方が、嵩高の側鎖基を持つArg，Trp，Phe，TyrまたはLys といったアミノ酸で置換された哺乳動物、好ましくはヒトのFKBPが挙げられる；その場合、FRBドメイン、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのペプチド配列を含むFRBドメインは、上述のように変異させて、この変異FKBPならびにラパマイシンもしくは所定のラパログとの三成分複合体を形成することができる相補性変異型を発生させるようにしてもよい。H87WまたはH87R hFKBP12に対して有用なFRB変異の例としては、Y2038がＶ，Ｓ，ＡまたはＬで置換されたか、F2039 がＡで置換されたか、および／またはR2042がＬ，ＡまたはＳで置換されたヒトF RBが挙げられる。190W又は190R hFKBP12に対して有用なFRB変異の例としては、K 2095がＬ，Ｓ，Ａ又はＴで置換されたヒトFRBがあげられる。また、本発明のレセプタードメインを最適化する場合、ポリペプチド配列の免疫原性は、MHCタンパク質によるペプチドの結合と、内生Ｔ細胞レセプターにより提示ペプチドを異物として認識することを必要とすると考えられていることを理解すべきである。少なくともヒトの遺伝子治療用途では、連結ペプチド配列を含む所定の外来のペプチド配列を、これがヒト中で免疫学的に提示される確率を最小限にするように修飾することが好ましいかも知れない。例えば、ヒトMHCクラスI分子に結合するペプチドは、結合ペプチド中の重要な「アンカー」位置にある或る種の残基に対して厳格な要件を持つ。例えば、HLA-A2は２位にロイシン、メチオニンまたはイソロイシンを、Ｃ末端にロイシンまたはバリンを必要とする（レビューについてはStern and Wiley（1994）Structure 2，145-251を参照）。従って、本発明の実施においてタンパク質を遺伝子工学処理する際に、これらの残基のこの周期性を、特にヒトの遺伝子治療用途では避けることが好ましい。以上のことは、レセプタードメイン中への点突然変異の遺伝子工学処理を制限なしに包含する本発明の全ての遺伝子工学処理の側面、ならびに各種のタンパク質ドメイン間の境界の選択もしくは設計にも当てはまる。他の成分、設計の特徴および用途本発明のキメラタンパク質は膜保持ドメインのような細胞局在化ドメインを異種ドメインとして含んでいてもよい。例えば、PCT/US94/01617、特に26〜27頁を参照。簡単に述べると、膜保持ドメインは、宿主細胞に内生であるか否かにかかわらず、任意の好都合な膜結合タンパク質から分離することができる。膜保持ドメインは、多くのレセプターを始めとする貫膜保持ドメイン、即ち、細胞表面タンパク質の場合のように、膜を横断する長さのアミノ酸配列であってもよい。貫膜ペプチド配列はまた、細胞外および／または細胞内ドメインの一部または全部に達する長さであってもよい。或いは、膜保持ドメインは、細胞表面膜の脂質との会合を可能にするミリストイル化またはパルミトイル化部位のような脂質膜保持ドメインであってもよい。脂質膜保持ドメインは、膜とのＮ末端結合に対してはコーディング配列の5'末端に、およびＣ末端結合に対しては3'末端付近に通常は付加されよう。脂質膜結合を準備するための翻訳後プロセシングに関与するペプチドは、Carr et al，PNAS USA（1988）79，6128;Aitken et al，Febs Lett. （1982）150，314;Henderson et al，PNAS USA（1983）80，319;Schulz et al， Virology（1984）123，2131;Dellman et al，Nature（1985）314，374に記載され、Ann．Rev．of Biochem.（1988）57，69に総括されている。興味あるアミノ酸配列としては、配列M-G-S-S-K-S-K-P-K-D-P-S-Q-Rが挙げられる。各種のDNA配列を用いて、本発明の各種キメラタンパク質内のこのような配列をコードすることができる。他の局在化ドメインとしては、-K-D-E-Lおよび-H-D-E-Lのようなオルガネラ標的ドメインおよび配列（これは、これを保有するタンパク質を小胞体に標的化する）、ならびに（直接的）転写調節用に設計されたキメラタンパク質に特に有用な核局在化配列が挙げられる。各種の細胞局在化配列およびシグナルが当該技術分野において周知である。 CD3ゼータ鎖のような細胞質シグナル開始ドメインを、とりわけVP16およびGAL 4を包含する核転写因子ドメイン、Fas細胞質ドメインを包含するアポトーシスを発動させることができるドメインその他包含する各種の作用ドメインを含んでいるキメラタンパク質をコードする構築物の設計、組立ておよび使用に関して本発明の実施に用いてもよいそれ以上の詳細は、PCT/US94/01617およびPCT/US95/105 91に開示されている。後者の国際出願はさらに、特に生物薬学の研究に疾病モデルとして使用できる遺伝子工学処理された動物の作製に適用できる別の内容も開示している。これらの内容は、キメラタンパク質の発現のための構築物に組織特異的な調節要素を使用すること、および標的遺伝子としてのCreリコンビナーゼの発現に調節された転写を適用して1oxP配列により挟まれた(flanked)対象遺伝子の消去を生ずることを包含する。さまざまな場合において、特に本発明に従って遺伝子工学処理された細胞を含んでいる完全な動物を利用する態様において、キメラタンパク質の各種ドメインを宿主細胞と同じ種のタンパク質から誘導することが往々にして好ましく、場合によっては必要となろう。即ち、ヒト細胞の遺伝子工学処理に対しては、異種ドメイン（ならびにFKBPおよびFRBドメイン）が、細菌、酵母または他のヒト以外の供給源に由来するものではなく、ヒト起源のものであることが好ましいことが多い。好都合な検出を可能にするために、エピトープ標識を本発明のキメラタンパク質に取り込んでもよいことにも我々は注目している。組織特異的またはセルタイプ（細胞型）特異的な発現ある種の態様では、本発明のキメラタンパク質を細胞特異的または組織特異的に発現させることが好ましいであろう。このような発現の特異性は、このキメラタンパク質をコードする１または２以上のDNA配列を、細胞型特異的な転写調節配列（例、プロモーター／エンハンサー）に操作可能に結合することにより達成しうる。数多くの細胞型特異的な転写調節配列が既知である。他のものも細胞型特異的に発現される遺伝子から得ることができる。例えば、PCT/US94/01617、特に36〜37頁を参照。例えは、本発明のキメラタンパク質を発現する構築物は、選択された組織中での特異的発現のために既知の遺伝子に由来する調節配列を含んでいてもよい。代表例を次に表にまとめて示す。標的遺伝子構築物キメラタンパク質をその多量体化が標的遺伝子の転写を活性化するように設計する本発明の態様では、遺伝子工学処理細胞に適当な標的遺伝子構築物もまた使用する。適当な標的遺伝子構築物は、標的遺伝子と、プロモーター／エンハンサーのようなキメラタンパク質の多量体化に応答性の同族転写制御要素とを含んでいるものである。転写の直接活性化を利用する態様では、この応答性は本発明のキメラタンパク質のDNA結合性ドメインにより認識される１又は２以上のDNA配列（即ち、キメラタンパク質が結合するDNA配列）が標的遺伝子構築物中に存在することにより達成されうる。転写の間接的な活性化を利用する態様では、応答性は、キメラタンパク質の多量体化により発生する細胞内シグナルにより活性化されるプロモーターおよび／またはエンハンサー配列が標的遺伝子構築物中に存在することにより達成されうる。例えば、キメラタンパク質がTCRゼータ鎖細胞内ドメインを含んでいる場合、標的遺伝子はIL-2プロモーター領域にその発現制御下で結合される。本発明はまた、（a）例えば本発明のDNA結合性キメラタンパク質が結合することができる（または上述のような間接的活性化に対して感受性の）同族DNA配列と、（b）宿主細胞に対して内生の所望の標的遺伝子の遺伝子座からのフランキングDNA配列とを含んでいる標的DNA構築物も提供する。このような構築物は、内生標的遺伝子に関して宿主細胞内への同族DNA配列の相同的組換えを可能にする。別の態様では、この構築物は、所望の遺伝子と、所望の遺伝子座への標的遺伝子の相同的組換えを可能にする標的遺伝子座からのフランキングDNAとを含んでいる。このような標的構築物はまた同族DNA配列を含んでいてもよく、或いは遺伝子座により同族DNA配列を提供してもよい。前述した任意の態様における標的遺伝子は、例えば、表面膜タンパク質（レセプタータンパク質などの）、分泌タンパク質、細胞質タンパク質、核タンパク質、Creのようなリコンビナーゼ、リボチーム、またはアンチセンスRNAをコードするものでよい。一般的な設計および構築の詳細と遺伝子治療を含む各種応用についてはPCT/US94/01617を、また疾病の動物モデルへの応用についてははPCT/US95 /10591を参照。本発明はキメラタンパク質の多様な配置形態を包含する。但し、標的遺伝子の転写活性化を包含する場合は全て、キメラタンパク質は、そのキメラをコードする構築物と標的遺伝子構築物とを含む細胞が、多量体化リガンドの存在下では、これが不存在の場合に比べて、少なくとも１桁、好ましくは少なくとも２桁、より好ましくは少なくとも３〜４桁の大きさで標的遺伝子を発現するという重要な特徴を共有している。最適には、細胞が多量体化リガンドに曝されるまでは選択された遺伝子の発現が観察されない。リキャップ(recap)のため、キメラタンパク質は、ラパマイシンまたはラパログリガンドの細胞に暴露される、即ち、キメラの多量体化の後、遺伝子工学処理された細胞内で検出可能なレベルの標的遺伝子の転写を開始させることができる。即ち、標的遺伝子の転写は、キメラタンパク質分子を多量体化させることができるラパマイシンまたはラパログリガンドへの細胞の暴露に続いて、本発明の遺伝子工学処理された細胞内で活性化される。本発明のこの異なる遺伝子工学処理がなされた細胞は、上述したキメラタンパク質を含んでおり、このキメラタンパク質分子を多量体化することができるラパマイシンまたはラパログリガンドの存在および／または濃度に応答性である。この応答性は標的遺伝子の転写の活性化として現れる。かかる転写活性化は、標的遺伝子の任意の慣用の転写検定法により容易に検出することができる。別の態様では、キメラのリガンド媒介多量体化に対する生物学的応答は、標的遺伝子の転写の直接的活性化ではなく、細胞の死または他の生物学的事象である。構築物の細胞内への導入本発明は特に、動物細胞の遺伝子工学処理用とかかる遺伝子工学処理された動物細胞を使用した用途に特に有用である。動物細胞は、昆虫、蠕虫(worm)、または哺乳動物の細胞でよい。例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ネズミおよびヒト以外の霊長類の細胞を包含する各種の哺乳動物の細胞を使用することができるが、ヒトの細胞が特に有利である。多様な種(species)のうち、造血、神経、神経膠、間葉、皮膚、粘膜、間質、筋肉（平滑筋細胞を含む）、脾臓、網状内皮、上皮、内皮、肝臓、腎臓、胃腸、肺、繊維芽その他の細胞型(cell type) といった各種の細胞の型を使用することができる。特に興味あるのは造血細胞であり、これは赤血球、リンパ球もしくは骨髄単球(myelomonocytic)系統、ならびに筋芽細胞および繊維芽細胞に関連しうる任意の核形成された細胞を包含しうる。別の興味ある細胞は、造血、神経、間質、筋肉、肝臓、肺、胃腸および間葉の幹細胞といった幹細胞および前駆細胞である。細胞は、意図した宿主生体に対してオートロガス（自己）細胞、同系細胞、同種（異系）細胞、そして場合によっては異種細胞でよい。細胞は、主要組織適合性("MHC")プロファイルの変化、機能クラスＩMHC分子の形成を防止するためのβ₂ -ミクログロブリンの不活性化、クラスII分子の不活性化、１もしくは２以上の MHC分子の発現の準備、細胞毒性活性に関与する遺伝子の発現の増進もしくは阻害による細胞毒性能力の増進もしくは不活性化などにより修飾してもよい。場合によっては、特異的クローンまたはオリゴクローナル細胞が有利となることがあり、その場合の細胞は特異的抗原特異性または帰還(homing)標的部位特異性を持つＴ細胞またはＢ細胞のような特定の特異性を有する。本発明のキメラタンパク質および標的遺伝子をコードする構築物は、１または２以上のDNA分子または構築物として、多くの場合にはその構築物を含む宿主細胞の選択を可能にする１または２以上のマーカーと組合わせて、細胞内に導入することができる。構築物の調製は、慣用の方法により実施でき、コード配列および調節領域は適宜に分離、連結、適当なクローニング用宿主内でクローン化、制限酵素処理もしくは配列決定分析または他の好都合な手段による分析を行えばよい。特に、PCRを用いて、機能ユニットの全部または一部を含む個々の断片を分離してもよく、その場合には適宜に「プライマー修復」、連結、in vitro変異誘発等を用いて１または２以上の突然変異を導入してもよい。構築物が完成し、適切な配列を持つことが実証されたら、これを次いで任意の好都合な手段で宿主細胞に導入する。構築物は、エピソーム複製の可能なベクター（例、BPVまたはEBV ベクター）中または宿主細胞の染色体中への組込み用に設計されたベクター中に取り込んでもよい。構築物は、細胞内への感染または形質導入のために、レトロウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)または単純性疱疹ウイルス(HSV)その他のような非複製型欠陥ウイルスゲノム中への組込みおよび詰込みをしてもよい。或いは、構築物を原形質体（プロトプラスト）融合、エレクトロポレーション、バイオリスティックス(biolistics)、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、DNAの微小注入(microinjec tion)などにより導入することもできる。宿主細胞は、場合により、構築物の導入の前に培養により増殖および拡大させておき、その後で構築物の導入および構築物の組込みのための適当な処理を行う。細胞を次いで拡大させ、構築物中に存在するマーカーによりスクリーニングする。首尾よく使用できる各種のマーカーとしては、hprt、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ヒグロマイシン耐性等、ならびにTac，CD8，CD3，Thy1およびNGFレセプターといった各種の細胞表面マーカーが挙げられる。場合により、構築物を特定の遺伝子座に組込むことが望ましい場合、相同的組換えに対する標的部位を有していてもよい。例えば、内在性遺伝子を削除および／または本発明の組換え標的構築物で（同じ遺伝子座またはどこでも）置換することができる。相同的組換えに対しては一般にΩまたはＯ−ベクターのいずれかを使用しうる。例えば、Thomas and Capecchi，Cell（1987）51，503-512;Manso ur，et al.，Nature（1988）336，348-352;およびJoyner，et al.，Nature（198 9）338，153-156を参照。複数の構築物は、遺伝子の全部をコードする単一のDNA分子として、または１または２以上の遺伝子を有する異なるDNA分子として導入することができる。複数の構築物の導入は、それぞれ同じまたは異なるマーカーを用いて同時にまたは順次行うことができる。 DNA構築物のストックの調製およびトランスフェクションの実施に使用できる、細菌もしくは酵母の複製起点、選択および／もしくは増幅可能なマーカー、原核生物もしくは真核生物中の発現のためのプロモーター／エンハンサー要素、および哺乳動物の発現制御要素等といった有用な要素を含むベクターは、当該技術分野で周知であり、多くのものが市販されている。構築物の動物への導入本発明のDNA構築物でex vivo修飾された細胞を選択的条件下で培養により増殖させ、所望の構築物を持つとして選ばれた細胞を次いで拡大させ、さらに例えば宿主細胞内の構築物の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応および／または所望の遺伝子産物の産生に対する検定を用いてさらに分析する。修飾された宿主細胞を同定したら、次いでこれを計画通りに用いて、例えば培養により増殖させるか、または宿主生体中に導入する。細胞の性質に応じて、細胞の宿主生体（例、哺乳動物）への導入は多様な方法により実施しうる。造血細胞を注射により血管系内に投与してもよく、細胞数は通常は少なくとも約10⁴個で、一般に約10¹⁰個以下である。使用する細胞数は、多くの状況、導入の目的、細胞の寿命、使用すべきプロトコル、例えば、投与回数、細胞の増殖能力、治療剤の安定性、治療剤の生理学的必要性等に依存しよう。一般に、例えば筋芽細胞または繊維芽細胞については、細胞数は約10⁴個以上、約10⁹個以下であり、分散液として、一般に対象位置またはその付近に注射されて投与しうる。細胞は通常は生理学的に許容される媒体中で用いる。本発明に従って遺伝子工学処理した細胞はまた、治療用タンパク質の産生のため宿主生体または患者に移植する前に、例えば慣用の生体適合性の材料と方法を用いてカプセル化してもよい。例えば、Hguyen et al，宿主内で高生菌密度を維持するための組織移植システム及び方法，米国特許第5,314,471(Baxter Interna tional，Inc.);Uludag and Sefton，1993，J．Biomed．Mater．Res．27(10):121 3-24(HepG2細胞／ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート膜); Chang et al，1993，Hum．Gene Ther．4(4):433-40（hGHを発現するマウスLtk細胞／免疫保護・選択<perm-selective>アルギネートマイクロカプセル);Reddy et al，1993，J．Infect．Dis．168(4):1082-3(アルギネート);Tai and Sun，1993 ，FASEB J．7(11):1061-9(hGHを発現するマウス繊維芽／アルギネート−ポリ− Ｌ−リシン−アルギネート膜);Ao et al，1995，Transplantation Proc．27(6): 3349-3350(アルギネート);Rajotte et al，1995，Transplantation Proc．27 (6):3389(アルギネート);Lakey et al，1995，Transplantation Proc．27(6):32 66(アルギネート);Korbutt et al，1995，Transplantation Proc．27(6):3212( アルギネート);Dorian et al,米国特許第5,429,821(アルギネート);Emerich et al，1993，Exp．Neurol．122(1):37-47(ポリマーカプセル化PC12細胞);Sagen et al.，1993，J．Neurosci．13(6):2415-23(ポリマー半透膜内にカプセル化され、ラット脊髄クモ膜下腔内に移植されたウシ・クロマフィン親和性細胞 );Aebischer et al，1994，Exp．Neurol．126(2):151-8(サルに移植されたポリマーカプセル化ラットPC12細胞、Aebischer WO92/19595も参照);Savelkoul et a l，1994，J．Immunol．Methods，170(2):185-96(抗体を産生するカプセル化ハイブリドーマ;各種サイトカインを発現するカプセル化トランスフェクティド);Win n et al，1994，PNAS USA 91(6):2324-8(免疫分離<immunoisolation>ポリマー製デバイスにカプセル化され、ラットに移植されたヒト神経成長因子を発現する遺伝子工学処理されたBHK細胞);Emerich et al，1994，Prog．Neuropsychopharmac ol．Biol．Psychiatry 18(5):935-46(ラットに移植されたポリマーカプセル化PC 12細胞);Kordower et al,1994，PNAS USA 91(23):10898-902(サルに移植された、hNGFを発現するポリマーカプセル化遺伝子工学処理BHK細胞);およびButler et al WO 95/04521（カプセル化デバイス）を参照。細胞を次いでカプセル化形態でそれを必要とする動物宿主、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの患者に導入しうる。好ましくは、カプセル化材料は、カプセル化された細胞により産生された分泌タンパク質の宿主中への放出が可能になるように半透過性である。多くの態様では、半透過性カプセル化により、カプセル化された細胞は、これを導入する宿主生体から免疫学的に分離されるようになる。そのような態様では、カプセル化される細胞は、宿主種のタンパク質に由来するか、および／またはウイルス性タンパク質もしくは宿主種以外の種からのタンパク質に由来する成分ドメインを含む１または２以上のキメラタンパク質を発現しうる。例えば、このような場合に、キメラはGAL4およびVP16に由来する要素を含有しうる。この細胞は受容体（者）以外の１または２以上の個体に由来するものでもよく、また受容生体または患者とは異なる種に由来するものでもよい。細胞のex vivo修飾の代わりに、多くの場合、細胞をin vivo修飾したいことがある。このために、標的組織および細胞のin vivo修飾用に各種手法が開発されている。アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスといった多くのウイルスベクターが開発されており、これらは宿主へのウイルスのトランスフェクションと場合により組込みを可能にする。例えば、Debenksky et al（1 984）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81，7529-7533;Kaneda et al,（1989）Sc ienece 243，375-378;Hiebert et al（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86， 3594-3598;Hatzoglu et al（1990）J．Biol．Chem．265，17285-17293;およびFe rry et al（1991）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，8377-8381を参照。ベクターは注射（例、脈管内または筋肉内）、吸入または他の非経口経路で投与しうる。リポソームとの複合体または注射、カテーテルもしくはビオリスティックスによるによるDNAの投与といった非ウイルス型の供給も使用できる。 in vivo遺伝的修飾によれば、修飾方法は、組織の性質、要求される細胞修飾の効率、その細胞を修飾する機会の数、導入すべきDNA組成物への組織の接近のし易さ等に依存しよう。所望により、標的転写開始領域を保有する弱毒化または修飾されたレトロウイルスを採用することにより、ウイルスが産生され、隣接細胞を移入するように、本発明の転写因子構築物の一つを用いてウイルスを活性化することができる。 DNA導入はすべての場合に組込みを生じなくてもよい。状況によっては、導入されたDNAの一時的な維持で十分である。このようにして短期間作用を得ることができ、その場合、細胞を宿主に導入してから、所定時間後、例えば細胞を特定の部位に戻ることができるようになった後、ターンオン(turn on)することができる。多量体化剤本発明に使用するのに適したリガンドとしては、FKBPキメラおよびFRAPキメラに結合して三成分複合体を形成することができるラパマイシンおよびラパマイシン類似体、誘導体および疑似体（ラパログ）が挙げられる。遺伝子工学処理された細胞に対して内生のFKBPおよび／またはFRAPへのその結合を減少させ、好ましくは実質的に阻止する１または２以上の置換基("バンプ")を有する本発明のラパログが好ましい。本発明の変異FKBPは、PCT/US94/01617およびPCT/US94/08008に記載のようにして、所定のラパログへの結合のために取得およびスクリーニングしうる。ある種のラパログは、FKBP複合体としてのFRAPへのその結合を減少させ、好ましくは実質的に阻止するが、（変異）FKBPキメラタンパク質、（変異）FR APキメラへの結合と複合体化（図２）は行う任意の置換基を有している。かかるバンプを含んでいるラパログは、FKBP12またはFRAPの内生プールによる妨害を受けずに、変異FKBPキメラおよび／または変異FRAPキメラへのより選択的な結合を可能にする。これは多くの用途、特に完全な生体内での使用にとって望ましい。内生FRAPへの結合の減少の別の利点は、このような多量体化剤が単独で又は内生FK BP12もしくはFKBPドメインを含んでいるキメラと一緒に、ラパマイシンに比べて相対的に減少した免疫抑制活性または機構に基づく毒性を有することである。表面残基変異のために内生FRAPへのリガンド依存性結合は実質的に阻止されるが、代償性変異を持つ１または２以上のFRBドメインを含んでいるキメラタンパク質にはリガンド依存性で結合することができる（図２Ｅ）変異FKBPドメインからなるキメラタンパク質も本発明で意図している。 PCT/US94/01617に開示されているような単量体型の１価リガンド、ならびに本書に記載した誘導体化合物は、キメラタンパク質の一方に結合することができるが、（リガンドの１価の性質のために）その二量体化またはより高次の多量体化を行うことができず、多量体化拮抗剤となる。特に興味あるラパログは、ヒトFKBP12に結合し、および／またはFK506，FK520 またはラパマイシンのいずれに比べても、そのロタマーゼ活性の阻害の効力が少なくとも１桁は小さい。このような検定法は当該技術分野で周知である。例えば、Holt et al，J．Amer．Chem．Soc.，1993，115，9925-9938を参照。阻害活性の減少は、約２桁以上の大きさとなることもあり、場合によっては約３桁を超えよう。有用なラパログ置換基としては、とりわけ、アルキル、アリール、−Ｏ− アルキル、−Ｏ−アリール、置換もしくは非置換アミン、アミド、カルバミドおよびウレアが挙げられ、ここでアルキルおよびアリールは本書のいずれかで定義する通りである。例えば、PCT/US94/01617およびPCT/US94/08008を参照。本発明の多量体化リガンドは具体的には、次式で示されるラパマイシンおよびラパログを包含する。上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-SR¹， -OC(O)R¹もしくは-OC(O)NHR¹， -NHR¹，-NHC(O)R¹，-NH-SO₂-R¹または -R²であり、ここでR²＝置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリール（例、ベンジルまたは置換ベンジル）Ｖは-OR³または（=O）でありＷは=O，=NR⁴，=NOR⁴もしくは=NNHR⁴， -NHOR⁴もしくは-NHNHR⁴， -OR⁴, -OC(O)R⁴もしくは-OC(O)NR⁴，または-HでありＹは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵でありＺは=O，-OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり R³はH，-R⁷，-C(O)R⁷もしくは-C(O)NHR⁷，またはC-28／C-30環式カーボネートであり R⁴はＨまたはアルキルであり、ここでR¹，R⁴，R⁵，R⁶およびR⁷は、Ｈ、アルキル、アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれる。ラパマイシンでは、Ｕが-OMe、Ｖが=O、Ｗ=O、Ｙが-OH、Ｚが=O、そしてR³およびR⁴がＨであり、立体異性は第１頁の式Ｉに示す通りである。本発明のラパログは可能な立体異性配向のいずれかにおいて置換基を含有しうる。アルキルなる用語を本書で用いた場合、これは一般に１〜８個の連続した脂肪族炭素原子を含有する飽和および不飽和の、線状（直鎖）、分岐鎖、環式および多環式の脂肪族炭化水素基（例、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、シクロブチル、n-ペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、シクロペンチルなど）を包含する意味であり、これは任意にヒドロキシ、C₁〜C₈アルコキシ、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、N-アシルアミノ、ケト、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロもしくはヨード）、トリハロメチル、シアノ、カルボキシル、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールよりなる群から選ばれた１または２以上の官能基（これらの官能基それ自体も、ヒドロキシ、ハロおよびシアノ基を除いて、１または２以上の上記官能基を有していてもよい）で場合により置換されていてもよい。好ましくは、アルキル、アルコキシおよびアシル基は１〜６個の連続した脂肪族炭素原子を含有し、置換基を有していてもよい。アリールなる用語を本書で用いた場合、これは安定な環式、複素環式、多環式、および複素多環式の不飽和C₃〜C₁₄部分（フェニル、ビフェニル、ナフチル、ピリジル、フリル、チオフェニル、イミダゾイル、ピリミジニル、およびオキサゾイルで例示されるが、これに限られない）を包含する意味であり、これはヒドロキシ、C₁〜C₈アルコキシ、C₁〜C₈分岐鎖もしくは直鎖アルキル、アシルオキシ、カルバモイル、アミノ、N-アシルアミノ、ニトロ、ハロ、トリフルオロメチル、シアノ、およびカルボキシルよりなる群から選ばれた１〜５個の官能基（これらの官能基それ自体も、ヒドロキシ、ハロ、トリフルオロメチルおよびシアノ基を除いて、１または２以上の上記官能基を有していてもよい）で置換されていてもよい。ヘテロアルキルおよびヘテロアリールなる用語を本書で用いた場合、これらは１または２以上の炭素原子の代わりに１または２以上の酸素、イオウ、または窒素を含有するそれぞれアルキルおよびアリール部分を意味する。ある種の態様では、特に有利なリガンドが、ラパマイシンそれ自体以外の化合物、14位にヒドロキシル基を有する還元形態のラパマイシン、またはＵがC₂〜C₈ 直鎖、分岐鎖もしくは環式脂肪族もしくはアルコキシル部分；アリールもしくはヘテロアリール;置換アルキルもしくはアルコキシル部分；またはアリールおよびヘテロアリール部分が置換でも非置換でもよいアリール、アリールオキシ、ヘテロアリルもしくはヘテロアリールオキシ部分であるラパマイシン誘導体を包含する。多様なかかる化合物または上記置換基を持つ関連化合物の例が、それらの合成と同様に当該技術分野で既知である。例示の目的で、所望のラパログを製造するのに採用できる変換の例を下記の合成反応式で示す。C-7 バンプの調製 C-13 バンプの調製 C-14 バンプの調製 C-20 バンプの調製 C-24 バンプの調製 C-28 バンプの調製 C-30 バンプの調製別の変換は下記を包含する。C-14 での変性 C-13 での変性 C-24 での変性処方、投与量および投与本発明のラパマイシンまたはラパログは、そのタンパク質−タンパク質相互作用の促進能力により、本発明の遺伝子工学処理された細胞を含んでいる哺乳動物内で本発明のキメラタンパク質の三成分複合体の形成を促進させるための薬剤組成物および方法に使用することができる。かかる処置または予防の好ましい方法は、遺伝子工学処理された細胞内でのこの複合体形成の測定可能な促進、または好ましくはこの複合体形成により発動される所望の生物学的事象（例、標的遺伝子の転写、遺伝子工学処理された細胞のアポトーシス等）の作動の測定可能な促進、に有効な量で該化合物を哺乳動物に投与することによる。治療用／予防用投与と薬剤組成物ラパマイシンおよび各種のラパログは、遊離形態で、または適当であれば塩の形態で存在しうる。薬剤に許容される塩およびその調製は当業者には周知である。この種の化合物の薬剤に許容される塩には、例えば、無機または有機の酸または塩基により形成されるこの化合物の慣用の無毒な塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。本発明の化合物は、水和物または溶媒和物を形成しうる。電荷を持つ化合物は水を用いて凍結乾燥すると水和種を形成し、また適当な有機溶媒との溶液状態で濃縮すると溶媒和物を形成することは当業者には知られている。本発明は、治療（または予防）に有効な量の前記化合物と、薬剤に許容される担体または賦形剤とからなる薬剤組成物にも関する。担体の例としては、食塩水、緩衝剤含有食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの混合物が挙げられ、後でより詳しく説明する。この組成物はまた、所望により、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、持効性処方剤、または散剤の形態をとりうる。組成物は、トリグリセライド等の従来の結合剤兼担体を用いて座剤として処方することもできる。経口用の処方は、薬剤用のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含有しうる。処方は、所望の製剤に応じて、成分の混合、造粒および圧縮、または溶解といった操作を適宜含んでいる。使用する薬剤用担体は、例えは、固体と液体のいずれでもよい。固体の担体の例としては、乳糖、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等が挙げられる。固体担体は、香料、滑剤、可溶化剤、懸濁剤、充填剤、グリダント(glidant)、圧縮助剤、結合剤、または錠剤崩壊剤としても作用しうる１種または２種以上の物質を含有することができ、またカプセル化材料であってもよい。散剤の場合、担体は微細な固体であり、これを微細な有効成分と混合する。錠剤では、有効成分を必要な圧縮特性を持つ担体と適当な割合で混合し、所望の形状および寸法に圧縮する。散剤および錠剤の有効成分の含有量はは好ましくは99％までである。適当な固体担体としては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、乳糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。液体担体の例としては、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、水などが挙げられる。液体担体は溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシールおよび加圧組成物の調製に使用される。有効成分を、水、有機溶媒、両者の混合物などの薬剤に許容される液体担体、または薬剤に許容される油脂に溶解または懸濁させることができる。液体担体は、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存料、甘味料、香料、懸濁剤、増粘剤、着色料、粘度調整剤、安定剤、または浸透圧調整剤などの他の適当な製薬用添加剤を含有しうる。経口および非経口投与用の液体担体の適当な例としては、水（上記の添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくはナトリウムカルボキシメチルセルロース溶液を部分的に含有する）、アルコール（１価アルコールおよび多価アルコール、例、グリコール）およびその誘導体、ならびに油（例、分留ヤシ油およびアラキス<arachis>油）がある。非経口投与に対しては、担体はオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルのような油状エステルであってもよい。滅菌液体カーダー(carder)は非経口投与用の滅菌液体形態組成物に有用である。加圧組成物用の液体担体は、ハロゲン化炭化水素その他の薬剤に許容される噴射剤でよい。滅菌溶液または懸濁液である液体薬剤組成物は、例えば、筋肉内、腹腔内、または皮下注射により利用することができる。滅菌溶液はさらに静脈内投与も可能である。化合物はまた、液体または固体のいずれかの組成物形態で経口投与することもできる。担体または賦形剤は、モノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリル単独、またはこれとワックス、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルメタクリレート等との組合わせといった、当該技術分野で周知の遅効材料を含有していてもよい。経口投与用に処方する場合、PHOSAL PG-50(1,2-プロピレングリコールとのリン脂質濃厚液，A．Nattermann & Cie． GmbH)中の0.01％Tween 80溶液が、ラパマイシンに対して許容される経口処方を与えることが認められた。この溶液は、各種のラパログに対する処方にも適用しうる。多様な剤形を採用できる。固体担体を使用した場合、調剤物を打錠するか、粉末もしくはペレット状で硬質ゼラチンカプセル内に充填するか、またはトローチもしくはロジンジの形態にすることができる。固体担体の量は広範囲に変動しうるが、好ましくは約25mgないし約１ｇであろう。液体担体を使用する場合には、調剤物はシロップ、エマルジョン、軟質ゼラチンカプセル、アンプルもしくはバイアル内の滅菌注射用溶液もしくは懸濁液、または非水液体懸濁液の形態となろう。安定な水溶性の投与形態を得るには、ラパマイシンまたはラパログの薬剤に許容される塩を、0.3Mコハク酸またはクエン酸溶液といった有機酸または無機酸の水溶液中に溶解させてもよい。或いは、酸性誘導体を適当な塩基性溶液中に溶解させることができる。可溶性の塩の形態が利用できない場合には、化合物を適当な共溶媒または２種以上の共溶媒の混合物中に溶解させる。このような適当な共溶媒の例としては、これらに限られないが、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール300、ポリソルベート80、グリセリン、ポリオキシエチル化脂肪酸、脂肪アルコールまたはグリセリンヒドロキシ脂肪酸エステルなどが挙げられ、全容積の０〜60％の範囲内の濃度で使用される。各種の供給システムが公知であり、ラパマイシンもしくはラパログ、またはその各種の処方物（錠剤、カプセル剤、注射液、リポソーム内封入剤、微粒子剤、マイクロカプセル剤等を含む）を投与するのに使用することができる。導入方法としては、これに限られないが、皮膚、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻孔内、肺、硬膜外、眼、および経口経路（これが通常は好ましい）が挙げられる。化合物は任意の好都合なまたはその他の点で有利な経路、例えば、輸注もしくはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通る吸収により投与してもよく、また他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してもよい。投与は全身または局所でよい。鼻孔、気管支または肺の症状の治療または予防の場合、好ましい投与経路は経口、経鼻、または気管支用エアゾールまたはネブライザーである。ある種の態様では、化合物を治療を必要とする部位に局所的に投与することが望ましいことがある。これは、例えば（限定としてではないが）手術中の局所輸注、局部の塗布、注射、カテーテルの使用、座薬として、または皮膚パッチもしくは移植片（この移植片は、シアラスティック<sialastic>膜のような膜を含む、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料のものでよい）により達成することができる。ある具体的態様においては、薬剤組成物をヒトへの静脈内投与に使われる薬剤組成物として常套的な手法に従って処方する。典型的には、静脈内投与用の組成物は滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物はさらに安定化剤および注射の側の苦痛を緩和するための局所麻酔薬を含有していてもよい。一般に、各成分は別々に供給されるか、一緒に混合されて単位投与形態にされ、例えば、有効成分の量を表示したアンプルまたは小袋のような密封容器内に凍結乾燥粉末または水を含まない濃厚液として収容される。組成物を輸注により投与すべき場合には、滅菌した薬剤用の水または食塩水を入れた輸液ビンで投薬することができる。組成物を注射により投与する場合には、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを用意することができる。有効量の化合物の個体への投与は、化合物をその個体の皮膚の患部に直接投与することにより局所的に行うこともできる。このためには、ゲル、軟膏、ローション、またはクリームといった薬剤に許容される局所用担体を含む組成物中で化合物が投与または塗布される。この担体は、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセライド、脂肪酸エステル、または鉱油といった担体（これらに制限されないが）を含んでいる。他の局所用担体は、流動石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（95％）、水中のポリオキシエチレンモノラウレート(5%)、または水中のラウリル硫酸ナトリウム(5％)を含有する。酸化防止剤、保湿剤、粘度安定剤、および類似の添加剤といった他の材料も、必要に応じて添加しうる。アゾン(Azone)のような経皮浸透向上剤も含有させることができる。さらに、ある種の態様では、皮膚の上、中、または下に置いた器材の内部に化合物を配置する場合があることも予想される。かかる器材としては、受動的または能動的放出機構により化合物を皮膚に放出するパッチ、移植片、および注射が挙げられる。多様な処方を作るための材料および方法は当該技術分野において周知であり、本発明の実施に適合させることができる。例えば、米国特許第5,182,293号および第4,837,311号（錠剤、カプセル剤およびその他の経口用処方ならびに静脈内処方）ならびに欧州特許出願公開第0 649 659号（1995年４月26日公開；静脈内投与用のラパマイシン処方）および第0 648 494号(1995年４月19日公開；経口投与用のラパマイシン処方）を参照。化合物の有効用量は、哺乳動物の体重１kg当たりで、典型的には約0.01〜約50 mg/kg、好ましくは約0.1〜約10mg/kgの範囲内であり、１回または複数回投与されよう。一般に、本発明の化合物は、かかる治療を必要とする患者に、一人当たり約１〜約2000mgの日用量範囲内で投与しうる。化合物がラパマイシンであるか、またはある程度の残留免疫抑制作用のあるラパログである態様では、投与量は過度の免疫抑制作用を伴う量より少なくすることが好ましい。具体的な疾患または症状の治療または予防に有効な化合物の量は、その疾患または症状の性質にも部分的には依存し、標準的な臨床技法により決定することができる。また、最適の投与量範囲の確定を助けるためin vitroもしくはin vivo 検定を任意に採用してもよい。有効量は、in vitroまたは動物モデル試験方式から得られた用量応答曲線から外挿してもよい。正確な投与量水準は担当医または他の健康管理提供者により決定されるべきであり、投与経路やその個体の年齢、体重、性別、および全般的健康状態を含む周知の因子；その疾病の性質、重篤度および臨床段階；同時に行う治療の有無；ならびに患者内の細胞の遺伝子工学処理の性質と程度に依存しよう。本発明はまた、本発明の薬剤組成物の１または２以上の成分を入れた１または２以上の容器からなる薬剤パックまたはキットも提供する。このような容器に任意に付随しうるのは、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売の規制に関する政府機関により指示された形態の注意書である。この注意書はヒトの投与用の製造、使用または販売の監督官庁による認可を反映した内容となる。応用本発明は、大きなゲノムの内部に埋め込まれた外性導入遺伝子の発現を必要とする任意の状況に適用可能である。所望の発現の水準を、非常に高水準または非常に低水準に予め設定できよう。或いは、調節された又は効力決定が可能な発現を達成するようにこのシステムをさらに遺伝子工学処理することもできる。例えば、PCT/US93/01617を参照。多くの場合、関連のない細胞の遺伝子の偶発的な活性化は望ましくない。次に本発明の応用の非制限的な例を説明する。１．調節された遺伝子治療：多くの場合、治療用遺伝子のオン、オフの切替えが随意に可能であること、または発現の強さを正確に定量できること、が治療効力に重要である。本発明は特にヒトの遺伝子治療の分野で治療用標的遺伝子の調節された発現を得るのによく適している。その１例は、一対のキメラタンパク質（一方はFRAP由来レセプタードメインを含み、他方はFKBP由来レセプタードメインを含む）と、これらのキメラを二量体化することができる二量体化剤と、発現させる標的遺伝子構築物とを使用する。キメラタンパク質の一方は、Pomerantz et al，同上，に説明した複合DNA結合性領域を異種の作用ドメインとして含有する。第２のキメラタンパク質は、転写活性化ドメインを異種の作用ドメインとして含有する。ラパマイシンまたはラパログの二量体化剤は、両方のキメラに結合することができ、こうしてこれらのキメラを二量体化またはオリゴマー化することができる。これらのキメラタンパク質をコードし、その発現を指令することができるDNA分子を、遺伝子工学処理する細胞内に導入する。やはりこの細胞内に導入されるのは、複合DNA結合性ドメインが結合することができるDNA配列に結合した標的遺伝子である。遺伝子工学処理した細胞またはそのプロゲニー（子孫）を二量体化剤と接触（この剤の動物または患者への投与により）させると、転写因子複合体の組立て、従って標的遺伝子の発現を生ずる。同様な成分の設計および使用は、PCT/US93/01617に開示されている。この参照用特許文献に開示されているような代替DNA結合性ドメインの代わりに複合DNA結合性ドメインとこれをコードするDNA配列とを用い、FKBP由来レセプタードメインの代わりにキメラの一方のFRAP由来レセプタードメインを使用し、開示のような二量体化剤の代わりに単量体のラパマイシン型二量体化剤を使用して、上記特許を本発明に応用してもよい。実施において、標的遺伝子発現のレベルは、キメラ転写因子複合体の数または濃度により変化し、この数または能動は二量体化リガンドの濃度により変化することになる。後述する実験データは、このような（二量体化リガンドの）用量−応答性遺伝子発現を実証している。二量体化リガンドは、標的遺伝子の転写を活性化するため所望に応じて患者に投与しうる。リガンドの結合親和性に応じて、望まれる応答、投与方法、半減期、細胞の存在数、各種プロトコルを採用しうる。リガンドは非経口または経口投与しうる。投与回数は上述した因子に応じて変動しよう。リガンドの投与は、錠剤、粉剤、もしくは分散液として経口；バッカル；舌下；静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下注射；吸入等の経路でよい。リガンド（および拮抗物質である単量体化合物）は、各種の投与経路に対して当該技術分野で周知の慣用方法および材料を用いて処方することができる。正確な投与量および具体的な投与方法は上記の因子に依存し、担当医やヒトもしくは動物の健康管理提供者により決定されよう。ほとんどの場合、投与方法は経験的に決定されよう。リガンドによる転写活性化を逆転または停止させたい場合には、二量体化リガンドと競合することができる単量体化合物を投与してもよい。即ち、副作用が現れたか、または治療効果を終了させたい場合、二量体化剤に対する拮抗物質を任意の好都合な方法で、特に素早く逆転させたい場合には脈管内経路で投与することができる。或いは、リガンド結合性ドメインと一緒に不活性化ドメイン（または転写サイレンサー）を存在させるようにしてもよい。別の手法として、各所に記載されているように、FasまたはTNFレセプターを介したシグナリングを経てアポトーシスにより細胞を排除してもよい。国際特許出願PCT/US94/01617およびPC T/US94/08008を参照。特定レベルの発現の維持が長期間（例、約２週間またはそれ以上）にわたって望まれる場合、または短期間にわたるリガンドの個々のもしくは反復投与を長期の間隔（例、２週間またはそれ以上）で繰り返す反復治療を行う場合、各用途に対するリガンドの具体的な投与量は、治療投与量の監視に対して使用される手法に従って決定しうる。所定範囲内のリガンドの用量を与え、応答を監視して、時間−発現レベルの関係を得ると同時に、治療応答を観察する。その時間内に観察されたレベルおよび治療応答に応じて、その応答に続く次回には用量を増減することができる。この方法を治療範囲内である投与量を得るまで反復して繰り返す。リガンドを長期投与する場合には、リガンドの維持用量を決定したら、細胞系が発現生成物の適当な応答およびレベルを与え続けることが確保されるように長期の間隔で検定を行うことができる。このシステムは、リガンドに対する細胞応答、発現の効率、ならびに適宜、分泌のレベル、発現生成物の活性、患者の具体的な必要性（これは時間と状況により変動しうる）、細胞自体もしくは個々の細胞の発現活性の消失に起因する細胞活性の低下の速度等の多くの変動因子による影響を受けることは理解されよう。２．組換えタンパク質およびウイルスの生産：商業的および研究の目的で組換え治療用タンパク質の生産が、高レベルにタンパク質を発現するように遺伝子工学処理された哺乳動物の細胞系を用いてしばしば行われている。細菌または酵母ではなく、哺乳動物細胞の使用は、タンパク質の適正な機能が、異種細胞では一般に達成されない翻訳後修飾を必要とする場合に指示される。この方法で商業生産されているタンパク質の例には、エリトロポイエチン、組織プラスミノーゲン活性化剤、第VIII因子：ｃのような血液凝固因子、抗体等が挙げられる。このような手段でのタンパク質の生産コストは遺伝子工学処理した細胞において達成された発現のレベルに直接関連する。かかるタンパク質の生産に及ぼす別の制限は、宿主細胞に対する毒性であり、タンパク質発現が細胞の高密度増殖を妨げて生産レベルが急減することがある。従って、調節された遺伝子治療について説明したように、タンパク質発現の緊密な制御が可能であることから、タンパク質を生産せずに細胞を高密度に増殖させることが可能となる。最適の細胞密度に達した後で始めて、遺伝子の発現を活性化させ、その後で生産されたタンパク質を採集する。同様の問題が、商業用（例、遺伝子治療）および実験用の組換えウイルスの生産についても「パッケージング（ゲノム詰め込み）系」の構築および使用において経験されている。これらの細胞系は、欠陥組換えゲノムをもつ感染性ウイルス粒子のアセンブリに必要なウイルス性タンパク質を生産するために遺伝子工学処理される。かかるパッケージング系に依存するウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスが挙げられる。後者の場合、或るパッケージング系から得られたウイルスストックの力価は、そのウイルスのrepおよびコアタンパク質の生産レベルに直接関係する。しかし、これらのタンパク質は宿主細胞に対する毒性が高い。従って、高力価の組換えAAVウイルスの発生は困難であることが証明されてきた。本発明は、repおよびコア遺伝子をここに説明したように設計された調節可能な転写因子の制御下に置いたパッケージング系の構築を可能にすることで、この問題に対する解答を与える。このパッケージング細胞系を高密度に増殖させ、ヘルパーウイルスで感染させ、組換えウイルスゲノムでトランスフェクションすることができる。その後、二量体化材料を添加して、パッケージング細胞でコードされるウイルス性タンパク質の発現を誘導させると、高力価のウイルスの生産が可能になる。３．生物学的研究：本発明は、標的遺伝子の正確な制御が求められる広範囲の生物学実験に適用可能である。このような実験には、（1）生化学的精製のための対象タンパク質もしくはRNAの発現、（2）組織培養細胞中（または遺伝子工学処理された細胞によりin vivo）の対象タンパク質もしくはRNAの生物学的機能を評価する目的での調節された発現、（3）形質転換動物中の対象タンパク質もしくはRNAの生物学的機能を評価する目的での調節された発現、（4）内在性遺伝子に作用する別の調節タンパク質、リボチームまたはアンチセンス分子をコードする遺伝子の発現を、その遺伝子の生物学的機能を評価する目的で調節、といった実験が含まれる。本発明の成分を適用できる形質導入動物モデルおよび他の応用としては、PCT/US95/10591に開示されているものがある。本発明はさらに、以上の用途に有用なキットも提供する。かかるキットは、本発明のキメラタンパク質をコードしその発現を指令することができるDNA構築物を含み（さらに上述した追加のドメインを含んでいてもよい）、調節された遺伝子転写を行う態様では、キメラタンパク質の多量体化により活性化される１または２以上の転写制御要素に連結した標的遺伝子を含んでいる標的遺伝子構築物も含む。或いは、標的遺伝子構築物は、実施者による所望の標的遺伝子の挿入のためのクローン化サイトを含んでいてもよい。かかるキットは、2種類の組換えタンパク質を二量体化して、標的遺伝子の転写を活性化することができる二量体化剤のサンプルをさらに含んでいてもよい。実施例実施例１：キメラ転写因子をコードする構築物Ａ．特に説明がなければ、この及び他の実施例に記載した全てのDNA操作は標準的な手法（例、F.M．Ausubel et al編，Current Protocols in Molecular Biolo gy<John Wiley & Sons，New York，1994>を参照）を用いて実施した。Ｂ．プラスミドヒトFKBP12（以下、"FKBP"）の酵母GAL4DNA結合性ドメイン、HSV VP16活性化ドメイン、ヒトＴ細胞CD3ゼータ鎖細胞内ドメイン、またはヒトFASの細胞内ドメインとの融合体をコードする構築物は、PCT/US94/01617に開示されている。本発明に関連する融合タンパク質の発現を指令する別のDNAベクターは、哺乳動物発現ベクターpCGNN（Attar，R.M．and Gilman，M.Z．1992，MCB 12:2432-24 43）から誘導された。pCGNNにXbaI-BamHI断片としてクローン化された挿入断片を、ヒトCMVプロモーターおよびエンハンサー配列（キャップ部位に対してヌクレオチド-522ないし+72）の制御下で転写し、任意のエピトープ標識（モノクローナル抗体12CA5により認識されるH．influenzaeヘマグルチニン（赤血球凝集素）遺伝子の16アミノ酸部分）および、転写因子ドメインの場合にはＮ末端核局在化配列（NLSと略記，SV40 T抗原から）と共に発現させる。説明した場合を除いて、pCGNNにクローン化された全ての断片は、BamHI部位のすぐ上流のSpeI部位を包含するXbaI-BamHI断片として挿入された。XbaIとSpeIは適合性のある末端を生ずるので、最初の挿入断片の下流にさらにXbaI-BamHI断片を挿入することが可能となり、多成分からなるタンパク質の段階的組立てが容易となった。停止コドンをSpeI部位とBamHI部位の間に入れた。初期構築物に対しては、ベクターpCGNN-GAL4をさらに使用した。このベクターでは、XbaI部位が断片の3'末端だけで再び生じるように、GAL4 DNA結合性ドメイン遺伝子のコドン1- 94が、pCGNNのXbaI部位中にクローン化されていた。従って、このベクター中にX baI-BamHI断片をクローン化してGAL4融合体を生成させ、その後に回収することができる。 (a) GAL4 DNA 結合性ドメイン−FRAP融合体をコードする構築物ヒトFRAP遺伝子の一部を得るために、MMLV逆転写酵素およびランダムヘキサマー・プライマー(Clontech第１ストランド合成キット)を用いて、ヒト胸腺全RN A（Clontech #64028-1）を逆転写した。このcDNAを、プライマー１および２とPf uポリメラーゼ（Stratagene）とを含有するPCR反応に直接使用した。プライマーは、Chenら(Proc．Natl．Acad．Sci．USA（1995）92，4947-4951)によりFKBP− ラパマイシン結合に必要かつ十分であると同定された最小'FRB’ドメイン（以下、FRBと命名）に本質的に対応する89アミノ酸領域であるヒトFRAPを内包するアミノ酸2025-2113に対するコード配列を増幅するように設計された。適当な大きさのバンドを精製し、XbaIおよびSpeIで消化し、XbaI-SpeI消化pCGNN-GAL4中に連結させた。この構築物を制限酵素分析（正確な方向を確かめるため）とDNA(塩基)配列決定とにより確認し、pCGNN-GAL4-1FRBと命名した。 FRB XbaI-BamHI断片を分離し、次いでこれをSpeIとBamHIで消化されたpCGNN-G AL4-1FRB中に戻して連結させてpCGNN-GAL4-2FRB(これは制限酵素分析により確認した)を生成させることにより、FRB多量体をコードする構築物を得た。この新たな構築物について上記の手法を同様に繰り返して、pCGNN-GAL4-3FRBおよびpCGNN -GAL4-4FRBを得た。最小FRBドメイン(アミノ酸2025-2113)を包含するが、これを超えた長さを持つ FRAPのより大きな断片をコードするベクターも構築した。下に示すように、両隣りが5'XbaIおよび3'SpeI部位となる各種FRAP領域を増幅するPCRプライマーを設計した。まず、断片FRAPiを上記のようにRT-PCRにより増幅し、XbaIおよびSpeIで消化し、XbaI-SpeI消化pCGNN-GAL4中に連結させた。この構築物pCGNN-GAL4-FRAPiをP CRにより分析して挿入方向を確認し、DNA配列決定により照合した。次いで、これをPCR基質として使用し、上に列挙したプライマーを用いて他の断片を増幅させた。これらの新たな断片を上記のようにGAL4融合体としてクローン化し、構築物pCGNN-GAL4-FRAPa，pCGNN-GAL4-FRAPb等を生成させ、これらをDNA配列決定により確認した。２つのより大きなFRAP断片、FRAPdとFRAPeのコンカテマー（鎖状体）をコードするベクターを、先に使用したのと類似の方法により形成した。FRAPdおよびFRA PeをコードするXbaI-BamHI断片をpCGNN-GAL4-FRAPdおよびpCGNN-GAL4-FRAPeから分離し、SpeIとBamHIで消化された同じベクター中に戻して連結させて、pCGNN-G AL4-2FRAPdおよびpCGNN-GAL4-2FRAPeを形成した。この新たな構築物について上記の手法を同様に繰り返して、pCGNN-GAL4-3FRAPd，pCGNN-GAL4-3FRAPe，pCGNN- GAL4-4FRAPdおよびpCGNN-GAL4-4FRAPeを得た。全ての構築物を制限酵素分析により確認した。 (b) FRAP-VP16 活性化ドメイン融合体をコードする構築物単純疱疹ウイルスタンパク質VP16の活性化ドメインとのFRBドメインのＮ末端融合体を生成させるため、１、２、３及び４コピーのFRBをコードするXbaI-BamH I断片をGAL4融合ベクターから回収し、XbaI-BamHI消化pCGNN中に連結して、pCGN N-1FRB、pCGNN-2FRB等を得た。次いでこれらのベクターをSpeIとBamHIで消化した。VP16のアミノ酸414-490をコードするXbaI-BamHI断片を、プラスミドpCG-Ga1 4-VP16（Das，G.，Hinkley，C.S．and Herr,W.(1995)Nature 374，657-660）から分離し、SpeI-BamHI消化ベクター中に連結して、pCGNN-1FRB-VP16，pCGNN-2FR B-VP16等を形成した。これらの構築物は制限酵素分析および／またはDNA配列決定により確認した。 (c) ZFHD1 DNA 結合性ドメイン−FRAP融合体をコードする構築物哺乳動物細胞中のZFHD1コード配列の発現を指令する発現ベクターを次にようにして調製した。プライマー5'Xba/Zifおよび3'Zif+Gを用いたPCRによりcDNAクローンからZif268配列を増幅した。プライマー5'Not Oct HDおよびSpe/Bam 3' Octを用いたPCRによりcDNAクローンからOct-1ホメオドメイン配列を増幅した。Z if268 PCR断片は、XbaIとNotIとて切断した。Oct-1 PCR断片は、NotIとBamHIとて切断した。両断片をpCGNN(Attar and Gilman，1992)のXbaI部位とBamHI部位との間に3-方向連結反応で連結して、cDNA挿入断片がヒトCMVプロモーターおよびエンハンサー配列の転写制御下にあり、SV40 T抗原からの核局在化配列に連結しているpCGNNZFHD1を作成した。プラスミドpCGNNはまた、選択可能なマーカーとして作用しうるアンピシリン耐性の遺伝子も含有している。（pCGNNZFHD1のSpeI部位とBamHI部位との間にXbaI-BamHI断片として連結させたヒトFKBP12の１または３縦列反復を含んだ誘導体てあるpCGNNZFHD1-FKBPx1およびpCGNNZFHD1-FKBPx3も調製した。pCGNNZFHD1-FKBPx3のサンプルは、American T ype Culture CollectionにATCC受託番号97399とし寄託された。）プライマー FRBドメインのキメラDNA結合性タンパク質ZFHD1とのＣ末端融合体を生成させるため、１、２、３及び４コピーのFRBをコードするXbaI-BamHI断片をGAL4融合ベクターから回収し、SpeI-BamHI消化pCGNN-ZFHD1中に連結して、pCGNN-ZFHD1-1 FRB、pCGNN-ZFHD1-2FRB等を得た。これらの構築物を制限酵素分析および／またはDNA配列決定により確認した。 ZFHD1とＣ末端FRBドメインとの間に追加の「リンカー」ポリペプチドを導入することによる効果を検証するため、FRBのＮ末端の外配列(extra sequence)をコードするFRAP断片をZFHD1融合体としてクローン化した。FRAPa，FRAPb，FRAPc， FRAPdおよびFRAPeをコードするXbaI-BamHI断片を、ベクターpCGNN-GAL4-FRAPa， pCGNN-GAL4-FRAPb等から切り出し、SpeI-BamHI消化pCGNN-ZFHD1中に連結させて、ベクターpCGNN-ZFHD1-FRAPa，pCGNN-ZFHD1-FRAPb等を得た。FRAPeの２、３、および４個のＣ末端コピーへのZFHD1の融合体をコードするベクターの構築も、pCGNN-GAL4-2FRAPe，pCGNN-GAL4-3FRAPeおよびpCGNN-GAL4-4FRAPeから、2FR APe、3FRAPeおよび4FRAPeをコードするXbaI-BamHI断片を分離し、これらをSpeI- BamHI消化pCGNN-ZFHD1中に連結させて、ベクターpCGNN-ZFHD1-2FRAPe，pCGNN-ZF HD1-3FRAPeおよびpCGNN-ZFHD1-4FRAPeを得ることにより行った。全ての構築物を制限酵素分析により確認した。 ZFHD1とのFRBドメインのＮ末端融合体をコードするベクターも構築した。１、２、３及び４コピーのFRAPeをコードするXbaI-BamHI断片をpCGNN-GAL4-1FRAPe、 pCGNN-GAL4-2FRAPe等から分離し、XbaI-BamHI消化pCGNN中に連結させて、pCGNN- 1FRAPe、pCGNN-2FRAPe等を得た。次いでこれらのベクターをSpeIとBamHIとで消化し、ZFHD1をコードするXbaI-BamHI断片（pCGNN-GZFHD1から分離）をこのベクター中に連結させて、構築物のpCGNN-1FRAPe-ZFHD1、pCGNN-2FRAPe-ZFHD1等を得た。これらの構築物は制限酵素分析により確認した。 (d) FRAP-p65 活性化ドメイン融合体をコードする構築物ヒトNF-kBp65サブユニット（以下、p65という）の活性化ドメインとのFRBドメインの融合体を形成するため、プラスミドpCG-p65からPCRにより２つの断片を増幅させた。プライマー９(p65/5'Xba)および11(p65 3'Spe/Bam)はアミノ酸450-55 0のコード配列を増幅させ、プライマー10(p65/361 Xba)および11はアミノ酸361- 550のコード配列を増幅させ、どちらも5'Xbaおよび3'SpeI/BamHI部位に隣接していた。PCR産物をXbaIとBamHIで消化し、XbaI-BamHI消化pCGNN中にクローン化して、pCGNN-p65(450-550)およびpCGNN-p65(361-550)を得た。これらの構築物は制限酵素分析とDNA配列決定により確認した。 100アミノ酸の方のp65転写活性化配列は、次の線状配列によりコードされる。より長い方のp65転写活性化ドメイン(351-550)は、次の線状配列によりコードされる。 p65活性化ドメインの部分とのFRBドメインのＮ末端融合体を生成させるため、プラスミドpCGNN-1FRB、pCGNN-2FRB等をSpeIおよびBamHIで消化した。p65(450-5 50)をコードするXbaI-BamHI断片をpCGNN-p65(450-550)から分離し、SpeI-BamHI 消化ベクター中に連結させて、プラスミドpCGNN-1FRB-p65(450-550)，pCGNN-2FR B-p65(450-550)等を得た。構築物pCGNN-1FRB-p65(361-550)も、pCGNN-p65(361-5 50)から分離したXbaI-BamHI断片を用いて同様に作成した。これらの構築物は制限酵素分析により確認した。 p65活性化ドメインとＮ末端FRBドメインとの間に追加の「リンカー」ポリペプチドを導入することによる効果を検証するため、FRBに対してＣ末端の外配列をコードするFRAP断片をp65融合体としてクローン化した。FRAPa，FRAPb，FRAPf， FRAPgおよびFRAPbをコードするXbaI-BamHI断片を、ベクターpCGNN-GAL4-FRAPa， pCGNN-GAL4-FRAPb等から切り出し、XbaI-BamHI消化pCGNN中に連結させて、ベクターpCGNN-FRAPa，pCGNN-FRAPb等を得た。次いで、これらのプラスミドをSpeIと BamHIとて消化し、p65(アミノ酸450-550)をコードするXbaI-BamHI断片をこれに連結させて、５種類のベクターpCGNN-FRAPa-p65，pCGNN-FRAPb-p65等を得た。これらは制限酵素分析により確認した。 FRAPeの１および３個のＮ末端コピーへのp65の融合体をコードするベクターも、pCGNN-1FRAPeおよびpCGNN-3FRAPeをSpeIおよびBamHIで消化することにより調製した。次に、p65(450-550)およびp65(361-550)をコードするXbaI-BamHI断片（ pCGNN-p65(450-550)およびpCGNN-p65(361-550)から分離）をこれに連結させて、ベクターpCGNN-1FRAPe-p65(450-550)，pCGNN-3FRAPe-p65(450-550)，pCGNN-1FRA Pe-p65(361-550)およびpCGNN-3FRAPe-p65(361-550)を得た。全ての構築物を制限酵素分析により確認した。 p65活性化ドメインの部分とのFRBドメインのＣ末端融合体をコードするベクターも構築した。プラスミドpCGNN-p65(450-550)及びpCGNN-p65(361-550)をSpeIおよびBamHIで消化し、FRAPeの１および３コピーをコードするXbaI-BamHI断片（pC GNN-GAL4-1FRAPeおよびpCGNN-GAL4-3FRAPeから分離）及びFRBの１コピー（pCGNN -GAL4-1FRBから分離）をこれに連結させて、プラスミドpCGNN-p65(450-550)-1FR APe，pCGNN-p65(450-550)-3FRAPe，pCGNN-p65(361-550)-1FRAPe，pCGNN-p65(361 -550)-3FRAPe，pCGNN-p65(450-550)-1FRBおよびpCGNN-p65(361-550)-1FRBを得た。全ての構築物を制限酵素分析により確認した。 (e) その他の構築物他の構築物も上記手順と同様に、但しFRAP配列の別の部分を用いて作成することができる。例えば、プライマー12および13はFRAPの全コード領域の増幅に使用される。プライマー１と13、６と13、および５と13は、FRBドメインを包含し、そのタンパク質のＣ末端へ伸びている（脂質キナーゼ相同ドメインを含む）三つの断片の増幅に使用される。これらの断片は、FRBドメインに対してＮ末端のタンパク質の異なる部分をコードすることにより相違する。どの場合も、RT-PCRを上記のように用いてヒト胸腺RNAからの領域を増幅し、PCR産物を精製し、XbaIおよびSpeIで消化し、XbaI-SpeI消化pCGNN中に連結させ、制限酵素分析およびDNA 配列決定で確認する。 (f) プライマー配列下線部は制限酵素部位である（XbaI＝TCTAGA、SpeI＝ACGAGT、BamHI＝GGATCC ） (g) 代表的最終構築物：pCGNN-ZFHD1-1FRBのDNA配列・非コード（コーディングしない）ヌクレオチドは小文字で表示・(S/X)および(X/S)は、どの酵素でも開裂しえない配列を生じさせるための、 XbaIおよびSpeIによる消化の適合性産物の間の連結反応の結果を示す・*は停止コドンを示す (h) 二シストロン性(bicistronic)構築物脳心筋炎ウイルスからの内部リボソーム・エントリー配列(IRES)をpWZL-Bleo からのPCRにより増幅した。得られた断片をpBS-SK+(Stratagene)中にクローン化したものは、IRES配列の上流側にXbaI部位と停止コドンを含み、その下流側には ATGを包含するNcoI部位とその後ろのSpeIおよびBamHI部位とを含んでいる。クローン化を容易にするため、それぞれ下記のオリゴヌクレオチドを使用して、pCGN N-ZFHD1-3FKBPの開始ATGの付近の配列をNcoI部位に変異させ、そしてXbaI部位は NheI部位に変異させた。および次いで、ZFHD1-3FKBPを含むNcoI-BamHI断片を、pBS-IRESの下流側でクローン化してpBS-IRES-ZFHD1-3FKBPを作成した。次にこのプラスミドから得たXbaI-BamHI 断片をSpeI/BamHI切断pCGNN-1FRB-p65(361-550)中にクローン化して、pCGNN-1FR B-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBPを作成した。Ｃ．キメラタンパク質発現のためのレトロウイルスベクター安定に組込まれた低コピー遺伝子から転写因子融合タンパク質を発現させるのに用いるレトロウイルスベクターをpSRαMSVtkNeo（Muller et al，MCB 11:1785 -92，1991）およびpSRαMSV(XbaI)(Sawyers et al，J．Exp．Med．181:307-313 ，1991)から得た。どちらのベクターにもあるユニークBamHI部位をBamHIによる消化により除去し、クレノウ(Klenow)断片で充填し、再連結反応させて、それぞれpSMTN2およびpSMTX2を作成した。pSMTN2は、内部チミジンキナーゼプロモーターからのNeo遺伝子を発現する。pSMTX2中の内部チミジンキナーゼプロモーターの下流側のユニークXbaI部位の中にNheI断片としてゼオシン（Zeocin）遺伝子(I nvitrogen)をクローン化すると、pSNTZが得られよう。このゼオシン断片は、pZe o/SV(Invitrogen)を下記プライマーを用いて変異誘発させて、ゼオシンコード配列の両側に隣接NheI部位を導入することにより形成された。 pSMTN2は、LTRの下流にユニークEcoRIおよびHindIII部位を含んでいる。XbaI- BamHI断片として合成された転写因子融合タンパク質のクローン化を容易にするため、下記の配列をEcoRI部位とHindIII部位との間に挿入してpSMTN3を作成した。 pSNTZのユニークEcoRI部位に同等の断片を挿入すると、3'HindIII部位がEcoRI 部位で置換された点が唯一の相違点であるpSMTZ3が作成される。 pSMTN3とpSMTZ3は、キメラ転写因子をXbaI-BamHI断片として5'ウイルスLTRの下流にクローン化させることを可能にし、それぞれ抗生物質のG418またはゼオシンに対する耐性を付与するそれらの能力のため安定な組込み体(integrant)に対する選択を可能にする。レトロウイルスベクターSMTN-ZFHD1-3FKBPを形成するため、まずpCGNN-ZFHD1- 3FKBPを変異させてこの融合タンパク質の最初のアミノ酸の上流にEcoRI部位を付加した。次いで、ZFHD1-3FKBPをレトロウイルスLTRから発現させるように、EcoR I-HindIII(blunted)pSRαMSVtkNeo(ref．51)中にEcoRI-BamHI(blunted)をクローン化した。実施例２：ラパマイシン依存性の転写活性化我々の以前の実験は、３コピーのFKBPをGa14 DNA結合性ドメインまたは転写活性化ドメインのいずれかに融合させた融合タンパク質は、安定的に取込まれたか、または一時的にトランスフェクションされたどちらのリポーター遺伝子も、１個または２個だけしかFKBPドメインを含んでいない対応する融合タンパク質より強力に活性化させることを示した。FRB融合タンパク質とのこのパラメーターを評価するため、１またはそれ以上のコピーのFRBドメインに融合させたGa14 DNA 結合性ドメインを含むエフェクタープラスミドを、一時的トランスフェクションにより３個のFKBPドメインおよびp65活性化ドメイン(3xFKBP-p65)をコードするプラスミドと一緒に共トランスフェクションした。図３Ａに示したデータは、この系では、４コピーのFRBドメインをGa14 DNA結合性ドメインに融合した融合タンパク質が、安定に組込まれたリポーター遺伝子を、FRBドメインの数がより少ない残りの対応する融合タンパク質より強力に活性化させたことを示している。方法：HT1080 B細胞を10％ウシ（仔牛）血清添加MEM中で増殖させた。６ウェル・プレート(Falcon)中の約４×10⁵個／ウェルの細胞を、供給業者(GIBCO，BLR) が推奨するようにリポフェクション(Lipofection)手法により一時的にトランスフェクションした。この実験に用いたDNA:リポフェクタミン比は1:6に相当した。各ウェルの細胞は、500ngのpCGNN F3-p65、担体として1.9ugのPUC 118プラスミド、および100ngの下記プラスミドのいずれか１つ(pCGNN Ga14-1FRB，pCGNN G a14-2FRB，pCGNN Ga14-3FRBまたはpCGNN Ga14-4FRB)を受容した。トランスフェクション後、２mlの新鮮培地を加え、指定濃度までラパマイシンを添加した。24 時間後、100ulの培地を文献記載(Spencer et al，1993)のようにSEAP活性について検定した。 p65活性化ドメインに融合した複数のFRBドメインがリポーター遺伝子の転写活性化の増大を生ずるかどうかを試験するため、本発明者らは、HT1080 B細胞をGa 14-3xFKBPを発現するプラスミドならびにp65活性化ドメインに融合させた１、２、３もしくは４コピーのFRBと一緒に共トランスフェクションした。予想外なことに、DNA結合性ドメイン−FRB融合体とは異なり、１コピーのFRBをp65活性化ドメインに融合させた融合タンパク質が、２以上のコピーのFRBを含んでいる対応する融合タンパク質より著しく強力にリポーター遺伝子を活性化させた。図３Ｂ。方法：HT1080 B細胞を10％ウシ（仔牛）血清添加MEM中で増殖させた。６ウェル・プレート(Falcon)中の約４×10⁵個／ウェルの細胞を、GIBCO，BLRが推奨するようにリポフェクション手法によって一時的にトランスフェクションした。使用したDNA:リポフェクタミン比は1.6に相当した。各ウェルの細胞は、担体として1 .9ugのPUC 118プラスミド、100ngのpCGNN Ga14-F3、および500ngの下記プラスミドのいずれか１つ(pCGNN 1，2，3または4 FRB-p65)を受容した。トランスフェクション後、２mlの新鮮培地を加え、指定濃度までラパマイシンを添加した。24時間後、100ulの培地を文献記載(Spencer et al，1993)のようにSEAP活性について検定した。同様の実験をさらに、5xGa14-IL2-SEAPリポーター遺伝子と、安定に組み込まれたGa14 DNA結合性ドメインおよび３コピーのFKBPを含む融合タンパク質をコードするDNA配列とを含んでいる、別の安定な細胞系（HT1080 B14）を用いて行った。この細胞は、１またはそれ以上のコピーのFRBドメインに融合させたp65活性化ドメインを発現するエフェクタープラスミドで一時的にトランスフェクションした。HT1080 B細胞での我々の考察と同様に、１コピーのFRB-p65活性化ドメイン融合タンパク質を発現するエフェクタープラスミドは、２コピー以上のFRBを含む他のものより強力にリポーター遺伝子を活性化させた。実施例３Ａ．一時的トランスフェクション細胞：ZFHD1およびp65融合体中でのラパマイシン依存性転写活性化 SEAP標的遺伝子と代表的なZFHD-FKBP-およびFRB-p65含有融合タンパク質をコードするプラスミドとで一時的にトランスフェクションされたヒト繊維肉腫細胞は、細胞培地中へのラパマイシン依存性で用量応答性のSEAP分泌を示した。図４Ａを参照。SEAP産生は、転写因子融合プラスミドの一方または両方が除かれた細胞では検出されず、ラパマイシンを添加しない場合も検出されなかった（図４Ｂ）。しかし、全成分が存在していると、0.5nMという低いラパマイシン濃度でもS EAP分泌が検出可能であった（図４Ａ）。ピークSEAP分泌は５nMで認められた。同じ転写因子を用いてhGHリポーター遺伝子またはレトロウイルスベクターの感染により作成したSEAPリポーター遺伝子の安定組み込みバージョンのラパマイシン依存性活性化を引き起こした場合にも同様の結果が得られた。薬剤が存在しない場合のSEAP分泌のレベルが検出不能であるため、ラパマイシンへの応答における活性化の倍数を決定することは困難であったが、この方式では、ラパマイシンが存在しないバックグラウンド水準に比べて少なくとも1000倍の増大になることは明らかである。即ち、このシステムは、検出不可能なバックグラウンド活性と高い動的範囲(dynamic range)を示す。転写因子融合タンパク質に対するいくつかの異なる形態が探査された（図５）。FKBPドメインをZFHD1に、FRBドメインをp65にそれぞれ融合させた場合、複数のFKBPがZFHD1に融合し、それより少ない数のFRBがp65に融合すると、最適レベルのラパマイシン誘発活性化が起こった。DNA結合性タンパク質に対して複数の薬剤結合性ドメインの方が優先することは、これらのタンパク質が複数の活性化ドメインを引き入れるため、より高度のプロモーター活性を引き出すことができることを反映しているかもしれない。活性化ドメイン上に薬剤結合性ドメインが１個だけしか存在していないと、ZFHD上の各FKBPは１個のp65を引き入れることができる。p65上のFRBの数が増大すると、１つづつが複数のFRB-FKBP相互作用に結合されて、より少ない数の活性化ドメインがZFHDに引き入れられる場合が多くなろう。方法：ヒト繊維肉腫細胞に由来するHT1080細胞(ATCC CCL-121)を、非必須アミノ酸および10％ウシ胎児血清添加MEM中で増殖させた。24ウェルの皿で平板培養した細胞（Falcon，６×10⁴個／ウェル）を、製造業者(GIBCO/BLR)が推奨する条件下でリポフェクションを用いてトランスフェクションした。各ウェルに、合計300ng の下記DNAをトランスフェクションした：100ngのZFHDx12-CMV-SEAPリポーター遺伝子、2.5ngのpCGNN-ZFHD1-3FKBPもしくは他のDNA結合性ドメイン融合体、5ngの pCGNN-1FRB-p65(361-550)もしくは他の活性化ドメイン融合体、ならびに192.5ng のpUC118。DNA結合性ドメインまたは活性化ドメインを省略した場合は、等量の空のpCGNN発現ベクターで置き換えた。リポフェクション後（約５時間）、表示量のラパマイシンを含む500μの培地を各ウエルに加えた。24時間後培地を取り出し、励起350nmおよび発光450nmのルミネセンス分光計(Perkin Elmer)を用いて、文献記載（Spencer et al，Science 262:1019-24，1993）のようにSEAP活性について検定した。マウスへの注射（後述）用の一時的にトランスフェクションされたHT1080細胞の調製は、100mmの皿に入れた細胞（２×10⁶個／皿）をリン酸カルシウム沈降により16時間トランスフェクションすることにより行った(Gatz，C.，Kaiser，A． & Wendenburg，R.，1991，Mol．Gen．Genet．227，229-237)。使用したDNA は、10μgのZHWTx12-CMV-hGH，1μgのpCGNN-ZFHD1-3FKBP，2μgのpCGNN-1FRB-p6 5(361-550)および７μgのpUC118であった。トランスフェクションした細胞をリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で２回洗浄し、新鮮培地で５時間培養した。注射用に採集するため、10mM EDTAを含有する・EPES緩衝食塩水中で皿から細胞を取り出し、PBS/0.1% BSA/0.1%グルコースで洗浄し、同じ液に２×10⁷個／mlの濃度で再懸濁させた。プラスミド転写因子融合プラスミドの構築は上に説明した。pZHWTx12-CMV-SEAP ZFHD1結合性部位(Pomerantz et al，1995)の12縦列コピーと、分泌アルカリ性フォスファターゼ(SEAP)をコードする遺伝子の発現を推進するヒトサイトメガロウイルス(CMV，Boshart et al，1985)の即時型遺伝子からの基礎プロモーターとを含んでいるこのリポーター遺伝子は、pSEAPプロモーター(Clontech)のNheI-Hi ndIII断片を、12のZFHD結合性部位を含む下記のNheI-XbaI断片：（下線部がZFHD1結合性部位である）および最小CMVプロモーター(-54〜+45)を含む下記のXbaI-HindIII断片：（下線部がCMV最小プロモーターである）で置換することにより調製した。pZHWTx12-CMV-hGH このリポーター遺伝子の活性化はhGHの生産を生ずる。これは、pZHWTx12-CMV- SEAP(SEAPコード配列を含む)のHindIII-BamHI(blunted)断片を、pOGH（hGHゲノムクローンを含む;Selden et al，MCB 6:3171-3179，1986;BamIIIおよびEcoR I部位は一緒にブラント<blunt>されていた）からのHindIII(blunted)-EcoRI断片で置換することにより構築された。pZHWTx12-IL2-SEAP このリポーター遺伝子は、最小CMVプロモーターを含むXbaI-HindIII断片を、最小IL2遺伝子プロモーター（出発部位に対して-72ないし+45，Siebenlist et a l，MCB 6:3042-3049，1986）を含む下記のXbaI-HindIII断片で置換した点を除いて、pZHWTx12-CMV-SEAPと同一である。（下線部がIL2最小プロモーターである）pLH １または少数コピーのリポーター遺伝子の安定な組込みを容易にするため、下記のレトロウイルスベクターを構築した。Moloneyマウス白血病ウイルスLTRにより運ばれたヒグロマイシンＢ耐性遺伝子とユニーク内部ClaI部位とを含んでいる pLH（LTR-hph）を次のようにして構築した。hph遺伝子を、pBabe HygroからのHi ndIII-ClaI断片（Morganstern and Land，NAR 18:3587-96，1990）としてBamHI- Clat切断pBabe Bleo（bleo遺伝子の損失を生ずる；BamHIおよびHindIII部位は一緒にブラントされていた）中にクローン化した。pLH-ZHWTx12-IL2-SEAP ZFHD1結合性部位の12縦列コピーと、pLHレトロウイルスベクター中へのSEAP遺伝子の発現を推進するIL2遺伝子からの基礎プロモーターとを含んでいる１コピーのリポーター遺伝子をクローン化するため、pZHWTx12-IL2-SEAP(ClaIリンカーを添加)からのMluI-ClaI断片をpLHのClaI部位中にクローン化した。これは、ウイルスLTRからの転写方向と内部ZFHD-IL2プロモーターからの転写方向が同じになるような向きであった。pLH-G5-IL2-SEAP SEAP遺伝子の発現を推進する最小IL2プロモーター中に埋め込まれた５個のGa1 4部位を含むレトロウイルスベクターを構築するため、下記からなるClaI-BstBI 断片を、ウイルスLTRからの転写方向と内部Ga14-IL2プロモーターからの転写方向が同じになるように、pLHのClaI部位中に挿入し[ClaI-HindIII断片は、５個の Ga14部位（下線部）と、IL2遺伝子の-324ないし-294（太字部）および-72ないし +45(イタリック体)とを含んでいる]: SEAP遺伝子コード配列を含んでいるHindIII-BstBI断片(Berger et al，Gene 66: 1-10，1988)を、停止コドンのすぐ後に下記配列（BstBI部位を含む）を追加するように変異誘発させた。Ｂ．安定的にトランスフェクションした細胞内のラパマイシン依存性転写活性化このシステムが安定的にトランスフェクションされた細胞内でも同様の性質を示すことを確認するために下記の実験を行った。SEAP標的遺伝子とそれぞれZFHD 1-3FKBPおよび1FRB-p65に対する発現ベクターの逐次トランスフェクションににより安定な細胞系を発生させた。最終トランスフェクションから得られた数十の安定なクローンを集めた集団は、ラパマイシン依存性SEAP産生を示した。この集団からいくつかの個々のクローンの特性を調べたが、その多くはラパマイシンに感応して高水準のSEAPを産生した。かかるクローンの１つから得られた結果を図４Ｃに示す。このクローンのSEAP産生水準は、集団より約40倍も高く、一時的にトランスフェクションした細胞よりも著しく高かった。このクローンのバックグラウンドSEAP産生および誘導比を厳密に定量化するつもりで、未処理細胞のSEAP 活性もすべて検出するためにSEAP検定の長さを約50倍も増大させた２回目の検定を行った。かかる条件下では、任意蛍光単位で、偽のトランスフェクションした細胞は47単位を生じたのに対し、トランスフェクションしたクローンは、ラパマイシンが存在しないと54単位を生じ、100nMのラパマイシン濃度で90,000単位以上を生じた。即ち、この安定な細胞系では、バックグラウンドの遺伝子発現は無視でき、誘導比（７単位：90,000単位）は４桁以上の大きさであった。安定なトランスフェクションの作業を単純化するため、内部リボソームエントリー配列(IRES)の使用により、ZFHD1-3FKBPと1FRB-p65の両方の産生を指令する二シストロン性の発現ベクターを使用した。この発現プラスミドを、ゼオシン耐性マーカープラスミドと一緒に、レトロウイルスにより形質導入されたSEAPリポーター遺伝子を有する細胞系に中に共トランスフェクションし、約50の薬剤耐性クローンの集団を選択し、拡張した。図４Ｄは、このクローン集団も、検出可能なバックグラウンドを持たずにラパマイシン依存性のSEAP産生を生じ、一時的にトランスフェクションした細胞に見られるのと非常に似た用量−応答曲線を与えることを示している。この集団も、図４Ｃで検討したクローンに似た性能を持つ個々のクローンを含んでいることが予測されよう。即ち、ラパマイシン応答性の遺伝子発現は、一時的と安定的のいずれのトランスフェクション細胞でも容易に得ることができる。いずれの場合も、調節は、バックグラウンドが非常に低く、誘導比が高いことが特徴である。安定細胞系リポーター遺伝子またはDNA結合性ドメイン融合体を含む、ヘルパーのないレトロウイルスを、Psi(-)両種性パッケージングベクターと、それぞれレトロウイルスベクターpLH-ZHWTx12-IL2-SEAPもしくはSMTN-ZFHD1-3FKBPとを用いて、293T 細胞の一時的共トランスフェクションによって発生させた(Pear，W.S.，Nolan， G.P.，Scott，M.L．& Baltimore D.，1993，一時的トランスフェクションによるヘルパー・フリーの高力価レトロウイルスの作成，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90，8392-8396)。安定に組み込まれたリポーター遺伝子を含むクローン性細胞系を形成するため、レトロウイルスの原液で感染させたHT1080細胞を希釈し、ヒグロマイシンＢ 300μg/mlの存在下で選択した。この細胞系および後述する他の細胞系から得られた個々のクローンを、上記のように欠落成分の一時的トランスフェクション後にラパマイシンを添加する試験でスクリーニングした。分析した 12の全部のクローンが誘導可能で、基礎活性はほとんど或いは全く持っていなかった。最も応答性の高いクローンHT1080Lをその後の検討のために選択した。 HT1080L細胞をまずSMTN-ZFHD1-3FKBPでパッケージングしたレトロウイルスで感染させ、500μg/mlのG418を含有する培地中で選択することにより、安定に組み込まれたpLH-ZHWTx12-IL2-SEAPリポーター遺伝子、ZFHD1-3FKBP DNA結合性ドメインおよび1FRB-p65(361-550)活性化ドメインを含んでいるHT20-6細胞を発生させた。次いで、強力に応答するクローンのHT1080L3を、直線化pCGNN-1FRB-p65 （361-550）およびpZeoSV（Invitrogen）でトランスフェクションし、250μg/ml のゼオシンを含有する培地中で選択した。個々のクローンを、まずウェスタンにより1FRB-p65(361-550)の存在について試験した。８個の陽性クローンをラパマイシンの添加により分析した。８個全部が基礎活性が低く、そのうち６個では遺伝子発現が少なくとも２桁の大きさで誘導された。最強の応答を示したクローン HT20-6をその後の分析のために選択した。直線化pCGNN-1FRB-p65(361-550)-IRES-ZFHD1-3FKBPとpZeoSVとでHT1080L細胞を共トランスフェクションし、250μg/mlのゼオシンを含有する培地中で選択することにより、HT23細胞を発生させた。約50クローンを分析のために集めた。分析のため、細胞を96ウェルの皿(1.5×10⁴個／ウェル)で平板培養し、指定量のラパマイシン（またはビヒクル）を含有する培地200μlを各ウェルに添加した。18時間後、培地を取り出し、SEAP活性について分析した。場合により、培地を分析前に希釈し、得られた相対SEAP単位に希釈倍数を乗じた。トランスフェクションしていないHT1080細胞で測定されたバックグラウンドSEAP活性を、それぞれの値から差し引いた。実施例４：マウスにおけるhGHのラパマイシン依存性の産生 in vivo 試験：動物、飼育および一般操作：雄性nu/nuマウスをCharles River La boratories（Wilmington，MA）から入手し、実験前に５日間馴化させた。各マウスは無菌条件下で飼育し、実験の全期間を通して滅菌食物および滅菌水を自由に摂取させ、無菌技法により取り扱った。免疫無防備状態の動物はどれも、外来感染(outward infection)を示さず、また飼育技法もしくは実験技法の結果として病気の状態になることもなかった。一時的にトランスフェクションされた細胞をマウスに移植するため、２×10⁶ 個のトランスフェクションHT1080細胞を、100μlのPBS/0.1% BSA/0.1%グルコース緩衝液中に懸濁させ、動物の脾腹と後四半部の４カ所の筋肉内部位に投与した (１部位当たり約25μl)。対照用のマウスには同量の緩衝液のみを注射した。ラパマイシンは、N,N-ジメチルアセトアミドとポリエチレングリコール(平均分子量400)およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートの9:1(v:v)混合物とを等量で混合した中に溶解させることにより、in vivo投与用に処方した。完成した処方中のラパマイシン濃度は、2.0ml/kg注射量で適当な量のin vivo投与が可能となるのに十分な濃度であった。尾静脈への静脈内投与の前に、投与用溶液の精度をHPLC分析により確認した。トランスフェクションHT1080細胞を持っていない一部の対照用マウスには、10.0mg/kgのラパマイシンを投与した。また、トランスフェクション細胞を持っている別の対照用マウスには、ラパマイシンのビヒクルだけを投与した。マウスを麻酔するか、CO₂吸入により致死させて血液を採取した。麻酔したマウスは、心臓穿刺により100μlの血液を採取するのに使用した。マウスが意識を取り戻した後、次回の血液採取のために回復させた。致死させたマウスは直ちにしゃ血した。血液検体を４℃で24時間放置して凝固させ、1000Xgで15分間の遠心分離後に血清を集めた。血清hGHをBoehringer Mannheim非等張サンドイッチELIS A（Cat No．1 585 878）により測定した。この検定法は、0.0125ng/mlと検出限界がより低く、動的範囲は0.4ng/mlに達していた。推奨された検定の指示に従った。Molecular Devicesマイクロタイター・プレート・リーダーを用いて、参照波長を490nmにして405nmで吸光度を測定した。ELISAでの抗体試薬は、希釈剤の血清中または自然の検体中では内生マウスhGHとの交差反応性を全く示さなかった。in vivo hGH 発現 hGH発現の用量依存性ラパマイシン誘導刺激の評価のために、HT1080細胞の注射から約１時間後にラパマイシンをマウスに投与した。ラパマイシンの投与量は、0.01，0.03，0.1，0.3，1.0，3.0，または10.0mg/kgのいずれかであった。ラパマイシン投与から17時間後に、血液採取のためにマウスを致死させた。 in vivo hGH発現の時間経過を追うために、マウスに細胞の注射から１時間後に10.0mg/kgのラパマイシンを投与した。ラパマイシン投与から4、8、17、24および42時間後にマウスを致死させた。ラパマイシンが移植したHT1080細胞から持続したhGH発現を誘導する能力を、ラパマイシンの反復投与により試験した。マウスに上記のようにしてトランスフェクションしたHT1080細胞を投与した。細胞の注射から約１時間後に、10.0mg/k g量の５回のラパマイシン静脈内投与の第１回目を行った。残りの４回の投与は、16、32、48および64時間での血液採取のすぐ後に麻酔下で行った。最初のラパマイシン投与から72、80、88および96時間後にも追加の血液採取を行った。対照用のマウスには細胞は投与したが、ラパマイシン投与の各時間にはビヒクルだけを投与した。実験動物およびそれらに対応する対照用の動物は、それぞれ２つの群の１つに帰属させた。２つの実験動物群および２つの対照動物群はどれも、それぞれ同じ薬剤またはビヒクル処置を受けた。これら２つの群の相違点は、各動物の血液採取の頻度を減らすために、血液採取時間を２つの群の間で交替させたことであった。結果ラパマイシンは実験動物におけるhGHの用量応答性産生を誘発させた（図６）。ラパマイシンで処置した動物のhGH濃度は、ヒトの正常な循環系濃度(0.2〜0.3 ng/ml)にほぼ匹敵する。この実験ではhGH産生のプラトーは認められなかった。これは、トランスフェクション細胞の最大hGH産生能力に達していないことを示唆している。トランスフェクション細胞を投与したがラパマイシンを投与しなかったものと、ラパマイシンを投与したが細胞を投与しなかったものを含む対照動物では、検出可能な血清hGHを示さなかった。即ち、試験動物におけるhGHの産生は遺伝子工学処理細胞とラパマイシンの両者の存在に完全に依存性であった。ラパマイシンの投与から17時間後の血清に著しい濃度でhGHが存在することは、この試験動物ではhGHが４分未満の半減期で循環系から消失するので、注目に値する。この観察結果は、遺伝子工学処理した細胞がラパマイシン処置の後も何時間もhGHを分泌し続けるということを示唆していた。hGH産生のラパマイシン制御の動力学（速度）を検証するため、動物をラパマイシンの１回の投与で処置し、その後の異なる時間でhGH濃度を測定した。血清hGHは、ラパマイシン処置から４時間以内に認められ、８時間でピーク(hGH ELISAの感度限界の100倍以上)に達し、処置から42時間は検出可能であり続けた（図７）。hGH濃度は、そのピークから約11時間の半減期で減少した。この半減期は、この試験動物におけるhGH自体の半減期の数百倍も長く、ラパマイシンの半減期(4.6時間)の約２倍の長さである。ラパマイシンに比べて血清hGHの減少速度が遅いことは、移植した細胞の付近により高いラパマイシン組織濃度が存在することを反映しているかもしれない。或いは、遺伝子工学処理細胞からのhGH産生の持続性が、hGH mRNAの安定性により向上したことも考えられる。興味深いことに、これらの動物に42時間で２回目のラパマイシンの投与を行うと、血清hGHの２番目のピークが生じ、このピークが最初と同様の速度で減少していった。このことは、遺伝子工学処理細胞が少なくとも２日間はラパマイシンに対する応答能力を保持することを示した。そのため、このシステムが持つ循環系hGH濃度の向上・維持能力を確める目的で、16時間の間隔で動物にラパマイシンを何回も投与する実験を行った。この間隔は、hGH濃度がピークに達し、次いで約半分まで減少するのに要する時間に対応している。この投与方法によれば、ラパマイシン濃度は２回目の投与後は1.7μg/mlの定常状態の一定濃度に達する（図８に破線で示すように）ことが予測される。hGH濃度も２回目の投与後は定常状態の一定濃度に達する筈である。図８は、処置した動物が実際にラパマイシンの反復した投与に応答して比較的安定な循環系hGH濃度を保持することを示している。最後の投与後、hGH濃度は16時間も一定を保持し、その後はラパマイシンに似た半減期（ラパマイシンの4.6時間に対してhGHは6.8時間）で減少した。これらのデータは、多数回の投与により循環系ラパマイシンがin vivoのトランスフェクション細胞からのhGH分泌に対する緊密な制御を付与することを示唆している。特に、薬剤の撤収によりタンパク質誘導がすばやく終了することが明らかである。考察上記の実験は、小分子薬剤を用いて、遺伝子工学処理した細胞からの分泌治療用タンパク質の産生を制御することが可能であることを実証している。このシステムは、ヒトの遺伝子および細胞治療への使用に必要な多くの特徴を備えている。まずバックグラウンド活性が非常に低く、誘導比が高いという特徴を持つ。また、宿主の生理作用または任意の細胞型特異的因子から独立して機能する。さらに、完全にヒトタンパク質から構成される。制御用薬剤はin vivoで十分に挙動し、経口で生体利用性がある。この一般的な設計のシステムで、in vivoで遺伝子工学処理細胞から安定かつ正確な力価の量の分泌治療用タンパク質を提供することが恐らく可能となろう。間欠的またはパルス様の投与も可能となるであろう。小分子による制御下で遺伝子工学処理細胞からタンパク質を供給する顕著な利点は、任意の所定時点でのタンパク質産生速度が、その小分子薬剤の循環系濃度に相関することである。従って、hGHのような治療用タンパク質の見掛けの薬物供給速度を劇的に変化させることができる。我々の実験では、例えば、ラパマイシンを１回投与した後の遺伝子工学処理細胞ら供給された循環系hGH濃度の変化は、組換えタンパク質を１回投与した後に見られるものとは著しく相違する。マウスに静脈内投与したhGHは数分の半減期で消失するのに対し、ラパマイシンで誘導した遺伝子工学処理細胞からのhGH濃度は、約11時間の半減期で減少した。ヒトの場合も、hGH消失の半減期は約20分であり、一日おきに注射する必要があり、血清hGH濃度は非常に大きく変動する。厳密な薬理的制御下で遺伝子工学処理細胞からタンパク質を供給すると、特に薬剤供給速度が低いか治療指数が低いタンパク質にとって、より効果的な治療を生ずることも考えられる。小分子の薬剤を用いてDNA結合性ドメインと活性化ドメインを結合するのは、i n vivo遺伝子発現の調節に対する有効な方策となる。特に魅力的な１つの特徴は、システムが完全にモジュール化されていて、各成分を別々に最適化および遺伝子工学処理することができることである。DNA結合活性の制御を比較的微妙なアロステリックな分子間相互作用に頼っている細菌リプレッサーとは異なり、本発明の二量体化の方策は実質的にあらゆるDNA結合性および活性化ドメインに適用することがことができる。ここでは、DNA結合親和性および新規な認識特異性の合理的な遺伝子工学処理を容易に支持する構造の確定したDNA結合性ドメインを使用した。同様に、活性化ドメインも効力および他の特性が最高になるように遺伝子工学処理することができる。実際、上記の実験で用いた遺伝子工学処理した転写因子は、従来のプロモーター／エンハンサーシステムに対して非常に高水準の遺伝子発現を誘起させ、いずれのドメインもさらなる向上を容易に取り入れることができる。単一の標的遺伝子の転写に供された遺伝子工学処理した転写因子の誘導が可能であるため、従来の発現ベクターに比べてより低いバックグラウンドと実質的により高水準のin vivo遺伝子発現を得る機会が与えられる。我々はまた、免疫系による認識可能性を最小限にするためにヒトタンパク質からの調節された転写因子を構築するように選択した。細菌性ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび疱疹ウイルスのチミジンキナーゼからなる融合タンパク質を発現するオートロガスＴ細胞が、免疫系の衰弱したエイズ患者でも、宿主細胞毒性Ｔ細胞により効果的に認識され、排除されたことが報告された(Ridde 11，S.R．et al，HIV感染患者における遺伝子修飾HIV特異性細胞毒性Ｔリンパ球のＴ細胞媒介拒絶，Nature Med.2，216-223(1996))。この考察は、遺伝子工学処理された細胞中の異種タンパク質の免疫認識の危険性が現実のものであり、従って、ヒト細胞中の調節機能を実行するヒトタンパク質の使用が賢明であることを示唆している。本発明の転写因子融合タンパク質の各成分はそれぞれ配列がヒトのものであるが、各タンパク質は異物として認識される可能性のある結合ペプチドを含んでいる。ただし、これらの結合は、既述したように、免疫系に対するその提示が最小限となるように設計ないし選択することができる。ラパマイシンに基づくシステムの原理的な制限は、FRAP活性の阻害により、in vivo免疫抑制を生ずる細胞周期進行を阻止するラパマイシンの本来の生物学的活性である。しかし、我々の実験は、ラパマイシンの免疫抑制用量未満(1mg/kg 未満)でhGHのような治療用タンパク質の生理学的に意味ある濃度を得ることができることを実証している。さらに、FKBPまたはFRAPのいずれかへの結合を破壊する置換基をラパマイシン分子上に導入することできるため、免疫抑制活性が完全に欠落したラパマイシン類似物に容易に接近させることができる。本来の生物学的活性は持たないが、ラパマイシンの魅力的な薬理特性を保持しているラパログは、実験動物およびヒトの遺伝子治療において遺伝子工学処理されたタンパク質産生の調節に広範囲に有用であることが恐らく証明されよう。実施例５：代表的C-24修飾ラパログの合成ラパマイシンの精製：ラパマイシンは醗酵により得た。ラパマイシンを産生する微生物のストレプトマイセス・ヒグロスコピカス(Streptomyces hygroscopicus) (ATCC # 29253)を15Lまたは30Lのフェッドバッチ（流加）培養器内で複合培地(c omplex medium)により培養した。9〜14日後に遠心分離によりバイオマスを集菌した。上清を非イオン性の高分子吸着剤樹脂XAD-16(Rohm and Haas)と１〜２時間接触させた。吸着剤を遠心分離により回収し、バイオマスと混合し、塩化メチレンで繰り返し抽出した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をアセトニトリルで抽出し、次いで抽出液を同様に濃縮した。粗製ラパマイシンのクロマトグラフィー精製を、シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（40％アセトン／ヘキサン）とその後のC-18逆相HPLC(70％CH₃CN/H₂O)により行った。得られたラパマイシンは、ラパマイシンの真正試料と同一のHPLC、分光学的および生物学的特性を示した。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-メチルオキシム)(AP1731および1732)一般操作 MeOH（2mL）中のラパマイシン（60mg，65.6mmol）の溶液を、NaOAc（22mg，26 2mmol，4.0等量）で、続いてメトキシルアミン塩酸塩（22mg，262mmol，4.0等量）で処理し、室温で48時間攪拌した。この攪拌時間の後、反応混合物をH₂O（10m L）で静め、EtOAc(3×10mL)で抽出した。有機抽出液を合わせて、飽和NaCl溶液( 2×10mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥し、濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（10％MeOH／ジクロロメタン）で処理して、異性体混合物を得た。この異性体混合物をHPLC(Kromosil C-18 2 50ｘ20mmカラムで35％〜25％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で分離して、13mg( 21％)のより速く溶離するＺ異性体と7.6mg（12％）のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 965.5749[(M+Na)⁺，C₅₂H₈₂N₂O₁₃Naの計算値965.5710]。Ｅ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 965.5701[(M+Na)⁺， C₅₂H₈₂N₂O₁₃Naの計算値965.5710]。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-エチルオキシム)(AP1688および1689) ラパマイシン(EおよびZ)-24−(O−メチルオキシム)と類似の方法で調製した。異性体混合物の分離をHPLC(Kromosil C-18250x20mmカラムで30％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で行って、7.7mg（25％）のより速く溶離するＺ異性体と0.5mg(2％)のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 979.5902[(M+Na)⁺，C₅₃H₈₄N₂O₁₃Naの計算値979.5871]。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-イソブチルオキシム)(AP1684および1685) ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-メチルオキシム)と類似の方法で調製した。異性体混合物の分離をHPLC(Kromosil C-18250x20mmカラムで15％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で行って、28mg(65％)のより速く溶離するＺ異性体と3.0mg(7％) のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z1007.6146［( M+Na)⁺，C₅₅H₈₈N₂O₁₃Naの計算値1007.6184］。Ｅ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1007.6157［(M+Na)⁺，C₅₅H₈₈N₂O₁₃Naの計算値1007.6184］。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-ベンジルオキシム)(AP1682および1683) ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-メチルオキシム)と類似の方法で調製した。異性体混合物の分離をHPLC(Kromosil C-18 250x20mmカラムで15％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で行って、19.6mg(44％)のより速く溶離するＺ異性体と6.1mg（ 14％）のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1041. 6033［(M+Na)⁺，C₅₈H₈₆N₂O₁₃Naの計算値1041.6028］。Ｅ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1041.5988［(M+Na)⁺，C₅₈H₈₆N₂O₁₃Naの計算値1041.6028］。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-カルボキシメチルオキシム)(AP1686および1687) ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-メチルオキシム)と類似の方法で調製した。異性体混合物の分離をHPLC(Kromosil C-18250x20mmカラムで45％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で行って、4.6mg（11％）のより速く溶離するＺ異性体と1.0mg(2 ％)のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z1009.5644 ［(M+Na)⁺，C₅₃H₈₂N₂O₁₅Naの計算値1009.5613］。Ｅ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1009.5604［(M+Na)⁺，C₅₃H₈₂N₂O₁₅Naの計算値1009.5613_]。ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-カルボキサミドメチルオキシム)(AP1729および1 730) ラパマイシン(EおよびZ)-24-(O-メチルオキシム)と類似の方法で調製した。異性体混合物の分離をHPLC(Kromosil C-18250x20mmカラムで35％H₂O/MeCNにより溶離、12mL/min)で行って、6.2mg（10％）のより速く溶離するＺ異性体と1.4mg(2 ％)のＥ異性体とを得た。Ｚ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1008.579 0［(M+Na)⁺，C₅₃H₈₃N₂O₁₄Naの計算値1008.5768］。Ｅ異性体：高解像質量スペクトル（FAB）m/z 1008.5753［(M+Na)⁺，C₅₃H₈₃N₂O₁₄Naの計算値1008.5768］。実施例６Ａ．ラパマイシンC24「バンプ」類似体のFKBPへの結合試験ラパマイシンC24類似体のFKBPに対する親和性を、蛍光偏り(FP)に基づく競合分析を用いて測定した。フルオレセイン標識FK506プローブ(AP1491)を合成し、その蛍光の偏りの増加を、亜飽和FKBPと種々の量のラパマイシン類似体を競合物として含む平衡結合実験において結合したプローブ割合（％）の直接の読みとして用いた。（ｉ）フルオレセイン化FK506プローブ(AP1491)の合成 FK506 の24,32−ビス（tert−ブチルジメチルシリル）エーテル tert−ブチルジメチルシリル・トリフルオロメタンスルホネート(108μL、470 μmol)をFK506(103mg、128μmol)と2,6−ルチジン（89.5μL、768μmol）のジクロロメタン（３mL）中の０℃の溶液に攪拌しながら滴加した。得られた溶液を０ ℃で２時間攪拌し、次いでMeOH（0.5mL）およびエーテル（15mL）で処理した。この混合物を10％NaHCO₃水溶液（３mL）およびブライン（３mL）で洗浄した。有機層をデカンテーションし、無水Na₂SO₄で乾燥し、ろ過し、濃縮して黄色油状物とした。カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−EtOAc ３：１）により表題化合物を無色油状物(104mg)として得た。中間体１ FK506の24,32−ビス（tert−ブチルジメチルシリル）エーテル(100mg、97μmo l)のTHF（2.5mL）中の溶液へ、モルホリンＮ−オキシド(68mg、580μmol)、次いで水(60μL)及び四酸化オスミウムの４％水溶液(123μL、20μmol)を加えた。得られた混合物を室温で4.5時間攪拌した。次いで、これをMeOH 50％水溶液(1.5mL )及び過ヨウ素酸ナトリウム(207mg、97μmol)で処理し、懸濁液をさらに１時間攪拌した。この混合物をエーテル(10mL)で希釈し、NaHCO₃飽和水溶液（２×４mL ）で洗浄した。有機層をデカンテーションし、亜硫酸ナトリウムを少量含む無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を無水THF(2.8mL)に溶解し、チッ素下で−78℃に冷却し、リチウムトリス[(３−エチル−３−ペンチル)オキシ]アルミニウム水素化物のTHF(282μl)中の0.5M溶液で処理した。得られた溶液を−78℃で1.75時間攪拌し、次いでエーテル（６mL）及び塩化アンモニウム飽和溶液(250μL)の添加により反応停止させた。この混合物を室温にまで温め、無水硫酸ナトリウムで処理した。ろ過及び減圧下での濃縮により淡黄色油状物(97mg) が得られ、これをカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−EtOAc ３：１）により精製すると、無色油状物として１が得られた。中間体２上記アルコール(300mg、290μmol)のアセトニトリル(10mL)中の溶液を2,6-ルチジン(338μL、2.9mmol)及びN,N'−ジスクシニミジルカーボネート(371mg、1.4 5mmol)で処理した。得られた懸濁液を室温で14.5時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン-EtOAc２：１〜 100％ EtOAcの勾配）にかけると淡黄色油状物(127mg)として混合カーボネート２が得られた。中間体３上記カーボネート(30mg、26μmol)とトリエチルアミン(36μL、260μmol)のアセトニトリル（１mL）中の溶液を、4'-(アミノメチル)フルオレセイン(13.5mg、 34μmol)で処理した。得られた明橙色の懸濁液を室温で１時間攪拌し、次いで減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン-EtOAc１：１〜100％ EtOAc〜EtOAc-MeOH 1：1の勾配）にかけると明黄色固体として３(20. 5mg)が得られた。化合物４ビス−シリルエーテル３(35mg、25μmol)のアセトニトリル（２mL）中の溶液をHFの48％(w/w)水溶液(250μL)で処理した。得られた混合物を室温で5.5時間攪拌した。次いでこれをジクロロメタン(10mL)で希釈し、水（２×２mL）で洗浄した。有機層をデカンテーションし、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をクロマトグラフィー(シリカゲル、100％EtOAc)にかけると、明黄色固体として４(13mg)が得られた。（ii）FPを用いたラパマイシン類似体の結合親和性（IC50）の測定各類似体の連続10倍希釈物をガラスビン中で100％エタノールで調製し、氷中に貯蔵した。その他の操作はすべて室温で行った。精製した組換えFKBP（標準的方法で精製、Wiederrecht，G．et al．1992，J．Biol．Chem．267，21753−2176 0参照）のストックを50mMリン酸カリウムpH7.8/150mM NaCl/100μg/mlウシガンマグロブリン（「FP緩衝液」：Panvera製、低蛍光試薬のみを用いて調製）で11. 25mMまで希釈し、98μL部分をDynatech micro-fluor black 96ウエル蛍光プレートのウェルに移した。次いで、2.0μLのラパマイシン類似体サンプルをこのウエルに混合しながら移した（二重）。最後に、0.1％エタノール／FP緩衝液中に10 μM AP1491を含むプローブ溶液を調製し、100μLを各ウエルに混合しなから加えた。二重の対照ウエルはラパマイシン類似体の代わりにエタノール（100％プローブ結合に対して）を、あるいはラパマイシン類似体の代わりにエタノール、そしてFKBPの代わりにFP緩衝液（０％結合）を含んでいた。このプレートを暗中で被覆された状態で約30分貯蔵し、平衡化させ、次いで各ウエル中のサンプルの蛍光の偏りを製造業者の説明に従ってJolley FPM-2FPプレートリーダー(Jolleyコンサルティング＆リサーチ社、グレイスレイク、IL)で読んだ。各競合物濃度に対する平均偏り(mP単位)は通常、対照値に対して全結合％に変換され、競合物(x)の最終モル濃度の対数に対してプロット(y)された。非線形最小二乗法分析を用い、曲線に合わせて以下の式を用いIC50を導いた。ｙ＝Ｍ１＋（Ｍ４−Ｍ１）／（１＋exp[Ｍ２^*(Ｍ３−Ｘ))）ここでM3は1C50である。不完全な曲線ではIC50は内挿によって決定した。各場合においてラパマイシンとC14−デソキソ−ラパマイシンが対照として含まれた（C14−デソキソ−ラパマイシンはLuengo，J.I．et al.1994，Tetrahedron Lett ．35，6469−6472に記載の方法で製造した）。(c) ラパマイシンC24オキシムの結合試験の結果親和性はIC50及び親和性減少の倍数（＝IC50／ラパマイシンのIC50）で示した。Ｂ．C7ラパログ−FKBP複合体のFRAPへの結合試験 C7に嵩高の置換基を有する一連のラパログを、文献に一般に記載されている化学反応（Luengo et al．1995，Chemistry and Biology 2，471-481）を用いて合成した。本明細書のデータは以下に示す３つのラパログに関する： (a) 合成 AP1700 、7S−イソプロポキシラパマイシン：ラパマイシン(60mg、0.066mmol)のイソプロパノール3.0mL中の溶液を固体ｐ− トルエンスルホン酸(75mg、0.39mmol)で処理した。反応混合物を室温で４時間攪拌し、次いで30mLの酢酸エチルで希釈し、重炭酸ナトリウム飽和水溶液(3×20mL )及びブライン(2×20mL)で洗浄した。次いで、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過し、濃縮した。逆相HPLC(Rainin C-18 ODS 1”カラム、35％アセトニトリル／水、55℃)により所望の精製物25mg(40％)を得た。AP1701 、7R−(3−インドリル)ラパマイシン及び−AP1702、7S−(3−インドリル) ラパマイシントリフルオロ酢酸(0.084mL、1.1mmol)をラパマイシン(50mg、0.055mmol)及びインドール(64mg、0.55mmol)のジクロロメタン２ml中の溶液（−40℃）に攪拌しながら添加した。温度は３時間の間−40℃から−45℃の間に維持し、次いで反応混合物を酢酸エチル(10mL)とブライン(20mL)との間で分配した。次いで、有機相をさらにブライン(4×20ml)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。逆相HPL C(Rainin C-18 ODS 1”カラム、65％アセトニトリル／水、55℃)にかけて11.8mg の7S−インドールと7.6mgの7R−インドール(35％)を得た。正確な質量分析とNMRにより化合物を確認した。 (b) C7 ラパログのFKBP結合親和性のFP試験競合FPを用いて、上記ＡでC24ラパログについて記載したようにして、FKBPに対するラパログの親和性を調べた。ラパマイシン及びC14−デソキソ−ラパマイシン(Luengo et al．1994，Tetrahedron Lett．35,6469−6472に記載のようにして調製)を対照として含んだ。親和性は以下において1C50及び親和性の減少倍数（＝IC50／ラパマイシンのIC 50）で示した。これらのデータは、ラパマイシン−FRAP界面におけるC7位の位置に応じ、これらの大きいC7置換基がラパマイシンのFKBPに対する親和性をあまり減少させないことを示している。(c) C7 ラパログのFKBP結合親和性のFP試験培養細胞におけるラパログ−FKBP複合体の結合を分析するために、HT20-6細胞（ZFHD1−応答性SEAPリポーターを有し、ZFHD1−(3×FKBP)及びFRB-p65を安定的に発現する、実施例３(B)参照）を用いた。HT20-6細胞を96−ウエルの皿で培養し(1×10⁴細胞／ウエル)、ラパログの連続希釈物を含む200μ培地を各ウエルに加えた（三重）。22時間後培地を除去し、実施例２に記載したようにしてSEAP 活性を調べた。結果は図15に示され、これはAP1700のイソプロポキシC7置換基がFRAP親和性を適度に減少させる（SEAP産生の減少により示される）ことを示している。しかし、AP1701及びAP1702のより大きいインドリル置換基はほぼ完全にSEAP発現を止め、これはこの修飾がラパログ−FKBP複合体のFRAPへの結合をさまたげるバンプとして作用することを示している。活性化ヒトＴ細胞又はネズミ脾臓細胞（splenocyte）増殖を減少させるC7ラパログの能力についても、FRAPに結合するその能力の減少を指標として調べた。当分野において、適当な試験法、例えば3H−チミジン取り込みの阻害(Luengo et a l.1995，Chemistry and Biology 2，471-481)がよく知られている。実施例７：種々のラパログに相補性の修飾リガンド結合性ドメインを作成するための変異誘発及びファージ発現（display）Ａ．遺伝子工学処理したFKBP及びFRBドメイン例示の修飾リガンド結合性ドメインを有する以下の表に挙げた融合タンパク質をコードする組み換えDNA構築物を設計し作成した。特に説明がなければ、変異体は標準的方法(Kunkel，T.A.，Bebenek，K.およびMcC1ary，J．1991，Meth Enz ymol．204，235-139)によるオリゴムクレオチド媒介部位特異的変異誘発を用いて作成し、ジデオキシ配列決定法により確認した。以下のFRB融合タンパク質をコードする構築物も作成した。本書で述べた修飾hFRAP FRBドメインと同様にして修飾した酵母およびカンジダFRBは、そのそれぞれのFRBドメイン内の２個の保存Phe残基と保存AspおよびAs n残基のうちの１または２以上の代わりに異なるアミノ酸のコドンを置き換えて製造してもよい。TOR1およびT0R2由来の例示した修飾FRBドメインには以下のものがある。Ｂ．合理的に設計されたFKBP変異体のラパログへの結合性試験ヘキサヒスチジン標識及びモノクローナル抗体12CA5のエピトープであるH.インフルエンザ(H．influenza)ヘマグルチニンタンパク質の一部を前に有するFKBP を発現する、pET20b(Novagen)に基づく発現ベクターを標準的操作を用いて構築した。ラパマイシン接触残基において変異したFKBP用発現ベクターを作成するために、文献記載の方法(Kunkel，T.A.，Bebenek，K.及びMcClary，J．1991，Meth．En gy mol．204，235-139)でE.coli CJ236から作成した単鎖形態のベクターにおいて、オリゴヌクアレオチド媒介部位特異的変異誘発を行った。変異体はジデオキシ配列決定法により確認した。変異体タンパク質は文献記載の方法(Wiederrecht，G ．et al．1992，J．Biol．Chem．267，21753-21760)でE．coli BL21(DE3)(Novag en)中で発現させ、文献記載の方法(Cardenas，M.E．et al．1994，EMBO J．13， 5944-5957)で均一になるよう精製した。このプロトコルを用いて以下の変異ヒトFKBP12タンパク質を、表示のオリゴヌクレオチドプライマー（変異した塩基を大文字で示す；5'→3'）を用いて生成させた：Ｃ24ラパログへの結合のために設計した変異体：Ｃ13／Ｃ14ラパログへの結合のために設計した変異体：Ｃ28／Ｃ30ラパログへの結合のために設計した変異体：ラパマイシン及びラパログのFKBP変異体への相対的結合親和性を調べるために、変異体によるFK506(及びプローブ)結合親和性の保持に依存する競合的蛍光偏り(FP)分析を用いる。この操作は、亜飽和を得るために競合反応において用いる変異FKBPの希釈（濃縮）を決定するために、最初に直接結合分析を行うことを除いて実施例６に記載されたものと同じである。変異FKBPの連続希釈をDynatech m icro-fluorプレートにおいて100μl容積でFP緩衝液（実施例６）中で行い、次いで各ウエルに［FP緩衝液＋２％エタノール］中の10nM AP1491(プローブ)100μl を加える。平衡化及びプレートの読みは実施例６の通りである。mP単位対FKBP変異体濃度のプロットは次式に適合し： y＝M3+(((x+M1+M2)-SQRT(((x+M1+M2)＾2)-(4^*×^*M1)))/(2^*(M1)))^* (M4-M3) 90％のプローブが特異的に結合している最終変異体濃度／希釈倍数は内挿により決定する。次いでこの最終濃度を実施例６で行った競合FP試験に用い、このプロトコルでは２×（変異体の最終濃度）が11.25nMのFKBPに置きかわる。競合試験により高い感度を与えるために、90％飽和の代わりに75％を選択することもできる。ラパマイシン類似体の連続希釈物を競合体として用い、結果は各変異体へ結合する各ラパログについてIC50として表わす。Ｃ．FKBP−ラパログ複合体への結合のために合理的に設計されたFBR変異体の試験ヒトFRAPの残基2021−2113（これも含む）をコードするNcoI−BamHI断片をプライマー28及び29（下記）を用いたPCRにより作成し、NdeI部位がNcoIに変異しているpET20b(+)(Novagen)誘導体中にクローン化し、pET-FRAP(2021-2113)を創出した。このベクターの単鎖DNAを上記した部位特異的変異誘発操作で鋳型として用いて、ラパマイシン接触残基において変異しているFRAPをコードするベクターを作成した。変異体はジデオキシ配列決定で確認した。次いで変異体を、XbaI 及びSpeI部位を付加したプライマー(30及び31)を用いたPCRによって増幅し、Xba I−SpeI消化pCGNN-FRB-p65(361-550)(実施例１)にクローン化し、E-N-変異FRAP( 2021-2113)-p65(361-550)型（ここでＥはHAエピトープ標識を、Ｎは核局在化配列を示す）のキメラタンパク質の哺乳動物での発現を指示する一連の構築物を作成した。構築物は制限酵素切断及びジデオキシ配列決定により確認された。この操作を用いて、C7ラパログに結合する可能があり、それぞれp65(361-550) 活性化ドメインに融合している変異FRAPをコードする以下の構築物を、記載のオリゴヌクレオチドプライマー（大文字は変異した塩基；5'→3'）を用いて作成した。これらの変異体のFKBPとラパマイシン及び各種ラパログとの複合体に対する相対的結合親和性を調べるために、各構築物を実施例２に記載したようにしてヒト HT1080B14細胞中に一時的に共トランスフェクションを行う。トランスフェクション後、連続希釈ラパマイシン又はラパログを培地に添加する。24時間後、実施例２に記載のようにしてSEAP活性を測定する；種々のラパログ濃度でのSEAP活性化の効力はFKBPとラパログとの複合体に対するFRAP変異体の親和性に比例する。 PCRプライマー(大文字は制限酵素部位を示す；5'→3'): Ｄ．繊維状バクテリオファージにおけるFRAPのFRBドメインの機能表示（発現）：修飾ドメインの合理的設計の代替としての選択の１方法 (a) ベクター構築カルベニシリン耐性ファージミド表示ベクター(Pharmacia)であるpCANTAB-5E の誘導体を、fd遺伝子IIIのCys202をTyrで置換したプライマー１を用いて部位特異的変異誘発により作成した。Cys202は混合ジスルフィドの形成によりAsp198で融合したタンパク質の発現を妨害することがあり、この問題はTyr置換により解消する（Cunningham，B.C．et al．1994，EMBO J．13，2508）。構築物はDNA配列決定により確認し、次いでNcoI及びBamHIで切断した。１対のオリゴヌクレオチド（２及び３）を連結し、プラスミドpCANTAB-AP-polyを生成させ、これはgen eIIIシグナル配列のNcoI部位とgeneIIIのコドン198のBamHIの間にNcoI-SpeI-Bam HIポリリンカーを含む。このベクターは枠内（in frame）NcoI-BamHI断片を受け入れ、ｐIII残基198-406上にコードされるタンパク質（Cunningham et al．(199 4，EMBO J．13,2508)により記載された融合形態）のＮ末端発現を指示する構築物を得た。残基2015-2114までをコードするFRAP断片をPfuポリメラーゼ(Stratagene)とプライマー４及び５を用いてpCGNN-FRAPPiから増幅した。この断片を精製し、NcoI 及びBamHIで切断し、NcoI-BamHI切断pCANTAB-AP-poly中に連結し、ベクターp-CA NTAB-FRAP(2015-2114)を作成し、これはDNA配列決定により確認された。(b) His6-flag-FKBP の調製 FRAP表示ファージミドの親和性富化（精製）用の標識FKBPタンパク質を得るために、pET20b(Novagen)に基づく発現ベクターを標準的操作を用いて作成し、これはヘキサヒスチジン標識（親和性精製のため）及び「flag」配列(Kodak IBI) （免疫学的検出のため）を前に有するFKBPを発現した。このタンパク質は既知の方法(Wiederrecht,G．et al．1992,J.Biol.Chem.267,21753-21760)によりE.coli BL21(DE3(Novagen))中で発現され、既知の方法(Cardenas,M.E．et al．1994，E MBO.J.13,5944-5957)によりNi-NTAアガロース(Qiagen)を用いて均一になるまで精製した。発現したタンパク質の配列は次の通り： (c) 結合富化 p-CANTAB-AP-FRAP(2015-2114)をE.coliXL-1(Stratagene)に形質転換し、以下の点を除いて本質的には既知の方法(Lowman,H.B.及びWells,J.A．Methods:Comp. Methods Enzymol.1991,3,205-126)によりヘルパーファージK07の助けにより表示（発現）ファージを作成した。既知の方法との違いは、ファージミド増殖物を接種するのに用いる一晩培養物は２％グルコース含有培地で増殖させ、ファージ増殖はK07感染を可能とするために37℃で最初に１時間培養した後25℃で行われた点であった。参照試薬を提供するために、ファージミド粒子も、クロランフェニコール耐性ベクターpBC(Stratagene)で形質転換した細胞から調製した。各場合のファージミド力価(コロニー形成単位、cfu)を既知のようにして(Lowman,H.B. 及びWells,J.A．Methods:Comp．Methods Engymol.1991,3,205-216)測定した。 FKBP−ラパマイシンへのFRAP含有ファージの特異的結合富化を立証するために、約10³cfuをPBS/３％BSA/0.05％トウィーン-20(「PBSBT」)250μl中のpBCファージミド約10¹⁰cfuと混合した。１μM(最終)のHis6-flag-FKBPタンパク質を加え、次いで100％エタノール中の100μMラパマイシン又はFK506、あるいはエタノール単独を2.5μl加えた。この混合物を室温で１時間インキュベーションし、次いでPBSBT中で平衡化されたNi-NTAPアガロースビーズの１：１スラリーを100μl(H is6-標識FKBP及び関連ファージミドを捕捉するために)加えた。この混合物をエンドーオバー−エンドミキサー（end-over-end mixer）で15分間穏やかに回転させ、その後、ビーズをマイクロヒュージ(microfuge)中で30秒間800 0rpmで回転させることによりペレット化した。次いでこのビーズを１mlのPBS/0. 05％トウィーン-20中で５回、１mlのPBS/0.05％トウィーン-20/1M NaCl中で５回洗浄した。結合したファージミドは200μlの0.2MグリシンpH2.0を加え10分間インキュベーションすることによりビーズから溶離した。このビーズをペレット化し、上清（溶離ファージミドを含有）を集め、26μlの1Mトリス塩基で中和した。カルベニシリン(carb)とクロランフェニコール(chlor)耐性cfu力価を上記のようにして測定し、carb/chlor比を(カルベニシリン耐性)FRAPファージミドの特異的富化（精製）の指標として用いた。結果は、ラパマイシン-FKBPマトリックス上での親和性富化の後は出発混合物に比べてFRAPファージの富化(271倍)が劇的であるが、FK506-FKBPマトリックス（2.4倍）またはFKBP単独(1.5倍)ではそうではないことを示した。この実験は、分子のFRAP結合側（例えばC7位）にバンプを有するラパマイシン類似体に結合する変異FRAPをライブラリーから精製するのに用いる操作を示す。(d) プライマー制限酵素部位に下線(NcoI=CCATGG;BamHI=GGATCC) (e) pCANTAB-AP-FRAP(2015-2114) の配列上記配列における注： *はXL-1(Lowman,H.B.及びWells,J.A.1993,J.Mol.Biol.234,564-578)などのSup E E.coli株にGlnとして抑制されているアンバー停止コドンを示す。 +は遺伝子工学処理されたCys202→Tyr変異の位置を示す。 +はシグナルペプチド開裂後の成熟ポリペプチドの１番目のアミノ酸(Ala)を示す。Ｅ．繊維状バクテリオファージでのFKBPの機能表示（発現）(a) ベクター構築 FKBP(アミノ酸1-107)のコード配列を５ngのプラスミドpCGNN-F1(米国特許出願 No.08/581,713(1995年12月29日出願))を鋳型としプライマー１及び２を用いてPC Rにより増幅した。PCR産物を精製し、NcoIとBamHIで消化し、NcoI-BamHI消化pCA NTAB-AP-polyに連結してベクターpCANTAB-AP-FKBPを作成し、これは制限酵素分析及びDNA配列決定で確認した。この構築物はCKys202がTyrに変異したpIII残基1 98-406においてFKBPのＮ末端発現を指令する：配置はCunningham et al.(1994,E MBO J.13,2508)により報告。(b) 親和性富化の研究のためのビオチニル化FK506の合成ファージ上でのFKBPの機能発現の立証を可能にする固定化リガンドを提供するために、ビオチン部分がリンカーを介してエフェクタードメインのアルキル基に結合した（以下の図式参照）FK506の変形を合成した。２mLのCH₂Cl₂中のN-(6-アミノヘキシル)FK506(35mg、36.8mmol)の溶液へ、ビオチン-Su(25.1mg、73.5mmol )、次いでNEt₃(51.4mL、368mmol)を加えた。この懸濁液へDMFを反応混合物が透明になるまで加えた。10分後反応が完了した。得られた混合物をCH₂Cl₂（25mL）で希釈し、H₂O(15mL)、ブライン(15mL)で洗浄し、Na₂SO₄で乾燥させた。溶離剤として10％MeOH/CH₂Cl₂を有するフラッシュクロマトグラフィーにより、所望の生成物13ng(30％)を白色固体として得た。この構造はNMRとMSで確認した。 N-(6-アミノヘキシル)FK506 カルバメイト（この化合物の調製は、アリアド317PCT参照） (c) FKBP 表示ファージの増殖 pCANTAB-AP-FKBPをE.coli XL-1(Stratagene)に形質転換し、表示ファージを以下の点を除いては既知の方法(Lowman,H.B．and Wells,J.A．Methods:Comp．Meth ods Enzymol.1991,3,205-216)と本質的に同じ方法でヘルパーファージK07の助けにより作成した。既知方法とは、ファージミド増殖物を接種するのに用いる一晩培養物を２％グルコース含有培地で増殖させた点で異なった。ファージミド力価 (コロニー形成単位、cfu)は既知のようにして(Lowman,H.B．and Wells,J.A．Met hods:Comp．Methods Enzymol.1991,3,205-216)測定した。(d) ビオチニル化FK506を用いた競合ELISAによるFKBP機能表示の立証 96−ウエルのマキシソープ（maxisorp）プレート(Nunc)のウエルを１ウエルにつきPBS中の１μg/mlストレプタビジン(Pierce)100μｌで被覆し、覆いをして４ ℃で一晩インキュベーションした。室温で１時間、１％トウィ−20/PBSでブロックした後、ブロック用溶液を除去し、PBS/1％エタノール中の10nMビオチニル化F K506を加え、インキュベーションをさらに10分間続けた。その間、インキュベーション液100μｌを、FKBPファージ（約５×10⁵cfu)及びPBS/0.02％ BSA/1％エタノール中の連続希釈FK506を含有する別々のチューブに入れた。これらのインキュベーション液を室温で１時間放置し平衡化させ、その後被覆したウエルをPBS/0.05％トウィーン−20で５回洗浄し、ファージ−FK506混合物をウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いでPBS/0.05％トウィーン−20で15回洗浄した。結合ファージの検出のために、抗M13抗体−HRPコンジュゲート(Pharmacia)の1/5000希釈液を100μｌ各ウエルに加え、室温で１時間インキュベーションを行い、その後プレートを前と同様10回洗浄し、次いで製造業者の指示に従いTMB基質(Boehringer)を用いてHRP活性を定量した。値はビオチニル化FK506を被覆していない（結合０％）か、FK506競合物を入れていない（結合100％）対照ウエルに対して全ファージ結合％として算出した。図に示すように、この実験は表示されたFKBPのFK506に対する特異的高親和性結合を実証した。この分析における相互作用に対するIC50は0.65nMであり、報告されたFKBPのFK506に対する0.4-1nMのKd値とよく一致した。この実験はファージでのFKBPの表示がバンプを有するリガンドに親和性をもつFKBPを変異体ライブラリーから親和性選択する手段として用いられることを確立した。(e) ラパマイシンのC13及びC14位を標的とするファージ上の変異FKBPのライブラリーの作成 C13及びC14位にバンプを有するラパマイシン類似体に結合する変異体を得るための変異FKBPのライブラリーを作成するために、縮重プライマー３及び４を用いてFKBP遺伝子の一部を再増幅し、Tyr26、Phe36、Asp37、Arg42及びPhe99のコドンの代わりに縮重コドンNNS(ここでＮは任意の塩基でｓはＧまたはＣ)を導入した。これらの残基の側鎖は、コンピューターグラフィックスを用いるとC14カルボニル及び／又はC13ヒドロキシルに接触しているか、あるいは接触している残基に隣接していることが観察され、従ってこれらの位置に導入されたバンプを有する類似体に対して良好な親和性を有するかもしれない変異体を作成するための変異の候補であった。ランダム化領域に隣接し、pCANTAB-AP-FKBPにおいて特異なApaLIとBamHI部位が好都合に用いられた。 FKBPの一部をプライマー３及び４とPfuポリメラーゼを用いてpCGNN-F1から増幅した。PCR産物をQIAEX IIキット(Qiagen)を用いて精製し、ApaLIとBamHIで広く消化し、ApaLI-BamHI消化pCANTAB-AP-FKBP中に連結した。連結生成物はフェノール抽出で精製し、エタノール沈殿で濃縮し、標準的手法(Dower,W.J．et a l.1988,Nucleic Acids Res.16,6127)によりE.coli XL-1細胞にエレクトロポレーションを行った。ファージを取り出し、上記のようにして(Lowman,H.G．and Wel ls,J.A．Methods:Comp．Methods Enzymol.1991,3,205-216)、力価を測定した。(f) ライブラリー選別約10¹⁰〜10¹¹cfuのファージミド粒子を250μｌのPBS/3％BSA/0.05％トウィーン−20(PBSBT)中に調製した。組み換えGST-FRAP融合タンパク質(E.coli中で発現させ、Chen et al.1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA．92,4947-4951に記載のようにして、精製)を最終濃度１μMとなるよう加え、次いでバンプを有するラパマイシンの100％エタノール中10μMのストックを５μｌを加えた。この混合物を室温で１時間インキュベーションし、次いで(GST標識FRAP及び関連ファージミドを捕捉するため)PBSBT中で平衡化したグルタチオン−アガロースビーズ(Pharmac ia)の１：１スラリー100μｌを加えた。この混合物をエンド−オバー−エンドミキサーで15分間穏やかに回転させ、その後ビーズをマイクロビュージで30秒間80 00rpmで回転させることによりペレット化した。次いでこのビーズを１mlのPBS/0 .05％トウィーン-20中で５回、１mlのPBS/0.05％トウィーン-20/1M NaClで５回洗浄した。200μｌの0.2MグリシンpH2.0を加え10分間インキュベーションすることにより結合ファージミドをビーズから溶離させた。ビーズをペレット化し、上清（溶離ファージミド含有）を集め、26μｌの1Mトリス塩基で中和した。カルベニシリン(carb)とクロランフェニコール(chlor)耐性のcfu力価を上記のようにして測定し、carb/chlor比を（カルベニシリン耐性）FRAPファージミドの特異的富化の指標として用いた。溶離ファージストック100μｌを対数期のE.coli XL-1細胞に感染させるのに用い、次回の選択のためのファージミドを作成した。これは既知の方法(Lowman,H.B．and Wells,J.A．Methods:Comp．Methods Enzymol.1991 ,3,205-216)によった。ファージの力価は数回の選択の間に監視され、バックグラウンドを超える特異的富化が検出された場合は個々のRKBPファージクローンを分離し、標準的方法で配列決定した。クローンのバンプ含有ラパマイシンに対する結合は競合ELISAまたは蛍光偏り分析により測定する。(g) プライマー配列下線は制限酵素部位(NcoI=CCATGG;BamHI=GGATCC;ApaLI=GTGCAC)(h) pCANTAB-AP-FKBP の配列 *はXL-1(Lowman,H.B．and Wells,J.A．1993,J.Mol.Biol.234,564-578)などのs up E E.coliにおいてGlnとして抑制されているアンバー停止コドンを示す。 +は遺伝子工学処理されたCys202−Tyr変異の位置を示す。 +はシグナルペプチド開裂後の成熟ポリペプチドの第１のアミノ酸(Ala)を示す。実施例８：シグナル伝達のラパマイシン依存性活性化多数の細胞レセプターがその生理学的リガンドあるいは抗レセプター抗体のいずれかによる凝集により活性化されうる。さらに、２つの異なるタンパク質の凝集は細胞内シグナルを開始しうることが多い。ラパマイシン及びその類似体を、キメラタンパク質をオリゴマー化することによりレセプターのエフェクタードメインの活性化を開始させのに用いることができ、キメラタンパク質のうちの一方は１または２以上のFKBPとエフェクタードメインを含有し、他方は１または２以上のFRAPドメインとエフェクタードメインを含有している。この機構は図T1(a) に説明されている。両タンパク質が膜に固定されて示されているが、唯一つが膜固定されていればよく、ラパマイシンまたは類似体の添加により第２のタンパク質が二量体化を介して膜に引き入れられるであろう。膜固定は貫膜タンパク質アンカーを介して、あるいはミリストイル化などのタンパク質の脂質修飾により行われてもよい。両タンパク質に同じエフェクタードメインが存在してもよく、または機能的に相互に作用する異なるタンパク質ドメイン、例えばプロテインキナーゼとプロテインキナーゼ基質などを用いてもよい。あるいは、第２のエフェクターが第１のエフェクターの活性を阻害するように作用してもよい。ある態様では、キメラタンパク質が前述の混合キメラであり、異種エフェクタードメインと共にFKBP及びFRAPドメインを含有している。図T1(b)に示すように単一の混合キメラのオリゴマー化をシグナル伝達の活性化に用いてもよい。ここでは、ラパマイシンはタンパク質の２つの同じコピーを二量体化するように示されている。 FKBPとFRAPドメインのくり返しにより、高次の複合体が生じ、幾何学的拘束を受ける。シグナル伝達においてラパマイシンを用いる２つの例は、レセプターチロシンキナーゼ活性化を開始させること、及びFas活性化を介したアポトーシスを開始させることであり、この２つは以下に説明される。特に説明がなければDNA操作は全て標準的方法により行われ(F.M.Ausubed et al．編、Current Protocols in Molucular Biology,John Wiley & Sons，New York,1994)、タンパク質プロトコルはすべて標準的操作(Harlow,E．and Lane,D.1988,Antibodies，a Laboratory Manual．Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)に従って行われた。構築物を作成するのに用いたPCR産物はすべて配列決定により確認された。Ａ．ラパマイシン−誘導性レセプタ−チロシンキナーゼ活性化１．ミリチル化シグナルを含む発現ベクターpCMの構築オリゴヌクレオチド１及び２をアニーリングして得られるXbaI-Myr-BamHIカセットをXbaI/BamHIで消化し、pCG発現ベクター(Tanaka,M．and Herr,W.1990，Cel l 60:375-386)のXbaI/BamHI部位にクローン化してpCGMを作成した（オリゴヌクレオチド配列については、以下の(7)参照）。このオリゴヌクレオチドカセットは枠内XbaI部位、その後のミリスチル化を可能にしタンパク質を原形質膜に標的化することが報告されてきた(Cross et al.,1984，MCB.4:1834-1842)c-Srcチロシンキナーゼの最初の15アミノ酸残基をコードする配列からなる。ミリストイル化ドメインの後は枠内SpeI部位と停止コドンが続く。pCGベクターのXbaI部位は、開始Met及びクローン化配列の間に２個のアミノ酸を付け加えるような位置に置かれる。開始Metとミリスチル化Gly間の距離はc-Srの膜局在化に重要である(P ellman et al．1985,PNAS．82:1623-1627)ので、pCGM中でATGに続くXbaI部位は製造業者のプロトコル(Muta-Gene，BoilRad)により部位特異的変異誘発により除かれた。後のクローニング工程を容易にするためミリスチル化カセット中のSpeI 部位をXbaI部位に変異させた。pCGMの一本鎖ウラシルDNAを調製し、オリゴヌクレオチド3(ATGの後のXbaIを除き、ATGの5'にEcoRI部位を加えるため)及びオリゴヌクレオチド４（ミリスチル化ドメインの後のSpeI部位をXbaI部位に変えるため）を用いて変異誘発を行った。pCMベクターのATGを囲む生成した配列はオリゴヌクレオチド５（下記(8)の配列１参照）を用いる配列により確認した。２．FKBP及びエピトープ・タグのpCMへの付加によりpCMF1/2/3.HAを作成相補性オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド６及び７）をアニーリングしてSpeI-HA-BamHIカセットを調製した。このカセットは枠内SpeI部位、続いて、モノクロール抗体12CA5により認識されるH.インフルエンザエのヘマグルチニン遺伝子の９アミノ酸、停止コドン及びBamHI部位を有する。SpeI-HA-BamHIカセットをpCGNNFI、pCGNNF2及びpCGNNF3のSpeI/BamHI部位にサブクローン化した。次いで、HAエピトープと融合した1/2/3コピーのFKBPをpCM中にXbaI/BamHI断片としてサブクローン化した。得られたプラスミド(pCMF1/2/3.HA)は次の特徴を有する：ミリスチル化ドメイン、枠内XbaI部位;1/2/3コピーのFKBP;枠内SpeI部位;HAエピトープ・タグ，停止コドン。3.FRB 及びエピトープ・タグのpCMへの付加によりpCMFR 1/2/3.Flagを作成 SpeI-Flag-BamHIカセットは相補性オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド８及び９）のアニーニングにより調製できる。このカセットは、枠内SpeI部位の次がモノクローナル抗体の抗−FLAG.M2(Kodak Scientific Imaging Systems)により認識される８アミノ酸(DYKDDDDY)(Hopp et al.，1988，Biotech.6:1205-121 0)をコードする配列であることを除いて、上記SpeI-HA-BamHIカセットと同じ特徴を有する。このSpeI-Flag-BamHIカセットをpCGNN-1FRB、pCGNN-2FRB及びpCGNN -3FRB中のSpeI/BamHI部位にサブクローン化する。次いで1/2/3コピーのFRBドメイン−Flagエピトープ融合物をXbaI/BamHI断片としてpCM中にサブクローン化する。得られプラスミド(pCMFR1/2/3.Flag)は次の特徴を有する;ミリストイル化ドメイン；枠内XbaI部位;1/2/3コピーのFRB;枠内SpeI部位;Flagエピトープ・タグ; 及び停止コドン。４．FKBP及びFRB構築物のレセプターチロシンキナーゼ細胞質ドメインへの融合選択したレセプターチロシンキナーゼの細胞質ドメイン（例えばEGFR、erbB-2 、PDGFR、KDR/F1k-1、Flt-1)を枠内5'XbaI及び3'SpeI部位でPCR増幅する。このP CR産物は、PCMFR群又はpCMF群のベクター（上記参照）において、XbaI部位を復帰させるように枠内XbaI部位へ、あるいはSpeI部位を復帰させるように枠内SpeI 部位へサブクローン化してもよい。その結果、FKBP/FRBドメインをレセプターチロシンキナーゼの細胞質ドメインのＣ末端又はNH₂末端に置くことができる。このベクターは、（ｉ）あるレセプターがFKBPとFRBの両方に融合する（例えばF KBP又はFRBに融合したEGFR細胞質ドメイン）か、（ii）２つの異なるレセプターの細胞質ドメインがFKBP及びFRBに融合する（例えばFKBPに融合したEGFR細胞質ドメイン及びFRBに融合したerbB-2細胞質ドメイン）ように構築される。前者では（ｉ）薬剤、ラパマイシンの添加がホモ二量体(例えばEGFR/EGFR)の形成を誘導し、一方後者では（ii）薬剤の添加がヘテロ二量体(例えばEGFR/erbB-2)を誘導し、これはシグナル伝達カスケードを活性化する。５．構築物の試験ラパマイシン又は類似体のFKBP-及びFRB-レセプター細胞質ドメイン融合物を二量体化する能力を試験するために、選択した構築物（例えばpCMEGFR-FR1及びp CMEGFR-F1）をリポフェクション(Gibco BRL)によりCos-1細胞中に共トランスフェクションする。トランスフェクションの３日後、細胞をラパマイシンで誘導し、溶菌緩衝液（１％TritonX-100;50mM Tris.cl pH8.0;150mM Nacl;5mM NaF;1mM オルトバナジウム酸ナトリウム;10ug/mlアプロチニン;10ug/mlロイペプチン）中で溶菌させる。ラパマイシン処理及び未処理細胞ライゼートからの融合タンパク質を抗Flag及び12CA5抗体で免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットする。細胞型の選択、移入されたDNA量;ラパマイシンの使用濃度及び薬剤処理の期間は最適の結果が得られるよう変化させる。６．ラパマイシン誘導性細胞増殖選ばれた哺乳動物細胞系（例えばNIH3T3）をFRB及びFKBP融合タンパク質をコードする構築物（例、pCMEGFR-FR1及びpCMEGFR-F1）で共トランスフェクションし、融合タンパク質を発現する安定細胞系を確立する。レセプター細胞質ドメインのラパマイシン誘導性活性化が細胞増殖を誘導するかどうかを測定するためには、融合タンパク質を発現する安定細胞系をラパマイシンの存在下又は不在下で増殖させ、細胞増殖の変化を通常の操作（例えば細胞数の監視、³Hチミジン取り込み速度の測定、その他により）により測定する。レセプターチロシンキナーゼの選択;レセプター活性化の型（ホモ二量体対ヘテロ二量体）は最適の結果が得られるように選べばよい。７．オリゴヌクレオチド配列８．配列１：修飾された配列は小文字の太字で示され、下線は開始ATGを示す。大文字で示す配列はもとのpCG骨格に由来する。Ｂ.Fasのドメインを含むキメラタンパク質をコードする構築物 Fas活性化を制御し、小分子を介してアポトーシスを開始させる能力は、遺伝子治療（遺伝子工学処理された細胞を選択的に除去するのに用いることができる）及び実験系の両方に応用される。本書に記載するタンパク質は低親和性NGFレセプター(p75とも称される)を介して膜に固定される。しかし、別のタンパク質固定を用いることができることも理解すべきである。p75はその細胞外ドメインに対する抗体を利用でき、任意の同定されたリガンド(Bothwell，M.1995，Annu ．Rev．Neurosci，18:223-253)との高親和性相互作用が欠けているため実験的に有用である。１．２−タンパク質ラパマイシン制御Fas活性化 (a) p75 ベクターの構築低親和性NGFレセプター(p75とも称する)の細胞外の貫膜ドメインを含むFRAP-F as融合タンパク質の発現を指令するベクターを、哺乳動物発現ベクターpJ7W(Mor genstern，J.P．and Land,H.1990,Nucleic Acids Res．18:1068)から誘導し、標準的方法を用いてもとのpBR骨格をpUC骨格で置き換えて修飾した。このベクターをpA7Wと呼ぶ。このプラスミドのポリリンカー部位にクローン化された挿入物をサルCMVプロモーター及びエンハンサー配列の制御下で転写する。ポリリンカーは、HindIII-SalI-XbaI-BamHI-SmaI-SstI-EcoRI-ClaI-KpnI-BglIIを有するCMV配列の後である。適宜クローニング部位及びプロモーターを有する任意の哺乳動物発現ベクターを代わりに用いてもよい。 HindIIIおよびXbaI部位に隣接するp75の断片をコードする制御酵素断片を、p7 5の配列(Johnson,D.，Lanahan，A.，Buck,C.R.，Shegal,A.，Morgen,C.，Mercer ,E.，Bothwell,M.，Chao,M．1986，Cell 47:545-554)に基づく、プライマーJ1(5 ')およびJ2(3')を用いたPCRにより作成した。PCR鋳型の供給源はJ1及びJ2に似ているが異なる制限酵素部位を有するプライマーを用いてヒト脳ライブラリーから誘導したクローンであった。得られた断片の5'末端はHindIII部位、次いでEcoRI部位、Kozak配列及びp75コード配列の開始（アミノ酸１）を含む。得られた3'末端はアミノ酸274まで（これも含む）のレセプター配列、予想された膜にわたる配列の２アミノ酸過ぎ、次いでXbaI部位をコードする。他の貫膜レセプターの類似部分をこの断片の代わりに用いてもよい。PCR産物をHindIII-XbaI切断pA7W中にHindIII-XbaI断片としてサブクローン化して、pA7Wp75を作成した。構築物は制限酵素分析及びDNA配列決定により確認した。(b) pA7Wp75 へのFasの付加 Fasアミノ酸206-304(Fas_S)およびFasアミノ酸206-319(Fas₁)をコードするXbaI -SpeI断片をPCRにより作成し、同じ酵素で切断したpA7Wp75へサブクローン化した。用いたプライマーはJ3(5')とJ4又はJ5(3')であった。J5はその停止コドンを超えて終わるFasの断片を生じ、SpeLで切断されるとFasの末端15アミノ酸をコードするヌクレオチドが除去されて細胞内Fasの切りつめた形（我々はFas_Sと呼ぶ）が生じる。これらの15アミノ酸の除去によりある細胞型ではFasの活性が増加する(Itoh,N.,and Nagata,S．1993，J.Biol．Chem.268:10932)。プライマーJ4は Fasの天然の停止コドンをSpeI部位に代え、またFasに含まれるもとのSpeI部位を変異させてFas_Lを生じる。これらの断片をサブクローン化して得られるプラスミドはそれぞれpA7Wp75-Fas_SおよびpA7Wp75-Fas_Lである。これらの構築物は制限酵素分析およびDNA配列決定により確認された。これらの挿入物へエピトープ・タグを加えるために、XbaI-SpeI Fas断片を分離し、pCMF 1/2/3.HA（SpeI部位、次いでBamHI部位の3'の、H.インフルエンザのヘマグルチニンタンパク質(E)からの９アミノ酸のエピトープ・タグをコードする上記プラスミド）のXbaI-SpeI切断骨格中に連結した。得られたプラスミドをXbaIおよびBamHIで切断するとFas、次いでエピトープ・タグ（これらの構築物ではＥと呼ぶ）をコードする断片を生じた。(c) p75-FRAP-Fas- エピトープ融合タンパク質：pA7Wp75-Fas_SE及びpA7Wp75-Fas_L EへのFRAP含有断片付加によるp75-FRAPx-Fas_S or _LE及びp75-Fas_S or _L-FRAPxE の作成 FRAPの一部を含むXbaI-SpeI断片は本書で既に説明している。これらのXbaI-Sp eI断片をp75コード配列のすぐ後のXbaI部位へ挿入してp75-FRAPx-Fas _S or _LEを作成するか、Fas断片のすぐ後のSpeI部位に挿入してp75-Fas_S or _L-FRAPxEを作成した。あるいは、２以上のFRAP断片を、FRAPn断片としてあるは第１のFRAPをX baI又はSpeIにサブクローン化した後に利用できるSpeI部位にXbaI-SpeI断片を連続サブクローン化することによりサブクローン化する。このように最終群のベクターは（ＮからＣ末端までの）p75の細胞外貫膜配列、１又は２以上のF RAP由来ドメインが１又は２以上のFas細胞内ドメインにＮ又はＣ末端で融合しているもの、およびエピトープ・タグをコードする。(d) p75-FKBP-Fas 融合タンパク質：pA7Wp75-Fas_SE及びpA7Wp75-Fas_LEへのFKBP含有断片の付加によるp75-FKBPn-Fas _S or _L又はp75-Fas_S or _L-FKBPnの作成１又は２以上のFKBPを含有するXbaI-SpeI断片は本書の他の箇所で説明した。これらの断片をp75コード配列のすぐ後のXbaI部位に挿入してp75-FKBPn-Fas_S or _Lを得るか、Fas断片のすぐ後のSpeI部位に挿入してp75-Fas_S or _L-FKBPnを得る。このように最終群のベクターは、（ＮからＣ末端までの）p75の細胞外貫膜配列、１又は２以上のFKBPが１又は２以上のFas細胞内ドメインへＮ又はＣ末端で融合したもの、及びエピトープ・タグをコードする。(e) ラパマイシン媒介Fas活性化の測定 Fas及びFRAPドメインを含むタンパク質並びにFas及びFKBPドメインを含むタンパク質のFasを活性化し、ラパマイシン添加により細胞死を引き起こす発現能力は一時的又は安定的にトランスフェクションされた細胞のいずれでも試験することができる。一時的トランスフェクションには、試験する２つのプラスミドをHT1080等の細胞系へ、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降又はエレクトロポレーション等の標準的方法で共トランスフェクションする。トランスフェノールの１日または２日以上後に細胞を、ラパマイシン無添加、１又は２以上の濃度のラパマイシン、又は１又は２以上の濃度のFK1012等の二量体化剤で処理する。FK1012はFKBP -Fas構築物が機能していることの正の対照として作用する。数時間から１日後細胞をいくつかの方法のうちの１つで応答を監視する。細胞ライゼートを慣用の方法で調製し、HA又はp75の細胞外ドメインに対する抗体でつり上げられるウエスタンブロットを作成するのに用いた。あるいは細胞を等張溶液＋10mMEDTA中に集めて分析し、抗p75モノクローナル抗体および標識二次抗体で染色し、陽性の細胞をFACSにより測定することもできる。ウエスタンブロットシグナル又は処理後のFACSシグナルの減少は細胞死をうまく誘導できたこと（あるいはタンパク質発現の減少）を示す。さらに、市販のキットを用いてアポトーシスを監視することもできる。細胞を安定にトランスフェクションするには、ネオマイシン耐性のような選択可能なマーカーをコードするベクターを上記プラスミドと共に共トランスフェクションする。トランスフェクションの２〜３日後、細胞をG418に入れ、耐性の集団即ちクローンを標準的方法で分離する。次いで、これらの集団を二量体化剤での処理、次いで細胞数の計測又は細胞生存能の他の測定法によりアポトーシスの誘導を直接監視することができる。対象の構築物を発現する安定な細胞系を作成する別の手段は、レトロウイルスベクター中に挿入物をサブクローン化することである。この挿入物はEcoRIで切り出し可能であり、このサブクローニングが容易になる。次いでこのベクターを用いて慣用の方法を用いてパッケージング細胞による形質導入用上清を製造する。２．単純タンパク質ラパマイシン制御Fas活性化 (a) Fas細胞内ドメインのラパマイシン依存性ホモ二量体化のためのFKBP-FRAPキメラ断片FKBP-FRAP融合構築物の構築ｉ．構造による設計ラパマイシン依存性ホモ二量体化が可能なFRAP及びFKBPドメインを含む分子を設計するためには、ヒトFKBP12、ラパマイシン及び最少FRBドメインを含むヒトF RAPの一部の間の三成分複合体の三次元構造を考えればよい。FRAP、FKBP及びFas 部分を含む融合タンパク質の２つの分子のホモ二量体化の要件には（ｉ）凝集したFasがシグナルを伝達する能力を維持しながら、FRAP-FKBP相互作用が膜に固定された分子間に生じるのに必要な歪に適合するのに十分なポリペプチドの長さ及び可変性、及び（ii）ラパマイシンによる分子内二量体化の防止又は最小化、キレート効果によりエントロピー的に非常に好ましく、従って望ましい分子間の分子二量体化を妨害すると予想される事象。構造を考慮することにより融合構築物に対する以下の設計が好ましいと考えられる。（ｉ）FRBとFKBPは、分子内二量体化が立体的に妨害されるのに十分短いポリペプチドリンカーで結合されるのがよい。一般に好ましい配置形態は、FRAPのＣ末端とFKBPのＮ末端が離れており、分子内二量体化を妨害するが可変性は有する長いリンカー(10以上のアミノ酸)を可能にする、FRAP-FKBPである。（ii）このFRAP-FKBP「カセット」が膜近くに（即ちＣ末端にFasドメインが付加されている）、あるいは膜から離れて(Fasドメインが膜近くであり、FRAP-FKBP カセットがＣ末端に付加されている)存在しうる。（iii）長いリンカーがFRAP-FKBPドメインのＮ末端に存在して、膜での二量体化に関与する構造の歪みを可能にするか、あるいはこのドメインがＣ末端に付加される場合。またFRAPがN-末端に存在するのは、この長いリンカーがFRBドメインに対してＮ末端の領域からの天然FRAP配列からなり、キメラタンパク質の免疫原性を最小にするので好ましい。（iv）あるタンパク質に対する最適のリンカー長さと融合位置は経験的に確認されるべきである。一連のFKBPとFRAPの12の融合物（T1〜T12称する）を設計した。９つはArg2018 (Ｎ末端リンカー)に対してＮ末端の13、23又は33アミノ酸、２つのタンパク質を分けている４、７又は10残基を含むN-FRAP-FKBP-C融合物であった。残りの３つはFKBP Glu107とFRAP Arg1028間のFRAP配列の３、０又は−４残基に介在するN-F RAP-FKBP-C融合物であった。（ii）構築 12個の融合物をXbaI-BamHIカセットとして作成し、これは3-プライマーPCRスプライシング法(You,J．and Fried,M．1989，Nucleic Acids Res.17,4895)を用いて単一断片として直接クローン化できた。この方法でクローン化すると、外来の配列をコードしリンカーの長さを変えるであろう遺伝子間への制限酵素部位の導入が避けられた。pCGNN-1FRAPiとpCANTAB-AP-FKBP各１ngの混合物を、所望の融合を行わせる両遺伝子に相補性の単一の「スプライス」オリゴ(B)0.01μMの存在下で、２っの外側のプライマー(A及びC)各１μMを用いPfuポリメラーゼにより増幅させた。用いたプライマーは以下に示す。 * は5'XbaI部位によりコードされるArgとFRAP Arg2018（融合物T1-T9に対して）との間のアミノ酸の数を示す。＋はFRAP Ser2112とFKBP Gly1との間（融合物T1-T9に対して）、あるいはFKBP Glu107とFRAP Arg2018との間(融合物T10〜T12)のアミノ酸数を示す。 PCR産物を精製し、XbaIとBamHIで消化し、XbaI-BamHI消化pCMに連結した。構築物は制限酵素分析とDNA配列決定により確認した。プライマー配列下線は制限酵素部位(XbaI=TCTAGA、SpeI=ACGAGT、BamHI=GGATCC) 代表的構築物の配列：融合物T6 (b) FRAP-FKBPキメラ挿入物のpA7Wp75-Fas _S EおよびpA7Wp75-Fas _L Eへの付加 T1からT12をXbaIで線状化したpA7Wp75-Fas _S EおよびpA7Wp75-Fas _L E中へXba I-SpeI断片としてサブクローン化すると、p75TFas _S Eまたはp75TFas _L Eが得られる。SpeIで線状化したpA7Wp75-Fas _L Eにサブクローン化するとp75Fas _S T-E またはpFas _L T-Eが得られる。これらの構築物を表１に示す(下記の(d))。 (c) 別のFRAP-Fas-FKBP構築物キメラ断片T1-T12配列の代わりに、一本鎖の方法では最適の活性にはドメインの異なる方向付けが必要となろう。この方法では、FRAPおよびFRBがFas断片で分離されている別の一連の構築物が得られた。これらの構築物の出発点はpCMF1HA 、pCMF2HAおよびpCMF3HAである。キメラ転写因子の構築のための上記方法と同様に、FRAPおよびFRB断片（本書の他の部分で説明）をBamHI部位の直ぐ上流にSpeI を含有するXbaI-BamHI断片としてpCM骨格中にクローン化した。XbaIおよびSpeI は適合末端を生ずるので、これによりさらにXbaI-BamHI断片を最初の挿入物の下流に挿入することが可能となった。さらに、XbaI-SpeI断片のクローン化により構築物の5'末端にこの断片が付加される。表１(下記の(d))に示すXbaI-SpeI断片をpA7Wp75-Fas _S Ｅ中にサブクローン化することによりp75固定最終構築物を作成した。pA7Wp75-Fas _L Eにサブクローン化することにより同様の構築物が作成される。XbaIで切断されたベクター中に挿入すると、p75断片の3'に挿入物が付加される。SpeIで切断されたこのベクター中に挿入すると、Fas断片の3'に挿入物が付加される。XbaIおよびSpeIで切断されたこのベクター中に挿入すると、p7 5断片の3'に挿入物が付加され、ベクター中にもともとあったFas断片が削除されることになる。これらの３つのサブクローン化方法を用いることにより、以下の一連の構築物を作成した。下付数字はドメインの反復数を示す。 (d) 表１コード：N＝p75NGFレセプターaa 1-274 Fas _S＝Fas aa 206-304 Fas _L＝Fas aa 206-319 K＝FKBP aa 2-108 R＝FRAP 2012-2113、但し他の境界に置換可 E＝pCMF1/2/3.HAにおいて記載した、HAエピトープ、次いで停止コドン(e) 使用断片の末端（FKBPおよびFRB断片は本書の他の箇所で説明） i.p75細胞外貫膜断片 5'末端3'末端 ii．Fasの細胞内ドメイン： 5'末端 Fas _L構築物の3'末端 Fas _S構築物の3'末端 (f) 使用オリゴ類タンパク質を膜に固定するのにミリストイル化配列を用いる構築物には、pCM （本書の他の箇所で説明）を使用し、挿入物をミリストイル化シグナル配列の3' にXbaI-BamHIまたはXbaI-SpeI断片としてクローン化した。(g) 安定的にトランスフェクションされた培養状態のヒトHT1080細胞のラパマイシン調節アポトーシス構築物A30およびA31（ｄ、表１）からのXbaI-BamHI断片をpCMにクローン化してM30およびM31を得た。これはMT5Fas _SEおよびMT6Fas _SEの発現を指令し、ここでMはミリストイル化ドメイン（この実施例のA.1.およびA.8.参照）を意味し、他の略語はd、表１に記載の通りである。これらの発現カセットを含むEcoRI-Bam HI断片を次いでレトロウイルスベクターpSMTN3（実施例１）中に挿入した。この DNAを含有するヘルパー−フリーのレトロウイルスを、この構築物およびPsi(-) 両種性パッケージングベクターを用いて293T細胞(Pear,W.S.et al.,1993，Proc. Natl.Acad.Sci．USA，90，8392-8396)の一時的共トランスフェクションにより作成した。HT1080細胞をウイルスのストックで感染させ、G418で選択した。安定的にトランスフェクションされた細胞集団のラパマイシンに応答したアポトーシスを分析するために、細胞を96-ウェル培養プレートに10000細胞／ウェルで培養した。一晩培養した後、50ｎｇ/ml(最終)のアクチノマイシンDと共に連続希釈ラパマイシンを添加し、培養を37℃、5％CO₂で約20時間続けた。培地を除去し、10％アラマーブルー(alamar blue)染料含有培地100μlで置き換えた。プレートを前と同様にして培養し、細胞の生存度をマイクロタイター・プレート・リーダーにおける570nmおよび600nmのODの分光光度定量により周期的に分析した。典型的には対照（未処理）ウェルがブランクを引いた後にOD0.2-0.4となるまで読み取りを続けた。図13は、(a)M30および(b)M31発現構築物で安定的にトランスフェクションされた細胞の生存がラパマイシンの存在下では用量応答的に効果的に低下することを示す。図13(c)から明らかなように、細胞死の程度は、合成FKBPホモ二量体化剤のAP1428で処理されたミリストイル化(FKBP×2)-Fas構築物（PCT/US94/08008に開示）を発現する細胞の場合と同等である。 AP1428はPCT/US94/10559に開示の化合物49である。ただしラパマイシンは混合キメラタンパク質を発現しない細胞の生存には最小の影響を示す(図13(c))。実施例９：ラパマイシン依存性DNA結合 DNA結合のレベルで転写因子機能を調節する能力は、治療用遺伝子発現の小分子制御への別の方法である。DNA結合についてラパマイシン依存性である転写因子の作成への一つの方法は、多くの転写因子が二量体としてその同族配列に結合するという事実を利用することである。かかる転写因子のDNA結合性ドメインは、DNAとの直接接触に関与する領域と二量体形成の媒介に関与する領域に副次分割されうることが多い。従って、天然の転写因子二量体化ドメインに代えFKBPまたはFRAPを用いることにより、キメラ転写因子はラパマイシン依存性DNA結合を示すはずである。任意のヒト二量体転写因子がこの方法によることができる。HNF-1、SRFまたはその他のMADS box含有タンパク質、MyoD、myogeninなどのヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子群の任意の因子、FOS,JUN,ATF,CREBなどのbZIP転写因子群の任意の因子が例示される。内生転写因子による治療用遺伝子の望ましくない活性化を避けるために、キメラ転写因子のDNA結合特異性を「もとの」タンパク質のものとは異なるように操作することができる。これは、ラパマイシン媒介キメラタンパク質二量体は結合しうるが天然のもとの二量体は結合できないようにパリンドローム標的DNA配列の半分の部位の位置を変えることにより行うことができる。in vitro ラパマイシン依存性DNA結合が細菌のレセプタータンパク質LexAの誘導体を用いて立証された LexAはその標的オペレーターに二量体として結合し、直接DNAと相互作用するアミノ末端ドメインと二量体化を媒介するカルボキシ末端ドメインとからなる。 LexA二量体化ドメインをFKBPまたはFRAPに代えたキメラタンパク質を作成した。図14は、Lex結合性部位含有DNAと共にインキュベーションしたおよそ等量のLex- FKBPとLex-FRAPタンパク質を含有する結合反応液のゲル移動度シフト分析を示す。ラパマイシンの不在下では特異的結合は検出されない（図14、レーン１）。結合反応にラパマイシンの増加量を含むと移動度シフトゲルに特異的複合体が同時に出現する（図14、レーン２〜４）。これらの結果は、ラパマイシンが、LexA標的配列を含むDNAに結合しうるLex-FKBP/Lex-FRAPヘテロ二量体の形成を促進するという結論を支持する。図14 Lex-FKBP/Lex-FRAPヘテロ二量体によるラパマイシン依存性DNA結合 Lex-FKBPおよびLex-FRAPタンパク質をin vitroで翻訳し、放射標識LexConオリゴヌクレオチドとの結合反応液に一緒に混合した。ラパマイシンは示された濃度（レーン１〜４）で結合反応液に含まれていた。矢印はラパマイシン依存性タンパク質-DNA複合体の位置を示す。 LexConプローブの配列を以下に示し、下線はLexA結合部位を示す：プラスミド構築物プラスミドp19BL87、p19BL87G6FKBPおよびp19BL87FRBを、すべての発現タンパク質がアミノ末端His・タグ、次いでヘマグルチニンエピトープ・タグを含むように修飾されたpET-19BHA、pET-19Bに基づくベクター中に作成した。 p19BL87はLexA DNA結合性ドメイン(aa 1-87)をコードする。LexAコード配列をプライマーLexAXbaおよびLexA87 Spe/Bamを用いてpCGNNLex202からPCRにより増幅した。PCR産物をXbaIおよびBamHIで消化し、p19BHAのXbaIおよびBamHI 部位の間に連結した。 p19BL87G6FKBPは６個のグリシンの可変性リンカーを介して枠内でFKBP(aa2-10 8)に融合しているLexA(aa 1-87)をコードする。FKBPコード配列をプライマー5'X G6FKBPおよびFKBP3'Spe/Bamを用いてpCGNNF1からPCRにより増幅した。pCGNNZFHD 1-FKBP3×3(ATCC受託番号97399)をFKBPコードDNAの供給源として用いてもよいUS SN 08/581,713（1995年12月29日出願）参照。PCR産物をXbaIおよびBamHIで消化し、p19BL87のSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。 p19BL87FRBは枠内でFRAP(aa 2025-2113)に融合しているLexA(aa 1-87)をコードする。FRAPコード配列をpCGNN-GAL4-1FRBからXbaI-BamHI断片として分離して、p19BL87のSpeIおよびBamHI部位の間に連結した。PCR プライマー結合反応液 p19BL87G6FKBPおよびp19BL87FRBプラスミドを製造業者の指示に従ってTNT結合網状赤血球ライゼート系(Promega)を用いin vitroで翻訳した。結合反応液は全量20ml中に15mlの結合緩衝液(10mMトリスpH7.5、1mMDDT、0.1m M EDTA、10％v/vグリセロール、５mM MgCl₂、60mM NaCl)、50mg/ml子ウシ血清アルブミン(NEB)、200ng Poly(dIdC)-Poly(dIdC)（Pharmacia）、L87G6FKBPおよび L87FRBがプログラムされた網状赤血球ライゼート各１ml、およびg-³²P-dATP標識 LexConプローブ0.2ngを含んでいた。ラパマイシンを適宜濃度で添加し、反応液を室温で30分間インキュベーションした。ゲル移動度シフト分析複合体を0.5×TBE緩衝液中の４％の40：1架橋ポリアクリルアミドゲル上で10- 15V/cmで２時間分解した。ゲルを乾燥し、はずし、3MMペーパーに乗せ８時間オートラジオグラフィーにかけた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ギルマン，マイケル・ゼットアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02168、ニュートン、チェストナット・ストリート555

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも２つの組み換えDNAを含有する動物細胞であり、第１の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはその類似体に結合することができ、少なくとも１つのラパマイシン結合性ドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのタンパク質ドメインを含有する第１のキメラタンパク質をコードし、ここでラパマイシン結合性ドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (i)天然FKBPまたはその一部、 (ii)天然FKBPの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (iii)（i）または（ii）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFKBP; 第２の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはラパマイシン類似体および第１のキメラタンパク質と複合体を形成することができ、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含有する第２のキメラタンパク質をコードし、ここでFRBドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (iv)天然のFRBドメイン、 (v)天然FRBの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (vi)（iv）または(v)のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFRB ドメイン。２．第１のキメラタンパク質が、ヒトFKBP12のペプチド配列、該配列の５個までのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む変異体、またはヒトFKBP12をコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるペプチド配列から選ばれたペプチド配列を含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。３．第１のキメラタンパク質が、ヒトFKBP12のTyr26、Phe36、Asp37、Arg42、Ph e46、Phe48、Glu54、Val55およびPhe99に相当する１または２以上のアミノ酸残基が削除あるいは代替アミノ酸で置換されているFKBPドメインを含む請求の範囲第２項記載の動物細胞。４．第２のキメラタンパク質が、次のペプチド配列：ヒトもしくはネズミFRAPの Glu-2025からLys2113、Tor1（S.セレビシアエ）のGlu-1962からArg-2050、Tor1 （S.セレビシアエ）のGlu-1962からArg-2050のペプチド配列、Tor2（S.セレビシアエ）のGlu-1965からLys-2053、これらの配列のいずれかの、10個までのアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を含む変異体、およびこれらのペプチド配列のいずれかをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるペプチド配列より選ばれたペプチド配列を含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。５．第２のキメラタンパク質が、ヒトFRAPのTyr2038、Phe2039、Thr2098、Gln20 99、Trp2101およびAsp2102に相当する１または２以上のアミノ酸残基が削除あるいは代替アミノ酸で置換されているFRBドメインを含む請求の範囲第４項記載の動物細胞。６．少なくとも１つのキメラタンパク質が膜局在化ドメインを含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。７．少なくとも１つのキメラタンパク質がヒト起源のペプチド配列を含む異種ドメインを含有する請求の範囲第１項記載の動物細胞。８．第１のキメラタンパク質が２またはそれ以上のFKBPドメインを含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。９．第２のキメラタンパク質が２またはそれ以上のFRBドメインを含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。 10．一方のキメラタンパク質が少なくとも１つのDNA結合性ドメインを含み、他方のキメラタンパク質が少なくとも１つの転写活性化ドメインを含み、前記細胞が、DNA結合性ドメインが結合しうるDNA配列に操作可能に連結されている標的遺伝子をさらに含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。 11．少なくとも１つのキメラタンパク質が、多量体化により細胞の成長、分化、増殖、アポトーシスもしくは遺伝子発現を生じる細胞内シグナルを開始することができる異種ドメインからなる異種ドメインを含む請求の範囲第１項記載の動物細胞。 12．異種ドメインがFASもしくはTNF-R1の細胞内ドメインまたはその断片から誘導されたペプチド配列を含む請求の範囲第11項記載の動物細胞。 13．２つのキメラタンパク質がそれぞれ１または２以上の共通異種ドメインを含有する請求の範囲第１項記載の動物細胞。 14．２つのキメラタンパク質がそれぞれ、多量体化により細胞の成長、分化、増殖、アポトーシスもしくは遺伝子発現を生じる細胞内シグナルを開始することができるドメインを含む請求の範囲第13項記載の動物細胞。 15．２つのキメラタンパク質が同じであり、多量体化により細胞内シグナルを開始する請求の範囲第11項ないし14項のいずれかに記載の動物細胞。 16．ヒト起源のものである請求の範囲第１項ないし15項のいずれかに記載の動物細胞。 17．生体適合性材料内にカプセル化した請求の範囲第１項ないし16項のいずれかに記載の動物細胞。 18．請求の範囲第１項ないし17項のいずれかに記載の動物細胞を含有するヒト以外の動物。 19．細胞によるDNA取り込みが可能な条件下で、キメラタンパク質をコードする１または２以上のDNA分子を宿主動物細胞に導入することを含む、請求の範囲第１項ないし18項のいずれかに記載の動物細胞を製造する方法。 20．キメラタンパク質の会合に応答して標的遺伝子転写を可能にするDNA配列に連結した標的遺伝子をコードするDNA分子を、細胞内に導入することをさらに含む請求の範囲第19項記載の方法。 21．動物に、該動物の１または２以上の細胞によるDNA取り込みが可能な条件下で、キメラタンパク質をコードする１または２以上のDNA分子を導入することを含む、請求の範囲第１項ないし16項のいずれかに記載の動物細胞を製造する方法。 22．動物に、請求の範囲第１項ないし17項のいずれかに記載の細胞を導入することを含む、請求の範囲第１項ないし17項のいずれかに記載の細胞を含む動物を製造する方法。 23．細胞を、キメラタンパク質との複合体の形成を可能にする条件下でラパマイシンもしくは適当なラパマイシン類似体の有効量と接触させることを含む、請求の範囲第１項ないし17項のいずれかに記載の細胞中でキメラタンパク質を多量体化する方法。 24．細胞を、ラパマイシン以外の下記式を有する化合物と接触させる請求の範囲第23項記載の方法：上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-SR¹， -OC(O)R¹もしくは-OC(O)NHR¹， -NHR¹，-NHC(O)R¹，-NH-SO₂-R¹または -R²であり、ここでR²＝置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリールＶは-OR³または（=O）でありＷは=O，=NR⁴，=NOR⁴もしくは=NNHR⁴， -NHOR⁴もしくは-NHNHR⁴， -OR⁴， -OC(O)R⁴もしくは-OC(O)NR⁴，または-HでありＹは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵でありＺは=O，-OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり R³はH，-R⁷，-C(O)R⁷もしくは-C(O)NHR⁷，またはC-28／C-30環式カーボネートであり R⁴はＨまたはアルキルであり、ここでR¹，R⁴，R⁵，R⁶およびR⁷は、Ｈ、アルキル、アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれる。 25．細胞を、遺伝子発現させるのに有効な量でキメラタンパク質との複合体形成が可能なラパマイシンもしくはラパマイシン類似体と接触させることを含む、キメラタンパク質の二量体化に応答性の標的遺伝子構築物を含む請求の範囲第10、 11または14項記載の細胞中で標的遺伝子の転写を活性化する方法。 26．細胞を、ラパマイシン以外の下記式を有する化合物と接触させる請求の範囲第25項記載の方法：上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-SR¹， -OC(O)R¹もしくは-OC(O)NHR¹， -NHR¹，-NHC(O)R¹，-NH-SO₂-R¹または -R²であり、ここでR²＝置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリールＶは-OR³または(=O)でありＷは=O，=NR⁴，=NOR⁴もしくは=NNHR⁴， -NHOR⁴もしくは-NHNHR⁴， -OR⁴， -OC(O)R⁴もしくは-OC(O)NR⁴，または-HでありＹは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵でありＺは=O，-OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり R³はH，-R⁷，-C(O)R⁷もしくは-C(O)NHR⁷，またはC-28／C-30環式カーボネートであり R⁴はＨまたはアルキルであり、ここでR¹，R⁴，R⁵，R⁶およびR⁷は、Ｈ、アルキル、アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれる。 27．細胞を、キメラタンパク質との複合体形成が可能なラパマイシンもしくはラパマイシン類似体と、該複合体を形成させるのに有効な量で接触させることを含む、請求の範囲第11ないし14項のいずれかに記載の細胞中でシグナル伝達経路を発動させる方法。 28．細胞を、ラパマイシン以外の下記式を有する化合物と接触させる請求の範囲第27項記載の方法：上記式中、Ｕは-H，-OR¹，-SR¹， -OC(O)R¹もしくは-OC(O)NHR¹， -NHR¹，-NHC(O)R¹，-NH-SO₂-R¹または -R²であり、ここでR²＝置換アリールもしくはアリルもしくはアルキルアリールＶは-OR³または（=O）でありＷは=O，=NR⁴，=NOR⁴もしくは=NNHR⁴， -NHOR⁴もしくは-NHNHR⁴， -OR⁴， -OC(O)R⁴もしくは-OC(O)NR⁴，または-HでありＹは-OR⁵，-OC(O)R⁵または-OC(O)NHR⁵でありＺは=O，-OR⁶，-NR^6,-H，-NC(O)R⁶，-OC(O)R⁶または-OC(O)NR⁶であり R³はH，-R⁷，-C(O)R⁷もしくは-C(O)NHR⁷，またはC-28／C-30環式カーボネートであり R⁴はＨまたはアルキルであり、ここでR¹，R⁴，R⁵，R⁶およびR⁷は、Ｈ、アルキル、アルキルアリールおよびアリールから別個に選ばれる。 29．細胞を、キメラタンパク質との複合体形成が可能なラパマイシンもしくはラパマイシン類似体と該複合体を形成させるのに有効な量で接触させることを含む、多量体化によりアポトーシスを始動させうる異種ドメインを含む少なくとも１つのキメラタンパク質を含有する請求の範囲第11、12、14、または15項のいずれかに記載の細胞中で細胞死を発動させる方法。 30．細胞を倍地中で増殖させ、接触を倍地にラパマイシンまたはラパマイシン類似体を添加することにより行う請求の範囲第23項ないし29項のいずれかに記載の方法。 31．細胞が宿主生体内に存在し、接触を宿主生体内にラパマイシンまたはラパマイシン類似体を投与することにより行う請求の範囲第23項ないし29項のいずれかに記載の方法。 32．宿主生体が哺乳動物であり、ラパマイシン型化合物が経口、バッカル、舌下、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、関節内または吸入投与によりその適宜医薬用または獣医薬用ビヒクル中で投与される請求の範囲第31項記載の方法。 33．少なくとも２つの組み換えDNAを動物細胞中に導入することを含む、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体に応答性の動物細胞を提供する方法であり、第１の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはその類似体に結合することができ、少なくとも１つのラパマイシン結合性ドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのタンパク質ドメインを含有する第１のキメラタンパク質をコードし、ここでラパマイシン結合性ドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (i)天然FKBPまたはその一部、 (ii)天然FKBPの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (iii)（i）または（ii）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFKBP; 第２の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはラパマイシン類似体および第１のキメラタンパク質と複合体を形成することができ、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含有する第２のキメラタンパク質をコードし、ここでFRBドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (iv)天然のFRB ドメイン、 (v)天然FRBの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (vi)（iv）または(v)のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFRB ドメイン。 34．少なくとも２つの組み換えDNAを、宿主動物の１または２以上の細胞のトランスフェクションを可能にする条件下で宿主哺乳動物に導入することを含む、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体に応答性の哺乳動物を提供する方法であり、第１の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはその類似体に結合することができ、少なくとも１つのラパマイシン結合性ドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのタンパク質ドメインを含有する第１のキメラタンパク質をコードし、ここでラパマイシン結合性ドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (i)天然FKBPまたはその一部、 (ii)天然FKBPの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (iii)（i）または（ii）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFKBP; 第２の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはラパマイシン類似体および第１のキメラタンパク質と複合体を形成することができ、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含有する第２のキメラタンパク質をコードし、ここでFRBドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (iv)天然のFRBドメイン、 (v)天然FRBの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (vi)（iv）または(v)のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFRBドメイン。 35．少なくとも２つの組み換えDNA含有する細胞を、宿主哺乳動物に導入することを含む、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体に応答性の哺乳動物を提供する方法であり、第１の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはその類似体に結合することかでき、少なくとも１つのラパマイシン結合性ドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのタンパク質ドメインを含有する第１のキメラタンパク質をコードし、ここでラパマイシン結合性ドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (i)天然FKBPまたはその一部、 (ii)天然FKBPの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (iii)（i）または（ii）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFKBP; 第２の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはラパマイシン類似体および第１のキメラタンパク質と複合体を形成することができ、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含有する第２のキメラタンパク質をコードし、ここでFRBドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (iv)天然のFRBドメイン、 (v)天然FRBの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (vi)（iv）または(v)のFRBをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFRBドメイン。 36．少なくとも２つの組み換えＤＮＡを含有するキットであり、第１の組み換えＤＮＡは、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体に結合可能であり、少なくとも１つのラパマイシン結合性ドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのタンパク質ドメインを含有する第１のタンパク質をコードし、ここでラパマイシン結合性ドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (i)天然FKBPまたはその一部、 (ii)天然FKBPの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (iii)（ｉ)または（ii）のFKBPをコードするDNA配列と選択的にハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFKBP; 第２の組み換えDNAは、ラパマイシンもしくはラパマイシン類似体および第１のキメラタンパク質と複合体を形成することができ、少なくとも１つのFRBドメインおよびそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含有する第２のキメラタンパク質をコードし、ここでFRBドメインは下記から選ばれたペプチド配列を含み： (iv)天然のFRBドメイン、 (v)天然FRBの、10個までのアミノ酸残基が欠失、挿入もしくは代替アミノ酸で置換された変異体、 (vi)（iv）または(v)のFRBをコードするDNA配列に選択的とハイブリッド形成しうるDNA配列によりコードされるFRBドメイン。 37．キメラタンパク質と複合体を形成しうるラパマイシンまたはラパマイシン類似体をさらに含む請求の範囲第36項記載のキット。 38．多量体化拮抗剤をさらに含有する請求の範囲第36項記載のキット。 39．キメラタンパク質およびラパマイシンもしくはラパマイシン類似体により形成される複合体に応答性の転写制御要素に連結した標的遺伝子を含む、少なくとも１つの標的遺伝子構築物をさらに含有する請求の範囲第36項記載のキット。 40．１または２以上のDNA構築物が異種ドメインの代わりにクローン化部位を含む請求の範囲第36項記載のキット。 41．標的遺伝子構築物が標的遺伝子の代わりにクローン化部位を含む請求の範囲第39項記載のキット。 42．１または２以上のFRBドメインおよびFasのペプチド配列から選ばれたペプチド配列を含む１または２以上のドメインを含有する融合タンパク質をコードする組み換えDNA構築物。 43．２または３以上のFRBドメインとそれに対して異種の少なくとも１つのドメインを含む融合タンパク質をコードする組み換えDNA構築物。 44．１または２以上のFRBドメインおよび細胞局在化ドメインを含む融合タンパク質をコードする組み換えDNA構築物。 45．FKBPドメイン含有タンパク質と共に、ラパマイシンよりも優位にラパマイシン類似体と三成分複合体を形成する１または２以上のFRBドメイン含有する融合タンパク質をコードする組み換えDNA構築物。