JP2002514410A

JP2002514410A - ヒト脱アデニル化ヌクレアーゼ、その調製と使用

Info

Publication number: JP2002514410A
Application number: JP2000548439A
Authority: JP
Inventors: ヒュルス，クリストフ; ガレルト，カルル−クリスティアン; ケルナー，クリストフ; ヴァール，エルマー
Original assignee: アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2002-05-21
Also published as: HUP0101805A2; WO1999058647A3; DE19822122A1; CA2328492A1; AU758898B2; PL345310A1; KR20010043415A; EP1084234A2; WO1999058647A2; AU4258399A; NZ507993A

Abstract

(57)【要約】本発明は、配列番号１１に示されるようなアミノ酸配列を有するヒト脱アデニル化ヌクレアーゼ（ＤＡＮ）をコードする核酸またはその機能する変異体、および少なくとも８ヌクレオチドを有するその一部分に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はヒト脱アデニル化ヌクレアーゼ（ｈｕｍａｎｄｅａｄｅｎｙｌａｔ
ｉｎｇｎｕｃｌｅａｓｅ：ＤＡＮ）、そのコード核酸（ｃｏｄｉｎｇｎｕｃ
ｌｅｉｃａｃｉｄ）、並びにその調製および使用に関する。

【０００２】ｍＲＮＡの細胞内濃度は、その産生速度と共に、その分解速度により、調節さ
れているようである。これに関連し、ｍＲＮＡは無作為なヌクレオチド鎖切断事
象（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃｅｖｅｎｔ）によってではなく、むしろ特異的な
機構および既定のＲＮＡに特異的な分解速度により、分解されるようである。現
在、ポリ（Ａ）テールが特定の役割を果たす、２つの異なる分解経路が知られて
いる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において、ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡまた
はＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ｅにより生成されるｍＲＮＡ断片に付加されている
。ポリ（Ａ）テールは、比較的定まった構造がない（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ
）単位として機能するようであり、該単位は他のタンパク質に加え、ポリヌクレ
オチドホスホリラーゼである進行性３’−エキソヌクレアーゼ、およびエキソヌ
クレアーゼがｍＲＮＡ中の阻害性二次構造（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｓｅｃｏｎ
ｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を包囲するのを補助するＲＮＡ依存ＡＴＰア
ーゼ（ＡＴＰａｓｅ）を含む複合体の付着の原因である。葉緑体においても同様
の機構が作用するようである。

【０００３】真核生物において、ポリ（Ａ）テールの外側からのヌクレオチド鎖切断による
（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は同様に
すべてではないが多くのｍＲＮＡの分解を開始する。細菌での過程と対照的に、
ポリ（Ａ）分解エキソヌクレアーゼは、分解を実行するに際して、３’−ＵＴＲ
およびコード配列内に進行しないようである。その代わり、ポリ（Ａ）テールを
分解した後、真核エキソヌクレアーゼは停止するようである。Ｓ．セレビシエ（
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ｍＲＮＡ分解の第二の段階は、特定の
ピロホスファターゼによる５’キャップ構造の除去を伴う。しかし、ＣＡＰは、
ポリ（Ａ）テールがおよそ１０−１５ヌクレオチドに短くなった後、初めて除去
される。ＣＡＰ構造の除去により、ｍＲＮＡは５’−エキソヌクレアーゼの影響
を受けやすくなる。５’−エキソヌクレアーゼの最も重要な例は、ＸＲＮ１遺伝
子によりコードされる。

【０００４】哺乳動物細胞における、最初の脱アデニル化過程を観察するのは比較的容易で
あるが、さらなる段階の研究は、続く分解過程が迅速であり、そして解析可能な
中間体が存在しないことにより、より困難となっている。しかし、間接的な証拠
により、ＣＡＰ構造は、第二の段階において除去されると示唆される。ＸＲＮ１
遺伝子の相同体が、マウスで記載されてきている。一般的に、安定したｍＲＮＡ
は、緩やかに脱アデニル化され、そして不安定なｍＲＮＡは迅速に脱アデニル化
される。迅速な分解は、３’−ＵＴＲまたはコード配列における特定の脱安定化
配列（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の存在に依存する。
さらに、これらの配列における突然変異は、ｍＲＮＡを安定化するだけでなく、
脱アデニル化を緩慢にすることにもつながる。対照的に、α−グロブリンｍＲＮ
Ａにおける安定化要素の不活性化は不安定性および脱アデニル化の加速につなが
る。これらのデータは、ｍＲＮＡの分解が脱アデニル化速度により調節されてい
ることを明らかに示唆する。

【０００５】特定のｍＲＮＡの脱アデニル化はまた、翻訳の不活性化につながる可能性があ
る。これは、翻訳の開始のためには、ポリ（Ａ）テールが重要であることにより
説明することができる。翻訳を制御するための機構としての脱アデニル化は、多
くの動物種における卵母細胞の成熟および初期胚形成に重要な役割を果たす。例
えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、胚の極性はいわゆ
るハンチバック（ｈｕｎｃｈｂａｃｋ）ｍＲＮＡの脱アデニル化により制御され
ている。

【０００６】脊椎動物において、卵母細胞成熟および初期胚発生において、概ね、３つの脱
アデニル化反応を区別することができる：１．未成熟卵母細胞において、ほとんどのｍＲＮＡは、短いポリ（Ａ）テールを
持つ、翻訳的に不活性な型で貯蔵される。この例はマウスにおけるｔＰＡ（組織
プラスミノーゲンアクチベーター）のｍＲＮＡである。このｍＲＮＡはまず、通
常のポリアデニル化反応において、長いポリ（Ａ）テールを与えられ、このテー
ルはその後、脱アデニル化により一部切除され、オリゴ（Ａ）テールになる。こ
の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、３’−ＵＴＲにおける配列により制御
される。２．卵母細胞の成熟中、脱アデニル化は、元来長いポリ（Ａ）テールを有し、そ
して初期卵発生（ｅａｒｌｙｅｇｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）において活性
であった特定のｍＲＮＡを不活性化するのに用いられる。この脱アデニル化は、
ｍＲＮＡの特定の配列に依存しない。能動的なアデニル化プロセスにより保護さ
れない限り、すべてのｍＲＮＡが脱アデニル化される。３．初期胚発生中、同様に３’−ＵＴＲに特定の配列を必要とする、特異的反応
において、特定のｍＲＮＡが脱アデニル化される。

【０００７】３つの脱アデニル化反応は、すべて細胞質で起こる。しかし、体細胞での状況
と対照的に、卵母細胞においては、オリゴアデニル化または脱アデニル化された
ｍＲＮＡは安定なままであり、そして再びアデニル化されるか、または続く発生
段階（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓ）において分解されるだけである
。

【０００８】これらの反応の原因である酵素は、これまでに明白に同定されていない。ポリ
（Ａ）の分解は、直接または間接的にポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢ１）に
依存することが酵母において示されている。ＰＡＢ１依存ポリ（Ａ）ヌクレアー
ゼ（ＰＡＮ）が精製されている（Ｓａｃｈｓ，Ａ．Ｂ．＆Ｄｅａｒｄｏｒ
ｆｆ（１９９２）Ｃｅｌｌ，７０，９６１；Ｌｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．
ら（１９９２）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，６，２０８８）が、関係する遺伝
子（ＰＡＮ２およびＰＡＮ３）の突然変異体においては、脱アデニル化の重要で
ない欠陥（ｄｅｆｅｃｔｓ）を同定することが可能であるに過ぎなかった（Ｂｏ
ｅｃｋ，Ｒ．ら（１９９６）２７１（１），４３２；Ｂｒｏｗｎ，Ｃ
．ら（１９９６）１６（１０）５７４４）。

【０００９】Ｋｏｒｎｅｒ，Ｃｈ．Ｇ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１０４４８，第１６号は、ウシ胸腺由
来の、分子量７４ｋＤａを有し、そしてまた脱アデニル化ヌクレアーゼ（ＤＡ
Ｎ）とも称されてきているＭｇ²⁺依存性ポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌク
レアーゼを記載している。記載されているウシ胸腺ＤＡＮは、限定された反応条
件下で、細胞質ポリ（Ａ）結合タンパク質Ｉ（ＰＡＢＩ）により刺激され（Ｋ
ｏｒｎｅｒ，Ｃｈｒ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上記を参照さ
れたい）、そして優先的にポリ（Ａ）を基質とする。

【００１０】本発明の目的は、ヒトポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼを利用
可能にすることであった。驚くべきことに、本発明によればヒト脱アデニル化ヌクレアーゼ（ヒトＤＡＮ
）をコードするが、詳細に性質決定されてきておらず、そして末端が配列決定さ
れているのみのクローンが、今般、遺伝子ライブラリーに見出された。

【００１１】本発明は、したがって、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有する
ヒトＤＡＮをコードする核酸、またはその機能する変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌｖａｒｉａｎｔ）、および少なくとも８ヌクレオチドを有するその一部分、
好ましくは少なくとも１５または２０ヌクレオチドを有するその一部分、特に少
なくとも１００ヌクレオチドをを有するその一部分、更には少なくとも３００ヌ
クレオチドを有するその一部分（以下、これらを「本発明の核酸」と称する）に
関する。

【００１２】完全な核酸（ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）は６３９アミノ
酸および７３．５ｋＤａの分子量を有するタンパク質をコードする。大腸菌に
おけるこの核酸の発現は、Ｋｏｒｎｅｒ，Ｃｈ．Ｇ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ
．（１９９７、上記を参照されたい）に記載されたＤＡＮによって示されたもの
と同様の酵素活性を示すタンパク質を生じた。本発明にしたがって行われた他の
実験により、該核酸がヒトＤＡＮをコードする核酸であることが確認された。本
発明の核酸は、１９９８年３月２５日に、ＤＳＭＺ−ＤｅｕｔｃｈｅＳａｍｍ
ｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌ
ｔｕｒｅｎ（ドイツ微生物および細胞培養コレクション）ＧｍｂＨ，Ｍａｓｃ
ｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ，３８１２４Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋに、寄託番
号ＤＳＭ１２０７５下に寄託された。

【００１３】好ましい態様において、本発明の核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二本
鎖ＤＮＡ、そして特に配列番号１２の５８位から１９７７位までに示される通り
の核酸配列を有するＤＮＡである。２つの位置は、本発明によれば、コード領域
（ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ）の始めおよび終わりを決定する。

【００１４】本発明によれば、「機能する変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｖａｒｉａｎｔ
）」という用語は、ヒトＤＡＮコード核酸（ｈｕｍａｎＤＡＮ−ｅｎｃｏｄｉ
ｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）に機能の上で関連し、そして特にヒト起源で
ある核酸を意味すると理解される。関連する核酸の例は、種々のヒト細胞または
組織由来の核酸、あるいは対立遺伝子変異体（ａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｎｔ
ｓ）である。本発明は同様に、種々のヒト個体に由来する可能性がある核酸の変
異体も含む。

【００１５】より広い意味で、「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」という用語は、本発明によ
れば、およそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、
そして非常に好ましくはおよそ９５％の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）、特に配列
同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す核酸を意味すると理解さ
れる。

【００１６】本発明において、核酸の部分は、例えば、他の機能する変異体を同定するため
のプローブとして、またはアンチセンス核酸として、個々のエピトープを調製す
るために用いることができる。例えば、少なくともおよそ８ヌクレオチドからな
る核酸は、アンチセンス核酸として使用するのに適しており、少なくともおよそ
１５ヌクレオチドからなる核酸は、ＰＣＲ法におけるプライマーとして使用する
のに適しており、少なくともおよそ２０ヌクレオチドからなる核酸は、さらなる
変異体を同定するのに適しており、そして少なくともおよそ１００ヌクレオチド
からなる核酸は、プローブとして使用するのに適している。

【００１７】別の好ましい態様において、本発明の核酸は、１つまたはそれ以上の非コード
配列および／またはポリ（Ａ）配列を含む。非コード配列は、ヒトＤＡＮコード
化遺伝子の制御された発現のための、例えば、イントロン配列または制御配列、
例えばプロモーターまたはエンハンサー配列である。

【００１８】別の態様において、本発明の核酸は、したがって、ベクター、好ましくは発現
ベクターまたは遺伝子治療に有効であるベクターに含まれる。発現ベクターは、例えば、原核または真核発現ベクターであってもよい。大腸
菌における発現のための原核発現ベクターの例は、発現されたタンパク質が、Ｎ
ｉ²⁺−ＮＴＡカラムを用いて、好都合に精製されることを可能にする、Ｎ末端Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグをコードする、Ｔ７発現ベクターｐＧＭ１０（Ｍａ
ｒｔｉｎ、１９９６）である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に適した真核発現ベクターの
例は、ベクターｐ４２６Ｍｅｔ２５およびｐ４２６ＧＡＬ１（Ｍｕｍｂｅｒｇら
（１９９４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２２，５７６７）であ
り、一方、昆虫細胞における発現に適したベクターの例は、ＥＰ−Ｂ１−０１２
７８３９またはＥＰ−Ｂ１−０５４９７２１に開示されているようなバキュロウ
イルスベクターであり、そして哺乳動物細胞における発現に適したベクターの例
は、ＳＶ４０ベクターである。これらのベクターは、一般的に入手可能である。

【００１９】一般的に、発現ベクターはまた、宿主細胞に適した制御配列、例えば大腸菌に
おける発現のためのｔｒｐプロモーター（例えば、ＥＰ−Ｂ１−０１５４１３３
を参照されたい）、酵母における発現のためのＡＤＨ−２プロモーター（Ｒｕｓ
ｓｅｌら（１９８３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，２６７４
）、昆虫細胞における発現のためのバキュロウイルス・ポリヘドリン（ｐｏｌｙ
ｈｅｄｒｉｎ）プロモーター（例えばＥＰ−Ｂ１−０１２７８３９を参照された
い）あるいは初期ＳＶ４０プロモーターまたは例えばＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍
ウイルス；Ｌｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２１４，２２８）由来
のＬＴＲプロモーターをも含む。

【００２０】遺伝子治療に有効なベクターの例はウイルスベクター、好ましくはアデノウイ
ルスベクター、特に複製不全アデノウイルスベクター（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｓ）またはアデノ
関連ウイルスベクター、例えば２つの挿入末端反復（ＩＴＲ）配列のみからなる
アデノ関連ウイルスベクターである。

【００２１】適切なアデノウイルスベクターの例は、ＭｃＧｒｏｒｙ，Ｗ．Ｊ．ら（１９
９８）Ｖｉｒｏｌ．１６３，６１４；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら（１９
８２） “ＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ”（Ｇｌｕｚｍ
ａｎ，Ｙ．監修）中，１８７，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー；Ｃｈｒｏｂｏｃｚ
ｅｋ，Ｊ．ら（１９９２）Ｖｉｒｏｌ．１８６，２８０；Ｋａｒｌｓ
ｓｏｎ，Ｓ．ら（１９８６）ＥＭＢＯＪ．，５，２３７７またはＷＯ
９５／００６５５に記載されている。

【００２２】適切なアデノ関連ウイルスベクターは、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（
１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１５８，９７；ＷＯ９５／２３８６７；Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ
．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，３８２２；ＷＯ９５／２３
８６７；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ，Ｊ．Ａ．ら（１９９５）ＨｕｍａｎＧｅｎ
ｅＴｈｅｒａｐｙ６，１５３１またはＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４
）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５，７９３に記載されている。

【００２３】遺伝子治療に有効なベクターはまた、本発明の核酸をリポソームで複合体化す
ることによっても得ることが可能である。Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ら（１９
８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ８４，７
４１３；Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６，６９８２；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｈ
．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５５０または
Ｇａｏ，Ｘ．＆Ｈｕａｎｇ，Ｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１８９，１９５に記載されるような脂質混合物
は、この目的に適している。リポソームを調製する際、陽性純電荷が残り、そし
てＤＮＡが完全にリポソームに複合体化されるような比で、リポソームの表面に
ＤＮＡをイオン的に結合させる。

【００２４】本発明の核酸は、例えば化学的に、例えばホスホトリエステル法（例えば、Ｕ
ｈｌｍａｎ，Ｅ．＆Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌＲｅｖｉｅｗｓ，９０，５４３，第４号を参照されたい）により、配
列番号１２に開示される配列に基づき、または配列番号１１に開示されるペプチ
ド配列に基づき、そして遺伝暗号を利用することにより、合成することができる
。本発明の核酸を得る別の可能性は、適切なプローブ（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ
，Ｊ．ら（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ａｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ．第二版，ニューヨーク州コールドスプリングハ
ーバー）を使用し、適切な遺伝子ライブラリー、例えばヒト遺伝子ライブラリー
から、該核酸を単離することである。適切なプローブの例は、およそ１００ない
し１０００ヌクレオチドの長さ、好ましくはおよそ２００ないし５００ヌクレオ
チドの長さ、特におよそ３００ないし４００ヌクレオチドの長さであり、そして
配列番号１２に示される核酸配列から誘導することができる、一本鎖ＤＮＡ断片
である。

【００２５】本発明はさらにまた、配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有するポ
リペプチド自体、またはその機能する変異体、および少なくとも６アミノ酸を有
するその一部分、好ましくは少なくとも１２アミノ酸を有するその一部分、特に
少なくとも６５アミノ酸を有するその一部分、そして更には６３８アミノ酸を有
するその一部分にも関する（以下、これらを「本発明のポリペプチド」と称する
）。例えば、長さおよそ６−１２アミノ酸、好ましくは長さおよそ８アミノ酸の
ポリペプチドは、キャリアーと結合した後、特異的なポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体を調製するのに用いられるエピトープを含むことができる（この
点に関しては、例えばＵＳ５，６５６，４３５を参照されたい）。長さが少な
くともおよそ６５アミノ酸であるポリペプチドはまた、キャリアーなしに、ポリ
クローナルまたはモノクローナル抗体を調製するのに直接用いることができる。

【００２６】本発明の意味内で、「機能する変異体」という用語は、本発明のペプチドに機
能の上で関連する、すなわちポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼ活
性を示し、そして好ましくは２つの異なる反応条件下で活性があるポリペプチド
を意味すると理解される。第一の反応条件において、活性は、塩が存在しない場
合、スペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｅｎｅ）の存在に完全に依存する。対照的に
、スペルミジンが存在しない場合、該酵素の活性は塩濃度に依存する。さらに、
ＰＡＢ１が存在する場合、限定された反応条件下で、ポリ（Ａ）テールの段階的
な分解を観察することが可能である（やはりＫｏｒｎｅｒ，Ｃｈｒ．Ｇ．＆
Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上記を参照されたい）。特に、主な分解産
物の長さはおよそ３０ヌクレオチド異なる。変異体はまた、対立遺伝子変異体あ
るいは他のヒト細胞または組織に由来するポリペプチドを意味するものとしても
理解される。これらはまた、種々のヒト個体に由来するポリペプチドを意味する
ものとしても理解される。

【００２７】より広い意味で、これらは、およそ７０％、好ましくはおよそ８０％、特に好
ましくはおよそ９０％、そして非常に好ましくはおよそ９５％の配列番号１１に
示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと配列相同性、特に配列同一性を持
つポリペプチドを意味するとも理解される。これらはさらにまた、およそ１−６
０、好ましくはおよそ１−３０、特におよそ１−１５、特におよそ１−５アミノ
酸の範囲の、ポリペプチドの欠失も含む。例えば、最初のアミノ酸、すなわちメ
チオニンは、該ポリペプチドの機能を有意に改変することなく欠失していてもよ
い。さらに、これらはまた、上述の本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質
も含み、該融合タンパク質は、すでにそれ自体ヒトＤＡＮの機能を有するか、ま
たは融合部分が除去された後のみ、特定の機能を獲得することが可能である。特
に、これらは、およそ１−２００、好ましくはおよそ１−１５０、特におよそ１
−１００、特に１−５０アミノ酸の、特に非ヒト配列の内容物を有する融合タン
パク質を含む。非ヒトペプチド配列の例は、原核ペプチド配列、例えば大腸菌ガ
ラクトシダーゼまたはいわゆるヒスチジンタグ、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ ₆ タグ由来である。いわゆるヒスチジンタグを含む融合タンパク質は、特に好都
合に、金属イオン含有カラムを用い、例えばＮｉ²⁺−ＮＴＡカラムを用い、発現
されたタンパク質を精製するのに適している。「ＮＴＡ」はキレート化剤ニトリ
ロトリ酢酸（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、ヒルデン）を表す。

【００２８】本発明のポリペプチドの部分は、例えば、抗体に特異的に認識されることが可
能なエピトープの代わりになる。既知のヌクレアーゼと比較することにより、本発明のポリペプチドがＲＮアー
ゼＤファミリーのメンバーであることが見出された。図４は、この種類のエキソ
ヌクレアーゼに特徴的であるＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩおよびＥｘｏＩＩＩモ
チーフの保存アミノ酸を示す。他の保存アミノ酸は、灰色の背景で示される。３
つの酸性アミノ酸側鎖、すなわちＥｘｏＩドメイン内の２つおよびＥｘｏＩ
ＩＩドメイン内の１つは、酵素加水分解に関与する２つのＭｇ²⁺イオンの結合に
直接関与する。ＥｘｏＩＩドメイン内に位置する第三の酸性アミノ酸側鎖は、
水素結合分子を通じ金属イオンの１つに結合する。これらのアミノ酸残基はすべ
て、ファミリー内で非常に保存され、そしてまた、本発明のヒトＤＡＮにも見ら
れる。本発明のポリペプチドは、したがって、ＲＮアーゼＤファミリーに属する
ポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼであると記載することが可能で
ある。

【００２９】本発明のポリペプチドは、例えば、本発明の核酸を、当業者に周知の方法を用
い、すでに上に記載されたように、適切な発現系で発現させることにより、調製
される。適切な宿主細胞の例は大腸菌株ＤＨ５、ＨＢ１０１およびＢＬ２１、酵
母株サッカロミセス・セレビシエ、昆虫細胞株、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒ
ａｎ）、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＦｒｕｇ
ｉｐｅｒｄａ）由来のもの、または動物細胞、例えばＣＯＳ、Ｖｅｒｏ、２９３
およびＨｅＬａ細胞であり、これらはすべて、一般的に入手可能である。

【００３０】特に、前記のポリペプチドの一部分はまた、古典的なペプチド合成（メリフィ
ールド技術：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により合成すること
もできる。これらは、本発明のポリペプチドの、他の機能する変異体を入手する
機会を得るという目的のための、適切な遺伝子発現ライブラリーをスクリーニン
グするために用いることができる、抗血清を得るのに特に適している。

【００３１】したがって本発明はまた、適切な宿主細胞で発現され、そして適切な場合、単
離されている、本発明の核酸を用い、本発明のポリペプチドを調製するための方
法に関する。

【００３２】本発明はさらにまた、ポリペプチドの上述の部分がそれ自体免疫原性であるか
、または免疫原性にすることが可能であるか、または適切なキャリアー、例えば
ウシ血清アルブミンとカップリングさせることにより、増加した免疫原性を有す
ることが可能である、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体にも関する
。

【００３３】抗体はポリクローナルまたはモノクローナルいずれかである。やはり本発明の
主題の一部であるその調製は、例えば周知の方法にしたがって、哺乳動物、例え
ばウサギを、適切な場合、例えばフロイントのアジュバントおよび／または水酸
化アルミニウムゲルの存在下で、本発明のポリペプチドまたは前記したその一部
分で免疫化することにより達成される（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｂ．Ａ．ら
（１９９１）ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ，１３４４を参照されたい）。免疫学的反応のため、動物におい
て産生されたポリクローナル抗体を、その後、周知の方法を用いて、血液から容
易に単離し、そして例えばカラムクロマトグラフィーを用い、精製することがで
きる。例えばＣ末端ＤＡＮ断片がＮＨＳ活性化ＨｉＴｒａｐカラムにカップリン
グしている、アフィニティークロマトグラフィーにより、抗体を精製することが
好ましい。

【００３４】モノクローナル抗体は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎの既知
の方法を用いて調製することができる（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．＆Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｃ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３）。

【００３５】本発明はさらにまた、本発明の核酸または本発明のポリペプチド、および適切
な場合、適切な添加剤またはアジュバントを含む医薬、並びに、癌、自己免疫疾
患、特に多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）または慢性関
節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、アルツハイマー病
、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまたはＩＶ型アレルギー、関節
症、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、骨粗鬆症、
急性および慢性感染性疾患および／または糖尿病を治療するための、および／ま
たは細胞の代謝、特に免疫抑制と関連した、特に移植と関連した前記代謝に影響
を及ぼすための医薬を製造するための方法であって、該医薬において、本発明の
核酸、例えばアンチセンス核酸、または本発明のポリペプチドが薬学的に許容し
うる添加剤および／またはアジュバントと共に処方される、前記方法にも関する
。

【００３６】本発明の核酸を裸の（ｎａｋｅｄ）形で、または遺伝子治療に有効な上述のベ
クターの１つの形で、またはリポソームと複合体化している形で含む医薬は、ヒ
トにおける遺伝子治療適用に非常に適している。

【００３７】適切な添加剤および／またはアジュバントの例は、生理学的塩化ナトリウム溶
液、安定化剤、プロテイナーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）阻害剤、ヌクレアーゼ
阻害剤などである。

【００３８】本発明はさらにまた、本発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗
体、および適切な場合、適切な添加剤および／またはアジュバントを含む診断剤
、並びに癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リウマチ、アルツ
ハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまたはＩＶ型アレル
ギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および慢性感染性疾患
および／または糖尿病を診断するための、および／または細胞の代謝、特に免疫
状態、特に移植と関連した前記代謝を解析するための診断剤を調製するための方
法であって、該診断剤において、適切な添加剤および／またはアジュバントを本
発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体に添加する、前記方法に
も関する。

【００３９】例えば、本発明によれば、本発明の核酸を用い、実施例５にさらに詳細に記載
されているように、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく診断剤（例えばＥＰ−０２０
０３６２に記載されるようなＰＣＲ診断剤）またはノーザンブロットに基づく診
断剤を調製することができる。これらの試験は、本発明の核酸と、相補的な対鎖
（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）、通常、対応するｍＲＮＡの前記対鎖との特異
的なハイブリダイゼーションに基づく。これに関連して、本発明の核酸はまた、
例えばＥＰ００６３８７９に記載されるように、修飾してもよい。周知の方法
を用い、本発明のＤＮＡ断片を、適切な試薬、例えば放射能的にα−³²Ｐ−ｄＡ
ＴＰで、または非放射能的にビオチンで、標識し、そして好ましくは、例えばセ
ルロースまたはナイロンからなる適切な膜に結合している単離ＲＮＡとともに該
ＤＮＡ断片をインキュベーションすることが好ましい。ハイブリダイゼーション
および膜への結合の前に、例えば、アガロースゲル電気泳動を用い、単離ＲＮＡ
を大きさにしたがい分画化することが、さらに好都合である。この方法だと、各
組織試料由来から検査されたＲＮＡの量が同一である場合、プローブにより特異
的に標識されているｍＲＮＡの量を測定することが可能である。

【００４０】別の診断剤は、上でより詳細に記載されている、本発明のポリペプチドまたは
その免疫原性部分を含む。好ましくは、例えばニトロセルロースまたはナイロン
からなる固相に結合している、ポリペプチドまたはその一部分を、例えば自己免
疫抗体と反応することが可能であるために、調べるべき体液、例えば血液とｉｎ
ｖｉｔｒｏで接触させることができる。抗体・ペプチド複合体を次いで、例え
ば標識抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭ抗体を用いて検出することができる。標
識は、例えば、呈色反応（ｃｏｌｏｒｒｅａｃｔｉｏｎ）を触媒する酵素、例
えばペルオキシダーゼである。自己免疫抗体の存在、および存在するこれらの抗
体の量は、したがって、呈色反応を用い、容易にそして迅速に検出することが可
能である。

【００４１】別の診断剤は、本発明の抗体自体を含む。これらの抗体を用い、例えば容易に
そして迅速にヒト組織試料を調べ、問題のポリペプチドが存在しているかどうか
決定することができる。この場合、本発明の抗体は、例えば既に上に記載したよ
うな酵素で標識されている。特異的な抗体・ペプチド複合体をそれにより容易に
、そして酵素呈色反応によってまさに迅速に検出することができる。

【００４２】本発明はまた、機能上の相互作用因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）、例えば阻
害剤または刺激剤（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ）を同定するための試験であって、
本発明の核酸、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体、および適切な場合、
適切な添加剤および／またはアジュバントを含む、前記試験にも関する。

【００４３】機能上の相互作用因子を同定するための適切な試験の例は、いわゆる２−ハイ
ブリッド系（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ）（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．
＆Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，Ｒ．（１９８４）ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎ
ｅｔｉｃｓ，１０，２８６）である。本試験において、細胞、例えば酵母細
胞を、本発明のポリペプチドおよび既知のタンパク質、例えば大腸菌Ｇａｌ４ま
たはＬｅｘＡ由来のＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を発現する、およ
び／または未知のポリペプチドおよび、例えばＧａｌ４、ヘルペスウイルスＶＰ
１６またはＢ４２由来の転写活性化ドメイン（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ａ
ｃｔｉｖａｔｉｎｇｄｏｍａｉｎ）を含む融合タンパク質を発現する、１つま
たはそれ以上の発現ベクターで、形質転換またはトランスフェクションする。さ
らに、該細胞はレポーター遺伝子、例えば、ＬｅｘＡプロモーター／オペレータ
ーなどの制御配列により、または酵母に存在しているいわゆる上流活性化配列（
ｕｐｓｔｒａｍａｃｔｉｖａｔｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＵＡＳ）により調節
されている、大腸菌ＬａｃＺ遺伝子、「緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）」または酵母アミノ酸生合成遺伝子Ｈ
ｉｓ３またはＬｅｕ２を含む。未知のポリペプチドは、例えば、遺伝子ライブラ
リー、例えばヒト遺伝子ライブラリー由来のＤＮＡ断片にコードされる。通常、
上述の発現ベクターは、酵母において直接ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーを調製す
るのに用いられ、したがって試験はその直後に行うことができる。

【００４４】例えば、形質転換された酵母が、本発明のポリペプチドおよびＬｅｘＡＤＮ
Ａ結合ドメインからなる融合タンパク質を発現するように、本発明の核酸を、酵
母発現ベクター中で、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸上に、機
能上の単一体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｕｎｉｔｙ）でクローン化する。別の酵
母発現ベクターにおいて、形質転換された酵母が、未知のポリペプチドおよびＧ
ａｌ４転写活性化ドメインからなる融合タンパク質を発現するように、ｃＤＮＡ
遺伝子ライブラリー由来のｃＤＮＡ断片を、Ｇａｌ４転写活性化ドメインをコー
ドする核酸上に、機能上の単一体でクローン化する。これら２つの発現ベクター
で形質転換され、そして例えば、Ｌｅｕ２^-である酵母は、Ｌｅｕ２をコードし
、そしてＬｅｘＡプロモーター／オペレーターにより調節される核酸を更に含む
。本発明のポリペプチドおよび未知のポリペプチドの間で、機能上の相互作用が
起こる場合、Ｇａｌ４転写活性化ドメインは、ＬｅｘＡＤＮＡ結合ドメインを
通じ、ＬｅｘＡプロモーター／オペレーターに結合し、その結果、後者が活性化
されそしてＬｅｕ２遺伝子が発現される。これはその後、Ｌｅｕ２^-酵母が、ロ
イシンを全く含まない最小培地上で増殖することを可能にする。

【００４５】アミノ酸生合成遺伝子の代わりにＬａｃＺレポーター遺伝子または緑色蛍光タ
ンパク質レポーター遺伝子を用いた場合、転写活性化は青色または緑色蛍光コロ
ニーが形成されることにより検出することができる。青色または蛍光色は次いで
、分光計（ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で、例えば青色の場合、５８５ｎＭで
容易に定量化することができる。

【００４６】このようにして、本発明のポリペプチドと相互作用するポリペプチドに関し、
容易にかつ迅速に、遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングすることが可能で
ある。発見された新規ポリペプチドをその後、単離し、そしてさらなる性質決定
に供することができる。

【００４７】２−ハイブリッド系を適用する別の可能性は、他の物質、例えば、化合物を用
い、本発明のポリペプチドおよび既知の若しくは未知のポリペプチドの間の相互
作用に影響を及ぼすことである。このようにして、治療剤として使用することが
可能な、新規の、価値ある、化学的に合成可能な活性化合物を、容易に発見する
ことも可能である。本発明は、したがって、ポリペプチド様相互作用因子を発見
するための方法に向けられるだけでなく、上述のタンパク質−タンパク質複合体
（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘ）と相互作用することが可能
な物質を発見するための方法にも拡張される。本発明の意味内で、こうしたペプ
チド様相互作用因子、そしてまた化学的相互作用因子は、したがって、阻害的ま
たは刺激的効果を有することが可能である、機能上の相互作用因子（ｆｕｎｃｔ
ｉｏｎａｌｉｎｔｅｒａｃｔｏｒｓ）と称される。

【００４８】本発明のポリペプチドの別の可能性がある適用は、核酸、特にｍＲＮＡのポリ
（Ａ）特異的分解である。核酸のポリ（Ａ）特異的分解は、研究実験室において
、特に有用であると言える。

【００４９】以下の図および実施例は、本発明を限定することなく本発明を明確にすること
を意図する。図面および最も重要な配列の説明配列番号１１は、ＥｘｏＩ（ＡＤＦＦＡＩＤＧＥＦＳＧＩＳ）、ＥｘｏＩ
Ｉ（ＬＶＩＧＨＮＭＬＬＤＶＭＨＴＶＨ）およびＥｘｏＩＩＩ（ＳＥＱＬＨＥ
ＡＧＹＤＡＹＩＴＧＬＣ）に関するドメインを含む、ヒトＤＡＮのアミノ酸配列
を示す。

【００５０】配列番号１２は、開始コドン（５８位）並びに停止コドン（１９７７位）およ
びそれに続く３’−ＵＴＲを含む、ヒトＤＡＮの核酸配列を示す。図１は、ヒトＤＡＮのＭｏｎｏＱの溶出プロフィール（図３Ａ）およびＳＤＳ
−ＰＡＧＥ（図１Ｂおよび１Ｃ）を示す。

【００５１】図２は、組換えヒトＤＡＮおよび天然ウシＤＡＮのウェスタンブロットを示す
。図３は、ｍＲＮＡの脱アデニル化、脱アデニル化ＲＮＡの集積およびＰＡＢＩ
の影響を示す。

【００５２】図４は、本発明のヒトＤＡＮと既知のヌクレアーゼの比較を示す。

【００５３】

【実施例】１．ヒトＤＡＮｃＤＮＡクローンの同定ウシＤＡＮは以下のように、そしてＫｏｒｎｅｒ，Ｇ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）（上記参照）、に記載される通りに精製した。

【００５４】精製のすべての段階は、４℃で行った。複数の精製段階の間で、試料を液体窒
素中で凍結し、そして−８０℃で凍結した。以下の基本的な緩衝液を用いた：５
０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール
、１ｍＭジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、０．４μｇ
のロイペプチン・ヘミサルフェート（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｈｅｍｉｓｕｌｆａ
ｔｅ）／ｍｌ、０．７μｇのペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）／ｍｌ、０．
５ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄ
ｅｔＰ−４０、ｐＨ７．９。以下に記載するように、種々の精製段階で異なる
濃度のＫＣｌをこの基本的な緩衝液に添加した。

【００５５】新鮮な子ウシ胸腺を地元の食肉処理場から得て、氷上で輸送し、そして−８０
℃で貯蔵した。５０ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液２リットル中で１ｋｇを
解凍し、そしてワーリング・ブレンダーホモジェナイザー（ＷａｒｉｎｇＢｌ
ｅｎｄａｒｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）中で、始めは低速で、その後中程度の速
度で、そして最後に最高速度で均質化した。ホモジェネートを１６０００×ｇで
１時間遠心分離し、そしてワイドメッシュガーゼ（ｗｉｄｅ−ｍｅｓｈｇａｕ
ｚｅ）を通し上清をデカントした（Ｗａｈｌｅ，Ｅ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６６，１９９１）。

【００５６】この子ウシ胸腺抽出物をＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（カラム体積４
ｌ）に装填し、そしてカラム体積の２．５倍の体積の５０ないし６００ｍＭＫ
Ｃｌの塩勾配を用い、流速３リットル／時間で、カラムから溶出させた。活性分
画は、７５および２００ｍＭＫＣｌの間の塩濃度で、カラムから溶出された。
該分画を集め、合わせ、硫酸アンモニウムで処理し、３０％飽和溶液を得て、そ
して氷上で１．５時間攪拌した。遠心分離（１０８００×ｇで３０分間、これは
以下に言及される遠心分離段階すべてに適用される）後、硫酸アンモニウムで上
清を５０％飽和に調整し、そして再び氷上で攪拌し、そして遠心分離した。沈降
物を、５０ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液４００ｍｌに再懸濁し、そして基
本的な緩衝液２×４．５リットルに対し、１０時間透析し；その後再び遠心分離
した。１．４リットルセファロース・ブルーカラム（７×３６ｃｍ）を、５０
ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液で平衡化し、そして透析した抽出物をカラム
に装填した。２５０ｍＭＫＣｌを含む１．５ベッド容量（ｂｅｄｖｏｌｕｍ
ｅｓ）の基本的な緩衝液でカラムを洗浄し、そして１ＭＫＣｌを含む１ベッド
容量の基本的な緩衝液で溶出させた（流速２ｌ／時間）。

【００５７】各場合、１．２ｋｇの子ウシ胸腺からの２つの調製物（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ
ｎ）由来の活性分画を合わせ、そして硫酸アンモニウム（６０％飽和）で沈澱さ
せた。遠心分離後、５０ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液２００ｍｌ中に
沈降物を採取し、同じ緩衝液３×４リットルに対し、１２時間透析し、そして２
つの部分に分け、ヘパリン・セファロースカラム（２．５×３７ｃｍ）に装填し
た。５０ｍＭＫＣｌを含む１．５ベッド容量の基本的な緩衝液でカラムを洗浄
し、そしてその後５００ｍＭＫＣｌまでの勾配で１０ベッド容量で溶出させた
（流速：１４５ｍｌ／時間）。ＤＡＮ活性は８０および１５０ｍＭＫＣｌの間
で溶出された。活性分画を合わせ、そして３０ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝
液に対し、４時間透析した。透析物を遠心分離し、そして２つの部分に分け、Ｍ
ｏｎｏＱＦＰＬＣカラム（ベッド容量８ｍｌ）上でクロマトグラフィーを行っ
た。５０ｍＭＫＣｌを含む２ベッド容量の基本的な緩衝液でカラムを洗浄し、
そしてその後、増加する濃度の塩を含む勾配３２０ｍｌで、カラムから溶出させ
た（最終濃度：５００ｍＭＫＣｌ、流速：２．５ｍｌ／時間）。ＤＡＮ活性は
およそ１６０ｍＭＫＣｌで溶出された。活性分画（４０ｍｌ）を合わせ、そし
て３０ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液２リットルに対し、４時間透析し、遠
心分離し、さらなるＭｏｎｏＱカラム（１ｍｌベッド容量、流速：０．９ｍｌ／
時間）に装填した。５００ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液で、カラムに結合
しているＤＡＮ活性を溶出させ、そして４つの部分に分け、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（３００ｍＭＫＣｌを含む基本的な緩衝液
で平衡化されている、流速：０．１５ｍｌ／時間）に充填した（Ｋｏｒｎｅｒ，
Ｃｈ．Ｇ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上記を参照されたい）
。

【００５８】Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラムから溶出され、そしてＤＡＮ活性を含む異なる分画を
集め、そしてＰｈｅｎｙｌＳｕｐｅｒｏｓｅカラムを通じ分画化した（Ｋｏｒ
ｎｅｒ，Ｇ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上記を参照されたい）
。活性分画を集め、そして緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．９
、１ｍＭＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭジチオスレイト
ール、０．４ｍｇのロイペプチン・ヘミサルフェート／ｍｌ、０．７ｍｇのペプ
スタチン／ｍｌ、０．５ｍＭフェニルメチルスルホネート（ＰＭＳＦ）、０
．０２％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔｐ−４０、５０ｍＭＫＣｌ）に対し、透
析した。遠心分離した後、透析物を１００ｍｌＳｍａｒｔＭｏｎｏＱ（ＰＣ
１．６／５）カラムに充填した。次いでカラムを、２００ｍｌの緩衝液で洗浄
した。増加する濃度の塩（最終濃度５００ｍＭＫＣｌ）を含み、そして４０カ
ラムベッド容量と等しい体積を有する勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）中で、結合した
タンパク質を溶出した。およそ２００ｍＭＫＣｌのＫＣｌ濃度で、ＤＡＮ活性
に関し陽性である分画が溶出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り、最も高いＤＡＮ活性を有する２つの分画を解析した。この後、プロテアーゼ
Ｌｙｓ−Ｃを用いてインサイチュー（ｉｎｓｉｔｕ）で加水分解し、ＨＰＬＣ
により分画化し、そしてペプチドの配列決定を行った。以下の配列が見出された
：１．ＫＳＦＮＦＹＶＦＰＫ、２．ＫＰＦＮＲＳＳＰＤ（Ｖ／Ｋ）Ｋ、３．ＫＹＡＥＳＹＷＩＱＴＹＡＤＹＶＧおよびまた４．ＫＥＱＥＥＬＮＤＡおよびＫＬＦＬＭＲＶＭＤからなる混合物。

【００５９】精製ウシＤＡＮのＮ末端配列を決定することは不可能であった。続いて、ＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）を用い、ＥＳＴ（発現配列タグ：
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ）データベース検索を行った
。以下のクローンが同定された：ペプチド１および２により、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローン（Ｃ
ｏｎｓｏｒｔｉｕｍｃｌｏｎｅ）ＩＤ６４５２９５、およびペプチド３により、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローンＩＤ３０１
９０１。

【００６０】見出されていたクローンは、ＡＢＩダイ・ターミネーターサイクル配列決定キ
ット（ＡＢＩＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇｋｉｔ）を用い、ＡＢ１３７３Ａ配列決定装置上で、完全に配列決定した
。

【００６１】これに関連し、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローンＩＤ３０１９
０１が、ＤＡＮの１７６のＣ末端アミノ酸および全長３’−ＵＴＲをコードする
一方、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムクローンＩＤ６４５２９５が、全
長ＯＲＦおよび５’ＵＴＲ並びに３’−ＵＴＲの一部をコードし、６３９アミノ
酸からなり、そして７３．５ｋＤａの分子量を有するタンパク質（配列番号１
１）に対応することが見出された。最初のＡＵＧコドンの上流に位置する５７ヌ
クレオチドは、読み枠（ｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）にいかなる停止コドンも
含まない。このＡＵＧコドンを取り巻く配列（ＡＧＡＡＵＧＧ）は、翻訳開始に
関する好ましい開始配列を記載する、いわゆるコザックの規則（Ｋｏｚａｋ、１
９９１）にしたがう。０．７ｋＢ３’−ＵＴＲはｃＤＮＡクローン６４５
２９５に存在し、そしてポリ（Ａ）テールはｃＤＮＡクローン３０１９０１の末
端に存在する。ポリ（Ａ）テールの上流には、稀なポリアデニル化シグナルＡＵ
ＵＡＡＡが先行する（配列番号１２）。２．発現ベクターの調製プラスミドｐＧＭＭＣＳは、以下の方式で構築した：Ｎ末端Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ６タグを有するＰＡＢＩＩｃＤＮＡ配列（Ｎ
ｅｍｅｔｈ、１９９６）を含む、Ｔ７発現ベクターｐＧＭ１０（Ｍａｒｔｉｎ、
１９９６）をＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＰＡＢＩＩの３
’部分を含む断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋／−）プラスミドのマ
ルチクローニングサイト（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅ）由来
のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片と置き換えた。生じたプラスミドは、Ｔ７プロ
モーターに制御され、そしてＭｅｔ−ＡｌａＨｉｓ６で始まり、その後ＰＡＢ
ＩＩの５’部分およびマルチクローニングサイトが続く配列を含む。ＮＤＥ
Ｉ切断部位はＨｉｓ６タグおよびＰＡＢＩＩ配列の間に位置し、そしてマルチ
クローニングサイトと共に用い、残ったＰＡＢＩＩ配列を、いかなる所望によ
るコード配列と置き換えることも可能である。

【００６２】プラスミドｐＧＭＭＣＳ３０１９０１は、以下の方式で構築した：１７６のＣ末端アミノ酸を含むヒトＤＡＮクローンの配列の一部分を、クロー
ン３０１９０１から、ＰＣＲにより、以下の条件を用いて増幅した：１５サイクル：９４℃で４５秒、５４℃で４５秒および７２℃で３．５分。Ｐｆ
ｕポリメラーゼおよびプライマーＮｄｅＩ３０１９０１：ＣＣＡＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＣおよびＸｈｏＩ３０１９０１：ＡＧＴＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧ。ＮｄｅＩおよびＸｈ
ｏＩを用いた消化に続き、Ｑｉａ−Ｅｘキット（ＱｉａｇｅｎＧｍｂＨ、ヒ
ルデン）を用いて生じたｃＤＮＡ断片を精製し、そしてＮｄｅＩおよびＸｈｏ
Ｉ消化ｐＧＭＭＣＳベクターに組み込んだ。配列は配列決定により確認した。

【００６３】プラスミドｐＧＭＭＣＳ６４５２９５は以下のように調製した：ヒトＤＡＮクローンのコード配列を、クローン６４５２９５から、ＰＣＲによ
り、以下の条件を用いて増幅した：２０サイクル：９４℃で４５秒、５４℃で４５秒および７２℃で３．５分。Ｐｆ
ｕポリメラーゼおよびプライマーＮｄｅＩ６４５２９５：ＡＧＴＧＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡＴＣＡＧＧＡＧＣＡおよびＸｈｏＩ６４５２９５：ＡＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＧＴＴＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡ。生じた産物をＴＡクロ
ーニングキット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））を用い、ベクターｐＣＲ
２．１にクローン化した。ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いた消化に続き、Ｑ
ｉａ−Ｅｘキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて生じたｃＤＮＡ断片を精製し、そし
てＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ消化ｐＧＭＭＣＳベクターに組み込んだ。その後
、ＤｒａＩＩＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化することにより、ＰＣＲ生成配列
の大部分を除去し、そして元来のクローンの対応する断片と置き換えた。新規配
列は配列決定により確認した。３．抗体の調製ヒトＤＡＮのＣ末端部分に対して向けられる抗体は、以下のように産生した：プラスミドｐＧＭＭＣＳ３０１９０１をＢＬ２１（ｐＬｙｓＣ）に形質転換し
た。２００ｍｇのカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｅｌｌｉｎ）／ｍｌを含
むＳＯＢ培地中で、ＯＤ６００が１．９になるまで細胞をインキュベーションし
た。次いで、２００ｍＭのイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドを添加し、
そして混合物をさらに５時間インキュベーションした。細胞を採取し、そして緩
衝液Ａ（１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、１０ｍＭＴｒｉｓ、８Ｍ尿素、ｐＨ
７．９）中に取った。超音波により細胞を溶解し、そして溶解物を遠心分離し、
そして３ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラム材料（Ｎｉ−ＮＴＡｃｏｌｕｍｎｍａ
ｔｅｒｉａｌ）と、室温で２時間インキュベーションした。カラム材料をカラム
に充填し、そして７０ｍｌの緩衝液Ａ、ｐＨ６．３で洗浄した。その後、１５
ｍｌの緩衝液Ｂ（３００ｍＭＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０
ｍＭＴｒｉｓ、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、８Ｍ尿素
、ｐＨ７．９）で洗浄した。タンパク質は、尿素含量を２勾配で減少させること
により、カラム上で再フォールディングさせた（ｒｅｆｏｌｄｅｄ）（４５ｍｌ
／時間、勾配１：８ないし４Ｍ尿素を含む緩衝液Ｂ、室温、勾配ＩＩ：４ない
し０Ｍ尿素を含む、４℃）。５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂでカラ
ムからタンパク質を溶出し、尿素を全く含まない緩衝液Ｂに対して透析し、そし
てその後、ウサギを免疫化するのに用いた。

【００６４】抗ＤＡＮ抗体は以下のようにアフィニティー精製した：製造者の指示にしたが
い、Ｃ末端ＤＡＮ断片をＮＨＳ活性化ＨｉＴｒａｐカラム（１ｍｌ体積、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ、フライブルグ）にカップリングさせた。３ｍｌの血清をカラ
ムに充填し、そして製造者の指示にしたがい、溶出させた。３００ｍｇのＢＳ
Ａ／ｍｌおよび０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ₃を分画に添加し、そして緩衝液を
透析により置換した。４．ヒトＤＡＮの発現および精製Ｎ末端Ｈｉｓタグ（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ₆タグ）を有する融合タンパク質
として、大腸菌において、以下の方式で、ヒトＤＡＮを発現した：プラスミドｐＧＭＭＣＳ６４５２９５をＢＬ２１（ｐＬｙｓＣ）に形質転換し
た。１００ｍｇのカルベニシリン／ｍｌおよび２４ｍｇのクロラムフェニコール
／ｍｌを含む５０ｍｌのＬＢ培地中で、３７℃で、細胞を培養し、そしてその後
、クロラムフェニコールを含まない５００ｍｌ培養に移し、そして３３℃でさら
なるインキュベーションに供した。ＯＤ６００が１．３に達した後、１００ｍＭ
のイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトシドを添加し、そして培養物をさらに１
時間インキュベーションした。細胞を採取し、そして緩衝液Ａ（５０ｍＭＴｒ
ｉｓ、３００ｍＭＫＣｌ、０．１ｍＭＭｇＡｃ、１ｍＭｂ−メルカプトエ
タノール、０．４ｍｇのロイペプチン／ｍｌ、０．７ｍｇのペプスタチン／ｍｌ
、０．５ｍＭＰＭＳＦ、ｐＨ７．９）中に取った。超音波により細胞を溶解し
、そして溶解物を遠心分離し、そして２ｍｌのＮｉ²⁺−ＮＴＡカラム材料と、
４℃で２時間インキュベーションした。カラム材料をカラムに充填し、そして２
５ｍｌの緩衝液Ａで、次いで２０ｍｌの緩衝液Ｂ（緩衝液Ａおよび１０％（ｖ／
ｖ）グリセロール、０，０２％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、マグネシウ
ム不含、ｐＨ６．３）で洗浄した。その後、５ｍｌの緩衝液Ｃ（５００ｍＭイ
ミダゾールを含む緩衝液Ｂ）でタンパク質を溶出させた。その後、緩衝液Ｄ（５
０ｍＭＴｒｉｓ、２０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＰＭＳＦ、
１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、
ｐＨ７．９）に対して透析した。調製物を遠心分離し、そしてＭｏｎｏＱカラム
（１ｍｌベッド容量）に充填した。次いでカラムを、５０ｍＭＫＣｌを含む５
ベッド容量の緩衝液で洗浄し、そして４０ベッド容量に等しい容量および最終濃
度５００ｍＭＫＣｌを有する勾配で溶出させた。ＤＡＮ活性は、およそ１９０
ｍＭＫＣｌにおいて鋭いピークで溶出された（図１Ａ）。

【００６５】該精製は、期待される分子量を有するタンパク質の実質的に均質な調製を生じ
た（図１Ｂおよび１Ｃ）。該タンパク質は、ポリ（Ａ）に特異的な３’−エキソ
リボヌクレアーゼ活性を示す（実施例６を参照されたい）。これにより、発見さ
れたｃＤＮＡクローンはヒトＤＡＮをコードするといえる。５．ノーザンブロット解析Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．＆Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．（１９８７）
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６に記載されている方法を用い
、ＨｅＬａ細胞からＲＮＡを単離した。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（１９８９
）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ，第二版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、に記載され
ている方法にしたがい、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用い、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ
を精製した。生じたＲＮＡを１％アガロースホルムアルデヒドゲル上で分画化し
、キャピラリーブロッティングにより、ＨｙｂｏｎｄＮ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍＢｕｃｈｌｅｒ、ブルンスウィック）に移し、そして８０℃で２時間インキ
ュベーションすることにより、膜に固定した。ヒトＤＡＮをコードする配列をＰ
ＣＲにより増幅し、ランダムプライミングによりα−³²Ｐ−ｄＡＴＰで標識し、
そしてプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションは、記載されている通り
に（Ａｕｓｕｂｅｌ）行い、そして膜は高ストリンジェンシー（ｈｉｇｈｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｃｙ）下で洗浄した。ＨｅＬａ細胞ポリ（Ａ）⁺ ＲＮＡを用いた
ノーザンブロット解析は、ＤＡＮプローブにハイブリダイズした単一の３．１ｋ
Ｂ断片を示した。この大きさはｃＤＮＡクローンの大きさとよく一致する。６．ＤＡＮ活性試験ＤＡＮ活性に関するアッセイは記載されている通りに行った（Ｋｏｒｎｅｒ，
ＣｈｒＧ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上記を参照されたい）
。Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０
に記載されている通りに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を行った。

【００６６】ウシの酵素と同様に、組換えＤＡＮは、リン酸荷電の中和に依存する２つの異
なる反応条件下で活性がある。塩の非存在下では、その活性はスペルミジンの存
在に完全に依存し、最適濃度は１ｍＭである。これらの条件下において、組換
えＤＡＮの比活性（７９０００Ｕ／ｍｇ）は精製ウシＤＡＮの活性（１１００
００Ｕ／ｍｇ）と有意に異ならない。スペルミジンの存在下では、ＤＡＮの活
性は塩により阻害される。スペルミジンの非存在下では、該酵素活性は塩に依存
し、最適濃度は１５０ｍＭ酢酸カリウムである。ウシＤＡＮはこれらの条件
下で同様の様式で作用する。しかし、これらの条件下で、組換えタンパク質の比
活性（９６０Ｕ／ｍｇ）は、子ウシ胸腺から精製された酵素の比活性（８０７
０Ｕ／ｍｇ）より低い。この相違は、翻訳後修飾により、またはウシ酵素の調
製物中に存在する汚染タンパク質により、説明することが可能である。

【００６７】キャップ化ポリアデニル化ＲＮＡを、塩の存在下でＤＡＮ調製物とインキュベ
ーションすると、ポリ（Ａ）テールは分解し、そして完全に脱アデニル化された
ＲＮＡが一過的に集積した（図３）。ＰＡＢＩの存在下でアッセイを行うと、そ
の活性は部分的に阻害され、そしてポリ（Ａ）テールの段階的な分解が観察され
た。主な分解産物の長さはおよそ３０ヌクレオチド異なり、これは明らかにＰＡ
ＢＩ結合により生じた現象である。これらの結果はウシタンパク質に対し行われ
た研究（Ｋｏｒｎｅｒ，Ｃｈｒ．＆Ｗａｈｌｅ，Ｅ．（１９９７）、上
記を参照されたい）と一致する。これらの結果を組み合わせると、組換えタンパ
ク質がポリ（Ａ）特異的３’−エキソリボヌクレアーゼであることが立証される
。７．ウェスタンブロット解析ウェスタンブロット解析は、以下のように行った：タンパク質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分画化し、そして半乾燥法（Ｋｙｓｅ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ、１９８４
）を用い、ニトロセルロース膜に移した。５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳を含むＴＮＴ
緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０５％
（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）中でブロット（ｂｌｏｔｓ）をイ
ンキュベーションした。抗血清を用いたインキュベーションおよび洗浄段階に、
同じ緩衝液を用いた。ブロットを抗体と、室温で２−３時間インキュベーション
し、そしてその後、洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫ
Ｏ．Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）および化学発光染色（ＳｕｐｅｒＳｉｇ
ｎａｌキット、Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、結合した抗体を検出した。

【００６８】解析により、ＤＡＮのＣ末端断片に対して生成されたウサギ抗体は、部分的に
精製された分画からＤＡＮを沈澱させることが可能であることが立証される。該
抗体はウェスタンブロットにおいて、ウシおよびヒトＤＡＮの両方を認識する（
図４）。この実験において、組換えＤＡＮは、ＨｅＬａ細胞から得たＳＤＳ溶解
物中の酵素より幾分大きいようであり、これは該配列へのタグ（１００４Ｄａ
）の導入により説明することが可能である。ｃＤＮＡ配列中の最初のＡＵＧが用
いられた開始コドンでなかったとしたら、ＨｅＬａ細胞由来の天然ＤＡＮは、タ
グ化組換えタンパク質より、少なくとも１２６０Ｄａ大きくなければならなっ
かったはずであろう。これらの結果もまた、ｃＤＮＡクローンにおける最初のＡ
ＵＧ配列がｉｎｖｉｖｏで開始コドンとして用いられることを確認する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＤＡＮのＭｏｎｏＱの溶出プロフィール（図３Ａ）およびＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（図１Ｂおよび１Ｃ）を示す。

【図２】組換えヒトＤＡＮおよび天然ウシＤＡＮのウェスタンブロットを示す。

【図３】ｍＲＮＡの脱アデニル化、脱アデニル化ＲＮＡの集積およびＰＡＢＩの影響を
示す。

【図４】本発明のヒトＤＡＮと既知のヌクレアーゼの比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/34 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ４Ｃ０８５ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/54 (72)発明者ケルナー，クリストフドイツ連邦共和国デー−80538 ミュンヘン，カロリネン・シュトラーセ３ (72)発明者ヴァール，エルマードイツ連邦共和国デー−35435 ヴァッテンベルク，アン・デル・フェルス 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA11 BA44 CA01 GA11 HA14 HA15 HA17 4B050 CC03 DD11 FF05E FF11E FF14E LL01 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ34 QQ42 QQ53 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QR55 QS15 QS28 QS33 QS34 QX02 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 CE02 CE06 CE07 CE11 CE12 DA01 DA05 DA08 DA14 DA15 4C084 AA07 AA13 DC22 NA14 ZA021 ZA022 ZA161 ZA162 ZA451 ZA452 ZA892 ZA962 ZA972 ZB022 ZB081 ZB082 ZB132 ZB152 ZB261 ZB262 ZB352 ZC352 4C085 AA13 AA14 AA38 BB11 EE01 EE06 FF24

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１１が本請求項の一部であり、配列番号１１に示
される通りのアミノ酸配列を有するヒト脱アデニル化ヌクレアーゼ（ＤＡＮ）を
コードする核酸またはその機能する変異体、および少なくとも８ヌクレオチドを
有するその一部分。
【請求項２】ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは二本鎖ＤＮＡである、請
求項１に記載の核酸。
【請求項３】配列番号１２が本請求項の一部であり、核酸が配列番号１
２の５８位から１９７７位までに示される通りの核酸配列を有するＤＮＡである
、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】核酸が１つまたはそれ以上の非コード配列および／または
ポリＡ配列を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】核酸がベクター、好ましくは発現ベクターまたは遺伝子治
療に有効であるベクターに含まれる、請求項１−４のいずれか１項に記載の核酸
。
【請求項６】核酸が化学的に合成されるか、またはプローブを用い遺伝
子ライブラリーから単離される、請求項１−４のいずれか１項記載の核酸を調製
するための方法。
【請求項７】配列番号１１に示される通りのアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドまたはその機能する変異体、および少なくとも６アミノ酸を有するその
一部分。
【請求項８】請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸が適切な宿主細
胞で発現される、請求項７に請求のポリペプチドを調製するための方法。
【請求項９】請求項７に記載のポリペプチドに対して向けられる抗体。
【請求項１０】哺乳動物を請求項７に記載のポリペプチドで免疫化し、そ
して適切な場合、生じた抗体を単離する、請求項９に記載の抗体を調製するため
の方法。
【請求項１１】請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸または請求項７
に記載のポリペプチド、および適切な場合、薬学的に許容しうる添加剤および／
またはアジュバントを含む医薬。
【請求項１２】癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リウ
マチ、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまたは
ＩＶ型アレルギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および慢
性感染性疾患および／または糖尿病を治療するための、および／または細胞の代
謝、特に免疫抑制と関連した、特に移植と関連した前記代謝に影響を及ぼすため
の医薬を製造するための方法であって、請求項１−５のいずれか１項に記載の核
酸または請求項７に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の抗体を、薬学的
に許容しうる添加剤および／またはアジュバントと共に処方する、前記方法。
【請求項１３】請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸または請求項７
に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の抗体、および適切な場合、適切な
添加剤および／またはアジュバントを含む診断剤。
【請求項１４】癌、自己免疫疾患、特に多発性硬化症または慢性関節リウ
マチ、アルツハイマー病、アレルギー、特に神経皮膚炎、Ｉ型アレルギーまたは
ＩＶ型アレルギー、関節症、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、急性および慢
性感染性疾患および／または糖尿病を診断するための、および／または細胞の代
謝、特に免疫状態、特に移植と関連した前記代謝を解析するための診断剤を調製
するための方法であって、薬学的に許容しうる賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を
請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸または請求項７に記載のポリペプチド
または請求項９に記載の抗体に添加する、前記方法。
【請求項１５】請求項１−５のいずれか１項に記載の核酸または請求項７
に記載のポリペプチドまたは請求項９に記載の抗体、および適切な場合、適切な
添加剤および／またはアジュバントを含む、機能上の相互作用因子を同定するた
めの試験。
【請求項１６】機能上の相互作用因子を同定するための、請求項１−５の
いずれか１項に記載の核酸または請求項７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１７】ヒトＤＡＮの変異体を発見するための、請求項１−５のい
ずれか１項に記載の核酸の使用であって、遺伝子ライブラリーを前記核酸でスク
リーニングし、そして発見された変異体を単離する、前記使用。
【請求項１８】核酸、特にｍＲＮＡのポリ（Ａ）特異的分解のための、請
求項７に記載のポリペプチドの使用。