JP2002509715A

JP2002509715A - 刺激された単球に由来する細胞、その調製及び用途

Info

Publication number: JP2002509715A
Application number: JP2000541279A
Authority: JP
Inventors: バルトラン，ジャック; ショクリ，モアメ; ラトゥール，ナタリー
Original assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Current assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Priority date: 1998-03-30
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2002-04-02
Also published as: WO1999050391A1; CA2320491A1; EP1066370A1; AU773561B2; US6399372B1; AU3601399A

Abstract

(57)【要約】本発明は、（１）通常の単球由来細胞に比べての増加した、例えばＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）の放出、及び通常の単球由来細胞に比べての増加した、例えばＣＤ１αの、その膜上での存在、並びに／或いは（２）その核内での、単球由来細胞の分裂の不在下で組み込まれている、少なくとも１種類の外因性核酸の存在という特徴を示す、刺激された単球由来細胞に関する。これらの刺激された単球由来細胞は、製剤組成物の活性物質となることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、刺激された単球に由来する細胞、その調製法、及びそれを含有する
製剤組成物に関する。

【０００２】（従来の技術の説明）マクロファージが創傷及び組織の修復に基本的な役割を有することが、確立さ
れて久しい〔例えば、Wong & Wahl, Inflammation and repair, in Handbook of
Exp. Pharmacol. 95:509-548, 1990を参照されたい〕。それらは、治癒のインデューサー及びレギュレーターであり；血管形成を支援し、創傷修復を完了する
ことになる細胞を動員する。組織が損傷された後（火傷、潰瘍、創傷、外傷、粘
膜破損、梗塞、又は再建外科手術でさえ）、コールされたマクロファージは、死
細胞が形成した壊死砕片の（食作用及びタンパク質分解による）排除によって、
創傷を局所的に浄化する。同時に、マクロファージは、この食作用によって局所
的に活性化されて、成長因子、モノカイン及びケモカインを能動的に放出する。
これらの自家因子は、周囲の細胞を刺激して、増加させ、創傷に向かって移動さ
せ、死細胞に取って代わる。

【０００３】マクロファージは、抗腫瘍応答に主要な役割を果たし、そして癌細胞に対抗し
て免疫学的活性化因子によって活性化されることができる（Adams, D. & Hamilt
on, T.: "Activation of macrophages for tumor cell kill: effector mechani
sm and regulation"; in Heppner & Fulton (eds.), Macrophages and cancer,
CRC Press, 1988, p.27; Fidler, M. Macrophages and metastases. A biologic
al approach to cancer therapy, Cancer Res., 45:4714, 1985）。

【０００４】更に、マクロファージ、又は単球にか若しくは前駆細胞に由来するその他の細
胞は、その強いエンドサイトーシス、消化及び表面抗原提示の能力により、特異
的な免疫応答を誘発することができる。このように、それらは、ワクチンの製造
、より具体的には、細胞性自家ワクチンの製造の優れた候補を意味する。

【０００５】単球由来細胞（ＭＤＣ）は、付着性でなく、通気性のプラスチック又はテフロ
ンの袋内で、血中単核細胞を、Ｏ2／ＣＯ2雰囲気で、３７℃で５〜１０日間培養
することによって得られるような、免疫細胞である。その培地（ＲＰＭＩ、ＩＭ
ＤＭ、ＡＩＭ５（Gibco）又はＸ−ＶＩＶＯ（Biowhittaker））は、ヨーロッパ特許第93/01232号、国際公開特許第94/26875号若しくはヨーロッパ特許第97/027
03号公報、又は

【０００６】 "Autologous lymphocytes prevent the death of monocytes in culture and
promote, as do GM-CSF, IL-3 and M-CSF, their differentiation into macrop
hages". (Lopez, M., Martinache Ch., Canepa, S., Chokri, M., Scotto, F; B
artholeyns J. J. of Immunological methods, 159:29-38, 1993)； "Immune therapy with macrophages: Present status and critical requirem
ents for implementation" (Barthleyns J., Romet-Lemonne J-L., Chokri M.,
Lopez M.; Immunobiol., 195:550-562, 1996)； "in vitro generation of CD83+ human blood dendritic cells for active t
umor immunotherapy" (Thurnher M., Papesh C., Ramoner R., Gastlt G., and
al.: Experimental Hematology, 25:232-237, 1997)； "Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors
" (Schuler G. & Steinman R. M.; J. Exp. Med., 186:1183-1187,1997) の論文で定義されたサイトカイン若しくはリガンドを結果的に含有する。

【０００７】これらの特許出願及び論文は、すべて、引用により本明細書に包含される。

【０００８】それらを、培養の終わりにＩＮＦ−γによって活性化することができ、特に細
胞障害性マクロファージを得ることができる。これを遠心分離して、濃縮し、精
製してから、等張液に再懸濁させることができる。

【０００９】単球由来細胞（ＭＤＣ）は、分化の条件によって、キラーマクロファージ、貪
食性細胞、成長因子及びサイトカイン放出細胞、又は樹状細胞のいずれかである
ことができる。樹状細胞は、例えば、"in vitro generation of CD83+ human bl
ood dendritic cells for active tumor immunotherapy" (Thurnher M., Papesh
C., Ramoner R., Gastlt G., and al.: Experimental Hematology, 25:232-237
, 1997)、及び"Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistanc
e to tumors" (Schuler G. & Steinman R. M.; J. Exp. Med., 186:1183-1187,1
997)、並びにヨーロッパ特許第97/02703号公報に記載のとおりに得ることができ
る。

【００１０】成熟樹状細胞は、免疫応答を開始するための非常に強力な抗原提示細胞である
。樹状細胞は、Ｔ細胞増殖の誘導、及びその表現型（その膜上でのＣＤ８０、Ｃ
Ｄ８６、ＣＤ−８３，ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−IIの存在）によって特徴付けること
ができる。

【００１１】樹状細胞は、重要な役割を果たすが、特に、多種類のサイトカインの存在が必
要とされるため、治療目的に必要な、大量を得ることが困難である。その上、標
準的手順に従って得られる樹状細胞は、刺激されておらず、そのため、直接の抗
腫瘍又は組織修復特性を提示しない。

【００１２】本発明の目的の一つは、従来記載された単球由来細胞に比べたとき、上記の増
強された生物学的活性を有する、刺激された単球由来細胞を提供することである
。

【００１３】本発明のもう１つの目的は、該刺激された単球由来細胞の製造法を提供するこ
とである。

【００１４】本発明のもう１つの目的は、該刺激された単球由来細胞を含有する新規な製剤
組成物を提供することである。

【００１５】本発明のもう１つの目的は、組織損傷の新規な治療法を提供することである。

【００１６】本発明のもう１つの目的は、腫瘍又は感染性（細菌若しくはウイルス）疾患に
対する、治療又は予防接種の新規な方法を提供することである。

【００１７】本発明のもう１つの目的は、遺伝子療法の新規な方法を提供することである。

【００１８】本発明は、下記の特徴、すなわち、（１）−下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、・ＩＧＦ１（インスリン成長因子）、・ＭＤＧＦ（マクロファージ由来成長因子）、・ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、・ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモンの少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、並びに／又は、（２）単球由来細胞核内における、その分裂の不在下で組み込まれている、少な
くとも１種類の外因性核酸の存在を示す、刺激された単球由来細胞に関する。

【００１９】正常単球由来細胞の発現は、規定された培地でか、又はサイトカインの存在下
で培養された、特定のストレスを受けていない単球に相当し、それゆえ上昇した
レベルの免疫刺激性タンパク質若しくは化合物を放出せず、そして、その膜上で
顕著に上昇したレベルのＭＨＣ及びアクセサリー分子を同時に発現しない。

【００２０】ＮＯは、通常、ＮＯシンターゼ抑制のため放出されないが、本発明の場合は、
ＮＯシンターゼが脱阻害されて、ＮＯの放出を生じる。

【００２１】単球由来細胞は、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ及びもう１つのサイトカイン、例えば
ＩＬ−４又はＩＬ−１３の存在下で、精製され培養された血液由来単球から得る
ことができる。

【００２２】本発明は、より詳しくは、放出されるポリペプチド、タンパク質及び化合物が
表１に列挙されたものである、上記の刺激された単球由来細胞に関する。

【００２３】好都合な実施態様によれば、活性化マーカーは、少なくとも約１，０００分子
／細胞の量で存在する。

【００２４】これは、フローサイトメトリーによって測定することができる。

【００２５】本発明の特定の実施態様では、上記の単球由来細胞は、問題の薬物、タンパク
質、成長因子のような外因性化合物をその細胞質中に含有する。

【００２６】もう１つの実施態様では、上記の単球由来細胞は、問題のタンパク質をコード
する外因性ＤＮＡをその細胞質中に含有する。

【００２７】物理的ストレスの性質に応じて、該単球由来細胞の細胞質中に含有されるＤＮ
Ａが、物理的ストレスの後に細胞質中に残存するか、又は物理的ストレスが可能
にする、その核による該外因性ＤＮＡの取込みが存在するかのいずれかであるこ
とを明確にしなければならない。

【００２８】物理的に刺激された、本発明の単球由来細胞は、導入された抗原、上昇した膜
レベルのＭＨＣ分子、及びリンパ球と作用し合うアクセサリー分子を同時に発現
し、そして増加した量のＴＨ１型（すなわちＩＬ−１２）サイトカインを放出す
るため、予防接種の目的に特に適する。

【００２９】好都合な実施態様によれば、本発明の刺激された単球由来細胞は、下記の特徴、すなわち、（１）−下記のポリペプチド又はタンパク質、すなわち、・ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、・ＩＧＦ１（インスリン成長因子）、・ＭＤＧＦ（マクロファージ由来成長因子）、・ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、・ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、例えばＨＳＰ７０、ＨＳＰ
９０、ＧＰ９６、・ケモカイン及びモノカイン、例えば、ＩＬ１２及びＩＦＮγ の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在及び／又は（２）単球由来細胞核内に、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在という特徴を示す。

【００３０】本発明の好都合な実施態様によれば、該活性化マーカーは、少なくとも約１，
０００分子／細胞の量で存在する。

【００３１】これは、フローサイトメトリーによって測定することができる。

【００３２】本発明による好都合な刺激された単球由来細胞は、下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ケモカイン及びモノカイン、例えば、ＩＬ１２及びＩＦＮγ ・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモンの少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、の特徴の少なくとも１つを示す。

【００３３】本発明の好都合な実施態様によれば、上記のポリペプチド、タンパク質又は化
合物は、約１pg／細胞／時より高率の量で存在し、活性化マーカーは、約１０³ 〜約１０⁵分子／細胞の範囲で存在する。

【００３４】これは、フローサイトメトリーによって測定することができる。

【００３５】本発明の好都合な刺激された単球由来細胞は、下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での増加した存
在を示す。

【００３６】本発明の好都合な実施態様によれば、上記のポリペプチド、タンパク質又は化
合物は、約１pg／細胞／時より高率の量で存在し、活性化マーカーは、約１０³ 〜約１０⁵分子／細胞の範囲で存在する。

【００３７】これは、フローサイトメトリーによって測定することができる。

【００３８】本発明は、より詳しくは、刺激された単球由来細胞であって、少なくとも１種
類の外因性核酸が、単球由来細胞の分裂の不在下でその核内に組み込まれた特徴
のある単球由来細胞に関する。

【００３９】細胞核内の外因性核酸のウイルスによらない手法による移入は、急速に分裂す
る細胞内で効果的に達成できることに気付くべきである。単球由来細胞のような
分裂しない細胞では、外因性核酸は、空胞又は細胞質内に内在化されるが、内因
性核酸への組込み及びコードされたペプチドの、非常に少ない発現が生ずる（＜
５％）。本発明の物理的刺激は、内在化された外因性核酸の細胞質から核への移
動を可能にし、そのため、導入遺伝子の発現の増加を可能にする。

【００４０】本発明による好都合な刺激された単球由来細胞は、下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、及び、単球由来細胞の核内での、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在を示す。

【００４１】本発明の好都合な実施態様によれば、上記のポリペプチド、タンパク質又は化
合物は、約１pg／細胞／時より多い量で存在し、活性化マーカーは、約１０³〜約１０⁵分子／細胞の範囲で存在する。

【００４２】これは、フローサイトメトリーによって測定することができる。

【００４３】本発明の好都合な刺激された単球由来細胞は、下記の特徴、すなわち、下記のポリペプチド又はタンパク質、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、及びＣＤ４０、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、及び −単球由来細胞の核内での、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在を示す。

【００４４】本発明の好都合な実施態様によれば、上記のポリペプチド、タンパク質又は化
合物は、約１pg／細胞／時より高率の量で存在し、上記の活性化マーカーは、約
１０³〜約１０⁵分子／細胞の範囲で存在する。

【００４５】ポリペプチド、タンパク質又は化合物の量は、ＥＬＩＳＡ法によって測定する
ことができ、膜活性化マーカーの数は、フローサイトメトリーによって測定する
ことができる。

【００４６】本発明は、単球由来細胞を調製する方法であって、該単球由来細胞を物理的手
段：例えば、熱ストレス（４０℃〜５０℃で少なくとも３０分間加熱すること）
、圧力変化（約１バール（１０⁵Ｐａ）〜約０．０５バールへ、、又は約１バールから約１０バールへ）、マイクロウェーブ、電気ショック（約２５０mVで約１
〜約１０秒間）、又はエレクトロパルセーションによって刺激する工程を含む方
法にも関する。

【００４７】熱ストレス又は熱ショックは、"Differential induction of stress proteins
and functional effects of heat shock in human phagocytes." (Polla B.S.,
Stubbe H., Kantengwa S., Maridonneau-Parini I., Jacquier-Sarlin M.R. -
Inflammation, 19:363-378, 1995)、又は "Stress-inducible cellular respons
es" (Feige U., Morimoto R.I., Yahara I., Polla B.S. - Birkhaeuser Verlag
(Basel, Boston, Berlin), 492p., 1996)に記載されたとおりに加える。

【００４８】マイクロウェーブは、５００〜７５０ワット（５秒〜５分）、１〜５回反復の
条件下で加える。

【００４９】エレクトロパルセーション（例えば、０．３〜０．８kV／cmで５ミリ秒の５〜
１０個の矩形電気パルス）は、核孔によっての細胞質からのイオンや核酸及び／
又はタンパク質輸送体の流動を可能にする。この正の流動は、パルセーション後
に停止し、そして外因性核酸が核ＤＮＡに組み込まれる（"Specific electroper
meabilization of leucocytes in a blood sample and application to large v
olumes of cells"; S. Sixou and J. Teissie; Elsevier, Biochimica et Bioph
ysica Acta. 1028:154-160, 1990）。

【００５０】電気ショックは、"Control by Pulse Parameters of Electric Field-Mediate
d Gene Transfer in Mammalian Cells" (Hendrick W. et al., Biophysical Jou
rnal, Vol. 66:524-531, February 1994)に記載のとおりに与える。

【００５１】本発明の刺激された単球由来細胞を調製する方法は、 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血液由来単核細胞を直
接回収し、次いで、必要ならば遠心分離によって、赤血球、顆粒球及び血小板の
実質的部分を除去し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＡＩＭ
−Ｖ、ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ型）に１０⁶〜２×１０⁷細胞／ml再懸濁させ、サイ
トカイン及び／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の袋
内での、Ｏ₂／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由来
細胞、及び混入するリンパ球を得る方法に従って単球由来細胞を調製すること； −該単球由来細胞を物理的手段、例えば、熱ストレス(４０〜５０℃で少なくとも３０分間加熱すること)、圧力変化（約１バールから約０．０５バールへ、、又は約１バールから約１０バール）、マイクロウェーブ、電気ショック（約２５
０mVで約１〜約１０秒間）、又はエレクトロパルセーションによって、上記の特
徴を誘導するに十分な時間刺激することを含む。

【００５２】該単球由来細胞の刺激は、該単球由来細胞の成熟を生じる化学物質を用いて達
成することもでき、上記のような増大した刺激をもたらす。好都合な化学物質は
、細胞を内因的に活性化する（ストレスシグナル）ＩＦＮの単球由来細胞による
産生の原因となるそれである。このＩＦＮ誘導は、二本鎖ＲＮＡ（例えばポリＩ
Ｃ）（ポリイノシン−ポリシチジル酸）によってか、或いは細菌若しくはミコバ
クテリア抽出物、特に細菌型ＤＮＡ、又は対応する天然のか、若しくは化学的に
修飾されたオリゴヌクレオチドによって、生成することができる。

【００５３】本発明は、 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血液由来単核細胞を直
接回収し、次いで、必要ならば、遠心分離によって、赤血球、顆粒球及び血小板
の実質的部分を排除し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＲＰＭ
Ｉ又はＩＭＤＭ型）で１０⁶〜２×１０⁷細胞／ml再懸濁させ、サイトカイン及び
／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の袋内での、Ｏ₂ ／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由来細胞、及び混入するリンパ球を得る方法にしたがって単球由来細胞を調製すること、 −該単球由来細胞を、二本鎖ＲＮＡ、或いは細菌若しくはマイコバクテリア抽出
物、特に細菌型ＤＮＡ、又は対応する天然のか、若しくは化学的に修飾されたオ
リゴヌクレオチドのような、外因性ＩＦＮ産生を誘導する化学物質の添加による
刺激を含む、刺激された単球由来細胞を調製する方法にも関する。

【００５４】単球の培養及び分化の際に単球由来細胞に混入するリンパ球の存在は、パラ分
泌細胞性の相互作用による刺激及び細胞回収の、より優れた制御を可能にするこ
とに留意しなければならない。

【００５５】リンパ球は、製造の終わりに、刺激された単球由来細胞から分離する。

【００５６】単球由来細胞は、例えば、ヨーロッパ特許第93/01232号、国際公開特許第94/2
6875号又はヨーロッパ特許第97/02703号公報に記載のような方法、又は"Autolog
ous lymphocytes prevent the death of monocytes in culture and promote, a
s do GM-CSF, IL-3 and M-CSF, their differentiation into macrophages". (L
opez M., Marinache Ch., Canepa S., Chokri M., Scotto F., Bartholeyns J.;
J. of Immunological Methods, 159:29-38, 1993)； "Immune therapy with macrophages: Present status and critical requirem
ents for implementation" (Bartholeyns J., Romet-Lemonne J-L., Chokri M.,
Lopez M.; Immunobiol., 195:550-562, 1996)； "In vitro generation of CD83+ human blood dendritic cells for active t
umor immunotherapy" (Thurnher M., Papesh C., Ramoner R., Gastlt G. and a
l.; Experimental Hematology, 25:232-237, 1997)； "Dendritic cells as adjuvants for immune-mediated resistance to tumors
" (Schuler G. and Steinman R. M.; J. Exp. Med., 186:1183-1187, 1997) の論文に記載の方法に従って調製することができる。

【００５７】単球由来細胞、及び混入しているリンパ球を、薬物、タンパク質又は抗原の存
在下で、該単球由来細胞及び混入リンパ球を２〜２４時間培養して、これらの化
合物を該単球由来細胞に内在化することによって、薬物、タンパク質又は抗原を
内在化するように処理することができる。

【００５８】本発明の特定の実施態様では、上記の方法は、刺激の工程の前に、単球由来細
胞に問題の薬物、タンパク質、成長因子のような外因性化合物を（例えば、飲作
用、特定の凝集体の食作用、拡散によって）、又は問題のタンパク質をコードす
るＤＮＡを（すなわち、ＤＮＡプラスミドでか、グリコシル化されたポリリシン
−ＤＮＡに対する糖受容体介在取込みによってか、又は脂質−ＤＮＡ摂取によっ
て）担荷させることを含む。次いで、装填された単球由来細胞を、上記のような
物理的手段によって、より詳しくは（例えばＤＮＡに挿入できるところで）装填
された外因性化合物の細胞質から核への輸送を生じるエレクトロパルセーション
によって、刺激する。

【００５９】本発明の方法は、好都合な実施態様では、刺激の工程の後、刺激された単球由
来細胞を、細胞の保存を可能にする温度、例えば４℃で遠心分離し、例えば自己
血清を含有する等張培地に、再懸濁させる追加の工程を含む。

【００６０】本発明の方法は、もう１つの好都合な実施態様によれば、刺激の工程の後、 −刺激された単球由来細胞を、細胞の保存を可能にする温度、例えば４℃で遠心
分離、そして、例えば、自己血清を含有する等張培地での再懸濁、及び −先行工程で得られた刺激された単球由来細胞のアリコートを、ポリエチレング
リコール、グリセリン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような凍結保存剤
を加えて、少なくとも−８０℃の温度で凍結させることの追加の工程を含む。

【００６１】好都合な実施態様によれば、本発明による刺激された単球由来細胞を調製する
方法は、 −このように得られた単球由来細胞に、そのマンノース及び／若しくはＦｃ受
容体を標的とするエンドサイトーシスによってか、又は高分子核酸凝集体の飲作
用を介して外因性核酸を担荷させること、及び −先行工程で得られた単球由来細胞を、エレクトロパルセーション、例えば、約
０．３〜約１kV／cmで約５ミリ秒の約１〜約１０パルスのような物理的ストレス
に付して、核への外因性核酸の細胞内伝達、及び核のＤＮＡへの組込みを可能に
することを含む。

【００６２】本発明のもう１つの好都合な実施態様によれば、刺激された単球由来細胞を調
製する方法は、 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血液由来単核細胞を直
接回収し、次いで、必要ならば、遠心分離によって、赤血球、顆粒球及び血小板
の実質的部分を排除し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＡＩＭ
−Ｖ、ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ型）に１０⁶〜２×１０⁷細胞／mlで再懸濁させ、サ
イトカイン及び／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の
袋内での、Ｏ₂／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由
来細胞、及び混入するリンパ球を得る方法に従って単球由来細胞を調製する工程、 −このように得られた単球由来細胞に、そのマンノース及び／若しくはＦｃ受容
体を標的とするエンドサイトーシスによってか、又は高分子核酸凝集体の飲作用
を介して外因性核酸を担荷させること、及び −先行工程で得られた単球由来細胞をエレクトロパルセーションのような物理的
ストレスに付して、核への外因性核酸の細胞内伝達、及び核のＤＮＡへの組込み
を可能にすることを含む。

【００６３】本発明の好都合な実施態様によれば、この方法は、エレクトロパルセーション
の工程の後に、刺激された単球由来細胞を、細胞の保存を可能にする温度、例え
ば４℃で遠心分離し、例えば自己血清を含有する等張培地に、再懸濁させる追加
の工程を含む。

【００６４】本発明のもう１つの好都合な実施態様によれば、この方法は、エレクトロパル
セーションの後に、 −刺激された単球由来細胞の、細胞の保存を可能にする温度、例えば、４℃での
遠心分離、そして、例えば、自己血清を含有する等張培地での再懸濁、及び −先行工程で得られた刺激された単球由来細胞のアリコートを、ポリエチレング
リコール、グリセリン、ＤＭＳＯのような凍結保存剤を加えて、少なくとも−８
０℃の温度で凍結させることの追加の工程を含む。

【００６５】本発明は、上記の方法によって得られたような、刺激された単球由来細胞にも
関する。

【００６６】本発明は、物理的ストレスを含む、単球由来細胞をex vivoで刺激する方法にも関する。発生した生物学的効果によって測定されるような、刺激された細胞は
、患者に再注入した後に、in vivoで免疫応答を高める。

【００６７】本発明は、製薬上許容され得る担体と結びつけて、上記の刺激された単球由来
細胞を活性物質として含む製剤組成物にも関する。

【００６８】本発明による好都合な製剤組成物は、無菌の注射可能調製品、又は無菌の局所
調製品の形態である。

【００６９】注射可能調製品では、活性物質は、体重１kgあたり約１０⁷〜約１０¹⁰細胞、特に約１０⁸〜約１０⁹細胞に相当するような量で存在する。局所調製品では、活
性物質は、体表面１cm²あたり約１０⁵〜約１０⁸細胞の量で存在する。

【００７０】特定の実施態様では、単球由来細胞は、１０⁷〜５×１０⁹の用量で、３日〜６
月の間隔で反復的に注射する。

【００７１】注射は、結果的に、最初に局所注射（皮下、筋内、経粘膜、腔内又は組織内）
、次いで、全身注射（静脈内又はリンパ腺内）であることができる。

【００７２】本発明は、処置しようとする病理学的状態に関与する病原体に対して免疫原性
である、ポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性核酸がその核に組込ま
れた、上記の刺激された単球由来細胞を活性物質として含む、ワクチンの形態の
上記の製剤組成物にも関する。

【００７３】本発明は、組織修復の処置のための医薬を製造するための、本発明の刺激され
た単球由来細胞の使用にも関する。

【００７４】本発明は、組織修復の処置の方法であって、上記の刺激された単球由来細胞を
用いることを含む方法にも関する。

【００７５】本発明は、腫瘍若しくは病原菌に対するワクチン、又は患者のポリペプチド若
しくはタンパク質欠乏を処置する医薬を製造するための、本発明の刺激された単
球由来細胞の使用であって、例えば、刺激された単球由来細胞の懸濁液の無菌フ
ラスコの製造、及び損傷部位へのその反復的な局所的適用を含む使用にも関する
。

【００７６】本発明は、腫瘍又は病原菌に対する予防接種の方法であって、本発明の刺激さ
れた単球由来細胞の使用を含み、該刺激された単球由来細胞は、上記の腫瘍又は
病原菌に対して免疫原性であるポリペプチド若しくはタンパク質をコードする外
因性核酸がその核に組み込まれている方法にも関する。

【００７７】本発明は、本発明の刺激された単球由来細胞の使用を含み、該刺激された単球
由来細胞は、患者に欠乏しているポリペプチド又はタンパク質をコードする外因
性核酸がその核に組み込まれている、ex vivoでの遺伝子療法の方法であって、該使用が、例えば、刺激された単球由来細胞の無菌の注射可能懸濁液の製造、並
びにその反復的な全身及び局所注射を含む方法にも関する。

【００７８】本発明は、単球由来細胞を刺激する方法であって、上記の刺激された単球由来
細胞を調製し、患者にインビボで注射して、メディエーターの放出その他の生物
学的効果によって証拠付けられる限りで、免疫系を刺激することを含む方法にも
関する。

【００７９】下記の詳細な説明で、本発明を更に解説することにする。

【００８０】新しい所望する刺激性生物学的活性を誘導するための、物理的処理による単球
由来細胞（ＭＤＣ）のエキソビボストレス付加。

【００８１】ヒトの血液由来単核細胞を、培養袋内で、規定された培地で、エキソビボで増
殖させる。エレクトロパルセーション、４０℃〜５０℃での加熱又は熱ショック
、及びマイクロウェーブのような特定の刺激に付す。これらの処理の強さ及び長
さが、ＭＤＣ（単球由来細胞）が達成する生理学的状況を決定する。

【００８２】物理的処理の前に、分化したＭＤＣは、結局は、薬物、核酸、ポリペプチド、
ケモカイン又は成長因子のような特定の化合物をエンドサイトーシスで摂取して
おり、そして処理しようとするこれらの化合物を装填される、及び／又は必要な
ときは放出される。そのため、それらは、新たな特定の能力をex vivoで獲得しており、次いで、それを、最初の血液単核細胞をアフェレーシスした患者に局所
又は全身的に再注射することによって、治療に活用することができる。こうして
、それ自身活性化された状況にあるストレスを受けたＭＤＣによって人為的に装
填されたか、又は内因的に産生される様々な因子の放出が制御される。

【００８３】方法及び培養条件を開示して、用いられる物理的処理、及び得られる特定のＭ
ＤＣの機能性を説明する。特定の疾病の養子療法に用いられる、これらの細胞の
好都合な効果を説明する。

【００８４】エキソビボで増殖させた単球−マクロファージ又はマクロファージ−樹状細胞
は、次いで、一般的には、ＭＤＣに人為的に装填されているか、又はそれが内因
的に産生する様々な因子の制御された放出を介しての、新たな治療的な刺激能力
を獲得させる目的で、照射、エレクトロパルセーション又は熱ストレスによって
刺激する。

【００８５】単球由来細胞は、血液アフェレーシスからか、又はプラスチック若しくは疎水
性の袋（例えば、エチレンビニルアセタート又はテフロン）内、及び規定された
培地中に末梢血白血球を含む、血液「バフィーコート」（ＰＣＴ特許願第FR96/0
0121号公報を参照されたい）から得られる単核細胞の培養後に、大量（＞１０⁹ ＭＤＣ）に得ることができる。

【００８６】これらのＭＤＣは、培養１週間後に分化している。次いで、これをin vitroで
物理的ストレスに接触させる。

【００８７】本発明では、ストレスは、細胞の物理的環境の乱れ（酸素／ＣＯ²濃度、及び浸透圧の変化、温度変化、電気刺激、マイクロウェーブ、超音波等々）からなり
、それが、イオン流束の一時的変更、細胞内キナーゼ類の活性化、ストレスタン
パク質の刺激、細胞質から核への分子（タンパク質、薬物、核酸）の流動をもた
らす。

【００８８】したがって、刺激されたＭＤＣは、上記のような、新たな特徴を獲得する。

【００８９】表１ストレスを受けた、刺激されたＭＤＣが放出する因子酵素ラジカル酸素リゾチームスーパーオキシド過酸化水素中性プロテアーゼヒドロキシルラジカルプラスミノーゲン活性化因子次亜ハロ化酸コラゲナーゼエラスターゼ生体活性脂質アンギオテンシン転換酵素アラキドン酸代謝物酸加水分解酵素プロスタグランジンＥ２、Ｆ２α プロテアーゼプロスタサイクリンリパーゼトロンボキサンリボヌクレアーゼロイコトリエンＢ４、Ｃ、Ｄ及びＥホスファターゼヒドロキシエイコサテトラエン酸グリコシダーゼ（ＳＲＳ−Ａを包含）スルファターゼ血小板活性化因子アルギナーゼサイトカイン、ホルモン補体化合物内因性発熱物質インターロイキン１α及びβ1 Ｃ１、４、２、３及び５腫瘍壊死因子α 因子Ｂ及びＤ並びにプロペルジンインターフェロンα及びβ1 Ｃ１インヒビターインターロイキン６及び８Ｃ３ｂ不活性化物質及びβ１−Ｈ走化性因子好中球に対する酵素インヒビター（アンチプロテアーゼ）Ｔリンパ球に対する単球に対する α１−抗プロテアーゼ繊維芽細胞に対するプラスミンインヒビター造血コロニー刺激因子 α２−マクログロブリン因子プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター対顆粒球−マクロファージ（ＧＭ−ＣＳＦ）対顆粒球（Ｇ−ＣＳＦ）鉄結合タンパク質及び脂質対マクロファージ（Ｍ−ＣＳＦ）エリスロポエチン酸性イソフェリン成長因子トランスフェリン繊維芽細胞成長因子トランスコバラミンII 「血小板由来成長因子」フィブロネクチン形質転換性成長因子α及びβ ラミニン内皮細胞増殖因子脂質伝達タンパク質ホルモントロンボスポンジン１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３インスリン様活性チモシンＢ４ βエンドルフィン副腎皮質刺激ホルモン

【００９０】実施例以下、継続中の開発及び応用の４例を記載する。

【００９１】（ａ）本発明の特定の実施態様では、ＭＤＣは、高いエンドサイトーシス活性を
有する細胞の培養１週間後に得る。

【００９２】これらのＭＤＣを、４５℃で３０分間加熱を契機として、成長因子、熱ショッ
ク及びストレスタンパク質、ケモカイン、及びモノカインを発現及び放出させる
。ヒト繊維芽細胞、ヒト骨芽細胞の培養体、及びヒト軟骨細胞の培養体に加えら
れたこれらの細胞は、これらの異なる細胞の増殖を刺激する。

【００９３】活性化されたＭＤＣを、アリコートで、−８０℃（１０％ＤＭＳＯ、１０％自
己血清中、又はポリエチレングリコール１０％自己血清中）において凍結し、そ
うして、必要な時に用いる。ポリエチレングリコールの濃度は、アリコートの急
速な解凍後に上昇させて、ゲルに含まれた細胞を得ることができ、傷、又は修復
を要する組織に直接塗布することができる。インビボでは、これらの誘発された
ＭＤＣは、壊死性病変を示す皮膚組織の再生を支援する。

【００９４】３０％グリセリン、２０％自己血清中で解凍されたＭＤＣの大部分は、酸素付
加された条件では少なくとも４８時間、生存度を保持する。１／１の比率で繊維
芽細胞に加えたときは、その増殖を増加させる。ヌードマウスに誘発した皮膚穿
孔病変への１０⁶個のＭＤＣの塗布を用いて、瘢痕形成及び浄化の質に対するこれらのヒトＭＤＣの効果を評価する（組織学）。

【００９５】本発明は、特に、ＭＡＫ Cell Processor（ＰＣＴ特許願第FR96/00121号公報）で調製し、適切な製薬用ゲル調製品に組み込んだ自己マクロファージ又はＭＤ
Ｃの局所塗布によって、皮膚創傷治癒を誘導する効果的な方法を説明する。マク
ロファージは、組織砕片及び混入細菌のエンドサイトーシスを能動的に開始する
。同時に、表皮及び真皮組織の再生、並びに皮膚修復を刺激する、成長因子及び
モノカインを数日／数週間局所的に放出する。これらのモノカイン類は、ＥＬＩ
ＳＡ法によって測定する。

【００９６】本発明の特定の実施態様では、細胞プロセッサで分化させ、回収したＭＤＣを
、グルコース、ポリエチレングリコール又は糖重合体（すなわち、デキストラン
誘導体、ヘパリン又はヘパラン硫酸、マンノース−６−リン酸等々）に再懸濁さ
せる。これらの糖又はポリエチレングリコール重合体は、逐次的使用のためのア
リコートされたマクロファージ調製品の凍結保存を可能とし、局所塗布の後は、
マクロファージが分泌した成長因子を複合体形成によって安定化し、必要に応じ
てそれらを放出する。マクロファージの低温保存には、好都合には、４％自己血
清、及び１０％ＤＭＳＯ又はポリエチレングリコールを用いることができる。

【００９７】もう１つの実施態様では、マクロファージは、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ等々
のような１種類若しくは数種類の成長因子、又はそれらの創傷治癒能力を高める
薬物をex vivoで予め持たせる。

【００９８】特定の実施態様では、自家マクロファージを、良好な製造実施条件下で適切に
分化させた、Mono Mac 6〔Ziegler Heitbrock et al., "Distinct patterns of
differentiation induced in the monocytic cell line Mono Mac 6", J. of Le
ucocyte Biol., Vol. 55, January 1994〕のようなアロジェニックマクロファー
ジ細胞系による療法に置き換える。

【００９９】（ｂ）本発明のもう１つの実施態様では、記載された方法に従って調製されたＭ
ＤＣは、問題の腫瘍抗原を（腫瘍細胞から生成され、特にミトコンドリア及びＤ
ＮＡを含み、ＭＤＣとともに３７℃で４時間培養した、腫瘍アポトーシス体のエ
ンドサイトーシスによって）内在化していて、次いで、物理的ストレスに付す。
抗原（同時にアクセサリー分子及び同時刺激分子として）の誘発された提示のた
めに、特異的なＴ細胞が活性化され、そしてＭＤＣと共培養したときには、実際
に増殖する。リンパ球のin vitro増殖を、混合リンパ球増殖の試験で示す。

【０１００】目的の抗原を提示する細胞周辺の免疫刺激は、ストレスを受けたＭＤＣの存在
下でのＴＨ１型サイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＬ−２）の分泌によっ
て立証される。

【０１０１】目的の抗原に対するワクチン注射は、これらの抗原を持たせストレスを受けた
１００万個のＭＤＣの、マウスでの皮下経路による注射後に示され、マウスは、
強い免疫応答を生じる（抗腫瘍抗体、および抗腫瘍細胞毒性Ｔ細胞の存在）。

【０１０２】（ｃ）本発明の第三の実施態様では、ＭＤＣに、そのマンノース受容体を標的と
する高分子核酸マンノース化ポリリシン凝集体の、３７℃で４時間のエンドサイ
トーシスによって、核酸を持たせる。等張ショ糖培地中の洗浄、及び５００万細
胞／mlでの再懸濁の後、これらの細胞を、短時間のエレクトロパルセーション刺
激（０．５kV／cmで５ミリ秒の５パルス）に付して、細胞質から細胞核への核酸
の細胞内移動、及びＤＮＡへの組込みを可能とする。次いで、これらの細胞を洗
浄し、動物モデルに注射する。ex vivo物理的処理の前の、内在化された核酸がコードするポリペプチドの、細胞発現、及び数週間の局所放出を、ＥＬＩＳＡ及
びＦＡＣＳ分析（蛍光細胞分析）によって立証する。

【０１０３】ポリリシン−ｃＤＮＡの取込みの条件は、０．１μg／ml／１０⁸細胞を３７℃
で４時間、その後、０．３〜０．５kVで５ミリ秒の５矩形パルスである。

【０１０４】非常に効果的なトランスフェクション（発現の≧２０％の効率、及び高い強度
）は、細胞外培地中での問題のタンパク質の延長された発現及び放出を可能とす
る。

【０１０５】この手法は、例えば因子VIII欠乏を有する血友病での因子VIIIの、遺伝子欠乏
の治療のための長く続く置換療法に特に効果的であると判明するものと思われる
。

【０１０６】自家的な方法で注射されたＭＤＣは、治療上問題となる因子の放出が測定でき
る場合、組織内で数ヶ月間生存する。

【０１０７】（ｄ）化学物質による単球由来細胞の刺激ＭＤ−ＡＰＣ（単球由来抗原提示細胞）の成熟及び刺激

【０１０８】材料及び方法ＭＤ−ＡＰＣの発生及び成熟：ＭＤ−ＡＰＣを、アフェレーシスで得られた全ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）か
ら発生させ、そしてＧＭ−ＣＳＦ（５００UI／ml）及びＩＬ−１３（５０ng／ml
）の存在下でのＡＩＭ−Ｖ培地中で培養する。培養の７日目に、二本鎖ＲＮＡ（
d.s.ＲＮＡ）（３０μg／ml）を培養に加え、細胞を更に４８時間インキュベートする。CellQuestというソフトウエア（Becton Dickinson, San Jose, CA）を用い、FACScaliburというサイトフルオメーターでのフローサイトメトリーによって、表現型の特徴付けを実施する。

【０１０９】アロジェニックリンパ球の増殖：マイトマイシン処理したＭＤ−ＡＰＣの段階希釈（１０³〜１０⁵）を、１０⁵ 個の同種レスポンダーＴ細胞の存在下で、４日間培養する。Ｔ細胞の増殖は、Ｂ
ｒｄＵ取込みによって測定する。

【０１１０】結果ＭＤ−ＡＰＣの表現型成熟： d.s.ＲＮＡ処理すると、ＭＤ−ＡＰＣでのＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６の発
現が上昇する。その上ＣＤ８３は、未処理ＭＤ−ＡＰＣには完全に不在であるが
、d.s.ＲＮＡの存在下で培養した細胞の８０％より多くにおいて明らかに発現さ
れる。対照的に、未処理細胞の７０％で発現されるＣＤ１４は、d.s.ＲＮＡで処
理された細胞には不在である。

【０１１１】ＭＤ−ＡＰＣの機能的成熟： d.s.ＲＮＡ処理すると、強い免疫刺激特性を示す未処理ＭＤ−ＡＰＣに比して
、同じレベルのＴ細胞増殖を観察するのに、２０倍少ないＭＤ−ＡＰＣを必要と
する。

【０１１２】サイトカイン分泌：ＭＤ−ＡＰＣによるＩＬ−１２分泌は、培地へのd.s.ＲＮＡの添加後４８時間
に、少なくとも１０〜１００倍増加するが、これはＴＨ１型の免疫応答を支持す
ると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ショクリ，モアメフランス国、エフ−75020 パリ、リュ・アクゾ（ニュメロ10） 69 (72)発明者ラトゥール，ナタリーベルギー国、ベー−1420 ブレヌ・ラルー、リュ・エルネ・ローラン 143 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA01 BA02 BA03 BA19 BA21 BA25 BA27 CA04 DA03 EA04 HA01 HA06 4B065 AA90X AA93X AB01 AC15 AC20 BA02 BB19 BB34 CA24 CA44 4C085 AA03 CC12 4C087 AA01 AA03 BB37 DA19 MA01 MA66 NA14 ZB26 ZB35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の特徴、すなわち、（１）−下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、・ＩＧＦ１（インスリン成長因子）、・ＭＤＧＦ（マクロファージ由来成長因子）、・ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、・ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモンの少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、並びに／又は、（２）単球由来細胞核内における、その分裂の不在下で組み込まれている、少な
くとも１種類の外因性核酸の存在を示す、刺激された単球由来細胞。
【請求項２】下記の特徴、すなわち、（１）−下記のポリペプチド又はタンパク質、すなわち、・ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、・ＩＧＦ１（インスリン成長因子）、・ＭＤＧＦ（マクロファージ由来成長因子）、・ｂＦＧＦ（塩基性繊維芽細胞成長因子）、・ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、例えばＨＳＰ７０、ＨＳＰ
９０、ＧＰ９６、・ケモカイン及びモノカイン、例えば、ＩＬ１２及びＩＦＮγ の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在及び／又は（２）単球由来細胞核内に、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在を示す、請求項１記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項３】活性化マーカーが、少なくとも約１，０００分子／細胞の量
で存在する、請求項１又は２記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項４】下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ケモカイン及びモノカイン、例えば、ＩＬ１２及びＩＦＮγ ・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモンの少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、の特徴の少なくとも１つを示す、刺激された単球由来細胞。
【請求項５】下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での増加した存
在の少なくとも一つを示す、請求項３記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項６】少なくとも１つの外因性核酸が、単球由来細胞の分裂の不在
下でその核内に組み込まれているという特徴を示す、刺激された単球由来細胞。
【請求項７】下記の特徴、すなわち、 −下記のポリペプチド、タンパク質又は化合物、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、・酵素又は酵素阻害剤、・補体成分、・伝達タンパク質、・過酸化物、ＮＯ（亜酸化窒素）、・生体活性脂質、・ホルモン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、又はＣＤ４０、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、及び、単球由来細胞の核内での、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項８】下記の特徴、すなわち、下記のポリペプチド又はタンパク質、すなわち、・ＰＤＧＦ、・ＩＧＦ１、・ＭＤＧＦ、・ｂＦＧＦ、・ＧＭ−ＣＳＦ、・熱ショックタンパク質又はストレスタンパク質、・ＩＬ１２及びＩＦＮγのような、ケモカイン及びモノカイン、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、増加された放出、及び −下記の活性化マーカー、すなわち、ＣＤ１α、ＣＤ１１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８
３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスII分子、アドヘシン、若しくは
ＩＣＡＭのような免疫刺激のためのアクセサリー分子、及びＣＤ４０、の少なくとも１つの、通常の単球由来細胞に比べての、その膜上での、増加した
存在、及び −単球由来細胞の核内での、その分裂の不在下で組み込まれた、少なくとも１種
類の外因性核酸の存在を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項９】ポリペプチド、タンパク質又は化合物が、約１pg／細胞／時
より多い量で放出され、活性化マーカーが、約１０³〜約１０⁵分子／細胞の範囲
で存在する、請求項４、５、７又は８記載の刺激された単球由来細胞。
【請求項１０】刺激された単球由来細胞を調製する方法であって、該単球
由来細胞を物理的手段、例えば、熱ストレス(４０℃〜５０℃で少なくとも３０分間加熱すること)、圧力変化（約１バール（１０⁵Ｐａ）から約０．０５バール
へ、又は約１バールから約１０バールへ）、マイクロウェーブ、電気ショック（
約２５０mVで約１〜約１０秒間）、又はエレクトロパルセーションによって刺激
する工程を含む方法。
【請求項１１】刺激された単球由来細胞を調製する方法であって、 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血液由来単核細胞を直
接回収し、次いで、必要ならば遠心分離によって、赤血球、顆粒球及び血小板の
実質的部分を除去し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＡＩＭ
−Ｖ、ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ型）に１０⁶〜２×１０⁷細胞／ml再懸濁させ、サイ
トカイン及び／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の袋
内での、Ｏ₂／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由来
細胞、及び混入するリンパ球を得る方法に従って単球由来細胞を調製すること； −該単球由来細胞を物理的手段、例えば、熱ストレス(４０℃〜５０℃で少なくとも３０分間加熱すること)、圧力変化（約１バールから約０．０５バールへ、又は約１バールから約１０バールへ）、マイクロウェーブ、電気ショック（約２
５０mVで約１〜約１０秒間）、又はエレクトロパルセーションによって刺激して
、上記の特徴を誘導することを含む方法。
【請求項１２】刺激された単球由来細胞を調製する方法であって、 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血液由来単核細胞を直
接回収し、次いで、必要ならば、遠心分離によって、赤血球、顆粒球及び血小板
の実質的部分を排除し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＲＰＭ
Ｉ又はＩＭＤＭ型）で１０⁶〜２×１０⁷細胞／ml再懸濁させ、サイトカイン及び
／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の袋内での、Ｏ₂ ／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由来細胞、及び混入するリンパ球を得る方法にしたがって単球由来細胞を調製すること、 −該単球由来細胞を、二本鎖ＲＮＡ、或いは細菌若しくはマイコバクテリア抽出
物、特に細菌型ＤＮＡ、又は対応する天然のか、若しくは化学的に修飾されたオ
リゴヌクレオチドのような、外因性ＩＦＮ産生を誘導する化学物質の添加による
刺激を含む方法。
【請求項１３】刺激する工程の前に、該単球由来細胞及び混入リンパ球を
、薬物、タンパク質又は抗原の存在下で２〜２４時間培養し、これらの化合物を
該単球由来細胞内に内在化する工程を含む、請求項１１又は１２記載の刺激され
た単球由来細胞を調製する方法。
【請求項１４】刺激された単球由来細胞を、細胞の保存を可能にする温度
、例えば４℃で遠心分離し、例えば、自己血清を含有する等張培地に、再懸濁さ
せる追加の工程を含む、請求項１１〜１３に記載の刺激された単球由来細胞を調
製する方法。
【請求項１５】 −刺激された単球由来細胞を、細胞の保存を可能にする温
度、例えば４℃で遠心分離、そして、例えば、自己血清を含有する等張培地での
再懸濁、及び −先行工程で得られた刺激された単球由来細胞のアリコートを、ポリエチレング
リコール、グリセリン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような凍結保存剤
を加えて、少なくとも−８０℃の温度で凍結させることの追加の工程を含む、請求項１１〜１４に記載の刺激された単球由来細胞を調製
する方法。
【請求項１６】 −このように得られた単球由来細胞に、そのマンノース及
び／若しくはＦｃ受容体を標的とするエンドサイトーシスによってか、又は高分
子核酸凝集体の飲作用を介して外因性核酸を担荷させること、及び −先行工程で得られた単球由来細胞を、エレクトロパルセーション、例えば、約
０．３〜約１kV／cmで約５ミリ秒の約１〜約１０パルスのような物理的ストレス
に付して、核への外因性核酸の細胞内伝達、及び核のＤＮＡへの組込みを可能に
することを含む、刺激された単球由来細胞を調製する方法。
【請求項１７】 −（１）血液アフェレーシスからか又は血液袋捕集から血
液由来単核細胞を直接回収し、次いで、必要ならば、遠心分離によって、赤血球
、顆粒球及び血小板の実質的部分を排除し、そして末梢血白血球を捕集し、（２）先行工程で得られた末梢血白血球を、例えば遠心分離（血小板、赤血球
及び砕片の９０％を除去するため）によって洗浄して、単核細胞を得、（３）先行工程で得られた全単核球細胞（単球＋リンパ球）を、培地（ＡＩＭ
−Ｖ、ＲＰＭＩ又はＩＭＤＭ型）に１０⁶〜２×１０⁷細胞／mlで再懸濁させ、サ
イトカイン及び／又は自己血清を補完することができ、そして疎水性で通気性の
袋内での、Ｏ₂／ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で５〜１０日間の培養によって、単球由
来細胞、及び混入するリンパ球を得る方法に従って単球由来細胞を調製する工程、 −このように得られた単球由来細胞に、そのマンノース及び／若しくはＦｃ受容
体を標的とするエンドサイトーシスによってか、又は高分子核酸凝集体の飲作用
を介して外因性核酸を担荷させること、及び −先行工程で得られた単球由来細胞をエレクトロパルセーションのような物理的
ストレスに付して、核への外因性核酸の細胞内伝達、及び核のＤＮＡへの組込み
を可能にすることを含む刺激された単球由来細胞を調製する方法。
【請求項１８】担荷させる工程の前に、該単球由来細胞及び混入リンパ球
を、薬物、タンパク質又は抗原の存在下で２〜２４時間培養して、これらの化合
物を該単球由来細胞内に内在化する工程を含む、請求項１７記載の刺激された単
球由来細胞を調製する方法。
【請求項１９】刺激された単球由来細胞を、細胞の保存を可能にする温度
、例えば４℃で遠心分離し、例えば自己血清を含有する等張培地に、再懸濁させ
る追加の工程を含む、請求項１７又は１８記載の刺激された単球由来細胞を調製
する方法。
【請求項２０】 −刺激された単球由来細胞の、細胞の保存を可能にする温
度、例えば、４℃での遠心分離、そして、例えば、自己血清を含有する等張培地
での再懸濁、及び −先行工程で得られた刺激された単球由来細胞のアリコートを、ポリエチレング
リコール、グリセリン、ＤＭＳＯのような凍結保存剤を加えて、少なくとも−８
０℃の温度で凍結させることの追加の工程を含む、請求項１７又は１８に記載の刺激された単球由来細胞を調
製する方法。
【請求項２１】請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法によって得
られたような刺激された単球由来細胞。
【請求項２２】製薬上許容され得る担体と共に、請求項１〜９のいずれか
１項に記載の刺激された単球由来細胞を活性物質として含む製剤組成物。
【請求項２３】無菌の注射可能調製品、又は無菌の局所調製品の形態をな
す、請求項２２記載の製剤組成物。
【請求項２４】処置しようとする病理学的状態に関与する病原体に対して
免疫原性である、ポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性核酸がその核
に組込まれた、請求項１〜３、６〜９のいずれか１項に記載の刺激された単球由
来細胞を活性物質として含む、ワクチンの形態の、請求項２２又は２３のいずれ
か１項に記載の製剤組成物。
【請求項２５】組織の処置のための医薬を製造するための、請求項１〜９
のいずれか１項に記載の刺激された単球由来細胞の使用。
【請求項２６】腫瘍若しくは病原菌に対するワクチンを製造するためか、
又は患者のポリペプチド若しくはタンパク質欠乏を処置する医薬を製造するため
の請求項１〜３、６〜９記載の刺激された単球由来細胞の使用。