JP2002500233A

JP2002500233A - 抗−クリプトコッカルペプチド類

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Publication number: JP2002500233A
Application number: JP2000527559A
Authority: JP
Inventors: ジョージ・アール・ペチット; ロビン・ケー・ペチット
Original assignee: アリゾナボードオブリーゼンツ
Priority date: 1998-01-09
Filing date: 1999-01-08
Publication date: 2002-01-08
Also published as: ATE284412T1; EP1045858A1; EP1045858B1; US6620911B1; CA2315230A1; DE69922484D1; WO1999035164A1; CA2315230C; EP1045858A4

Abstract

(57)【要約】【課題】ここで記載したのは、ドラスタチン１０およびその４個の変異種（ここでは“ペプチド”）をベースとする抗真菌剤および菌類が引き起こす感染症で苦しんでいる患者への治療方法である。【解決手段】ブロスマクロ分析により、これらのペプチドはＡＴＣＣ菌株およびＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの臨床培養をおこない抗真菌物質であることがわかった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのためのｓｐｅｆｉｃｉｔｉｔｙは固形培地ディスクでも証明されさらに抗菌活性は殺菌動態学の実験で確認された。最も有効な変異体のブロスマクロでの最小抑制は０．０９７５−１．５６μｇ／ｍｌ、最小濃度は０．０９７５−１５６μｇ／ｍｌのそれぞれの範囲であった。該最小抑制濃度はヒトの漿液の中でもほとんど同じであったが、低いｐＨでは増加した。この新しい抗真菌剤を使用するための好ましい投薬方法もまた述べられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、一般的に一つ以上の真菌類の病気の治療に関し、特に詳しくは、ド
ラスタチン１０の選ばれた構造変異体が抗真菌薬として著しく有用であることの
発見に関する。この研究は、ＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＤＨＨ
Ｓから授与されたＯｕｔｓｔａｎｄｉｎｇＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒＧｒ
ａｎｔＣＡ４４３４４−０１−０９によって部分的に援助された。米国合衆国
政府はこの発明にある程度の権利を有する。

【０００２】ドラスタチン１０の解明及び分離は、１９８９年３月２８日Ｇ．Ｒ．ＰＥＴＥ
ＩＴに付与された米国特許４，４１６，４４４に記載されているが、ドラスタチ
ン１０の合成に対する努力及びそのある種の修正は米国特許４，９７８，７４４
；５，４１０，０２４；５，５０４，１９１；５，５２１，２８４；５，５３０
，０９７；５，５９９，９０２；５，６３５，４８３；５，６６３，１４９；及
び５，６６５，８６０に記載されている。これらはすべて１９９０〜１９９７間
にＧ．Ｒ．ＰＥＴＥＩＴ等に付与された。上記の引用米国特許の各々からの一般
的バックグラウンド情報はここに一括される。

【０００３】ドラスタチン１０は４個の異形アミノ酸を含む線状ペプチド（化合物１ａ，図
１）で、最初はインド洋産のＤｏｌａｂｅｌｌａａｕｒｉｃｕｌａｒｉａアメ
フラシから単離された（参照：Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ，顕著な海洋動物の抗
ネオプラスチック成分の単離：ドラスタチン１０，ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃ
．１９８７，１０９：６８８３−８５）。ドラスタチン１０の合成（Ｐｅｔｔｉ
ｔｅｔａｌ．，Ｔｈｅａｂｓｏｌｕｔｅｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ
ａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｎａｔｕｒａｌ（−）−ｄｏｌａｓｔａｔ
ｉｎ１０，ＪＡｍＣｈｅｍ１Ｓｏｃ１９８９，１１１：５４６３−
６５；Ｐｅｔｔｉｔｅｔａｌ．，ドラスタチン２４．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ（−）−ｄｏｌａｓｔａｔｉｎ１０．Ｘ−ｒａｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＮ，Ｎ−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｖａｌｙｌ−ｖａｌｙｌ
−ｄｏｌａｉｓｏｌａｕｉｎｅｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｅｓｔｅｒ，ＪＣｈｅ
ｍＳｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓ１１９９６，８５９−６３）、１９
９５年にＩ期の癌の臨床試験の開始で、その強力な抗ネオプラスチックの詳細な
調査が促進された（参照：Ｔｈｅｄｏｌａｓｔａｔｉｎｓ．，Ｉｎ：Ｈｅｒｚ
ｅｔａｌ．，（ｅｄｓ）ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎｔｈｅＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙｏｆＯｒｇａｎｉｃＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ，７０年版ニ
ューヨークＳｐｒｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９９７：１−７９）。該アメフラ
シ誘導体ペプチドドラスタチン１０は現在、Ｉ期およびＩＩ期の癌の臨床試験
にある。哺乳類の細胞において、ドラスタチン１０の細胞内ターゲットはチュー
ビュリンである。ペプチドは、微小管の組み立て及びチュービュリン依存のＧＴ
Ｐ結合を制止し（Ｂａｉｅｔａｌ．，ドラスタチン１０，海産動物から誘導
される強力な細胞増殖抑制ペプチド：チュービュリン重合の阻害はツルニチニチ
草アルカロイド拘束域を調査、ＢｉｏｃｈｅｍＰｈａｒ１ｃｏｌ１９９
０、３９（１２）：１９４１−４９）、そしてチュービュリンへのビンクリスチ
ン結合の非競争的抑制剤である（Ｂａｉｅｔａｌ．，交換可能なヌクレオチ
ド及びツルニチニチ草アルカロイド域の近くのペプチド細胞分裂阻害剤のための
明らかな域でのチュービュリンに対するドラスタチン１０の結合、ＪＢｉｌｏ
Ｃｈｅｍ１９９０年２６５（２８）：１７１４１−４９）。ドラスタチン１０
は広い範囲の動物及びびヒトの癌細胞ラインのメタフェース阻止を起こし、ハツ
カネズミ腫瘍モデルにおいて印象的な活性を示す（参照：Ｐｅｔｉｔｅｔａ
ｌ，１９９７，ｓｕｐｒａ）。さらに、ドラスタチン１０は、確かにヒトのリン
パ腫細胞ラインでのアポトシスを起こす（Ｂｅｃｋｗｉｔｈｅｔａｌ．，海
産物による人間のリンパ腫細胞ラインの成長抑制，ドラスタチン１０および１５
，ＪＮａｔＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ１９９３，８５８（６）４８３−８
８：Ｍａｋｉｅｔａｌ．，ｂｃｌ−２およびＰ−５３の腫瘍蛋白はブリオス
タチン１によって調整することができ、ヒトの中のドラスタチンは大きい細胞リ
ンパ腫を分散する、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ１９９５，：３２９
−９７）。このアポプトティックのメカニズムはその細胞分裂阻止性の効果とは
明らかに無関係である（上記Ｂｅｃｋｗｉｔｈｅｔａｌ．，１９９３；Ｍａ
ｋｉｅｔ．ａｌ．１９９５）。

【０００４】進行した硬い腫瘍を持つ患者の臨床試験においては、２００ｕｇ／ｍ^２までの
最小毒性がある（Ｔｒａｎｅｔａｌ．，Ｐｈａｓｅ１，進行した硬い腫瘍
を持つ大人のにおけるドラスタチン１０のファルマコカイネチック／ファルマコ
ダイナミック研究，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ
ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ１９９７＃２０５６；Ｂａｇｎｉｅｗｗｓｋｉｅｔａ
ｌ．，硬い腫瘍を持つ大人の患者におけるドラスタチン１０のファルマコカイネ
チック，ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏ
ｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳａｎＤｉｅｇ
ｏ，ＣＡ１９９７，＃２０５６；ＭｃＥｌｏｒｙｅｔａｌ．，Ｐｈａｓｅ
１進行した硬い腫瘍を持つ患者におけるドラスタチン１０の試み，Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｏｆＣｌ
ｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ１９９７，＃７８２）
。

【０００５】ドラスタチン１０に対して発見されたチュービュリン結合性は、ドラスタチン
１０もまた抗真菌剤として有用であるかも知れないと考える見解をさらに促進し
た。その努力はドラスタチン１０および４個の特殊な構造のモジフィケイション
（図１）をもたらした。それはＣｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎａ
ｎｓに対して特に活性である所の効力のある特有な抗真菌類物質と一致した。

【０００６】ドラスタチン１０およびその４個の構造モジフィケイションの抗真菌スペクト
ルは評価されここに公表する。肉汁マクロ希釈アッセイにおいて、このペプチド
はＡＴＣＣ株やＣｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの（フルコナゾ
ール抵抗株を含む）臨床単離物に対して殺菌性であったが、試験した他のイース
トや糸状真菌類のいづれにもそうでなかった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの特異
性もまたはに固相ジスクジフュージョンアッセイに表され、そして殺菌活性はキ
リングカイネチック実験において確かめられた。１９個の臨床アイソレートの５
０％および９０％がメチルエステルモディフィケーションによって抑えられた
（ＭＩＣ_５０，ＭＩＣ_９０）ＭＩＣ_ｓはそれぞれ０．１９５ｕμｇ／ｍｌおよび
０．３９ｕｇ／ｍｌであった。このペプチドに対するＭＦＣ_５０（最小殺菌濃度
）は、０．３９μｇ／ｍｌであり、ＭＦＣ_９０は０．７８μｇ／ｍｌであった。
最も有効な肉汁大希釈溶液の濃度の最小抑制及び最小殺菌は、それぞれ０．０９
７５−１．５６μｇ／ｍｌおよび０．０９７５−６．２４μｇ／ｍｌであった。
最小抑制濃度（ＭＩＣｓ）は、ほぼヒトの血漿に等しいが、低いｐＨで増加する
。これらのペプチドはＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのための可能性のある化学療法
薬ではあるが免疫不全患者への感染および死亡を引き起こす厄介な問題をも提供
する。

【０００７】従って、本発明の主な目的は、新しい抗−クリプトコッカルペプチドおよび
その使用方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、ドラスタチン１０の解明と同定及び防カビ剤とし
て使用するためその化学的モジフィケーションを提供することにある。これら及びなおその他の目的は、以下の具体例な詳細な記載から、顕著に予期
しない態様において、本発明によって容易に達成される。

【０００８】抗真菌剤ドラスタチン１０１ａおよびモジフィケーション１ｄ（図１）は別に記載のご
とく合成された（Ｐｅｔｔｉｔｅｅｔａｌ．，１９８９，ｓｕｐｒａ；Ｐｅ
ｔｔｉｔｅｅｔａｌ．，１９９６，ｓｕｐｒａ；Ｐｅｔｔｉｔｅｅｔａ
ｌ．，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃａｇｅｎｔ３６５．ドラスタチン１０
ＳＡＲｐｒｏｂｅｓ，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＤｅｓｉｇｎ
１９９７：Ｉｎｐｒｅｓｓ）。モジフィケーション１ｅの合成はアメリカ特許
５，６６３，１４９（１９９７年９月２日発行）に、そしてモジフィケーション
１ｂおよび１ｃの合成はアメリカ特許出願中のＳＮ＊−＊に記載されている。こ
の化合物はすべての分析より先に直ちに無菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
で再構成された。ＤＭＳＯのみではどんな微生物試験でも抑制効果を検出できな
かった。

【０００９】真菌類の株Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの臨床培養はバージニア大学メディカルセンター
の患者の脳脊髄液、血液、骨髄、唾液、気管支洗浄液および感染した傷から得ら
れた。ｆｌｕｃｏ−ｎａｚｏｌｅに対する臨床上の耐性菌株はＣａｓｅＷｅｓ
ｔｅｒｎＲｅｓｅｒｖｅ大学、ＭｅｄｉｃａｌＭｙｃｏｌｏｇｙセンター
によって得られた（Ｊｅｓｓｕｐ，Ｃ．Ｊ．ｅｔａｌ，１９９７；Ｐｏｓｔｅ
ｒ＃Ｆ−８８，３７ｔｈＩＡＣＣＡ．Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ参照）
。イースト株（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓ＆Ｃ．Ｉａｕｒｅｎｔｉｉのほか）はｐ
Ｈ５．６，３５℃，ＳａｂｏｕｒａｕｄＤｅｘｔｒｏｓｅＡｇａｒ（ＳＤＡ
）で単一コロニー転移により維持された。Ｃｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓａｌｂｉｄ
ｕｓ，Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ及びＣ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ（＃６６０
３３）はＳＤＡ，ｐＨ６．６，２５℃で維持され、Ｃ．ｕｎｉｇｕｔｔｕｌａｔ
ｕｓ（＃３４１４３）及びＣ．ａｔｅｒは２５℃でイーストマーフォロギー（Ｙ
Ｍ）アガー、そして糸状真菌類は３５℃でポテイトデキストロースアガー（ＰＤ
Ａ）で維持された。

【００１０】ディスク拡散感染力テスト抗菌性活性はＮＣＣＬＳ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣ
ｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄａｒｄ，Ｐｅｒｆｏｒｍａ
ｎｃｅＳｔａｎｄａｒｄｆｏｒＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＤｉｓｋ
ＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔｓ−ＳｉｘｔｈＥｄｉｔｉｏｎ：Ａ
ｐｐｒｏｖｅｄｓｔａｎｄａｒｄＭ２−Ａ６，ＮＣＣＬＳ，Ｗａｙｎｅ，Ｐ
Ａ，１９９７）によりディスク拡散感染力テストによって検査された。接種原は
ＳＤＡ肉汁の中に６２５ｎｍでの０．１０の濃度に調整され、ＳＤＡのプレート
に散布された。過剰の湿気は薬剤の２倍の希釈溶液を含む乾燥したデイスクを適
用する前１０分間吸収させた。テストプレートは３５℃（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓお
よびＣ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉでは２５℃）で培養し、抑制ゾーンは４８時間後に
記録された。この最小抑制濃縮（ＭＩＣ）は成長抑制の明らかなゾーンで生じる
薬剤の最低濃縮であることが判明した。Ｓｔａｐｈｙ−ｌｏｃｏｃｃｕｓａｕ
ｒｅｕｓ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのディスク
感応性テストもまた行われた。

【００１１】イーストのブロスマクロ希釈溶液感染性テストドラスタチン１０およびその変異体をＮＣＣＬＳ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｍ
ｍｉｔｔｅｅｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳｔａｎｄ
ａｒｄｓ，ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｆｏｒＢｒｏｔｈＤｉｌｕ
ｔｉｏｎＡｎｔｉ−ｆｕｎｇａｌＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙＴｅｓｔ
ｉｎｇｏｆＹｅａｓｔｓ：ＡｐｐｒｏｖｅｄＳｔａｎｄａｒｄＭ−２７
−Ａ，ＮＣＣＬＳ，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ，１９９７）のブロスマクロ希釈溶液検査
法に従って、イーストで調べた。イーストは最終接種原率０．５−２．５Ｘ１０
^３コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌで得るように懸濁されそして希釈された。
テストは０．１６５Ｍのモルフォリンプロパネスルホン酸（ＭＯＰＳ）−緩衝Ｒ
ＰＭＩ１６４０媒体（ｐＨ７．０）の中にペプチドの希釈溶液が二つ折りで入っ
ている無菌の１２Ｘ７５ｍｍのプラスチックチューブで行うわれた。一方のチ
ューブは濁りを調整するために薬品のない状態にした。チューブは振動させずに
３５℃（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓおよびＣ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉでは２５℃）で
培養された。ＭＩＣｓをＣｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓでは７２時間後、イースト属で
は４８時間後に終えた。該ＭＩＣをテストした生体があらゆる成長を止める化合
物の最低濃度として画定した。

【００１２】糸状真菌のブロスマクロ希釈溶液感染性テストＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＲｈｉｚｏｐｕｓｏｌ
ｉｇｏｓｐｏｒｕｓのブロスマクロ希釈溶液感染性テストは標準的な手順を少し
改良した方法によっておこなわれた（Ｅｓｐｉ−ｎｅｌ−Ｉｎｇｒｏｆｆｅｔ
ａｌ．，糸状真菌の抗真菌感染性テストのための標準的な手順のＭｕｌｔｉｃ
ｅｎｔｅｒ評価ＪＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ１９９７，３５：１３９−
４３）。分生子および胞子嚢柄を形成させるために、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ及
びＲ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓを３５℃６日、ＰＤＡスラントの上で培養した。
真菌のスラントは無菌の０．８５％ＮａＣｌ１ｍｌに浸し、そしてその懸濁液
は無菌のパストゥールピペットの先でコロニーをそっと扱うことによって作られ
た。得られた菌糸残存物および分生子または胞子嚢柄の混合物は回収され、無菌
で透明なミクロフュージチューブに移され、分光光度計で調節され、そして濃
い微粒子は１０分間沈殿させられた。ホモジナイズされた上澄み懸濁液はさらに
無菌のミクロフュージチューブ移され、１５秒間ろ過され、分光光度計で調節
され、そして、無菌の０．１６５ＭＭＯＰＳ−緩衝ＲＰＭＩ１６４０媒体ｐＨ
７．０で０．５−２．５×１０^３ＣＦＵ／ｍｌの範囲に最終接種物がなるよう希
釈された。合成されたペプチドに対する感染性は上述のイースト培養でのブロス
マクロ希釈溶液感染性テストによって決められた。糸状真菌のＭＩＣｓは２４時
間後に読まれた。

【００１３】真菌類を殺すための最小濃度真菌類を殺すための最小濃度（ＭＦＣｓ）はドラグ−フリーＳＤＡプレート上
のＭＩＣブロスマクロ希釈溶液感染性シリーズでの成長がみられない各チューブ
から０．１ｍｌを二次培養することによって決定した。Ｃｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓ
では、３５℃４８時間（Ｃ．ａｌｂｉｄｕｓおよびＣ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉでは
２５℃）、そして、他のすべてのイーストおよび糸状真菌では３５℃２４時間、
このプレートを培養した。このＭＦＣはＳＤＡプレート上の成長を止める薬の最
小濃度として決定した。寄主要因の効果ブロス大希釈溶液感染性テストはｐＨ５，６およひ７でＲＰＭＩとして行われ
た。ＲＰＭＩの中には正常なヒトの漿液（ＬａｍｐｉｒｅＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＬａｂｓ）ありと５０％なしであった。Ｃｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆ
ｏｒｍａｎｓ＃９０１１２は、それぞれのケースで使われた。殺菌動態ＭＯＰＳ−緩衝ＲＰＭＩ１６４０媒体ｐＨ７．０でのＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎ
ｓ（＃９０１１２）の夜通しの培養は抗真菌ペプチドの１×ブロスマクロ希釈溶
液ＭＦＣを含む同じ媒体、或いはＤＭＳＯと同じ容量のなかで接種された。培養
は３５℃で揺り動かされ、そしてディリューションプラッティングのため様々
な時間帯に無菌処理した部分標本として取り出された。

【００１４】結論および考察ドラスタチン１０およびおよび４個の類似体は抗真菌活性（表１）に狭い−ス
ペクトルを持っていることが、抗菌活性のための最初のスクリーン、ディスク散
布検査で推測された。さらに、１００ｕｇ／ディスクで、テストしたパクテリア
の菌株（見よ、ＭａｔｅｒｉａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，上出）の阻害抑制がみら
れた。このＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの特異性はブロスマクロ希釈溶液（表２）
で確かめられた。ディスク散布法では、本化合物は近種のＣ．ａｌｂｉｄｕｓお
よびＣ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉ、Ｃ．ｌａｕｒｅｎｔｉｉおよびＣ．ａｔｅｒの成
長阻止はなかった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのためのＭＦＣｓは、ＭＩＣｓよ
り典型的に同じか或いは２倍卓越していた。例外はＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ＃
１４１１６で起きた、化合物１ｂおよひ１ｃでＭＦＣｓをしたところＭＩＣｓよ
り１６倍卓越していた。ドラスタチン１０は、またフルコナゾルに臨床的に耐性
であったＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの菌株に抗真菌であった（Ｊｅｓｓｕｐｅ
ｔａｌ．，上出）。メチルエステル１ｄはブロスマクロ希釈溶液感染性テスト
で最も有力な抗真菌ペプチドであり、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの１９件の臨床
例でテストされ（フルコナゾル耐性菌は含まない）分離された。耐臨床分離は見
出されなかった。

【００１５】

【表１】

【００１６】

【表２】

【００１７】Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの１９臨床培養のうち、培養物の５０％およひ９０
％であるＭＩＣｓは変異１ｄがそれぞれ０．１９５μｇ／ｍｌおよび０．３９μ
ｇ／ｍｌであることによって抑制された（ＭＩＣ_５０，ＭＩＣ_９０）。変異１ｄ
にたいするＭＦＣ_５０は０．３９μｇ／ｍｌ、そしてＭＦＣ_９０は０．７８μｇ
／ｍｌであった。変異１ｄに対するＭＩＣｓ臨床培養物は０．０９７５−０．７
８μｇ／ｍｌの範囲であり、そしてＭＦＣｓは０．０９７５−６．２４μｇ／ｍ
ｌの範囲であった。臨床培養物６８％以上のＭＦＣ／ＭＩＣ率は２より小さいか
同じであり、そして培養物の２６％は４であった。該ＭＦＣｓは決められた培養
期間の後に得られ、そして一週間後に対比された。再生の証拠はまったくなかっ
た。

【００１８】該ペプチドの４個の抗真菌効果は殺菌動態学実験（図２）（変異１ｃの少数は
殺菌動態を妨げた）で確認された。概して、殺菌はＭＩＣの１×および４×の間
では濃度に依るが、ＭＩＣの４×および８×での間では濃度に依らなかった。Ｃ
ＦＵｓにおける最もドラマチックな減少は変異１ｄで得られた。ドラスタチン１０および３個の変異体はＭＩＣｓおよびＭＦＣｓのブロスマ
クロテストでのｐＨおよび漿液という二つの寄主の影響を研究をするのに十分
に役に立つ量があった。該ＭＩＣｓおよびＭＦＣｓは酸性化されたＲＰＭＩで増
加した（表４）。該、変異１ｄの抗クリプトコッカル活性は低いｐＨで最も影響
を受けなかった。ｐＨ８でのＭＩＣｓａ得させることを試みたが、菌株はアル
カリＲＰＭＩでは成長しなかった。

【００１９】

【表３】

【００２０】

【表４】

【００２１】酸性培地でのＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓを殺菌することについて、ドラスタチ
ン１０の濃度が増加すれば、ペプチドの活性が失われるのか、或いはさらにテス
トした検体が急速に増殖するか、二つの検査がおこなはれた。ドラスタチン１０
をブロスマクロ分析で同じ条件のもと、ｐＨ５、ｐＨ６およびｐＨ７で保ち、
そして６個のヒト癌細胞ライン（膵ＢＸＰＣ−３、神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ
、甲状腺ＳＷ１７３６、肺の小細胞癌ＮＣＩ−Ｈ４６０、咽頭ＦＡＤＵ、前立腺
ＤＵ−１４５）のＧＩ_５０ｓ（細胞成長の５０％を抑えるよう濃縮したもの）を
比較した。酸で処理したドラスタチン１０には抗増殖活性の明確な損失はみられ
なかった（データーは示してない）。もう一つの方法は、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａ
ｎｓを含むｐＨ５、ｐＨ６またはｐＨ７のＲＰＭＩ培地のフラスコを振ることで
長時間の光学濃度を比較した。ｐＨ５およびｐＨ６の増殖率は同じであり、ｐＨ
７では、僅かに少ない増殖率であった（データーは示してない）。酸性培地での
ドラスタチン１０のＭＩＣｓおよびＭＦＣｓでの増加は説明できない。中性での
ペプチドのさらに急速に増加する取り込みの可能な説明は浸透性の増加あるいは
転写メカニズムあるいはドラスタチン１０のイオン化状態が真菌のターゲット（
ヒト癌細胞ラインのコントロールは、ドラスタチン１０のイオン化状態が哺乳類
のチュ−ブリンターゲットには相互に影響し合わないということを示唆する）
に相互に作用をあたえる。確かに、低いｐＨでの増加したＭＩＣｓは臨床での抗
真菌薬の開発のための化合物の可能性を無視できない。酸性培地でＭＩＣｓが増
えるとして既に知られている抗生物質は、ストレプトマイシン、エリトロマイシ
ン、ゲンタマイシンそしてメトロニダゾールがある（ｆｏｒｒｅｖｉｅｗｓ
ｅｅ，アムステルダム「液状培地における抗生物質の感染度テスト」Ｌｏｒｉａ
ｎ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｉｎｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ，Ｍメリーランド：Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９６：５２−１１１）。

【００２２】試験管内で、ドラスタチン１０はヒト、犬、マウスの血漿のなかで、３７℃少
なくとも２４時間安定している（Ｎｅｗｍａｎｅｔａｌ．，「自然海の生成
物ドラスタチン１０（ＮＳＣ３７６１２８）の臨床以前の薬理学」、Ｄｒｕｇ
ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄＤｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ１９９４，２２（
３）：４２８−３２）。マウスに静脈注射の後の半減期の推定は５．６である（
Ｎｅｗｍａｎｅｔａｌ．，１９９４，該出）。ヒトの漿液があるなしにかか
わらず、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対するペプチドのＭＩＣｓおよびＭＦＣｓ
はひじょうに似ている（表５）。化合物１ｄおよび１ｅにとって、ＭＩＣｓおよ
びＭＦＣｓはヒトの漿液の存在にかかわらない。２個の異なる供給物（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｌａｍｐｉｒｅ）からの漿液の中のペプチドの活性は似ている（データーは
示してない）。

【００２３】

【表５】

【００２４】上記から、新しい抗真菌剤の関連性がわかった。ヒトの癌の臨床試験において
、本化合物は、４５５μｍ／ｍ^２以上の容量の最小毒性をもっているようで（Ｔ
ｒａｎｅｔａｌ．，１９９７既出、Ｂａｎｇｎｉｅｗｓｋｉｅｔａｌ．，１
９９７既出、ＭｃＥｌｒｏｙｅｔａｌ．，１９９７既出））、癌患者への真
菌感染症の発病率は５％近くから３０％である（Ｍｅｕｎｉｅｒ，「新生物病患
者のカビ寄生」ＣｕｒｒｅｎｔＣｌｉｎｉｃａｌ刊行ＩｎｔＪＡｎｔｉ
−ｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｇｅｎｔｓ１９９６，６：１３５−４０）、そして
Ｃ．Ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓは、このような感染の先駆になるケースでもある（Ｓ
ａｍｏｎｉｓｅｔａｌ．，「癌患者における真菌感染」。増加する課題Ｉｎ
ｖｉｖｏ，１９９２，６：１８３−９４）。有望な臨床毒性データーが得られ
たことにより、ペプチドがクリプトコックス症に苦しむ患者のための限られた治
療法に、貴重な追加になることは明らかである。ここで評価された特徴によって
、変異１ｄが生体をクリプトコッカルから守る最も有望な研究であると思える。
Ｃ．Ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓに対する特異性を得たことは、ペプチドｎｅｏｆｏｒ
ｍａｎｓの同属の病気に対して可能性のある治療法として試みられるべきである
。

【００２５】投与量は、真菌病のタイプや感染部位などの患者の状態、同時に行うなはれて
いる治療法および治療の頻度といった要因に依存する。例えば、患者の体重当たりの活性成分の量は、静脈注射では０．１から約６μｍ
／Ｋｇ、経口投与では０．１から約３０μｍ／Ｋｇ、筋肉内注射では０．１から
６μｍ／Ｋｇ、経鼻吸入では０．１から約３０μｍ／Ｋｇ、そしてエアゾルの場
合０．１から約３０μｍ／Ｋｇである。濃度であらわすと、局所への用途、例えば、経皮、経鼻、経咽頭、経気管支、
経膣、または眼部からの投与では、本発明組成物中の活性成分は約０．０１から
約５０Ｗ／Ｗ％好ましくは、約１から約２０Ｗ／Ｗ％であり、腸管外の用途では
約０．０５から約５０Ｗ／Ｗ％であり、好ましくは約５％から約２０Ｗ／Ｗ％で
ある。

【００２６】本発明の組成物は、好ましくは単位用量形態、例えば活性成分の適量を含む患
部用湿布薬や軟膏、錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、座薬、無菌の腸管外用
液または懸濁液、トローチの形でヒトや動物に投与する。また、諸事情により活
性成分を効果的に供給する。

【００２７】経口投与のためには、固形または液状の単位用量形態が製造される。粉末剤は、活性成分を適当な細かいサイズに粉砕し希釈剤と混合ることにより
極めて容易に得られる。希釈剤は、例えば乳糖やデンプンのような可食性の炭水
化物であって良い。好ましくは蔗糖のような甘味剤が調味油とどうように用いら
れる。カプセル剤は、上述のような粉末をゼラチン製のカプセルに充填して製造す
る。好ましくは、充填の操作を助けるために、充填する前に先立ってタルク、ス
テアリン酸、マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなどのような滑剤を粉末に
加える。ゼラチンの軟カプセル剤は、活性成分のスラリーを、植物油、軽質の液状ペ
トロラクラム、その他の不活性油やトリグリセリドと共に機械によるカプセル化
で製造する。

【００２８】錠剤は粉末混合物を準備し、顆粒化あるいはスラッグ化し、滑剤を加え、そ
して圧縮して製造する。粉末混合物は、活性成分を混合し、希釈剤や基剤、例え
ば、デンプン、乳糖、カオリン、リン酸カルシウムなどと共に適当に細粉化して
製造する。粉末混合物は、結合剤、例えばコーンシロップ、ゼラチン液、メチル
セルロース液やアラビアゴムで湿らせ、そして編み目を強制通過させて顆粒にす
ることができる。顆粒化する代わりに、粉末混合物を、例えば、錠剤機の中を通
し、得られた不完全な形の錠剤を小片（スラグ）に粉砕してスラグ化することが
できる。スラグには、ステアリン酸、ステアリン塩、タルクや鉱物油を添加して
錠剤成形用の型に付着するのを防ぐため、潤滑化することができる。潤滑化され
た混合物を圧縮して錠剤とする。

【００２９】好ましくは、錠剤はシェラックのシーリングコーティングや腸溶性のコーテ
ィング、糖やメチルセルロースのコーティングおよびカルナウバ蝋のポリッシュ
コーティングから成る保護コーティングを施すことができる。ひとさじ分が一定量の活性成分を含むようにした、シロップ、エリキシル、お
よび懸濁液のような経口投与のための液状の単位用量形態をも調剤することがで
きる。水溶性の形態は、糖と香料と保存剤と一緒に水性賦形剤中に溶解してシロ
ップとすることによって製造する。エリキシルは、水性アルコール賦形剤を適当
な甘味剤と香料と共に用いて製造する。懸濁液は、アラビアゴム、トラガカント
、メチルセルロースのような懸濁溶剤を用い、適当な賦形剤と共に不溶性の形で
つくることができる。

【００３０】腸管外投与のために、活性成分と無菌の賦形剤（水が好ましい）を用いて、液
状の単位用量形態を製造する。活性成分は、その形態や濃度に応じて、賦形剤の
中に懸濁させるかまたは溶解させる。溶液をつくるには、活性成分を注射用の適
当な賦形剤に溶かし、適当なバイアルまたはアンプルに封入する前に無菌ろ過す
る。好ましくは、賦形剤の中に佐剤、例えば局所麻酔剤、保存剤や緩衝剤を溶解
させる。腸管外懸濁液は、活性成分を賦形剤の中に溶解させずに懸濁させ、そ
して減菌工程はろ過によって完了しないことを除けば、実質的に上記と同様にし
て製造される。腸管外懸濁液に関して、活性成分は無菌賦形剤に懸濁させる前に
好ましくはエチレンオキシドと接触させて減菌する。好ましくは、界面活性剤ま
たは湿潤剤を組成物に含有させ、活性成分の分布を均一にする。

【００３１】さらに治療として、経口および腸管外投与のほかに、膣からのルートにも使用
できる。活性成分は、座薬という手段で投与できる。融点がほぼ体温であるかま
たは容易に溶ける賦形剤が用いられる。例えば、カカオバターや数々のポリエチ
レングリコール類（カーボワックス）が、高い効果をもつ座薬用賦形剤として使
用できる。鼻内滴下のための点鼻薬には、活性成分と適当な好ましくはパイロジェンを含
まない水（“Ｐ．Ｆ．”）を用いて、液状の単位用量形態を製造する。投与法と
して吸入法が選択されたときには、乾燥粉末が処方し得る。エアゾルとしての用途のためには、活性成分を気体または液化した噴霧剤、例
えば、ジクロロジフルオロメタン、二酸化炭素、窒素、プロパンなどおよび必要
または所望に応じ通常の佐剤、例えば、共溶剤や湿潤剤と共に、加圧エアゾル容
器内に封入して製造する。皮膚に対する真菌病の好ましい治療法においては、活性成分は主要担体として
水と油乳剤から成る軟膏又は膏薬として患部に塗布される。その他の通常の成分
は、必要に応じて、ワセリンおよび鉱油、ポリエチレングリコールの如きリポフ
ィリック溶解剤、カーボワックス、ラノリンおよび芳香剤を含む。

【００３２】本願明細書において使用する「単位用量形態」という用語は、ヒトや動物の単
位用として適当な物理的に個々の単位を意味し、ここに各々の単位は、必要な医
療用希釈剤、担体または賦形剤と一緒になって所望の治療効果を生ずるように計
算された量の活性成分を含有するものである。本発明の所望な単位用量形態の明
細は、次の条件により指示され直接に依存する。すなわち、（ａ）活性成分の特
性および特定の所望の治療効果および（ｂ）この明細書に開示してあるように、
ヒトにおける治療用途のための活性成分を配分する技術に本質的な限界。これら
は、本発明の特徴である。適当な単位用量形態の例としては、錠剤、カプセル剤
、トローチ、座薬、粉末剤、ウエハース、カシュ剤、茶さじ用剤、大さじ用剤、
滴剤、アンプル剤、パイアル剤、以上のいずれかの複合形態、その他ここに述べ
られるような他の形態がある。

【００３３】抗真菌剤として用いられる活性成分は、それ自体容易に入手でき、そして既に
確立されており、ここには再び記載する必要のない方法で製造できるような医薬
用材料を用いることによって容易に単位用量形態としてつくることができる。本
発明の理解を更に助けるために、但し本発明を限定する意味ではなく、本発明を
一層明瞭に開示するための実施例を以下に掲げる。本発明の実施のために幾つか
の用量形態を作成した。ここに記載した「活性成分」とは、既に述べた如く、ド
ラスタチン１０あるいはその変異体として掲示した化合物の一つのことである。

【００３４】組成物Ａ硬ゼラチンカプセル剤カプセル中に活性成分２０ｍｇを含有する、二鞘式硬質ゼラチンカプセル剤１
０００個を、次のタイプと分量の成分から製造する。微粉化した活性成分２ｇｍトウモロコシデンプン２０ｇタルク２０ｇステアリン酸マグネシウム２ｇエア・マイクロナイザーで微粉化した活性成分を、他の微粉化成分に加え、完
全に混合し、常用に従ってカプセルに充填する。ここに得たカプセル剤は、１回１〜２カプセル１日１〜４回経口投与すれば真
菌病の治療に有用である。上記方法に準じ、活性成分を２ｇｍの代わりに０．１ｇｍ、５ｇｍまたは２０
ｇｍ用いることにより、１カプセル中に活性成分をそれぞれ０．１ｇｍ、５ｇｍ
または２０ｇｍ含有する製剤を製造することができる。

【００３５】組成物Ｂ軟ゼラチンカプセル剤最初に化合物をトウモロコシ油０．５ｍｌに懸濁して材料をカプセル化できる
ようにし、次に上述の方法でカプセル化して、１カプセル中にエア・マイクロナ
イザーで微粉化した活性成分２ｇｍを含有する経口投与用の一鞘式ソフトゼラチ
ンカプセル剤を製造する。このカプセル剤は、１回１〜２カプセル１日１〜４回経口投与すれば真菌病の
治療に有用である。

【００３６】組成物Ｃ錠剤一錠中に活性成分２ｇｍを含有する錠剤１０００錠を、次のタイプと分量の成
分から製造した。微粉化した活性成分２ｇｍ乳糖３００ｇｍトウモロコシデンプン５０ｇｍステアリン酸マグネシウム４ｇｍ軟質液状ペトロレータム５ｇｍエア・マイクロナイザーで微粉化した活性成分を他の成分に加え、完全に混合
しスラグ化し、このスラグを１６番篩を通して力を加えて錠剤とし、１錠中に活
性成分が２ｇｍ含まれるようになる。上述の錠剤は、１回１〜２錠１日１〜４回経口投与することによって、真菌病
を治療するのに有用である。上述と同じようにして、活性成分２ｇｍの代わりに０．１ｇｍ，５ｇｍまたは
２０ｇｍを用いることにより、１錠中に活性成分を０．１ｇｍ，５ｇｍまたは２
０ｇｍ含有する錠剤を製造することができる。

【００３７】組成物Ｄ経口用懸濁剤次のタイプと量の成分を用いて、各茶さじ１杯（５ｍｌ）容量あたり２ｍｇの
活性成分を含有する水性懸濁液１リットルを製造する。微粉化した活性成分０．４ｇｒａｍクエン酸２ｇｍ安息香酸１ｇｍ蔗糖７９０ｇｍトラガント５ｇｍレモン油２ｇｍ脱イオン水を加え全量１０００ｍｌクエン酸、安息香酸、蔗糖、トラガカント及びレモン油を充分な量の水に分散
させ８５０ｍｌの懸濁液とする。エア・マイクロナイザーで微粉化した活性成分
を、それが均一に分布するまでシロップで攪拌し、充分な量の水を加えて１００
０ｍｌとする。このようにして製造された組成物は１回茶さじ１杯１日３回（１５ｍｌ）投与
することにより、真菌病を治療するのに有用である。

【００３８】組成物Ｅ非経口用製品真菌病治療用活性成分４００μｇをそのミリリットル中に含有する非経口注射
用無菌水性懸濁液１リットルを、次のタイプと量の成分から製造する。微粉化した活性成分４００ｍｇポリソルベート８０５ｍｇメチルパラベン２．５ｍｇプロピルパラベン０．１７ｍｇ注射用水を加え全量１０００ｍｌ活性成分以外のすべての成分を水に溶かし、溶液をろ過して無菌とし、これに
エア・マイクロナイザーで微粉化した無菌の活性成分を添加し、得られる懸濁液
を無菌のバイアルに充填し、バイアルを密閉する。このようにして得られた組成物は、１回１ｍｌ（１ｍｌ）１日１〜３回用いる
ことにより真菌病の治療に有用である。

【００３９】組成物Ｆ経直腸および経膣座薬次のタイプの成分を用い、１個の重量２．５ｇでかつ活性成分２ｇｍを座薬１
０００個を製造する。微粉化した活性成分０．１５ｇｍプロピレングリコール１５０ｇｍポリエチレングリコール４０００を加え全量２，５００ｇｍ活性成分をエア・マイクロナイザーを用いて微粉化し、プロピレングリコール
に添加し、混合物が均一に分散されるまでコロイドミルに通過させる。ポリエチ
レングリコールを融かし、プロピレングリコール分散液を、ゆっくりと攪拌しつ
つ添加する。この懸濁液を、冷却していない４０℃の型に注入し、組成物を放冷
して固化させ、型から取り出し、各々の座薬をホイルで包む。上述の座薬は真菌病の治療のために直腸または膣に挿入する。

【００４０】組成物Ｇ経鼻用懸濁液次のタイプと分量の成分を用いて、１ｍｌあたり２ｇｍの活性成分を含有する
経鼻点滴用の無菌水性懸濁液１ｌを製造する。微粉化した活性成分２ｇｍポリソルベート８０５ｇｍメチルパラベン２．５ｇｍプロピルパラベン０．１７ｇｍ脱イオン水を加え全量１０００ｍｌ活性成分以外のすべての成分を水に溶かし、その溶液をろ過して無菌とし、こ
の無菌液に、エア・マイクロナイザーで微粉化した無菌の活性成分を加え、得た
懸濁液を無菌容器へ無菌充填する。この組成物は０．２〜１．０ｍｌを１日１〜４回点鼻することにより真菌病の
治療に有用である。活性成分はまた、非希釈の純品形態で皮膚、経鼻、経咽頭、経気管支または経
口的に局所使用のためにも存在しうる。

【００４１】組成物Ｈ粉末剤バルク形態の活性成分５ｇをエア・マイクロナイザーを用いて微粉化し、シェ
イカータイプの容器に入れる。上記組成物は１日１〜４回局所に適用することにより真菌病の治療に有用であ
る。

【００４２】組成物Ｉ経口用粉末剤バルク形態の活性成分１０ｇをエア・マイクロナイザーを用いて微粉化し、各
々２ｇｍずつ分包する。上述の粉末は、１回１〜２包を１日１〜４回、コップ一杯の水に懸濁させて経
口投与することにより、真菌病の治療に有用である。

【００４３】組成物Ｊ吸入剤バルク形態の活性成分１０ｇを、エア・マイクロナイザーを用いて微粉化する
。この組成物２ｇｍを１日１〜４回吸入することによって真菌病の治療に有用で
ある。

【００４４】組成物Ｋ軟膏バルク形態の活性成分１００ｇを、エア・マイクロナイザーを用いて微粉化す
る。次に、この微粉末を水とオイル乳液の中に混入させ、適度な湿気と好ましい
芳香を与える。この軟膏を少なくとも１日２回患部にぬり、ぬり薬として使用することによっ
て真菌病の治療に有用である。

【００４５】上述したところから、それに基づく新規で有用な抗新生物薬剤および新規で有
用な抗新生物製剤がここに記載され説明されており、それは上記の目的のすべて
を極めて予期しない態様で満たしている。この開示に直面する当業者において容
易に起こるその修飾、変更および適用は、請求の範囲で定義される本発明の精神
の範囲内にあると意図されることは当然に理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ドラスタチン１０（１ａ）および誘導体（１ｂ−１ｅ）の化学構
造を示す。

【図２】ドラスタチン１０および選ばれたモジフィケーションのＣｒｙｐ
ｔ−ｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの致死活性を示す。ここに「致死」は
各化合物に対して四角形（薬剤なし）、三角形（１ｘ）、逆三角形（４ｘＭＩＣ
）およびダイヤモンド形（８ｘＭＩＣ）で示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳＦターム(参考） 4C084 AA02 BA01 BA10 BA14 BA15 BA23 BA32 CA51 CA59 MA55 MA60 MA66 NA14 ZB352 4H045 AA30 BA11 CA50 EA29

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】薬学的に受容可能な担体と下記の化学構造から成る群から選
ばれた活性成分の有効量を投与することから成る真菌類誘導感染された患者を処
理する方法。【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】
【請求項２】該真菌類はＣｒｙｐｔｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ
クリプトコッカスネオフォルマンスである請求項１の方法。
【請求項３】該真菌類起因感染疾患はクリプトコッカスでＣｒｙｐｔｃｏ
ｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓとの接触から生ずる表皮および全身性疾患であ
る請求項１に依る方法。
【請求項４】該活性成分は非経口手段によって投与されるする請求項３に
依る方法。
【請求項５】該活性成分は局所的に投与される請求項３に依る方法。
【請求項６】該活性成分は静脈内に投与される請求項３に依る方法。
【請求項７】該活性成分は座薬で投与される請求項３に依る方法。
【請求項８】該活性成分は水と油乳剤、ワセリン、鉱油、加湿剤、溶解剤
および芳香剤から成る担体に担持される請求項５に依る方法。