JP2002544234A

JP2002544234A - 発作の処置のための骨髄移植

Info

Publication number: JP2002544234A
Application number: JP2000617907A
Authority: JP
Inventors: イリ，; マイケルチョップ，
Original assignee: Henry Ford Health System
Current assignee: Henry Ford Health System
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-11
Publication date: 2002-12-24
Also published as: PT1183035E; AU5130000A; ES2531592T3; CA2373808C; EP1183035B1; US20090162327A1; DK1183035T3; WO2000069448A1; CA2373808A1; EP1183035A4; AU780994B2; EP1183035A1

Abstract

(57)【要約】神経変性疾患または神経損傷に罹患している患者を処置する方法を提供し、この方法は、必要とされる患者の脊髄または脳へ培養した骨髄細胞を移植する工程または骨髄細胞を脈管内注射する工程を包含する。損傷した脳においてニューロン細胞の分化を活性化する方法もまた提供し、この方法は、骨髄細胞を損傷した脳細胞に隣接させて移植する工程および内因性中枢神経系の幹細胞を活性化して、ニューロンに分化させる工程を包含する。損傷した脳細胞または脊髄細胞を処置する方法もまた提供し、この方法は、骨髄細胞を損傷した脳細胞の近辺に移植する工程および移植した位置で新しいニューロンを発生させる工程を包含する。ＭＳＣおよびニューロスフェアの複合体を用いて、損傷した脳または脊髄を処置する方法もまた提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照）本出願は、１９９９年５月１４日に出願された、米国仮特許出願番号６０／１
３４，３４４（本明細書中で参考として援用される）の転換である。

【０００２】（技術分野）本発明は、神経障害および神経変性疾患の処置に関する。より詳細には、本発
明は、神経障害（発作、外傷性脳損傷、脊髄損傷）および神経変性（例えば、パ
ーキンソン病）の処置のための、骨髄細胞および混合された骨髄細胞およびニュ
ーロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）の使用に関する。

【０００３】（背景技術）胚性組織由来のドナー細胞の脳内移植は、神経発生を促進し得る（Ｓｙｎｄｅ
ｒら、１９９７）。線条体内の胎児の移植片が使用され、損傷を受けた脳幹神経
節回路を再構築し、そして虚血の動物モデルにおける行動欠陥を改善した（Ｇｏ
ｔｏら、１９９７）。成体生物に移植される胎児造血系幹細胞（ＨＳＣ）または
胚に移植される成体ＨＳＣは、細胞が播種された微小環境内で、内因性細胞を反
映するキメラを生じる（Ｇｅｉｇｅｒら、１９９８）。多能性幹細胞は、成体Ｃ
ＮＳに保有され、そして成体脳は、新しいニューロンを形成し得る（Ｇａｇｅ
１９９８；ＫｅｍｐｅｒｍａｎｎおよびＧａｇｅ、１９９８）。

【０００４】骨髄移植の概念は、他者により研究されている。例えば、Ａｚｚｉｚｉらの参
考文献において、研究者は、ヒト骨髄間質細胞を、アルビノのラットの脳に移植
する。これらの第一の観察は、ヒト間葉細胞がラットの星状細胞と類似の様式で
移植され、移動し、そして生存し得ることであった。さらに、Ｅｇｌｉｔｉｓお
よびＭｅｚｅｙによる文書において、骨髄細胞は、成体マウスの脳に移植される
場合、小膠細胞および大膠細胞に分化し得ることが示される。再び、これが、正
常マウスの脳に移植される場合、生じた。これらの２つの論文が、いくつかの大
グリア細胞は骨髄の正常な成分である前駆体細胞から生じるという仮説を支持す
るために、使用された。しかし、骨髄細胞がニューロンに分化するということ示
す研究は存在しなかった。さらに、これが損傷した脳または脊髄および神経変性
疾患において生じることの研究も存在しなかった。さらに、神経損傷（発作、外
傷性脳損傷、脊髄損傷）および神経変性疾患（パーキンソン病）の、骨髄細胞を
用いた処置が、機能的な結果を改善するというデータも存在しなかった。

【０００５】（発明の要旨）本発明に従って、中枢神経系の損傷および神経変性疾患に罹患した患者の処置
（骨髄細胞を培養する工程ならびに必要な患者の脳に骨髄細胞を移植するかまた
は投与し、そしてその患者の脳に新しいニューロンを産生するための工程を含む
）が提供される。さらに、本発明者らは、ＣＮＳ損傷および神経変性の処置のた
めの骨髄細胞および胚性脳組織の複合体を使用する。また、損傷した脳における
神経細胞の分化を活性化する方法（損傷した脳細胞に隣接して骨髄細胞を移植す
る工程、骨髄細胞の脈管内（動脈内、静脈内）投与およびニューロンに分化する
内因性中枢神経系幹細胞を活性化する工程を含む）が提供される。損傷した脳お
よび変性脳を処置する方法がまた、提供される（骨髄細胞を調製する工程ならび
に損傷した脳細胞の近くに骨髄細胞を移植する方法および骨髄細胞の脈管内投与
のための方法を含む）。

【０００６】骨髄全体および骨髄の細胞成分が使用され（すなわち、間葉幹細胞、ＭＳＣ；
造血系幹細胞、ＨＳＧ）、発作（ラット、マウス）および外傷性脳損傷（ラット
）を処置した。骨髄の細胞成分は、特別な培地中および神経栄養物（ｎｅｕｒｏ
ｔｒｏｐｈｉｎ）（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ）を含む培地中で培養された。細胞は、脳
にか、内頸動脈にか、または大腿静脈のいずれかに直接注射された。結果の測定
は、骨髄細胞の表現型形質転換を形態学的に同定するための２重染色免疫組織化
学、ならびに神経学的欠陥を同定するための行動（ｂｅｈａｖｏｒｉａｌ）試験
および機能性試験であった。本発明者らのデータは、発作、脊髄損傷、または外
傷性脳損傷の、骨髄全体または細胞性成分を用いた処置が、有意に機能性欠陥を
低減することを示す。骨髄細胞はまた、実質細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌｃ
ｅｌｌ）の表現型を発現する。さらに、パーキンソン病の症状を誘導する神経毒
ＭＰＴＰを用いて処置されたマウスが、大脳内に送達される骨髄細胞を用いて処
置された。パーキンソン病の症状は、骨髄細胞を用いて処置されたマウスにおい
て有意に低減された。これらのデータは、骨髄細胞が、神経障害および神経変性
疾患を処置するのに使用され得ることを示す。

【０００７】この分野への主要な貢献および新規な貢献は、神経栄養物中における骨髄細胞
の培養、発作、外傷およびパーキンソン病の、骨髄を用いた治療および処置のた
めの、（増殖因子があるかまたはないかで培養された）これらの細胞の実質内（
ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）投与および脈管内投与である。

【０００８】また、胎児ニューロスフェア由来の神経幹細胞、成体骨髄細胞由来の間葉幹細
胞および成体Ｗｉｓｔａｒラット由来の脳脊髄液からなる凝集物（ＮＭＣスフェ
ア（ＮＭＣｓｐｈｅｒｅ）と呼ばれる）が開発される。これらのＮＭＣスフェア
は、発作および脳の外傷を処置するために首尾良く使用されて、そして神経変性
疾患を処置するために使用され得る。

【０００９】（詳細な説明）一般に、本発明は、骨髄移植を用いて神経損傷および神経変性を処置する方法
を提供する。骨髄細胞は、ニューロンおよび他の実質細胞に分化することが決定
された。傷つけられた脳および脊髄内の骨髄細胞は、サイトカインおよび増殖因
子のアレイを産生する。骨髄細胞は、増殖し、そして実質細胞（ニューロンを含
む）に分化するために、脳における内因性幹細胞、上衣細胞を活性化する。次い
で、新しいニューロンは、歯状回および嗅球において、ならびに損傷部位に隣接
して存在する。従って、骨髄は、内因性中枢神経系幹細胞を活性化し、ニューロ
ンに分化する。骨髄細胞はまた、脳の修復および形成性を促進する因子（サイト
カインおよび増殖因子）を産生する。

【００１０】本発明の方法は、骨髄細胞の特定の培養、および骨髄細胞の注射の特定の部位
を使用する。細胞は、病変に隣接して、そして病変内ではない、周辺組織中に移
植される。病変に隣接した組織は、骨髄細胞の生存および分化のために、発生中
の脳の受容環境と類似した受容環境を提供する。骨髄が、特定の脳または脊髄損
傷を起こしている神経損傷および神経変性において有用であり得るのは、この活
性に基づく。さらに、骨髄細胞は、これらの細胞が脈管内に（すなわち、動脈内
にかまたは静脈内に）投与される場合、神経損傷および変性を処置するのに有効
である。従って、このような脳損傷後、脳組織が死ぬ場合、失われた組織を代償
するために、骨髄およびその誘導体の移植が、細胞の十分な供給源および活性を
提供し、このような損傷に対する脳の代償性応答を促進する。

【００１１】骨髄は、ラットおよびマウスの虚血性脳、傷つけられたラット脳、傷つけられ
た脊髄の中におよびパーキンソンマウスの脳の中に移植される。脳への移植がま
た、増殖因子（ＢＤＮＦ、ＮＡＦ）の同時移植により実施された。骨髄（特にＭ
ＳＣ）が、神経増殖因子（ＮＧＦ）と共に培養された。

【００１２】移植は、ラットおよびマウスの両方において実験的発作後に種々の時点（マウ
スにおいて、発作後４時間〜２日、外傷後１日〜７日、脊髄損傷後７日、および
パーキンソン病の発症後１４日）で実施された。このデータは、虚血性脳への骨
髄または成分の移植が、脳実質細胞（ニューロンを含む）への骨髄細胞の分化を
生じることを示す。さらに、内因性脳幹細胞は、増殖し、そして実質細胞へ分化
するために活性化される。これらの細胞は、脳内の異なる領域（海馬、嗅球およ
び皮質を含む）に移動する。増殖因子と共にかまたは組み合わされて培養された
骨髄移植により処置されたラットにおいても、機能的結果が改善された。このモ
デルは、高等な哺乳動物（ヒトを含む）における陽性の結果の、非常に高い予測
である。ＭＳＣを用いた発作患者の処置のための臨床試験が、再調査のためにＩ
ｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄｏｆＨｅｎｒｙＦ
ｏｒｄＨｏｓｐｉｔａｌに提出される。

【００１３】上記議論は、神経損傷および神経変性の処置のための骨髄移植の使用のための
事実に基づく根拠を提供する。本発明を用いて使用される方法および本発明の有
用性は、以下の非限定的な例および添付の図により示され得る。

【００１４】当該分野で公知の、特に記載されない標準的な分子生物学技術は、一般に、以
下のように従い、そして本明細書中で参考として援用される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏ
ｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ
（１９８９）およびＰｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＪｈｏｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ
、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔＤＮＡ、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＢｏｏｋｓ、Ｎｅｗ
ＹｏｒｋおよびＢｉｒｒｅｎら（編）ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹ
ｏｒｋ（１９９８）および米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，
２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号、および同第
５，２７２，０５７号において示されるような方法論。ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）は、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＴｏＭｅｔｈｏ
ｄｓＡｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｓ
ａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）のように一般的に実行された。フローサイ
トメトリーと組み合わせて、インサイチュ（インセル（Ｉｎｃｅｌｌ））ＰＣ
Ｒが、特定のＤＮＡ配列およびｍＲＮＡ配列を含む細胞の検出のために使用され
得る（Ｔｅｓｔｏｎｉら、１９９６、Ｂｌｏｏｄ８７：３８２２）。

【００１５】当該分野で公知で、そして詳細に記載されていない免疫学の標準的な方法は、
以下のように一般的に従った：Ｓｔｉｔｅｓら（編）、ＢａｓｉｃａｎｄＣ
ｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌ
ａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）およびＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈ
ｉｉｇｉ（編）、ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８０）。

【００１６】（実施例）（ＭＳＣの脳内移植による発作の処置（ラット））ラットにおける大脳虚血後の骨髄由来のＭＳＣの脳内移植の説明：この研究に
、成体雄性Ｗｉｓｔａｒラットを使用した（ｎ＝２８）。ラットを管内閉塞モデ
ルを使用して、２時間、中大脳動脈閉塞に供した。実験グループは以下を含む：
（コントロール）ＭＳＣを移植しないＭＣＡｏ単独（ｎ＝８）；（グループ２）
リン酸緩衝化生理食塩水のＭＣＡｏの２４時間後、虚血境界領域（ＩＢＺ）への
注射（ｎ＝４）：（グループ３）非ＮＧＦ培養骨髄ＭＳＣのＭＣＡｏの２４時間
後、虚血境界領域（ＩＢＺ）への注射（ｎ＝８）；（グループ４）ＮＧＦ培養Ｍ
ＳＣのＭＣＡｏの２４時間後、虚血境界領域（ＩＢＺ）への注射（ｎ＝８）。１
０μｌの総液体容量中約４×１０⁴個の細胞を移植した。ラットは移植片を受け
、そしてＭＣＡｏの１４日後に屠殺された。

【００１７】行動結果測定：機能試験のバッテリー（ロータロッド試験、粘着−除去（ａｄ
ｈｅｓｉｖｅ−ｒｅｍｏｖａｌ）試験および神経学的重篤度スコア試験）による
行動データにより、運動機能および体性感覚機能は、虚血発作により損なわれる
ことが示された。グループ間の、ロータロッド試験、粘着−除去試験およびＮＳ
Ｓ試験の有意な差違は、手術前および移植前には検出されなかった。ＭＣＡｏの
みの動物と比較して、ＭＳＣを移植した動物では、体性感覚行動（ｐ＜０．０５
）およびＮＳＳ（ｐ＜０．０５）の有意な回復が検出された（図１ａ、ｃ）。Ｎ
ＧＦの移植後２週間で、ＮＧＦと共に培養したＭＳＣを受けた動物は、ＭＳＣの
みの移植と比較して、運動（ｐ＜０．０５）、体性感覚試験（ｐ＜０．０５）お
よびＮＳＳ（ｐ＜０．０５）の行動試験の有意な回復を示した。図１ａ、ｂ、ｃ
は、それぞれ、粘着−除去試験、ロータロッド運動試験、および神経学的重篤度
スコア（ＮＳＳ）のデータを示す。これらのデータは、運動試験データに示され
るように、ＭＳＣの脳内移植による発作の処置が、有意な治療的利点を提供し、
そしてＭＳＣが、ＮＧＦ中で培養された場合、ＮＧＦなしで培養されたＭＳＣよ
り優れた治療的利点を提供することを、明らかに示す（図１ｂ）。

【００１８】（ＭＳＣの脳内移植による発作の処置（マウス））発作後のマウスへのＭＳＣの脳内移植：塞栓性ＭＣＡｏおよび移植。

【００１９】実験用成体マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、体重２７〜３５ｇ）を、ＭＣＡｏに供
し、そしてＭＳＣを移植した（ｎ＝５）。コントロールマウスを、ＭＣＡｏのみ
（ｎ＝８）；虚血性線条へのＰＢＳの注射（ｎ＝５）；および正常な線条へのＭ
ＳＣの移植（ｎ＝５）に供した。ＭＣＡｏは、本発明者らの研究室で開発した塞
栓性モデルを使用して誘導した（Ｚｈａｎｇら、１９９７）。簡潔には、フェー
スマスクを使用して、マウスを３．５％ハロタンを用いて麻酔し、そして７０％
Ｎ₂Ｏおよび３０％Ｏ₂中１．０％ハロタンを用いて、麻酔を維持した。単一のイ
ンタクトなフィブリンリッチな２４時間齢の同種クロット（８ｍｍ×０．０００
６２５ｍｍ²、０．１８μｌ）を、改変型ＰＥ−５０カテーテルにより、ＭＣＡ
の起点に配置した。外科的および生理学的なモニタリング手順は、以前に公開さ
れた手順（Ｚｈａｎｇら、１９９７）と同じであった。ＭＣＡｏの４日後（ｎ＝
１８）、マウスを定位フレーム（ＳｔｏｅｌｔｉｎｇＣｏ．ＷｏｏｄＤａｌ
ｅ，ＩＬ）にのせた。無菌技術を使用して、バーホール（１ｍｍ）を頭蓋の右側
に作製して、右の皮質を覆っている硬膜を露出した。半懸濁したＭＳＣ（３μｌ
ＰＭＳ中１×１０⁵）を、右線条（ブレグマから、ＡＰ＝０ｍｍ、ＭＬ＝２．０
ｍｍ、およびＤＶ＝３．５ｍｍ）に、１０分間かけてゆっくりと注射した。この
位置は、線条内の虚血性境界領域に近い。ドナーの逆流を避けるために、針を線
条内にさらに５分間保持した。マウスを、発作後２８日に屠殺した。

【００２０】行動試験：各マウスを、一連の行動試験（ロータロッド運動試験、神経学的重
篤度スコア）に供して、実験グルーに対して盲目的な研究者により、神経学的機
能の様々な局面を評価した。測定は、発作の前および発作後２８日で行った。

【００２１】結果：ＢｒｄＵ反応性ＭＳＣは生存し、そして移植領域から虚血性領域までの
約２．２ｍｍの距離を移動した。ＢｒｄＵ反応性細胞は、ニューロンタンパク質
（約１％ＮｅｕＮ）および星状細胞タンパク質（約８％ＧＦＡＰ）を発現し
た。ロータロッド試験（ｐ＜０．０５）および改変された神経学的重篤度スコア
試験（運動、感覚および反射を含むＮＳＳ、ｐ＜０．０５）からの機能回復は、
ＭＳＣを受けたマウスでは、ＭＣＡｏのみと比較して、有意に改善された（図２
）。図２は、ＭＳＣを移植して処置されたマウスが、ビヒクルで処置した動物と
比較して、ロータロッドにおける持続時間の有意な改善を示し（図２）、そして
改善された神経学的機能を示す（図２）ことを表す。この所見は、脳内移植した
ＭＳＣが虚血性の脳において生存し、そして成体マウスの機能回復を改善するこ
とを示唆する。

【００２２】（ＭＳＣの脈管内投与による発作の処置（マウス））実験の説明：体重２７０〜２９０ｇの成体雄性Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝３０）を用いて実
験を行った。全ての外科的手順において、ラットにおける麻酔は、３．５％ハロ
タンで誘導し、そしてフェースマスクを使用して、７０％Ｎ₂Ｏおよび３０％Ｏ₂ 中１．０％ハロタンで維持した。直腸温は、フィードバック調節型温水システム
を使用して３７℃に制御した。一過性ＭＣＡｏは、上記のように、管内血管閉塞
の方法を使用して誘導した。ＭＣＡｏの２時間後、その先端部が内頸動脈から取
り除かれるまで、縫合を引き抜くことによって、再灌流を行った。

【００２３】（ａ−ＭＳＣの頸動脈内投与）ＭＳＣの頸動脈内移植を、ＭＣＡｏの２４時間
後に行った（ｎ＝２３）。改変型ＰＥ−５０カテーテルを、ＭＣＡの起点に対し
て２ｍｍ近位に静止するまで、外頸動脈の同じ部位から内頸動脈の管腔に進めた
（図１）。２００μｌＰＢＳ中約２×１０⁶のＭＳＣ（ｎ＝６）またはコントロ
ール液（２００μｌＰＭＳ、ｎ＝８）を１０分間かけて各実験用ラットに注射し
た。いずれの動物にも免疫抑制薬は使用しなかった。全てのラットを、ＭＣＡｏ
の１４日後に屠殺した。

【００２４】（ｂ−ＭＳＣの静脈内投与）ＭＳＣの静脈内投与のため、大腿静脈にカニュー
レ挿入し、そして１．５×１０⁶ＭＳＣまたは３×１０⁶ＭＳＣを注射した。

【００２５】行動試験および免疫組織化学：各ラットを、一連の行動試験（ＮＳＳおよび粘
着除去試験）に供して、ＭＣＡｏ前、ならびにＭＣＡｏの１、４、７、および１
４日後の神経学的機能を評価した。単一および二重の免疫組織学的を用いて、Ｂ
ｒｄＵ反応性ＭＳＣの細胞特異性タンパク質を同定した。

【００２６】結果：動脈内投与について、ＢｒｄＵ反応性細胞（２×１０⁶個の移植ＭＳＣ
の約２１％）は、虚血の１４日後まで、ＭＣＡの領域全体に分散した。いくらか
のＢｒｄＵ反応性細胞は、星状細胞（グリア原線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ
））およびニューロン（微小管結合タンパク質−２、ＭＡＰ−２）に特徴的なタ
ンパク質を発現した。ＭＳＣを動脈内移植したラットは、コントロールと比較し
て、１４日目に粘着−除去試験（ｐ＜０．０５）（図３）、および改変された神
経学的重篤度スコア（ｐ＜０．０５）（図３）における有意な改善を示した。Ｍ
ＳＣの静脈内投与についてのデータは、非常に類似していた。すなわち、ＭＳＣ
で処置したラットは、プラシーボ処置したラットと比較して、有意な機能的改善
があった。図４は、コントロールの虚血ラットと比較した、ＭＳＣを静脈内投与
したラットの機能データを示す。有意な改善は、コントロール動物と比較して、
発作の７日後および１４日後に、ラットがそれらの足から粘着性のタブ（ｔａｂ
）を除去するスピードで示される（図４）。ＭＳＣの動脈内投与で処置されたラ
ットの全神経学的機能は、発作の１４日後に、コントロール虚血ラットと比較し
て有意に改善した。この所見は、動脈内注射されたＭＳＣが局在化し、そしてＭ
ＣＡの領域に向かい、そしてそれらの細胞が大脳虚血後に、機能の改善を促進す
ることを示唆する。さらに、ＭＳＣの静脈内投与もまた、機能的結果の有意な改
善を提供する。従って、本発明者らは、静脈投与が、治療的に有利なＭＳＣの投
与の実行可能かつ有効な経路であることを示した。

【００２７】（ＭＳＣの脳内移植による外傷性脳損傷の処置（ラット））説明：体重２５０〜３５０ｇの６６匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを使用して、
実験を行った。制御皮質衝突デバイスを使用して、損傷を引き起こした（Ｄｉｘ
ｏｎＥら、ＡＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄｃｏｒｔｉｃａｌｉｍｐａｃｔｍ
ｏｄｅｌｏｆｔｒａｕｍａｔｉｃｂｒａｉｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａ
ｔ，Ｊ．ＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅＭｅｔｈｏｄｓ３９：２５３〜２６２、
１９９１）。４ｍｍ／ｓの速度で移動し、２．５ｍｍの圧縮を生成する、６ｍｍ
の直径を有する空気式ピストンを、左皮質に衝突させることにより、損傷を引き
起こした。ＢｒｄＵ標識したＭＳＣをドナー動物から収集し、そして発作実験と
同様に、同側の大脳半球に移植した。ＭＳＣを、損傷の２４時間後に、脳に移植
した。ＭＳＣを受けたラットを、移植の、４日後（ｎ＝４）、１週間後（ｎ＝１
５）、２週間後（ｎ＝４）および４週間後（ｎ＝４）に屠殺した。コントロール
動物を以下の３つのグループに分けた：１）損傷に供し、移植を行わず、そして
損傷の８日後（ｎ＝４）および２９日後（ｎ＝４）に屠殺したラット；２）損傷
の１日後にＰＢＳを注射し、そしてＰＢＳ注射の４日後（ｎ＝４）、７日後（ｎ
＝４）、１４日後（ｎ＝４）、および２８日後に屠殺したラット；３）開頭して
いるが、損傷も移植もしていない、開頭の８日後（ｎ＝４）、および２９日後（
ｎ＝４）に屠殺した偽コントロールラット。

【００２８】結果測定（行動、組織学）：加速的ロータロッド試験を用いて、運動機能を測
定した。測定は、損傷の２、５、１５、および２９日後に実施した。屠殺後、脳
切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、そして二重標識免疫組織化学を
行って、ＭＳＣ細胞型を同定した。

【００２９】結果：組織学的試験は、移植後に、ＭＳＣが生存し、増殖し、そして損傷部位
に移動することを示した。ＢｒｄＵ標識したＭＳＣは、星状細胞およびニューロ
ンのマーカーを発現した。ＭＳＣを移植したラットは、コントロール動物と比較
して、運動機能の有意な改善を示した。本発明者らのデータは、ＭＳＣの脳内移
植が、外傷性脳損傷後、神経機能を有意に改善することを示す。相完的セットの
試験において、本発明者らはまた、外傷性脳損傷に供したラットをＭＳＣで処置
した；しかし、この試験において、ＭＳＣは、動脈内（頸動脈内）投与により脳
に送達されなかった。データは、頭蓋内移植に類似した。ＭＳＣは、脳の損傷領
域に容易に移動し、そしてこれらの細胞は、脳細胞（星状細胞、ニューロン）の
タンパク質マーカーを発現した。従って、本発明者らの研究は、外傷性脳損傷が
、ＭＳＣの脳内投与または血管経路を有する投与により処置され得ることを示す
。

【００３０】（ＭＳＣの頭蓋内移植によるパーキンソンの処置（マウス））（ＭＰＴＰ法の説明および結果）成体雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８〜１２週齢、体重２０〜３５ｇ）を、この
実験に使用した。重篤な長く続く病変を得るために、マウスを、７日間続けて一
日一回、生理食塩水中のＭＰＴＰ塩酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ）の腹腔
内注射で処置した（全用量２１０ｍｇ／ｋｇ）。マウスの右線条に、定位置にＢ
ｒｄＵ標識したＭＳＣ（３×１０⁵／３μｌ）を直接移植した。

【００３１】（行動試験）各ＭＰＴＰ注射を受けたマウスは、文献［Ｈｅｉｋｋｉｌａら、ｌ．１９８９
］で報告されたように、行動異常性（運動不能、体位不安定性、震えおよび硬直
）を数時間示し続けた。

【００３２】ロータロッド試験を使用する薬物を使用しないパーキンソン病の評価は、Ｒｏ
ｚａｓら［１９９７、１９９８］により記載される。ＭＳＣ移植した、またはＭ
ＳＣ移植していないＭＰＴＰ−ＰＤマウスを、さらに増強した薬物注射を行うこ
となく、最後のＭＰＴＰ注射（安定な値を得るために、一日につき５回試行）の
後、増加速度（１６ｒｅｖ／分および２０ｒｅｖ／分）にて、ロータロッドを用
いて試験した。マウスがロータロッドから落ちた場合、試行を終了した。ＭＳＣ
移植により処置したパーキンソン病のマウスにおいて、コントロールのＭＰＴＰ
注射のみしたマウスと比較して、ＭＰＴＰ注射の３５日後に、運動機能の有意な
改善（ｐ＜０．０５）が観察された。図５は、ＭＰＴＰ神経毒性に供したマウス
のロータロッド結果を示す。以下の２つの実験を行った：マウスを１６ｒｐｍま
たは２０ｒｐｍで回転するロータロッドに配置した。このデータは、ＭＳＣで処
置したマウスが、ＰＢＳを脳内投与されたＭＰＴＰマウスと比較して、両方の角
速度のロータロッドにおける持続時間の有意な増加を示したことを示す。ＮＧＦ
と共に培養したＭＳＣで処置したマウスは、ＭＳＣ処置と比較して、その差違は
有意ではないものの、増加した利点を有するようである。

【００３３】（形態学的変化）生存ＢｒｄＵ免疫反応性細胞を、注射領域において同定し、そして３５日目に
、宿主線条までの可変距離まで移動させた（図１ｂ）。二重染色は、散在したＢ
ｒｄＵ反応性細胞（図１ｃ）が、移植片内で、チロシンヒドロキシル（ドーパミ
ンマーカー）免疫反応性を発現することを示す（図１ｄ）。

【００３４】結果：これらのデータは、ＭＳＣの脳内移植が、マウスにおけるパーキンソン
病の症状を軽減することを示す。

【００３５】（ＭＳＣの病変内移植による脊髄損傷の処置（ラット））（脊髄損傷の説明）脊髄損傷：重りの落下（２５ｍｍの高さから１０ｇ、「ＮＹＵ衝突」モデル）
を使用して衝突損傷を引き起こし、中程度の重篤度の脊髄損傷を生じさせた。成
体雄性Ｗｉｓｔａｒラット（３００±５ｇ）をペントバルビタール（５０ｍｇ／
ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、そして椎弓切除をＴ９レベルで行った。

【００３６】移植および行動試験：ＭＳＣ２．５×１０⁵／４μｌを、ＳＰＩの７日後に、
損傷の中心に注射した。Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（Ｂ
ＢＢ）ＬｏｃｏｍｏｔｏｒＲａｔｉｎｇスコアを、移植の前後に得た［Ｂａｓ
ｓｏら、１９９５］。図７は、脊髄損傷を受け、ＭＳＣ移植で処置された動物、
または単に同用量のビヒクルを投与された動物のＢＢＢ試験のデータを示す。全
てのラットは、脊髄損傷前に、２１のスコア（正常なスコア）を有し、そして挫
傷後に０〜６のスコアを有した。ＰＢＳ注射を受けた挫傷に供したラットにおい
て、スコアは、６．７（１週間）から１１．５（５週間）に改善した。コントロ
ールグループは、初期は神経学的機能の改善を有し、これは三週間目までに横ば
い状態に達した。ＭＳＣ移植を受けた挫傷に供したラットは、７．０（１週間）
および１５．３（５週間）の有意に改善されたスコアを有した。ＭＳＣで処置さ
れたグループは、この実験の終点である５週間目まで横ばい状態に達しない安定
した回復を示した。ＭＳＣで処置したラットは、処置効果について、別個の時点
の全ておよび各々について、ｐ値０．０１を有するＢＢＢスコアにおける有意な
改善を有した。機能的期間において、ＭＳＣ処置したグループにおける挫傷した
ラットは、前脚および後ろ脚が協調した、一貫した重量が支持された足底の歩調
で歩行し得た。逆に、ＰＢＳコントロールグループにおける挫傷したラットは、
明らかな運動機能欠陥を示した。

【００３７】（組織学的分析）ＭＳＣから誘導された細胞（ＢｒｄＵ免疫反応性によって同定される）は、Ｍ
ＳＣ移植後１週間〜４週間、生存し、そしてこの損傷組織（Ｔ９、図１ａ）にわ
たって分散された。ＢｒｄＵ反応性の細胞は、移植した細胞の中心から尾部およ
び頭部の両方に５ｍｍ移動した（図１ｂ）。図２ａは、Ｒｉｐに対する抗体が、
ＰＢＳ注射による未処置の挫傷ラットにおいて、損傷稀突起神経膠細胞と反応し
なかったことを示す。対照的に、脊髄損傷およびＭＳＣ移植後で（図２ｂ）、強
いＲｉｐ免疫反応性が、小さい直径および大きい直径の有髄線維を明確に区別し
た。二重免疫染色（図２ｃ〜ｄ）は、散乱したＢｒｄＵ反応性の細胞が、ニュー
ロンマーカー（ＮｅｕＮ）を発現することを実証する。

【００３８】（結論：）中程度〜重篤な脊髄損傷の損傷部位へのＭＳＣ移植による処置は、
運動機能の有意な改善を提供する。ＭＳＣは、ニューロンおよび稀突起神経膠細
胞のタンパク質マーカーを発現し、これは、これらの細胞が脊髄内に配置された
場合に、実質細胞の特性を獲得することを示す。

【００３９】（ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒ）（ＮＭＣスフェア）−ＣＮＳの
損傷および疾患の処置のための新規複合体）（ニューロスフェア実験の説明）本発明者らは、胎児ニューロスフェア由来の神経幹細胞、成体骨髄由来の間葉
幹細胞および成体Ｗｉｓｔａｒラット由来の脳脊髄液からなる凝集体（ＮＭＣス
フェアと呼ばれる）を使用した。胎児脳細胞を、１，１’−ジオクタデシル（ｄ
ｉｏｃｔａｄｅｃｙ）−６，６’−ジ（４−スルホフェニル）−３，３，３’，
３’−テトラメチルインドカルボシアニン（Ｄｉｌ）で前標識し、そして成体ラ
ット由来の骨髄間葉細胞を、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンペ
ルクロレート（ＤｉＯ）および／またはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で
前標識した。パラフィン凍結切片に対するレーザー走査共焦点顕微鏡（３次元）
および免疫組織化学的分析を使用して、本発明者らは以下を同定した：１．（細胞間相互作用）：ＮＭＣスフェア下で、骨髄間葉幹細胞から誘導された
細胞は、迅速に足場（１日目）および網状構造（９日目、図８）を経時的にイン
ビトロで形成する。図８は、細胞−ニューロスフェア統合後９日目の複合体ＭＳ
Ｃニューロスフェアを示す。このＭＳＣ（ＤｉＯおよびＢｒｄＵによって同定さ
れる）は、軸索樹状様の網状構造（黄緑）を形成する。２．（細胞間相互作用）：ＮＭＣスフェア下で、神経幹細胞から誘導された細胞
は、ニューロスフェア単独下よりも長い寿命を有した。ＮＭＣスフェアは、例え
ば、以下のタンパク質を発現する：未成熟神経細胞に通常見い出される、ネスチ
ン；分化した星状細胞についての特異的マーカーである、神経膠原線維酸性タン
パク質（ＧＦＡＰ）；稀突起神経膠細胞のマーカーである、ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）；および未成熟ニューロンについてのマーカーである、ニュー
ロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリン（ＴｕＪ１）、ならびにニューロン細
胞体および樹状突起についてのマーカーである微小管結合タンパク質−２（ＭＡ
Ｐ−２）。３．（ＮＭＣスフェア−微小環境）：ＮＭＣスフェアのサイズおよび構造は、培
地の微小環境によって影響され、すなわち、これらは、標準的なＤＭＥＭよりも
、幹細胞因子を含むＩＭＤＭ中でより良好に増殖する。４．（ＮＭＣスフェアの分泌）：ニューロスフェアおよびＭＳＣのための培地Ｄ
ＭＥＭおよびＩＭＤＭ内に、培養したＮＭＣスフェアからの上清を添加すること
は、それぞれ、ニューロスフェアおよびＭＳＣの両方の増殖を刺激した。この上
清によって、明らかな細胞間連結および増殖が誘導された。これは、ＮＭＣスフ
ェアが、幹細胞についての支持物質を分泌することを示唆する。これらの物質を
使用して、神経発生を増強し得る。５．脳脊髄液（ＣＳＦ）は、従来の培地より優れた、ＮＭＣスフェアを形成する
ための最適な微小環境を提供する。

【００４０】（ＮＭＣスフェアでの発作および脳外傷の処置）（ＭＣＡｏおよびＴＢＩ後のラットにおけるＭＳＣおよびニューロスフェア移
植のためのプロトコル）（ＭＣＡｏ）ＢｒｄＵ前標識したＭＳＣおよびニューロスフェアを混合し、そして７日間フ
ラスコで培養した。ＭＣＡｏ後２４時間で、ラットをハロタンで麻酔し、そして
複合体ＮＭＳスフェアを、脳に注射した（ｎ＝４）。これらの動物を、定位装置
（Ｍｏｄｅｌ５１６０３、ＳｔｏｅｌｔｉｎｇＣｏ．，ＷｏｏｄＤａｌｅ
，ＩＬ）上にマウントした。５ｍｌのＰＢＳ中２０個のスフェア（０．２ｍｍ未
満の直径）を、ブレグマに対して座標ＬＭ＝２．５ｍｍ、ＶＤ＝４．５ｍｍおよ
びＡＰ＝０ｍｍの右線条に、およびＬＭ＝２．５ｍｍ、ＶＤ＝２ｍｍおよびＡＰ
＝０ｍｍの右皮質に、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジによって垂直に注射した。この
位置は、虚血性の境界領域に近接する。３μｌのスフェアを、線条に最初に注射
し、そして２ｍｌを、各スポットにおいて１０分にわたって皮質に注射した。針
を、さらに５分間皮質中に保持し、注射領域から脳表面への骨髄の逆流を回避し
た。注射後、骨ろう（Ｗ８１０、Ｅｔｈｉｃｏｎ）を、頭蓋に配置し、溶液の漏
出を妨げた。ラットを、ＭＣＡｏ後１４日目で屠殺した。

【００４１】（外傷性脳損傷（ＴＢＩ））ＢｒｄＵ前標識したＭＳＣおよびニューロスフェアを混合し、そして７日間フ
ラスコで培養した。ＴＢＩ後４日目に、ラット（ｎ＝４）を、含水塩化物（ｃｈ
ｌｏｒｉｄｅｈｙｄｒａｔｅ）で麻酔し、そして定位枠上に配置し、次いで、
先に損傷させた領域を露出させた。２０ＵＬのＰＢＳ中の１５の調製した混合Ｎ
ＭＣスフェア（０．２５ｍｍ直径）を含む、ガラスチップ（０．５ｍｍ直径）を
有するピペットを、この定位枠上に固定した。針の先端を、損傷領域の中心部位
に、脳の表面から２．５ｍｍ離して挿入した。５分間にわたって脳にスフェアを
注射し、次いで、さらに５分間維持して逆流を回避した。両実験セット（発作お
よびＴＢＩ）において、機能的結果の測定を、ロータロッド試験および粘着除去
試験を使用して測定した。

【００４２】（結果）：発作およびＴＢＩの両方における機能的利点は、ＮＭＣスフェアで
処置したラットにおいて明らかであった。これらのデータは、ＮＭＣスフェアが
、発作および脳損傷の処置に使用され得ることを示す。この複合体は、ＣＮＳ損
傷および神経変性の処置の潜在能力を有する新規な物質である。

【００４３】（神経損傷および神経変性の処置のためのＭＳＣの培養に使用される新規培地
（増殖因子含有および非含有）の説明）一次骨髄細胞を、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、１５０ｍｇ／ｋｇ）での
成体Ｗｉｓｔｅｒラットの処置後４８時間で獲得し、そして１０％胎仔ウシ血清
（ＦＢＳ）および幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したイソコブ（Ｉｓｏ
ｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で培養した。粘着性ＭＳＣを、神
経成長因子（ＮＧＦ、２００ｎｇ／ｍｌ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１
００ｎｇ／ｍｌ）および上皮増殖因子（ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ）を含む新鮮な
ＩＭＤＭ中に１ヶ月間再懸濁した。コントロールＭＳＣを、神経成長因子を含ま
ないＩＭＤＭ中で培養した。ニューロン核（ＮｅｕＮ）、微小管結合タンパク質
−２（ＭＡＰ−２）および神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に対する抗
体を、培養細胞の免疫細胞化学的同定に使用した。

【００４４】このデータは、成体骨髄幹細胞および前駆細胞由来の細胞が、培養物中で多量
に増殖し得、ニューロンおよび星状細胞に特徴的なタンパク質を発現し得ること
を示す。神経栄養増殖因子は、インビトロで、骨髄細胞由来の細胞の神経発現を
増強する。免疫細胞化学的染色は、神経栄養増殖因子を含まないコントロールＭ
ＳＣが、ニューロンＮｅｕＮ（約１％、図１ａ）および星状細胞ＧＦＡＰ（約３
％、図１ｂ）を発現することを示す。しかし、神経栄養増殖因子（例えば、ＮＧ
Ｆ）で処理したＭＳＣは、ニューロンＮｅｕＮ（約３％、図１ｃ）および星状細
胞ＧＦＡＰ（約３０％、図１ｄ）を発現する。

【００４５】ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ、３Ｆｇ／ｍｌ）（これは、分裂細胞に取
り込まれ、そして新しく形成されたＤＮＡを同定する）を、移植７２時間前に培
地に添加した。３’３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、褐色）と共に免疫ペルオ
キシダーゼを使用し、そしてヘマトキシリンによって対比染色して、骨髄細胞を
ＢｒｄＵに対する抗体によって同定する。ＢｒｄＵで標識されたＭＳＣの数は、
インビトロで約９０％である。

【００４６】（考察）このデータは、培養成体骨髄細胞（特に、骨髄幹細胞（ＭＳＣ））が、虚血、
脳外傷および脊髄外傷、ならびにパーキンソン病後の成体齧歯類脳において生存
し、そして実質様細胞に分化すること、および骨髄が、ＶＺ／ＳＶＡＮＳＣの
顕著な増殖、分化および移動を促進することを実証する。

【００４７】多能性骨髄細胞は、正常ラット脳においてグリアになり（Ａｚｉｚｉら、１９
９８）、そしてＭＣＡｏ後の細胞増殖および細胞特異的分化を促進する。骨髄移
植実験は、骨髄細胞の運命をモニタリングする高感度の手段を必要とする。トレ
ーサーおよびマーカー（例えば、ＢｒｄＵ、ＣＤ３４、ネスチン、ＰＣＮＡ）を
保有する骨髄細胞により補助される。ＭＣＡｏ後の新しい虚血性の微小環境に曝
露された成体骨髄由来の多能性造血幹細胞および間葉幹細胞は、増殖しそしてニ
ューロン細胞（ＭＡＰ−２、ＮｅｕＮ）表現型およびグリア細胞（ＧＦＡＰ）表
現型に分化するように誘発される。新鮮な骨髄または支質体液因子（ｓｔｒｏｍ
ａｈｕｍｏｒａｌｆａｃｔｏｒ）はまた、分化因子の供給源であり、そして
ＶＺ／ＳＶＺから神経幹細胞の増殖、移動および分化を増強するための走化性微
小環境を提供する。

【００４８】哺乳動物前脳のＶＺ／ＳＶＺは、妊娠後期に発生し、拡大し、次いでサイズが
減少するが、生涯、痕跡形態で存続する、胚性マトリクスの領域である（Ｇａｇ
ｅ１９９８）。正常成体脳において、前脳ニューロン産生の非存在は、適切な
神経幹細胞の欠失を反映するのではなく、むしろ分裂後期の栄養支持および遊走
（移動）支持の持続性の阻害および／または欠失を反映する。正常ＶＺ／ＳＶＺ
内の休止ＣＮＳ幹細胞を細胞周期に進入するよう誘発するシグナルは、まだ解明
されていないが、これらのデータは、病変性ＣＮＳが、インタクトなＣＮＳとは
異なる環境であり、そして神経幹細胞の最終分化された表現型を顕著に変更する
ことを示す。重要なことに、成体前脳中のＶＺ／ＳＶＺが、受動性の虚血切迫性
のゾーンではなく、虚血領域から離れて位置し（図３Ｆ〜Ｈ）、脳を再構築する
ための細胞を提供する活性組織である。ＶＺ／ＳＶＺ細胞は、ＭＣＡｏ後にニュ
ーロン表現型およびグリア表現型に増殖および分化する。成体ＮＳＣから生じる
ニューロンの生存は、遊走の許容性経路の利用能および遊走が生じる環境の両方
によって決定される。新しいニューロンは、ＶＺ／ＳＶＺから離れて、放射状の
誘導線維（ｒａｄｉａｌｇｕｉｄｅｆｉｂｅｒ）を介して脳実質に進入する
。これらの線維は、成体ラットの脳室上衣中の細胞体から出発し（図２Ｋ〜Ｌ）
、そして発生中に見い出されるような遊走の許容性経路を提供する（Ｒａｋｉｃ
１９７２）。移植片およびＶＺ／ＳＶＺ内の有糸分裂は、移植された細胞と共
に虚血性の損傷された脳が、発生初期に戻って修復を促進することを示す。これ
らのデータは、成体脳が、新しいニューロンを形成し得るという観察（Ｇａｇｅ
１９９８）と一致する。

【００４９】要約すると、これらのデータは、発作性の神経損傷およびパーキンソン病後の
脳内および脈管内の骨髄移植が、機能的回復を有意に改善することを示す。移植
はまた、外因性骨髄幹細胞および内因性ＮＳＣの増殖および分化を増強する。骨
髄吸引および生検は、臨床疾患の診断および処置に使用されている。骨髄移植は
、損傷した脳および脊髄の可塑性を誘導するための新しい手段を提供し、そして
神経損傷および神経変性の処置のための治療ストラテジーを提供する。

【００５０】さらに、新規物質である、ＭＳＣおよびニューロスフェアの複合体を同定し、
これは、発作または外傷後の脳に移植した場合に、機能的回復を改善する。

【００５１】本出願を通して、種々の刊行物が、著者および年によって参照される。これら
の刊行物の全ての引用を、以下に列挙する。これらの刊行物のそれら全体の開示
は、本発明が属する技術状態をより十分に記載するために、本出願に参考として
本明細書中に援用される。

【００５２】本発明は例示的様式で記載され、そして使用される技術用語は、限定ではなく
記載のための用語であることが意図されることが理解される。

【００５３】明らかに、本発明の多くの改変および変更が、上記の教示を考慮して可能であ
る。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明が、具体的に記載される以外で
実施され得ることが理解される。

【００５４】（参考文献）

【００５５】

【表１】添付の図面と関連して考えられる場合、同じことが以下の詳細な説明に対する
参考によりより良く理解されことから、本発明の他の利点が容易に理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１Ａ〜Ｂは、骨髄移植による、ＭＣＡｏの２時間後のラット脳の３領域の図
である。

【図２】図２Ａ〜Ｌは、代表的タンパク質の免疫反応性におけるＨ＆Ｅ調製切片の骨髄
細胞を示し、骨髄移植４日後に殺傷されたラット由来の、一連の隣接する切片の
ＩＢＺにおける写真である（Ａ−Ｈ）。図２Ｉは、神経特異的核タンパク質（Ｎ
ｅｕＮ）を示し；図２Ｊは、上衣細胞に隣接した細胞の骨髄細胞移植が、ニュー
ロンマーカーＭＡＰ−２に対して反応性を示すことを示し；そしてＫ〜Ｌは、Ｓ
ＶＺの細胞が、ＮｅｕｒｏＤおよびＧＦＡＰタンパク質マーカーを発現するこ
とを示す。

【図３】図３Ａ〜Ｈは、ＭＣＡが骨髄細胞移植により移植された後、大脳組織のＨ＆Ｅ
調製切片を示す写真である。図３Ｉ〜Ｊは、４日目の骨髄移植片内におけるアポ
トーシス様細胞を示した、ＴＵＮＥＬ染色を示す写真である。

【図４】図４Ａ〜Ｃは、それぞれ、粘着除去試験、ロータロッド運動試験および神経学
的重篤性のスコアからのデータである。

【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＭＳＣ移植により処置されたマウスが、ロータロッドにおける
持続期間において有意な改善を示したことを示す移植片、およびビヒクルで処置
された動物と比較してどれほど神経学的機能を改善したかを示す。

【図６】図６Ａ〜Ｂは、ラットが、ＭＳＣ動脈内移植により、粘着除去試験において有
意な改善を示したこと、およびコントロールと比較して１４日の改変された神経
学的重篤度スコアを示す。

【図７】図７Ａ〜Ｂは、コントロール虚血性ラットと比較した、脈管内にＭＳＣを投与
されたラットの機能性データを示す。

【図８】図８は、ＭＰＴＰ神経毒性に供されたマウスのロータロッドデータを示す。

【図９】図９Ａ〜Ｄは、形態学的変化を示す。すなわち、ＭＰＴＰ−ＤＰマウスにおい
て、ＭＳＣ移植後４５日で、ほとんどの縮んで着色されたニューロンが消失し、
およびそれらのほんの少しだけが黒質において観察された；生存可能なＢｒｄＵ
免疫反応性細胞が、注射領域において同定され、そして４５日で宿主線条の中へ
不定の距離で移動した、；二重染色が、散在したＢｒｄＵ反応性細胞が移植片内
でＴＨ免疫反応性を発現することを示す。

【図１０】図１０は、脊髄損傷に供された動物のＢＢＢ試験からのデータを示す。

【図１１】図１１は、細胞ニューロスフェア形成９日後の複合体ＭＳＣニューロスフェア
を示す写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4C087 AA01 AA02 BB44 BB64 MA66 NA14 ZA02 ZA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】脳または脊髄の損傷あるいは神経変性疾患に罹患している患
者を処置する方法であって、以下の工程：必要とされる該患者の脳または脊髄へ、培養した骨髄細胞を脈管内投与する工
程または移植する工程；および該患者の脳において新しいニューロンを発生させる工程を包含する、方法。
【請求項２】損傷した脳または脊髄においてニューロン細胞の分化を活性
化する方法であって、以下の工程：骨髄細胞を該損傷した脳細胞に隣接させて移植する工程；および内因性中枢神経系の幹細胞を活性化して、ニューロンに分化させる工程を包含する、方法。
【請求項３】損傷した脳細胞または脊髄細胞を処置する方法であって、以
下の工程：培養した骨髄細胞を該損傷した脳細胞の近辺に移植する工程；および培養した骨髄細胞の移植または脈管内（動脈内、静脈内）注射の位置で、新し
いニューロンを発生させる工程を包含する、方法。
【請求項４】ＭＳＣおよびニューロスフェアの複合体を注射または移植す
ることによって、損傷した脳または脊髄を処置する方法。