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JP2002543980A - 混合床固相及び核酸の単離におけるその使用 - Google Patents

混合床固相及び核酸の単離におけるその使用

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JP2002543980A
JP2002543980A JP2000618447A JP2000618447A JP2002543980A JP 2002543980 A JP2002543980 A JP 2002543980A JP 2000618447 A JP2000618447 A JP 2000618447A JP 2000618447 A JP2000618447 A JP 2000618447A JP 2002543980 A JP2002543980 A JP 2002543980A
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Abstract

(57)【要約】 混合床固相が、このような固相を使用して標的核酸、例えば、プラスミドDNA、染色体DNA、RNA、又は酵素増幅により生成された核酸をタンパク質、脂質、細胞デブリ、又はその他の核酸を含む汚染物質から単離する方法とともに提供される。本発明の混合床固相は少なくとも２種の異なる固相の混合物であり、これらの夫々が異なる溶液条件下で標的核酸に結合する能力、及び同様の溶離条件下で核酸を放出する能力を有する。溶液条件を本発明の方法に従って交換することにより、汚染物質を混合床固相に結合された標的核酸から除去し、次いで標的核酸を溶離緩衝液中に溶離することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 関連出願の相互参照 この出願は1999年５月14日に出願された米国特許出願第09/312,139号の利益を
主張する。 本発明は一般に汚染物質、例えば、タンパク質、脂質、細胞デブリ、又はその
他の核酸から核酸、例えば、プラスミドDNA、染色体DNA、全RNA、mRNA、ウイル
スDNA、ウイルスRNA、又はRNA/DNAハイブリッドを単離するための材料及び方法
に関する。本発明は、特に、一つの組の溶液条件下で標的核酸に結合し、また別
の組の溶液条件下で標的核酸を放出する、磁性又は非磁性のマトリックス及びク
ロマトグラフィー固定相を含む、固相に関する。更に特別には、本発明は少なく
とも２種の異なる固相を含む混合床固相に関するものであり、混合物中の夫々の
固相が異なる条件下で標的核酸に結合し、また標的核酸を放出する。
【０００２】 （背景技術） 多くの分子生物学的技術、例えば、逆転写、クローニング、制限分析、増幅及
び配列決定はその技術に使用される核酸がこのようなプロセシング操作又は分析
操作を妨害し得る汚染物質を実質的に含まないことを必要とする。一般に、この
ような汚染物質として、化学反応を阻止もしくは抑制する物質（例えば、核酸に
ハイブリダイズする物質、もしくは酵素触媒反応、及び分子生物学的技術に使用
されるその他の型の反応を阻止もしくは抑制する物質）、核酸もしくは関係する
その他の生物学的物質の分解もしくは解重合を触媒する物質、又は関係する核酸
の検出を阻止もしくはマスクする物質が挙げられる。この最後の型の物質は、関
係する核酸が実際にサンプル中に存在しない場合に或る量の関係する核酸（又、
本明細書中、“標的核酸”と称される）のサンプル中の存在を示す“バックグラ
ウンド”を与えることにより阻止又はマスクし得る。又、汚染物質として、標的
核酸が単離されるin vivoもしくはin vitro培地からの巨大分子物質、酵素、そ
の他の型のタンパク質、多糖、もしくはポリヌクレオチドの如き巨大分子物質だ
けでなく、低分子量物質、例えば、脂質、低分子量酵素インヒビター、オリゴヌ
クレオチド、又は非標的核酸が挙げられる。又、汚染物質はその物質をその他の
物質から単離するのに使用される薬品又はその他の物質から標的生物学的物質に
導入し得る。この最後の型の普通の汚染物質として、痕跡金属、色素、及び有機
溶媒が挙げられる。
【０００３】 分子生物学的適用のために汚染物質を充分に含まない標的核酸を得ることは、
標的核酸が典型的に見られる複雑な系により複雑にされる。このような系（例え
ば、組織からの細胞、体液、例えば、血液、リンパ液、母乳、尿、糞、精液等か
らの細胞、培養液、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル中の細胞、又は
標的核酸増幅が行なわれた溶液）は典型的には関係する標的核酸が分子生物学的
操作に使用される前に単離される必要があるかなりの量の汚染物質を含む。
【０００４】 エンドトキシンはグラム陰性バチルスから単離された核酸の製剤中の特に問題
のある汚染物質である。一般に言えば、エンドトキシンは大腸菌（“E. coli”
）を含む、殆どのこのようなバチルスの細胞壁中に見られるリポ多糖物質である
。E. coli 形質転換体からプラスミドDNAを放出するために行なわれるような細
菌細胞の分解中に、エンドトキシンがそれにより生成された細胞分解産物中に放
出される。核酸サンプル中のエンドトキシン汚染は、特に、このような汚染に感
受性である適用において、サンプルの実用性をひどく制限し得る。例えば、HeLa
、Huh7、COS7、及びLMHを含む、幾つかの異なる培養真核生物細胞系のトランス
フェクション効率がエンドトキシンの存在下で急激に低下されることが示されて
いた（Weber, M.ら 1995, BioTechniques 19(6):930-939）。又、エンドトキシ
ンはエントリー−コンピテントアデノウイルス粒子の存在下で原発性ヒト細胞、
例えば、原発性ヒト皮膚繊維芽細胞及び原発性ヒトメラノーマ細胞に毒性である
ことが知られていた（Cotten, M.ら 1994, Gene Therapy 1:239-246）。又、エ
ンドトキシンは動物に導入された時に高熱、血管拡張、下痢及び、極端な場合に
は、致死性ショックを含む顕著な病態生理学的反応を生じることが示されていた
（Morrison, David C. 1987, Ann. Rev. Med. 38:417-32）。
【０００５】 エンドトキシンは核酸、特にプラスミドDNAから容易に分離されない。エンド
トキシンはミセルを形成する傾向があり、これらはエンドトキシンミセルの外表
面でプラスミドDNAと同様の密度、サイズ及び電荷分布を有する。結果として、
エンドトキシンは今日使用される殆どの核酸単離操作において核酸、特にプラス
ミドDNAと同時純化する。例えば、エンドトキシンは細菌細胞分解産物中でプラ
スミドDNAをその他の物質から分離するのに使用される塩化セシウム勾配でDNA-
臭化エチジウム複合体と同じバンド中に現れる。又、エンドトキシンはサイズ排
除及び陰イオン交換樹脂からプラスミドDNAと同時移動し、同時溶離する。
【０００６】 細菌を含む、種々の型の細胞からDNA又はRNAを単離するための通常のプロトコ
ルは細胞分断工程で始まる（例えば、F. Ausubelら編集, Current Protocols in
Molecular Biology, Wiley-Interscience, New York (1993)の２章(DNA)及び４
章(RNA)を参照のこと）。通常のDNA単離プロトコルは一般に細胞を溶液中で懸濁
し、酵素及び／又は薬品を使用して、細胞を穏やかに分解し、それにより細胞内
に含まれたDNAを得られる細胞分解産物溶液に放出することを伴う。RNA単離につ
いて、通常の細胞分解操作及び可溶化操作はRNAから分離すべきDNAを含む、リボ
ヌクレアーゼ及び汚染物質の抑制のための手段を含む。
【０００７】 上記の細胞から生成された混合物を含む、標的核酸及び汚染物質の種々の混合
物から標的核酸を単離するための多くの通常の操作は、フェノール、クロロホル
ム、及び臭化エチジウムの如き有害な薬品の使用を伴う。例えば、フェノール又
はフェノール及びクロロホルムを含む有機溶媒混合物が多くのこのような通常の
操作に使用されて標的核酸及び種々の汚染物質の混合物から汚染物質を抽出する
。又、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配がフェノール又はフェノール−クロロ
ホルム抽出に代えて、又は加えて使用される。閉環DNA、例えば、プラスミドDNA
は臭化エチジウムとインターカレーションして数時間の超遠心分離後に形成され
た塩化セシウム勾配中にバンドを形成する。DNA/臭化エチジウムバンドがそれか
ら抽出され、ブタノール又はその他の通常の手段を使用してプラスミドDNAが臭
化エチジウムから単離される（例えば、Sambrookら(1989)により編集され、Cold
Spring Harbor Pressにより発行されたMolecular Cloning, 1.42-1.50頁を参照
のこと）。フェノール／クロロホルム抽出工程、又は塩化セシウムバンディング
及び臭化エチジウム抽出工程に続いて、エタノールを抽出水相に添加することに
よるその水相中に残っている核酸物質の沈殿が一般に行なわれる。沈殿が典型的
には遠心分離により溶液から除去され、沈殿の得られるペレットが乾燥され、そ
の後に更なるプロセシング又は分析のために水又は緩衝液中で再度懸濁される。
【０００８】 このような通常の核酸単離操作は重大な欠点を有する。これらの欠点の中に、
多くのプロセシング工程及び抽出工程に必要とされる多量の時間、並びにフェノ
ール及び／又はクロロホルムを使用することの危険がある。フェノールは接触す
るとひどい火傷を生じる。クロロホルムは高度に揮発性、毒性かつ発癌性である
。これらの特性はフェノールがヒュームフード中で取り扱われ、フェノール／ク
ロロホルム抽出が行なわれることを必要とする。フェノール／クロロホルム抽出
の別の望ましくない特徴はフェノールの酸化生成物が核酸を損傷し得ることであ
る。新たに再蒸留されたフェノールのみが有効に使用され、核酸がフェノールの
存在下で残され得ない。一般に又、多工程操作がフェノール／クロロホルム抽出
後にRNAを単離するのに必要とされる。エタノール（又はイソプロパノール）沈
殿がDNAをフェノール／クロロホルム抽出されたDNAの水溶液から沈殿させ、残留
フェノール及びクロロホルムをDNAから除去するのに使用される必要がある。更
に、エタノール（又はイソプロパノール）沈殿は若干のヌクレオシドトリホスフ
ェート及び短い（即ち、約30未満の塩基又は塩基対）一本鎖又は二本鎖オリゴヌ
クレオチド汚染物質をDNAから除去するのに必要とされる。更に、最良の状況下
で、このような方法は単離された核酸物質の比較的低い収率を生じ、単離された
核酸物質が不純物で汚染されている。
【０００９】 塩化セシウム勾配は生成するのに時間を要し、最速の最新の遠心分離でさえも
少なくとも４時間のスピン時間を必要とする。このような勾配におけるプラスミ
ド又は染色体DNAのバンディングに必要とされる臭化エチジウムは突然変異原で
ある。又、塩化セシウムバンディングが先行又は続行するタンパク質抽出工程、
例えば、フェノール／クロロホルム抽出を用いないでプラスミドDNAを細菌細胞
分解産物から単離するのに使用される場合、それにより単離されたプラスミドDN
Aはエンドトキシンで高度に汚染されることが知られていた（例えば、Cottenら,
Gene Therapy (1994) 1:239-146, 240〔表1〕を参照のこと）。 幾つかの更に簡単、迅速、かつ安全な方法が開発されており、これらはクロマ
トグラフィー樹脂又はシリカをベースとする材料の如き固相を利用して細胞分解
産物又は核酸と汚染物質のその他の混合物から核酸を単離する。しかしながら、
今までに開発された夫々のこのような単離系はそれ自体の特異な欠点を有する。
詳しくは、殆どのこのような固相抽出系はエンドトキシンの如き望ましくない汚
染物質を排除することができないし、又それらは初期の核酸混合物中に存在しな
い望ましくない汚染物質、例えば、プロテアーゼもしくは腐食性塩を導入する。
それにより単離された核酸がこのような汚染物質に感受性の適用に使用し得る前
に、夫々のこのような汚染物質が付加的な抽出工程を使用して除去される必要が
ある。
【００１０】 核酸の単離用に開発された最初の固相の一つは高性能液体クロマトグラフィー
(HPLC)用に設計された多孔性シリカゲル粒子の特殊樹脂であった。多孔性シリカ
ゲル粒子の表面は陰イオン交換体（これらは或る塩条件及びpH条件下でプラスミ
ドDNAと交換し得る）で官能化された（米国特許第4,699,717号及び同第5,057,42
6号明細書を参照のこと）。マチリィ−ナーゲル社（デュレン、ドイツ）はこの
ような陰イオン交換シリカゲル粒子で装填されたHPLCカラムを提供した最初の会
社の一つであった。マチリィ−ナーゲル社は今日このようなカラムを販売し続け
ている（例えば、http://www.machrey-nagel.com.で6/12/98のインターネットの
マチレィ−ナーゲルホームページからダウンロードされた製品情報中のヌクレオ
ゲン（登録商標）4000-7DEAEに関する情報を参照のこと）。夫々のこのようなカ
ラムはそれに結合されたプラスミドDNAが高濃度の高度に腐蝕性の塩を含む水溶
液中で溶離されるように設計された（例えば、プラスミドDNAが6M尿素中でヌク
レオゲン（登録商標）4000-7DEAEカラムから溶離される）。夫々のこのようなカ
ラムはその系からのDNAとともにカラムに結合された腐食性の塩及び汚染物質を
除去するために夫々の単離操作の間に充分に洗浄される必要があった。又、それ
から溶離された核酸溶液は、それが通常の分子生物学的技術、例えば、クローニ
ング、形質転換、制限酵素による消化、又は増幅に使用し得る前に腐食性の塩を
それから除去するために更に処理される必要があった。
【００１１】 種々のシリカをベースとする固相分離系が上記の早期HPLC系以降開発されてい
た。最新のシリカをベースとする系は調節された細孔ガラス、シリカ粒子が埋め
込まれたフィルター、シリカゲル粒子、ケイソウ土の形態のシリカを含む樹脂、
ガラス繊維又は上記の混合物を利用する。夫々の最新のシリカをベースとする固
相分離系はカオトロピック試薬の存在下で核酸物質を含む媒体と接触して置かれ
た時にこのような物質を可逆的に結合するように構成される。このような固相は
固相が遠心分離又は真空濾過の如き外部の力に暴露されてマトリックス及びそれ
に結合された核酸物質を残りの媒体成分から分離する間に核酸物質に結合された
ままであるように設計される。次いで核酸物質が固相を溶離溶液、例えば、水又
は溶離緩衝液に暴露することにより固相から溶離される。多くの商用源が遠心分
離及び／又は濾過単離系中の使用のために設計されたシリカをベースとする樹脂
を提供する〔例えば、プロメガ・コーポレーション（マジソン、ウィスコンシン
、U.S.A.）からのウィザードTMDNA精製系製品；又はキアゲン社（サンタクラリ
タ、カリフォルニア、U.S.A.）からのQiaPrepTMDNA単離系を参照のこと〕。
【００１２】 又、タンパク質又は抗体の如きポリペプチドを単離し、精製するのに以前使用
された、磁気応答性粒子が、核酸を単離する際の固相としての使用のために開発
されていた。このような物質の単離に設計された磁気応答性粒子の幾つかの異な
る型が文献に記載されており、粒子のこれらの型の多くが商用源から入手し得る
。このような粒子は一般に二つのカテゴリー、即ち、核酸物質を直接に可逆的に
結合するように設計されたもの、及び仲介により核酸物質を可逆的に結合するよ
うに設計されたもののいずれかに入る。最初の型の粒子の例について、DNAに直
接に可逆的に結合するように設計されたシリカをベースとする多孔性粒子、例え
ば、プロメガ・コーポレーションから製造、市販されているMagneSilTM粒子、又
はパーセプチブ・バイオシステムズから入手し得るBioMag（登録商標）磁性粒子
を参照のこと。核酸の一つの特別な型（mRNA）を可逆的に結合するように設計さ
れた第二の型の粒子及び系の例について、プロメガ・コーポレーションからのPo
lyA Tract（登録商標）シリーズ9600TMmRNA単離系、又はバングス・ラボラトリ
ィズ（カーメル、インジアナ、U.S.A.）からのストレプトアビジン被覆微小球体
粒子のProActiveTM系を参照のこと。これらの最後の二つの系の両方がそれに共
有結合されたアビジンサブユニットを有する磁気応答性粒子、及びそれに共有結
合されたオリゴdT部分を有するストレプトアビジンを使用する。ストレプトアビ
ジン−オリゴdT分子は仲介として作用し、それと接触して置かれた時にmRNA分子
のポリＡテールにハイブリダイズし、次いで放出可能なストレプトアビジン−ア
ビジン結合により粒子に結合する。
【００１３】 核酸単離又は分離のための間接結合磁気分離系は全て少なくとも三つの構成成
分、即ち、磁性粒子、仲介物、及び関係する核酸物質を含む媒体を必要とする。
仲介物／核酸ハイブリダイゼーション反応及び仲介物／粒子結合反応はしばしば
互いに異なる溶液条件及び／又は温度反応条件を必要とする。核酸単離操作に使
用される夫々の付加的な構成成分又は溶液がヌクレアーゼ、金属、及びその他の
有害な物質による単離された最終生成物の汚染のリスクを加える。
【００１４】 磁気応答性のシリカをベースとする粒子の種々の型が直接又は間接の核酸結合
単離方法における固相としての使用のために開発されていた。一つのこのような
粒子型は、好ましくは調節された細孔サイズの、磁気応答性ガラスビードである
。例えば、CPG社（リンカーン・パーク、ニュージャージー、U.S.A.）からの磁
性多孔性ガラス(MPG)粒子、又は米国特許第4,395,271号、同第4,233,169号、も
しくは同第4,297,337号に記載された多孔性磁性ガラス粒子を参照のこと。核酸
物質はガラスに非常にしっかりと結合する傾向があるが、一旦それに結合される
と、除去し難いことがある。それ故、磁性ガラス粒子からの溶離効率が少量の核
酸結合材料、例えば、シリカを含む粒子からの溶離効率と較べて低い傾向がある
。 核酸、特にDNAの直接結合及び単離における固相としての使用のために設計さ
れた磁気応答性粒子の別の型は、更に小さい強磁性粒子が埋め込まれ、ガラスで
被覆されたアガロースを含む粒子である（例えば、米国特許第5,395,498号を参
照のこと）。核酸の直接結合及び単離のために設計された磁気応答性粒子の第三
の型は磁性材料をポリマーの二酸化ケイ素化合物のマトリックスに混入すること
により製造される（例えば、ドイツ特許第DE4307262A1号を参照のこと）。磁性
粒子の最後の二つの型、即ち、アガロース粒子及びポリマーの二酸化ケイ素マト
リックスは、核酸物質を夫々のこのような磁性粒子に直接結合するのに必要とさ
れる条件下で鉄を媒体に滲出する傾向がある。又、それに結合された核酸物質の
迅速かつ有効な単離を確実にするのに充分な一様かつ集中された磁気能力を有す
るこのような粒子を製造することは困難である。
【００１５】 シリカをベースとする固相核酸単離系（磁性又は非磁性をベースとしているか
、又は直接結合もしくは間接結合のために構成されているかを問わない）は使用
するのに迅速かつ容易であり、腐食性又は有害な薬品の使用を必要としない。し
かしながら、このような系は核酸をエンドトキシンの如き汚染物質から単離する
のに有効ではなく、これらは核酸と同じ条件下でこのような固体担体に結合し、
それらから溶離する傾向がある（例えば、Cotten, Mattら, Gene Therapy (1994
) 1:239-246を参照のこと）。
【００１６】 タンパク質を含む核酸溶液が上記の型のシリカをベースとする固体担体を使用
する核酸の単離の前にプロテアーゼで前処理されてその中に含まれるタンパク質
の少なくとも一部を消化する幾つかの核酸単離系が開発されていた。例えば、プ
ロテアーゼを利用する、キアゲン社（サンタクラリタ、カリフォルニア）により
提供されるQiaAmpTM血液キット、及びアルカリ性プロテアーゼを利用する、プロ
メガ社（マジソン、ウィスコンシン）により提供されるウィザード（登録商標）
プラスSVミニプレプスDNA精製系を参照のこと。しかしながら、このような前処
理系は別の汚染物質を消化するために混合物への一種の汚染物質の混入を必要と
する。キャリィオーバープロテアーゼはプロテアーゼが消化するのに導入される
タンパク質で汚染された核酸サンプルと少なくとも同じ位に多くのこのような修
飾されたシリカをベースとする系を使用して単離された核酸の実用性を制限し得
る。詳しくは、適当な溶液条件が与えられると、核酸溶液中のプロテアーゼは下
流のプロセシング又は分析のためにその中に含まれた核酸を修飾し、切断し、又
は転写するためにその中に導入された酵素を含む、溶液に導入されたあらゆるタ
ンパク質を消化するであろう。又、プロテアーゼ添加、インキュベーション及び
除去工程がこのような付加的な工程を含まない単離系と較べて時間及び金を消費
して核酸単離のコストを上昇する。
【００１７】 上記の全ての固相系において、その中に使用される夫々の固相は、シリカもし
くはシリカゲル表面の形態、又は陰イオン交換体活性を示す化学基で修飾された
シリカゲルもしくはポリマー表面の形態の、関係する核酸を結合するように設計
された実質的に一様な表面組成を有する。又、バイモーダル系及びマルチモーダ
ル系が開発されており、多カラムの夫々が系中のその他のカラムとは異なる化学
基で修飾された固相を含み（例えば、Wheatley J. B., J. Chromatogr. (1992)
603: 273）、又は少なくとも二つの異なる化学基を有する単一固相を含む単一カ
ラムが使用される（例えば、特許'680；Little, E. L.ら, Anal. Chem. (1991)
63: 33）。単一カラム又は多カラムマルチモーダル系中の固体担体の表面にある
化学基の夫々は、どんな基質が系中に導入されようとも、異なる物質に結合する
ように構成される。二三のこのようなバイモーダル又はマルチモーダルカラムク
ロマトグラフィー系のみが核酸単離のために特別に開発されていた（例えば、米
国特許第5,316,680号を参照のこと）。このような固相系中に使用される表面基
組み合わせは逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ
排除クロマトグラフィー、通常の相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマ
トグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、及びアフィニティークロマ
トグラフィーを含む。このような系は表面基の一つのみが核酸の如き標的種を結
合し、一方、一つ以上のその他の表面基が混合物中の一種以上の非標的種に結合
し、これらを除去するように設計される。
【００１８】 バイモーダル系及びマルチモーダル系は上記の核酸単離の通常の有機方法又は
樹脂方法の簡単な有効な別法ではない。多カラム系は本来運転するのに複雑であ
る。何とならば、夫々のカラムが系の静止固定相に結合された所望の標的又は非
標的種を結合し、かつ／又は放出するための移動相条件の特異な組を必要とする
からである。非標的種は標的種に結合するように構成された隣接官能基をブロッ
クする傾向があり、こうして全収率に悪影響する。又、全てのバイモーダル系又
はマルチモーダル系は官能基がアフィニティーを有するその他の基から標的種を
分離するように設計されているにすぎない。 分子生物学操作に使用される、汚染物質、特にエンドトキシンを充分に含まな
い標的核酸を迅速、安全かつ有効に単離し得る材料及び方法が必要とされる。本
発明は標的核酸とグラム陰性細菌の細胞分解産物を含む、汚染物質の混合物から
標的核酸を単離するのに迅速かつ有効な手段を与え、それにより培養細胞のトラ
ンスフェクション及び生物への核酸のin vivo投与を含む、種々の生物学的適用
に使用し得る精製核酸を与える材料及び方法に対する要望に取り組む。
【００１９】 （発明の開示） 簡単に言えば、一局面において、本発明は標的核酸及び少なくとも一種の汚染
物質を含む混合物から標的核酸を単離する際の使用のために設計された混合床固
相である。好ましい実施において、多種の汚染物質が混合物中に含まれる。混合
床固相は少なくとも２種の異なる固相を含み、これらの夫々が異なる溶液条件の
存在下で標的核酸を結合し、放出する能力を有する。 本発明の混合床固相は第一固相及び第二固相を含むことが好ましく、 第一固相は第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能
力と、第二溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有し、 第二固相は第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能
力と、第一溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有し、
かつ 第一固相及び第二固相の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的核
酸を放出する能力を有する。
【００２０】 別の局面において、本発明は標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混
合物から標的核酸を単離するための混合床固相であり、その混合床固相は第一シ
リカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子を含み、 (a) 第一シリカ磁性粒子は第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的
核酸に結合する能力と、第二溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出す
る能力とを有し、 (b) 第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的
核酸に結合する能力と、第一溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出す
る能力とを有し、かつ (c) 第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子の全てが溶離緩衝液の存在
下でそれらに結合された標的核酸を放出する能力を有する。
【００２１】 本発明のこの局面において、第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子は夫
々がそれに共有結合された少なくとも一種のイオン交換残基を含むシリカ磁性粒
子、又はケイ素質酸化物被覆物を含み、陰イオン交換残基を含まないシリカ磁性
粒子である。イオン交換残基は陰イオン交換残基、又は第一溶液もしくは第二溶
液の存在下で正電荷を有するイオン交換残基であり、その結果、それはその溶液
中で標的核酸と交換し得る。 別の局面において、本発明は多数の第一シリカ磁性粒子を含むシリカ磁性粒子
であり、これらの夫々がジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基に共有結合され
た第一シリカ磁性粒子を含む。このようなDEAイオン交換シリカ磁性粒子は上記
の本発明の混合床固相、及び以下に記載される本発明の標的核酸の単離方法にお
いて固相の一つとしての使用に特に適している。
【００２２】 又、本発明は第一固相及び第二固相を含む混合床固相を使用して、標的核酸及
び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物から標的核酸を単離する方法である。
この方法は a) 混合床固相を用意する工程、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、標的核酸を第一固相に
結合させる工程、 c) 混合床固相を第一溶液から分離する工程、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、核酸を第一固相から放出させ、第二固相
に結合させる工程、 e) 混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、標的核酸を混合床固相から溶離緩衝液
に放出させる工程を含む。
【００２３】 本発明のこの実施態様は付加的な工程を更に含むことが好ましく、この工程で
は混合床固相が再度合わされ、第一溶液及び第二溶液から分離され、その後に工
程(f)で溶離緩衝液と合わされる。 本発明の方法及び材料はアガロース並びに標的核酸以外の細菌、動物組織、及
び血液細胞の成分を含むが、これらに限定されない種々の汚染物質からプラスミ
ドDNA、全RNA、増幅された核酸、及びゲノムDNAを含むが、これらに限定されな
い標的核酸を単離するのに使用し得る。 本発明の混合床固相及び方法は有害な薬品（例えば、フェノール、クロロホル
ム、臭化エチジウム、又は塩化セシウム）を使用することを必要としないで種々
の異なる型の標的核酸を種々の異なる物質から迅速かつ有効に単離することを可
能にする。本発明の範囲を限定することを意図しないで、以下の理由のために、
第一固相及び第二固相は標的核酸を単離するのに単独で、タンデムに、又は同じ
固相の別々の官能基として使用される場合のいずれの相よりも本発明の混合床形
態で有効に作用することが本明細書に提案される。
【００２４】 混合床形態は標的核酸を第一固相から第二固相に前後に転移することを可能に
し、それにより、標的核酸をそれと混在した汚染物質から夫々の転移工程で更に
単離する。唯一の固相が標的核酸を単離するのに使用される場合、かなり少ない
汚染物質が除去される。 タンデムに使用される場合、標的核酸は夫々の固相に一度だけ結合され、放出
されて、少なくとも一種の汚染物質、即ち、標的核酸混合物を残す。標的核酸に
対し異なるアフィニティーを有する２種の異なる官能基が同じ固相に用意される
場合、標的核酸はそれが本発明の方法で混合床固相を使用して一つの固相から別
の固相に転移されるよりも有効に結合されず、又放出されない。混合床固相は既
知の固相系又はその他のクロマトグラフィー分離技術と較べて驚くべきかつ予想
されない結果を生じる。 本発明の混合床固相又は方法を使用して単離された標的核酸は付加的なプロセ
シング、分析、又は更には哺乳類への投与に使用するのに適しているのに充分に
汚染物質を含まない。核酸を種々の異なる媒体から単離するための本発明の混合
床固相の適用は以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。当業者は
その発明の詳細な説明が例示にすぎないことを意味し、本発明の範囲を限定する
ものと見なされるべきではないことを認めるであろう。
【００２５】 （発明を実施するための最良の形態） “固相”という用語は、通常のクロマトグラフィーの意味で、溶質混合物中の
溶質、この場合には標的核酸と相互作用する不溶性の、通常硬質の、マトリック
ス又は固定相を表すのに本明細書中に使用される。本明細書に使用される、固相
という用語は特に液体クロマトグラフィー(LC)、高圧液体クロマトグラフィー(H
PLC)、フィルターに埋め込まれ、又は結合された粒状マトリックス中の固定相、
及び溶質混合物に直接添加された場合に溶質と相互作用する磁性又は非磁性の多
孔性又は非多孔性のマトリックス粒子を含む。 本明細書に使用される“第一固相”及び“第二固相”という用語は夫々が溶質
混合物中の標的核酸溶質に対し異なるアフィニティーを有する別々かつ異なる固
相媒体（例えば、別々の樹脂、マトリックス、粒子、又は濾材）を表す。
【００２６】 本明細書に使用される“混合床固相”という用語は単一容器又はカラム中の少
なくとも２種の異なる固相（例えば、第一固相及び第二固相）を表し、混合床中
の夫々の固相は溶質に対し異なるアフィニティーを有する。混合床固相は少なく
とも二つの異なる型のクロマトグラフィー粒子の混合物（例えば、逆相粒子及び
イオン交換粒子の混合物、又は特別な標的核酸に対する異なるアフィニティーを
有するイオン交換粒子の混合物）、少なくとも二つの異なる型のシリカ磁性粒子
の混合物（例えば、混合物中の一つの種の粒子の表面がそれに結合された官能基
を有しないシリカゲルもしくはガラス又はケイ素質酸化物被覆物を有するシリカ
ゲルもしくはガラスであり、一方、混合物中の粒子の別の種がそれに共有結合さ
れたイオン交換基を有するシリカ磁性粒子の混合物）、又はそれに結合され、も
しくはその中に埋め込まれた異なる型の粒子もしくは官能基を有する少なくとも
２種の異なるフィルターの組み合わせを含む、幾つかの異なる形態又は形態の混
合物のいずれか一つであってもよい。混合床固相中の夫々の固相が呈される形態
にもかかわらず、所定の溶質に対する夫々の固相のアフィニティーは夫々の固相
粒子の表面の組成を含む、固相の組成に依存する。本発明の混合床固相における
標的核酸に対するアフィニティーはイオン相互作用（例えば、陰イオン交換クロ
マトグラフィー）及び疎水性相互作用（例えば、逆相クロマトグラフィー）を含
むが、これらに限定されない、溶質を固相に結合するのに典型的に使用される幾
つかの手段のいずれか一つによるものであってもよい。
【００２７】 本明細書に使用される“シリカゲル”という用語はクロマトグラフィー等級の
シリカゲルを表し、その物質が幾つかの異なる源から市販されている。シリカゲ
ルはケイ酸塩、例えば、ケイ酸ナトリウムを含む溶液を10又は11未満のpHまで酸
性にし、次いで酸性にされた溶液をゲル化させることにより最も普通に調製され
る。例えば、Kurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 21巻, Mary
Howe-Grant編集, John Wiley＆Sons, 1997年発行, 1020-1023頁のシリカ調製の
説明を参照のこと。 本明細書に使用される“ガラス粒子”という用語は、たとえ結晶性シリカが無
定形低ではないのでそれらが以前に“ガラス”ではないとしても、結晶性シリカ
（例えば、α−石英、ガラス質シリカ）の粒子、又は主としてシリカからつくら
れたガラスの粒子を意味する。
【００２８】 本明細書に使用される“シリカ磁性粒子”という用語は磁場を有しないが、磁
場に暴露された時に磁気双極子を形成する材料、即ち、磁場の存在下で磁化され
得るが、それら自体はこのような磁場の不在下では磁性ではない材料を更に含む
シリカマトリックスを表す。これに関して使用される“磁性”という用語は常磁
性材料又は超常磁性材料である材料を含む。本明細書に使用される“磁性”とい
う用語は又一時的に磁性の材料、例えば、強磁性材料又はフェリ磁性材料を含む
。以下に特に示される場合を除いて、本発明に使用されるシリカ磁性粒子は含水
ケイ素質酸化物吸着表面（即ち、シラノール基の存在を特徴とする表面）を有す
る、ケイ素質酸化物で被覆された超常磁性コアーを含むことが好ましい。 本明細書に使用される“カオトロピック試薬”という用語は、水溶液中に充分
に高い濃度で存在する場合に、その中に存在するタンパク質を変性させ、核酸に
二次構造を失わせる特別なイオンの塩を表す。カオトロピックイオンはこれらの
効果を有するものと考えられる。何とならば、それらは液体の水中に存在する水
素結合網状構造を分断し、それによりそれらの正確に折り畳まれた相対物又は構
造相対物よりも熱力学的に安定な変性タンパク質及び変性核酸をつくるからであ
る。カオトロピック試薬として、グアニジウム、ヨージド、パークロレート、及
びトリクロロアセテートが挙げられる。カオトロピック試薬として、グアニジン
塩酸塩、グアニジンチオシアネート（これは時折グアニジンイソチオシアネート
と称される）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸ナ
トリウムが挙げられる。
【００２９】 本発明の混合床固相の第一固相成分及び第二固相成分の夫々が異なる溶液条件
下で標的核酸に結合し、それを放出する能力を有する。第一固相は第一溶液の存
在下で標的核酸に結合し、第二溶液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、
一方、第二固相は第二溶液の存在下で標的核酸に結合し、第一溶液の存在下で標
的核酸を放出する能力を有する。こうして、混合床固相が第一溶液の存在下で標
的核酸と少なくとも一種の汚染物質の混合物と合わされる場合、標的核酸が第一
固相に結合する。次いで混合床固相が第一溶液から分離され、第二溶液と合わさ
れる場合、標的核酸が第一固相から放出され、第二固相に結合する。次いで混合
床固相が第二溶液から分離され、溶離緩衝液と合わされ、標的核酸が溶離緩衝液
に放出される。混合床固相は第一溶液と合わされ、それから分離され、かつ／又
は第二溶液と合わされ、それから分離され、少なくとも或る付加的な時間の後に
溶離緩衝液と合わされることが好ましい。 第一固相及び第二固相は軟質ゲル担体、例えば、アガロース、ポリアクリルア
ミド、もしくはセルロース、又は硬質担体材料、例えば、ポリスチレン、ラテッ
クス、メタクリレート、もしくはシリカを含むあらゆる普通の担体材料からつく
られてもよい。固相担体材料がシリカである場合、それはシリカゲル、ケイ素質
酸化物、固体シリカ、例えば、ガラスもしくはケイソウ土、又は上記の２種以上
の混合物の形態であることが好ましい。混合床固相中の固相の少なくとも一種が
シリカゲル粒子を含むことが好ましい。シリカゲル粒子は軟質ゲル担体材料から
つくられた固相よりも高圧で極めて安定であり、シリカゲル固相をHPLCだけでな
くLC及びバッチ分離適用に適するようにする。シリカゲル粒子の如きシリカ材料
はカオトロピック試薬の存在下で標的核酸を結合し得る。シリカ材料は又このよ
うなカオトロピック試薬の不在下でエンドトキシンの如き少なくとも一種の汚染
物質を結合し得る。
【００３０】 本発明に使用される混合床固相混合物は、溶質混合物が外力の適用によりそれ
と合わされた後に標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む溶質混合物から
分離し得る形態であることが好ましい。当業者は混合床固相混合物を溶質混合物
から分離する際の使用に適した外力の型が混合床固相混合物が溶質混合物に呈さ
れる形態、及び混合床固相それ自体の物理的性質に依存することを認めるであろ
う。例えば、混合床固相がLCカラムに装填された混合床樹脂である場合、混合床
固相が溶質混合物にバッチ式で添加され、次いでデカント又は濾過によりそれか
ら分離される混合床樹脂もしくは調節された細孔の粒子（例えば、シリカをベー
スとする粒子）の混合物である場合、又は混合床固相が溶質混合物が通過するフ
ィルターに埋め込まれ、もしくは結合される場合に、重力が混合床固相を溶質混
合物から分離するのに使用し得る。混合床固相が高圧液体クロマトグラフィーカ
ラム(HPLC)の固定相を形成する場合、外力は高圧液体である。本発明の方法にお
ける使用に適した外力のその他の形態として、真空濾過（例えば、混合床固相が
調節された細孔のガラスの粒子、その他のシリカをベースとする粒子の混合物の
如き混合床固相粒子であり、又はフィルターに埋め込まれ、もしくは結合されて
いる場合）、遠心分離（例えば、混合床固相が粒状物である場合）、又は磁気（
例えば、混合床固相が磁性粒子又は常磁性粒子を含む場合）が挙げられる。
【００３１】 シリカ材料、特にシリカゲルは、上記の一つ以上の除去手段が使用される本発
明の混合床固相中の使用のために配置し得る。本発明の混合床固相中の第一固相
又は第二固相としての使用に特に好ましいシリカをベースとする固相として、PC
T公開番号WO 95/06652、米国特許第6,658,548号、PCT公開番号WO 98/31840並び
にプラスミドDNA単離用にプロメガ・コーポレーションにより販売される固相、
即ち、ウィザード（登録商標）ミニプレプスDNA精製樹脂が挙げられ、これらの
文献の全てが参考として本明細書に含まれる。 第一固相又は第二固相が磁性であるシリカゲル粒子である場合、それはシリカ
磁性粒子であることが好ましく、PCT公開番号PCT/US98/01149に開示されたよう
なケイ素質酸化物被覆(SOCM)シリカ磁性粒子であることが更に好ましい。シリカ
磁性粒子はその他のシリカマトリックスとの使用について上記された外部手段の
いずれかを使用して溶液から分離し得る。しかしながら、シリカ磁性粒子を溶液
から分離するのに使用される外部手段は磁力であることが好ましい。第一固相及
び第二固相は両方ともシリカ磁性粒子であることが好ましい。
【００３２】 第一シリカマトリックス又は第二シリカマトリックスのいずれかがシリカ磁性
粒子である場合、粒子のサイズは以下のように選ばれることが好ましい。一層小
さいシリカ磁性粒子は吸着に関して一層大きな表面積（重量単位基準で）を与え
るが、一層小さい粒子は一層大きい粒子と較べてこのような粒子に混入し得る磁
性材料の量で制限される。本発明の特に好ましい実施態様に使用されるシリカ磁
性粒子のメジアン粒子サイズは約１〜15μm、更に好ましくは約３〜10μm、最も
好ましくは約４〜７μmである。粒子サイズ分布は又変化されてもよい。しかし
ながら、比較的狭いモノダル粒子サイズ分布が好ましい。モノダル粒子サイズ分
布は粒子の約80重量％がメジアン粒子サイズについて10μm範囲、更に好ましく
は８μm範囲、最も好ましくは６μm範囲内であるようなものであることが好まし
い。 本発明の混合床固相の第一固相及び第二固相は多孔性又は非多孔性の固体又は
半固体であってもよい。本発明の混合床固相中に使用される固相の夫々のこのよ
うな性質の選択は標的核酸の性質、及びそれが単離されるべきである材料の性質
により殆ど決められる。細孔が混合床固相中の固相のいずれか中に存在する場合
、細孔の少なくとも一部は標的核酸物質を固相粒子の内部に入れるのに充分に大
きいサイズのものであることが好ましい。
【００３３】 シリカ磁性粒子は遷移金属又は揮発性有機化合物の如き物質を含んでもよく、
これらはこのような物質で実質的に汚染された標的核酸の実用性に悪影響し得る
。このような汚染物質は下流のプロセシング、分析、及び／又はそれらで汚染さ
れた標的核酸の使用に影響し得る。例えば、このような汚染物質は標的核酸を損
傷又は劣化し、又は標的核酸に添加される酵素の活性を抑制することがある。本
発明に使用されるシリカ磁性粒子中に存在するあらゆるこのような物質は粒子か
ら本発明の方法に従って生成された単離された生物学的標的物質へと容易に滲出
しない形態で存在することが好ましい。特に生物学的標的物質が標的核酸である
場合に、鉄が一つのこのような望ましくない汚染物質である。 磁鉄鉱の形態の鉄が本発明のシリカ磁性粒子の特に好ましい形態のコアーに存
在する。鉄は260〜270ナノメーター(nm)の広い吸収ピークを有する。標的核酸は
約260nmにピーク吸収を有し、こうして標的核酸サンプル中の鉄汚染はこのよう
なサンプルの定量的分光分析の結果の正確さに悪影響し得る。本発明を使用して
標的核酸を単離するのに使用される鉄含有シリカ磁性粒子は鉄が260nm付近で物
質の分光分析を妨害するために鉄で充分に汚染された単離された標的核酸物質を
生じないことが好ましい。
【００３４】 本発明の方法及び材料に使用される最も好ましいシリカ磁性粒子（即ち、SOCM
粒子）は以下のようにアッセイされた場合に50ppm以下、更に好ましくは10ppm以
下、最も好ましくは5ppm以下の遷移金属を滲出する。詳しくは、粒子（110℃で
オーブン乾燥した）0.33gが1N HCl水溶液（脱イオン水を使用する）20mlに入れ
られる。次いで得られる混合物が撹拌されて粒子を分散させる。約15分の合計接
触時間後に、混合物からの液体の一部がその後に金属含量について分析される。
あらゆる通常の元素分析技術が得られる液体中の遷移金属の量を定量するのに使
用されてもよいが、誘導結合型プラズマ分光学(ICP)が好ましい。 少なくとも２種の市販のシリカ磁性粒子、パーセプチブ・バイオシステムズか
らのBioMag（登録商標）磁性粒子、及びプロメガ・コーポレーションから入手し
得るMagneSilTM粒子が本発明における第一又は第二シリカマトリックスとしての
使用に特に好ましい。シリカ磁性粒子を溶液から分離するのに充分に強い磁力の
あらゆる源が本発明における使用に好適であろう。しかしながら、磁力は磁気分
離スタンド、例えば、プロメガ・コーポレーションからのMagneSphere（登録商
標）技術磁気分離スタンド（カタログ番号Z5331から３、又はZ5341から３）の一
つの形態で与えられることが好ましい。
【００３５】 標的核酸はpH 2より上のpHで本来負に荷電され、それ故、pH 2より上のpHで正
に荷電されるイオン交換体に可逆的に結合し得る。幾つかのイオン交換体はそれ
が陰イオン交換体として作用し得る或るpHで総合して正の電荷を有し、別のpHで
総合して中性又は負の電荷を有することに注目されたい。このようなイオン交換
体はイオン交換体が陰イオン交換体として作用するpH及びその他の条件で標的核
酸とイオンを交換することができるにすぎない。標的核酸との交換に関する能力
はイオン交換体によって広く変化する。混合床固相中の固相の少なくとも一種は
直接に又は仲介により担体材料の表面に共有結合された標的核酸と交換し得るイ
オン交換樹脂を有することが好ましい。本明細書に使用される“表面”という用
語は固相がそれと接触される時に溶液と直接接触する固相の担体材料の部分を表
す。本発明の混合床固相中の使用に適した陰イオン交換固相が市販されている。 イオン交換固相は固体担体、例えば、セファロース（登録商標）（ファーマシ
ア）、ポリスチレン、又はシリカをベースとする材料であり、イオン交換基がそ
れに共有結合されている。イオン交換基は少なくとも一つのイオン交換残基を含
み、これは陰イオン交換体として作用することができ、そのイオン交換残基は直
接に、又は炭化水素リンカーを介して固体担体に共有結合されている。炭化水素
リンカーが存在する場合、それはイオン交換残基が正に荷電されるpHの範囲内で
はないpHで陽イオン交換体として作用し得る少なくとも一つの残基を含むことが
好ましい。このようなリンカーを有するイオン交換固相が本明細書中“混合様式
”固相と称される。本明細書に参考として含まれる、核酸単離用に適した特に好
ましい混合様式固相に関する更なる情報について同時に出願された米国特許出願
第09/312,172号を参照のこと。
【００３６】 混合様式又は単一様式のイオン交換固相のいずれが本発明に使用されるかにか
かわらず、イオン交換基のイオン交換残基の好ましい性質は同じである。イオン
交換残基は標的核酸が化学的に分解されない溶液条件下で関係する標的核酸と容
易に交換する能力を有することが好ましい（例えば、RNAは強アルカリ性溶液、
即ち、10以上のpHを有する溶液の存在下で分解し、一方、DNAはこのような溶液
中で安定であることが知られている。又、DNAは濃縮されたカオトロピック試薬
溶液、例えば、少なくとも2Mのグアニジンチオシアネートを含む溶液の存在下で
分解し、一方、RNAは２〜５Ｍのグアニジンチオシアネート濃度で安定であるこ
とが知られている）。例えば、米国特許第5,346,994号を参照のこと。 イオン交換固相に結合されたイオン交換基はジメチルアミン、ヒスタミン、エ
タノールアミン、ヒスチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステインから
なる群から選ばれることが最も好ましい。先にリストされた最後の二つの好まし
いイオン交換基は、夫々が異なる固相に共有結合される形態で以下に示される、
混合様式イオン交換基であることに注目されたい。下記の式中の波線は、イオン
交換基の夫々が結合されている固相、例えば、シリカ磁性粒子を表す。
【００３７】
【化１】
【００３８】 所定の溶液条件下で標的核酸に結合し、又はそれと交換する第一固相又は第二
固相の能力は、外表面又はライニング上で細孔の外表面がそれから固相の夫々の
粒子に延びているかを問わないで、固相の表面における官能基の機能である。固
相が陰イオン交換固相である場合、標的核酸は陰イオン交換基が充分に荷電され
て標的核酸とイオンを交換する溶液条件（特に、pH及び塩）のもとに固相の表面
にある陰イオン交換官能基に可逆的に結合する。
【００３９】 本発明の混合床固相中の使用に適した陰イオン固相は、特に非磁性固相の形態
で市販されている。例えば、ファーマシア（ピスカタウェイ、ニュージャージー
）からのDEA-セファロースTM、Q-セファロースTM、及びDEAE-セファデックスTM
、ダウ・ケミカル社（ミッドランド、ミシガン）からのダウエックス（登録商標
）Ｉ、ローム・アンド・ハース（フィラデルフィア、ペンシルバニア）からのア
ンバーライト（登録商標）、デュオライト・インターナショナル社（クリーブラ
ンド、オハイオ）からのデュオライト（登録商標）、ディアロンTI、及びディア
ロンTIIを参照のこと。又、本発明における使用に適した陰イオン交換固相は、
通常の合成有機化学を使用して、好適な陰イオン交換残基を上記の好適な担体材
料の一つに共有結合することにより合成し得る。例えば、好適な陰イオン交換固
相はシリカをベースとする材料を3-(ジエチルアミノ)プロピルトリメトキシシラ
ンをジクロロメタン及びトリブチルアミンの存在下で反応させることによりジメ
チルアミン残基をシリカゲル粒子又は磁性シリカ粒子の如きシリカをベースとす
る材料に共有結合することにより製造し得る（W. Jostら, J. Chromatog. 185 (
1979) 403-412を参照のこと）。ヒスチジンの如きその他の陰イオン交換残基が
同様にシリカをベースとする材料に結合されて好適な陰イオン交換固相を製造し
得る。
【００４０】 本発明の混合床固相の第一固相及び第二固相は異なる溶液条件下で標的核酸に
結合し、それを放出するそれらの能力について選ばれ、その結果、第一固相は第
一溶液の存在下で標的核酸を結合し、第二溶液の存在下でそれを放出し、一方、
第二固相は第二溶液の存在下で標的核酸を結合し、第一溶液の存在下で標的核酸
を放出する。第一溶液及び第二溶液の組成は夫々第一固相及び第二固相の表面に
おける官能基の性質に依存する。例えば、第一固相の官能基が陰イオン交換体で
ある場合、第一溶液はイオン交換反応に必要とされるイオンを与えるのに充分に
高い塩濃度を含むが、固相の陰イオン交換基と標的核酸の間のイオンの交換を妨
害するのに充分に高い塩濃度を含まない。又、第一溶液のpHは第一陰イオン交換
固相の陰イオン交換基に関するpKa以下であり、陰イオン交換基が標的核酸と交
換するのに充分に正の電荷を有することを確実にする必要がある。 第一固相が陰イオン交換固相であり、又第二固相が陰イオン交換固相である場
合、第二固相の陰イオン交換基のpKaは少なくとも0.5 pKa単位だけ、更に好まし
くは少なくとも1 pKa単位だけ、最も好ましくは少なくとも2 pKa単位だけ第一固
相のそれとは異なることが好ましい。又、第一陰イオン交換固相及び第二陰イオ
ン交換固相は、夫々のこのような固相の表面における電荷及び／又は陰イオン交
換基密度の相違のために、関係する標的核酸を結合する能力において互いに異な
り得る。
【００４１】 図１は本発明の第一陰イオン交換固相及び第二陰イオン交換固相の理論的な固
相混合物、並びに本発明の方法による標的核酸の単離に使用するための第一溶液
、第二溶液、及び溶離溶液の選択を示す。詳しくは、図１は種々の塩条件及びpH
条件下で標的核酸（RNA又はDNA）を結合し、放出する２種の異なる固相、Ａ及び
Ｂの相対能力を示す。固相Ａは7.0のpKaを有し、一方、固相Ｂは8.5のpKaを有す
る。固相Ａは又異なるpHにおけるその電荷密度の点で固相Ｂとは異なる。詳しく
は、固相Ａは6.0未満のpHの溶液の存在下でＢより高い正電荷密度を有し、6.0よ
り大きいpHの溶液の存在下でＢより低い正電荷密度を有する。固相Ａは図１中の
Ａライン（ダッシュが付されている）より下にある溶液pH及び塩濃度で標的核酸
に結合し、同ラインより上のpH及び塩濃度でそれに結合された標的核酸を放出す
る。図１中のＢライン（点線）は同様に固相Ｂが標的核酸に結合し（ラインより
下で）、又は標的核酸を（ラインより上で）放出するpH及び塩濃度を示す。この
ような結合較正曲線が、通常の結合能力研究を使用して容易につくられる。
【００４２】 固相較正曲線、例えば、図１に示されたものは本発明の標的核酸の単離方法に
使用される第一溶液、第二溶液、及び溶離溶液について最適条件を選択するのに
使用し得る。図１中“溶液＃１”と標識された円は固相Ａが標的核酸に結合し、
一方、固相Ｂがそれに結合された標的核酸を放出する溶液条件を示す。溶液＃１
のpHは固相Ａ及びＢの結合及び放出能力の差を最適化するとともに中性pHにでき
るだけ近くなるように選ばれる。溶液＃２と標識された円は同様に中性pHにでき
るだけ近いpH範囲で固相Ｂに結合し、固相Ａから放出するために選ばれる。溶離
溶液組成は図１中のラインＡ及びＢの両方のそれより上の塩濃度及びpH混合物か
ら選択し得る。しかしながら、pHは約７であることが好ましく、塩濃度はできる
だけ低いことが好ましい。 溶液＃１と＃２の間で前後に固相Ａ、固相Ｂ、及び標的核酸の理論混合物の溶
液条件を何回も切り替えて非標的核酸不純物を混合物から除去し、その後に標的
核酸をそれから溶離することができる。
【００４３】 第一固相又は第二固相のいずれかが陰イオン交換固相ではない場合、それはイ
オン交換による以外の相互作用、例えば、疎水性相互作用、逆相相互作用、核酸
ハイブリダイゼーション、又はフーグスティーン型塩基対合により関係する標的
核酸に直接結合することができる表面上の官能基を有する固相材料であることが
好ましい。本発明のこの実施態様において、混合床固相の第一固相又は第二固相
はシリカをベースとする固相材料、更に好ましくはケイ素質酸化物被覆物を有す
るシリカ材料である。シリカをベースとする固相がケイ素質酸化物被覆物を有す
るシリカ材料である場合、固相はシリカ材料の表面にシラノール基を有すること
を特徴とする。シラノール基は逆相相互作用により標的核酸を放出可能に結合す
ることが知られている（McLaughlin, L.M., Chem Rev (1989) 89:309-319, 309
頁）。直ぐ上に記載された混合床固相の特に好ましい実施態様、陰イオン交換固
相及びシリカをベースとする固相を含む実施態様が本明細書中“シリカ/IE混合
床固相”と称される。
【００４４】 シリカ/IE混合床固相は本発明の方法を使用して標的核酸を単離するのに使用
され、混合床固相が上記のように第一溶液、続いて第二溶液と合わされる。一方
の溶液はシリカ固相との結合を促進し、一方、他方の溶液はイオン交換固相との
結合を促進する。いずれかの溶液が第一溶液として使用され、但し、別の溶液が
第二溶液である。 第一溶液又は第二溶液は少なくとも100mM、更に好ましくは少なくとも250mM、
更に好ましくは少なくとも500mMの濃度のカオトロピック試薬を含むことが好ま
しい。カオトロピック試薬はグアニジン塩であることが好ましく、グアニジンチ
オシアネートであることが更に好ましい。標的核酸はカオトロピック試薬の存在
下でシリカをベースとする固相材料に容易に結合するが、実質的にカオトロピッ
ク試薬を含まない溶液の存在下でそれから容易に放出される。本明細書に使用さ
れる“実質的に含まない”という用語はシリカをベースとする混合床固相と接触
する溶液中のカオトロピック試薬の濃度が充分に低く、その結果、第二固相が優
先的に溶液中のエンドトキシンと複合体を形成し、シリカ/IE混合床固相中の別
の固相に結合された標的核酸を放出することを意味する。
【００４５】 上記の特性を有する一方の溶液が本発明の方法に使用される第一溶液又は第二
溶液としての使用に選ばれる場合、他方の（即ち、第二又は第一）溶液は以下の
特性を有する。その溶液は実質的にカオトロピック試薬を含まないことが好まし
い。その溶液のpH及び塩組成は標的核酸と第一固相の陰イオン交換基の間のイオ
ンの交換を促進するそれらの能力について選ばれることが好ましい。塩濃度はシ
リカをベースとする固相からの標的核酸の放出を確実にするためにできるだけ低
いことが好ましい。
【００４６】 本発明の方法に従って単離される標的核酸がRNAである場合、この溶液の組成
は標的RNA（DNAではない）がイオン交換固相に結合することを可能にする組成で
あることが好ましい。この溶液の組成は混合床固相の少なくとも一つの固相への
標的RNAの結合を促進することが更に好ましい。 本発明の方法に従って単離される標的核酸がDNAである場合、この溶液の組成
は標的DNA（RNAではない）がイオン交換固相に結合することを可能にする組成で
あることが好ましい。この溶液の組成はシリカ/IE混合床固相のシリカをベース
とする固相成分ではなく、イオン交換固相への標的DNAの結合を促進することが
更に好ましい。その溶液の組成は混合床固相、更に好ましくはシリカ/IE混合床
固相のシリカをベースとする固相成分へのエンドトキシンの結合を促進すること
が更に好ましい。
【００４７】 直ぐ上に記載された本発明のシリカ/IE混合床固相は標的核酸をその混合物中
のエンドトキシンから単離する際の使用に特に良く適している。詳しくは、カオ
トロピック試薬を実質的に含まない第一溶液の存在下におけるエンドトキシンと
標的核酸の混合物とのこのような混合床固相の組み合わせは、標的核酸を陰イオ
ン交換により一方の固相に結合させ、エンドトキシンを他方の固相に結合させる
であろう。エンドトキシンは実質的にカオトロピック試薬を含まない溶液中でシ
リカをベースとする固相に結合する傾向がある。このような固相へのエンドトキ
シンの結合はこのような固相混合物へのカオトロピック試薬を含む溶液の添加が
それからのエンドトキシンの放出をもたらさないことが明らかである程にしっか
りしている。エンドトキシンは、水で洗浄することによりシリカ表面、例えば、
ケイ素質酸化物被覆されたシリカ磁性粒子に見られる表面から除去し得る。
【００４８】 本発明の方法が標的核酸と少なくとも一種の汚染物質の混合物から標的核酸を
単離するのに使用される場合、第一溶液又は第二溶液のいずれかが第一工程で標
的核酸混合物の存在下で混合床固相と合わされる。最初に使用された溶液はどの
溶液が次の工程で使用されるのかを決める。詳しくは、第一溶液が最初に混合床
固相と合わされる場合、第二溶液が次にそれと合わされ、その逆も又真である。
初期の合わせる工程後に、混合床固相が初期の溶液から分離され、別の溶液と合
わされる。合わせる工程及び分離工程は、混合床固相が少なくとも２回第一溶液
及び第二溶液の夫々と合わされ、それから分離されるまで繰り返されることが好
ましい。第一溶液から第二溶液への夫々の変化の際に、標的核酸の少なくとも90
％が混合床固相に結合されて残り、一方、少なくとも一種の汚染物質がそれから
除去される。 第一溶液及び第二溶液の組成に応じて、本発明の方法は溶液添加工程の間かつ
／又は最終溶液からの分離の後かつ溶離工程の前に混合床固相を洗浄する工程を
更に含むことが意図されている。洗浄工程は実質的にカオトロピック試薬を含ま
ない第一溶液、第二溶液、又は溶離溶液との接触の前にカオトロピック試薬（例
えば、GTC）を含む第一溶液又は第二溶液との接触後であることが特に好ましい
。このような洗浄緩衝液の組成は標的核酸が混合床固相に結合されて残ることを
確実にするために選ばれる。水が先に示された第一陰イオン交換固相及び第二の
シリカをベースとする固相を洗浄するのに使用されてそれへの第二溶液の添加後
にカオトロピック試薬の完全な除去を確実にすることが好ましい。
【００４９】 第一溶液、第二溶液、及び洗浄溶液の全てが蒸留水、脱イオン水、又はナノピ
ュアー水から調製され、又はこれらからなることが好ましい。本明細書に使用さ
れる“ナノピュアー水”という用語はナノピュアー（登録商標）濾過システムに
匹敵する品質の水を生成する限外濾過システムで精製された水を表す。蒸留水、
脱イオン水、又はナノピュアー水はその方法における使用の前にオートクレーブ
処理又は濾過される。しかしながら、このような付加的なプロセシング工程中に
、不純物、例えば、pH 5.0より大きい弱緩衝液が水に導入し得る。このような不
純物はそれが標的核酸、特に増幅された核酸（例えば、PCR増幅DNA）をそれと接
触された時に混合床樹脂から放出させ得るような程度まで水のpHを上昇し得る。
標的核酸がRNAである場合、混合床固相と直接接触して置かれた水は実質的にRNA
seを含まない必要がある。 混合床固相からの標的核酸の溶離は混合床固相からの標的核酸の放出を確実に
するその能力について選ばれた溶離緩衝液の存在下で行なわれる。その方法の最
終工程で混合床固相から溶離された核酸は充分に純粋であり、エンドトキシン及
びその他の少なくとも一種の汚染物質による汚染に敏感な適用に使用され、これ
らの適用として組織培養細胞のトランスフェクションが挙げられる。
【００５０】 以下の非限定実施例は本発明の種々の実施態様を教示する。実施例、並びに明
細書及び特許請求の範囲のいずれかにおいて、容積及び濃度は特にことわらない
限り室温である。磁性シリカ粒子、特にケイ素質酸化物被覆シリカ磁性粒子、例
えば、上記され、又以下に直ぐに記載されたもののみが以下の実施例に使用され
た。しかしながら、当業者は本開示の教示を使用してシリカ磁性粒子以外のシリ
カマトリックス、及び以下の実施例に示された本発明の方法の説明において使用
された特定の型の粒子以外のシリカ磁性粒子を選択し、使用することができるで
あろう。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではな
い。
【００５１】 以下の実施例の夫々に使用されたシリカ磁性粒子は粒子の二つのバッチのいず
れかから選択された。シリカ磁性粒子の両方のバッチは以下に記載されるように
して試験された場合に許容し得る結果を生じることがわかった。以下に使用され
る粒子の二つのバッチの一つは下記の物理的特性を有していた：55m2/gの表面積
、<600Åの直径の粒子に関して0.181ml/gの細孔体積、>600Åの直径の粒子に関
して0.163ml/gの細孔体積、5.3μmのメジアン粒子サイズ、及びICPを使用して本
明細書に上記されたようにアッセイされた場合に2.8ppmの鉄滲出。以下に使用さ
れたシリカ磁性粒子のその他のバッチは下記の特性を有することがわかった：49
m2/gの表面積、0.160ml/gの細孔体積（<600Åの直径）、0.163ml/gの細孔体積（
>600Åの直径）、5.5μmのメジアン粒子サイズ、及び2.0ppmの鉄滲出。 以下の実施例は磁性粒子の２種の異なる混合床固相を製造するのに使用された
操作、混合床固相粒子を使用してプラスミド又はゲノムDNAを種々の媒体から単
離するのに使用された方法、及び混合床固相粒子から溶離された核酸のサンプル
について行なわれた種々のアッセイの結果を記載する。
【００５２】 （実施例） 実施例１−ゲル電気泳動アッセイ 以下の実施例に記載された操作に従って単離された標的核酸のサンプルを非標
的核酸による汚染、及びサイズについて以下のように分析した。サンプルを適当
な密度のアガロースゲルで分別した（例えば、0.7％のアガロースゲルをプラス
ミドDNAを分析するのに使用し、一方、1.5％のアガロースゲルをRNAを分析する
のに使用した）。蛍光標識を使用して、又はゲルをDNA感受性染色剤、例えば、
臭化エチジウムもしくは銀染色で染色することにより、分別された核酸を視覚化
した。得られる分別され、視覚化された核酸をフルオルイメージャーを使用して
写真撮影又は視覚化し、得られる像をレーザープリンターを使用してプリントア
ウトした。 或る場合には、サイズ標準物を標的核酸と同じゲルで分別し、標的核酸のおよ
そのサイズを測定するのに使用した。ゲルアッセイを行なった場合毎に、分別さ
れた核酸の写真又はフルオロイメージを非標的核酸による汚染について調べた。
例えば、プラスミドDNAの分別サンプルの像を同ゲルでDNAよりかなり速く流れる
RNA、及び同ゲルでプラスミドDNAよりかなり遅く流れる染色体DNAについて調べ
た。又、単離されたプラスミドDNAの像を、像中に示されたプラスミドDNAの殆ど
が無傷のスーパーコイルプラスミドDNAであるか否かを測定するために調べた。
【００５３】 実施例２−吸収分光学 以下に記載される、種々の媒体から単離された標的核酸のサンプルを、吸収分
光学を使用して又分析した。吸収測定を260、280、及び230ナノメーター(nm)の
波長で読み取った。A260/A280吸収比を測定から計算した。1.80以上のA260/A280 はその中で分析されたサンプルがタンパク質汚染を比較的含まないことを示すと
解された。夫々のサンプル中の核酸の濃度を260nmにおける吸収の読み（A260）
から測定した。 実施例３−エンドトキシンアッセイ リムルス変形細胞分解産物(LAL)ゲル沈殿アッセイを行なって細胞分解産物溶
液が以下の実施例で試験された一種以上のシリカマトリックスと接触する前後に
採取された細菌細胞分解産物サンプル中のエンドトキシンの単位の数を測定した
。シグマ（登録商標）からのE-TOXATE（登録商標）（セントルイス、MO、カタロ
グ番号210-D1）をこの一連のLALアッセイのための変形細胞分解産物標準物質と
して使用した。E-TOXATE（登録商標）は1997年のシグマ（登録商標）カタログ（
448頁）に“リムルス・ポリフェムス(Limulus polyphemus)からの（変形細胞分
解産物；蹄鉄状クラブ細胞分解産物）”として記載されている。無エンドトキシ
ン水（“ETF水”）を、全ての希釈工程を含むこのアッセイの全ての工程で使用
した。夫々のサンプル又はサンプルの組を以下の操作に従ってアッセイした。
【００５４】 1. サンプルを連続希釈のために調製し、エンドトキシン除去剤、例えば、シ
リカゲル粒子と接触しなかったサンプルについて大きい初期希釈係数（例えば、
1:10000以上）を使用し、このような除去剤と接触したサンプルについて1:500〜
1:1000の小さい初期希釈を使用した。無エンドトキシン（“ETF”）水を本明細
書に記載された全ての希釈のために使用した。 2. 2X連続希釈を以下のように夫々のサンプルについて調製した。夫々のサン
プル25μlを96ウェルミクロタイタプレートのウェルの最初の組中のETF水25μl
に添加し、ピペット操作により混合した。次いでその希釈溶液25μlを別のETF水
25μlを含む第二ウェルに移し、一連の12のサンプルがサンプルについて調製さ
れるまでそうした。 3. エンドトキシン標準物質の一連の希釈を以下のように調製した。最初に、
エンドトキシン標準物質（シグマ（登録商標）カタログ番号210-SE）の新しいび
んの内容物をびんの製造業者の指示に従ってETF水で希釈した。第二に、以下の
容積のETF水を以下のように一連の９個の1.5mlの微小遠心分離管の夫々に添加し
た：900μlを管1-3に、1,050μlを管４に、又500μlを管5-9に添加した。第三に
、上記のように希釈されたびんからのエンドトキシン標準物質100μlを管１に移
し、混合し、次いで以下のように連続希釈した。
【００５５】 １ミリリットル(ml)当り40エンドトキシン単位（“EU”）のために、管１から
の100μlを管２に添加し、混合し、 4EU/mlのために、管２からの100μlを管３に添加し、混合し、 0.5EU/mlのために、管３からの150μlを管４に添加し、混合し、 0.25EU/mlのために、管４からの500μlを管５に添加し、混合し、 0.125EU/mlのために、管５からの500μlを管６に添加し、混合し、 0.06EU/mlのために、管６からの500μlを管７に添加し、混合し、 0.03EU/mlのために、管７からの500μlを管８に添加し、混合し、 0.015EU/mlのために、管８からの500μlを管９に添加し、混合した。
【００５６】 4. 次いで上記のように希釈されたエンドトキシン標準物質及びブランク標準
物質を以下のようにミクロタイタプレートに移した：カラム１中にETF水（ブラ
ンク）25μl、カラム２中に標準管４からの25μl、カラム３中に標準管５からの
25μl、カラム４中に標準管６からの25μl、カラム５中に標準管７からの25μl
、カラム６中に標準管８からの25μl、そしてカラム７中に標準管９からの25μl
。 5. E-TOXATE（登録商標）、即ち、凍結乾燥形態のLALの新しいびんを試験す
べきサンプル又は標準物質の夫々二つのミクロタイタプレートのために開放した
。ETF水をE-TOXATE（登録商標）の夫々のびんに最終濃度の内容物まで添加し、
或る量のETF水を夫々のびんに添加してETF水約5mlを夫々のびんに添加した。E-T
OXATE（登録商標）の多数のびんをアッセイの単一組のために開放した時、びん
内容物を直ぐ上に記載されたようにETF水中で再度懸濁させ、使用前に合わせた
。E-TOXATE（登録商標）25μlをサンプル、標準物質、又はブランクを含む夫々
のミクロタイタプレートの夫々のウェルに添加した。
【００５７】 6. E-TOXATE（登録商標）を一旦夫々のウェルに添加し、ミクロタイタプレー
トを覆い、プレートを１時間（±５分）にわたって37℃のインキュベーターに入
れ、その時間中にE-TOXATE溶液が充分に多量のエンドトキシンの存在下でゲル化
するであろう。 7. 次いでミクロタイタプレートをインキュベーターから除去し、ゲル化につ
いて調べ、ゲル化（即ち、陽性結果）した夫々のカラム中の最後のウェルを記録
した。下記の式を使用して夫々のカラム中で試験された初期のサンプルのEU/ml
を測定した。 EU/ml＝１／（陽性を試験するサンプルの最高希釈）ｘ （陽性を試験する標準物質の最高希釈） 例えば、サンプルが1/4000の希釈で陽性（即ち、ゲルが見られた）であったが
、1/8000の希釈で陰性（即ち、ゲルが見られなかった）であり、標準物質が0.06
希釈で陽性であり、0.03で陰性であった場合、EU/mlは以下のように測定される
。 EU/ml＝1/(1/4000)x0.06＝240EU/ml
【００５８】 実施例４−トランスフェクションアッセイ 以下に記載される操作に従って単離されたDNAを又HeLa細胞、ヒト卵巣癌細胞
系をトランスフェクトするのに使用した。細胞をダルベッコ改良イーグル培地(D
MEM)＋10％のウシ胎児血清−10％のCO2中で培養した。細胞を24ウェル皿中で適
当な培地中に塗布し、下記の操作に従った。 1. 細胞をトランスフェクションの開始約24時間前にウェル当り約50,000の細
胞で24ウェル皿中に入れた。 2. トランスフェクションの日に、培地を夫々のウェルから除去し、トランス
フェクション開始前の１〜３時間以内に新しい増殖培地（＋血清）と交換した。 3. DNAの４種のサンプル（サンプル1-4）の夫々の混合物を以下のように調製
した。DNAの夫々のサンプルの充分な混合物を以下のように調製し、細胞培養物
の６個のウェルをトランスフェクトした。DNA６μl（約６μg）、塩化カルシウ
ム23.8μl、及び無菌水160μlを無菌ポリスチレン管中で合わせた。先に調製し
たDNA/CaCl2混合物をハンクス緩衝食塩水(HBS)190.2μlに滴下して添加し、その
間HBSを穏やかに撹拌した。
【００５９】 4. HBS/DNA/CaCl2混合物を室温で30分間インキュベートし、その後にその混
合物54.6μlを細胞の夫々のウェルに添加した。その混合物を血清を含む培地に
直接添加した。 5. 次いで処理した細胞のプレートをインキュベーターに戻した。翌日、上記
工程２で使用した同じ血清組成物を使用して、細胞に新しい血清を供給した。 6. 48時間後に、増殖培地を除去し、ウェル当り100μlの細胞培養物細胞分解
試薬を添加することにより、細胞を回収した。 上記のようにトランスフェクトされ、回収された細胞をその後にアッセイして
リポーター遺伝子、この場合にはpGL3プラスミドDNAのルシフェラーゼ遺伝子が
細胞中で発現されたか否かを見た。標準ルシフェラーゼアッセイ、即ち、プロメ
ガ・コーポレーションから市販されているルシフェラーゼアッセイ系を使用して
細胞中のルシフェラーゼ発現を検出し、定量した。 上記工程６で回収した細胞を室温で更に15分間インキュベートし、その後にル
シフェラーゼ発現についてアッセイした。次いで細胞の夫々のウェルからのアリ
コートをミクロタイタプレート皿の異なるウェルに入れた。ルミノメーターを使
用して、夫々のウェルから発するルミネセンスの量を検出し、定量した。
【００６０】 実施例５−陰イオン交換磁性シリカ粒子の合成 ジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基を下記の合成操作に従ってプロピルジ
メトキシシランリガンドを介してMagneSilTM粒子に共有結合した。 1. MagneSilTM粒子を120℃で真空オーブン中で一夜乾燥することにより活性
化した。 2. 活性化MagneSilTM粒子4.25gを〔3-(ジエチルアミノ)プロピル〕トリメト
キシシラン（アルドリッチ（登録商標）からの96％）2.5ml及びジクロロメタン
（アルドリッチ（登録商標））17.5mlと合わせた。次いでトリブチルアミン（ア
ルドリッチ（登録商標））３〜４滴を得られる混合物に添加した。 3. その反応混合物を室温で２日間振とうした。インキュベーション期間の終
了時に、溶液を濾過により粒子から分離した。 4. 次いで粒子／濾液をジクロロメタン75mlで５回、続いて水100mlで２回洗
浄した。 5. 洗浄した粒子のアリコートを以下の実施例５に示される標的核酸結合研究
における使用のためにオーブン中で乾燥させた。 この実施例に使用したDEA-磁性シリカ粒子合成反応は以下の反応ダイアグラム
により更に示される。
【００６１】
【化２】
【００６２】 実施例６−プラスミドDNAで形質転換された細菌細胞の浄化された分解産物の調
製 E. coli細菌細胞、DH5α株をpGL3-コントロールベクター（プロメガ）プラス
ミドDNAで形質転換し、ルリアブロース（“LB”）培地の一夜培養物中で37℃で
増殖させ、次いで遠心分離により回収した。以下に記載されるように、下記溶液
を使用して回収細胞の分解産物を調製した。 細胞再懸濁溶液： 50mM トリス-HCl, pH 7.5 10mM EDTA 100μg/ml 無DNaseリボヌクレアーゼＡ(RNaseA) ウィザード（登録商標）中和溶液： 1.32M KOAc（酢酸カリウム）、pH 4.8 ＃５中和溶液 1.69M K+/2.26M GTC/6.6M酢酸塩、pH 4.18 細胞分解溶液： 0.2M NaOH １％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）
【００６３】 形質転換細胞の浄化された分解産物を以下のように生成した。 1. 細菌培養液10mlからの細胞を、その培養液を微小遠心分離機中でトップス
ピードで1-2分間遠心分離することにより回収した。回収した細胞を細胞再懸濁
溶液250μl中で再度懸濁させ、微小遠心分離管に移した。再度懸濁された細胞の
得られる溶液は濁っていた。 2. 次いで細胞分解溶液250μlを再度懸濁された細胞の溶液に添加し、溶液が
比較的透明になって、再度懸濁された細胞が分解したことを示すまで反転により
混合した。 3. 中和溶液（ウィザード（登録商標）又は以下に示される＃５）350μlを細
胞分解産物溶液に添加し、反転により混合した。中和溶液を添加した後、細胞分
解産物が濁った。 4. 次いで溶液を微小遠心分離機中でトップスピードで５分間回転して細胞分
解産物を浄化した。 5. 浄化された細胞分解産物の得られる上澄みを新しい微小遠心分離管に移し
た。 工程５からの浄化された細胞分解産物溶液を溜め、次いで以下の実施例4-6に
記載されるように、いずれか又は両方の固相へのプラスミドDNAの付着を促進す
るように設計された種々の溶液条件下で二つの磁性シリカ固相又は二つの固相の
混合物に暴露した。次いで混合床固相を洗浄し、以下に記載されるようにプラス
ミドDNAをそれから溶離した。夫々の溶離液を実施例３に従ってエンドトキシン
について、並びに実施例１及び２に記載された操作に従ってその中に含まれたプ
ラスミドDNAの収率及び品質について試験した。
【００６４】 実施例７−シリカ/IE-DEA混合床固相、シリカ磁性粒子、又はIE-DEAシリカ磁性
粒子を使用する浄化された細胞分解産物からのプラスミドDNAの単離 a.出発物質及び溶液組成物 プラスミドDNAを実施例６に記載されたように調製された細菌細胞分解産物か
ら以下のようにして、その中に含まれたプラスミドDNAをいずれかのシリカ磁性
粒子、実施例４に記載されたように調製されたDEA-シリカ磁性粒子、又は二つの
型の粒子の混合物に結合し、それらから溶離することにより単離した。この実施
例に使用されたシリカ磁性粒子とDEA-シリカ磁性粒子の混合物を本明細書中“シ
リカ/DEA混合床”粒子と称する。単一粒子結合操作及び溶離操作が対照として含
まれた。 下記溶液を以下に記載されるように使用した。 洗浄溶液Ａ： 0.74 M K+/0.29M酢酸塩、pH 4.0 1.0Mグアニジンチオシアネート(GTC) 洗浄溶液Ｂ： 0.37M K+/0.12M酢酸塩、pH 4.0 0.43Mグアニジンチオシアネート 溶離緩衝液： 2.0M NaCl 200mM トリス-HCl、pH 7.3
【００６５】 b.対照１：シリカ磁性粒子を使用して、GTCを含む細胞分解産物から単離され
たプラスミドDNA プラスミドDNAの第一対照サンプルを以下のようにシリカ磁性粒子単独を使用
して細胞分解産物溶液から単離した。＃５中和溶液（即ち、2.26M GTCを含む中
和溶液）を使用して、細胞分解産物を実施例４に従って調製した。100mgの粒子/
mlの最終濃度のために、水中で懸濁されたMagneSil（登録商標）粒子150μlを細
胞分解産物250μlに添加し、次いで磁力を使用して細胞分解産物から除去した。
次いで粒子を懸濁させ、２回磁力により0.85M GTC 1.0mlから除去した。第二除
去工程後に、粒子を懸濁させ、３回洗浄溶液Ａ1.0mlから除去した。次いで洗浄
した粒子を真空遠心分離（SpeedVac）中で乾燥させた。最後に、乾燥粒子を水80
μl中で５分間にわたって懸濁させ、微小遠心分離機中で10分間にわたって12,00
0gで遠心分離により得られる溶離液から除去した。
【００６６】 c.対照２：DEA-シリカ磁性粒子を使用して、GTCを含まない細胞分解産物から
単離されたプラスミドDNA 別の対照として、プラスミドDNAを下記の操作に従って先の実施例４に記載さ
れたように合成されたDEA-磁性シリカ粒子から単離した。ウィザード（登録商標
）中和溶液（即ち、GTCを含まない中和溶液）を使用して、細胞分解産物を実施
例１に従って調製した。DEA-シリカ磁性粒子（100mg/mlの濃度のために水中で懸
濁された）150μlを細胞分解産物250μlに添加し、次いで磁力を使用して細胞分
解産物から除去した。次いで粒子を洗浄溶液Ｂ1.0ml中に１回再懸濁させ、続い
て水1.0ml中で３回再懸濁させ、磁力を使用して粒子を夫々の再懸濁工程後に洗
浄溶液から除去した。最後に、乾燥粒子を５分間にわたって溶離緩衝液300μl中
で懸濁させ、微小遠心分離機中で10分間にわたって12,000gで遠心分離により得
られる溶離液から除去した。
【００６７】 d.WIZ-サンプル：シリカ/IE-DEA混合床固相を使用して、GTCを含む細胞分解産
物から単離されたプラスミドDNA 以下のようにシリカ磁性粒子15mg及びDEA-シリカ磁性粒子30mgの混合床固相を
使用して、ウィザード（登録商標）中和溶液（GTCなし）を使用して実施例６に
記載されたように調製された細胞分解産物からプラスミドDNAを単離した（水を
細胞分解産物添加の前に混合床固相粒子から除去した）。 1. 細胞分解産物をMagneSilTM 15mg及びDEA-磁性シリカ粒子30mgと合わせ、
混合し、磁力によりそれから分離した。細胞分解産物を捨てた。 2. 粒子を洗浄溶液Ｂ950μl中で再懸濁させ、混合し、磁力によりそれから分
離した。洗浄溶液を夫々の分離工程後に捨てて、この工程を２回繰り返した。 3. 粒子を2M GTC 950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。こ
の工程を１回繰り返し、GTC溶液を夫々の分離工程後に捨てた。 4. 粒子を0.85M GTC 950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。
この工程を１回繰り返し、GTC溶液を夫々の分離工程後に捨てた。 5. 粒子を水950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。この工程
を１回繰り返し、水を夫々の分離工程後に捨てた。 6. 工程2-5を１回繰り返した。 7. 粒子を溶離緩衝液300μl中で５分間にわたって再懸濁させ、磁力により得
られる溶離液から除去した。
【００６８】 e.＃５サンプル：シリカ/IE-DEA混合床固相を使用して、GTCを含まない細胞分
解産物から単離されたプラスミドDNA 以下のようにシリカ/IE-DEA混合床固相を使用して、プラスミドDNAを又実施例
６に記載されたようにして＃５中和溶液を使用して調製された細胞分解産物から
単離した。 1. 細胞分解産物をシリカ磁性粒子15mg及びDEA-磁性シリカ粒子30mgと合わせ
、混合し、磁力によりそれから分離した。細胞分解産物を捨てた。 2. 粒子を水950μl中で再懸濁させ、混合し、磁力によりそれから分離した。
水洗浄溶液を夫々の分離工程後に捨てて、この工程を１回繰り返した。 3. 粒子を洗浄溶液Ｂ950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。
この工程を３回繰り返し、GTC溶液を夫々の分離工程後に捨てた。 4. 粒子を2M GTC 950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。こ
の工程を１回繰り返し、GTC溶液を夫々の分離工程後に捨てた。 5. 粒子を0.85M GTC 950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。
この工程を１回繰り返し、GTC溶液を夫々の分離工程後に捨てた。 6. 粒子を水950μl中で再懸濁させ、磁力によりそれから分離した。この工程
を１回繰り返し、水を夫々の分離工程後に捨てた。 7. 工程2-6を１回繰り返した。 8. 粒子を溶離緩衝液300μl中で５分間にわたって再懸濁させ、磁力により得
られる溶離液から除去した。
【００６９】 f.試験サンプル及び対照サンプル中のプラスミドDNAの沈殿 以下のようにして、プラスミドDNAを上記のように生成された夫々の対照及び
試験サンプルから沈殿させた。95％のエタノール800μlを溶離液の夫々300μlの
サンプルと合わせ、微小遠心分離管中で-20℃で60時間にわたって貯蔵した。次
いで得られるDNA沈殿を微小遠心分離機中で10分間にわたって12,000gで遠心分離
により溶液から回転して析出した。エタノール上澄みを捨て、ペレットを70％の
エタノール500μlで洗浄した。第二エタノール洗浄溶液を同様に遠心分離により
除去し、ペレットを乾燥させた。次いでDNAの得られるペレットをETF水80μl中
で再懸濁させた。 実施例８−シリカ磁性粒子、DEA-シリカ磁性粒子、又はシリカ/IE-DEA混合床固
相を使用して細胞分解産物から単離されたプラスミドDNAの分光学的アッセイか
らの結果 単一粒子型対照又は上記実施例７に記載された混合床固相から溶離されたサン
プルの夫々を、上記実施例２に記載された分光学的アッセイ操作を使用して分析
した。アッセイ結果を下記の表１に示す。
【００７０】 表１
【００７１】 表１中の結果は、MagneSilTM粒子又はDEA-MagneSilTM粒子単独（夫々、上記対
照１及び２）を使用してウィザード（登録商標）中和溶液（上記“WIZ”）中の
細胞分解産物又は＃５中和溶液（上記“＃５”）中の細胞分解産物から単離する
よりも、多量のDNAを混合床樹脂を使用してそれから単離したことを示す。試験
した溶離液の全てがかなり純粋であった（即ち、約1.8のA260/A280の吸収比を有
する）。対照１（即ち、MagneSilTM単独の溶離液）、及びWIZ-1〜３（即ち、WIZ
中の細胞分解産物溶液からの混合床粒子の溶離液）は1.80を越えるA260/A280比
で高度に純粋であった。DNAの最高収率をWIZ-2サンプルで得、試験したサンプル
をWIZ中の細胞分解産物への粒子の暴露、続いて２種の異なる溶液（洗浄溶液Ｂ
及び2M GTC）の夫々中の洗浄後にシリカ/DEA混合床粒子から溶離した。
【００７２】 実施例９−実施例７で細胞分解産物から単離されたプラスミドDNAのエンドトキ
シン及びトランスフェクション効率のアッセイの結果 実施例８でアッセイされたのと同じ対照及び試験サンプルを又上記実施例３に
記載された操作に従ってエンドトキシン汚染について、又上記実施例４に記載さ
れた操作に従ってトランスフェクション効率についてアッセイした。アッセイ結
果の両方の組を以下の表２に示す。
【００７３】 表２
【００７４】 上記表２中の結果は夫々の対照-1溶離液がエンドトキシンで高度に汚染された
ことを示す。全てのWIZサンプルは非常に低いエンドトキシン活性単位値（1,000
未満のEU/ml）、及びかなり高いトランスフェクション効率（少なくとも50％の
トランスフェクション％）を示した。上記＃５サンプルの全てがわずかに高いエ
ンドトキシンレベルを有していた。しかしながら、全ての＃５サンプルに関する
トランスフェクション効率は100％を越えた。
【００７５】 実施例10−シリカ/IE-ヒスチジン混合床固相の製造 第二シリカ／イオン交換混合床固相を、以下の追加の核酸単離実施例（即ち、
実施例11〜12）における使用のために、以下のように製造した。等しい量の先に
使用したのと同じ型のシリカ磁性粒子をイオン交換シリカ磁性粒子と合わせるこ
とにより第二シリカ／イオン交換混合床を製造し、そのイオン交換粒子はそれら
に共有結合されたヒスチジン残基を有するシリカ磁性粒子である（以下、“IE-H
is粒子”と称する）。以下の実施例について、シリカ磁性粒子の100mg/ml溶液50
μlをIE-His粒子の100mg/ml溶液50μlと合わせた。得られる混合物を本明細書中
“シリカ/His混合床”固相と称する。 上記実施例５でIE-DEAシリカ磁性粒子を製造するのに使用した操作と実質的に
同様のシリカ活性化及びリガンド結合操作を使用して、シリカ/His混合床固相を
つくるのに使用したIE-His粒子を製造した。ヒスチジンを中性〜塩基性のpH範囲
の優れた陰イオン交換体としてのその知られている性質のためにリガンドとして
選んだ。
【００７６】 実施例11−シリカ/IE-His混合床固相を使用する、アガロースからのプラスミドD
NAの単離 上記実施例10に記載されたように調製したシリカ/IE-His混合床固相を使用し
て以下に本明細書に記載されるようにアガロースゲルから切断されたDNAのバン
ドからプラスミドDNAを抽出し、単離した。対照として、又、プラスミドDNAを以
下に記載されるようにシリカ磁性粒子を使用して同アガロースゲルから切断され
た同DNAのバンドから抽出した。 プラスミドDNAを以下のようにアガロースゲルで分別し、それから切除した。p
GL3プラスミドDNA20μgを１％のアガロースゲルの５個の異なるウェルの夫々に
アリコートにし、プラスミドDNAを夫々のレーン中で染色体汚染物質又はRNA汚染
物質から明らかに分離するのに充分な時間の量にわたって電気泳動した。次いで
ゲルを臭化エチジウムで染色し、バンドを紫外線のもとに視覚化した。バンドを
ゲルから個々に切除した（バンド重量は薄片当り0.51g〜0.56gの範囲であった）
。図２はアガロースゲル及びプラスミドDNAバンドがそのゲルから切除された切
除位置を示す。 ゲルから一旦切除すると、夫々のバンドを65℃で30分のインキュベーションに
よりGTC緩衝液（4.0 M GTC、1.7 M Na+、及び2.6M酢酸塩；pH 5.35）550μlに溶
解した。ゲル薄片を完全に溶解した時、夫々の溶解されたバンドから得られる液
体500μlを磁性シリカ粒子50μl、又はシリカ/IE-His混合床固相100μlを含む管
に移し、プラスミドDNAを以下に記載されるようにそれから抽出した。
【００７７】 上記のように調製された、溶解されたゲル薄片混合物及びシリカ磁性粒子の対
照サンプル管を以下のように処理した。 1. 対照サンプルを室温で20分間インキュベートし、そのインキュベーション
期間中の中間にシリカ磁性粒子を混合物中で２回再懸濁させた。 2. 次いでシリカ磁性粒子を磁力によりインキュベーション混合物中の全ての
液体から除去した。 3. 次いでシリカ磁性粒子を夫々の洗浄工程で粒子に添加された70％エタノー
ル500μlで３回洗浄した。エタノール洗浄溶液の夫々の添加後に、磁力を使用し
て洗浄溶液をシリカ磁性粒子から除去した。 4. シリカ磁性粒子を最終の洗浄及び磁気分離工程後少なくとも15分間にわた
って空気乾燥させた。 5. DNAを10mMトリス緩衝液（pH 8.7）100μlでシリカ磁性粒子から溶離した
。得られる溶離液を遠心分離により粒子から分離した。
【００７８】 上記のように調製された、溶解されたゲル薄片混合物及びシリカ/IE-His混合
床固相粒子の試験サンプル管を以下のように処理した。 1. 対照サンプルの管を室温で20分間インキュベートし、そのインキュベーシ
ョン期間中の中間にシリカ磁性粒子を混合物中で２回再懸濁させた。 2. 次いでシリカ磁性粒子を磁力によりインキュベーション混合物中の全ての
液体から除去した。 3. 次いでシリカ磁性粒子を管当り添加されたナノピュアー水500μlで３回洗
浄した。夫々の洗浄工程後に、磁力を使用して洗浄溶液をシリカ磁性粒子から除
去した。 4. DNAを10mMトリス緩衝液（pH 8.7）100μlでシリカ磁性粒子から溶離した
。得られる溶離液を遠心分離により粒子から分離した。
【００７９】 次いで上記実施例２に示された分光分析操作を使用して、上記のように生成さ
れた対照溶離液及び試験サンプル溶離液を収率及び純度について試験した。プラ
スミドDNAの収率及び純度の両方は混合床固相からの溶離液である試験サンプル
で高かった。詳しくは、対照サンプル（即ち、シリカ磁性粒子単独からの溶離液
）に関するA260を0.0104で測定し、一方、試験サンプル（即ち、シリカ/IE-His
混合床からの溶離液）に関するA260を0.0166で測定した。こうして、A260結果は
プラスミドDNAの有意に高い収率が対照と較べてアガロースサンプルから回収さ
れることを示した。対照サンプルA260/A280を1.54で測定し、一方、試験サンプ
ルA260/A280は1.89であることがわかった。こうして、吸収比結果は混合床固相
を使用してアガロースから単離されたプラスミドDNAがシリカ磁性粒子単独を使
用してアガロースから単離されたプラスミドDNAよりも高い純度であることを更
に示した。
【００８０】 実施例12−シリカ/IE-His混合床固相を使用vsシリカ磁性粒子単独を使用する、
アガロースからのラムダDNAの断片の単離 等しい量のラムダDNA/HindIIIマーカー（プロメガカタログ番号G1711）の二つ
のアリコートを同じ１％アガロースゲルに装填し、マーカー中のDNAの異なるサ
イズの断片の全てが完全に分離されるまで電気泳動した。次いで4,361の分子量
に相当する二つのマーカーレーンの夫々中のバンドを切除した。切除したバンド
中のラムダDNA断片の出発量は約306mgであった。GTC緩衝液（4.0M GTC/0.34M Na
+/0.52M酢酸塩、pH 5.3）306μlをセパレート管中で夫々の切除したバンドと合
わせ、65℃で30分間インキュベートしてゲルを溶解した。ゲル薄片を完全に溶解
した時、一つのサンプルからの液体250μlを対照サンプルである100mg/mlのシリ
カ磁性粒子50μlを含む管に移した。別のサンプルからの液体250μlを100mg/ml
のシリカ/IE-His混合床固相100μlを含む管に移すことにより、混合床樹脂試験
サンプルをつくった。 上記実施例10でプラスミドDNAを試験サンプル及び対照サンプルから単離する
のに使用したのと同じプロトコルを使用して、切除したバンドからのラムダDNA
のサンプルを上記のように調製された試験サンプル及び対照サンプルから抽出し
た。 二つの異なる型の樹脂から溶離されたラムダDNAの得られるサンプルは、実施
例２記載の分光分析及び実施例１記載のゲル電気泳動により試験された時に匹敵
する収率及び純度であった。
【００８１】 実施例13−シリカ/IE-His混合床固相を使用する、アガロースゲルからの増幅さ
れたDNAの単離 又、上記実施例10に記載されたように調製されたシリカ/IE-His混合床固相を
使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して増幅されたDNAの1.8Kb断片を
アガロースゲルから単離した。下記方法を使用して関係する断片をゲルから単離
した。 1. アデノメタス・ポリポシス・コリ(Adenometous polyposis coli)(APC)遺
伝子の1.8Kb配列の増幅からの反応混合物をアガロースゲルで分別し、1.8Kb断片
に相当するサイズのバンドをそれから切除した。切除したバンドは725mgの重量
であった。 2. GTC緩衝液（4.0M GTC、1.7M Na+、及び2.1M酢酸塩、pH 5.35）725μlを切
除したバンドに添加し、アガロースゲルが溶解するまで65℃でインキュベートし
た。 3. 得られる溶液のアリコート400μlを上記実施例10に記載されたように調製
されたシリカ/IE-His混合床固相粒子10mgを含む三つのセパレート管に移した。
【００８２】 4. 粒子及び溶液の得られる混合物を室温で15分間放置して、粒子への混合物
中のDNAの結合を確実にした。その期間の終了時に、磁力を使用して、溶液を粒
子から除去した。 5. 次いで粒子の夫々のサンプルを下記の洗浄溶液の一種で３回洗浄した：(1
)ナノピュアー水（5.0未満のpHを有する、緩衝されていない精製水）；(2)ナノ
ピュアー水で調製された0.2mM KOAc pH 4.8；又は(3)ナノピュアー水で調製され
た1.3mM KOAc pH 4.8。磁力を使用して夫々の洗浄工程後に粒子を洗浄溶液から
分離した。 6. 10mM トリス-HCl, pH 8.0 50μlを粒子の夫々のサンプルに添加してDNAを
それから溶離し、磁力により粒子から分離した。粒子の夫々のサンプルからの溶
離液20μlを上記工程１からの反応混合物の二つのアリコートとともにアガロー
スゲルに装填し、ゲル電気泳動により分別した。図５はゲルが臭化エチジウムで
染色され、紫外線で照射された後のゲルの写真である。
【００８３】 図５に示されたゲルのレーンを以下のように装填した。 1. PCR反応混合物 2. シリカ/IE-His混合床粒子のナノピュアー水洗浄 3. PCR反応混合物 4. シリカ/IE-His混合床粒子の0.2mM KOAc, pH 4.8洗浄 5. シリカ/IE-His混合床粒子の1.3mM KOAc, pH 4.8洗浄 図５はレーン1-3及び５中のサンプルの全てが約1.8Kbで予想されたバンドを含
んでいたことを示す。しかしながら、レーン５中のバンドはレーン２中よりもか
なり強くなく、バンドがレーン４中に見られなかった。ナノピュアー水が上記工
程５でDNAをそれから溶離しないで粒子を洗浄するのに最良に作用したことが明
らかである。
【００８４】 実施例14−マウス血液からの全RNA及びゲノムDNAの予備単離 以下のように、SV全RNA単離系（プロメガ、カタログ番号Z3100）からの試薬を
使用して、ゲノムDNA及び全RNAをランパイアー・バイオロジカル・ラボラトリィ
ズ（ピパーズビル、PA）からのマウス血液から部分単離した。次いで下記の実施
例15〜17の操作に従って、３種の異なる基質及びプロトコルを使用して、ゲノム
DNA及び全RNAの得られる混合物を更に処理してゲノムDNAをそれから単離した。
又、全RNAを以下の理論実施例19の操作に従って本明細書に記載されたように生
成されたゲノムDNA及び全RNAの混合物から単離することができた。
【００８５】 下記溶液を本予備単離操作に使用した。 SV RNA赤血球分解溶液 5mM MgCl2 10mM NaCl 10mM トリス-HCl (pH 7.0) SV RNA分解緩衝液 4M GTC 0.01M トリス(pH 7.5) 0.97％β−メルカプトエタノール SV RNA洗浄溶液 60mM 酢酸カリウム 10mM トリス-HCl(25℃でpH 7.5) 60％エタノール（容積％） SV RNA希釈緩衝液 17.5％NaCl 8.8％クエン酸ナトリウム、pH 7.0 10％SDS（飽和） 10％F,D＆Cブルー＃１ （上記％量は特に示された場合を除き全て重量％である）
【００８６】 部分単離された全RNA及びゲノムDNAの混合物を以下のようにマウス血液細胞の
サンプルから生成した。 1. マウス全血細胞1.0mlを12の微小分離管の夫々にアリコートにした。 2. 夫々の管中の細胞を２分間にわたって4,000rpmで遠心分離によりペレット
にした。血漿上澄みをピペットで除去し、捨てた。 3. SV RNA赤血球分解溶液1mlを回収した細胞に添加し、細胞をピペット操作
により、又は穏やかに撹拌することにより分解溶液中で再懸濁させた。 4. 再懸濁された細胞／分解溶液混合物を２分間にわたって4,000rpmで遠心分
離した。得られる上澄みをピペットで除去し、捨て、白血球ペレット及び白血球
の上の赤血球デブリのペレットを後に残した。液体をこの工程及びこの操作の全
ての残りの工程中に微小遠心分離管キャップから除去した。
【００８７】 5. 工程３及び４を、合計３回のために２回繰り返した。600μlより大きい血
液容積について、赤血球デブリ200μlを除去し、数百マイクロリットルの赤血球
デブリを管中に残した。 6. 細胞ペレットを高速セッティングで５秒間撹拌して白血球及び赤血球デブ
リを再懸濁させた。 7. SV RNA分解緩衝液175μlを細胞に添加し、細胞を再度高速で５秒間撹拌し
た。 8. SV RNA希釈緩衝液350μlを分解された細胞の夫々の管に添加し、再度高速
で５秒間撹拌した。 9. 次いで分解され、希釈された細胞の管を12,000〜14,000rpmで10分間にわ
たって20〜25℃で遠心分離した。 10. 上澄みを95％-100％エタノール150μlを含む無菌微小分離管に移し、そ
の後に得られる混合物中のDNAが沈殿を形成した。次いで全ての沈殿したDNAが溶
液に逆に戻るまで混合物を反転により混合した。
【００８８】 実施例15−SV RNA回転バスケットを使用するゲノムDNAの単離 実施例14の工程10からの上澄み／エタノール混合物の三つのサンプルを別個の
無菌SV RNA回転バスケットに移し、これらの夫々を新しい回収管内に入れた。得
られる集合体を室温で５分間インキュベートした。次いで下記操作に従って、回
転バスケット集合体を使用して、ゲノムDNAを混合物から単離した。 1. 回転バスケット集合体を微小分離機中で12,000〜14,000で10秒間回転させ
た。回収管の内容物を捨て、回転バスケットを回収管に再挿入し、更に10秒間再
度回転させた。回収管の内容物を再度捨てた。 2. 水中70％のエタノール700μlを回転バスケットに入れ、回転バスケット／
回収管集合体を12-14Kで10秒間回転させた。得られるフロースルーを捨てた。 3. 空の回転バスケットを再度12-14Kで20秒間回転させて残留洗浄溶液をバス
ケットから除去した。 4. 最後に、回転バスケットを無菌微小分離管に入れ、100μlの50mM トリス-
HCl緩衝液、pH 9.5を回転バスケットに添加してそれに結合されたゲノムDNAを溶
離した。回転バスケットを室温で５分間インキュベートし、次いで微小分離機中
で12-14Kで10秒間回転させた。次いで回転バスケットを溶離液の微小分離管から
除去し、以下の次の二つの実施例に記載される単離操作に従って単離されるゲノ
ムDNAのサンプルとともに、以下の実施例18に記載される試験のために溶離液を
保存した。
【００８９】 実施例16−シリカ磁性粒子を使用するゲノムDNAの単離 実施例14の工程10からの上澄み／エタノール混合物の三つのサンプルを別個の
微小分離管に移し、それらの夫々が100mg/mlのシリカ磁性粒子単独（即ち、混合
床形態ではない）50μlを含んでいた。これらの管を室温で５分間インキュベー
トし、そのインキュベーション期間のほぼ半ばで粒子を混合物中で２回再懸濁さ
せた。次いで下記操作に従ってゲノムDNAを混合物中のその他の物質から単離し
た。 1. インキュベーション期間が終わった後に、磁力を使用してシリカ磁性粒子
を混合物の液体部分から分離した。液体を捨てた。 2. 次いでシリカ磁性粒子を70％エタノール1mlで４回洗浄した。エタノール
洗浄溶液を磁力によりシリカ磁性粒子から分離した。洗浄溶液を夫々の洗浄工程
後に捨てた。 3. エタノールが蒸発するまで、シリカ磁性粒子を微小遠心分離管中で室温で
乾燥させた。 4. 最後に、100μlの50mM トリス-HCl緩衝液、pH 9.5を最後の洗浄工程後に
シリカ磁性粒子に添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで緩衝液／粒
子混合物を微小遠心分離機中で12-14Kで10秒間回転させた。溶離液をシリカ磁性
粒子の得られるペレットから除去し、以下の実施例17に記載されるような別のサ
ンプルと一緒の試験のために取っておいた。
【００９０】 実施例17−シリカ/IE-His混合床固相を使用するマウス血液からのゲノムDNAの単
離 実施例14の工程10からのエタノール／マウス血液細胞分解産物混合物の６個の
サンプルを別個の微小遠心分離管に移し、それらの夫々が100mg/mlのシリカ/IE-
His混合床固相粒子50μlを含んでいた。これらの管を室温で５分間インキュベー
トし、そのインキュベーション期間のほぼ半ばで粒子を混合物中で２回再懸濁さ
せた。次いで下記操作に従ってゲノムDNAを混合物中のその他の物質から単離し
た。 1. インキュベーション期間が終わった後に、磁力を使用して混合床固相粒子
を混合物の液体部分から分離した。液体を捨てた。 2. 上記工程１で上澄み／エタノール混合物から分離された混合床固相粒子の
サンプルのうちの３個を洗浄溶液Ａ（66mM KOAc, pH 4.8; 500mM NaCl）1.0mlで
１回洗浄し、一方、残りの３個のサンプルを洗浄溶液Ｂ(66mM KOAc, pH 5.8、Na
Clを添加しなかった) 1.0mlで１回洗浄した。磁力を使用して混合床粒子を洗浄
溶液から分離した。洗浄溶液を捨てた。
【００９１】 3. 次いで混合床固相粒子を夫々1.0mlのナノピュアー水で４回洗浄し、水を
混合床固相粒子から夫々の洗浄工程後に磁力により分離した。洗浄溶液を夫々の
洗浄工程後に捨てた。 4. 最後に、100μlの50mM トリス-HCl緩衝液、pH 9.5を最後の洗浄工程後に
混合床固相粒子に添加し、室温で５分間インキュベートした。次いで緩衝液／粒
子混合物を微小遠心分離機中で12-14Kで10秒間回転させた。溶離液をシリカ磁性
粒子の得られるペレットから除去し、以下の実施例18に記載されるような別のサ
ンプルと一緒の試験のために取っておいた。 実施例18−SV RNA回転バスケット、シリカ磁性粒子、及びシリカ/IE-His混合床
固相から溶離されたゲノムDNAのアッセイ 上記実施例15-17に使用された単離手段の夫々から溶離されたゲノムDNAを、実
施例２に記載された分光分析を使用して試験した。このアッセイの結果を下記の
表３に示す。
【００９２】 表３
【００９３】 上記表３中の結果は比較的高い純度及び収率のマウスゲノムDNAが実施例14の
細胞分解及び予備単離操作に従って同じ量(1ml)のマウス血液から生成されたDNA
及びRNAの同じ混合物からDNAを単離するために実施例15-17に記載された操作の
夫々を使用して得られたことを示す。詳しくは、試験したサンプルの夫々に関す
るA260/A280比がタンパク質汚染を比較的含まないゲノムDNAについて予想された
範囲である1.70〜1.90の範囲内に入った。 又、操作で単離されたゲノムDNAの夫々の最終サンプルへの夫々の単離操作に
使用されたグアニジンのキャリーオーバーを検出するために、吸収の読みを230n
mで夫々のサンプルについて取った。A230結果を上記表３に示す。最低のA230読
みがSV RNA回転バスケットを使用して単離されたゲノムDNA、及び混合床固相及
び洗浄溶液Ｂ（塩なし）を使用して単離されたゲノムDNAのサンプルから得られ
ることがわかり、サンプルのこれらの二つの組中のグアニジンキャリーオーバー
の最低量を示す。しかしながら、上記表３に示されたA230読みの全てが充分に低
くて、先に単離された全てのサンプルが実質的に純粋であることを示す。
【００９４】 換言すれば、ここで得られたA230結果はグアニジンをDNAの溶離の前にゲノムD
NAを単離するのに使用された固体担体から除去するための全ての手段がほぼ同等
に有効であったことを示す。しかしながら、ここに試験されたサンプルを得るの
に使用された単離方法のうちの二つは夫々のこのような方法に使用された固体担
体からのグアニジンの除去を確実にするためにDNA溶離の前に時間を浪費する蒸
発又は特別な遠心分離工程を必要とした。例えば、実施例15における空の回転バ
スケットによる回転工程３中の蒸発、及び実施例16の工程３における粒子からの
洗浄溶液の蒸発を参照のこと。対照的に、このような蒸発工程は上記実施例16に
記載された単離操作に従って混合床固相からのゲノムDNAの溶離の前に使用され
なかった。詳しくは、その特別な実施例において、溶離工程の前に混合床固相と
合わされ、それから除去された洗浄水溶液が残留グアニジンを溶解し、それから
除去した。
【００９５】 実施例19−種々の単離手段による全RNAの単離における基質としての使用のため
のマウス肝臓組織の浄化された細胞分解産物とエタノールの混合物の調製 エタノールとマウス肝臓組織の浄化された細胞分解産物の混合物を以下のよう
にSV全RNA単離系技術マニュアル（プロメガ、TM#48）に示された組織細胞分解産
物調製操作に従って調製した。 1. 三つのマウス肝臓をSV RNA分解緩衝液の存在下で均一にし、肝臓組織171m
gを分解緩衝液夫々１ミリリットルと合わせた。分解が完結するまで（即ち、目
視できる組織断片が溶液に残らなくなるまで）、均一化を続けた。 2. 細胞分解産物175μlを６個の1.5mlの微小遠心分離管の夫々に移した。SV
RNA希釈緩衝液（青色）（実施例14を参照のこと）350μlを夫々の管に添加した
。夫々の微小遠心分離管の内容物を反転により混合した。次いで希釈された細胞
分解残物を70℃で水浴又は加熱ブロックに入れ、約３分間インキュベートした。 3. 次いで希釈された細胞分解産物の全てのサンプルを約12,000〜14,000xgで
10分間遠心分離し、浄化された細胞分解産物上澄みを生成した。 4. 浄化された細胞分解産物の夫々の上澄み（約500μl）をピペット操作によ
り新しい微小遠心分離管に移し、95％エタノール200μlを浄化された細胞分解産
物の夫々のサンプルに添加した。得られるエタノール／細胞分解産物混合物をピ
ペット操作により混合した。
【００９６】 実施例20−多孔性及び非多孔性のシリカ/IE-His混合床固相を使用する、マウス
肝臓の細胞分解産物／エタノールからの全RNAの単離 次いで２種の異なる混合床固相を使用して、全マウスRNAを上記実施例19に記
載されたマウス肝臓から調製されたエタノール／細胞分解産物混合物の４個のサ
ンプルから単離した。２種の混合床固相の一種は上記実施例10に記載されたよう
に調製された多孔性シリカ磁性粒子のシリカ/IE-His混合床固相であった。ここ
に使用した別の混合床固相は、非多孔性シリカ磁性粒子を多孔性粒子に代えて使
用した以外は、多孔性シリカ/IE-His混合床固相と同じ方法で調製された。同じ
操作を使用して、両方の型の混合床固相を使用して、全RNAを夫々のサンプルか
ら単離した。 エタノール／細胞分解産物混合物の夫々のサンプルを夫々50μlの100mg/mlの
多孔性又は非多孔性のシリカ/IE-His混合床固相粒子を含む微小遠心分離管に移
した。混合物及び粒子を室温で５分間インキュベートし、そのインキュベーショ
ン期間のほぼ半ばで混合床固相粒子を混合物中で２回再懸濁させた。次いでRNA
を以下の操作に従って混合床固相から単離した。
【００９７】 1. 磁力を使用して混合床固相粒子を上澄み／エタノール混合物から分離した
。それから分離した液体を捨てた。 2. DNase緩衝液（0.0225Mトリス(pH 7.5)、1.125M NaCl、及び0.09M MnCl2）
中のDNase I酵素の混合物50μlを混合床固相粒子に直接添加し、20-25℃で15分
間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、SV DNase停止溶液
（60mM酢酸カリウム、10mMトリス-HCl, pH 7.5(25℃)、及び60％エタノール）20
0μlを夫々のサンプルに添加した。 3. 粒子を磁力によりDNaseインキュベーション溶液から分離し、溶液を捨て
た。 4. 洗浄溶液Ｂ（66mM KOAc, pH 5.8）1.0mlを夫々のサンプルに添加し、磁力
を使用して混合床固相粒子を洗浄溶液から分離した。それから分離した洗浄溶液
を捨てた。 5. 混合床固相粒子を夫々1.0mlのナノピュアー水で４回洗浄し、水を混合床
固相粒子から夫々の洗浄工程後に磁力により分離した。それから分離した洗浄溶
液を夫々の洗浄工程後に捨てた。 6. 最後に、無ヌクレアーゼ水100μlを最後の洗浄工程後に混合床固相粒子に
添加し、室温で５分間インキュベートした。水／粒子混合物を微小遠心分離機中
で12-14Kで10秒間回転させた。得られる溶離液をシリカ磁性粒子の得られるペレ
ットから除去し、以下の実施例22に記載されるように試験した。
【００９８】 実施例21−SV RNA回転バスケット集合体を使用する、マウス肝臓の細胞分解産物
／エタノールからの全RNAの単離 次いで以下のように、SV全RNA単離系技術マニュアル（TM#48、プロメガ・コー
ポレーション）に記載された単離操作を使用して、全マウスRNAを上記実施例19
に記載されたようにマウス肝臓から調製されたエタノール／細胞分解産物混合物
の残りの二つのサンプルから単離した。 1. 上澄み／エタノール混合物の二つのサンプルの夫々をSV RNA回転バスケッ
トに移し、12,000-14,000xgで約１分間にわたって回収管で遠心分離した。回収
管中に回収した溶液を捨てた。 2. DNase緩衝液（0.0225Mトリス(pH 7.5)、1.125M NaCl、及び0.09M MnCl2）
中のDNase I酵素の混合物50μlを上記分離工程後に夫々の回転バスケットに直接
添加した。得られる混合物を15分間にわたって20-25℃でインキュベートした。
インキュベーション後に、SV DNase停止溶液（60mM酢酸カリウム、10mMトリス-H
Cl, pH 7.5(25℃)、及び60％エタノール）200μlを夫々のサンプルに添加した。 3. エタノールを添加したSV RNA洗浄溶液600μlを夫々の回転バスケット中の
サンプルに添加した。回転バスケットを12,000-14,000xgで約１分間にわたって
回収管で遠心分離し、回収管の内容物を捨てた。 4. SV RNA洗浄溶液250μl、及び高速遠心分離を２分間使用して、上記洗浄工
程３を繰り返した。 5. 最後に、ナノピュアー無ヌクレアーゼ水100μlを夫々の単離手段に添加し
て全RNAをそれから溶離した。溶離液を遠心分離により単離手段の夫々から分離
した。
【００９９】 実施例22−シリカ/IE-His混合床固相を使用してマウス血液から単離されたDNA及
び全RNAの比較 夫々実施例17及び21に記載されたようにシリカ/IE-His混合床固相でマウス血
液から単離されたゲノムDNA及び全RNAの夫々のサンプル20μlをアガロースゲル
で分別し、臭化エチジウムで染色した。ゲルの写真を図３に再現する。ゲルのレ
ーンを以下のように装填した。 レーンＡ、Ｂ、及びＣに単離された全RNAを装填した。 レーン1-3に洗浄溶液Ａを使用して単離されたDNAを装填した。 レーン4-6に洗浄溶液Ｂを使用して単離されたDNAを装填した。 ゲルアッセイ結果から、無傷RNA及びDNAがマウス血液から単離されたが、単離
されたRNAの量がDNAに較べて小さかったことが明らかである。又、工程２で使用
したいずれかの洗浄溶液で単離されたDNAは実質的に無傷であり、RNAによる汚染
がないことが明らかであったことが明らかである。
【０１００】 実施例23−多孔性シリカ/IE-His混合床固相、非多孔性シリカ/IE-His混合床固相
、及びSV RNA回転バスケット集合体から溶離された全マウスRNAのアッセイ 上記実施例19-21で使用した単離手段の夫々から溶離された全マウスRNAを、以
下のようにゲル電気泳動を使用して分析した。夫々のサンプル10μlを1.5％アガ
ロースゲルの別個のウェルに装填し、100bp DNAラダー（プロメガカタログ番号G
2101）により分離された対で装填された同じ単離手段で溶離されたサンプルをサ
ンプルの夫々の対の間の空のウェルに装填した。次いで1.5％アガロースゲルを
充分な時間の量にわたって電気泳動して100bpラダーの横さんの間の明らかな分
離を得た。最後に、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、紫外線の下で写
真撮影した。
【０１０１】 図４は上記のように装填され、分別されたサンプル及びラダーの1.5％アガラ
ースゲルの写真のコピーである。下記のサンプルを図４に示されたゲルの夫々の
レーンに装填した。 レーン１：プロメガ100bp DNAラダー レーン２＆３：多孔性シリカ/IE-His混合床固相からの溶離液 レーン４：100bp DNAラダー レーン５＆６：SV RNA回転バスケットからの溶離液 レーン７：100bp DNAラダー レーン８＆９：非多孔性シリカ/IE-His混合床固相からの溶離液 レーン10：100bp DNAラダー このアッセイの結果は上記実施例19-21に使用した全ての三つの単離手段及び
方法が無傷RNAであることが明らかであるものを生じることを示した。又、図４
はSV RNA回転バスケットの一つからの２種の溶離液のうちの少なくとも一種が高
分子量核酸、おそらくゲノムマウスDNAで汚染されたことを示す。レーン４中の
ウェルの直ぐ下のバンドを参照のこと。多孔性又は非多孔性の混合床固相粒子で
単離された全RNAのサンプルのいずれもがこのような汚染物質を含まないことが
明らかである。
【０１０２】 図４は本方法の磁気分離及び混合床単離操作がSV RNA回転バスケットを使用し
て生成されたものと少なくとも同じ位に汚染物質を含まない全RNAを単離するの
に使用し得ることを示す。しかしながら、上記実施例21に使用したSV RNA単離操
作と違って、本方法（例えば、上記実施例20を参照のこと）は遠心分離中の回転
を必要としないし、エタノール洗浄を必要としない（水洗浄にすぎない）。 明らかに、先に示された本発明の多くの改良及び変化が本発明の精神及び範囲
を逸脱しないでなし得る。それ故、このような限定のみが特許請求の範囲に示さ
れるように課されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ２種の異なる陰イオン交換固相（一種の固相（三角）は第二の固相（円）のpK
aよりかなり低いpKaを有する）の結合活性の理論プロットである。
【図２】 アガロースゲルで分別され、臭化エチジウムで染色されたプラスミドDNAの写
真のコピーであり、矢印はプラスミドDNAのバンドが実施例11に記載されたよう
に混合床固相粒子によるそれからのプラスミドDNAの単離の前にゲルから切除さ
れた位置を示す。
【図３】 アガロースゲルで分別され、臭化エチジウムで染色された、実施例14、17、及
び18に記載されたように混合床固相を使用してマウス血液から単離されたゲノム
DNA及び全RNAの写真のコピーである。
【図４】 100bpラダーの幾つかのサンプルとともにアガロースゲルで分別され、臭化エ
チジウムで染色された、混合床固相を使用して、又はSV全RNA単離系（登録商標
）（プロメガ・コーポレーション）を使用してマウス肝臓から単離された全RNA
の写真のコピーである。
【図５】 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅され、種々の洗浄条件下で混合床固相を使
用して単離され、臭化エチジウムで染色されたDNAの写真のコピーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/553 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ホームズ ダイアナ エル アメリカ合衆国 イリノイ州 60012 ク リスタル レイク タイル ライン ロー ド 4818 (72)発明者 シンプソン ダニエル ジェイ アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53562 ミドルトン ノース ハイ ポイ ント ロード 1329 (72)発明者 カッツェンドラー エホシュア イスラエル 91120 エルサレム ハパル マッチ ストリート 68 (72)発明者 ビットナー レックス エム アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53012 セダーバーグ バーチ ストリー ト ダブリュー53 エヌ598 (72)発明者 グローシュ ジョセフィン シー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53560 マゾメニー ジャコビー ドライ ヴ 6121 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 AA20 CA01 CA11 HA20 4D017 AA08 BA07 CA06 CA17 CB01 DA03 EA05

Claims (62)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物から標
    的核酸を単離するための混合床固相であって、混合床固相が 第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第二
    溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有する第一固相、
    及び 第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的核酸に結合する能力と、第一
    溶液の存在下でそれに結合された標的核酸を放出する能力とを有する第二固相を
    含み、 第一固相及び第二固相の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的核
    酸を放出する能力を有することを特徴とする混合床固相。
  2. 【請求項２】 第一固相が第一溶液の存在下で標的核酸と交換する能力を有
    するイオン交換体である請求の範囲第１項記載の混合床固相。
  3. 【請求項３】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpHを有し、かつカ
    オトロピック試薬を実質的に含まない請求の範囲第２項記載の混合床固相。
  4. 【請求項４】 イオン交換体がそれに共有結合された少なくとも一種のイオ
    ン交換残基を有するシリカ材料である請求の範囲第２項記載の混合床固相。
  5. 【請求項５】 それに共有結合された少なくとも一種のイオン交換残基を有
    するシリカ材料がシリカ磁性粒子である請求の範囲第４項記載の混合床固相。
  6. 【請求項６】 イオン交換残基がアミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、ヒ
    スチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステインからなる残基の群から選
    ばれる請求の範囲第４項記載の混合床固相。
  7. 【請求項７】 第二固相がシリカ材料である請求の範囲第２項記載の混合床
    固相。
  8. 【請求項８】 第二固相がシリカ磁性粒子である請求の範囲第７項記載の混
    合床固相。
  9. 【請求項９】 第二溶液が少なくとも0.5Mのカオトロピック試薬を含む請求
    の範囲第７項記載の混合床固相。
  10. 【請求項１０】 第一固相及び第二固相が両方ともイオン交換体であり、但
    し、第一溶液が第二溶液のpHとは少なくとも0.5 pH単位異なるpH及び第二溶液と
    は少なくとも20％異なる塩濃度を有することを条件とする請求の範囲第１項記載
    の混合床固相。
  11. 【請求項１１】 溶離緩衝液が約3M以下の塩濃度及び少なくとも約４かつ約
    9.5までのpHを有する請求の範囲第１項記載の混合床固相。
  12. 【請求項１２】 標的核酸がプラスミドDNA、ゲノムDNA、全RNA、及び酵素
    増幅により生成された核酸からなる群から選ばれる請求の範囲第１項記載の混合
    床固相。
  13. 【請求項１３】 第一固相、第二固相、第一溶液、第二溶液、及び溶離緩衝
    液は少なくとも一種のエンドトキシン汚染物質が第一溶液又は第二溶液の存在下
    で混合床固相に結合し、かつ第一溶液、第二溶液、又は溶離緩衝液の存在下でそ
    れから溶離されないことを確実にするように構成される請求の範囲第１項記載の
    混合床固相。
  14. 【請求項１４】 プラスミドDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合
    物からプラスミドDNAを単離するための混合床固相であって、混合床固相が それに共有結合された少なくとも一種の陰イオン交換残基を含む第一磁性シリ
    カ粒子（その第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に
    プラスミドDNAに結合する能力を有し、かつ第二溶液の存在下でそれに結合され
    たプラスミドDNAを放出する能力を有する）、及び それに共有結合されたケイ素質酸化物を含む第二磁性シリカ粒子（その第二磁
    性シリカ粒子は第二溶液の存在下で混合物と合わされた時にプラスミドDNAに結
    合する能力を有し、かつ第一溶液の存在下でそれに結合されたプラスミドDNAを
    放出する能力を有する）を含み、 第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそ
    れに結合された標的核酸を放出する能力を有することを特徴とする混合床固相。
  15. 【請求項１５】 第一磁性シリカ粒子に共有結合された陰イオン交換残基が
    アミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、ジエタノールアミン、ヒスチジン、ピリ
    ジルアラニン、及びピリジルシステインからなる群から選ばれる請求の範囲第１
    ４項記載の混合床固相。
  16. 【請求項１６】 少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、かつ
    第二シリカ磁性粒子が実質的にカオトロピック試薬を含まない第一溶液又は第二
    溶液の存在下でエンドトキシンに結合する能力を有する請求の範囲第１４項記載
    の混合床固相。
  17. 【請求項１７】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を含む請求の範囲第１４項記載の混合床固相。
  18. 【請求項１８】 第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約0.5Mのカオトロピック試薬濃度を含む請求の範囲第１４項記載の混合床固相
    。
  19. 【請求項１９】 溶離溶液が約5M以下の塩濃度及び少なくとも約４かつ約９
    までのpHを含む請求の範囲第１４項記載の混合床固相。
  20. 【請求項２０】 a) 第一固相及び第二固相を含む混合床固相を用意し （第一固相は第一溶液中で標的核酸に結合し、また第二溶液の存在下でそれに結
    合された標的核酸を放出する能力を有し、 第二固相は第二溶液中で標的核酸に結合し、また第一溶液の存在下でそれに結
    合された標的核酸を放出する能力を有し、かつ 第一固相及び第二固相の夫々が溶離緩衝液の存在下でそれに結合された標的核
    酸を放出する能力を有する）、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、標的核酸を第一固相に
    結合させ、 c) 混合床固相を第一溶液から分離し、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、核酸を第一固相から放出させ、第二固相
    に結合させ、 e) 混合床固相を第二溶液から分離し、そして f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、標的核酸を混合床固相から溶離緩衝液
    に放出させることを特徴とする標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混
    合物からの標的核酸の単離方法。
  21. 【請求項２１】 工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピッ
    ク試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工
    程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第２０項記載の方法。
  22. 【請求項２２】 デカント、真空下の直接除去、遠心分離、濾過、カラム中
    の重力流、及びカラム中の高圧流からなる群から選ばれた溶液除去手段を使用し
    て、工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程を行なう請求の範囲
    第２０項記載の方法。
  23. 【請求項２３】 第一固相及び第二固相が両方とも磁性粒子であり、磁力を
    使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた少なくとも一つの除去工程中
    に容器中に保持する請求の範囲第２０項記載の方法。
  24. 【請求項２４】 第一固相がシリカ磁性粒子であり、第二固相がそれに共有
    結合された陰イオン交換基を有するシリカ粒子を含み、その陰イオン交換基が標
    的核酸と交換することができる請求の範囲第２３項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 陰イオン交換基がアミン、ジメチルアミン、ヒスタミン、
    ジエタノールアミン、ヒスチジン、ピリジルアラニン、及びピリジルシステイン
    からなる群から選ばれる請求の範囲第２４項記載の方法。
  26. 【請求項２６】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第２４項
    記載の方法。
  27. 【請求項２７】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第２４項
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】 工程(a)で用意された混合床固相の第一固相及び第二固相
    が陰イオン交換固相であり、第一固相及び第二固相の夫々が互いに少なくとも0.
    5 pKa単位だけ異なっている異なるpKaを有する請求の範囲第２０項記載の方法。
  29. 【請求項２９】 標的核酸がプラスミドDNA、ゲノムDNA、全RNA、及び酵素
    増幅により生成された核酸からなる群から選ばれる請求の範囲第２０項記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】 工程(d)で混合床固相と合わされる混合物が標的核酸及び
    アガロースを含む混合物である請求の範囲第２０項記載の方法。
  31. 【請求項３１】 工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも１回行な
    った後にのみ、単離された標的核酸の溶液を工程(g)で混合床固相から溶離する
    請求の範囲第２０項記載の方法。
  32. 【請求項３２】 少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、混合
    物中に存在するエンドトキシンの少なくとも90％が工程(g)で混合床固相から溶
    離された溶液中に存在しない請求の範囲第２０項記載の方法。
  33. 【請求項３３】 プラスミドDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合
    物からのプラスミドDNAの単離方法であって、その方法が a) 第一シリカ磁性
    粒子及び第二シリカ磁性粒子固相を含む混合床固相を用意する工程 （第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下でプラスミドDNAに結合し、また第
    二溶液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、 第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下でプラスミドDNAに結合し、また第一
    溶液の存在下でプラスミドDNAを放出する能力を有し、かつ 第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそ
    れに結合されたプラスミドDNAを放出する能力を有する）、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、プラスミドDNAを第一
    固相に結合させる工程、 c) 混合床固相を第一溶液から分離する工程、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、プラスミドDNAを第一固相から放出させ
    、第二固相に結合させる工程、 e) 混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、プラスミドDNAを混合床固相から溶離
    緩衝液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
  34. 【請求項３４】 工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピッ
    ク試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工
    程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第３３項記載の方法。
  35. 【請求項３５】 磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた
    少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第３３項記載の方法
    。
  36. 【請求項３６】 第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第３３項記載の方法。
  37. 【請求項３７】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第３６項
    記載の方法。
  38. 【請求項３８】 第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第３３項記載の方法。
  39. 【請求項３９】 第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第３８項
    記載の方法。
  40. 【請求項４０】 工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも２回行な
    った後まで、混合床固相を工程(f)で溶離緩衝液と合わせない請求の範囲第３３
    項記載の方法。
  41. 【請求項４１】 少なくとも一種の汚染物質がエンドトキシンであり、エン
    ドトキシンの少なくとも90％が工程(g)で混合床固相から溶離された溶液中に存
    在しない請求の範囲第３３項記載の方法。
  42. 【請求項４２】 ゲノムDNA及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物か
    らのゲノムDNAの単離方法であって、その方法が a) 第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子固相を含む混合床固相を用意
    する工程 （第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下でゲノムDNAに結合し、また第二溶
    液の存在下で標的核酸を放出する能力を有し、 第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下でゲノムDNAに結合し、また第一溶液
    の存在下でゲノムDNAを放出する能力を有し、かつ 第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそ
    れに結合されたゲノムDNAを放出する能力を有する）、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、ゲノムDNAを第一固相
    に結合させる工程、 c) 混合床固相を第一溶液から分離する工程、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、ゲノムDNAを第一固相から放出させ、第
    二固相に結合させる工程、 e) 混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、ゲノムDNAを混合床固相から溶離緩衝
    液に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
  43. 【請求項４３】 工程(a)で用意される混合床固相を実質的にカオトロピッ
    ク試薬を含まない平衡緩衝液で平衡にし、その後に平衡にされた混合床固相を工
    程(b)で混合物と合わせる請求の範囲第４２項記載の方法。
  44. 【請求項４４】 磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた
    少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第４２項記載の方法
    。
  45. 【請求項４５】 第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第４２項記載の方法。
  46. 【請求項４６】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第４５項
    記載の方法。
  47. 【請求項４７】 第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第４２項記載の方法。
  48. 【請求項４８】 第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第４２項
    記載の方法。
  49. 【請求項４９】 工程(b)、(d)、(e)、及び(f)の夫々を少なくとも２回行な
    った後まで、混合床固相を工程(f)で溶離緩衝液と合わせない請求の範囲第４２
    項記載の方法。
  50. 【請求項５０】 核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からの酵
    素増幅により生成された核酸の単離方法であって、その方法が a) 第一シリカ
    磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子固相を含む混合床固相を用意する工程 （第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で核酸に結合し、また第二溶液の存
    在下で標的核酸を放出する能力を有し、 第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下で核酸に結合し、また第一溶液の存在
    下で核酸を放出する能力を有し、かつ 第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそ
    れに結合された核酸を放出する能力を有する）、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、核酸を第一固相に結合
    させる工程、 c) 混合床固相を第一溶液から分離する工程、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、核酸を第一固相から放出させ、第二固相
    に結合させる工程、 e) 混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、核酸を混合床固相から溶離緩衝液に放
    出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
  51. 【請求項５１】 磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた
    少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第５０項記載の方法
    。
  52. 【請求項５２】 第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第５０項記載の方法。
  53. 【請求項５３】 標的RNA及びDNAを含む混合物からの標的RNAの単離方法で
    あって、その方法が a) 第一シリカ磁性粒子及び第二シリカ磁性粒子固相を含む混合床固相を用意
    する工程 （第一磁性シリカ粒子は第一溶液の存在下で標的RNAに結合し、また第二溶液
    の存在下で標的RNAを放出する能力を有し、 第二シリカ磁性粒子は第二溶液の存在下で標的RNAに結合し、また第一溶液の
    存在下で標的RNAを放出する能力を有し、かつ 第一磁性シリカ粒子及び第二磁性シリカ粒子の夫々が溶離緩衝液の存在下でそ
    れに結合された標的RNAを放出する能力を有する）、 b) 混合物を第一溶液の存在下で混合床固相と合わせ、標的RNAを第一固相に
    結合させる工程、 c) 混合床固相を第一溶液から分離する工程、 d) 混合床固相を第二溶液と合わせ、標的RNAを第一固相から放出させ、第二
    固相に結合させる工程、 e) 混合床固相を第二溶液から分離する工程、及び f) 混合床固相を溶離緩衝液と合わせ、標的RNAを混合床固相から溶離緩衝液
    に放出させる工程を含むことを特徴とする単離方法。
  54. 【請求項５４】 磁力を使用して混合床固相を工程(d)及び(f)から選ばれた
    少なくとも一つの除去工程中に容器中に保持する請求の範囲第５３項記載の方法
    。
  55. 【請求項５５】 第一シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第二シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第５３項記載の方法。
  56. 【請求項５６】 第一溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第二溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第５３項
    記載の方法。
  57. 【請求項５７】 第二シリカ磁性粒子がそれに共有結合された少なくとも一
    種の陰イオン交換基を含み、第一シリカ磁性粒子がケイ素質酸化物被覆物を含む
    請求の範囲第５３項記載の方法。
  58. 【請求項５８】 第二溶液が少なくとも約４かつ約９までのpH及び少なくと
    も約100mMかつ約3Mまでの塩濃度を有し、第一溶液が少なくとも約４かつ約９ま
    でのpH及び少なくとも0.5Mかつ約4.0Mまでの塩濃度を有する請求の範囲第５９項
    記載の方法。
  59. 【請求項５９】 夫々がジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基に共有結合
    された第一シリカ磁性粒子を含む、多数の第一シリカ磁性粒子を含むことを特徴
    とする、標的核酸及び少なくとも一種の汚染物質を含む混合物からの標的核酸の
    単離用のシリカ磁性粒子。
  60. 【請求項６０】 ジエチルアミノ(DEA)陰イオン交換残基がプロピルジメト
    キシシランリガンドにより第一シリカ磁性粒子に共有結合されている請求の範囲
    第５９項記載のシリカ磁性粒子。
  61. 【請求項６１】 多数の第二シリカ磁性粒子を更に含み、多数の第一シリカ
    磁性粒子及び多数の第二シリカ磁性粒子が混合床固相の形態で一緒に混合されて
    いる請求の範囲第５９項記載のシリカ磁性粒子。
  62. 【請求項６２】 多数の第一シリカ磁性粒子が第一溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的
    核酸に結合する能力と、第二溶液の存在下でそれらに結合された標的核酸を放出
    する能力とを有し、 多数の第二シリカ磁性粒子が第二溶液の存在下で混合物と合わされた時に標的
    核酸に結合する能力と、第一溶液の存在下でそれらに結合された標的核酸を放出
    する能力とを有し、かつ 多数の第一シリカ磁性粒子と多数の第二シリカ磁性粒子の夫々が溶離緩衝液の
    存在下でそれらに結合された標的核酸を放出する能力を有する請求の範囲第６１
    項記載のシリカ磁性粒子。
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