JP2002345490A

JP2002345490A - 平滑筋細胞分化維持に関与する遺伝子

Info

Publication number: JP2002345490A
Application number: JP2001343870A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Funahashi; 真一舟橋; Shoji Miyata; 昌二宮田; Kenji Sofue; 憲治祖父江; Kenichiro Hayashi; 謙一郎林
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2002-12-03

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、平滑筋細胞の分化維持に関与する新
規な遺伝子、および該遺伝子によってコードされる蛋白
質、並びに該遺伝子の発現を指標とした平滑筋細胞の異
常増殖に起因する疾患の診断方法、および診断薬の提供
を課題とする。【解決手段】ニワトリ砂嚢平滑筋細胞の培養時に、イン
シュリン様増殖因子(IGF-I)を添加することにより、平
滑筋細胞分化型のフェノタイプを維持するために適した
培養系を開発した。この培養系を用い、ディファレンシ
ャルディスプレイ法から選択した681クローン、および
サブトラクティッドハイブリダイゼーション法を用いて
作製した2016クローンについてマクロアレイ解析を行
い、平滑筋分化型で発現が上昇している79個の新規な遺
伝子（ESTクローン）を単離した。さらに、13個の既知
遺伝子が平滑筋細胞の分化維持に関与していることを見
出した。該遺伝子の発現を検出することにより、平滑筋
細胞のフェノタイプ変換が病因と考えられている動脈硬
化、心筋梗塞、大動脈瘤、脳卒中、および糸球体腎炎等
の疾患の診断を行うことが期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、平滑筋細胞の分化
維持に関与する遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】平滑筋細胞は血管、気管、消化管、膀胱
および子宮等の組織における主要な筋細胞であり、その
重要な機能は収縮弛緩の調節である。この平滑筋細胞の
収縮能を消失し、増殖能を獲得するフェノタイプへの変
換と病態への関与が最近明らかにされてきた。血管形成
術（PTCA）後の再狭窄等の病態形成に、血管平滑筋細胞
の増殖が大きく関与している。動脈硬化発症の初期に血
管中膜平滑筋細胞の脱分化型へのフェノタイプの変換に
より、運動能を獲得して血管内膜へ移動することによっ
て、血管内膜の肥厚の主因となることも明らかになって
きた。しかしながら、この平滑筋細胞のフェノタイプの
変換については関与する遺伝子、その分子メカニズム等
不明な点が多い。平滑筋細胞の増殖が引き起こす病態に
対する治療法の開発のためにも、平滑筋細胞が分化型の
フェノタイプをどう維持して、それがどのようにして脱
分化型へ変換するのかを理解することが必要である。し
かし、平滑筋の研究に適した分化型フェノタイプを維持
するための平滑筋細胞の培養系は、これまでのところ知
られていない。

【０００３】分化型平滑筋細胞のフェノタイプに依存し
て発現する遺伝子を明らかにすることにより、平滑筋細
胞の異常増殖に起因する疾病、例えば、動脈硬化、心筋
梗塞、大動脈瘤、脳卒中等の虚血性の心疾患、脳血管障
害、血管性の痴呆症に対する治療法の開発、および該疾
病の診断薬の提供が期待される。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、平滑筋細胞
の分化維持に関与する新規な遺伝子、および該遺伝子に
よってコードされる蛋白質、並びに該遺伝子の発現を指
標とした平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の新規な
診断方法、および診断薬の提供を課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために下記の如く鋭意研究を行った。まず本
発明者らは、ニワトリ砂嚢平滑筋細胞の培養が、インシ
ュリン様増殖因子(IGF-I)により可能になることを見出
し、平滑筋分化型のフェノタイプを維持するために適し
た培養系を開発することに成功した。次に本発明者ら
は、このニワトリ砂嚢平滑筋細胞の培養系を用いること
により、分化型平滑筋細胞のフェノタイプに依存して発
現する遺伝子の単離を試みた。そして、ディファレンシ
ャルディスプレイ法から選択したノンリダンダント(non
-redundant)な681クローン、およびサブトラクティッド
ハイブリダイゼーション法を用いて作製した2016クロー
ンについてマクロアレイによる解析を行い、ニワトリES
T断片を単離した。発現解析を行った結果、79個の新規
遺伝子、および13個の既知遺伝子が、分化型平滑筋細胞
において高い発現を示した。

【０００６】即ち、これらは平滑筋細胞が分化型のフェ
ノタイプを維持するのに伴って発現がみられ、脱分化に
よって発現が減少するものであり、平滑筋細胞の分化型
の維持に深く関与していることが示唆された。また、本
発明者らによって取得されたこれらのESTは、ヒトESTお
よびヒトゲノム配列とも高い相同性を有することからヒ
トオルソログ(orthologue)を容易に単離することが可能
である。

【０００７】本発明者らにより単離された遺伝子および
該遺伝子によってコードされる蛋白質は、平滑筋細胞の
異常増殖に起因する疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞、
大動脈瘤、脳卒中等の虚血性の心疾患、脳血管障害、お
よび血管性の痴呆症に対する予防または治療のための医
薬組成物としての応用が期待される。さらに、これら遺
伝子の発現を検出することで、平滑筋細胞の異常増殖に
起因する上記の疾病の診断を行うことが可能である。

【０００８】従って、本発明は、平滑筋細胞の分化維持
に関与する新規な遺伝子、および該遺伝子によってコー
ドされる蛋白質、並びに該遺伝子の発現を指標とした平
滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の新規な診断方法、
および診断薬に関し、より具体的には、〔１〕下記
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、（ａ）配列
番号：１から７９のいずれかに記載の塩基配列のコード
領域を含むDNA、（ｂ）配列番号：１から７９のいずれ
かに記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列に
おいて１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、
および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番
号：１から７９のいずれかに記載の塩基配列によりコー
ドされるアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋
白質をコードするDNA、（ｃ）配列番号：１から７９の
いずれかに記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、配列番号：１から７
９のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるアミ
ノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコード
するDNA、〔２〕配列番号：１から７９のいずれかに
記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からな
るペプチドの部分をコードするDNA、〔３〕〔１〕ま
たは〔２〕に記載のDNAによりコードされる蛋白質また
はペプチド、〔４〕〔１〕または〔２〕に記載のDNA
が挿入されたベクター、〔５〕〔１〕または〔２〕に
記載のDNA、または〔４〕に記載のベクターを保持する
形質転換体、〔６〕〔５〕に記載の形質転換体を培養
し、該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋
白質またはペプチドを回収する工程を含む、〔３〕に記
載の蛋白質またはペプチドの製造方法、〔７〕〔３〕
に記載の蛋白質に結合する抗体、〔８〕配列番号：１
から７９のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAまた
はその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドを含
むポリヌクレオチド、

〔９〕〔３〕に記載の蛋白質に
結合する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）
該蛋白質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させ
る工程、（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと被検
試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該蛋白質また
はその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選
択する工程、を含む方法、〔１０〕平滑筋細胞の異常
増殖に起因する疾患の治療のための化合物のスクリーニ
ング方法であって、（ａ）〔３〕に記載の蛋白質若しく
は下記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のDNAに
よりコードされる蛋白質またはそれらの部分ペプチドに
被検試料を接触させる工程、（ｂ）該蛋白質またはそれ
らの部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工
程、（ｃ）該蛋白質またはそれらの部分ペプチドに結合
する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（ｉ）配列番号：８０から９９、１０２、１０５、１０
７から１１６のいずれかに記載の塩基配列のコード領域
を含むDNA、（ｉｉ）配列番号：８０から９９、１０
２、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩基
配列によりコードされるアミノ酸配列において１若しく
は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または
付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：８０から９
９、１０２、１０５、１０７から１１６のいずれかに記
載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む蛋
白質と機能的に同等な蛋白質をコードするDNA、（ｉｉ
ｉ）配列番号：８０から９９、１０２、１０５、１０７
から１１６のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番
号：８０から９９、１０２、１０５、１０７から１１６
のいずれかに記載の塩基配列によりコードされるアミノ
酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードす
るDNA、〔１１〕〔１〕に記載のDNA、〔１０〕の
（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のDNA、または
これらDNAによりコードされる蛋白質を有効成分として
含有する平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の治療
薬、〔１２〕平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患を
診断する方法であって、（ａ）該疾患の患者から細胞試
料を調製する工程、および（ｂ）該細胞における〔１〕
に記載のDNA、または〔１０〕の（ｉ）から（ｉｉｉ）
のいずれかに記載のDNAの発現を検出する工程、を含む
方法、〔１３〕下記（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白
質に結合する抗体、または配列番号：１から９９、１０
２、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩基
配列からなるDNA若しくはその相補鎖に相補的な少なく
とも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、平
滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の診断薬、（ａ）
〔３〕に記載の蛋白質、（ｂ）〔１０〕の（ｉ）から
（ｉｉｉ）のいずれかに記載のDNAによりコードされる
蛋白質、を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は、平滑筋細胞の分化維持
に関与する新規なタンパク質および遺伝子を提供する。
本発明者らにより単離されたニワトリ由来の新規遺伝子
の各塩基配列をそれぞれ配列番号：１から７９に示す。
これら遺伝子は、平滑筋細胞の分化型のフェノタイプに
おいて発現する遺伝子として単離されたため、平滑筋細
胞の分化維持に関与していると考えられる。従って、こ
れら遺伝子は、その発現を検出することにより、平滑筋
細胞の異常増殖に起因する疾病、例えば、動脈硬化、心
筋梗塞、大動脈瘤、脳卒中等の虚血性の心疾患、脳血管
障害、血管性の痴呆症の診断に利用することが考えられ
る。また、これら遺伝子がコードするタンパク質の活性
や発現を修飾する化合物は、これら疾患の予防や治療の
ための薬剤の候補となると考えられる。

【００１０】また本発明は、これまでのところ機能が不
明であったニワトリ既知遺伝子、および本発明の新規ニ
ワトリ遺伝子のヒトオルソログの新たな用途を提供す
る。こられの遺伝子および該遺伝子をコードする蛋白質
は、上記の平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の診断
への利用、および該疾患の予防や治療のための薬剤とし
ての使用が期待される。また、該疾患の治療のための化
合物のスクリーニング方法への利用も期待される。本発
明者により初めて平滑筋細胞の分化維持に関与すること
が見出されたニワトリ既知遺伝子としては、実施例８に
記載した13個の遺伝子が挙げられる。該遺伝子の塩基配
列を配列番号：９８から１０２、１０４、１０５、１０
７から１１５に示す。また、本発明の新規ニワトリ遺伝
子のヒトオルソログの各塩基配列をそれぞれ配列番号：
８０から９７、および１１６に示す。

【００１１】本発明者らにより単離された配列番号：１
から１０２、１０４、１０５、１０７から１１６に記載
の塩基配列からなるDNAは、完全長のDNAではないと考え
られるが、当業者であれば、常套手段により、これらDN
Aに対応する完全長DNAを単離することが可能である。例
えば、通常のcDNA libraryのハイブリダイゼーションス
クリーニング、およびRACE法を用いることにより配列番
号：１から１０２、１０４、１０５、１０７から１１６
に記載のDNA配列の全長配列を得ることが可能である。

【００１２】さらに、当業者であれば、後述するような
公知の宿主−ベクター系を利用して、単離された完全長
DNAによりコードされる完全長タンパク質を得ることが
可能である。従って、本発明には、配列番号：１から１
０２、１０４、１０５、１０７から１１６に記載の塩基
配列を含む完全長DNA、および該完全長DNAによりコード
される完全長タンパク質が含まれる。

【００１３】本発明はまた、配列番号：１から１０２、
１０４、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の
塩基配列からなるDNAによりコードされるアミノ酸配列
を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質を包含する。この
ような蛋白質には、例えば、上記ニワトリまたはヒト由
来の蛋白質の変異体、ニワトリ以外の生物のホモログ等
が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となる
蛋白質が平滑筋細胞の分化維持に関与する機能を有する
ことを指す。目的の蛋白質が平滑筋細胞の分化維持に関
与する機能を有するか否かは、以下の手法により判定す
ることができる。

【００１４】例えば、FCSや抗IGF-I抗体を添加して脱分
化状態にした平滑筋細胞に、動物発現ベクターに組み込
んだ目的の遺伝子を導入し、細胞の形態的な特徴、およ
び細胞の収縮能など(Tanpakushitsu Kakusan Koso 40;
1-15 (1995))の分化特異的な細胞の特徴を維持できるか
どうかによって判断することができる。もしくは、分化
の特異的な発現を指標にすることも可能であり、分化型
特異的に発現するカルポニン遺伝子や分化特異的にスプ
ライシングを受けるカルデスモン遺伝子(Tanpakushitsu
Kakusan Koso 40; 1-15 (1995), J. Biol Chem 272; 1
5396 (1997))の発現をRT-PCRなどにより解析すること
で、分化維持を司る機能の有無を確認することができ
る。具体的には、平滑筋細胞の分化に特異的に発現する
遺伝子、例えば、アルファ１インテグリン（J. Biol Ch
em 272; 26643 (1997)）、カルデスモン(J Biol Chem 2
70: 23661 (1995))、アルファーSMアクチン(Exp Cell R
es 247, 279(1999))などの遺伝子を制御するプロモータ
ー領域を、ルシフェラーゼ遺伝子、ベータ・ガラクトシ
ダーゼ遺伝子などの適当な遺伝子の上流につないだレポ
ーター遺伝子を使って分化維持に特異的な遺伝子の発現
の制御に関与していることを確認すればよい。

【００１５】また、目的のタンパク質がこのような機能
を有するか否かは、平滑筋細胞の分化型のフェノタイプ
における特異的な発現を指標として推定することもでき
る。

【００１６】ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製
するための、当業者によく知られた方法としては、蛋白
質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業
者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,
T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, a
nd Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、
Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 94
41-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enz
ymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad
Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzym
ol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明者らにより
単離されたDNAによってコードされるアミノ酸配列を含
む蛋白質のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、
該蛋白質と機能的に同等な蛋白質を調製することができ
る。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じう
る。このように、配列番号：１から１０２、１０４、１
０５、１０７から１１６のいずれかに記載のDNAによっ
てコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質のアミノ酸配
列において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ
酸配列を有し、該蛋白質と機能的に同等な蛋白質もまた
本発明の蛋白質に含まれる。このような変異体におけ
る、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であ
り、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましく
は10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）であると
考えられる。

【００１７】変異するアミノ酸残基においては、アミノ
酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異され
ることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質として
は、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、
T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、
P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫
黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸
及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、芳香族含
有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることが
できる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表
す）。

【００１８】あるアミノ酸配列に対する１又は複数個の
アミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸によ
る置換により修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質が
その生物学的活性を維持することはすでに知られている
（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M.Nu
cleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang,
A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFar
land, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982)
79, 6409-6413 ）。

【００１９】本発明のタンパク質のアミノ酸配列に複数
個のアミノ酸残基が付加された蛋白質には、これら蛋白
質を含む融合蛋白質が含まれる。融合蛋白質は、これら
蛋白質と他のペプチド又は蛋白質とが融合したものであ
り、本発明に含まれる。融合蛋白質を作製する方法は、
本発明の蛋白質（例えば、配列番号：１から１０２、１
０４、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載のDN
Aによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質）を
コードするDNAと他のペプチド又は蛋白質をコードするD
NAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベク
ターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知
の手法を用いることができる。本発明の蛋白質との融合
に付される他のペプチド又は蛋白質としては、特に限定
されない。

【００２０】本発明の蛋白質との融合に付される他のペ
プチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al.,
BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒ
スチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエ
ンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p
18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag 、E-tag 、SV40T抗原の
断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C
の断片等の公知のペプチドを使用することができる。ま
た、本発明の蛋白質との融合に付される他の蛋白質とし
ては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラ
ーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリ
ン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース
結合蛋白質）等が挙げられる。市販されているこれらペ
プチドまたは蛋白質をコードするDNAを本発明の蛋白質
をコードするDNAと融合させ、これにより調製された融
合DNAを発現させることにより、融合蛋白質を調製する
ことができる。

【００２１】また、ある蛋白質と機能的に同等な蛋白質
を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハ
イブリダイゼーション技術（Sambrook,J et al., Molec
ularCloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor
Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。即
ち、当業者であれば、ニワトリまたはヒト由来の本発明
の蛋白質をコードするDNA配列（配列番号：１から１０
２、１０４、１０５、１０７から１１６）もしくはその
一部を基に、これと相同性の高いDNAを単離して、該DNA
からニワトリまたはヒト由来の本発明の蛋白質と機能的
に同等な蛋白質を単離することも通常行いうることであ
る。

【００２２】本発明には、ニワトリ由来の本発明の蛋白
質をコードするDNAとハイブリダイズするDNAがコード
し、平滑筋分化維持蛋白質と機能的に同等な蛋白質が含
まれる。このような蛋白質としては、例えば、マウスお
よび他の哺乳動物のホモログまたはオルソログ（例え
ば、ヒト、ラット、ウサギ、ウシなどがコードする蛋白
質）が挙げられる。

【００２３】ニワトリまたはヒト由来の本発明の蛋白質
と機能的に同等な蛋白質をコードするDNAを単離するた
めのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば
適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの
条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙
げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダ
イゼーション後の洗浄において、例えば42℃、5×SSC、
0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、2×SSC 、0.1
％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーシ
ョンの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げ
られる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、
0.1×SSC及び0.1％SDSの条件である。一般的に低い温
度、高塩濃度の条件から温度を上げていき、さらに塩濃
度を下げることで高い相同性を有するDNAが効率的に得
られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーショ
ンのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や
塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれ
ら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシー
を実現することが可能である。

【００２４】また、ハイブリダイゼーションにかえて、
ニワトリまたはヒト由来の本発明の蛋白質をコードする
DNA（配列番号：１から１０２、１０４、１０５、１０
７から１１６）の配列情報を基に合成したプライマーを
用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法を利用して単離することも可能である。

【００２５】例えば、本発明のニワトリ由来の遺伝子
（配列番号：１から７９）からヒトのオルソログ(ortho
log)は以下のような方法によって単離することができ
る。

【００２６】ニワトリの遺伝子を含むPCR産物をプロー
ブとして、通常のコロニーハイブリダイゼーションやプ
ラークハイブリダイゼーションによってTm値を5℃から1
0℃低くすることにより、ハイブリダーゼーションの条
件を緩和することで、ニワトリの遺伝子に対して相同性
のある遺伝子を単離することができる。さらに、ニワト
リの遺伝子を含むオリゴヌクレオチドをプローブとして
通常のコロニーハイブリダイゼーションやプラークハイ
ブリダイゼーションによってスクリーニングすることも
可能である。これらの方法については、Current Protoc
ols in Molecular Biology UNIT 6.4.1 "Using Synthet
ic Oligonucleotide probes"に記された方法に従って行
うことができる。既知の遺伝子のニワトリとヒトとの間
での遺伝子のホモロジーの比較の結果、ニワトリとヒト
との間でよく保存されているハウスキーピング遺伝子に
ついては90％以上の同一性を有するが、機能的に重要な
遺伝子については70％から80数％の同一性を有してい
る。

【００２７】例えば、ニワトリの遺伝子とヒトの遺伝子
の間のホモロジーについては、J. Biol. Chem. 271, 11
920 (1995)においてクレアチニン・キナーゼ遺伝子の比
較があり、核酸で78％、アミノ酸で82.5％の相同性が報
告されている。また、Gene 196, 201 (1997)ではベータ
・カテニン遺伝子は核酸で85％の相同性を、Eur. J.Bio
chem. 218, 117 (1993) ではSPARC/osteonectin遺伝子
は85%の相同性を有することが報告されている。さら
に、発明者らが公的なデーターベースから解析した結
果、ベータ・チューブリンとは90％、GAPDH（グリセル
アルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ）とは84％、リボ
ゾーマルプロテインＬ22とは82％、IGFレセプターとは7
9％の相同性を示した。

【００２８】このことから平滑筋の形質に重要な遺伝子
についてはハイブリダイゼーションの温度を下げること
によって相同性のあるヒト遺伝子をクローニングするこ
とができるものと予想される。使用するヒトcDNAライブ
ラリーとしては、ヒトの平滑筋細胞に富む組織のcDNAラ
イブラリーを使用するのが好ましい。たとえば、大動脈
(aorta)、胃(stomach)、前立腺(prostate)、小腸(small
intestine)などのヒトcDNAライブラリーが好ましい
が、他の組織のcDNAライブラリーであっても発現してい
ればクローニングすることが可能である。また、ニワト
リの遺伝子の配列からPCRに最適な配列を、例えばOLIGO
5.0, OLIGO^TM primer analysis software(宝酒造
〔株〕)のようなプライマー配列の検索ソフトを使用し
て選びだし、ニワトリの遺伝子のプライマーからヒトの
遺伝子をクローニングすることもPCR のアニーリングの
温度を下げることによって可能となる。さらには、公的
な核酸データーベース（GenBank、DDBJ、EMBL、dbEST、
Unigene等）に対してホモロジー検索を行い、ニワトリ
の遺伝子に相同性のあるヒトの遺伝子配列の中からPCR
に最適な配列を、例えばOLIGO5.0のようなプライマー配
列の検索ソフトを使用して選択し、これを用いて5'RACE
(Rapid amplification of cDNA end)法や3'RACE法によ
ってヒトの遺伝子をクローニングすることも可能であ
る。ホモロジー検索は、例えばGCG Sequence Analysis
Software Package (Genetic Computer Group, Oxford M
olecular Group, Inc)のBLAST、またはFASTA、WU-BLAST
(Altschul, SF, and W Gish. Local alignment statist
ics. ed. R. Doolittle. Methods in Enzymology 266:4
60 (1996))などのプログラムによって行うことができ
る。RACE法に用いるcDNAは、例えばLife Technologies,
Inc.またはClontech社から購入できるRACE cDNAの合成
用のキットを用いれば、容易に作製することができる。
また、Life Technologies, Inc.やClontech社よりRACE
法用のヒトcDNAも市販されているのでそれらのマニュア
ルに従って操作を行えば、容易にニワトリの平滑筋細胞
遺伝子に相当するヒトの遺伝子をクローニングすること
ができる。あるいは、公的なヒトの遺伝子の核酸データ
ーベースをBLASTまたはFASTAによりホモロジー検索を行
い、ニワトリ平滑筋の遺伝子に相当する配列のうちPCR
に最適な配列を選んだのち、予め作製したヒトcDNAのプ
ールをテンプレートとしてPCR反応を行い、該当するバ
ンドが検出されたヒトcDNAプールをさらにコロニーハイ
ブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼーション
法によりスクリーニングして該当するヒト遺伝子を選び
だすことができる。このときのプローブとしてはこれら
のプライマーを用いて増幅されたヒトの遺伝子の断片を
使用することが好ましいが、ニワトリの遺伝子由来の断
片を使用しても選びだすことは可能である。もしくは、
予めヒトcDNAライブラリーを形質転換した大腸菌を適当
な大きさの大腸菌が増殖できるような寒天培地の上にプ
レートして、37℃で１晩おいたものから384ウェルや96
ウェルのプレートに液体培地を分注しておいたものにコ
ロニーを拾いあげて植菌する。次いで1晩37℃で培養し
たものをマスタープレートとして用意し、さらにBioRob
otics社のBioGridderなどのスポッターあるいはグリッ
ダーと呼ばれる機械、または自分の手でナイロンメンブ
レン（アマーシャム社製のHybond N+など）にスポット
したものを用意しておき、各プレートごとあるいは各列
や各段ごとのクローンに相当する大腸菌からDNAを抽出
し、これを先述の適当に選択したプライマーを用いてPC
R反応を行い、該当するバンドが検出されたヒトcDNAプ
ールをさらにコロニーハイブリダイゼーションやプラー
クハイブリダイゼーション法によりスクリーニングして
該当するヒト遺伝子を選びだすことも可能である。

【００２９】これらハイブリダイゼーション技術や遺伝
子増幅技術により単離されるDNAがコードする蛋白質
は、通常、ニワトリ由来の本発明の蛋白質（配列番号：
１から７９のいずれかに記載のDNAによってコードされ
るアミノ酸配列を含む蛋白質）とアミノ酸配列において
高い相同性を有する。本発明の蛋白質には、ニワトリ由
来の本発明の蛋白質と機能的に同等であり、かつ該蛋白
質のアミノ酸配列と高い相同性を有する蛋白質も含まれ
る。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、
少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同
一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ま
しくは95％以上の同一性を指す。蛋白質の相同性を決定
するには、文献（Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Pr
oc. Natl.Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730）に記載
のアルゴリズムにしたがえばよい。

【００３０】本発明の蛋白質は、後述するそれを産生す
る細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、
分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得
る。しかしながら、得られた蛋白質が、ニワトリまたは
ヒト由来の本発明の蛋白質（配列番号：１から１０２、
１０４、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の
DNAによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質）
と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。例
えば、本発明の蛋白質を原核細胞、例えば大腸菌で発現
させた場合、本来の蛋白質のアミノ酸配列のN末端にメ
チオニン残基が付加される。本発明の蛋白質はこのよう
な蛋白質も包含する。

【００３１】本発明の蛋白質は、当業者に公知の方法に
より、組み換え蛋白質として、また天然の蛋白質として
調製することが可能である。組み換え蛋白質であれば、
本発明の蛋白質をコードするDNA(例えば、配列番号：１
から１０２、１０４、１０５、１０７から１１６のいず
れかに記載の塩基配列を有するDNA)を、適当な発現ベク
ターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た
形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆
相、ゲルろ過などのクロマトグラフィー、あるいは本発
明の蛋白質に対する抗体をカラムに固定したアフィニテ
ィークロマトグラフィーにかけることにより、または、
さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精
製し、調製することが可能である。

【００３２】また、本発明の蛋白質をグルタチオン S-
トランスフェラーゼ蛋白質との融合蛋白質として、ある
いはヒスチジンを複数付加させた組み換え蛋白質として
宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現さ
せた場合には、発現させた組み換え蛋白質はグルタチオ
ンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製すること
ができる。融合蛋白質の精製後、必要に応じて融合蛋白
質のうち、目的の蛋白質以外の領域を、トロンビンまた
はファクターXaなどにより切断し、除去することも可能
である。

【００３３】天然の蛋白質であれば、当業者に周知の方
法、例えば、本発明の蛋白質を発現している組織や細胞
の抽出物に対し、後述する本発明の蛋白質に結合する抗
体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製す
ることにより単離することができる。抗体はポリクロー
ナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよ
い。

【００３４】本発明は、また、本発明の蛋白質の部分ペ
プチドを包含する。本発明の部分ペプチドは、少なくと
も７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに
好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該
部分ペプチドは、例えば、本発明の蛋白質に対する抗体
の作製、本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニ
ングや、本発明の蛋白質の促進剤や阻害剤のスクリーニ
ングに利用し得る。また、本発明の蛋白質のアンタゴニ
ストや競合阻害剤になり得る。本発明の部分ペプチド
は、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるい
は本発明の蛋白質を適切なペプチダーゼで切断すること
によって製造することができる。ペプチドの合成は、例
えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよ
い。

【００３５】本発明の蛋白質をコードするDNAは、上述
したような本発明の蛋白質のin vivoやin vitroにおけ
る生産に利用される他、例えば、本発明の蛋白質をコー
ドする遺伝子の異常に起因する疾患や本発明の蛋白質に
より治療可能な疾患の遺伝子治療などへの応用も考えら
れる。本発明のDNAは、本発明の蛋白質をコードしうる
ものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合
成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成D
NAであるかなどを問わない。また、本発明の蛋白質をコ
ードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配
列を有するDNAが含まれる。

【００３６】本発明のDNAは、当業者に公知の方法によ
り調製することができる。例えば、本発明の蛋白質を発
現している細胞よりcDNAライブラリーを作製し、本発明
のDNAの配列（例えば、配列番号：１から１０２、１０
４、１０５、１０７から１１６）の一部をプローブにし
てハイブリダイゼーションを行うことにより調製でき
る。cDNAライブラリーは、例えば、文献（Sambrook, J.
et al., Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Lab
oratory Press (1989)）に記載の方法により調製しても
よいし、市販のDNAライブラリーを用いてもよい。ま
た、本発明の蛋白質を発現している細胞よりRNAを調製
し、逆転写酵素によりcDNAを合成した後、本発明のDNA
の配列（例えば、配列番号：１から１０２、１０４、１
０５、１０７から１１６）に基づいてオリゴDNAを合成
し、これをプライマーとして用いてPCR反応を行い、本
発明の蛋白質をコードするcDNAを増幅させることにより
調製することも可能である。

【００３７】また、得られたcDNAの塩基配列を決定する
ことにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本
発明の蛋白質のアミノ酸配列を得ることができる。ま
た、得られたcDNAをプローブとしてゲノムDNAライブラ
リーをスクリーニングすることにより、ゲノムDNAを単
離することができる。

【００３８】具体的には、次のようにすればよい。ま
ず、本発明の蛋白質を発現する細胞、組織、臓器(例え
ば、ニワトリ砂嚢平滑筋細胞、砂嚢および大動脈）か
ら、mRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例え
ば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Bio
chemistry (1979) 18, 5294-5299)、AGPC法 (Chomczyns
ki, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. (1987) 162,
156-159) 等により全RNAを調製し、mRNA Purification
Kit (Pharmacia) 等を使用して全RNAからmRNAを精製す
る。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmac
ia) を用いることによりmRNAを直接調製することもでき
る。

【００３９】得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNA
を合成する。cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcripta
se First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業)等
を用いて行うこともできる。また、適当なプライマー等
を用いて、5'-Ampli FINDERRACE Kit (Clontech製)およ
びポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction
; PCR)を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Pr
oc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. (1988) 85, 8998-9002 ;
Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17,
2919-2932) に従い、cDNAの合成および増幅を行うこと
ができる。

【００４０】得られたPCR産物から目的とするDNA断片を
調製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組
換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを
選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とする
DNAの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌ
クレオチドチェインターミネーション法により確認する
ことができる。

【００４１】また、本発明のDNAにおいては、発現に使
用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率
の高い塩基配列を設計することができる（Grantham, R.
etal., Nucleic Acids Research (1981) 9, r43-74
）。また、本発明のDNAは、市販のキットや公知の方法
によって改変することができる。改変としては、例え
ば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適
当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コ
ドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTA
G）の挿入等が挙げられる。

【００４２】本発明のDNAはまた、配列番号：１から１
０２、１０４、１０５、１０７から１１６のいずれかに
示す塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするDNAであ
り、且つ上記本発明の蛋白質と機能的に同等な蛋白質を
コードするDNAを含む。ハイブリダイゼーションにおけ
る条件は当業者であれば適宜選択することができるが、
具体的には上記した条件を用いることができる。これら
の条件において、温度を上げる程に高い相同性を有する
DNAを得ることができる。上記のハイブリダイズするDNA
は、好ましくは天然由来のDNA、例えばcDNA又は染色体D
NAである。

【００４３】本発明は、また、本発明のDNAが挿入され
たベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿
主細胞内において本発明のDNAを保持したり、本発明の
蛋白質を発現させるために有用である。

【００４４】ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主
とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、JM109、D
H5α、HB101、XL1Blue）などで大量に増幅させ大量調製
するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をも
ち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例え
ば、何らかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、
カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別でき
るような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。
ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクタ
ー、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが挙げられ
る。また、cDNAのサブクローニング、切り出しを目的と
した場合、上記ベクターの他に、例えば、pGEM-T、pDIR
ECT、pT7などが挙げられる。本発明の蛋白質を生産する
目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現
ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例え
ば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大
腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を
JM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大腸菌とした場
合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロ
モーター、例えば、lacZプロモーター（Wardら, Nature
(1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-242
7）、araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 24
0, 1041-1043 ）、またはT7プロモーターなどを持って
いることが不可欠である。このようなベクターとして
は、上記ベクターの他にpGEX-5X-1（ファルマシア社
製）、「QIAexpress system」（キアゲン社製）、pEGF
P、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを
発現しているBL21が好ましい)などが挙げられる。

【００４５】また、ベクターには、ポリペプチド分泌の
ためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌
のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズム
に産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei, S. P. et
al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379）を使用すればよ
い。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシ
ウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことが
できる。

【００４６】大腸菌以外にも、例えば、本発明の蛋白質
を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発
現ベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロゲン社製）
や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p532
2)、pEF、pCDM8 ）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例
えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」
（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベク
ター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベ
クター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイ
ルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由
来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Ki
t」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草
菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙
げられる。

【００４７】CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細
胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させる
ために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター
（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプ
ロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nuclei
c Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターな
どを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換
を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシ
ン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝
子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有す
るベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、p
BK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。

【００４８】さらに、遺伝子を安定的に発現させ、か
つ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場
合には、核酸合成経路を欠損したCHO細胞にそれを相補
するDHFR遺伝子を有するベクター（例えば、pCHOIな
ど）を導入し、メトトレキセート（MTX）により増幅さ
せる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目
的とする場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色
体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点を持つベク
ター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複
製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノ
ウイルス、ウシパピローマウィルス（BPV）等の由来の
ものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝
子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーと
して、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（APH）遺
伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogp
t）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等を
含むことができる。

【００４９】一方、動物の生体内で本発明のDNAを発現
させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに
組み込み、例えば、レトロウイルス法、リポソーム法、
カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などによ
り生体内に導入する方法などが挙げられる。これによ
り、本発明の遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝
子治療を行うことが可能である。用いられるベクターと
しては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばpAde
xlcw）やレトロウイルスベクター(例えばpZIPneo）など
が挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの
本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法
に従って行うことが可能である（MolecularCloning ,5.
61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、
in vivo法であってもよい。

【００５０】また、本発明は、本発明のDNAまたはベク
ターが導入された形質転換体を提供する。本発明のベク
ターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例
えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能
である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明の蛋白質
の製造や発現のための産生系として使用することができ
る。蛋白質製造のための産生系は、in vitroおよびin v
ivo の産生系がある。in vitroの産生系としては、真核
細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙
げられる。

【００５１】真核細胞を使用する場合、例えば、動物細
胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。
動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO（J. Exp.
Med. (1995) 108, 945）、COS、3T3、ミエローマ、BHK
（baby hamster kidney）、HeLa、Vero、両生類細胞、
例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al.,Na
ture (1981) 291, 358-340）、あるいは昆虫細胞、例え
ば、Sf9、Sf21、Tn5が知られている。CHO細胞として
は、特に、DHFR遺伝子を欠損したCHO細胞であるdhfr-CH
O（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-422
0）やCHO K-1（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 6
0, 1275）を好適に使用することができる。動物細胞に
おいて、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が
好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リ
ン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニック
リボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用
いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクショ
ンなどの方法で行うことが可能である。

【００５２】植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・
タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生
産系として知られており、これをカルス培養すればよ
い。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス
（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例え
ば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られて
いる。

【００５３】原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用い
る産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. col
i）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その
他、枯草菌が知られている。

【００５４】これらの細胞を目的とするDNAにより形質
転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養すること
により蛋白質が得られる。培養は、公知の方法に従い行
うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例
えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することがで
きる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用
することもできるし、無血清培養してもよい。培養時の
pHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30
〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交
換、通気、攪拌を加える。

【００５５】一方、in vivoで蛋白質を産生させる系と
しては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用す
る産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的と
するDNAを導入し、動物又は植物の体内で蛋白質を産生
させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これら
の動物、植物を包含する。

【００５６】動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を
用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブ
タ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Vick
i Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 199
3）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニ
ック動物を用いることができる。

【００５７】例えば、目的とするDNAを、ヤギβカゼイ
ンのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードす
る遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この
融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚
を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれる
トランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁か
ら、目的の蛋白質を得ることができる。トランスジェニ
ックヤギから産生される蛋白質を含む乳汁量を増加させ
るために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使
用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology
(1994) 12, 699-702）。

【００５８】また、昆虫としては、例えばカイコを用い
ることができる。カイコを用いる場合、目的の蛋白質を
コードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに
感染させることにより、このカイコの体液から目的の蛋
白質を得ることができる（Susumu, M. et al., Nature
(1985) 315, 592-594）。

【００５９】さらに、植物を使用する場合、例えばタバ
コを用いることができる。タバコを用いる場合、目的と
する蛋白質をコードするDNAを植物発現用ベクター、例
えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアを
タバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana ta
bacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプ
チドを得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eu
r. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。

【００６０】これにより得られた本発明の蛋白質は、宿
主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的
に純粋で均一な蛋白質として精製することができる。蛋
白質の分離、精製は、通常の蛋白質の精製で使用されて
いる分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定される
ものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フ
ィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸
留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合
わせれば蛋白質を分離、精製することができる。

【００６１】クロマトグラフィーとしては、例えばアフ
ィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げ
られる（Strategies for Protein Purification and Ch
aracterization: A Laboratory Course Manual. Ed Dan
iel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液
相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロ
マトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、
これらの精製方法を用い、高度に精製された蛋白質も包
含する。

【００６２】なお、蛋白質を精製前又は精製後に適当な
蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を
加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋
白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリ
プシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナー
ゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。

【００６３】本発明は、また、本発明の蛋白質と結合す
る抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限
はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体
も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明の蛋
白質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクロ
ーナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体
や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。

【００６４】抗体取得の感作抗原として使用される本発
明の蛋白質は、その由来となる動物種に制限されないが
哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来の蛋白質
が好ましく、特にヒト由来の蛋白質が好ましい。ヒト由
来の蛋白質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はア
ミノ酸配列を用いて得ることができる。

【００６５】本発明において、感作抗原として使用され
る蛋白質は、完全な蛋白質であってもよいし、また、蛋
白質の部分ペプチドであってもよい。蛋白質の部分ペプ
チドとしては、例えば、蛋白質のアミノ基（N）末端断
片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書
で述べる「抗体」とは蛋白質の全長又は断片に反応する
抗体を意味する。

【００６６】本発明の蛋白質又はその断片をコードする
遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターに
より本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主
細胞内外から目的の蛋白質又はその断片を公知の方法で
得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、蛋
白質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合
成した本発明の蛋白質を感作抗原として使用してもよ
い。短いペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニ
ン、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミンなどのキャリ
ア蛋白質と適宜結合させて抗原とすることが好ましい。

【００６７】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用され
る。

【００６８】げっ歯目の動物としては、例えば、マウ
ス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動
物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動
物としては、例えば、サルが使用される。サルとして
は、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイ
ザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用
される。

【００６９】感作抗原を動物に免疫するには、公知の方
法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗
原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的に
は、感作抗原をPBS(Phosphate-Buffered Saline)や生理
食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望に
より通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジ
ュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。
さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量
混合した感作抗原を、4〜21日毎に数回投与することが
好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用す
ることができる。このように免疫し、血清中に所望の抗
体レベルが上昇するのを常法により確認する。

【００７０】ここで、本発明の蛋白質に対するポリクロ
ーナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上
昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血
液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分
離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル
抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血
清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離し
て、これを使用してもよい。例えば、本発明の蛋白質を
カップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本
発明の蛋白質のみを認識する画分を得て、さらにこの画
分をプロテインAあるいはプロテインGカラムを利用して
精製することにより、免疫グロブリンGあるいはMを調製
することができる。

【００７１】モノクローナル抗体を得るには、上記抗原
を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇
するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出
し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用さ
れる好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられ
る。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、
好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましく
は、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミ
エローマ細胞が挙げられる。

【００７２】前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合
は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方
法(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol.
(1981) 73, 3-46)等に準じて行うことができる。

【００７３】細胞融合により得られたハイブリドーマ
は、通常の選択培養液、例えば、HAT培養液（ヒポキサ
ンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）
で培養することにより選択される。当該HAT培養液での
培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合
細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間
継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目
的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニン
グおよびクローニングを行う。

【００７４】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEB
ウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroで蛋白質、
蛋白質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球
をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例え
ばU266と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望の
ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる
（特開昭63-17688号公報）。

【００７５】次いで、得られたハイブリドーマをマウス
腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られた
モノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン
A、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフ
ィー、本発明の蛋白質をカップリングしたアフィニティ
ーカラムなどにより精製することで調製することが可能
である。本発明の抗体は、本発明の蛋白質の精製、検出
に用いられる他、本発明の蛋白質のアゴニストやアンタ
ゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明の蛋白
質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられ
る。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で
使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗
体やヒト型抗体が好ましい。

【００７６】例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを
有するトランスジェニック動物に抗原となる蛋白質、蛋
白質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を
取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリド
ーマを用いて蛋白質に対するヒト抗体を取得することが
できる（国際公開番号WO92-03918、WO93-2227、WO94-02
602、WO94-25585、WO96-33735およびWO96-34096参
照）。

【００７７】ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以
外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺
伝子(oncogene)により不死化させた細胞を用いてもよ
い。

【００７８】このように得られたモノクローナル抗体は
また、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗
体として得ることができる（例えば、Borrebaeck, C.
A. K.and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONOCLONAL AN
TIBODIES, Published in theUnited Kingdom by MACMIL
LAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照)。組換え型抗体は、そ
れをコードするDNAをハイブリドーマ又は抗体を産生す
る感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当
なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させ
る。本発明は、この組換え型抗体を包含する。

【００７９】さらに、本発明の抗体は、本発明の蛋白質
に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよ
い。例えば、抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fv又は
H鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチ
ェインFv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられ
る。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプ
シンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗
体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクタ
ーに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例え
ば、Co, M. S. etal., J. Immunol. (1994) 152, 2968-
2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H.,Methods Enzym
ol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerr
a, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamo
yi, E., Methods Enzymol. (1986)121, 652-663 ; Rous
seaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663
-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biote
chnol. (1991) 9, 132-137参照)。

【００８０】抗体修飾物として、ポリエチレングリコー
ル（PEG）等の各種分子と結合した抗体を使用すること
もできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も
包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られ
た抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることがで
きる。これらの方法はこの分野において既に確立されて
いる。

【００８１】また、本発明の抗体は、公知の技術を使用
して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領
域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のCDR（相補
性決定領域）とヒト抗体由来のFR（フレームワーク領
域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ること
ができる。

【００８２】前記のように得られた抗体は、均一にまで
精製することができる。本発明で使用される抗体の分
離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方
法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマト
グラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ
ー、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせ
れば、抗体を分離、精製することができる(Antibodies
: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) が、これらに
限定されるものではない。上記で得られた抗体の濃度測
定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-
linked immunosorbent assay; ELISA)等により行うこと
ができる。

【００８３】アフィニティークロマトグラフィーに用い
るカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧ
カラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用
いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F.
(Pharmacia)等が挙げられる。

【００８４】アフィニティークロマトグラフィー以外の
クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロ
マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾
過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー
等が挙げられる(Strategies for Protein Purification
and Characterization : A Laboratory Course Manua
l. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィ
ーはHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行
うことができる。

【００８５】また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定
する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫
吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELIS
A）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）
あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ELISAを用
いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明
の蛋白質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例え
ば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵
素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗
体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベ
ーションし、次いで洗浄した後、p-ニトロフェニル燐酸
などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結
合活性を評価することができる。蛋白質として蛋白質の
断片、例えばそのC末端からなる断片を使用してもよ
い。本発明の抗体の活性評価には、BIAcore(Pharmacia
製)を使用することができる。

【００８６】これらの手法を用いることにより、本発明
の抗体と試料中に含まれる本発明の蛋白質が含まれると
予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該蛋白質との
免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明の
蛋白質の検出又は測定方法を実施することができる。本
発明の蛋白質の検出又は測定方法は、蛋白質を特異的に
検出又は測定することができるため、蛋白質を用いた種
々の実験等に有用である。

【００８７】本発明はまた、本発明の蛋白質をコードす
るDNA（例えば、配列番号：１から１０２、１０４、１
０５、１０７から１１６）またはその相補鎖に相補的な
少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提
供する。

【００８８】ここで「相補鎖」とは、A:T（ただしRNAの
場合はU）、G:Cの塩基対からなる2本鎖核酸の一方の鎖
に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少な
くとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配
列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは
少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは
95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。相同性
を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したも
のを使用すればよい。

【００８９】このような核酸には、本発明の蛋白質をコ
ードするDNAの検出や増幅に用いるプローブやプライマ
ー、該DNAの発現を検出するためのプローブやプライマ
ー、本発明の蛋白質の発現を制御するためのヌクレオチ
ド又はヌクレオチド誘導体（例えば、アンチセンスオリ
ゴヌクレオチドやリボザイム、またはこれらをコードす
るDNA等）が含まれる。また、このような核酸は、DNAチ
ップの作製に利用することもできる。

【００９０】プライマーとして用いる場合、3'側の領域
は相補的とし、5'側には制限酵素認識配列やタグなどを
付加することができる。

【００９１】アンチセンスオリゴヌクレオチドとして
は、例えば、配列番号：１から１０２、１０４、１０
５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩基配列中の
いずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが含まれる。このアンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、好ましくは配列番号：１から１０２、１
０４、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩
基配列中の連続する少なくとも15個以上のヌクレオチド
に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さら
に好ましくは、連続する少なくとも15個以上のヌクレオ
チドが翻訳開始コドンを含むアンチセンスオリゴヌクレ
オチドである。

【００９２】アンチセンスオリゴヌクレオチドとして
は、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。
修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチル
ホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾
体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート
修飾体等が挙げられる。

【００９３】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNA
又はmRNAの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応す
るヌクレオチドが全て相補配列であるもののみならず、
DNAまたはmRNAとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１
から１０２、１０４、１０５、１０７から１１６のいず
れかに示される塩基配列に特異的にハイブリダイズでき
る限り、1又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存
在しているものも含まれる。

【００９４】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、本発明の蛋白質の産生細胞に作用して、該蛋
白質をコードするDNA 又はmRNAに結合することにより、
その転写又は翻訳を阻害したり、mRNA の分解を促進し
たりして、本発明の蛋白質の発現を抑制することによ
り、結果的に本発明の蛋白質の作用を抑制する効果を有
する。

【００９５】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和し
て塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。

【００９６】また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、
溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠
剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル
剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とす
ることができる。これらは常法にしたがって調製するこ
とができる。

【００９７】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投
与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に
適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチ
センス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソ
ーム、ポリ-L-リジン、リピッド、コレステロール、リ
ポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。

【００９８】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好
ましい量を用いることができる。例えば、一般的には0.
1〜100mg/kg、好ましくは0.1〜10mg/kgの範囲で投与す
ることができると考えられる。

【００９９】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
は本発明の蛋白質の発現を阻害し、従って、本発明の蛋
白質の生物学的活性を抑制することにおいて有用であ
る。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを
含有する発現阻害剤は、本発明の蛋白質の生物学的活性
を抑制することが可能である点で有用である。

【０１００】本発明の蛋白質は、これに結合する化合物
のスクリーニングに有用である。すなわち、本発明の蛋
白質と、該蛋白質に結合する化合物を含むと予想される
被検試料とを接触せしめ、そして本発明の蛋白質に結合
する活性を有する化合物を選択する、ことからなる本発
明の蛋白質に結合する化合物をスクリーニングする方法
において使用される。

【０１０１】スクリーニングに用いられる本発明の蛋白
質は組換え蛋白質であっても、天然由来の蛋白質であっ
てもよい。また部分ペプチドであってもよい。また細胞
表面に発現させた形態、または膜画分としての形態であ
ってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例え
ば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海
洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製蛋白
質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合
物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本
発明の蛋白質は、例えば、精製した蛋白質として、可溶
型蛋白質として、担体に結合させた形態として、他の蛋
白質との融合蛋白質として、細胞膜上に発現させた形態
として、膜画分として被検試料に接触させることができ
る。

【０１０２】本発明の蛋白質を用いて、例えば該蛋白質
に結合する蛋白質をスクリーニングする方法としては、
当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。
このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法によ
り行うことができる。具体的には、以下のように行うこ
とができる。本発明の蛋白質をコードする遺伝子を、pS
V2neo, pcDNA I, pCD8などの外来遺伝子発現用のベクタ
ーに挿入することにより動物細胞などで当該遺伝子を発
現させる。発現に用いるプロモーターとしてはSV40 ear
ly promoter (Rigby In Williamson (ed.), Genetic En
gineering, Vol.3. Academic Press, London, p.83-141
(1982)), EF-1 α promoter (Kimら Gene 91, p.217-22
3 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.1
93-200(1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in
Enzymology 152, p.684-704 (1987), SR α promoter
(Takebe et al. Mol. Cell. Biol. 8, p.466 (1988)),C
MV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc.
Natl. Acad. Sci. USA84, p.3365-3369 (1987)), SV40
late promoter (Gheysen and Fiers J. Mol.Appl. Gen
et. 1, p.385-394 (1982)), Adenovirus late promoter
(Kaufman etal. Mol. Cell. Biol. 9, p.946 (1989)),
HSV TK promoter 等の一般的に使用できるプロモータ
ーであれば何を用いてもよい。

【０１０３】動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺
伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法
(Chu, G. et al. Nucl. Acid Res. 15, 1311-1326 (19
87))、リン酸カルシウム法 (Chen, C and Okayama, H.
Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987))、DEAEデキス
トラン法 (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 1
2, 5707-5717 (1984); Sussman, D. J. and Milman, G.
Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985))、リポフェク
チン法 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lam
b, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); R
abindran, S. K.et al. Science 259, 230-234 (1993))
等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。

【０１０４】特異性の明らかとなっているモノクローナ
ル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明の蛋白質のN
末またはC末に導入することにより、モノクローナル抗
体の認識部位を有する融合蛋白質として本発明の蛋白質
を発現させることができる。用いるエピトープ−抗体系
としては市販されているものを利用することができる
（実験医学 13, 85-90 (1995))。マルチクローニングサ
イトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合
蛋白質、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、緑色蛍光
蛋白質（GFP）などとの融合蛋白質を発現することがで
きるベクターが市販されている。

【０１０５】融合蛋白質にすることにより本発明の蛋白
質の性質をできるだけ変化させないようにするために数
個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分
のみを導入して、融合蛋白質を調製する方法も報告され
ている。例えば、ポリヒスチジン（His-tag）、インフ
ルエンザ凝集素HA、ヒトc-myc、FLAG、Vesicular stoma
titis ウイルス糖蛋白質（VSV-GP）、T7 gene10蛋白質
（T7-tag）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖蛋白質（HSV-
tag）、E-tag（モノクローナルファージ上のエピトー
プ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル
抗体を、本発明の蛋白質に結合する蛋白質のスクリーニ
ングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実
験医学 13, 85-90 (1995))。

【０１０６】免疫沈降においては、これらの抗体を、適
当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加す
ることにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体
は本発明の蛋白質、それと結合能を有する蛋白質、およ
び抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる
以外に、本発明の蛋白質に対する抗体を利用して免疫沈
降を行うことも可能である。本発明の蛋白質に対する抗
体は、例えば、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を適
当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現さ
せ、発現させた蛋白質を精製し、これをウサギやマウ
ス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製
することができる。また、合成した本発明の蛋白質の部
分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製す
ることもできる。

【０１０７】免疫複合体は、例えば、抗体がマウスIgG
抗体であれば、Protein A SepharoseやProtein G Sepha
roseを用いて沈降させることができる。また、本発明の
蛋白質を、例えば、GSTなどのエピトープとの融合蛋白
質として調製した場合には、グルタチオン-Sepharose 4
Bなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利
用して、本発明の蛋白質の抗体を利用した場合と同様
に、免疫複合体を形成させることができる。

【０１０８】免疫沈降の一般的な方法については、例え
ば、文献（Harlow,E. and Lane, D.: Antibodies, pp.5
11-552, Cold Spring Harbor Laboratory publication
s, New York (1988) ）記載の方法に従って、または準
じて行えばよい。

【０１０９】免疫沈降された蛋白質の解析にはSDS-PAGE
が一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることで蛋白
質の分子量により結合していた蛋白質を解析することが
できる。また、この際、一般的には本発明の蛋白質に結
合した蛋白質は、クマシー染色や銀染色といった蛋白質
の通常の染色法では検出することは困難であるので、放
射性同位元素である³⁵S-メチオニンや³⁵S-システインを
含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内の蛋白質を標識
して、これを検出することで検出感度を向上させること
ができる。蛋白質の分子量が判明すれば直接SDS-ポリア
クリルアミドゲルから目的の蛋白質を精製し、その配列
を決定することもできる。

【０１１０】また、本発明の蛋白質を用いて、該蛋白質
に結合する蛋白質を単離する方法としては、例えば、ウ
エストウエスタンブロッティング法（Skolnik, E. Y. e
t al., Cell (1991) 65, 83-90）を用いて行うことがで
きる。すなわち、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発
現していることが予想される細胞、組織、臓器よりファ
ージベクター（λgt11, ZAPなど）を用いたcDNAライブ
ラリーを作製し、これをLB-アガロース上で発現させフ
ィルターに発現させた蛋白質を固定し、精製して標識し
た本発明の蛋白質と上記フィルターとを反応させ、本発
明の蛋白質と結合した蛋白質を発現するプラークを標識
により検出すればよい。本発明の蛋白質を標識する方法
としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方
法、本発明の蛋白質又は本発明の蛋白質に融合したペプ
チド又はポリペプチド（例えばGSTなど）に特異的に結
合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用
する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。

【０１１１】また、本発明のスクリーニング方法の他の
態様としては、細胞を用いた2-ハイブリッドシステム
（Fields, S., and Sternglanz, R.,Trends. Genet. (1
994) 10, 286-292、Dalton S, and Treisman R (1992)C
haracterization of SAP-1, aprotein recruited by se
rum response factor to the c-fos serum response el
ement. Cell 68, 597-612、「MATCHMAKER Two-Hybrid S
ystem」、「MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Ki
t」、「MATCHMAKER One-Hybrid System」(いずれもクロ
ンテック社製)、「HybriZAP Two-Hybrid Vector Syste
m」(ストラタジーン社製)）を用いて行う方法が挙げら
れる。2-ハイブリッドシステムにおいては、本発明の蛋
白質またはその部分ペプチドをSRF DNA結合領域またはG
AL4 DNA結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現さ
せ、本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現しているこ
とが予想される細胞より、VP16またはGAL4転写活性化領
域と融合する形で発現するようなcDNAライブラリーを作
製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性ク
ローンからライブラリー由来cDNAを単離する（酵母細胞
内で本発明の蛋白質と結合する蛋白質が発現すると、両
者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性の
クローンが確認できる）。単離したcDNAを大腸菌に導入
して発現させることにより、該cDNAがコードする蛋白質
を得ることができる。これにより本発明の蛋白質に結合
する蛋白質またはその遺伝子を調製することが可能であ
る。2-ハイブリッドシステムにおいて用いられるレポー
ター遺伝子としては、例えば、HIS3遺伝子の他、Ade2遺
伝子、LacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝
子、PAI-1（Plasminogen activator inhibitor type1）
遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハ
イブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳
動物細胞などを使って行うこともできる。

【０１１２】本発明の蛋白質と結合する化合物のスクリ
ーニングは、アフィニティークロマトグラフィーを用い
て行うこともできる。例えば、本発明の蛋白質をアフィ
ニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明の蛋白質
と結合する蛋白質を発現していることが予想される被検
試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば
細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適
用した後、カラムを洗浄し、本発明の蛋白質に結合した
蛋白質を調製することができる。

【０１１３】得られた蛋白質は、そのアミノ酸配列を分
析し、それを基にオリゴDNAを合成し、該DNAをプローブ
としてcDNAライブラリーをスクリーニングすることによ
り、該蛋白質をコードするDNAを得ることができる。

【０１１４】本発明において、結合した化合物を検出又
は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用し
たバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズ
モン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、本発明の蛋
白質と被検化合物との間の相互作用を微量の蛋白質を用
いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナ
ルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例
えばBIAcore、Pharmacia製）。したがって、BIAcore等
のバイオセンサーを用いることにより本発明の蛋白質と
被検化合物との結合を評価することが可能である。

【０１１５】また、蛋白質に限らず、本発明の蛋白質に
結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含
む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明
の蛋白質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはラン
ダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用
させ、本発明の蛋白質に結合する分子をスクリーニング
する方法や、コンビナトリアルケミストリー技術による
ハイスループットを用いたスクリーニング方法（Wright
on NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone F
P; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK;
Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of t
he protein hormone erythropoietin, Science (UNITED
STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., Th
e combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLA
ND) Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed
combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 19
96,384 p17-9）が当業者に公知である。

【０１１６】本発明のスクリーニングにより単離しうる
化合物は、本発明の蛋白質の活性を調節するための薬剤
の候補となり、本発明の蛋白質の発現異常や機能異常な
どに起因する疾患や本発明の蛋白質の活性を制御するこ
とにより治療可能な疾患の治療への応用が考えられる。
本発明のスクリーニング方法を用いて単離しうる化合物
の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換
される物質も、本発明の蛋白質に結合する化合物に含ま
れる。

【０１１７】本発明の蛋白質、または本発明のスクリー
ニングにより単離しうる化合物をヒトや動物、例えばマ
ウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、
イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパ
ンジーの医薬として使用する場合には、蛋白質や単離さ
れた化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製
剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能であ
る。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル
剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的
に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る
液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口
的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もし
くは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、
乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形
剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせ
て、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形
態で混和することによって製剤化することが考えられ
る。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の
適当な容量が得られるようにするものである。

【０１１８】錠剤、カプセル剤に混和することができる
添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、ト
ラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セ
ルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、
アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウム
のような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような
甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのよう
な香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである
場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を
含有することができる。注射のための無菌組成物は注射
用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従
って処方することができる。

【０１１９】注射用の水溶液としては、例えば生理食塩
水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-
ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナ
トリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコ
ール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えば
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イ
オン性界面活性剤、例えばポリソルベート80^（TM）、HC
O-50と併用してもよい。

【０１２０】油性液としてはゴマ油、大豆油があげら
れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアル
コールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸
塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、
塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、
フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された
注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

【０１２１】患者への投与は、例えば、動脈内注射、静
脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支
的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方
法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与
方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与
量を適宜選択することが可能である。また、該化合物が
DNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子
治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考え
られる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状
などにより変動するが、当業者であれば適宜選択するこ
とが可能である。

【０１２２】本発明の蛋白質の投与量は、その1回投与
量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異
なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重60kgとし
て）においては、1日あたり約100μgから20mgであると
考えられる。

【０１２３】本発明の蛋白質と結合する化合物や本発明
の蛋白質の活性を調節する化合物の投与量は、症状によ
り差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重
60kgとして）においては、1日あたり約0.1から100mg、
好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20
mgであると考えられる。

【０１２４】非経口的に投与する場合は、その１回投与
量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異
なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重60kgとし
て）においては、通常、1日当り約0.01から30mg、好ま
しくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程
度を静脈注射により投与するのが好都合であると考えら
れる。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した
量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与するこ
とができる。

【０１２５】また本発明者らは、本発明の遺伝子の発現
が、分化型のフェノタイプを維持するのに伴ってみられ
る一方、脱分化によって発現が減少することを見出し
た。従って本発明は、本発明の遺伝子の発現を指標とす
る平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患を診断する方法
を提供する。

【０１２６】本発明の診断方法は、該疾患の患者（いま
だ発症していない者を含む）から細胞試料を調製し、該
細胞における本発明の遺伝子の発現を検出することによ
り実施することができる。本発明の診断の対象となる疾
患としては、平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患であ
れば特に制限はないが、例えば、動脈硬化、心筋梗塞、
大動脈瘤、脳卒中等の虚血性の心疾患、脳血管障害、血
管性の痴呆症等が挙げられる。患者から調製する細胞試
料は、通常、平滑筋細胞を含む患者の病巣の細胞あるい
は病巣となるおそれのある細胞である。

【０１２７】細胞における本発明の遺伝子の発現は、当
業者に公知の方法により検出することができる。即ち、
転写レベルであれば、例えば、ノーザンブロッティング
法やRT-PCR法により、蛋白質レベルであれば、例えば、
ウェスタンブロッティング法により検出することができ
る。

【０１２８】検出の結果、正常細胞と比較して、本発明
の遺伝子の発現の有意な減少が認められれば、患者は疾
患に罹患している、またはその素因があると判定され
る。

【０１２９】また、本発明は、平滑筋細胞の異常増殖に
起因する疾患の上記診断を行うための診断薬を提供す
る。本発明の診断薬の一つの態様は、本発明の遺伝子に
ハイブリダイズし、少なくとも15塩基の鎖長を有するDN
Aを含む診断薬である。このようなDNAには、本発明の遺
伝子の転写産物量を測定するためのプローブDNAおよび
プライマーDNAが含まれる。これらDNAは、当業者であれ
ば、本発明の遺伝子の塩基配列を基に設計して、合成す
ることができる。プライマーDNAは通常、15塩基〜100塩
基であり、好ましくは17塩基〜30塩基である。該プライ
マーDNAを利用して本発明の遺伝子の発現を検出する方
法としては、例えば、RT-PCR法を例示することができ
る。

【０１３０】一方、プローブDNAは、通常、少なくとも1
5塩基以上の鎖長を有する。プローブDNAは適宜標識して
用いられる。標識する方法としては、例えば、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの5'端
を³²Pでリン酸化することにより標識する方法や、クレ
ノウ酵素などのDNAポリメラーゼを用い、ランダムヘキ
サマーオリゴヌクレオチドなどをプライマーとして、³²
Pなどのアイソトープ、蛍光色素、あるいはビオチンな
どにより標識された基質塩基を取り込ませる方法（ラン
ダムプライム法など）が挙げられる。該プローブDNAを
利用して、本発明の遺伝子の発現を検出する方法として
は、ノーザンブロッティング法を例示することができ
る。

【０１３１】本発明の診断薬の他の態様は、本発明の蛋
白質に結合する抗体を含む診断薬である。本発明の蛋白
質に結合する抗体は、当業者に公知の方法で調製するこ
とができる。該抗体を利用して本発明の遺伝子の発現を
検出する方法としては、ウェスタンブロッティング法を
例示することができる。

【０１３２】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。

【０１３３】[実施例１] ニワトリ砂嚢平滑筋細胞の
培養ニワトリ白色レグフォン種より産みたての卵を孵卵器に
て37℃にて培養し、培養15日目に胎仔を取り出し、砂嚢
をピンセットによりリン酸バッファーの入ったシャーレ
皿に摘出した。摘出した砂嚢はハサミにより細かく裁断
した後、コラゲネース処理により細胞をまばらにし、さ
らに100μmのフィルターにより大きな細胞の凝集物を取
り除いた。これを20mg/ml牛血清アルブミン（BSA: Sig
ma A-7638）の入ったダルベコ変法イーグル培地（ニッ
スイ#05919）により洗浄し、血球計数盤にて細胞数を計
測して、5万細胞を3.5cmペトリ皿に播種して、37℃にて
1晩培養した。これらの培地を0.2ng/ml、または20ng/ml
インシュリン様増殖因子（IGF-I；ベーリンガーマンハ
イム社#1048066）を添加した20mg/ml BSA /DMEMへ交換
し、把握さらに2日ごとに新しい同様な培地に交換し
た。コラゲネースタイプV（Sigma C-9263）はSol．3（1
37mM NaCl、5mM KCl、4mM NaHCO₃、5.4mM Glucose、2mM
MgCl₂、10mM PIPESをpH6.5に調製）で1mg/mlに調製
し、ろ過滅菌したものを使用した。

【０１３４】培養開始9日目に細胞を回収し、これより
総RNAを回収した。IGF-Iを添加した培地で培養したもの
を以下の実験では分化型平滑筋と称し、牛血清および抗
IGF-I抗体（Upstate Biotechnologyを添加して増殖型に
細胞の性質が変化したものを脱分化型平滑筋と称する。
サブクラスが同じであるマウスのIgG抗体の添加（これ
を以下コントロール抗体と称する）によって脱分化への
移行は起こらず、これを添加したものも分化型平滑筋細
胞として維持される。

【０１３５】[実施例２] Differential Display法に
よる解析 Differential Display法による解析は、GenHunter Corp
oration社のRNAimageキットを用いて行った。回収した
総RNA のうち、0.2μgを用いてcDNAをキットに添付のH-
T11A、H-T11C、H-T11Gアンカープライマーにより合成し
た。条件はGenHunter Corporation社のRNAimageキット
に添付のマニュアルに従い、cDNA合成に使用した同じア
ンカープライマーとキットより提供されるアービタリー
プライマーH-AP1からH-AP80 の80種類のプライマーを組
み合わせたPCR反応を行った。 94℃30秒、40℃2分、72
℃30秒のサイクルを40回行うPCR (polymerase chain re
action) 反応により、TAKARA Taq polymeraseを用いて
ランダムに遺伝子を増幅した。反応液にはα³³P dATPが
含まれており、シークエンスゲル泳動にて分離した。分
化型平滑筋細胞から抽出した総RNAを用いて増幅したバ
ンドと脱分化型の平滑筋細胞からに抽出した総RNAを用
いて増幅したバンドを比べて、分化型平滑筋細胞から由
来したバンドが濃くなっているもの、つまり、分化型平
滑筋細胞でのmRNAの発現が上昇しているものを選択し
た。該当するバンドはゲルより切り出して、再度同じ条
件にて増幅し、増幅されたDNA断片をQiaquick spin PCR
purification kit（キアゲン社）を使用して抽出し
た。抽出されたDNA断片は増幅に用いた同じプライマー
を用いてDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready R
eactionkit（アプライドバイオシステムズ社 Catalog #
402122）によりDNA配列の解析を行った。

【０１３６】[実施例３] PCR-Select cDNA subtracti
on法による解析上記の方法で単離し培養したニワトリ砂嚢平滑筋細胞の
総RNA 1μgを使用して、CapFinede PCR Synthesis Kit
(CLONTECH #K1052-1)によりマニュアルに従ってcDNAを
合成した。具体的には、抗IGF-I中和抗体添加により脱
分化したニワトリ砂嚢平滑筋細胞（以下CGSMC-B）、0.2
ng/ml IGF-Iにコントロール抗体を添加した分化型平滑
筋細胞（以下CGSMC-C）、牛血清添加1日目の脱分化した
平滑筋細胞（以下CGSMC-D）の3種類から得られた総RNA
を使用した。3.5μlに調製した総RNA 1μg、1μlのCDS
primer（キット添付）、0.5μlのCapSwith II oligo
（キット添付）を混合し、70℃2分間の保温の後、室温
に放置し、さらにキットのマニュアルに従い、2μlの5x
first strand buffer、1μlのDTT、1μlの10mM dNTP、
1μlのMMLV reverse trasncriptaseをさらに加えた後、
42℃で1時間保温した。40μlのTE(pH7.5)を加えた後、7
2℃で7分間保温した。得られたcDNA 1μlを蒸留水で10
倍希釈したものを用意して、以下のPCR反応を行った。
反応組成は次の通りである。 10μl cDNA (10倍に希釈したもの) 10μl 10x Advantage KlenTaq buffer 4μl 2.5mM dNTP 2μl 10μM PCR primer（キット添付） 2μl Advantage KlenTaq mix (50x)72μl 蒸留水

【０１３７】予め95℃に加温しておいたThermal Cycler
PE2400 (PE Biosytems社)に、上記の組成物を混合した
0.2ml PCR tubeをセットし、95℃1分の変性の後、95℃1
5秒、68℃5分間の2ステップのPCRを15サイクルかけて、
そこからさらに3サイクルずつ同じ2ステップのPCRを行
い、3サイクルごとに15μlを分取し、PCRによる増幅が
対数増殖的に増えており、飽和していないサイクル数を
算出した。その結果、17サイクルが概ね適当であると考
えられたことから、この条件で増幅したPCR反応産物を
各cDNAについて8チューブを用いて行った。これらをそ
れぞれにまとめてフェノール/クロロホルム/イソアミル
アルコール（25：24：1）の混合物等量と混ぜ合わせて
脱蛋白質を行い、n-ブタノールによる抽出で溶液量を濃
縮し、これをCLONTECH CHROMA SPIN-1000 Columnにか
け、マニュアルに従い1x TNE buffer(10mM Tris-HCl (p
H8.0)/10mM NaCl/0.1mM EDTA)にて溶出した。得られたc
DNAを用いてCLONTECH PCR-Select Subtraction Kitのマ
ニュアルに従い、サブトラクションを行った。2μgのCG
SMC-B、CGSMC-C、CGSMC-DのcDNAを、キット添付のバッ
ファーおよび制限酵素RsaI 15ユニットを含む反応液50
μl中で、37℃で3時間にて消化した後、キット添付の20
x EDTA /glycogen mix を2.5μl、3倍量のSALT solutio
n（キット添付）を加えて激しく混合し、ここにPCR-Pur
e BIND（キット添付）8μlを加えて室温で5分間保温
し、14,000回転で1分間遠心操作を行い、上清を除い
て、WASH Solution（キット添付）1mlで沈殿物をピペッ
ティング操作により溶かし、これを再び14,000回転で1
分間遠心操作を行い上清を除いた。さらに遠心操作を繰
り返して残っているWASH Solutionを完全に除いた。10
分間風乾してからこの沈澱を17μlのTE bufferにピペッ
ティング操作で懸濁し、室温5分間懸濁状態を保ちなが
ら保温し、14,000 回転で5分間遠心操作を行い溶出され
た上清を別のチューブに移し、9μlの4M 酢酸アンモニ
ウムNH₄OAc（キット添付）および75μlのエタノールに
よりエタノール沈澱させた。20分間の遠心操作の後、沈
殿物を80%エタノールで洗浄し、10分間の風乾後6.7μl
の1x TNE bufferに溶解した。300ng/μlに調製したRsaI
により消化したcDNAのうち、CGSMC-Cのサンプルはテス
ターとなるので、アダプターの連結反応を引き続いて行
った。CGSMC-Cのサンプルをアダプター1(10μM)、また
はアダプター2(10μM)（いずれもキット添付）ととも
に、1μlのT4 DNA ligaseを含む10μlの反応液によりキ
ット添付のLigation bufferを用いて、16℃で1晩の連結
反応を行った。20x EDTA/ glycogen mix 1μlを添加
後、72℃5分間処理して酵素を失活させた。できあがっ
たアダプターの連結したテスターcDNAを以下TC-1、TC-2
と呼ぶ。

【０１３８】制限酵素RsaI 消化を行ったドライバー cD
NAとなる脱分化したニワトリ砂嚢平滑筋細胞 CGSMC-B、
CGSMC-D 300ng/μlをそれぞれ1.5μlおよび1.5μlのTC
-1を、キットに添付されている4x Hybridization buffe
r 1.5μlとともに総容積6μlにして0.2mlチューブ内で
混合し、1滴のミネラルオイルをその上に滴下した。こ
れをH1と呼ぶ。同じようにしてTC-1のかわりにTC-2を加
えたチューブを用意した。これをH2と呼ぶ。H1、H2はそ
れぞれThermal cycler (アプライドバイオシステムズ社
PE2400)により、98℃で90秒の熱変性の後、68℃にて8
時間保温した。制限酵素RsaI 消化を行った脱分化した
ニワトリ砂嚢平滑筋細胞 CGSMC-B、CGSMC-D300ng/μlを
それぞれ1.5μl、およびキットに添付されている4x Hyb
ridizationbuffer 1μlとともに総容積4μlにしたドラ
イバーcDNAを新たに作製し、98℃で90秒熱変性したもの
を作製した。H2を吸い込んだ200μlのピペットチップに
さらに空気を吸い込んで直接接しないようにしておいた
ところへ、そのドライバーcDNAを変性した状態で吸い込
んで、これをH1の入ったチューブに移してピペッティン
グにより混合した。H1の入ったチューブはこの間Therma
l cycler上に置いたままの状態にしておいた。これを68
℃で1晩保温してテスターcDNAのうちドライバーcDNA中
に存在しているcDNAをハイブリさせた。200μlのDiluti
on Buffer（キット添付のもの）を加えて、ピペッティ
ングにより混合し、75℃7分間保温した。これをdiluted
subtracted CGSMC IGF(+) cDNAとして-20℃にて保存し
た。diluted subtracted CGSMC IGF(+) cDNAは以下の組
成の反応液中にてPrimary PCRを行った。反応液組成： 16μl 蒸留水 2.5μl 10x Advantage KlenTaq PCR buffer 4μl 2.5mM dNTPs (TAKARA社製) 1μl 10μM PCR primer 1 (キット添付のもの) 0.5μl 50x Advantage KlenTaq DNA polymerase 1μl diluted subtracted CGSMC IGF(+) cDNA

【０１３９】これらを0.2mlチューブで混ぜ合わせて、
ミネラルオイルを1滴滴下し、75℃5分間、94℃25秒間、
94℃10秒／66℃30秒／72℃90秒の3ステップのPCR反応を
27サイクル行った。このPrimary PCR産物3μlを27μlの
蒸留水で希釈して、次のPCR反応を行った。反応液組成： 18.5μl 蒸留水 2.5μl 10x Advantage KlenTaq PCR buffer 0.5μl 10mM dNTPs (キット添付のもの) 1μl 10μM Nested primer 1 (キット添付のもの) 1μl 10μM Nested primer 2 (キット添付のもの) 0.5μl 50x Advantage KlenTaq DNA polymerase 1μl 10倍に希釈したprimary PCR産物

【０１４０】これらを0.2mlチューブで混ぜ合わせて、
ミネラルオイルを1滴滴下し、94℃25秒間、94℃10秒／6
6℃30秒／72℃90秒の3ステップのPCR反応を19サイクル
行った。サイクル13、15、17、19でサンプルを抽出し、
アガロースゲル電気泳動にてPCR産物の状態を確認し
た。その結果、15サイクルより超えると反応生成物は飽
和した状態になっているように考えられたので、15サイ
クルの反応産物を用いて以下の操作を行った。25μlで
反応したもののうち、8μlを電気泳動に使用したので、
残りの17μlに5倍量のbuffer PB (QIAGEN社製 Qiaquick
PCR purificationkitに添付のバッファー)を加えてよ
く混合し、これをQiaquick column (前記と同じキット
の組成物)に入れ、13,000回転で遠心操作を行い、その
カラムにBuffer PE (前記と同じキットの組成物)750μl
を加えて、さらに遠心操作を行い、キットに添付の水30
μlで溶出した。5μlの溶出物にPromega社製 pGEM-T V
ectorsystem（A3600）のマニュアルに従い、TAクローニ
ングを行った。4℃にて1晩連結反応を行った後に、2μl
を使用してキットに従い、大腸菌DH5αを形質転換し
た。得られたコロニーを前述のNested primer 1、Neste
d primer 2を用いてコロニーPCR反応を行い、得られたP
CR産物をミリポア社製 MultiScreenにて精製し、プライ
マーを除去した後、それぞれのプライマーによってDye
Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction kit
（アプライドバイオシステムズ社 Catalog#402122）に
よりDNA配列の解析を行った。

【０１４１】以上の方法によって得られたクローンの配
列は、塩基配列のアッセンブルソフトであるAutoAssemb
ler2.1(アプライドバイオシステムズ社)を用いて重複す
る遺伝子の有無を確認し、さらにこれをNCBI-BLAST2.0
（NCBI）を用いて配列のホモロジー検索を行った。その
結果、重複しないニワトリ平滑筋遺伝子は681配列にま
とめられた。

【０１４２】[実施例４] ニワトリ砂嚢平滑筋によりク
ローニングされた遺伝子の発現解析ニワトリ砂嚢平滑筋分化型、脱分化型での遺伝子発現の
違いについての解析を行った。平滑筋細胞の分化形質の
転換に伴う遺伝子発現量の変化については、RT-PCRおよ
びにVirtual Northern法により解析した。RT-PCRは予め
総RNA を逆転写酵素によりcDNAを作製し、これをテンプ
レートとして遺伝子特異的な2つのプライマーによりPCR
反応を行い、cDNA中に含まれている遺伝子の量を比較し
た。Virtual Northern法は仮想ノーザンブロッティング
のことでcDNAをRNAに見立てて解析する方法で、CLONTEC
H CapFinder PCR cDNA Synthesis Kit (PT3041-1) Appe
ndixに記載の方法に従った。PCR-Select cDNA subtract
ion法に使用したCapFinder PCR Synthesis Kit (CLONTE
CH #K1052-1)のマニュアルに従い、0.2ng/ml IGF-I添
加、抗IGF-I中和抗体添加、0.2ng/ml IGF-I、コントロ
ール抗体添加のニワトリ砂嚢平滑筋細胞3種類から得ら
れた総RNAを使用して行った。総RNAよりoligo dTプライ
マーとCapSwitch oligoを用いて合成したcDNAをオリゴ
内に存在するPCRプライマーで増幅した。その際に、mRN
Aの組成を反映するようにPCRにより生成されるcDNAが飽
和しないサイクル数をあらかじめ決定しておいてそのサ
イクル数だけcDNAを増幅して約30μgのcDNAを合成し
た。0.5μg cDNAを0.8％アガロースゲルで分離し、通常
のサザンブロッティングの方法によりナイロンメンブレ
ン(Hybond N+ : アマーシャム社製)に転写し、アルカリ
変性、中和後、2x SSCにて洗浄し、UVにより固定した。
cDNAがブロットされたメンブレンフィルターのことを以
下Virtual Northern用のフィルターと呼ぶ。Virtual No
rthernのためのプローブは通常の方法に従い、アマーシ
ャム社のMegaprime DNA labeling kit (catalog RPN160
7)を用いて25ngのDNA 断片をα³²P dCTPでラベルした。
前述のように作製したVirtual Northern用のフィルター
はExpressHyb Hybridization Solution(Clontech Catal
og 8015-2) 2mlにて 68℃30分間プレハイブリダイゼー
ションを行い、ラベルされたプローブを同じくExpressH
yb Hybridization Solution 2mlに2x 10⁶ cpm/mlとなる
ように添加して 68℃2時間ハイブリダイズさせた。2x S
SC (0.3M NaCl、 0.03M Sodium citrate (pH7.0))/0.05
% SDSを用いて室温で10分3回フィルターを洗い、さらに
0.1x SSC / 0.1% SDSにて50℃で15分2回洗った後、FUJ
I Imaging plateにて1晩感光させ、FUJI BAS2000にて解
析した。

【０１４３】[実施例５] ニワトリ砂嚢平滑筋よりクロ
ーニングされた遺伝子の全長クローニング CLONTECH社のMarathon cDNA amplification kit (TOYOB
O CLK1802-1)を用いてRACE のためのcDNAを合成した。
ニワトリ砂嚢分化型平滑筋細胞から得られた総RNA 1μg
を用いて実験を行った。10μM oligo dT primerを1μl
加え、全量5μlとし、70℃にて2分保温し、2分間氷上に
置いた。これに2μl 5x First-strand buffer、1μl 10
mM dNTP mix、1μl 100unit/μl MMLV Reverse Trascri
ptaseを加え10μlとし、42℃で1時間保温しfirst-stran
d cDNAを合成した。これにさらに16μl 5x Second-stra
nd buffer 16μl、10mM dNTP mix 1.6μl、20x Second-
strand enzyme cocktail 4μlの水を加えて全量80μlと
し、16℃で90分間保温した。5 units/μl T4 DNA polym
erase 2μlを添加した後、16℃45分の反応を行った。4
μl 20x EDTA/glycogenを添加した後、等量のフェノー
ル／クロロホルム、イソアミルアルコール／クロロホル
ムで除蛋白質を行った。35μl 4M 酢酸アンモニウム(am
monium acetate)、95% エタノール263μlでエタノール
沈殿をし、80%エタノールで洗浄した後、10分間自然乾
燥させた。脱イオン水10μlに溶解し、7.5μlを使って
アダプターの連結反応を行った。3μl 10μM Marathon
cDNA adaptor、3μl 5x DNA ligation buffer、1.5μl
(1 units/μl) T4 DNA ligaseを加えて、16℃で1晩反応
させた。70℃5分の保温により、酵素を失活させ、キッ
トに添付のTricine-EDTA buffer 135μlを加えて全量を
150μlとした。

【０１４４】前述の5μl cDNAを使ってキットのマニュ
アルに従い、5' RACE(Rapid Amplification of cDNA En
ds)を行った。反応液は、5μl cDNA、5μl 10x Advanta
ge^TMKlenTaq buffer (キット添付のものを使用)、4μl
2.5mM dNTP、1μl 10μM AP1primer（キット添付）、1
μl 10μM GSP (Gene specific primer: 遺伝子特異的
なプライマー)、1μl Advantage^TM KlenTaq polymerase
mix (TOYOBO CLK8417-1)、33μl脱イオン水を混合し50
μlとした。PerkinElmer Thermal Cycler 2400を使って
PCR反応を行った。94℃1分、94℃5秒／72℃2分を5回、9
4℃5秒／70℃2分を5回、94℃5秒／68℃2分を25回の反応
で遺伝子が増幅された場合にはTAクローニングを行い、
サイクルシークエンスに供した。また、このPCR反応で
はっきりしたバンドを検出することはできなかった場合
には、同じ条件でnested PCRを行った。プライマーはAP
2 primer（キット添付）およびGSP2 (Gene specific pr
imer 2: 遺伝子特異的なプライマー2)を用い、最初のPC
R産物を50倍に希釈したものを5μl用いた前述と同様な
組成の反応液にてPCR反応を行った。反応のサイクル
は、最後のサイクルを変更し94℃5秒／68℃2分を25回で
はなく15回で行った。塩基配列の決定は前述の方法に従
い、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready React
ion kit（アプライドバイオシステムズ社 Catalog #402
122）、またはBigDye Terminator Cycle Sequencing FS
Ready Reaction kit（アプライドバイオシステムズ社
Catalog #4303150）を用いたサイクルシークエンス法
にて塩基配列を決定した。全長のcDNAを取得する方法と
しては適当なcDNAライブラリーを構築してそこからコロ
ニーハイブリダイゼーションやプラークハイブリダイゼ
ーションによりcDNAを選択する方法も有効である。

【０１４５】cDNAライブラリーの構築はCLONTECH社のSM
ART^TM cDNA Library ConstructionKit (K1051-1)を用い
た。ニワトリ砂嚢平滑筋初代培養より抽出したmRNA、ま
たはニワトリ大動脈より抽出した50ng、100ngのmRNAを
用いて添付のプロトコールに従い、SMART III oligonuc
leotideとCDSIII/3' PCRの2つのプライマーを用いて逆
転写酵素によりファーストストランドcDNAを合成した。
合成したcDNAはキットに添付の5' PCR primer、CDSIII/
3' PCR primerを用いたLD (long distance)PCRを95℃5
秒の変性反応、68℃6分の伸張反応を20〜24回行った。P
roteinase Kで消化し、制限酵素 SfiIで消化した後、C
HROMASPIN400で短い鎖長のcDNAを除去分画した。ラムダ
TriplEx2ベクターにT4 DNA ligaseを用いて連結反応を
行った。方法は添付のマニュアルに従い、連結されたcD
NAはラムダファージにパッケージングした。Stratagene
社のGigapack III Gold Packaging extract (#200201)
を使用した。パッケージングされたファージは通常の方
法により力価を測定した。10mM MgSO₄で処理した大腸菌
DH5αにパッケージングされた200,000 pfu (プラークフ
ォーミングユニット)のファージを感染させ37℃30分間
の保温の後22cmx22cmのアッセイプレートにプレーティ
ングした。ナイロンメンブレン(Hybond N+: アマーシャ
ム社製)にプラークを転写させた後、1cm角にフィルター
を裁断し、SM buffer 750μlを分注した2ml deep well
plateにて溶出させた。これをファージのストックとし
て96 well plateの各列、各行ごとに10μlずつを分取し
てファージのプールとした。プレート1枚ごとに各列の
ファージをまとめてプレートのファージプールとした。
10枚のプレートのファージプールを作製し、さらに各プ
レートごとに各列、各行をまとめたプールができあがっ
た。全長のcDNAのスクリーニングにはこれらのプールを
テンプレートとしたPCRを3回繰り返すことにより目的の
クローンを含んだファージのプールを見出すことができ
る。具体的には、まずスクリーニングしたい遺伝子に特
異的な18-27merのプライマーを準備した。プレートのフ
ァージプールを用いてどのプレートに目的のcDNAが含ま
れているかをPCRによりスクリーニングした。PCRの条件
はあらかじめ各プライマーの組み合わせで最適な方法を
確定しておくが、標準的には94℃5分、94℃15秒／55℃3
0秒／72℃30秒の3ステップPCRを35回、72℃3分の条件で
PCRを行えば、PCR産物が1kb以下であれば増幅される。
目的のcDNAを含むプレートが確定できたら、該当のプレ
ートの各列、各行についてPCRを行い、目的のcDNAを含
むウェルを同定した。ファージは10mM MgSO₄で処理した
大腸菌DH5αに感染させ37℃30分間の保温の後10cmシャ
ーレにプレーティングした。通常の方法によりナイロン
メンブレン(Hybond N+: アマーシャム社製)に転写し、
アルカリ変性、中和後、2x SSCにて洗浄し、UVにより固
定し、プラークハイブリダイゼーションを行った。アマ
ーシャム社のMegaprime DNA labeling kit (catalog RP
N1607)を用いて25ngのDNA 断片をα³²P dCTP でラベル
した。ExpressHyb Hybridization Solution (ClontechC
atalog 8015-2)にて 68℃30分間プレハイブリダイゼー
ションを行い、ラベルされたプローブを同じくExpressH
yb Hybridization Solutionに2x 10⁶ cpm/mlとなるよう
に添加して68℃1時間ハイブリダイズさせた。2x SSC
(0.3M NaCl、0.03M Sodium citrate (pH7.0))/ 0.05% S
DSを用いて室温で10分3回フィルターを洗い、さらに 0.
1x SSC/ 0.1% SDSにて68℃で15分2回洗った後、FUJI Im
aging plateにて1晩感光させ、FUJI BAS2000にて解析し
た。陽性のシグナルを呈したプラークは該当のプライマ
ーの組み合わせで再度PCRを行い、確かに目的のcDNAを
含んでいることを確認した後、キットに添付の大腸菌BM
25.8に感染させ、Cre-loxPによりpTriplEx2プラスミド
として切り出し、これをベクター上のプライマーを用い
てサイクルシークエンシングにより配列を決定した。

【０１４６】[実施例６] マクロアレイ法による遺伝子
発現解析マクロアレイ法やマイクロアレイ法による遺伝子発現の
解析は一度に複数の遺伝子の発現パターンを解析するこ
とができる方法である。マクロアレイはナイロンメンブ
レンなどのフィルター上でハイブリダイズする遺伝子を
選択する方法で、マイクロアレイはそれをスライドガラ
ス上で行う方法である。PCR法などから得られたDNA断片
をメンブレン上やスライドガラス上にスポットし、発現
を調べたい組織や細胞などから回収したRNAを鋳型とし
て逆転写酵素によって作製したcDNAをハイブリダイズさ
せる。RNAから逆転写酵素によってcDNAを作製する際
に、放射性同位元素である³²Pや³³P、または³⁵Sでラベ
ルしたdCTPやdATPなどで内部ラベルする方法、あるいは
Cy3-dUTP、Cy5-dUTP、Dig-dUTP等のタグのついたヌクレ
オチドを挿入させることでラベルする方法などがある
が、いずれの方法であってもよい。または、作製したcD
NAをランダムにラベルする方法を用いてもよい。

【０１４７】本実施例では上記のSMART cDNAを制限酵素
RsaIで処理したPCR-Selectに使用したものと同様なもの
を前記の方法により調製し、これを放射性同位元素³³P
でランダムプライマーによりラベルしたものを用いてハ
イブリダイゼーションを行った。方法はCLONTECH Diffe
rential Screening kitに添付のマニュアルに準拠し
て、ExpressHyb Solution(CLONTECH社 Catalog 8015-2)
を用いて行った。プレハイブリダイゼーションはニシ
ン、またはサケの精子DNA10mg/mlのもの10μlと20xSSC
(3M NaCl、0.3M Sodium citrate (pH7.0))10μlを95℃5
分間沸騰させ、急冷したものをExpressHyb Solution 1m
lに加えて、68℃で1時間行った。プレハイブリダイゼー
ションを行ったフィルターに対して、通常の方法に従
い、アマーシャム社のMegaprime DNA labeling kit(cat
alog RPN1607)を用いて50ngのDNA断片をα³³P dCTPでラ
ベルした。ラベルされたプローブを同じくExpressHyb H
ybridization Solution 5mlに1x 10⁶ cpm/mlとなるよう
に添加して68℃1晩ハイブリダイズさせた。2x SSC (0.3
M NaCl、0.03M Sodium citrate (pH7.0))/0.5% SDSを用
いて68℃で10分3回フィルターを洗い、さらに 0.1x SSC
/ 0.5% SDSにて68℃で15分2回洗った後、FUJI Imaging
plateに3時間から1晩感光させ、FUJI BAS2000IIまたは
富士フィルム社のArrayGaugeにて解析した。マクロアレ
イによる解析の結果を図１に示す。

【０１４８】陰性コントロールとしてpUC18を、陽性コ
ントロールとしてベータアクチン、G3PDH、ribosomal p
rotein L34、およびribosomal protein L22を同じフィ
ルター上にスポットしてデータの解析の際の補正に使用
した。あるいは、全シグナルの合計数が各フィルター間
で一定であるということを前提として、全シグナル強度
を合計し、これで各スポットのシグナルの値を割った値
を比較のために使用した。FUJI BAS2000IIによって解析
したスポットのPSLはその面積で割って、陰性コントロ
ール4点の値の平均値を差し引いた。G3PDHは発現に偏り
があったので、内部コントロールとしてribosomal prot
ein L34、ribosomal protein L22のシグナル強度をフィ
ルター上に6点から得られた値の平均値を算出し、この
値で陰性コントロールの平均値を差し引いたそれぞれの
スポットのシグナル強度を割った。このときの血管平滑
筋および内臓平滑筋における分化型、脱分化型の比の値
をそれぞれ「Ao/AoDD」、「Gz/GzDD」で表す。

【０１４９】その結果、217スポット（クローン）が血
管平滑筋(大動脈／aorta)、内臓平滑筋(砂嚢／gizzard)
の分化型細胞に共通して特異的に分化型の平滑筋細胞で
発現している遺伝子として同定された。表１〜３に各ク
ローンの「Ao/AoDD」、「Gz/GzDD」値、および相同性検
索の結果を示す。相同性の検索にはBLASTを使用し、Gen
Bank(ftp://ncbi.nlm.nih.gov/ncbi-genbank/)に対して
検索を行った。表中の配列001〜079は、それぞれ配列番
号：１〜７９に記載された配列をさす。

【０１５０】

【表１】

【０１５１】

【表２】

【０１５２】

【表３】

【０１５３】その結果、公知のニワトリ遺伝子ではemb|
CAB53970.1| (AJ249218) alpha-actinin associated LI
M protein, emb|X06546.1|GGMYHGSM Chicken mRNA for
gizzard smooth muscle myosin heavy chain, gb|M3104
8.1|CHKSMMLCK Chicken smooth muscle myosin light c
hain kinase, gb|M96655.1|CHKTELOKIN Chicken teloki
n mRNA, gb|M74143.1|CHKACTAC Chicken alpha-actinin
mRNA, gb|AF012348.1|AF012348 Gallus gallus smooth
muscle gamma actin, gb|M36337.1|CHKTROPBChicken t
ropomyosin (clone CTm7) mRNA, gb|U30520.1|GGU30520
Gallus gallus P311 POU (3.1) (J. Biol. Chem. 27
5, 4215 (2000)) mRNAの遺伝子発現が平滑筋細胞の分化
型細胞で上昇していることが確認された。これらは平滑
筋細胞での発現が報告されているものである。ニワトリ
の遺伝子においてはこれら以外にもemb|X66286.1|GGTEN
S G.gallus mRNA for tensin、gb|U22076.1|GGU22076 G
allus gallus A2 isoform of vacuolar H+-ATPaseの発
現が上昇していた。

【０１５４】gb|U40811.1|Mus musculus orphan G-prot
ein-coupled receptor (edg-1) gene、dbj|BAA88118.1|
Eps15R [Homo sapiens]、gb|AAC02901.1|RalBP1-intera
cting protein [Homo sapiens]、ref|MN_005539.1| Hom
o sapiens inositol polyphosphate-5-phosphatase, 40
kd (INPP5A)、sp|Q60994|ADIPOCYTE SPECIFIC PROTEIN
ADIPOQ、dbj|D90173.1|MUSNFIB2 Mouse mRNA for NFI-B
protein、ref|NM_010447.1|Mus musculus heterogeneo
us nuclear ribonucleoprotein、dbj|AK001428.1|AK001
428 Homo sapiens cDNA FLJ10566 fis、gb|J00914.1|CH
KSRU1R chickenu1 small nuclear rna (snrna)、dbj|D8
6981.1|D86981 Human mRNA for KIAA0228 geneの以上の
遺伝子群は、平滑筋細胞での分化への関与については報
告がなく、分化型での平滑筋細胞において脱分化型平滑
筋細胞よりも遺伝子発現レベルが高いことから、平滑筋
細胞が分化型の形質を維持するための機能を有したタン
パク質である可能性が考えられる。

【０１５５】また、データーベース上には未だ登録され
ていない新規遺伝子を見出した。表１〜３で示したクロ
ーンの中から重複するクローンを除いた結果、79個の新
規遺伝子を取得した。該遺伝子の塩基配列を配列番号：
１〜７９に示す。配列番号とクローン名との対応は次の
通りである。配列番号：1, 000120_1 配列番号：2, 000120_118 配列番号：3, 000120_126 配列番号：4, 000120_165 配列番号：5, 000120_166 配列番号：6, 000120_167 配列番号：7, 000120_266 配列番号：8, 000120_3 配列番号：9, 000120_386 配列番号：10, 000120_484 配列番号：11, 05NP2_A04_021_425 配列番号：12, 10NP2_B08_061_958 配列番号：13, 24NP1_D04_030 配列番号：14, 25NP2_D02_014 配列番号：15, 60_19NP1GC1 配列番号：16, cmm000756_chps0040 配列番号：17, final012 配列番号：18, final013 配列番号：19, final081 配列番号：20, final122 配列番号：21, final151 配列番号：22, final181 配列番号：23, final189 配列番号：24, final197 配列番号：25, final213 配列番号：26, final222 配列番号：27, final230 配列番号：28, final245 配列番号：29, final248 配列番号：30, final257 配列番号：31, final282 配列番号：32, final283 配列番号：33, final368 配列番号：34, final402 配列番号：35, m03_F08 配列番号：36, m09_A11 配列番号：37, m11_B12 配列番号：38, m12A10 配列番号：39, m12F07 配列番号：40, m13A08 配列番号：41, m13B01 配列番号：42, m13B10 配列番号：43, m13C03 配列番号：44, m13D05 配列番号：45, m13D06 配列番号：46, m13G07 配列番号：47, m13H04 配列番号：48, m14F07 配列番号：49, m15C02 配列番号：50, m15D06 配列番号：51, m15G01 配列番号：52, m16C07 配列番号：53, m16F10 配列番号：54, m18D04 配列番号：55, m18E09 配列番号：56, m18G09 配列番号：57, m19B02 配列番号：58, m20B09 配列番号：59, m21D08 配列番号：60, nbcf138 配列番号：61, nbcf139 配列番号：62, nbcf319 配列番号：63, nbcf330 配列番号：64, nbcf34 配列番号：65, nbcf361 配列番号：66, nbcf48 配列番号：67, nbcf54 配列番号：68, ro01NP2_F09_075_70 配列番号：69, ro036 配列番号：70, ro19NP2_C12_086_1 配列番号：71, ro254 配列番号：72, 000120_119 配列番号：73, 000120_466 配列番号：74, m03D01 配列番号：75, m12B06 配列番号：76, m15A08 配列番号：77, m16E05 配列番号：78, m21A04 配列番号：79, ro19NP2_H07_060_1.seq

【０１５６】[実施例７] 新規ニワトリ遺伝子のヒト遺
伝子に対するホモロジー検索 BLASTN 2.0MP-WashU (Gish, W. (1996-2000) http://bl
ast.wustl.edu) によるホモロジー検索の結果から、実
施例６に示した79個の新規な遺伝子配列の中で下記の16
個の配列については、相同的なヒトの遺伝子の配列が存
在した。配列番号：2, 000120_118 配列番号：7, 000120_266 配列番号：9, 000120_386 配列番号：10, 000120_484 配列番号：15, 60_19NP1GC1 配列番号：23, final189 配列番号：27, final230 配列番号：36, m09_A11 配列番号：40, m13A08 配列番号：48, m14F07 配列番号：53, m16F10 配列番号：58, m20B09 配列番号：61, nbcf139 配列番号：69, ro036 配列番号：74, m03D01 配列番号：76, m15A08

【０１５７】各配列に相同性を有するヒト遺伝子を含む
ゲノムクローンおよびUnigene (http://www.ncbi.nlm.n
ih.gov/UniGene/index.html) のクラスターの番号か
ら、相同的なヒトの遺伝子に相当する領域の配列を選び
出した。

【０１５８】相同的なヒトゲノム配列についてはタンパ
ク質をコードする遺伝子としては同定されておらず、平
滑筋細胞で発現するcDNAから由来する本発明の配列と相
同性を有することから、該ヒトゲノム配列は転写される
遺伝子を含む配列であることが想定される。Unigeneは
１つのクラスターが1遺伝子に相当し、ホモロジー検索
により相同性を指標にクラスターとして分類された遺伝
子のデーターベースである。クラスターの方法について
はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/build.html
に詳細が示されている。発明者らは平滑筋で発現してい
る本発明の遺伝子と相同的なヒト遺伝子を、該当するUn
igeneのクラスターに属するESTの配列をAutoAssembler
2.1 (アプライドバイオシステムズ社)を用いた解析によ
るひとつのコンティグとして作成した。本発明の配列と
相同性を示す各配列については、GenBankのアクセス番
号、Unigeneのクラスター番号、登録されている配列の
長さ(Length)、相同性を示す指標となるスコア(Scor
e)、期待値(Expect)、同一性(Identities)、相同性(Pos
itives)を示した。以下に新規ニワトリ遺伝子のヒト遺
伝子との相同性検索の結果を示す。

【０１５９】（１）配列番号：２に記載された配列
は、GenBankアクセス番号AC021502.2のHomo sapiens ch
romosome 15 clone RP11-150N12 map 15に存在するヒト
遺伝子と77%の相同性を有する。このニワトリの配列と
相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列2Gと
し、配列番号：８０に示す。配列の番号のあとにC, G,
Uというタグをつけた。Cはコンティグにより得られた配
列を示し、Gはゲノムの配列を示す。UはUnigeneに該当
するクラスターのうちのESTの配列を示す。（以下同
様） >gb|AC021502.2|AC021502 Homo sapiens chromosome 15
clone RP11-150N12 map15, LOW-PASS SEQUENCE SAMPLI
NG // Length = 101,629 // Score = 659 (104.9 bit
s), //Expect = 1.6e-18, P = 1.6e-18 // Identities
= 191/247 (77%),Positives = 191/247 (77%)

【０１６０】（２）配列番号：７に記載された配列
は、Unigeneクラスター番号Hs.93748のGenBankアクセス
番号AW026208のヒト転写因子BTF3aに中程度に相同性を
有するESTと85%の高い相同性を有する。また、GenBank
アクセス番号AC010093.4のHomo sapiens chromosome 2
clone RP11-323O5に存在するヒト遺伝子と85%の高い相
同性を有している。Hs.93748に属している83個のESTか
らコンティグを作成した。このニワトリの配列と相同性
を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列7Cとし、配列
番号：８１に示す。 >gnl|UG|Hs#S1602189 wv09g05.x1 Homo sapiens cDNA /
3' end /clone=IMAGE:2529080 /clone_end=3' //gb=AW0
26208 /gi=5879727 // ug=Hs.93748 //len=704 //Score
= 533 bits (269) //Expect = e-149 //Identities =
560/653 (85%) //ESTs, Moderately similar to BTF3_H
UMAN TRANSCRIPTION FACTOR BTF3 [H.sapiens] >gb|AC010093.5|AC010093 Homo sapiens chromosome 2
clone RP11-323O5, WORKING DRAFT SEQUENCE, 4 unorde
red pieces // Length = 167,364// Score = 2769 (42
1.5 bits), // Expect = 2.2e-117, P = 2.2e-117 // I
dentities = 667/783 (85%), // Positives = 667/783
(85%)

【０１６１】さらに詳細に解析を行った結果、配列番
号：７に記載された配列は、AK027750Homo sapiens cDN
A FLJ14844 fis, clone PLACE1000133, highly similar
to TRANSCRIPTION FACTOR BTF3と核酸レベルでもアミ
ノ酸レベルでも非常に高い相同性があることが判った。
ホモロジー検索の結果、BLASTN検索でGenbankアクセス
番号AK027750と580/669（86％）の同一性（Identitie
s）を示し、また、BLASTX検索でGenbankアクセス番号BA
B55342のunnamed protein product [Homo sapiens]とは
アミノ酸レベルで90％以上の非常に高い同一性を示して
おり、FLJ14844fis遺伝子は、配列番号：７に記載され
た配列に対するヒトのオルソログであると考えられる。
このヒトオルソログの完全長遺伝子の塩基配列を配列番
号：１１６に示し、該遺伝子によってコードされるアミ
ノ酸配列を配列番号：１１７に示す。

【０１６２】これはUniGene ( http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/UniGene/) のクラスター番号Hs.93748に相当す
る。BTF3(basic transcription factor 3)にはlong for
m 206aa, short form 162aaと BTF3L1, BTF3L2, BTF3L3
の3つのホモログが報告されている(Gene 117, 219-228
(1992) Kannoら)が、Human cDNA FLJ14844fisがコード
している蛋白質はこれらとは80数％の同一性を示してお
り、別の蛋白質である。この蛋白質は転写因子であり、
平滑筋細胞の分化維持に関与する遺伝子の制御を行って
いるものと考えられる。図４に配列番号：７をアミノ酸
に翻訳した配列とBAB55342の配列との相同性検索の結果
を示す。

【０１６３】（３）配列番号：９に記載された配列
は、GenBankアクセス番号AC023142.4のHomo sapiens ch
romosome 8 clone RP11-558B2に存在するヒト遺伝子と6
9%の相同性を有している。このニワトリの配列と相同性
を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列9Gとし、配列
番号：８２に示す。 >gb|AC023142.4|AC023142 Homo sapiens chromosome 8
clone RP11-558B2, WORKING DRAFT SEQUENCE, 19 unord
ered pieces // Length = 159,505// Score = 321 (54.
2 bits), // Expect = 2.8e-07, Sum P(2) = 2.8e-07 /
/ Identities = 111/159 (69%), Positives = 111/159
(69%)

【０１６４】（４）配列番号：１０に記載された配列
は、GenBankアクセス番号AL365399.6AL365399 Homo sap
iens chromosome 10 clone RP11-484D21に存在するヒト
遺伝子と68％の相同性を有している。このニワトリの配
列と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列10
G1、10G2とし、それぞれ配列番号：８３、８４に示す。 >emb|AL365399.6|AL365399 Homo sapiens chromosome 1
0 clone RP11-484D21, ***SEQUENCING IN PROGRESS **
*, 39 unordered pieces // Length = 163,144 // Sco
re = 378 (62.8 bits), // Expect = 2.6e-12, Sum P
(2) = 2.6e-12 // Identities = 160/234 (68%), Posit
ives = 160/234 (68%)

【０１６５】（５）配列番号：１５に記載された配列
は、Unigeneクラスター番号Hs.78521のGenBankアクセス
番号AA506368のESTと75%の相同性を有している。このニ
ワトリの配列と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領
域を配列15Cとし、配列番号：８５に示す。

【０１６６】また、GenBankアクセス番号AC016802.5 H
omo sapiens clone RP11-5O9に存在するヒト遺伝子と74
％の相同性を示す。Hs.78521に属する77個のESTからコ
ンティグを作成した。 >gnl|UG|Hs#S793704 ni11c01.s1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:967680 /clone_end=3' //gb=AA50
6368 /gi=2242608 //ug=Hs.78521 //len=204 //Score =
248 (43.3 bits), //Expect = 3.3e-14, Sum P(2) =
3.3e-14 //Identities = 80/106 (75%), Positives = 8
0/106 (75%) >gb|AC016802.5|AC016802 Homo sapiens clone RP11-5O
9, WORKING DRAFT SEQUENCE, 30 unordered pieces //
Length = 146,868 // Score = 359 (59.9 bits), // E
xpect = 3.9e-09, Sum P(2) = 3.9e-09 // Identities
= 123/166 (74%),Positives = 123/166 (74%)

【０１６７】（６）配列番号：２３に記載された配列
は、GenBankアクセス番号AC018403.4Homo sapiens clon
e RP11-16N2に存在するヒト遺伝子と55％の相同性を有
する。このニワトリの配列と相同性を有するヒト遺伝子
の相当する領域を配列23Gとし、配列番号：８６に示
す。 >gb|AC018403.4|AC018403 Homo sapiens clone RP11-16
N2, WORKING DRAFT SEQUENCE, 5 unordered pieces //
Length = 148,247 // Score = 344 (57.7 bits),// Exp
ect = 1.3e-05, P = 1.3e-05 // Identities = 412/741
(55%), Positives = 416/741 (56%),

【０１６８】（７）配列番号：２７に記載された配列
は、GenBankアクセス番号AC026526.3Homo sapiens clon
e RP11-531P20に存在するヒト遺伝子と62%の相同性を有
している。このニワトリの配列と相同性を有するヒト遺
伝子の相当する領域を配列27G1、27G2とし、それぞれ配
列番号：８７、８８に示す。 >gb|AC026526.3|AC026526 Homo sapiens clone RP11-53
1P20, WORKING DRAFT SEQUENCE, 32 unordered pieces
// Length = 214,242 // Score = 243 (42.5 bits), //
Expect = 1.4e-05, Sum P(2) = 1.4e-05 // Identitie
s = 152/249 (61%), Positives = 155/249 (62%)

【０１６９】（８）配列番号：３６に記載された配列
は、Unigeneクラスター番号Hs.112830のGenBankアクセ
ス番号R13696のESTと86%の高い相同性を有している。ま
た、GenBankアクセス番号AC010733.4のHomo sapiens ch
romosome 2 clone RP11-373L24に存在するヒト遺伝子と
84%の高い相同性を有している。Hs.112830に属する17個
のESTからコンティグを作成した。このニワトリの配列
と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列36C
とし、配列番号：８９に示す。 >gnl|UG|Hs#S99659 yf64e03.r1 Homo sapiens cDNA, 5'
end /clone=IMAGE:26974 /clone_end=5' //gb=R13696
/gi=766772 //ug=Hs.112830 //len=398 //Score= 401
(66.2 bits), Expect = 5.5e-12, P = 5.5e-12 //Ident
ities = 105/133(78%), Positives = 105/133 (78%) >gb|AC010733.4|AC010733 Homo sapiens chromosome 2
clone RP11-373L24, WORKING DRAFT SEQUENCE, 20 unor
dered piecesLength = 206,249 // Score = 444 (72.7
bits), // Expect = 2.3e-14, Sum P(2) = 2.3e-14 //
Identities = 106/126 (84%), Positives = 106/126 (8
4%)

【０１７０】（９）配列番号：４０に記載された配列
は、Unigeneクラスター番号Hs.122142のGenBankアクセ
ス番号BE047228のESTと73%の高い相同性を有している。
Hs.122142に属する31個のESTからコンティグを作成し
た。このニワトリの配列と相同性を有するヒト遺伝子の
相当する領域を配列40Cとし、配列番号：９０に示す。 >gnl|UG|Hs#S2044371 hq77a10.x1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:3125370 /clone_end=3' //gb=BE0
47228 /gi=8364281 //ug=Hs.122142 //len=342 //Score
= 374 (62.2 bits), //Expect = 1.1e-10, P = 1.1e-1
0 //Identities =118/160 (73%), Positives = 118/160
(73%)

【０１７１】（１０）配列番号：４８に記載された配
列は、Unigeneクラスター番号Hs.90408 (Neogenin，g
b:NM_002499)、GenBankアクセス番号AI685419 76%の高
い相同性を有している。また、GenBankアクセス番号AC0
68397.2 Homo sapiens chromosome 15 clone RP11-272D
12 map 15に存在するヒト遺伝子と76%の高い相同性を有
している。このニワトリの配列と相同性を有するヒト遺
伝子の相当する領域を配列48Gとし、配列番号：９１に
示す。 >gb|AC068397.2|AC068397 Homo sapiens chromosome 15
clone RP11-272D12 map15, WORKING DRAFT SEQUENCE,
23 unordered pieces // Length = 159,964 //Score =
349 (58.4 bits), // Expect = 4.5e-08, P = 4.5e-08
// Identities= 105/137 (76%), Positives = 105/137
(76%)

【０１７２】（１１）配列番号：５３に記載された配
列は、Unigene クラスター番号Hs.13522のGenBankアク
セス番号W94051のESTと70%の高い相同性を有している。
また、GenBankアクセス番号AC009277.4 Homo sapiens c
hromosome 18 clone RP11-481E24 map 18に存在するヒ
ト遺伝子と70%の高い相同性を有している。Hs.13522に
属する49個のESTからコンティグを作成した。このニワ
トリの配列と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域
を配列53Cとし、配列番号：９２に示す。 >gnl|UG|Hs#S436206 zd98b12.s1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:357503 /clone_end=3' //gb=W940
51 /gi=1423182 //ug=Hs.13522 //len=560//Score = 47
2 (76.9 bits), //Expect = 2.4e-15, P = 2.4e-15 //I
dentities= 168/239 (70%), Positives = 168/239 (70
%) >gb|AC009277.4|AC009277 Homo sapiens chromosome 18
clone RP11-481E24 map18,*** SEQUENCING IN PROGRES
S ***, 1 ordered pieces // Length = 160,401// Scor
e = 472 (76.9 bits), // Expect = 1.2e-13, P = 1.2e
-13 // Identities = 168/239 (70%), Positives = 168
/239 (70%)

【０１７３】（１２）配列番号：５８に記載された配
列は、GenBankアクセス番号BE503307.1のESTと83%の高
い相同性を有している。また、GenBankアクセス番号AC0
11439.8Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-443A1
3に存在するヒト遺伝子と76%の高い相同性を有してい
る。このニワトリの配列と相同性を有するヒト遺伝子の
相当する領域を配列58Gとし、配列番号：９３に示す。 >gnl|UG|Hs#S203210 ym01b07.s1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:46352 /clone_end=3' //gb=H0974
6 /gi=874568 //ug=Hs.4241 //len=476//Score = 353
(59.0 bits), //Expect = 6.8e-10, P = 6.8e-10 //Ide
ntities= 115/151 (76%), Positives = 115/151 (76%) >gb|AC011439.8|AC011439 Homo sapiens chromosome 10
clone RP11-443A13, WORKING DRAFT SEQUENCE, 9 unor
dered pieces // Length = 182,068 // Score =353 (5
9.0 bits), // Expect = 3.0e-08, P = 3.0e-08 // Ide
ntities = 115/151 (76%), Positives = 115/151 (76%)

【０１７４】（１３）配列番号：６１に記載された配
列は、GenBankアクセス番号AC073582.4 Homo sapiens c
hromosome Xp clone RP11-4P23に存在するヒト遺伝子と
70%の高い相同性を有している。このニワトリの配列と
相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列61Gと
し、配列番号：９４に示す。 >gb|AC073582.4|AC073582 Homo sapiens chromosome Xp
clone RP11-4P23, ***SEQUENCING IN PROGRESS ***, 5
6 unordered pieces // Length = 160,658 // Score =
754 (119.2 bits), // Expect = 2.3e-26, P = 2.3e-26
// Identities =244/347 (70%), Positives = 244/347
(70%)

【０１７５】（１４）配列番号：６９に記載された配
列は、GenBankアクセス番号AL390999.1のHomo sapiens
chromosome 1 clone RP11-151E7に存在するヒト遺伝子
と65%の高い相同性を有している。このニワトリの配列
と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列69G
とし、配列番号：９５に示す。 >emb|AL365263.1|AL365263 Homo sapiens chromosome 1
clone RP11-384I6, ***SEQUENCING IN PROGRESS ***,
7 unordered pieces // Length = 87,244 // Score = 5
29 (85.4 bits), // Expect = 3.3e-16, P = 3.3e-16 /
/ Identities = 222/337 (65%), Positives = 223/337
(66%)

【０１７６】（１５）配列番号：７４に記載された配
列は、ヒトゲノムの配列GenBankのアクセス番号AC00842
6.2のHomo sapiens chromosome 5 clone CTC-307A7に存
在する遺伝子と56％の相同性を示したこのニワトリの配
列と相同性を有するヒト遺伝子の相当する領域を配列74
Gとし、配列番号：９６に示す。 >gb|AC008426.2|AC008426 Homo sapiens chromosome 5
clone CTC-307A7, WORKING DRAFT SEQUENCE, 37 unorde
red pieces // Length = 141,932 // Score = 331 (55.
7 bits), // Expect = 3.8e-05, P = 3.8e-05 // Ident
ities = 375/665(56%), Positives = 375/665 (56%)

【０１７７】（１６）配列番号：７６に記載された配
列は、ヒトゲノムの配列GenBankのアクセス番号AC00759
7.2のHomo sapiens chromosome 16 clone RPCI-11_137H
10に存在する遺伝子と67％の相同性を示した。Unigene
のクラスター番号Hs.75928に属するAI492902と83％の相
同性を示した。このニワトリの配列と相同性を有するヒ
ト遺伝子の相当する領域を配列76Gとし、配列番号：９
７に示す。 >gb|AC007597.2|AC007597 Homo sapiens chromosome 16
clone RPCI-11_137H10,*** SEQUENCING IN PROGRESS *
**, 3 ordered pieces // Length = 163,880 //Score =
524 (84.7 bits), // Expect = 1.8e-16, Sum P(2) =
1.8e-16 // Identities = 222/331 (67%), Positives =
222/331 (67%) >gnl|UG|Hs#S1307407 th78d12.x1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:2124791 /clone_end=3' //gb=AI4
92902 /gi=4393905 //ug=Hs.75928 /len=534 //Score =
374 (62.2 bits), //Expect = 6.9e-11, P = 6.9e-11
//Identities = 98/118 (83%), Positives = 98/118 (8
3%)

【０１７８】本発明のニワトリ遺伝子に相当するヒト遺
伝子からヒトの全長遺伝子の取得方法は、例えば、適当
な18-30塩基の配列を二箇所選んでこのオリゴDNAを作成
し、これらを用いたRACE法によって全長配列を得ること
ができる。あるいは、この増幅されたDNAをプローブと
して適当なヒトcDNAライブラリーをスクリーニングする
ことにより、ヒトの遺伝子の取得が可能である。また、
ニワトリと配列の相同性から選び出したゲノムの配列
は、ニワトリのcDNAと相同性があることから、cDNAとし
て発現されていると考えられる。従って、ヒトの配列を
基にした適当な18-30塩基の配列を二箇所選び、このオ
リゴDNAを作成し、これらを用いたRACE法等によりヒト
遺伝子の全長の配列を得ることができる。さらに、この
増幅されたDNAをプローブとして適当なヒトcDNAライブ
ラリーをスクリーニングすることによっても、ヒトの遺
伝子の取得が可能である。

【０１７９】[実施例８] ニワトリ遺伝子の既知遺伝
子配列との相同性検索実施例６の表１〜３に示したニワトリ遺伝子についてニ
ワトリ既知遺伝子配列、およびヒト遺伝子配列との相同
性検索を行った。相同性検索は、実施例７で示す方法に
従った。以下で示す配列については、既知の遺伝子配列
と相同性を有しており、これまでのところ平滑筋細胞で
の分化への関与は知られていない。

【０１８０】（１） 000120_12（配列番号：９８）はG
enBankアクセス番号AF010233のHomo sapiens RalBP1-in
teracting protein (POB1)と71％の高い相同性を示し、
ニワトリのRalBP1-interacting proteinをコードしてい
る遺伝子であると考えられる。POB1タンパク質はsmall
GTP結合タンパク質であるRalタンパク質の下流の分子
で、RalBP1、Epsin、Eps15、alpha-adaptinとともに複
合体を形成し、レセプターを介したエンドサイトーシス
に関与していると考えられる。（J Biol Chem 2000275
(24):18399-406） >gb|AF010233.1|AF010233 Homo sapiens RalBP1-intera
cting protein (POB1) mRNA, complete cds //Length =
2285 //Score = 1169 (181.4 bits), //Expect= 2.5e-
46, P = 2.5e-46 //Identities = 361/509 (70%), Posi
tives = 363/509(71%)

【０１８１】（２） 11_67（配列番号：９９）はGenBa
nkアクセス番号AJ005433.1のBranchiostoma lanceolatu
m gene encoding dopamine D1/beta receptorと92％の
高い相同性を示し、また、GenBankアクセス番号 D4444
3.1のMouse mRNA for dexamethasone induced product
とも77％の高い相同性を有する。さらに、ヒト遺伝子に
ついては、GenBankアクセス番号AC018550 Homo sapiens
chromosome 15 clone RP11-95H15 map 15q21に存在す
る遺伝子が88％の相同性を有しており、このクローン11
_67のヒトオルソログであると考えられた。 >emb|AJ005433.1|BLAJ5433 Branchiostoma lanceolatum
gene encoding dopamine D1/beta receptor //Length
= 1528 //Score = 503 (81.5 bits), //Expect =5.2e-2
5, Sum P(2) = 5.2e-25 //Identities = 111/120 (92
%), Positives = 111/120 (92%) >dbj|D44443.1|MUSDIP Mouse mRNA for dexamethasone
induced product, complete cds //Length = 573 //Sco
re = 525 (84.8 bits), //Expect = 3.2e-17, P= 3.2e-
17 //Identities = 154/198 (77%), Positives = 155/1
98 (78%) >gb|AC018550.2|AC018550 Homo sapiens chromosome 15
clone RP11-95H15 map15q21, LOW-PASS SEQUENCE SAMP
LING//Length = 162,807 //Score = 546 (88.0bits), /
/Expect = 2.9e-25, Sum P(2) = 2.9e-25 //Identities
= 127/144 (88%), Positives = 128/144 (88%)

【０１８２】（３） cmm000755_chps0039.sdn（配列番
号：１００）は、スプィンゴシン１リン酸（S1P）、リ
ゾフォスファチジック酸（LPA）のリセプターとして報
告されているG-protein coupled receptor の一つであ
る。（J. Biol Chem 265:9308-13(1990)）細胞の分化、
増殖に関与していることが報告されている。CHPS0039の
配列を基にして5’RACE を行ったが、途中長いポリTの
領域が存在することから決定した全長配列はここで分断
されており、ここまでの領域は非コード領域であった。
コード領域を含む配列をchEDG1a（配列番号：１０
２）、CHPS0039を含む非コード領域をchEDG1b（配列番
号：１０１）とした。コーディング領域を含む配列chED
G1aは1746bpである。251番から1387番までの配列が遺伝
子をコードしている。GenBankアクセス番号AF233365 Ho
mo sapiens G protein-coupled sphingolipid receptor
(CHEDG1) mRNA, complete cdsと核酸配列の比較で76％
の相同性を示し、アミノ酸配列で84％の相同性を示す。

【０１８３】chEDG1aによってコードされるアミノ酸配
列（配列番号：１０３）を、GenBankのnon-redundant n
ucleotide databaseに対してNCBI-BLASTにて検索する
と、ラットEDG1と82％、ヒトEDG1と81%の相同性を示し
た。タンパク質で比較するとヒト、ラットともに84％の
相同性であった。ヒトEDG1とGCG の中にある解析ソフト
GAPを用いて2つのタンパク質間の相同性を検索したとこ
ろ、84.6％の同一性、87.5％の相同性が見い出された。
このことからもこの遺伝子はEDG1のヒトオルソログであ
ると考えられた。図２はヒトEDG1 gb|AAA52336.1|(M312
10) endothelialdifferentiation protein (edg-1) [Ho
mo sapiens]とchEDG1aのアミノ酸配列（配列番号：１０
３）を比較したものである。

【０１８４】（４） final127（配列番号：１０４）は
GenBankアクセス番号AF161424.1のHomo sapiens HSPC30
6 mRNA, partial cdsと67％の相同性を示し、486番から
647番にコードされる遺伝子は90％以上の高い相同性を
示した。しかしながら、このHSPC306遺伝子について
は、CD34+幹細胞からクローニングされた遺伝子である
ことのみしか知られていない。または、UniGeneクラス
ター番号Hs.18368に属するAI921711とも76％の相同性を
示した。HSPC261を含むこのUnigeneクラスターからコン
ティグを作成した（図３）。ニワトリクローンfinal127
に相同性を示すUniGeneクラスター番号Hs.18368に属す
るEST111個をアプライドバイオシステムズ社のAutoAss
embler2.0を用いて解析して3557塩基からなるコンティ
グと既知遺伝子、HSPC306 262アミノ酸 (GenBankアクセ
ス番号AF161424), HSPC206 160アミノ酸(GenBankアクセ
ス番号AF161379)、DKFZp564B0769.1 299アミノ酸（GenB
ankアクセス番号AL080186）とともに遺伝子の位置関係
を示した図である。コンティグより得られた塩基配列fi
nal127Cを配列番号：１０５に、該配列によりコードさ
れるアミノ酸配列を配列番号：１０６に示す。このfina
l127Cは549アミノ酸をコードするが、N末端の配列につ
いては不明である。206 塩基（69番目のアミノ酸Met）
からがコード領域であり、481アミノ酸をコードする遺
伝子であるかも可能性もある。303番目のアミノ酸あた
りからセリン、アルギニンに富んだ領域が存在すること
からスプライシングに関与するタンパク質であることが
考えられる。 >gb|AF161424.1|AF161424 Homo sapiens HSPC306 mRNA,
partial cds //Length= 786 //Score = 713 (113.0 bi
ts), //Expect = 7.5e-26, P = 7.5e-26 //Identities
= 280/414 (67%), Positives = 281/414 (67%) >gnl|UG|Hs#S1524176 wo29c03.x1 Homo sapiens cDNA,
3' end /clone=IMAGE:2456740 /clone_end=3' /gb=AI92
1711 /gi=5657675 /ug=Hs.18368 /len=517 /Score = 83
3 (131.0 bits), /Expect = 1.3e-31, P = 1.3e-31 /Id
entities = 245/322 (76%), Positives = 245/322 (76
%)

【０１８５】（５） m01_92（配列番号：１０７）はGe
nBank番号のMUSEPS15A Mus musculuseps15 mRNA, compl
ete cdsと77％の相同性を有し、あるいは、GenBank番号
のHSU07707 のHuman epidermal growth factor recepto
r substrate (eps15)と72％の相同性を示している。こ
のことからこのクローンは、epidermal growth factors
ubstrate, eps15のニワトリオルソログであると考えら
れる。アミノ酸配列にして比較するとpdb|1C07|A Chain
A, Structure Of The Third Eps15 Homology Domain O
f Human Eps15とは80％の高い相同性を示した。増殖因
子EGFのリセプターであり、チロシンリン酸化酵素であ
るEGERのシグナルパスウェイの基質としてクローニング
された遺伝子である。過剰発現によりNIH3T3細胞をトラ
ンフォームすることが知られている。（Mol..Cell. Bio
l. 13: 5814-5828 (1993)、 Oncogene 9: 1591-1597 (1
994)）. >gb|L21768.1|MUSEPS15A Mus musculus eps15 mRNA, co
mplete cds //Length =3033 //Score = 329 (55.4 bit
s), //Expect = 1.1e-10, Sum P(2) = 1.1e-10 //Ident
ities = 87/112 (77%), Positives = 87/112 (77%) >gb|U07707.1|HSU07707 Human epidermal growth facto
r receptor substrate (eps15) //Score = 347 (58.1 b
its), //Expect = 2.6e-08, P = 2.6e-08 //Identities
= 111/154 (72%), Positives = 111/154 (72%) >pdb|1C07|A Chain A, Structure Of The Third Eps15
Homology Domain Of Human Eps15 /Length = 95 /Score
= 158 (60.7 bits), /Expect = 1.2e-10, P = 1.2e-10
/Identities = 28/35 (80%), Positives = 32/35 (91
%)

【０１８６】（６） m12E09（配列番号：１０８）はGe
nbankアクセス番号D86981.1 のHumanmRNA for KIAA0228
gene, partial cdsと79％の相同性を示し、これはUniG
eneアクセス番号Hs.84084に含まれている。このKIAA022
8については部分配列を示しており、その全長配列につ
いては明らかではない。また、機能についても未知なタ
ンパク質である。 >dbj|D86981.1|D86981 Human mRNA for KIAA0228 gene,
partial cds //Length= 6465 //Score = 674 (107.2 b
its), //Expect = 4.2e-23, P = 4.2e-23 //Identities
= 190/238 (79%), Positives = 190/238 (79%)

【０１８７】（７） m15C09（配列番号：１０９）はGe
nbankアクセス番号GGA293817 のGallus gallus mRNA fo
r adenylyl cyclase type V (AC5 gene)をコードしてい
る遺伝子である。細胞内のシグナル伝達に重要な機能を
有するcAMP(サイクリックAMP)を合成する酵素である。 >emb|AJ293817.1|GGA293817 Gallus gallus mRNA for a
denylyl cyclase type V(AC5 gene) //Length = 4236 /
/Score = 882 (138.4 bits), //Expect = 1.3e-32, P =
1.3e-32 //Identities = 186/195 (95%), Positives =
186/195 (95%) >dbj|AK022760.1|AK022760 Homo sapiens cDNA FLJ1269
8 fis, clone NT2RP1000677, weakly similar to SODIU
M-INDEPENDENT ORGANIC ANION TRANSPORTER //Length =
3725 //Score = 529 (85.4 bits), //Expect = 1.4e-1
6, P = 1.4e-16 //Identities = 247/392 (63%), Posit
ives = 247/392 (63%)

【０１８８】（８） m15H04（配列番号：１１０）は、
Genbankアクセス番号MMU37222の Musmusculus 30kDa ad
ipocyte complement-related protein Acrp30 mRNA, co
mplete cdsと66％の相同性を示す。タンパク質の配列で
比較するとWO99/07736ではリポ蛋白質をモヂュレートす
る方法および薬物成分として、脂肪分解（lipolysis）
を昂進させるリセプターの活性を阻害したり活性化する
物質、ポリペプチドについて言及しているが、平滑筋細
胞の分化や脱分化に関する記述はない。 >gb|U37222.1|MMU37222 Mus musculus 30kDa adipocyte
complement-related protein Acrp30 mRNA, complete
cds //Length = 1276 //Score = 408 (67.3 bits), //E
xpect = 3.0e-09, P = 3.0e-09 //Identities = 152/22
8 (66%), Positives = 152/228 (66%)

【０１８９】（９） m18C05（配列番号：１１１）は、
ヒト43Kdaイノシトールポリフォスフェート5-フォスフ
ァターゼと73％の相同性を有し、ニワトリでのオルソロ
グであると考えられる。この遺伝子産物はフォスファチ
ジルイノシトールの代謝の最終段階のイノシトール1,4,
5 3リン酸（Ins(1,4,5)P3）を加水分解する酵素であ
る。心臓、脳、骨格筋で主に発現していることが知られ
ている。（J. Biol. Chem.269: 17305-17310 (1994）） >emb|Z31695.1|HSINPO5P H.sapiens mRNA for 43 kDa i
nositol polyphosphate5-phosphatase //Length = 2640
//Score = 645 (102.8 bits), //Expect = 6.0e-22, P
= 6.0e-22 //Identities = 217/297 (73%), Positives
= 217/297 (73%)

【０１９０】（１０） m18G02（配列番号：１１２）は
ニワトリバキュオールのプロトンポンプの触媒Aサブユ
ニットの2つ目のアイソフォームとして同定された遺伝
子である。相同性が見られた領域はサブユニットA1と共
通の領域であり、この遺伝子がA1をコードするのか、A2
をコードするのかは区別することはできなく、どちらの
可能性もある。（Proc Natl Acad Sci U S A 92(13):60
87-91 (1995)） >gb|U22076.1|GGU22076 Gallus gallus A2 isoform of
vacuolar H+-ATPase subunit A mRNA, complete cds //
Length = 3986 //Score = 452 (73.9 bits), //Expect
= 4.4e-13, P = 4.4e-13 //Identities = 108/118 (91
%), Positives = 108/118 (91%)

【０１９１】（１１） m21E10（配列番号：１１３）は
アクチンに結合する蛋白質であるニワトリtensin遺伝子
をコードする遺伝子である。(J Mol Biol Sep 20;227
(2):593-5 (1992)) >emb|X66286.1|GGTENS G.gallus mRNA for tensin //Le
ngth = 4881 //Score =2503 (381.6 bits), //Expect =
1.4e-106, P = 1.4e-106 //Identities = 505/509であ
る。 (99%), Positives = 505/509 (99%)

【０１９２】（１２） nbcf235（配列番号：１１４）
は、ラットhelix-destabilizing proteinと67％の相同
性を有しており、この蛋白質、あるいは72％の相同性を
示すヒトheterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1
(HNRPA1)のニワトリでのオルソログであると考えられ
る。RNA ポリメーラーゼIIにより合成された転写物は、
細胞質のmRNAとなる前に核内で40Sのリボヌクレオプロ
テインのパーティクルを形成しているが、hnRNP A1また
はhelix-destabilizing proteinはその構成蛋白質の1つ
である。細胞質外へのmRNAの輸送に関与しているという
報告もある。（J Biol Chem 261(8):3536-43 (1986), J
Mol Biol 207(3):491-503 (1989)） >gb|M12156.1|RATHDP Rat helix-destabilizing protei
n mRNA, complete cds //Length = 1696 //Score = 426
(70.0 bits), //Expect = 4.6e-12, P = 4.6e-12 //Id
entities = 214/318 (67%), Positives = 214/318 (67
%) >gi|4504444 ref|NM_002136.1| Homo sapiens heteroge
neous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRPA1) mRNA /
/Length = 1769 //Score = 336 (56.5 bits), //Expect
= 6.4e-08, P = 6.4e-08 //Identities = 128/177 (72
%), Positives =128/177 (72%)

【０１９３】（１３） ro01NP1_G06_040_47.seq（配列
番号：１１５）は、ラットubc2e ubiquitin conjugatin
g enzyme (E217kB) mRNAと93％の相同性を有しており、
この遺伝子のニワトリでのオルソログであると考えられ
る。ユビキチンコンジュゲート酵素はユビキチンを介し
た蛋白分解のユビキチンと基質となる蛋白質との共役を
触媒する酵素であり、蛋白質の分解に関わる。 (Bioche
m J 305 (Pt 1):125-32(1995)） >gb|U13176.1|RNU13176 Rattus norvegicus clone ubc2
e ubiquitin conjugating enzyme (E217kB) mRNA, comp
lete cds //Length = 915 // Score = 774 (122.2 bit
s), //Expect = 1.1e-28, P = 1.1e-28 //Identities =
162/173 (93%), Positives = 166/173 (95%) >dbj|AK001311.1|AK001311 Homo sapiens cDNA FLJ1044
9 fis, clone NT2RP1000947, highly similar to Human
E2 ubiquitin conjugating enzyme UbcH5B mRNA//Leng
th = 1732 //Score = 773 (122.0 bits), //Expect =
3.9e-28, P = 3.9e-28 //Identities = 161/171 (94%),
Positives = 165/171 (96%)

【０１９４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SOBUE, KENJI CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISYA <120> Novel genes associated with maintenance of smooth muscle cell differentiation. <130> C2-A0006Y1 <140> <141> <150> JP 2000-344379 <151> 2000-11-10 <160> 117 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1259 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 1 gtacactgga gamaaatgtg gnraargata atttaagcct ctcacttttt tgttgaagac 60 tgcactgctt gtggatttgt tttcattccc tattaatctt tgtgtttata tatttgtgca 120 gtcaactgat gtcctgtata catgaccctt ttccagccct gttgcctgcg gcaaagtcta 180 ttaatctgtt tagcatcatg actggtcttt cttaataaga gggtcattca atgacaaatt 240 atatatatat gtattcagtt taatgtcatt ttaaaagaga ttttcttaaa ggaacctcta 300 gcatattttt ttcaagttag tttatcgaga tcctttgcta gcaaatgacg atgtarttag 360 aataacttgc cgagaatcat tttaatgtwa tggcagcaca aagctacaaa gcagatttca 420 ccaagtctat taataatgat ccatgcmagg ctatttaggt taaaaatgga agtgcatcma 480 tttatttcaa actaagataa tgaattctca tgcaaacaca caaacctttt attatgttgc 540 taattgcgct tgataattgc tagcggammc mcwycaynca atgaaatgag cakgcattta 600 atactccnta ttyytaaaga ammccaatga agctgaaaaa agtctttgct tattaggata 660 gtttgncagt ttttttttyy wyttttcatt tagctctgtg ctatgaagtt actttcacat 720 ttgctcctcc tcctattkgk ggactacttt acagtagcat gccccatttt aaataactcg 780 tgctgaataa cagcagaaaa aaagtcccat gacagataat atgatacgtt gatatccagr 840 taagttgaat ccagaggcma taatttggaa ggtgacagtt cttcccaatt agggtgcaaa 900 acttgtaacy tcctaaatgc tgtttctgga tttcttgtaa tttatatggg aatgatgaga 960 gttacttcaa aaatataata aaaaaacaag agtttcttaa caaatggcta aacttatcta 1020 catggtcaga tgacagaaga atgaggactt tcctaagatt acagatgttt ggagagctaa 1080 ggcatgaaga aagtccactg aactccatgg agttgtttgg accagcaatg aatttagttt 1140 tttttcagag agcttgtcag atgaagtaat aaataaaatt aaggggcaac actttgttgt 1200 agctgaagtc tgagaaccag caatcagaat gagggaaaaa gggtaataca aagaagtac 1259 <210> 2 <211> 4714 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 2 gtcaaagtgc agtatttgct tcaataattg tttgtatatt tgcttacatc tggtcttcac 60 aagggaaatg cacgtgttta gtgggtgaaa atccataaat acatctgtac taactagaaa 120 ctcatgcaga aagctgtatg gaaatgcata aatctttgct tgctgttgac tgcaggctaa 180 gataagaata tttaggtttt aataactctg cctgaaagat tgtatgtttg catgcgtgtt 240 tatttcttca agtggagtag tgctttgagt tagccactgc agttctggac ttagtttcca 300 cccaaggaaa cagatacact ctcttgttac agaggtaaca agargtgttt tcattttaat 360 tctattttta taatttttgt tcagatgtca tcagttgagc tagaaattca gatgttatta 420 acaaagaggt ttaaatacaa gttgatgtca gccagtgtca ctttcttagg tcaacagatc 480 tcttcataat actgaggact taaagggaga tgtgaccttt gtcccttagt cccagtttgc 540 tcgagtacaa tgtaatgcta tggccacctt caactccatg ataagaaatg aatgagttaa 600 atttgtccac acgctgtgaa ctggtttact taaattggag taattaaggt tgaagttgat 660 ggactgacag cacaaagcct ggtggtgctc attttgtttg gcagggagtt gctaaattag 720 ccaaaatact gggagatgaa tttaaaaatc ataataaaag aatgatctgg gagagggaga 780 gtttgatatt aagccagcag aagataagct ctcatttctc tccttttagc tagatgaatt 840 cctgcatcca gttcactagg tagtgcaggt agatggtcag ggcctttaat twcaagacac 900 gctcaggagt crtatgggga actggaaggg ctgctgaagt gatggcagct ttggcttata 960 ttggctccct caccagtgtg aagtgcatgc atgtaattca ggtaaggtct gcttctgaat 1020 tttgggcagt attcctgttg gtgcatccca gtcctgctca tctcaggtgg attactctga 1080 aaccctcctc cgctctcaaa tgccttggaa acaggtagcc taaacttctg tcccatggcc 1140 atcttttcag gctcctaaaa gttggtttac atgggggaag rgggaatata taatctgttt 1200 aaaaatgagc acagcagtag aggaaggcaa agcccattgc tggctgtgtg ctctgtggcg 1260 gtacaaggca aagactctgc ttctgaggtg actgtctaaa ctccatgaca aatgaagggt 1320 taacaatgca tggatttcaa ggggctctgt tcagtttctt tttagttcta tttttatttt 1380 ttgttttatt ttatttgatt ttttttgttt gtttgtttaa tttctgtgtt ctggccacac 1440 ccaggagaac cgtctgcttt tgatttctcc ctttacggtt acatggtaaa ttttctttct 1500 cattcttcag agatggaaac gttcaaatac tctctctata catttattta tttatttatt 1560 ttgacactgc tcatcatgtt gcttgktatt tattgcagag tctgaggcca gactaaaagg 1620 gtgacagtta ctcggtctct tcaggccctt tgaataaacc tttgggtaaa aggggggctt 1680 agtctggccc tgcaaattgc tcacaagttc tgaaaatgtt tgctggggtt attcagtgcc 1740 cactgggtac attgaggctt acatttattt tctgcttgga agaagttccc ggcagttgtt 1800 ggtggagggg aaatgttgaa aaaatcagcc ttgttgttat aacagcctta tcaaatgcaa 1860 gctatttgta tcaattctag aaactttatg tcatcttttt tgtttttaac ccaggattgc 1920 atcttccctt cctctggctc catacatatt accatggggc aaaccagtac ctgctgtaga 1980 tctgagctag cagacattgg tcatctgcct cctgttctta tttttttctt tatggttaag 2040 acaaccttgg gagggagaac tgagaatgct ttgttgtata cgtttctagg tacaaattaa 2100 tccctattct ttgcaggtca tctgtgagaa ggaatttaaa atacacgtat aatttttctt 2160 ccccgcatca aaaatatgta tttaattgct gattttcaaa cttggaaata atagaaatgt 2220 caagcatggc tcacttattt ttcctgatga aaatttgaat gtctaagagt tgcattaaga 2280 agactaacca agcgggcaca aatattgact ctatcatagt cgactatgta aagtgttaat 2340 tcagcattga cgttaaatgg ttttcaacaa agagttgcat aagctaagga ctgatctgtg 2400 aataataaaa aatctggtta attagttatg ttgttcagaa tcaaattaac tctgttttaa 2460 ttcacattgt taattattcc tatctagtct gcatgtggat tgtaccctac cttgatttaa 2520 cttcctaaaa atgctgacaa ttccaagtca gtttaaagat atttgatgat aatgttataa 2580 aatcccttac agacttcatt aattgagaac aaatgtgaat ttaaatggtc ttaatttggt 2640 tctagtctgc acaggctaat gtctaaaaaa ttaccttccc tctgctctcc agctttcagt 2700 tcacagcatc acagaaaaca taaatcgtgc tcaggctctg caggattgtc tagaacaaac 2760 aaaaattttc atgtcaaagg agaagaggga aatggagatt gctgtcacag tcttttcctc 2820 ccctcctcct caaacctttt taaagatgct ttttccccca ttatatcgaa cagagggaaa 2880 cgtgttactc tatttctcag tctccccttg ctccgtgaga gttctttgaa gcagatacaa 2940 tacactgtcc cttcataatc agctttgtta ttataccacc ccccagttcc ctgcaacctc 3000 tttgagagat gcgtgtggtt ggactgattt attggccctg atctcttgta gctttgattt 3060 taattcattt caactgaaag catttgttgt tctgaaaaag gcaacagttg gttatctata 3120 tagcctttta tttcctttaa gctggagaaa agaaattatc tgaagtttta gattagaggc 3180 ttggcaccca aaaaggagag ctcttattgg tttcaatgtg acagtattgg catatccaag 3240 ttttggkttt cttttttttt tctttttttt gattactgct gttcctgaga gaggaaaaag 3300 aaaaaagaaa ggctacatta cattttacaa acatgtaacg gttttgtgct ggaagcctag 3360 ctgtggatga taaaggccag catgcacaag gcagcttctt aagactggtg tggtgcagcc 3420 ctttgaaaaa cacttaatgt gatggcttgc ttgtgtcttg ttgctaacag tgcctagaaa 3480 tcaagatggt attttttgag tatccacgca tcctgaccct gagcttcatg gagggcctgc 3540 caggctagca tgccatttcc ctgatacgac ataacttgca gttgatcact ttaactggtg 3600 ctctgcttaa tatcaggagt ttccattgca ttggatgcag acgttggtct tcctgcctgt 3660 gcattaaact gggatttgct ttatagtaag ccatagaagc cagttctcct cccattctta 3720 aggtaccctg aaagcaaaac acaggcaagt tttcagcttg gcccagctct ctgcagtggc 3780 atgaaaatca tctcctcgtg attgtctgta gtaaagcact atttcctaca agctaaattc 3840 ctaatcgcct tagtcgtaga tctgcttgac tgtcagcgca ctcacctccg tggaagtgag 3900 catgttttcc actgcccttg tacccaactg cttgagttga tggccatgtg agcatgtggg 3960 acaggagcat tgcatgcgcc ctcatagact gggtaaatct gaatcattgg tacaatcggg 4020 gggacacatt ggtagtccct gagcttattg ctgcatgttt tcttcaagct ttttagtgca 4080 tctaggcaga gatcatcacc acccatggta cagaggtttc catcttagaa caaacctaag 4140 taagatgggt ggcagtccct gaaggaggga acagtaggcc agaagtgcca gaaaagccct 4200 ctctttacca atagatctct gttgaggtgt tcaggtttac ctacaggttc aacatggcac 4260 aggtaggaaa ataaggaaac cagaacaaca ctaattgctc taaatcttca cgttgagtga 4320 ctttcttctc ctgacgctac ctagaagtcc tcctttctct cagggcccca tgcattatta 4380 gggaagtcat aggcctagaa gtagacgtga gttgtgccct gaagagtttg caagggatgc 4440 tttacaaaca gcccttccty tcagccgctc tccaaggtag gtgattatta atctctccat 4500 tttacaggtg ggaaaagcaa agttcagtgt ttgaattgcc caaagcttcg cggaattgct 4560 gctgccagga actcagatga cagtgaatgt tcaagagatc ggagtgctgt gctgtcctat 4620 cctgtgcccg gggcaggcag caggctcagc actgtgtgca tttgctgtca gggacagaac 4680 ctaacccgct tcctatgcca ggtttagttc tttg 4714 <210> 3 <211> 634 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 3 gtacgcggga atgctgtttt cttaattaaa tattatgcag cctaaattgg gcttttatat 60 ttccgacaac ataacacttt tgatctgaaa aaaaatgtgt ttcaaattat cttaccccag 120 ggatagaaga ctcaacggct tcatgctgta tttactcatt agacaaaatc cctgttcgca 180 attttccagt aaatactacg tgaaatattt cttatgttca ttaggcttca ctctgttcta 240 atttttatca gtgtttaaac aagtaatgtt gatttacatc tgcatgtagg agattagact 300 tagccgctta cactgctgaa gctctgtgtt catgttgctt tcagtatttt aagagcagaa 360 tttgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ararkrcagc tctcttccag gagttccaac 420 accaacaccc aaagagggca aagaaataga agcaaggaag gggaagcagt tcaaagtaag 480 aaacaactga gatgataact gggcagtatt gtggcagtgc cagcactgaa atccaacggc 540 tgcaggctgg aaattgtagc tctgcattaa cagaatacac cccaaaatcc aggtctgagc 600 acctgtaacc acatacacct gtatccacat acac 634 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 4 aggtacctcc tatatttgga gttttgccca taaaatagca tttggacatt gagttactaa 60 ttttgtgctc ccaagtgccc atttggctta ccagatataa gctggaaatg atagactgag 120 ctgttccttc taaatcttca gaatcctaaa actagtgaga gaccattagt tgcattcatg 180 cttgcttgtt taactcaaaa ataatgtttt agaagatttc tcagctatga tgcttcagga 240 ggctaaggaa tattgcagaa agattctcca aatcgtaact gymcaatcat ttatattgtn 300 caggaacaaa taactgttnt gtac 324 <210> 5 <211> 404 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 5 agtaaagggc tcttgtgagg actgctcatt tataaatgga atgatcaact gtcagaacct 60 tcatgagagt gagaaccagc actaaaggga actgccaatt tcttttctgg ggcactcagt 120 catttggcca gccgacattc ccaaggaatc acagtgaaag tgagttcaga acaacagcag 180 cagcctgctc atgaatccgg gagaacaata cacagcatta ataaatcatg tgcttttgcc 240 atggaaaaaa gatagcacag cccatttcct cttctgacaa ccacagcaaa gattcacctt 300 cactgcctac aagcaaaatg ataccatgca cttgggtttt gatactgtat aatttacttc 360 tgatttgttc atggaaaatt caaggggaga gttaaaaaaa aaaa 404 <210> 6 <211> 1715 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 6 acagtgagca gataactgtt tattattgca cgtattccag cagaacaacc gacaaaactc 60 cagacagcag tacatggatt gtagtacaca gcttgcaaaa tctgtgatga aggtattttt 120 gtgtgaagag tgaaacatat ctgcatcttc gtaagacctg aaaagtataa cacaatatcc 180 tattcaagtt ttgaaagcat gcaaattgag gtaaatctgt tattttgcat ctaagaaaac 240 gaaatcccta aggggctata tgtctgtgta tatatatatc catatcctca gtgcaatacg 300 gatatatttg tacgtcacat aaaagcaaaa ctacctactg ttctcagaat gttaataagg 360 aggaaagcac attacagtgt gcacatcaca tgcataaaaa acaggggcac gagcaggggg 420 gtaatctcaa cattgttgaa aaaagaccct tctttgtgct tggtgataaa taaaagcccc 480 tcaggtctct caacggaaat tgtctcggta gctaataaaa gcagctgacg tattgagagg 540 atgaacaagg ataaaatgcc aaaggcagca gagcctgggg tttgcaatac atttatattt 600 cmgaaaagaa aaaaaaaaaa 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tttcaggaat aacctcacct ctcccacaac 1500 agccaccctg cacgctctgc tgggaarggc tgtccgcttt gtttcggtga aaaagcagca 1560 ctggagcccc ctcacagctc agcactacga ggaggaggag gaggaaccyg tgggtataca 1620 ggggtattgt tcagtaagta cctcctttca attgtaactc gcaccatttt catagggaat 1680 cccgcggcca tggcggccgg gagcatgcga cgtcg 1715 <210> 7 <211> 797 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 7 cacacataca cacacgcaca tgcacacacc cctcaaactg cactgacatt tttgttttga 60 ccaaaagagt agatcctggg agtaagtgca aaatgcaaaa tcaactgaca gaaaatgctg 120 aacaaacagt atcataaaaa tacaaaatat ttatattact gaactattaa cagatgatgt 180 tctctgtttc tttaaaactt tggaaccaca tagccgattt cttaaatcta gtccatgcca 240 gcttccagaa ctattaatga tttagttagc ttcattcttt gatgcttcat caaagttttc 300 tacgagatct gggacatcat catcttcttc atcaatatct tcagattttg gtgctttact 360 gtccaacact tgtcttggga attgttcagc taacttcctg agacttgtta agctgcagca 420 ccaagctggc ttaagatgcc tggaagcatt tctgtgatcg gtttagcctc tgcatgacca 480 gtaattgcaa aagtgttagc agagagggat gcctgaacct tggggttgtt gaagtgaata 540 accgttccat 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caaatgttcc 540 tagaattttg agacaaagat tgttaaaaat taatgtatgt ctttgtttta ggcagaactg 600 gaaatattaa gtagtgagag tactatagtt tcccttttgc ctacataaaa gcattttaaa 660 attagtttta tgatttcttt gtaagcttta tttaaattca aagtcttttt cataacactt 720 aagagaaaga gccctttgta cttcttagta tctcttatat agtcccaaat atagtctgtg 780 gtttatttta ggaaaaacat caactctgaa tacctggaaa agtcaaaaga aaataaagtt 840 ggtaaaatga aaaatgtcca agtaagaaa 869 <210> 90 <211> 1472 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 90 atgtaataga ttttaaagtc tataatttat taagtacaaa agcaaattat ttaaaaaagc 60 acttgatcct aattttgtaa aaaattttta aaaagaaaaa ataaatccct gagagggttt 120 atgttacata cgaatgctgc tgtttactca gaggtagaat tataagaaat tttaattttc 180 tttatacttt aatgtgcttt ctagatttta tgctataagc ataactgctt ttatagtcag 240 aaaaaaagca aaataagata caacctattc ggggtaattt aaagaccctt ttcacacatt 300 tcaaaatgca gaattacaaa gtcaataact tttattaaca taatgatata aaaattttag 360 tgtgatatac agaattccca gagtaattct aaaacatttt aatgcacttc ttaaaatctt 420 aatttacaag acaccttgtc ttaccaccac tgacctttca 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ctgtccttag aagaaagggc 2160 atttttactt ttgaaccaaa aaagagaaaa aaaaatcaga agtgttgcat cttgaggcga 2220 attaactgta agacattttt aattatgact actgcaattt gacaccattt gaaataatca 2280 attcagagac actaaagatt tcacaatatt cattggtatt gtaaaaaaaa aatactattg 2340 tatggatttt tgtattgctg ttaagtattg ttttgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg 2400 gaacctcctg gggacatgtt atattttgaa gtgattaaac tatttaattg tgtgtctata 2460 ttttggagtg gaataatttc ttcattaaaa aatgttttta aaaacactaa aaaaaaaaaa 2520 a 2521 <210> 93 <211> 142 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 gtacaaaccc tttttacaag acaagagagt tatcactggt tgttacagat gacagagttg 60 ggtagatcat ttcagagcac cagcatatag tctcttcttc aattcctgtc aggtcagagt 120 aattaatcat aatcataatc at 142 <210> 94 <211> 340 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 gtactggtag ctgactctgg ggtctttgct gagcatgagc tctctgtgta gcttcacggg 60 aacttcactg tagtatgcta tcaatttcca tagcttttca tagttttctc gggtcattgg 120 acactcaaag tccaaggcaa ctgttgcatt tatgtcaata tctggaggat ccgtttggtt 180 caagtgaatc ttgtacacat ccattggttt cttgatgtca cagaccaagt tcaccatgtt 240 cccgtgctcg tcggtcatat tcaaagagat gctccactgg ggcagttgga atttctccag 300 gatgagctgc tgccaccatc ctcttcctgt tcttgctcct 340 <210> 95 <211> 326 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 atgtgaggaa caacagaagc atcattaagc aacttaaaga tgtgtttgaa agggactggt 60 attcaccgta tgccaaaacc ttacagccaa ccaaacagcc gaactgctca agcctgttca 120 aactcaaacc cctctccaac aaaactgcca cagacgacac aggcggaaag gatccccgga 180 acgtataaca tgatgaagaa actgacagga cagctctgta tttcatattt atacataaag 240 gacttgagga gagaaaaaac actttaatat gtctcttttt ttagggaaaa agcacactta 300 taaaaaatat tctctgaaca acacat 326 <210> 96 <211> 631 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 tgggcaaaat catctaacac aatgcttatt ttataatgaa gtgttgaata tctcatgtaa 60 tttattgaat attatcctga aagtgaaaaa acatatatat atgtatatat aaagtctaca 120 cacatgaata tactctcaca cagatctata cacctgtata tactatatat acatacatcg 180 gcatacacac acacactcac acacacacat gcataaagat aggctctgca gtatttttta 240 taatagtgaa attttaaaat cagagtttat aaaaagaggg aaaaggtcaa ttttatgtaa 300 ttttccaaaa tgtaaaaagc atatttttac atatttagga atctacatta aattactaat 360 gtgtagattt gttctcagcc tatcttttaa aggttaacat agcatctaca ggttatattc 420 taaaaacaat acttgtacaa caatataatg atataatttt ggtaattact cttttgaaaa 480 actttaattt ctgattcaca tgtaagtcat cactacaaat cctgagaatg agttcagtta 540 acaagaatca aaagattcat cacatcttaa ctcaataatc agaatttcaa ctcatatagg 600 tagtaaacaa agaattcagt tgtttttttt t 631 <210> 97 <211> 319 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 ttcaatatgt tcatatttta attcacaatg gaaaaatgtg ttccaaaact ggaaactcat 60 agtactcgtg taaactgtgg aagatttcaa atgtgatgtt attttgacaa tgttttaaat 120 tttagagtca cattttattc tgatcagaat ttttattgag atgttgagct tttgtttttg 180 aaactagttt gtcataacat gtgcataatc acagtattta ttttctagga caattgtgaa 240 tgtgtagact tatgtttact gctaagggaa caattattta taaaataata ttaaatccag 300 tattagctgc ctatttcag 319 <210> 98 <211> 518 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 98 gtactcattt taaatgtctg tagctcctta tgaagtcaga cactctactc accagcaaga 60 tggatcatca tcagggaatt acggggccaa acctgctctc gcatgttcaa ctcttagtcg 120 gtctctttca gtggagcggg agcagccaga cagcagtgcc cactactcag atgacccttg 180 gaggataact gaggagcagc gagactacta tgtcaaccag ttcaagtccc ttcagcccga 240 tctgaactcc tttatttcag gttccgtggc aaagaatttc ttcacgaaat caaagctgcc 300 catcccagag ctttmtcaca tctgggagct gagtgatgtg gattgcgatg gggcgctgac 360 actccctgag ttttgtgctg ctttccatct ggtggttgca aggaagaatg gttaccagtt 420 gccmgagaca ctgcctgaga cactgctgcc agactacctc caagcagcct ccttgaagcc 480 tctgcatgag tgtgcgctgt tcgattctta ctctgagc 518 <210> 99 <211> 671 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 99 tggkkgggcc ctctagatgc atgstcgagc ggcncgccag tgtgatggat atctgcagaa 60 ttcgccctta gcgtggtcgc ggccgaggta ccatggcctg gtaggaggtg ctagccttgt 120 tcctggactg ggaagcaaag atggaaaatt ccccaggaaa gaattggctg ggacttaagg 180 tcattttgag gtggttaagg caccttactc ctggctagtt ggttaatctg ttctatacat 240 catgttgtgt gtatttaaat gaccacgtct gacaggcaag tgctacatcg tggacacgat 300 gcttttcaaa tagctccagc tggtggcact ttatcaaaag gtttacacaa cctttaaaaa 360 ctgttcttta ttctcatgag tcaatctggg acaaatccag ttttttgttt ttgttttttc 420 ctgacattga taaactgtaa atttttttta aggccaatgt atatattgta aatgtgattt 480 attatatata tttactagcc agaaccgcaa gtcttgtacc tgcccgggcg gncgctcgaa 540 gggcgaattc cagcacactg gcggccgtac taagtggatc cgagctcgga ccaagcttga 600 tgcatagctt gagtattcta tagtgtcacc taaatagctt ggcgnaatca tgggggtaaa 660 wngtttttcm a 671 <210> 100 <211> 345 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 100 gtactttttt tttttttttt tttttttaac aaaaaatcag tttattaatg tttagaagtc 60 aacaaagcta tgtgcaaatt gaacaacaga agtcagaaac atattaaata ctatttttta 120 aaccagaaaa aaaaaaacaa tttaattgca ctggaaattt tactacaaaa gcaatatttt 180 ttatttttta ttttattttt ttacaaaata ccacttctag gagttacagt ccataactgt 240 aaatcagtca gttgctctca gctatcccag atataccact tttgttatag taatactcta 300 ggtgcgtgaa gactcctgta tctcactaac ttatttacat tgtac 345 <210> 101 <211> 1237 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 101 tttttttttt tttttttttt ccttttcccc tgtgagaaga atgtgaagtt atttttcctt 60 tacttgcagc aaaccactga cacaaagctc tttctgtact gggtttagtg atggctcgta 120 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ggatagctga gagcaactga ctgatttaca gttatggact gtaactccta 1020 gaagtggtat tttgtaaaaa aataaaataa aaaataaaaa atattgcttt tgtagtaaaa 1080 tttccagtgc aattaaattg tttttttttt tctggtttaa aaaatagtat ttaatatgtt 1140 tctgacttct gttgttcaat ttgcacatag ctttgttgac ttctaaacat taataaactg 1200 attttttgtt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagtac 1237 <210> 102 <211> 1746 <212> DNA <213> Gallus gallus <220> <221> CDS <222> (251)..(1387) <400> 102 gagaagcagt ggtaacaacg cagagtacgc ggggaggggt taaaaaggag ggttaggagc 60 ctccgcccca ggagcattaa aactgcctgg ccccggccgg ctgctggagt cgctcagcgg 120 cactcaggat gcggacgctg tatgcgggcg gcgcggtgcg gctgagcgag gactgcagtt 180 tgtgagcgtg tgcagaagtg ctgggaactg cggggccacc acaggtttgc gttctgtgtc 240 tggcggcacc atg agc tct ggc acc acc gcc cca gtg agg gtg gtc agc 289 Met Ser Ser Gly Thr Thr Ala Pro Val Arg Val Val Ser 1 5 10 agc ctc acc aac act gac gtc aac tac gtc atc aaa gag cac tat aat 337 Ser Leu Thr Asn Thr Asp Val Asn Tyr Val Ile Lys Glu His Tyr Asn 15 20 25 tac acg gga aag cta aat gag aat gca gac agt gga ata aaa gtc acg 385 Tyr Thr Gly Lys Leu Asn Glu Asn Ala Asp Ser Gly Ile Lys Val Thr 30 35 40 45 tcg gtg ggt ttt atc ata att tgc tgc ttt ata atc tta gag aac att 433 Ser Val Gly Phe Ile Ile Ile Cys Cys Phe Ile Ile Leu Glu Asn Ile 50 55 60 ttt gtc ttg ctc acc atc tgg aaa acc aag aaa ttt cac aga ccg atg 481 Phe Val Leu Leu Thr Ile Trp Lys Thr Lys Lys Phe His Arg Pro Met 65 70 75 tac tat ttc att ggg aac ctg gct ctt tca gac ttg ttg gct ggc gtg 529 Tyr Tyr Phe Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala Gly Val 80 85 90 gct tac act gcc aac ctc ctg ctc tcc gga cac aaa act tac agc ctt 577 Ala Tyr Thr Ala Asn Leu Leu Leu Ser Gly His Lys Thr Tyr Ser Leu 95 100 105 acc cct tcc cag tgg ttc gta agg gag ggc agc atg ttt gtt gcc ttg 625 Thr Pro Ser Gln Trp Phe Val Arg Glu Gly Ser Met Phe Val Ala Leu 110 115 120 125 tca gct tct gtg ttc agc ttg ttg gcc atc gcc att gag aga tac atc 673 Ser Ala Ser Val Phe Ser Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg Tyr Ile 130 135 140 acc atg ctg aag atg aag ctc cac 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365 cct gaa acc atc atg tct tca ggc aac gtt acc tca tct tct 1387 Pro Glu Thr Ile Met Ser Ser Gly Asn Val Thr Ser Ser Ser 370 375 taggagtgac catggaggtg tgtttagagc cttcctctga aactgggagc tgaggcacct 1447 tctgctcgct gcagcagtgc tgggctgagg agcgagtatc attagttcta acgaggccaa 1507 tggtgcactt gtgaggctgg agttcaagaa aatgggacac gctgttctkg ctcaaaagtc 1567 tatttccctg gagcatgttt tgtctttgca ctgaggcagc tcaggattgt caggcgcatt 1627 catatcctga aatctcctta gtaactctga aagactgatg ctttggggaa gtgatgccta 1687 gtgtgtgcaa gagaatgaga gtgggggaat aggcaaagag agaattaatc ttttttttt 1746 <210> 103 <211> 379 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 103 Met Ser Ser Gly Thr Thr Ala Pro Val Arg Val Val Ser Ser Leu Thr 1 5 10 15 Asn Thr Asp Val Asn Tyr Val Ile Lys Glu His Tyr Asn Tyr Thr Gly 20 25 30 Lys Leu Asn Glu Asn Ala Asp Ser Gly Ile Lys Val Thr Ser Val Gly 35 40 45 Phe Ile Ile Ile Cys Cys Phe Ile Ile Leu Glu Asn Ile Phe Val Leu 50 55 60 Leu Thr Ile Trp Lys Thr Lys Lys Phe His Arg Pro Met Tyr Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Gly Asn Leu Ala Leu Ser Asp Leu Leu Ala Gly Val Ala Tyr Thr 85 90 95 Ala Asn Leu Leu Leu Ser Gly His Lys Thr Tyr Ser Leu Thr Pro Ser 100 105 110 Gln Trp Phe Val Arg Glu Gly Ser Met Phe Val Ala Leu Ser Ala Ser 115 120 125 Val Phe Ser Leu Leu Ala Ile Ala Ile Glu Arg Tyr Ile Thr Met Leu 130 135 140 Lys Met Lys Leu His Asn Gly Ser Asn Ser Phe Arg Ser Phe Leu Leu 145 150 155 160 Ile Ser Ala Cys Trp Val Ile Ser Val Ile Leu Gly Gly Leu Pro Ile 165 170 175 Met Gly Trp Asn Cys Ile Ser Leu Leu Ser Asn Cys Ser Thr Val Leu 180 185 190 Pro Leu Tyr His Lys His Tyr Ile Leu Phe Cys Thr Thr Val Phe Thr 195 200 205 Gly Leu Leu Leu Ser Ile Val Val Leu Tyr Cys Arg Ile Tyr Ser Met 210 215 220 Val Arg Thr Arg Ser Arg Arg Leu Thr Phe Arg Lys Asn Ile Thr Lys 225 230 235 240 Ala Thr Arg Ser Ser Glu Lys Ser Leu Ala Leu Leu Lys Thr Val Ile 245 250 255 Ile Val Leu Ser Ala Phe Ile Ala Cys Trp Ala Pro Leu Phe Ile Leu 260 265 270 Leu Leu Leu Asp Val Gly Cys Arg Val Lys Thr Cys Pro Ile Leu Tyr 275 280 285 Lys Ala Glu Tyr Phe Leu Val Leu Ala Val Leu Asn Ser Ala Thr Asn 290 295 300 Pro Ile Ile Tyr Thr Leu Thr Asn Lys Glu Met Arg Arg Ala Phe Ile 305 310 315 320 Lys Ile Leu Cys Cys Cys Lys Cys Pro Pro Thr Asp Ser Gly Thr Lys 325 330 335 Phe Lys Arg Pro Ile Ile Gly Gly Met Glu Phe Ser Arg Ser Lys Ser 340 345 350 Asp Asn Ser Ser His Pro Gln Lys Glu Glu Gly Asp Arg Pro Glu Thr 355 360 365 Ile Met Ser Ser Gly Asn Val Thr Ser Ser Ser 370 375 <210> 104 <211> 702 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 104 gtgcagtgtt ctgtaaatca gtgtagaaaa attccatatg acgttcagaa tttctgtagc 60 cctggactac ggaagaggct gaagtcattt cggtgttctc ttctgggaaa gatcccaggc 120 atttcccttt ttcccgtccg gttgctgata gaaaggaagg caatgttccc atcttcacag 180 agaggttttt tgcccttcca tacagtggaa aaagtattgt ggtcacagtg gttacctggt 240 gaaaatagac gagatgttcc agaaggagta gaactggaca gtaagcatca atgcagatat 300 gggggccttg atcacaccag tcaaacscca ttggcactta acagattaaa gtaacttctg 360 cagagaagag gaagtgaagg gagggcagtg ttactctcct ctttgcccaa agaaatatta 420 agaatgaaac ttaagctttc ctcgtgatag 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gag tat caa atg atg ttg 241 Ser Asp Pro Glu Met Thr Glu Glu Glu Lys Glu Tyr Gln Met Met Leu 65 70 75 80 ctg aca aaa atg ctt cta aca gaa att ctg ctg gat gtc aca gat gaa 289 Leu Thr Lys Met Leu Leu Thr Glu Ile Leu Leu Asp Val Thr Asp Glu 85 90 95 gaa att tat tac gta gcc aaa gat gca cac cgc aaa gca acg aaa gct 337 Glu Ile Tyr Tyr Val Ala Lys Asp Ala His Arg Lys Ala Thr Lys Ala 100 105 110 cct gca aaa cag ctg gca cag tcc agt gca ctg gct tcc ctc act gga 385 Pro Ala Lys Gln Leu Ala Gln Ser Ser Ala Leu Ala Ser Leu Thr Gly 115 120 125 ctc ggt gga ctg ggt ggt tat gga tca gga gac agt gaa gat gag agg 433 Leu Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Gly Asp Ser Glu Asp Glu Arg 130 135 140 agt gac aga gga tct gag tca tct gac act gat gat gaa gaa tta cgg 481 Ser Asp Arg Gly Ser Glu Ser Ser Asp Thr Asp Asp Glu Glu Leu Arg 145 150 155 160 cat cga atc cgg caa aaa cag gaa gct ttt tgg aga aaa gaa aaa gaa 529 His Arg Ile Arg Gln Lys Gln Glu Ala Phe Trp Arg Lys Glu Lys Glu 165 170 175 cag cag cta tta cat gat aaa cag 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actgctgctg gccctaagtg gcacagagat ggctgaccag 600 gctgaccagt ccgaccccaa aatgtcatgt gccaactgga tgggaggagc acctggacac 660 cctggccaca atgggctgcc tggaagggac ggcaaggatg gaaaagatgg acaaaaggga 720 gacaaaggag agccaggtct acaaggtgtc aaaggggaca cgggtgaaaa gggtgccaca 780 ggtgcagaag gaccgagagg atttccagga cacatgggga tgaaggggca gaag 834 <210> 111 <211> 305 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 111 gtacggattg aactgttgag aaaacattct gcaagcagac accaaatcat ttcaatggta 60 gtgatttata ccaaaatcca gcataaatct aatgccatca cgcagtccat gaactctgta 120 gtgttctaaa ttaaatcaat aaaacataca tttgtgtttc atcaacagac tccctaatca 180 ccctttaatg ttgtatttag cggtgggaga aaaatgttac taacaggatg atagcatcgg 240 ccgcaccgag ccaccaacca gggcaagtta cggtcctttt tcttccttta accctgtatg 300 tgtac 305 <210> 112 <211> 118 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 112 gtacctggcc ctgaagtgtg accagttcaa acagtgttgc atgtatagtt gtgtgtggtg 60 cttttttgtt ttgtgtctca gttttcagtg ttgggattct gatgttcact gtgtgtac 118 <210> 113 <211> 509 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 113 gtacgtcacc tttttgtgtt gatttgttct ttggagaacc ttcccattcc catccctctt 60 tcctttgctg tcggtgttgc tgccttacag gaaggctcct gggggggtct cccatccgac 120 ctggcaatta tttggggggt ttggctgtgt tgctgtctgc tggagggatg caccctttgt 180 gcaatgagcg attcattccc attggatgta accaaccgaa tggatgtaac caaccgaatg 240 aagccaggtt ttggttgctc tggatgtaac atgtgctgat cgatggaaaa tcatagagct 300 gtggaattgt tggagttgga agggtctggt gggaagaaaa cccatctcca gcccctcctg 360 cagattgatg ccgcgggaag gggtcccacg agcagagcca ggctttgtcc cagcctccag 420 gaaacacctg gatgtggcca cagcctccgg gcattgattt tttagcagtg aaacagccaa 480 actggagcac accctgccca gcaggtcgg 509 <210> 114 <211> 314 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 114 gggacagggc aaagctgcag gttacccgag ctgtgaactc agccagctga cagctgtggc 60 gggggggggt ggctgcgacg tcaagacgtg cattagccag aagtctcctt tgcgaacagg 120 actgtaattg tgactcattg tataacaggt tcttttagtt ttctgtgccg tggaagcatt 180 ccttcaaacg agggctcccg ggagcctcgg ttttatttgc gcgcccgtgc tgtcgatcga 240 tcgctgactg taacaggaaa tgacgctgaa taaatgtgtc ctttggtttt ttttaaaaaa 300 aaaaaaaaaa aaaa 314 <210> 115 <211> 193 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 115 rtatgcgawg taattaaaga aattwtkgga taacctctac aaataaagct aggggaactc 60 tgggagagag aaagtccttt tgatttccat ttgactgctt tctatgagcc cacgcctcat 120 cttcccctgt gcacatgttt acctgacaca gcagtgctgc gtgttgtacc tcggccgcga 180 ccacgctann ann 193 <210> 116 <211> 2203 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (91)..(564) <400> 116 gtcgtctttc tgtctcggct gaggcagcca tctttctctt gccgcgtgct ggtgttggag 60 gaccctccct gcttcagatt taccaacagc atg aat caa gaa aag tta gcc aaa 114 Met Asn Gln Glu Lys Leu Ala Lys 1 5 ctt cag gct cag gtc cgg ata ggg ggc aag ggt aca gct cgc aga aag 162 Leu Gln Ala Gln Val Arg Ile Gly Gly Lys Gly Thr Ala Arg Arg Lys 10 15 20 aag aag gtg gta cat aga aca gcc aca gct gat gac aaa aag ctt cag 210 Lys Lys Val Val His Arg Thr Ala Thr Ala Asp Asp Lys Lys Leu Gln 25 30 35 40 agt tct cta aaa aaa ctg gct gtg aat aat ata gct ggt att gaa gag 258 Ser Ser Leu Lys Lys Leu Ala Val Asn Asn Ile Ala Gly Ile Glu Glu 45 50 55 gtg aac atg att aaa gat gat ggg aca gtt att cat ttc aac aat ccc 306 Val Asn Met Ile Lys Asp Asp Gly Thr Val Ile His Phe Asn Asn Pro 60 65 70 aaa gtc caa gct tcc ctt tct gct aat acc ttt gca att act ggt cat 354 Lys Val Gln Ala Ser Leu Ser Ala Asn Thr Phe Ala Ile Thr Gly His 75 80 85 gca gaa gcc aaa cca atc aca gaa atg ctt cct gga ata tta agt cag 402 Ala Glu Ala Lys Pro Ile Thr Glu Met Leu Pro Gly Ile Leu Ser Gln 90 95 100 ctt ggt gct gac agt tta aca agc ctt agg aag tta gct gaa cag ttc 450 Leu Gly Ala Asp Ser Leu Thr Ser Leu Arg Lys Leu Ala Glu Gln Phe 105 110 115 120 cca cgg caa gtc ttg gac agt aaa gca cca aaa cca gag gac att gat 498 Pro Arg Gln Val Leu Asp Ser Lys Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ile Asp 125 130 135 gag gaa gat gat gat gtt cca gat ctt gta gaa aat ttt gat gag gca 546 Glu Glu Asp Asp Asp Val Pro Asp Leu Val Glu Asn Phe Asp Glu Ala 140 145 150 tca aag aat gaa gct aac taaaagtttg gtttttggaa gctggcatgg 594 Ser Lys Asn Glu Ala Asn 155 actagattta acaaatcagc tatgtggttc caaagtttta cagacatgga gaacatcacc 654 tgttactagt tcagtaatat aaatattttg tatattaata atgctgtttg ttcagcattt 714 ttcggtcatt tgattttgca ttttgcactt cctcccagga tatttttttg gtcaaaatat 774 gaagtattgg tgcagtttga gggtgttttg gtttttgatt cctggttttt ttgttttttg 834 tttggggtat ttttggtgta tgtatgttta tgtatgtgtg tgggtatgtg tgtatacagt 894 ggagagcaaa ttggaaaaca gttctattta tcctcctccc tccccagtag aaataaaaaa 954 aatctttaca tttgttactt ttcttttccc cccgtaagac acagaattaa tggaaagtga 1014 gtatcttgga tttcaaatct gaagagattt ttaccattag tggtttgatt ttaatttgct 1074 tggttaacta tcatattttt catacacttc tctggattta aaatatcttg aggtattttg 1134 ccactggctt catgctggag taatgggtaa catatctttg gtatggttgc cttagattaa 1194 cttacctagt cagacccaga agaacttctt ttactagctt gcttcctaaa tgcctttttt 1254 cctctccttt tggtctccaa atggcctggt cagcttttgg taatattctt cctcatcttc 1314 cacctagctt gagaaggatg ttctccatat agagtttagc gagtgcctaa tccctccttt 1374 tgtaagattt tgttccctca gcttgaggaa caacttcatc ttcaactttt tatttctccc 1434 tgatgttaca gtttggtaga tttcaaactg gaatagctag catgtgcttg ctaaataatt 1494 ttatgccagc cttatcctgt atcctagctg ttcttaacag caggtacaaa aatgcctgtt 1554 tttcagcaag gttgaaattg ggaatgtcct tttgaatcag aagaaaatag gccatagact 1614 catctcccag cacaaatggg cattctatga aatggtactg gccctaggag gatttcctca 1674 accactctcc tactcttggc cttgaaccta cctctgggtt ggatcttact attgtagctg 1734 ctcactatac cctcctgcat gcttagaata atgctttgag gggagcactg gtaaaacaca 1794 gtatttattt ttttacctcc tttaagagga cttggaggta agttgcattc attcactcaa 1854 gtttccctct tgctgtctaa tagaagctta ctttttgcta tatcagcatt tgttacagcc 1914 aatatttaag gacaaaattt agaaaatata tcatttcctg gcccatcatc aaactaatac 1974 agcttaacct tgcagctacc aatttttgtg tcaagctaga tatctttatt tgatatctaa 2034 ggtgcaagac caacaatata ttaagagatc tgtagacatg aaggcaaagc tcttgtattt 2094 tttttcatcc aaacacctca atttatttta taaattcgtt catttttcct gttatgtttt 2154 atataatata tggactaaac aaaataaaat aacagtgcaa aagagaaac 2203 <210> 117 <211> 158 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Met Asn Gln Glu Lys Leu Ala Lys Leu Gln Ala Gln Val Arg Ile Gly 1 5 10 15 Gly Lys Gly Thr Ala Arg Arg Lys Lys Lys Val Val His Arg Thr Ala 20 25 30 Thr Ala Asp Asp Lys Lys Leu Gln Ser Ser Leu Lys Lys Leu Ala Val 35 40 45 Asn Asn Ile Ala Gly Ile Glu Glu Val Asn Met Ile Lys Asp Asp Gly 50 55 60 Thr Val Ile His Phe Asn Asn Pro Lys Val Gln Ala Ser Leu Ser Ala 65 70 75 80 Asn Thr Phe Ala Ile Thr Gly His Ala Glu Ala Lys Pro Ile Thr Glu 85 90 95 Met Leu Pro Gly Ile Leu Ser Gln Leu Gly Ala Asp Ser Leu Thr Ser 100 105 110 Leu Arg Lys Leu Ala Glu Gln Phe Pro Arg Gln Val Leu Asp Ser Lys 115 120 125 Ala Pro Lys Pro Glu Asp Ile Asp Glu Glu Asp Asp Asp Val Pro Asp 130 135 140 Leu Val Glu Asn Phe Asp Glu Ala Ser Lys Asn Glu Ala Asn 145 150 155

【０１９５】

【発明の効果】本発明により、平滑筋細胞の分化維持に
関与する新規な遺伝子、および該遺伝子によってコード
される蛋白質が提供された。該遺伝子は、平滑筋細胞が
分化型のフェノタイプを維持するのに伴って発現があ
り、脱分化によって発現が減少するものである。該遺伝
子および該蛋白質は、平滑筋細胞の異常増殖に起因する
疾病、例えば動脈硬化、心筋梗塞、大動脈瘤、脳卒中等
の虚血性の心疾患、脳血管障害、および血管性の痴呆症
に対する予防または治療のための医薬組成物としての応
用が期待される。

【０１９６】また、平滑筋細胞にきわめて類似した形質
を有するメサンギウム細胞、肺胞上皮細胞、周皮細胞、
伊東細胞が異常増殖した状態である糸球体腎炎、肺繊維
症、脳動脈硬化、肝炎等も、平滑筋細胞と同様なメカニ
ズムにより細胞の形質転換の結果引き起こされる疾患と
考えられることから、本発明の遺伝子および蛋白質は、
これらの慢性疾患に対する新しい治療薬としても期待さ
れる。

【０１９７】さらに本発明は、本発明の遺伝子の発現を
指標とすることによって、平滑筋細胞の異常増殖に起因
した上記の種々の疾患の新しい診断方法、および診断薬
を提供する。これにより、該疾患に対する迅速かつ適切
な治療が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】マクロアレイによる解析結果を示す図であ
る。Aorta(大動脈細胞)、Aorta (dedifferentiated)
(脱分化した大動脈細胞)、Gizzard SMC (砂嚢平滑筋細
胞)、Gizzard (dedifferentiated) (脱分化した砂嚢平
滑筋細胞)から得られたSMART cDNAを³³Pでランダムラベ
ルしたプローブにより、ニワトリESTのPCR産物をスポッ
トしたフィルターに対してハイブリダイゼーションを行
った。

【図２】ヒトEDG1とニワトリchEDG1aとのアミノ酸配
列の比較を示す図である。

【図３】ニワトリクローンfinal127に相同性を示すUn
iGene クラスター番号Hs.18368に属するEST111個を、ア
プライドバイオシステムズ社のAutoAssembler2.0を用い
て解析して3557塩基からなるコンティグと既知遺伝子、
HSPC306 262アミノ酸(GenBankアクセス番号AF161424)、
HSPC206 160アミノ酸(GenBankアクセス番号AF161379)、
DKFZp564B0769.1 299アミノ酸（GenBankアクセス番号
AL080186）と共に遺伝子の位置関係を示した図である。
新規に矢印で示した549アミノ酸からなる遺伝子が想定
された。

【図４】配列番号：７をアミノ酸に翻訳した配列とBA
B55342の配列との相同性検索の結果を示す図である。上
段の配列は配列番号：７をアミノ酸に翻訳した配列、下
段の配列はBAB55342の配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 25/28 ４Ｃ０８４１０１Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｃ０８６ 25/28 16/18 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/02 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者祖父江憲治大阪府茨木市東宮町４−４ (72)発明者林謙一郎大阪府三島郡島本町水無瀬２丁目８番２− 901 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB07 BB10 BB20 BB29 BB41 BB46 BB48 CB01 DA13 DA36 FA20 FB02 FB03 FB05 4B024 AA01 AA11 BA80 CA01 GA11 HA12 4B063 QA19 QQ08 QQ42 QQ79 QQ96 QR32 QR48 QS33 QS34 QX01 4B064 AG01 AG27 CA19 CC24 DA13 4B065 AA90Y AB01 AC12 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 BA01 BA02 CA41 NA14 ZA152 ZA362 ZA402 ZA452 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA15 ZA36 ZA40 ZA45 4H045 AA10 BA10 CA40 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載
のDNA。（ａ）配列番号：１から７９のいずれかに記載の塩基配
列のコード領域を含むDNA。（ｂ）配列番号：１から７９のいずれかに記載の塩基配
列によりコードされるアミノ酸配列において１若しくは
複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付
加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１から７９のい
ずれかに記載の塩基配列によりコードされるアミノ酸配
列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコードするDN
A。（ｃ）配列番号：１から７９のいずれかに記載の塩基配
列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、配列番号：１から７９のいずれかに記載の塩
基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と
機能的に同等な蛋白質をコードするDNA。
【請求項２】配列番号：１から７９のいずれかに記載
の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるペ
プチドの部分をコードするDNA。
【請求項３】請求項１または２に記載のDNAによりコ
ードされる蛋白質またはペプチド。
【請求項４】請求項１または２に記載のDNAが挿入さ
れたベクター。
【請求項５】請求項１または２に記載のDNA、または
請求項４に記載のベクターを保持する形質転換体。
【請求項６】請求項５に記載の形質転換体を培養し、
該形質転換体またはその培養上清から発現させた蛋白質
またはペプチドを回収する工程を含む、請求項３に記載
の蛋白質またはペプチドの製造方法。
【請求項７】請求項３に記載の蛋白質に結合する抗
体。
【請求項８】配列番号：１から７９のいずれかに記載
の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少
なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項９】請求項３に記載の蛋白質に結合する化合
物のスクリーニング方法であって、（ａ）該蛋白質また
はその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該蛋白質またはその部分ペプチドと被検試料との
結合活性を検出する工程、（ｃ）該蛋白質またはその部
分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工
程、を含む方法。
【請求項１０】平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患
の治療のための化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項３に記載の蛋白質若しくは下記（ｉ）から
（ｉｉｉ）のいずれかに記載のDNAによりコードされる
蛋白質またはそれらの部分ペプチドに被検試料を接触さ
せる工程、（ｂ）該蛋白質またはそれらの部分ペプチド
と被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）該蛋白
質またはそれらの部分ペプチドに結合する活性を有する
化合物を選択する工程、を含む方法。（ｉ）配列番号：８０から９９、１０２、１０５、１０
７から１１６のいずれかに記載の塩基配列のコード領域
を含むDNA。（ｉｉ）配列番号：８０から９９、１０２、１０５、１
０７から１１６のいずれかに記載の塩基配列によりコー
ドされるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ
酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ
酸配列を有し、配列番号：８０から９９、１０２、１０
５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩基配列によ
りコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同
等な蛋白質をコードするDNA。（ｉｉｉ）配列番号：８０から９９、１０２、１０５、
１０７から１１６のいずれかに記載の塩基配列からなる
DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
配列番号：８０から９９、１０２、１０５、１０７から
１１６のいずれかに記載の塩基配列によりコードされる
アミノ酸配列を含む蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコ
ードするDNA。
【請求項１１】請求項１に記載のDNA、請求項１０の
（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のDNA、または
これらDNAによりコードされる蛋白質を有効成分として
含有する平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の治療
薬。
【請求項１２】平滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患
を診断する方法であって、（ａ）該疾患の患者から細胞
試料を調製する工程、および（ｂ）該細胞における請求
項１に記載のDNA、または請求項１０の（ｉ）から（ｉ
ｉｉ）のいずれかに記載のDNAの発現を検出する工程、
を含む方法。
【請求項１３】下記（ａ）または（ｂ）に記載の蛋白
質に結合する抗体、または配列番号：１から９９、１０
２、１０５、１０７から１１６のいずれかに記載の塩基
配列からなるDNA若しくはその相補鎖に相補的な少なく
とも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、平
滑筋細胞の異常増殖に起因する疾患の診断薬。（ａ）請求項３に記載の蛋白質。（ｂ）請求項１０の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに
記載のDNAによりコードされる蛋白質。