JP2002212198A - 核酸の分離方法および核酸分離用担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 核酸を含有する試料から、迅速、簡便に高純
度核酸を大量に分離する方法およびこの分離に用いる固
体相を得る。 【解決手段】 水溶性有機溶媒の存在下、核酸を含む
試料と表面に凹凸を有する水不溶性固体相を接触させ、
核酸を前記固体相に吸着させることにより核酸を試料か
ら分離することを特徴とする核酸の分離方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する試
料から、迅速、簡便に高純度核酸を大量に分離する方法
およびこの分離に用いる固体相に関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸を含有する試料から核酸を得る方法
としては、フェノール・クロロホルム抽出法が古くから
利用されてきた。この方法はフェノール・クロロホルム
を用いて蛋白質、脂質等の水難溶性検体成分を変性、溶
解、または沈殿させ、核酸を水相に溶解する溶解度の違
いを利用する。また、有毒な有機溶媒を使用せず、カオ
トロピック溶液を利用して蛋白質、脂質等の夾雑物を水
相に可溶化し、核酸をシリカビーズに吸着させて、固相
で回収した後、核酸を水相に回収するBoom法などが知ら
れている。しかし、それらの方法では、抽出された核酸
をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の鋳型として使用す
る場合、または制限酵素で消化する場合、核酸溶液に残
存するフェノール・クロロホルムやカオトロピックイオ
ンにより、酵素反応が阻害されることがある。その場
合、エタノール沈殿や限外ろ過、カラムクロマトグラフ
ィー等より核酸の再度精製を施す必要があった。また、
フェノール・クロロホルムが有毒のため、使用場所、実
験設備の制限があり、かつ、数回も要する遠心分離のた
め、機械化での対応が難しかった。また、カオトロピッ
ク溶液とシリカ固体相を用いる方法では、処理できる検
体量が1ml未満であり、検体の容量が増えれば、回収さ
れる核酸純度が著しく低下する傾向にある。これは使用
するシリカ固体相の吸着能に起因する。シリカ固体相の
表面積を増やせば、カオトロピックイオンの残存量も固
体相の容量と共に増えるので、有効な回避策にはならな
い。また、特開平８−１７３１５９に示された様に、核
酸を含有する溶解物にカチオン性の高分子であるポリエ
チレンイミンを添加して、核酸との水不溶性の塩を形成
させ、沈殿物を回収する方法が提案されているが、この
方法では、沈殿物から核酸を回収する方法として、水酸
化ナトリウム溶液などの強塩基性溶液を沈殿に加えてポ
リエチレンイミンと核酸とを解離させる操作、ポリエチ
レンイミンと核酸との再結合を防ぐためにアニオン界面
活性剤の溶液を添加する操作、溶液のpHを中和する操作
が必要であり、簡便であるとは言い難い。また、水酸化
ナトリウム溶液などのアルカリの添加は核酸の加水分解
を招く危険があり、さらに、混在するポリエチレンイミ
ン、アニオン界面活性剤はPCR反応などの酵素反応を阻
害するが、除去することが困難であり、PCR反応に供す
る場合には、その阻害効果が無視できるまで希釈する必
要があるが、核酸含量が少ない場合はその検出を妨げか
ねなかった。また、核酸含有溶液をエタノール溶液で沈
殿し、ガラス棒で巻き取ることも古く知られている（例
えば、阿南功一編 基礎生化学実験法-2 丸善 1974)。
この方法はガラスと核酸の親和性に基づく因子もある
が、より決定的な要素は核酸沈殿物によるガラス棒への
物理的な、幾何学的な絡み合いが強い。つまり、核酸の
沈殿量が少ないとき、または、沈殿するほどの核酸量が
ないとき、同じエタノール溶液に核酸があっても、ガラ
ス棒による核酸の巻き取りはできない。核酸とガラス棒
の親和性が低い故に、巻き取った核酸の純度が低く、核
酸以外の蛋白質等の混入が見られるため、実質的な応用
はできなかった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来のフェノール
・クロロホルムのような有毒溶媒を使用せず、また、カオトロ
ピックのような腐食性試薬も使用せず、高純度核酸を迅
速、簡便、かつ自動化できる方法で血液、細胞、組織、
植物等のソースから大量に抽出、精製する手段を提供す
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、水溶性有機溶
媒の存在下、核酸を含む試料と表面に凹凸を有する固体
相（以下、単に「固体相」という）とを接触させ、核酸
を前記固体相に吸着させることにより核酸を試料から分
離することを特徴とする核酸の分離方法を提供するもの
である。

【０００５】本発明の固体相を形成する材料は水に不溶
であればよい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、
他のいかなる水可溶性組成を含む水溶液に溶解しない固
相を意味する。具体的に無機化合物、金属、金属酸化
物、有機化合物またはこれらを組み合わせた複合材料を
含む。無機化合物としては、ガラス、アルミナ、窒化珪
素など、金属としてはステンレス、ジルコニアなど、有
機化合物としてはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ
エチレン、ポリアミド、ポリメチルメタクリレートなど
のポリマーを挙げることができる。これらのなかでは有
機ポリマー、特にポリスチレンが好ましい。本発明の固
体相の表面凹凸は通常の表面粗さの最大高さ表現法で表
すと、その最大高さは0.005-100μｍにあることが好ま
しい。最大高さが0.005μｍ未満または100μｍを超える
と、核酸の初期析出物のサイズと合わず、効率的な核酸
抽出ができないため好ましくない。ここでいう最大高さ
とは、JIS規格（B0601)で定義されている表面粗さの表
現方法である。具体的には例えば、触針法で固体相表面
の粗さを測定し、得られた凹凸表面曲線の一部規準長さ
を選択し、その部分の最大凹凸部を含むように平行な２
直線を引き、この２直線の間隔を最大高さの値とするも
のである。本発明の固体相は使用する素材によって、表
面を凹凸化する方法が異なる。例えば、ガラスなどの無
機材料の場合、曇りガラスの製造方法であるフッ酸処理
をそのまま転用することができる。また、有機ポリマー
の場合、成形されたポリマー表面をサンドパーパーで研
磨する方法、または、研磨機にかける等の方法が利用で
きる。固体相表面に凹凸を持たせることにより、固体相
の比表面積を増やすことにもなる。本発明の固体相の形
状は粒子、チューブ、プレート、管、容器等が挙げら、
特に粒子が好ましい。粒子の形状としては、例えば球
形、立方形、楕円形、あるいは直方形等も用いることが
できる。本発明の固体相が粒子である場合、粒子のスト
ークス直径は通常0.01mm〜50mmであり、特に0.05〜15mm
が好ましい。粒子のストークス直径が0.01mm未満である
と、固体相の分散安定性が難しくなり、一方、50mmを超
えると、固体相のハンドリング、特に自動化におけるハ
ンドリングが現行機器での対応が困難となる。本発明で
いうストークス直径とは、固体相が粒子の場合の有効径
であり、球状以外の形状を持固体相の直径は、ストーク
ス法則に従って求められた直径を同一ストークス直径を
もつ球状担体の直径と見なした。

【０００６】本発明において水溶性有機溶媒は、メタノ
ール、エタノール、プロパノール、プロパノール、イソ
プロパノール、ブタノール、２−ブタノールからなる群
から選択される。その中で特にエタノール、イソプロパ
ノールが好ましい。これら水溶性有機溶媒の核酸抽出時
の濃度は20〜99重量%、好ましくは40〜95重量%である。
また、必要に応じて、水溶性有機溶媒に塩、界面活性剤
などを添加しても良い。例えば、ナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、またはドテシルスルホン酸ナト
リウムが挙げられる。添加する塩の濃度は、0.1〜50m
M、特に0.5〜10mMであることがより好ましい。塩濃度が
0.1mM未満になると、添加塩の核酸析出効果が小さくな
り、0.50mMを超えると、核酸以外の水親和性の高い蛋白
質等の析出も引き起こすので好ましくない。また、界面
活性剤の濃度は0.01〜1重量%、特に0.05〜0.5重量%であ
ることがより好ましい。界面活性剤の濃度が0.01重量%
未満になると、疎水性蛋白質のミセル効果が弱くなり、
1重量%を超えると、界面活性剤の析出を引き起こすので
好ましくない。なお、上記塩および界面活性剤の濃度は
試料と水溶性有機溶媒との総量を基準としたものであ
る。

【０００７】本発明の核酸を含む試料とは、血液、組
織、細胞培養液、細菌含有液からなる群から選ばれた検
体の細胞を溶解したものであり、具体的には、上記検体
から公知の方法で核酸含有細胞を分離する。例えば、血
液の場合、全血を遠心分離して、採取したパフィコート
（リンパ球より形成される層）を塩化アンモニアで溶血
した後、回収したリンパ球の細胞を溶解してから本発明
の試料として使用する。また、組織細胞を対象とする場
合に、それぞれの組織に適する公知の方法または市販キ
ットを使用することもできる。

【０００８】細胞の溶解操作は、検体細胞の種類によっ
て異なるが、公知の適応方法を用いることができる。例
えば浸透圧を利用する細胞膜破壊方法、物理的なエネル
ギーを利用する超音波法、界面活性剤を利用するなどの
化学的方法またはこれらの組み合わせを利用しても良
い。特に化学的方法によっては、添加する試薬よっては
核酸とガラスの親和力に影響を与えるものもあるので、
アニオン系界面活性剤、特にドデシルスルホン酸ナトリ
ウムが好ましい。界面活性剤の濃度は0.1〜10重量、特
に0.25〜5重量%が好ましい。また、核酸と蛋白質の分離
度を上げるために、細胞溶解物を蛋白質分解酵素で処理
することもできる。また、DNAとRNAの区別をより完成度
の高いものにするために、DNA分解酵素またはRNA分解酵
素を用いてDNAまたはRNAの消化を行ってから残りのRNA
またはDNAの抽出を実施しもよい。

【０００９】本発明では、水溶性有機溶媒の存在下、核
酸を含む試料と固体相とを接触させることによって、核
酸が固体相に吸着される。核酸を含む試料、固体相およ
び水溶性有機溶媒の混合順については限定されない。固
体相は、その形状および表面粗さによって異なるが、ビ
ーズ状の場合、一般的に試料５ｍｌにつき１〜２０個程
度使用することができる。核酸の固体相への吸着に要す
る時間は、水溶性有機溶媒、核酸を含む試料および固体
相を混合後、通常0.5〜20分、好ましくは5〜15分であ
る。また、吸着温度は10〜６０℃、好ましくは15〜40℃
である。特にゲノムのような長い核酸を抽出するとき、
吸着工程時間を長くすることが好ましい。吸着工程にお
いて反応液を攪拌する場合には、通常0.5〜20回転/分、
好ましくは1〜5回転／分の速度である。

【００１０】核酸の固体相への吸着工程が終了後、反応
液から固体相を分離し、分離した固体相を洗浄する。洗
浄液としては、吸着工程で使用した水溶性有機溶媒と同
じ溶媒であっても、その他の水溶性有機溶媒であっても
よい。また、核酸の固体相への吸着が維持できるなら、
必要に応じて水溶性有機溶媒濃度を低くしても良い。

【００１１】固体相に吸着した核酸は前記洗浄後、乾燥
する。乾燥温度は通常室温ないし６０℃が好ましく、乾
燥時間は5〜20分であることが好ましい。ここで、乾燥
方法としては風乾が好ましい。乾燥した固体相に滅菌蒸
留水Tris-塩酸/EDTA緩衝液を加え、攪拌することで固体
相に吸着した核酸を液層に溶出することができる。

【００１２】本発明の実施において核酸量が少ない時
に、バッチ法の実施が好ましいが、核酸量が多いとき、
核酸抽出率を上げるために、カラム方式が好ましい。使
用する固体相の粒径は実施形態によって選ぶことができ
る。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。な
お、本実施例中、部および％は重量換算である。 実施例１ 全血の試料の試料調製 ヘパリン入りの全血10mlを３０００回転x10分で遠心
し、血漿と血球を分離した。血漿を除去した後、パフィ
コート2mlを回収した。2mlパフィコートに8mlの0.2M塩
化アモニウムを加え、ゆっくり2-3回攪拌した後、氷水
に１０分静置し、溶血を行った。続いて3000回転ｘ５分
でリンパ球沈殿を回収し、回収リンパ球をPBSで２回洗
浄した後、細胞をカウントしたところ、10⁷/ｍｌであっ
た。 リンパ球の細胞溶解 上記で採取したリンパ球200ulを取り、20mM Tris-HCl
(pH8)/0.2MNaCl/0.2%SDS/10mM CaCl2/0.1%proteinase K
溶液を同量200ulを加えて、軽く攪拌した後に、50℃で
１時間インキュベートし、核酸含有試料を得た。光学顕
微鏡で確認したところ、この操作により、リンパ球の残
骸が殆ど無くなり透明な均一溶液となった。 核酸の分離 上記で得た核酸含有試料200μlを含むチューブにエタ
ノール溶液500μlを加え、ストークス直径６mmのポリス
チレンビーズ（イムノケミカル社製、表面粗さの最大高
さ５μｍ）を３ヶ加えて、室温で１０分ゆっくり回転攪
拌した。 続いて上澄を捨て、0.5mlの７０％エタノー
ルを加え、３回上下攪拌してから、上澄を捨てた。ポリ
スチレンビーズをチューブ内で１０間静置し、ポリスチ
レンビーズ周辺のエタノール溶液が蒸発したことを確認
してから、100μlのTE緩衝液を加え、室温で１０分イン
キュベートし、核酸の溶出を行った。回収されたDNA量
を260nmの紫外吸光度(A260)から算出し、純度を260nmと
280nmの吸光度の比(A260/A280)、及び0.8%アガロースゲ
ル電気泳動で確認し、さらに回収したDNA１μｇを０．
２単位の制限酵素HindIIIにより消化し、酵素処理後の
消化結果も電気泳動で確認した。

【００１４】実施例２ 実施例１において、実施例１エタノールのかわりにイ
ソプロプルアルコールを使用した以外の操作は実施例１
と全く同様に行った。回収されたＤＮＡ量を実施例１と
同様にして確認した。

【００１５】実施例３ 実施例１において、実施例１と同様の核酸含有試料を
200ulを含むチューブにプロパノール溶液500ulを加え、
直径10mmのアルミナボール（タキザワ理化社製、表面粗
さの最大高さ0.01μｍ ）を１ヶ加えて、室温で１０分
ゆっくり回転攪拌した以外は実験例１と全く同様に核酸
の分離を行った。回収されたＤＮＡ量を実施例１と同様
にして確認した。

【００１６】実施例４ 実施例１において実施例１で核酸含有試料200ulを含
むチューブにメタノール溶液2000ulを加え、直径20mmの
ジルコニアボール（ニッカドー社製、表面粗さの最大高
さ10μｍ ）を１ヶ加えて、室温で１０分ゆっくり回転
攪拌した以外は実験例１と全く同様に核酸の分離を行っ
た。回収されたＤＮＡ量を実施例１と同様にして確認し
た。

【００１７】実施例５ 実施例１において、実施例１で核酸含有試料を200ul
を含むチューブにペンタノール溶液200ulを加え、直径
0.5mmの窒化珪素ホ゛ール（井口盛栄堂、表面粗さの最大高
さ0.05μｍ ）を１０ヶ加えて、室温で１０分ゆっくり
回転攪拌した以外は実験例１と全く同様に核酸の分離を
行った。回収されたＤＮＡ量を実施例１と同様にして確
認した。

【００１８】参考例 実施例１で得たと同様の核酸含有試料を200ulをフェノール
・クロロホルム法で抽出した。抽出方法はMolecule Clo
ning(J. Sambrook著、CSH出版）に従った。回収された
ＤＮＡ量を実施例１と同様にして確認した。 比較例 実施例１において、実施例１核酸含有試料を200ulを
含むチューブにエタノール溶液2000ulを加え、直径6.4m
mのナイロンヒ゛ース゛（井口盛栄堂、表面粗さの最大高さ0.
005μｍ ）を３ヶ加えて、室温で１０分ゆっくり回転攪
拌した以外は実験例１と全く同様に核酸の分離を行っ
た。回収されたＤＮＡ量を実施例１と同様にして確認し
た。

【００１９】

【表１】

【００２０】

【発明の効果】ミクロンオーダーの凸凹は特に核酸の初
期段階析出物とサイズ的に合致するので、核酸と本発明
固相固体相のミクロ的な接触効果を著しくエンハンス働
きがある。本発明は水溶性有機溶媒中にある核酸と核酸
以外成分の析出速度の違い、析出物の形成速度の違いを
利用し、核酸の初期析出物を本発明の固相固体相表面に
吸着させ、他成分との分離を可能にした。本発明の核酸
の分離方法を用いることにより、試料から、迅速、簡便
に高純度核酸を大量に精製することができ、遺伝子工
学、遺伝子診断、遺伝子治療、ゲノム化学、ゲノム創薬
等の分野に広く応用ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 日方 幹雄 東京都中央区築地二丁目11番24号ジェイエ スアール株式会社内 (72)発明者 佐藤 功栄 茨城県猿島群総和町大字下大野字高谷2965 −37 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA02 HA11 HA19 HA20 4C057 AA05 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04 4D017 AA03 BA07 CA01 CA05 CA13 CB01

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水溶性有機溶媒の存在下、核酸を含む試
   料と表面に凹凸を有する水不溶性固体相を接触させ、核
   酸を前記固体相に吸着させることにより核酸を試料から
   分離することを特徴とする核酸の分離方法。
2. 【請求項２】 固体相の凹凸が最大高さ法で表した場合
   の表面粗さで0.005-100μｍであることを特徴とする請
   求項１記載の核酸の分離方法。
3. 【請求項３】 前記固体相がストークス直径0.01mm〜50
   mmの粒子であることを特徴とする請求項１記載の核酸の
   分離方法。
4. 【請求項４】 前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エ
   タノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノー
   ル、２−ブタノール、ペンタノール、2-ペンタノールか
   らなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載
   の核酸の分離方法。
5. 【請求項５】 表面に凹凸を有する水不溶性固体相から
   なる核酸分離用担体。