JP2002256064A - ３−ヒドロキシ−５−フェノキシ吉草酸ユニット及び３−ヒドロキシ−５−（４−シアノフェノキシ）吉草酸ユニットを含む新規なポリヒドロキシアルカノエート、およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 PHA及びその製造方法において,従来法ではほ
とんど含まれなかった3-ヒドロキシ-5-(4-シアノフェノ
キシ)吉草酸ユニットの含有量を高め,かつ３-ヒドロキ
シ-５-フェノキシ吉草酸ユニットをも含んだポリマー,
及びその製造方法を提供する。 【解決手段】 下記化学式[4][5]で示される化合物を含
む培地中で微生物を培養し,培養後の細胞から分離精製
することで,下記化学式[1]で示される3-ヒドロキシ-5-
(4-シアノフェノキシ)吉草酸ユニット,下記化学式[2]で
示される3-ヒドロキシ-5-フェノキシ吉草酸ユニットを
それぞれ１％以上含むPHAを得る。 【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規なポリヒドロキ
シアルカノエート(以下、ＰＨＡと略す場合もある)に関
する。また、ＰＨＡを生産し菌体内に蓄積する能力を有
する微生物を用いた当該ＰＨＡの極めて効率的な製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、多くの微生物がポリ-３-ヒド
ロキシ酪酸(以下、ＰＨＢと略す場合もある)あるいはそ
の他のＰＨＡを生産し、菌体内に蓄積することが報告さ
れてきた(「生分解性プラスチックハンドブック」,生分
解性プラスチック研究会編,(株)エヌ・ティー・エス,Ｐ
178-197)。これらのポリマーは従来のプラスチックと同
様に、溶融加工等により各種製品の生産に利用すること
ができる。さらに、生分解性であるがゆえに、自然界で
微生物により完全分解されるという利点を有しており、
従来の多くの合成高分子化合物のように自然環境に残留
して汚染を引き起こすことがない。また、生体適合性に
も優れており、医療用軟質部材等としての応用も期待さ
れている。

【０００３】このような微生物産生ＰＨＡは、その生産
に用いる微生物の種類や培地組成、培養条件等により、
様々な組成や構造のものとなり得ることが知られてお
り、これまで主に、ＰＨＡの物性の改良という観点か
ら、このような組成や構造の制御に関する研究がなされ
てきた。

【０００４】[１]まず、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３Ｈ
Ｂと略す)をはじめとする比較的簡単な構造のモノマー
ユニットを重合させたＰＨＡの生合成としては、次のも
のが挙げられる。

【０００５】(a)３ＨＢと３-ヒドロキシ吉草酸(以下３
ＨＶ)を含むもの 例えば、アルカリゲネス・ユウトロファス Ｈ16株(Ａlc
aligenes eutropus Ｈ16、ＡＴＣＣ Ｎo.17699)及びそ
の変異株は、その培養時の炭素源を変化させることによ
って、３-ヒドロキシ酪酸(以下、３ＨＢと略す場合もあ
る)と３-ヒドロキシ吉草酸(以下、３ＨＶと略す場合も
ある)との共重合体を様々な組成比で生産することが報
告されている(特表平６-１５６０４号公報、特表平７-
１４３５２号公報、特表平８-１９２２７号公報など)。

【０００６】特開平５-７４４９２号公報では、メチロ
バクテリウム属(Ｍethylobacteriuｍsp.)、パラコッカ
ス属(Paracoccus sp.)、アルカリゲネス属(Ａlcaligene
s sp.)、シュードモナス属(Pseudoｍonas sp.)の微生物
を、炭素数３から７の第一アルコールに接触させること
により、３ＨＢと３ＨＶとの共重合体を生産させる方法
が開示されている。

【０００７】(b)３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸(以
下３ＨＨx)を含むもの 特開平５-９３０４９号公報、及び、特開平７-２６５０
６５号公報では、アエロモナス・キャビエ(Ａeroｍonas
caviae)を、オレイン酸やオリーブ油を炭素源として培
養することにより、３ＨＢと３-ヒドロキシヘキサン酸
(以下、３ＨＨxと略す場合もある)との２成分共重合体
を生産することが開示されている。

【０００８】(c)３ＨＢと４-ヒドロキシ酪酸(以下４Ｈ
Ｂ)を含むもの 特開平９-１９１８９３号公報では、コマモナス・アシ
ドボランス・IＦＯ 13852株(Ｃoｍaｍonas acidovorans
IＦＯ 13852)が、炭素源としてグルコン酸及び１,４-
ブタンジオールを用いた培養により、３ＨＢと４-ヒド
ロキシ酪酸とをモノマーユニットに持つポリエステルを
生産することが開示されている。

【０００９】(d)炭素数６から 12 までの３-ヒドロキシ
アルカノエートを含むもの 特許公報第２６４２９３７号では、シュードモナス・オ
レオボランス・ＡＴＣＣ 29347株(Pseudoｍonas oleovo
rans ＡＴＣＣ 29347)に、炭素源として非環状脂肪族炭
化水素を与えることにより、炭素数が６から１２までの
３-ヒドロキシアルカノエートのモノマーユニットを有
するＰＨＡが生産されることが開示されている。

【００１０】(e)単一の脂肪酸を炭素源とした生合成。
生産物は(d)とほぼ同様 Ａppl.Ｅnviron.Ｍicrobiol,５８(２),746 (1992)に
は、シュードモナス・レジノボランス(Pseudoｍonas re
sinovorans)が、オクタン酸を単一炭素源として、３-ヒ
ドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキ
シオクタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 1：15：7
5：9)をモノマーユニットとするポリエステルを生産
し、また、ヘキサン酸を単一炭素源として、３-ヒドロ
キシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン酸、３-ヒドロキシオ
クタン酸、３-ヒドロキシデカン酸(量比 8：62：23：7)
をユニットとするポリエステルを生産することが報告さ
れている。

【００１１】これら(a)〜(e)はいずれも下記に示すよう
に、 (１)微生物による炭化水素等のβ酸化 (２)糖からの脂肪酸合成 により合成された、いずれも側鎖にアルキル基を有する
モノマーユニットからなるＰＨＡ、即ち、「usual ＰＨ
Ａ」である。

【００１２】(１)通常、ＰＨＡの生合成は、細胞内の様
々な代謝経路の中間体として生じる「Ｄ-３-ヒドロキシ
アシル-ＣoＡ」を基質とし、ＰＨＡシンターゼ(ＰＨＡ
synthase)により行われる。

【００１３】ここで、「ＣoＡ」とは「補酵素Ａ(coenzy
ｍe Ａ)」のことである。そして上記(d)(e)の先行技術
に記載されている様に、オクタン酸やノナン酸等の脂肪
酸を炭素源とした場合、ＰＨＡの生合成は、「β酸化サ
イクル」中に生じた「Ｄ-３-ヒドロキシアシル-ＣoＡ」
が出発物質として行われるとされている。

【００１４】以下に、「β酸化サイクル」を経由してＰ
ＨＡが生合成されるまでの反応を示す。

【００１５】

【化９】 (２)一方、グルコース等の糖類を基質とし、ＰＨＡを生
合成する場合は、「脂肪酸合成経路」中に生じた「Ｄ-
３-ヒドロキシアシル-ＡＣＰ」から変換された「Ｄ-３-
ヒドロキシアシル-ＣoＡ」が出発物質として行われると
されている。

【００１６】ここで、「ＡＣＰ」とは「アシルキャリア
プロテイン(acyl carrier protein)」のことである。前
記(e)において、原料の脂肪酸よりも鎖長の長い３ＨＡ
モノマーユニットはこの脂肪酸合成経路を経由している
と考えられる。

【００１７】[２]しかし、このような微生物産生ＰＨＡ
のより広範囲な応用、例えば機能性ポリマーとしての応
用を考慮した場合、アルキル基以外の置換基を側鎖に導
入したＰＨＡ「unusual ＰＨＡ」が極めて有用であるこ
とが期待される。置換基の例としては、芳香環を含むも
の(フェニル基、フェノキシ基、ベンゾイル基など)や、
不飽和炭化水素、エステル基、アリル基、シアノ基、ハ
ロゲン化炭化水素、エポキシドなどが挙げられる。

【００１８】(f)このうち、不飽和炭化水素については
前記[１]の延長線上にある次の報告がある。

【００１９】Int.Ｊ.Ｂiol.Ｍacroｍol.,１６(３)、119
(1994)には、シュードモナス sp.61-3株(Pseudoｍonas
sp.61-3 strain)が、グルコン酸ナトリウムを単一炭素
源として、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシヘキサン
酸、３-ヒドロキシオクタン酸、３-ヒドロキシデカン
酸、３-ヒドロキシドデカン酸といった３-ヒドロキシア
ルカン酸及び、３-ヒドロキシ-５-cis-デセン酸、３-ヒ
ドロキシ-５-cis-ドデセン酸といった３-ヒドロキシア
ルケン酸をユニットとするポリエステルを生産すること
が報告されている。この文献では前記(２)の脂肪酸合成
経路を利用した合成について詳述されている。

【００２０】[３]「unusual ＰＨＡ」の中でも、特に、
芳香環を有するＰＨＡの研究が盛んになされている。

【００２１】(g)フェニル基もしくはその部分置換体を
含むもの Ｍakroｍol.Ｃheｍ.,１９１，1957-1965(1990)及びＭac
roｍolecules,２４，5256-5260(1991)には、５-フェニ
ル吉草酸を基質として、シュードモナス オレオボラン
ス(Pseudoｍonas oleovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェ
ニル吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産すること
が報告されている。

【００２２】より詳細には、シュードモナス・オレオボ
ランスが５-フェニル吉草酸(以下、ＰＶＡと略す場合も
ある)とノナン酸とを基質として(モル比２:１、総濃度
10ｍｍol/L)、３ＨＶ、３-ヒドロキシヘプタン酸、３-
ヒドロキシノナン酸、３-ヒドロキシウンデカン酸、３-
ヒドロキシ-５-フェニル吉草酸(以下、３ＨＰＶと略す
場合もある)をモノマーユニットとして、0.6：16.0：4
1.1：1.7：40.6 の量比で含むＰＨＡを、培養液１Lあた
り 160ｍg(菌体に対する乾燥重量比 31.6％)生産し、ま
た、ＰＶＡとオクタン酸とを基質として(モル比１:１、
総濃度 10ｍｍol/L)、３ＨＨx、３-ヒドロキシオクタン
酸、３-ヒドロキシデカン酸、３ＨＰＶをモノマーユニ
ットとして、7.3：64.5：3.9：24.3の量比で含むＰＨＡ
を、培養液１Lあたり 200ｍg(菌体に対する乾燥重量比
39.2％)生産することが報告されている。この報告にお
けるＰＨＡは、ノナン酸やオクタン酸が用いられている
ことからも主にβ酸化経路を経て合成されているものと
考えられる。

【００２３】Ｍacroｍolecules,２９，1762-1766(1996)
には、５-(４'-トリル)吉草酸を基質として、シュード
モナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovorans)が３
-ヒドロキシ-５-(４'-トリル)吉草酸をユニットとして
含むＰＨＡを生産することが報告されている。

【００２４】Ｍacroｍolecules,３２，2889-2895(1999)
には、５-(２',４'-ジニトロフェニル)吉草酸を基質と
して、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas o
leovorans)が３-ヒドロキシ-５-(２',４'-ジニトロフェ
ニル)吉草酸及び３-ヒドロキシ-５-(４'-ニトロフェニ
ル)吉草酸をユニットとして含むＰＨＡを生産すること
が報告されている。

【００２５】(h)フェノキシ基もしくはその部分置換体
を含むもの 側鎖にフェノキシ基をもつＰＨＡは、通常の側鎖が脂肪
族炭化水素であるＰＨＡに比べて熱的に特に安定であ
り、ポリマーの性状としても優れているため、フェノキ
シ基に置換基を導入することで更なる機能性を付与しよ
うとする試みがなされてきている。

【００２６】Ｍacroｍol.Ｃheｍ.Ｐhys.,１９５，1665-
1672(1994)には、11-フェノキシウンデカン酸を基質と
して、シュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas o
leovorans)が３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸と３-
ヒドロキシ-９-フェノキシノナン酸のＰＨＡコポリマー
を生産することが報告されている。

【００２７】また、Ｍacroｍolecules,２９,3432-3435
(1996)には、シュードモナス・オレオボランスを用い
て、６-フェノキシヘキサン酸から３-ヒドロキシ-４-フ
ェノキシ酪酸及び３-ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサ
ン酸をユニットとして含むＰＨＡを、８-フェノキシオ
クタン酸から３-ヒドロキシ-４-フェノキシ酪酸及び３-
ヒドロキシ-６-フェノキシヘキサン酸及び３-ヒドロキ
シ-８-フェノキシオクタン酸をユニットとして含むＰＨ
Ａを、１１-フェノキシウンデカン酸から３-ヒドロキシ
-５-フェノキシ吉草酸及び３-ヒドロキシ-７-フェノキ
シヘプタン酸をユニットとして含むＰＨＡを生産するこ
とが報告されている。この報告におけるポリマーの収率
を抜粋すると以下のとおりである。

【００２８】

【表１】 特許第２９８９１７５号公報には、３-ヒドロキシ-５-
(モノフルオロフェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＭＦ
Ｐ)Ｐ)ユニットあるいは３-ヒドロキシ-５-(ジフルオロ
フェノキシ)ペンタノエート(３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐ)ユニッ
トからなるホモポリマー、少なくとも３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐ
ユニットあるいは３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐユニットを含有する
コポリマー；これらのポリマーを合成するシュードモナ
ス・プチダ；シュードモナス属を用いた前記のポリマー
の製造方法が記載されている。

【００２９】これらの生産は以下の様な「二段階培養」
で行われている。 培養時間： 一段目、24時間 ； 二段目、96時間 各段における基質と得られるポリマーを以下に示す。 (１)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐホモポリマー 一段目の基質:クエン酸、イーストエキス 二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸 (２)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐホモポリマー 一段目の基質:クエン酸、イーストエキス 二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸 (３)得られるポリマー:３Ｈ５(ＭＦＰ)Ｐコポリマー 一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イースト
エキス 二段目の基質:モノフルオロフェノキシウンデカン酸 (４)得られるポリマー:３Ｈ５(ＤＦＰ)Ｐコポリマー 一段目の基質:オクタン酸あるいはノナン酸、イースト
エキス 二段目の基質:ジフルオロフェノキシウンデカン酸 その効果としては、置換基をもつ中鎖脂肪酸を資化し
て、側鎖末端が１から２個のフッ素原子で置換されたフ
ェノキシ基を有するポリマーを合成することができ、融
点が高く良い加工性を保ちながら、立体規則性、撥水性
を与えることができるとしている。

【００３０】この様なフッ素基置換体以外に、シアノ基
やニトロ基の置換体の研究もなされている。

【００３１】Ｃan.J.Ｍicrobiol.,４１，32-43(1995)及
び Polyｍer International,39,205-213(1996)には、シ
ュードモナス オレオボランス(Pseudoｍonas oleovoran
s)ＡＴＣＣ 29347 株及びシュードモナス プチダ(Pseud
oｍonas putida)ＫＴ 2442株を用いて、オクタン酸とp-
シアノフェノキシヘキサン酸或いはp-ニトロフェノキシ
ヘキサン酸を基質として、３-ヒドロキシ-p-シアノフェ
ノキシヘキサン酸或いは３-ヒドロキシ-p-ニトロフェノ
キシヘキサン酸をモノマーユニットとして含むＰＨＡの
生産が報告されている。

【００３２】これらの報告は側鎖がアルキル基である一
般的なＰＨＡとは異なり、いずれもＰＨＡの側鎖に芳香
環を有しており、それに由来する物性を有するポリマー
を得る上で有益である。

【００３３】

【発明が解決しようとする課題】この中で、シアノフェ
ノキシ基を有するＰＨＡに関しては、シアノ基が様々な
機能性を発現させる、或いは更なる変換反応にも用いる
ことができる等、非常に重要な官能基であると考えられ
る。しかしながら、３-ヒドロキシ-p-シアノフェノキ吉
草酸ユニットを含むＰＨＡでは、その導入割合は１％以
下に過ぎず、また、融点やガラス転移点が低く、非常に
柔らかいといった、物性的にも不十分なものしか得られ
ていなかった。

【００３４】本発明の目的は３-ヒドロキシ-p-シアノフ
ェノキ吉草酸ユニットをこれまで以上に含有しかつプラ
スチックとしての物性を兼ね備えた新規なＰＨＡ及びそ
の生産方法を提供することにある。

【００３５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため鋭意研究の結果、以下に示す発明に至っ
た。

【００３６】即ち、本発明の第一は、化学式[１]に示さ
れる、３-ヒドロキシ-５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸
ユニット及び化学式[２]に示される、３-ヒドロキシ-５
-フェノキシ吉草酸ユニットをそれぞれ１ユニット％以
上同時に含む新規なポリヒドロキシアルカノエートであ
る。

【００３７】

【化１０】

【００３８】

【化１１】 本発明のポリヒドロキシアルカノエートにおいて、化学
式[１]に示されるユニット及び化学式[２]に示されるユ
ニット以外のユニットは、化学式[３]で示される直鎖状
３-ヒドロキシアルカン酸ユニットである。

【００３９】

【化１２】 本発明のポリヒドロキシアルカノエートは、数平均分子
量が 10000 から 300000 の範囲であるポリヒドロキシ
アルカノエートである。

【００４０】本発明の第二は、化学式[４]で示される、
５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸及び化学式[５]で示さ
れる５-フェノキシ吉草酸を含む培地中で、それぞれの
化合物に由来するユニットを含有するポリヒドロキシア
ルカノエートを合成しうる微生物を培養する工程を有す
る微生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシア
ルカノエートの製造方法である。

【００４１】

【化１３】

【００４２】

【化１４】 好ましくは、前記微生物を培養する工程ののち、該培養
した微生物の細胞からポリヒドロキシアルカノエートを
回収する工程を含むものである。

【００４３】即ち本発明者らは、前記の合成系を有する
菌株を、ポリペプトンやグルコース等を基質として、末
端に直鎖脂肪族アルキル以外の官能基が付加された脂肪
酸である５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸、及び５-フ
ェノキシ吉草酸と共に培養したところ、３-ヒドロキシ-
５-シアノフェノキシ吉草酸ユニット及び３-ヒドロキシ
-５-フェノキシ吉草酸ユニットがそれぞれ少なくとも１
％以上同時に含まれる「unusual ＰＨＡ」が得られるこ
とを見出し、本発明に至ったものである。

【００４４】また、本発明では、微生物が生産した該Ｐ
ＨＡを単離する工程を更に有することが好ましい。

【００４５】本発明のＰＨＡは、一般にＲ-体のみから
構成され、アイソタクチックなポリマーである。

【００４６】以下に、本発明において利用される微生
物、培養工程等について説明する。

【００４７】(微生物)本発明の方法で用いる微生物は、
化学式[４]及び[５]で示される化合物を含む培地中で培
養することにより化学式[１]及び[２]で示すユニットを
同時に１％以上含むポリエステルを生産しうる微生物で
あれば如何なる微生物であってもよい。また、本発明の
目的を達成できる範囲内で、必要に応じて複数の微生物
を混合して用いることもできる。その一例としては、シ
ュードモナス(Pseudoｍonas)属に属する微生物が挙げら
れる。さらに詳しくは、微生物がシュードモナス・チコ
リアイ ＹＮ2株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ2；ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ-7375)、シュードモナス・チコリアイ Ｈ45株(P
seudoｍonas cichorii Ｈ45、ＦＥＲＭ ＢＰ-7374)、シ
ュードモナス・ジェッセニイＰ161株(Pseudoｍonas jes
senii Ｐ161、ＦＥＲＭ ＢＰ-7376)が挙げられる。これ
ら３種の微生物は経済産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されており、特願平１１-３７１８６３
号に記載されている微生物である。

【００４８】以下にＹＮ2株、Ｈ45株及びＰ161株につい
ての詳細を示す。 ＜ＹＮ２株の菌学的性質＞ (１)形態学的性質 細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.5〜2.0μｍ 細胞の多形性 :なし 運動性 :あり 胞子形成 :なし グラム染色性 :陰性 コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表
層なめらか、光沢、半透明 (２)生理学的性質 カタラーゼ :陽性 オキシダーゼ :陽性 Ｏ/Ｆ試験 :酸化型(非発酵性) 硝酸塩の還元 :陰性 インドールの生成 :陽性 ブドウ糖酸性化 :陰性 アルギニンジヒドロラーゼ :陰性 ウレアーゼ :陰性 エスクリン加水分解 :陰性 ゼラチン加水分解 :陰性 β-ガラクトシダーゼ :陰性 Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性 ４％ＮaＣlでの生育 :陽性(弱い生育) ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性(＊) Ｔｗeen80の加水分解 :陽性 ＊ nutrient agar培養コロニーをズダンブラックで染
色することで判定。 (３)基質資化能 ブドウ糖 :陽性 Ｌ-アラビノース :陽性 Ｄ-マンノース :陰性 Ｄ-マンニトール :陰性 Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陰性 マルトース :陰性 グルコン酸カリウム :陽性 n-カプリン酸 :陽性 アジピン酸 :陰性 dl-リンゴ酸 :陽性 クエン酸ナトリウム :陽性 酢酸フェニル :陽性 ＜Ｈ45株の菌学的性質＞ (１)形態学的性質 細胞の形と大きさ :桿菌、0.8μｍ×1.0〜1.2μｍ 細胞の多形性 :なし 運動性 :あり 胞子形成 :なし グラム染色性 :陰性 コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表
層なめらか、光沢、クリーム色 (２)生理学的性質 カタラーゼ :陽性 オキシダーゼ :陽性 Ｏ/Ｆ試験 :酸化型 硝酸塩の還元 :陰性 インドールの生成 :陰性 ブドウ糖酸性化 :陰性 アルギニンジヒドロラーゼ :陰性 ウレアーゼ :陰性 エスクリン加水分解 :陰性 ゼラチン加水分解 :陰性 β-ガラクトシダーゼ :陰性 Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性 ４％ＮaＣlでの生育 :陰性 ポリ-β-ヒドロキシ酪酸の蓄積 :陰性 (３)基質資化能 ブドウ糖 :陽性 Ｌ-アラビノース :陰性 Ｄ-マンノース :陽性 Ｄ-マンニトール :陽性 Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性 マルトース :陰性 グルコン酸カリウム :陽性 n-カプリン酸 :陽性 アジピン酸 :陰性 dl-リンゴ酸 :陽性 クエン酸ナトリウム :陽性 酢酸フェニル :陽性 ＜Ｐ161株の菌学的性質＞ (１)形態学的性質 細胞の形と大きさ :球状、φ0.6μｍ桿状、0.6μｍ×
1.5〜2.0μｍ 細胞の多形性 :あり(伸長型) 運動性 :あり 胞子形成 :なし グラム染色性 :陰性 コロニー形状 :円形、全縁なめらか、低凸状、表
層なめらか、淡黄色 (２)生理学的性質 カタラーゼ :陽性 オキシダーゼ :陽性 Ｏ/Ｆ試験 :酸化型 硝酸塩の還元 :陽性 インドールの生成 :陰性 ブドウ糖酸性化 :陰性 アルギニンジヒドロラーゼ :陽性 ウレアーゼ :陰性 エスクリン加水分解 :陰性 ゼラチン加水分解 :陰性 β-ガラクトシダーゼ :陰性 Ｋing'sＢ寒天での蛍光色素産生:陽性 (３)基質資化能 ブドウ糖 :陽性 Ｌ-アラビノース :陽性 Ｄ-マンノース :陽性 Ｄ-マンニトール :陽性 Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン :陽性 マルトース :陰性 グルコン酸カリウム :陽性 n-カプリン酸 :陽性 アジピン酸 :陰性 dl-リンゴ酸 :陽性 クエン酸ナトリウム :陽性 酢酸フェニル :陽性 (培養工程)本発明にかかるＰＨＡの製造方法に用いる微
生物の通常の培養、例えば、保存菌株の作成、ＰＨＡの
生産に必要とされる菌数や活性状態を確保するための増
殖などには、用いる微生物の増殖に必要な成分を含有す
る培地を適宜選択して用いる。例えば、微生物の生育や
生存に悪影響を及ぼすものでない限り、一般的な天然培
地(肉汁培地、酵母エキスなど)や、栄養源を添加した合
成培地など、いかなる種類の培地をも用いることができ
る。温度、通気、攪拌などの培養条件は、用いる微生物
に応じて適宜選択する。

【００４９】前記したようなＰＨＡ生産微生物を用い
て、３-ヒドロキシ-５-シアノフェノキシ吉草酸、及び
３-ヒドロキシ-５-フェノキシ吉草酸をモノマーユニッ
トとして含むＰＨＡを製造するためには、ＰＨＡ生産用
の原料として、該モノマーユニットに対応する、上記化
学式[４]で示される、５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸
と、上記化学式[５]で示される、５-フェノキシ吉草酸
と、微生物の増殖用炭素源とを少なくとも含んだ無機培
地などを用いることができる。５-(４-シアノフェノキ
シ)吉草酸、及び５-フェノキシ吉草酸は、それぞれ培地
あたり 0.01％から１％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.02％
から 0.2％の割合で含有していることが望ましい。

【００５０】これらの化合物の水溶性は必ずしも良好で
はないが、本発明に示す微生物を用いれば、懸濁された
状態であっても何ら問題は無い。また、場合によっては
１-ヘキサデセンやn-ヘキサデカンのような溶媒に溶解
或いは懸濁された形で培地中に含有されることも可能で
ある。この場合、該溶媒の濃度は培地溶液に対して３％
以下にすることが必要である。

【００５１】増殖用炭素源としては、酵母エキスやポリ
ペプトン、肉エキスといった栄養素を用いることが可能
であり、更に、糖類、ＴＣＡ回路中の中間体として生じ
る有機酸及びＴＣＡ回路から一段階ないしは二段階の生
化学反応を経て生じる有機酸或いはその塩、アミノ酸或
いはその塩等から用いる菌株に対する基質としての有用
性で適宜選択することができる。

【００５２】これらのうち、糖類としては、グリセロア
ルデヒド、エリスロース、アラビノース、キシロース、
グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース
といったアルドース、グリセロール、エリスリトール、
キシリトール等のアルジトール、グルコン酸等のアルド
ン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸、マ
ルトース、スクロース、ラクトースといった二糖等から
選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用できる。

【００５３】また、有機酸或いはその塩としては、ピル
ビン酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、オキサ
ロ酢酸、イソクエン酸、ケトグルタル酸、フマル酸或い
はその塩から選ばれる１つ以上の化合物が好適に利用で
きる。

【００５４】また、アミノ酸或いはその塩としては、グ
ルタミン酸、アスパラギン酸或いはその塩から選ばれる
１つ以上の化合物が好適に利用できる。これらの中で
は、ポリペプトンや糖類を用いるのが好ましく、また糖
類の中ではグルコース、フルクトース、マンノースから
なる群から選択される少なくとも一つであることがより
好ましい。これらの基質は通常培地あたり 0.1％から５
％(ｗ/v)、更に好ましくは 0.2％から２％の割合で含有
していることが望ましい。

【００５５】一例を挙げれば、Ｄ-グルコースを 0.1％
から 5.0％程度、および、５-(４-シアノフェノキシ)吉
草酸、及び５-フェノキシ吉草酸をそれぞれ 0.01％から
1.0％程度含んだ無機培地等で培養し、対数増殖後期か
ら定常期の時点で菌体を回収して所望のＰＨＡを抽出す
ることができる。Ｄ-グルコースの代わりに同量の酵母
エキスを与えても良い。

【００５６】微生物にＰＨＡを生産・蓄積させる方法と
しては、一旦十分に増殖させて後に、塩化アンモニウム
のような窒素源を制限した培地へ菌体を移し、目的ユニ
ットの基質となる化合物を加えた状態で更に培養すると
生産性が向上する場合がある。具体的には、前記の工程
を複数段接続した多段方式の採用が挙げられる。例え
ば、Ｄ-グルコースを 0.1％から 5.0％程度、および、
５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸、及び５-フェノキシ
吉草酸をそれぞれ 0.01％から 1.0％程度含んだ無機培
地等で対数増殖後期から定常期の時点まで培養し、菌体
を遠心分離等で回収したのち、５-(４-シアノフェノキ
シ)吉草酸、及び５-フェノキシ吉草酸をそれぞれ 0.01
％から 1.0％程度含んだ、窒素源を制限した、あるいは
ほとんど存在しない無機培地で更に培養する方法があ
る。

【００５７】培養温度としては上記の菌株が良好に増殖
可能な温度であれば良く、例えば 15〜40℃、好ましく
は 20〜35℃、更に好ましくは 20℃から 30℃程度が適
当である。

【００５８】培養は液体培養、固体培養等該微生物が増
殖し、ＰＨＡを生産する培養方法ならいかなる培養方法
でも用いることができる。さらに、バッチ培養、フェド
バッチ培養、半連続培養、連続培養等の種類も問わな
い。液体バッチ培養の形態としては、振とうフラスコに
よって振とうさせて酸素を供給する方法、ジャーファー
メンターによる攪拌通気方式の酸素供給方法がある。

【００５９】上記の培養方法に用いる無機培地として
は、リン源(例えば、リン酸塩など)、窒素源(例えば、
アンモニウム塩、硝酸塩など)等、当該微生物の増殖に
必要な成分を含んでいるものであればいかなるものでも
良く、例えば、ＭＳＢ培地、Ｍ９培地等を挙げることが
できる。

【００６０】本発明の一方法に用いた無機塩培地(Ｍ９
培地)の組成を以下に示す。

【００６１】[Ｍ９培地] Ｎa₂ＨＰＯ₄ ６.２g ＫＨ₂ＰＯ₄ ３.０g ＮaＣl ０.５g ＮＨ₄Ｃl １.０g (培地１リットル中、pＨ７.０) 更に、良好な増殖及びＰＨＡの生産のためには、上記の
無機塩培地に培地に以下に示す微量成分溶液を0.3％(v/
v)程度添加する必要がある。

【００６２】[微量成分溶液] ニトリロ三酢酸:1.5 ；ＭgＳＯ₄:3.0 ；ＭnＳＯ₄:0.5
；ＮaＣl:1.0 ；ＦeＳＯ₄:0.1 ；ＣaＣl₂:0.1 ；ＣoＣ
l₂:0.1 ；ＺnＳＯ₄:0.1 ；ＣuＳＯ₄:0.1 ；ＡlＫ(Ｓ
Ｏ₄)₂:0.1 ；Ｈ₃ＢＯ₃:0.1 ；Ｎa₂ＭoＯ₄:0.1 ；ＮiＣl
₂:0.1 (培地１リットル中、pＨ7.0) 本発明にかかる培養液からのＰＨＡの取得には、通常行
なわれている方法を適用することができる。ＰＨＡが培
養液中に分泌される場合は、培養液からの抽出精製方法
が、また、菌体に蓄積される場合は、菌体からの抽出精
製方法が用いられる。例えば、微生物の培養菌体からの
ＰＨＡの回収は、通常行われているクロロホルム抽出が
最も簡便であるが、クロロホルム以外にジオキサン、テ
トラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトンが用いら
れる場合もある。また、有機溶媒が使用しにくい環境中
においては、ＳＤＳ等の界面活性剤処理、リゾチーム等
の酵素処理、ＥＤＴＡ等の薬剤処理によってＰＨＡ以外
の菌体内成分を除去することによってＰＨＡのみを回収
する方法を採ることもできる。

【００６３】なお、本発明の微生物の培養、本発明の微
生物によるＰＨＡの生産と菌体への蓄積、並びに、本発
明における菌体からのＰＨＡの回収は、上記の方法に限
定されるものではない。

【００６４】以下に実施例を示す。なお、以下における
「％」は特に標記した以外は重量基準である。

【００６５】

【実施例】[実施例１]ポリペプトン 0.5％及び５-(４-
シアノフェノキシ)吉草酸、５-フェノキシ吉草酸をそれ
ぞれ 0.05％含有したＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート
上のＹＮ2株のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラ
スコで 30℃、24時間培養した。培養後、遠心分離によ
り菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後凍結乾燥し
た。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、60℃で 2
4時間ポリマーを抽出した。ポリマーが抽出されたクロ
ロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した後、
冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥し
て、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 170
ｍg、得られたポリマーの重量は 26ｍgであった。

【００６６】得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミ
エーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した
(東ソー ＨＬＣ-8220ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-Ｇ
ＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレ
ン換算)。その結果、ピークが２つ見られ、前者はＭn＝
2100000、Ｍｗ＝2600000 であり、後者はＭn＝71000、
Ｍｗ＝150000 であった。ＵＶ吸収(254nｍ)は後者のみ
にあったため、目的ポリマーは後者であることが示され
た。

【００６７】得られたポリマーの構造決定は、¹Ｈ-ＮＭ
Ｒによって行った(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400；¹
Ｈ共鳴周波数: 400ＭＨz；測定核種:¹Ｈ；使用溶媒:Ｃ
ＤＣl₃；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl₃；
測定温度:室温)。¹Ｈ-ＮＭＲチャートを図１に示す。そ
れぞれの帰属されたピークの積分値から計算したとこ
ろ、下記式に示すユニットの割合は、Ａ:Ｂ:Ｃ:Ｄ＝8：
25：5：62 であった。

【００６８】

【化１５】 [実施例２]グルコース 0.5％及び５-(４-シアノフェノ
キシ)吉草酸、５-フェノキシ吉草酸をそれぞれ 0.05％
含有したＭ９培地 200ｍLに、寒天プレート上のＹＮ2株
のコロニーを植菌し、500ｍL容振とうフラスコで 30
℃、72時間培養した。培養後、遠心分離により菌体を収
穫し、ＮＨ₄Ｃl成分を含まないＭ９培地に、グルコース
0.5％及び５-(４-シアノフェノキシ)吉草酸、５-フェ
ノキシ吉草酸をそれぞれ 0.05％を加えて調製した培地
に菌体を移し、30℃、50時間培養した。培養後、遠心分
離により菌体を収穫し、メタノールで洗浄した後凍結乾
燥した。乾燥菌体を秤量後、クロロホルムを加え、60℃
で 24時間ポリマーを抽出した。ポリマーが抽出された
クロロホルムをろ過し、エバポレーターにより濃縮した
後、冷メタノールで沈殿固化した部分を集め、減圧乾燥
して、目的とするポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 2
00ｍg、得られたポリマーの重量は 61ｍgであった。

【００６９】得られたポリマーの分子量は、ゲルパーミ
エーションクロマトグラフィー(ＧＰＣ)により測定した
(東ソー ＨＬＣ-8220ＧＰＣ、カラム:東ソー ＴＳＫ-Ｇ
ＥＬ ＳuperＨＭ-Ｈ、溶媒:クロロホルム、ポリスチレ
ン換算)。その結果、Ｍn＝76000、Ｍｗ＝180000 であっ
た。

【００７０】得られたポリマーの構造決定は、¹Ｈ-ＮＭ
Ｒによって行った(ＦＴ-ＮＭＲ:Ｂruker ＤＰＸ400；¹
Ｈ共鳴周波数:400ＭＨz；測定核種:¹Ｈ；使用溶媒:ＣＤ
Ｃl₃；reference:キャピラリ封入ＴＭＳ/ＣＤＣl₃；測
定温度:室温)。¹Ｈ-ＮＭＲチャートを図２に示す。それ
ぞれの帰属されたピークの積分値から計算したところ、
下記式に示すユニットの割合は、Ａ:Ｂ:Ｃ:Ｄ＝30：3：
10：54 であった。

【００７１】

【化１６】 [実施例３]菌株をＨ45株とした以外は実施例２と同様の
方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 180ｍg、得
られたポリマーの重量は 49ｍgであった。実施例１およ
び２と同様に¹Ｈ-ＮＭＲを測定した結果、下記式に示す
ユニットの割合は、Ａ:Ｂ:Ｃ:Ｄ＝14：9：9：68 であっ
た。

【００７２】

【化１７】 [実施例４]菌株をＰ161株とした以外は実施例２と同様
の方法でポリマーを得た。乾燥菌体の重量は 200ｍg、
得られたポリマーの重量は 53ｍgであった。実施例１お
よび２と同様に¹Ｈ-ＮＭＲを測定した結果、下記式に示
すユニットの割合は、Ａ:Ｂ:Ｃ:Ｄ＝20：5：9：66 であ
った。

【００７３】

【化１８】

【００７４】

【発明の効果】本発明の方法により、３-ヒドロキシ-５
-フェノキシ吉草酸ユニット及び３-ヒドロキシ-５-(４-
シアノフェノキシ)吉草酸ユニットを含む新規なポリヒ
ドロキシアルカノエートの生産が可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１におけるポリヒドロキシアルカノエー
トの¹Ｈ-ＮＭＲチャート及びその帰属を示す。

【図２】実施例２におけるポリヒドロキシアルカノエー
トの¹Ｈ-ＮＭＲチャート及びその帰属を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 本間 務 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 須川 悦子 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 (72)発明者 矢野 哲哉 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キヤ ノン株式会社内 Ｆターム(参考） 4B064 AC21 AD30 AE01 4J029 AA02 AB01 AB04 AC02 EB01 ED05A EF01

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 化学式[１]に示されるユニット及び化学
   式[２]に示されるユニットをそれぞれ１ユニット％以上
   同時に含むことを特徴とするポリヒドロキシアルカノエ
   ート。 【化１】 【化２】
2. 【請求項２】 化学式[１]に示されるユニット及び化学
   式[２]に示されるユニット以外のユニットが、化学式
   [３]で示されるユニットである請求項１に記載のポリヒ
   ドロキシアルカノエート。 【化３】
3. 【請求項３】 数平均分子量が１００００から３０００
   ００の範囲である請求項１または２に記載のポリヒドロ
   キシアルカノエート。
4. 【請求項４】 化学式[４]で示される化合物及び化学式
   [５]で示される化合物を含む培地中で、それぞれの化合
   物に由来するユニットを含有するポリヒドロキシアルカ
   ノエートを合成しうる微生物を培養する工程を有する微
   生物を培養することを特徴とするポリヒドロキシアルカ
   ノエートの製造方法。 【化４】 【化５】
5. 【請求項５】 前記微生物を培養する工程ののち、該培
   養した微生物の細胞からポリヒドロキシアルカノエート
   を回収する工程を含む請求項４に記載の製造方法。
6. 【請求項６】 該微生物が化学式[４]で示される化合物
   を化学式[１]で示されるユニットに、化学式[５]で示さ
   れる化合物を化学式[２]で示されるユニットに、それぞ
   れ変換する能力および、それぞれのユニットを１ユニッ
   ト％以上同時に含むポリヒドロキシアルカノエートを生
   産する能力を有する微生物である請求項４または５に記
   載の製造方法。 【化６】 【化７】
7. 【請求項７】 該ポリヒドロキシアルカノエートが化学
   式[３]で示されるユニットを含有するものである請求項
   ６に記載の製造方法。 【化８】
8. 【請求項８】 該微生物がシュードモナス(Pseudoｍona
   s)属に属する微生物である請求項４〜７のいずれかに記
   載の方法
9. 【請求項９】 該微生物がシュードモナス・チコリアイ
   ＹＮ２株(Pseudoｍonas cichorii ＹＮ２；ＦＥＲＭ
   ＢＰ-７３７５)である請求項８に記載の方法
10. 【請求項１０】 該微生物がシュードモナス・チコリア
    イ Ｈ４５株(Pseudoｍonas cichorii Ｈ４５、ＦＥＲＭ
    ＢＰ-７３７４)である、請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 該微生物がシュードモナス・ジェッセ
    ニイ Ｐ１６１株(Pseudoｍonas jessenii Ｐ１６１、Ｆ
    ＥＲＭ ＢＰ-７３７６)である、請求項８に記載の方
    法。