JP2002085078A - アルカリセルラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】 バチルス属細菌由来の特定のアミノ酸配
列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする
アルカリセルラーゼ遺伝子。上記アルカリセルラーゼ遺
伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを
含む形質転換体。更に宿主が微生物である形質転換体。 【効果】 本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いて
洗剤用アルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産するこ
とができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、衣料用洗剤等に配
合可能なアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】セルロースは地球上で最も豊富に存在す
るバイオマス資源である。１９７３年の石油ショック以
来、石油代替資源開発の一貫として、バイオマスを利用
した再生可能な生物資源を燃料用エタノール等のエネル
ギーや工業用素材、医療素材等への付加価値産物への変
換利用技術研究が、世界中の研究機関において多岐にわ
たり行われている。セルラーゼ利用の中で、環境負荷を
小さくするセルラーゼの衣料用洗剤への応用が考えられ
ていたが、従来のセルラーゼは中酸性領域のみで作用す
る酵素であり、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用でき
るものは知られていなかった。しかし、掘越（特公昭５
０−２８５１５号公報、Horikoshi & Akiba, Alkalophi
lic Microorganisms, Springer, Berlin, 1982）によっ
て好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラー
ゼが見出され、これまでに困難とされていたセルラーゼ
の衣料用重質洗剤への応用が可能となり、実際に好アル
カリ性バチルス属細菌の生産するアルカリセルラーゼ
（特公昭６０−２３１５８号公報、特公平６−０３０５
７８号公報、ＵＳ４９４５０５３等）が開発され、衣料
用洗剤へ配合されるに至った。衣料用洗剤へのアルカリ
セルラーゼの配合は、洗浄力を向上させるばかりでな
く、洗剤のコンパクト化にも貢献して広く定着してき
た。

【０００３】一般に、洗剤用酵素として優れた効果を発
揮するプロテアーゼ、アミラーゼ又は、リパーゼの共通
した特徴として、何れも高い等電点を有していることが
経験上認められ、等電点の高い酵素は洗浄力も高いと考
えられている。従って、洗剤用酵素としてのセルラーゼ
についても等電点の高い物が求められるが、これまでに
高い等電点を有するアルカリセルラーゼは一部のカビ(F
usariumu oxysporum)由来のものが見出されているだけ
で（ＷＯ９５／２４４７１号公報）、その等電点も９で
あり、洗浄力も十分ではない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
自然界から高等電点を有するアルカリセルラーゼを得る
べく種々のセルラーゼ生産菌をスクリーニングし、等電
点約９．３を有する新規な洗剤用アルカリセルラーゼを
見出し、特許出願を行った（特願２０００−５０１１
６）。本発明の目的は、この洗剤用酵素として有用なア
ルカリセルラーゼをコードする遺伝子を取得し、遺伝子
組換えにより大量かつ単一のアルカリセルラーゼを製造
し得る形質転換体を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、バチルス
エスピー ＫＳＭ−Ｎ２５７株と命名され、ＦＥＲＭＰ
−１７４７３として寄託されているアルカリセルラーゼ
生産菌からアルカリセルラーゼをコードする遺伝子をク
ローニングし、また遺伝子組換えによりアルカリセルラ
ーゼの生産性の優れた形質転換体が得られることを見出
した。

【０００６】本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列
又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠
失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする
アルカリセルラーゼ遺伝子を提供するものである。ま
た、本発明は、上記のアルカリセルラーゼ遺伝子を含有
する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転
換体を提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子は、配列番号１に
示すアミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列をコードする塩基配列を有する。アルカリセルラーゼ
活性を失わない限り、該アミノ酸配列中のアミノ酸の欠
失、置換又は付加（以下、変異ということがある）は特
に制限されない。また、配列番号１に示した成熟酵素の
アミノ酸配列（アミノ酸番号１番〜４０７番）における
アミノ末端には１〜数個のアミノ酸が付加、欠失、置換
していても構わない。

【０００８】本発明の配列番号１に示すアルカリセルラ
ーゼ（以下、Ｎ２５７セルラーゼと表記する）のアミノ
酸配列と従来公知のセルラーゼのアミノ酸配列とその相
同性を比較するとBacillus circulansの生産するセルラ
ーゼ(Bueno ら、Nucleic Acids Research 18, 4248, 19
90)との相同性が最も高く、７５．９％であり、Bacillu
s sp.ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ（Ozakiら、J.
Gen. Microbiol., 137, 41-48, 1991）と４４．４％、
Clostridium josui由来のセルラーゼ(EMBL D16670, G39
1654)とは、２７．８％であった。最も高い相同性を示
したBacillus circulans の生産するセルラーゼ（相同
性７５．９％）はエンドβ−１，３−１，４ グルカナ
ーゼ(EC3.2.1.73)に属するリケナーゼであり、本発明の
遺伝子からコードされるＮ２５７セルラーゼ(EC 3.2.1.
4)とは分類上異なる酵素である。また、Bacillus sp.Ｋ
ＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ(EC 3.2.1.4)は所謂、
酸性セルラーゼである。従って、本発明の遺伝子からコ
ードされるアルカリセルラーゼは新規な酵素である。な
お、相同性の検索はＧＥＮＥＮＴＹＸ−ＣＤバイオデー
タソフトウェア［ソフトウェア開発（株）製、ｖｅｒ．
３６］を用いたアミノ酸配列ホモロジー検索法にて行っ
た。

【０００９】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子は、配
列番号１に示すアミノ酸配列又はその変異体をコードす
るものであればよい。本発明のアルカリセルラーゼ遺伝
子は、例えばBacillus sp.（バチルス エスピー） Ｋ
ＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７４７３）等から
既知のショットガン法、ＰＣＲ法等を用いてクローン化
することにより得られる。

【００１０】また、本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子
を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複
製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることが
でき、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリ
セルラーゼ遺伝子を組込めばよい。かかるベクターとし
ては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２
２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主に
する場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４(Sumitomoら、B
iosci. Biotechnol, Biocem., 59, 2172-2175,1995)あ
るいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。

【００１１】かくして得られた組換えベクターを用いて
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテ
ントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行う
ことができる。宿主菌としては特に制限されないがBaci
llus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli
（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線
菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カ
ビ）等の真菌が挙げられる。

【００１２】得られた形質転換体は、資化しうる炭素
源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適
当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液
から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、
凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得
ることができる。

【００１３】

【実施例】実施例１ アルカリセルラーゼ生産菌のスク
リーニング 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０
分間熱処理し、以下の組成を有する寒天平板培地に塗布
した［２．０重量％（以下単に％と記載する）カルボキ
シメチルセルロース（Ａ１０ＭＣ）、１．０％肉エキス
（オキソイド社）、１．０％バクトペプトン（ディフ
コ）、１．０％塩化ナトリウム、０．１％リン酸２水素
カリウム、０．５％炭酸ナトリウム（別滅菌）］。３０
℃の培養器で３日間静置培養し、菌の生育後、０．１％
（ｗ／ｖ）コンゴーレッド溶液を注ぎ染色した。その
後、１Ｍの塩化ナトリウム溶液で脱色し、生育した菌の
周辺にカルボキシメチルセルロースの分解に伴う溶解斑
が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化
を繰り返した。これらの菌株を２．０％ポリペプトンＳ
（日本製薬）、１．０％魚肉エキス（和光純薬）、０．
１５％リン酸１水素カリウム、０．１％酵母エキス（デ
ィフコ）、０．０７％硫酸マグネシウム７水塩、０．１
％カルボキシメチルセルロース、０．５％炭酸ナトリウ
ム（別滅菌）から成る液体培地を用いて３０℃、３日間
振盪培養を行った。培養上清液を採り、Phast-system
（ファルマシア；IEFゲル、pH３．０−９．０）を用い
て等電点電気泳動を行った。泳動したゲルを１０mMリン
酸緩衝液（pH７．０）に浸した後、カルボキシメチルセ
ルロースを含む寒天プレート［１．０％カルボキシメチ
ルセルロース、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH９．０）、１．５％寒天］上に置いた。３０℃、
３時間放置後、ゲルを取り去り、０．１％コンゴーレッ
ド溶液を注いだ。約１０分後に１Ｍの塩化ナトリウム溶
液で脱色し、等電点の高い部分にカルボシキメチルセル
ロースの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選
抜し、Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株を取得した。

【００１４】Bacillus sp. KSM-N257株は、次の菌学的
性質を有していた。 Ａ．形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌（０．６〜０．８×
３．２〜６．８μｍ） （ｂ）多形性：無し （ｃ）運動性：有り （ｄ）胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無：楕円形、
０．８〜１．０×１．０〜１．６μｍ、準端位、膨潤有
り。 （ｅ）グラム染色：不定、但しクリスタルバイオレット
（ＣＶＴ）寒天培地には生育しない。 （ｆ）抗酸性：陰性

【００１５】Ｂ．生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元：陽性 （ｂ）脱窒反応：陰性 （ｃ）ＭＲテスト：陽性（ｐＨ５−５．５） （ｄ）ＶＰテスト：陰性 （ｅ）インドールの生成：陰性 （ｆ）硫化水素の生成：陰性 （ｇ）デンプンの加水分解：陽性 （ｈ）カゼインの加水分解：陰性 （ｉ）ゼラチンの液化：陰性 （ｊ）クエン酸の利用：陰性 （ｋ）カタラーゼ：陽性 （ｌ）オキシダーゼ：陽性 （ｍ）ウレアーゼ：陰性 （ｎ）生育の温度範囲：１３−１４℃ （ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ６−１０ （ｐ）生育における酸素の影響：嫌気条件下で生育す
る。 （ｑ）塩化ナトリウム耐性：１０％塩化ナトリウム存在
下で生育する。 （ｒ）グルコースからのガス産生：陰性 （ｓ）糖からの酸産生：グルコース、アラビノース、キ
シロース、マンニトール、ガラクトース、シュークロー
ス、マンノース、マルトース、ラクトース、トレハロー
ス、フラクトース、メリビオース、リボース、サリシ
ン、グリセロール、ラムノース等から酸産生が認めら
れ、ソルビトール、イノシトールから酸産生は認められ
ない。

【００１６】実施例２ Bacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２５
７株のゲノムＤＮＡの調製Bacillus sp. Ｎ２５７株の培養は、２％ポリペプトン
Ｓ（大日本製薬）、０．１％カルボキシセルロース（Ａ
１０ＭＣ）、０．１％酵母エキス（ディフコ）、１％魚
肉エキス、０．１５％リン酸１水素カリウム、０．０７
％硫酸マグネシウム７水塩、０．５％グルタミン酸ナト
リウム（別滅菌）及び０．５％炭酸ナトリウム（別滅
菌）から成る培地を用い、３０℃、４０時間振盪（１２
５rpm）して行った。得られた培養液約３００mLから遠
心分離（１２０００×ｇ、１５分、５℃）により菌体を
回収した。この菌体から斉藤・三浦の方法によりゲノム
ＤＮＡを調製した。

【００１７】実施例３ Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子断片
のクローニング （ａ）ゲノムＤＮＡの制限酵素処理 Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子の取得は、ＬＡ ＰＣＲ ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ（タカラ製）を
用いて行った。まず、Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株
ゲノムＤＮＡを以下の手順によりＥｃｏＲｌ処理による
部分分解処理を行った。即ち、ゲノムＤＮＡ１．５μL
（１μg）、１０倍濃度緩衝液１０μL、脱イオン水８
６．５μL、及びＥｃｏＲｌを２μL（２０units）混合
し、３７℃で３時間処理し、反応終了後、ＧＦＸ ＰＣ
Ｒ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製（２５
μL）した。

【００１８】（ｂ）ライゲーション反応 精製したゲノムＤＮＡのＥｃｏＲｌ分解フラグメント溶
液５μLに、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏ
ｎｉｇ ＫｉｔのＥｃｏＲｌカセット２．５μL（５０n
gＤＮＡ）、ライゲーション溶液Ｉ １５μL及びライゲ
ーション溶液II７．５μLを加え、１６℃で３０分間反
応した後、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡａｎｄ Ｇｅｌ Ｂ
ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔによりＤＮ
Ａを精製回収した。

【００１９】（ｃ）ＰＣＲによるＮ２５７セルラーゼ遺
伝子の増幅 ライゲーション精製溶液２０μLに脱イオン水１４．５
μLを加え、９４℃で１０分間加熱処理した後、次の通
り１回目のＰＣＲを行った。加熱処理溶液３４．５μL
にＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋ
ｉｔ中の１０倍濃度緩衝液５μL、ＬＡ Ｔａｑポリメ
ラーゼ０．５μL、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μL、プライマー
Ｃ１ １μL（１０ｐｍｏｌ）及びBacillus sp.ＫＳＭ
−Ｎ２５７株の培養上清より精製したアルカリセルラー
ゼのＮ末配列より推定した複合プライマー１（配列番号
３）１μL（１０ｐｍｏｌ）を混合した。ＰＣＲ反応条
件は、９４℃、１分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、
５５℃、２分間、７２℃、１分間（３０サイクル）で行
った。得られたＰＣＲ反応溶液を脱イオン水で１００倍
希釈し、１μLを用いて２回目のＰＣＲ反応を行った。
１００倍希釈溶液１μLにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ中の１０倍濃度緩衝液５μ
L、ＬＡ Ｔａｑポリメラーゼ０．５μL、ｄＮＴＰ ｍ
ｉｘ８μL、プライマーＣ２ １μL（１０ｐｍｏｌ）及
びBacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２５７株からの精製酵素の
Ｎ末配列より推定した複合プライマー２（配列番号４）
１μL（１０ｐｍｏｌ）を混合し、サーマルサイクラー
４８０（パーキンエルマー製）でＤＮＡを増幅した。Ｐ
ＣＲ反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９４℃、３
０秒間、５５℃、２分間、７２℃、１分間（３０サイク
ル）で行った。かくして得られたＮ２５７セルラーゼ遺
伝子の部分増幅断片（約０．７ｋｂ）を用いて塩基配列
決定を行った。得られたＤＮＡ断片の塩基配列は、ＤＮ
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオ
システム）及び３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキン
エルマーバイオシステム）を用いて決定した。

【００２０】実施例４ 全塩基配列決定 （ａ）インバースＰＣＲ（ＥｃｏＲｌ） Ｎ２５７セルラーゼ遺伝子の部分増幅断片（約０．７ｋ
ｂ）の塩基配列をシークエンスプライマーとして、プラ
イマーＣ２（３．２ｐｍｏｌ）及びプライマー２（配列
番号４、３．２ｐｍｏｌ）を用いて解析した。決定した
約０．５ｋｂの塩基配列を基にインバースＰＣＲを行っ
た。Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株のゲノムＤＮＡ溶
液１．５μL（１μg）、１０倍濃度緩衝液１０μL、脱
イオン水８６．５μL及びＥｃｏＲｌ ２μＬ（２０uni
ts）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理した。得ら
れたゲノムＤＮＡ分解産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ
ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製後（２０μL）、５
μLを使用してＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２
（タカラ製）を用いて自己閉環した（１６℃、１時
間）。得られたライゲーションミクスチャー１μLを鋳
型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。アンチセンスプライマ
ー３（配列番号５）及びセンスプライマー４（配列番号
６）を用いた。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μL、各
プライマー２０μL（１μM）、１０倍濃度緩衝液１０μ
L、ｄＮＴＰミックス８μL（２．５mM）、Ｐｙｒｏｂｅ
ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ製）０．５μL
（２．５units）、及び脱イオン水４０μLを混合した
後、サーマルサイクラーでＤＮＡを増幅した。反応条件
は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５７
℃、１分間、７２℃、２分間（３０サイクル）及び７２
℃、２分間で行った。得られたＰＣＲ産物（約０．７ｋ
ｂ）をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａ
ｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシ
ア製）を用いて精製した後、アンチセンスプライマー５
（配列番号７）及びセンスプライマー６（配列番号８）
を用いてシークエンスを行い、Ｎ２５７セルラーゼ遺伝
子のプロモータ領域中のＥｃｏＲｌ部位（塩基番号１）
から下流の構造遺伝子内のＥｃｏＲｌ部位（塩基番号１
０９０）間約１．１ｋｂの塩基配列を決定した。

【００２１】（ii）インバースＰＣＲ（ＰｖｕII） 構造遺伝子内のＥｃｏＲｌ部位下流の未決定の塩基配列
を決定する目的で、再度インバースＰＣＲをＰｖｕIIを
用いて行った。Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ２５７株のゲノ
ムＤＮＡ溶液１．５μL（１μg）、１０倍濃度緩衝液１
０μL、脱イオン水８６．５μL及びＰｖｕII ２μL
（２０units）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理
した。得られたゲノムＤＮＡ分解産物をＧＦＸ ＰＣＲ
ＤＮＡａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製後（２０μ
L）、５μLを使用してＬｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅ
ｒ．２（タカラ製）にて自己閉環した（１６℃、１時
間）。得られたライゲーションミクスチャー１μLを鋳
型ＤＮＡとして、アンチセンスプライマー７（配列番号
９）及びセンスプライマー４（配列番号６）を用いてＰ
ＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、自己閉環溶液１μL、各
プライマー２０μL（１μM）、１０倍濃度緩衝液１０μ
L、ｄＮＴＰミッスク８μL（２．５mM）、Ｐｙｒｏｂｅ
ｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ製）０．５μL
（２．５units）、及び脱イオン水４０μLを混合した
後、サーマルサイクラーでＤＮＡを増幅した。反応条件
は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃、３０秒間、５
７℃、１分間、７２℃、２分間（３０サイクル）及び７
２℃、２分間で行った。得られたＰＣＲ産物（約１．５
ｋｂ）をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂ
ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマ
シア製）を用いて精製した後、センスプライマー６（配
列番号８）及びセンスプライマー８（配列番号１０）を
用いてシークエンスを行い、構造遺伝子内ＥｃｏＲｌ部
位下流の未決定の塩基配列を決定した。以上、プロモー
ター領域及びターミネーター領域を含めたＮ２５７セル
ラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定した。

【００２２】実施例５ 形質転換枯草菌によるＮ２５７
セルラーゼの生産 Ｎ２５７セルラーゼのアミノ末端側からターミネーター
下流までの遺伝子をプラスミド（ｐＨＳＰ６４）のＳａ
ｌｌ／ＢａｍＨｌ部位に連結し、構築した組換えプラス
ミドを枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換し
た。形質転換株を３．０％ポリペプトンＳ、３．０％マ
ルトース、０．５％魚肉エキス、０．１％酵母エキス、
０．１％リン酸２水素カリウム、０．０２％硫酸マグネ
シウム７水塩及びテトラサイクリン（７．５μg／mL）
から成る培地（ＰＭ培地、pH６．８）にて３０℃、４８
時間振盪培養を行った、遠心分離（８０００×ｇ、２０
分間、４℃）により得られた培養上清中のセルラーゼの
活性は、約１００００Ｕ／Ｌであった。

【００２３】実施例６ 組換えＮ２５７アルカリセルラ
ーゼの精製 組換えＮ２５７培養上清液を８５％飽和の硫安塩析処理
した後、遠心分離（１２０００×ｇ、１５分間、５℃）
を行い沈殿物を回収した。この沈殿物を２mM塩化カルシ
ウムを含んだ適当量の１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）に懸濁した後、充分量の同緩衝液に対して５℃で１
５時間透析した。透析内液を遠心分離（１２０００×
ｇ、１５分間、５℃）し、得られた上清を予め２mM塩化
カルシウムを含んだ１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）で平衡化したＳＰトヨパール（東ソー）カラム
（２．５cm×１５cm）に添着した後、同緩衝液でカラム
を洗浄した後、同緩衝液中０〜０．２Ｍの塩化ナトリウ
ムによる直線濃度勾配によりタンパク質を溶出させた。
目的のＮ２５７アルカリセルラーゼは、塩化ナトリウム
濃度０．０２Ｍ付近で、電気泳動的にほぼ単一な成分と
して溶出された。比活性は１４．８Ｕ／mgであった。

【００２４】実施例７ 組換えＮ２５７アルカリセルラ
ーゼの最適反応pH 実施例６の如く調製して得られた組換えＮ２５７アルカ
リセルラーゼ精製標品を用いて、最適反応pHを調べた。
酢酸緩衝液（pH５．１−６．６）、リン酸緩衝液（pH
６．２−７．９）、トリス−塩酸緩衝液（pH７．６−
９．１）、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．
５−１０．７）、炭酸緩衝液（pH１０．８−１１．
５）、塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０．５−１１．４）の各緩衝液（５０mM）を用いて最適
反応pHを調べた結果、本酵素はpH８．５のグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液中で最も高い反応速度を示した。
また、pH７から９の間で最大活性の７０％以上の活性を
示すとともにpH５から１０の広範囲でも最大活性の１０
％以上の活性を有していた（図１）。組換えＮ２５７ア
ルカリセルラーゼは分子量、約４２ｋＤａ、pH７．５で
陽イオン交換体に吸着し、野生株の酵素と同様に塩化ナ
トリウムにより溶出されることから等電点が高く、最適
反応pHがpH８．５、２０個のＮ末端アミノ酸配列Ala-As
n-Lys-Pro-Phe-Pro-Gln-His-Thr-Ser-Tyr-Thr-Ser-Gly-
Ser-Ile-Lys-Pro-Asn-AsnがBacillus sp. ＫＳＭ−Ｎ２
５７株由来の酵素のＮ末端アミノ酸と完全に一致するこ
とから、野生株由来のＮ２５７アルカリセルラーゼと同
じ性質を持つ酵素である。

【００２５】［酵素活性測定法］０．２mLの０．５Ｍグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０）、０．４
mLの２．５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース
（Ａ０１ＭＣ；日本製紙）、０．３mLの脱イオン水から
成る反応液に０．１mLの適当に希釈した酵素液を加え２
０分間反応させた後、１mLのジニトロサリチル酸試薬
（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、
１．６％水酸化ナトリウム水溶液）を添加し、沸水中で
５分間還元糖の発色を行った。氷水中で急冷し、４mLの
脱イオン水を加え５３５nmにおける吸光度を測定し還元
糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに
処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、
酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵
素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に
１μｍｏｌのグルコース相当の還元糖を生成する量とし
た。

【００２６】

【発明の効果】本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子を用
いて洗剤用アルカリセルラーゼを単一且つ大量に生産す
ることができる。

【００２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KAO CORPORATION <120> A gene for alkaline cellulase <130> P04491209 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 407 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 1 Met Lys Val Phe Arg Asn Ser Ile Ile Arg Lys Ser Ala Val Leu Phe 1 5 10 15 Cys Ala Val Leu Leu Ile Leu Pro Ala Gly Leu Ser Leu Ala Ala Asn 20 25 30 Lys Pro Phe Pro Gln His Thr Ser Tyr Thr Ser Gly Ser Ile Lys Pro 35 40 45 Asn Asn Val Thr Gln Ser Ala Met Asp Asn Ala Val Lys Ser Lys Trp 50 55 60 Asn Ser Trp Lys Gly Ser Phe Leu Lys Pro Ala Ala Thr Gly Gln Tyr 65 70 75 80 Tyr Val Lys Tyr Asn Ser Ala Gly Glu Thr Val Ser Glu Ala His Gly 85 90 95 Tyr Gly Met Leu Phe Thr Val Leu Met Ala Gly Tyr Asp Ser Asn Ala 100 105 110 Gln Ser Tyr Phe Asp Gly Leu Tyr Arg Tyr Tyr Lys Ala His Pro Ser 115 120 125 Asn Asn Asn Pro Tyr Leu Met Ala Trp Lys Gln Asn Ser Ser Phe Gln 130 135 140 Asn Ile Gly Gly Ala Asn Ser Ala Thr Asp Gly Asp Met Asp Ile Ala 145 150 155 160 Tyr Ala Leu Leu Leu Ala Asp Lys Gln Trp Gly Ser Ser Gly Ser Ile 165 170 175 Asn Tyr Leu Gln Ala Ala Lys Asp Met Ile Asn Ala Ile Met Ser Asn 180 185 190 Asp Val Asn Gln Ser Gln Trp Thr Leu Arg Leu Gly Asp Trp Ala Thr 195 200 205 Ser Gly Ile Phe Asp Thr Ala Thr Arg Pro Ser Asp Phe Met Leu Asn 210 215 220 His Met Lys Ala Phe Arg Ala Ala Thr Gly Asp Ala Arg Trp Glu Asn 225 230 235 240 Val Ile Asn Lys Thr Tyr Thr Ile Ile Asn Ser Ile Tyr Asn Gly Tyr 245 250 255 Ser Ser Asn Thr Gly Leu Leu Pro Asp Phe Val Val Met Ser Gly Gly 260 265 270 Asn Tyr Gln Pro Ala Ala Ala Glu Phe Leu Glu Gly Ala Asn Asp Gly 275 280 285 Lys Tyr Tyr Tyr Asn Ser Ser Arg Thr Pro Trp Arg Ile Thr Thr Asp 290 295 300 Tyr Leu Met Thr Gly Asp Thr Arg Ala Leu Asn Gln Leu Asn Lys Met 305 310 315 320 Asn Thr Phe Ile Lys Ser Ala Thr Ser Ser Asn Pro Ala Asn Val Lys 325 330 335 Ala Gly Tyr Asn Leu Asn Gly Thr Ala Leu Val Thr Tyr Asn Ser Gly 340 345 350 Ala Phe Tyr Ala Pro Phe Gly Val Ser Ala Met Thr Ser Ser Ser His 355 360 365 Gln Ser Trp Leu Asn Ser Val Trp Ser Tyr Thr Ala Asn Ala Ser Ala 370 375 380 Glu Gly Tyr Tyr Glu Glu Ser Ile Lys Leu Phe Ser Met Ile Val Met 385 390 395 400 Ser Gly Asn Trp Trp Thr Tyr 405

【００２８】 <210> 2 <211> 1224 <212> DNA <213> Bacillus sp. <400> 2 atgaaagtat tccgaaattc gatcatccgt aagtcggctg tgttgttctg tgctgttcta 60 ctgatcttgc cagccggatt gtctctggcg gccaacaagc cgtttcccca gcatacgtcg 120 tatacgagcg gttcgattaa accaaacaat gtgacgcagt ccgcgatgga caatgcggtc 180 aagagcaaat ggaacagctg gaaagggtct ttcttgaagc ctgcagctac agggcaatat 240 tacgtaaaat acaattcggc gggcgagacg gtgtccgagg ctcatggcta cgggatgctc 300 ttcaccgttc tgatggcggg ttacgacagt aacgcacagt cgtatttcga cggactttat 360 cgctattaca aggcgcatcc gagtaataac aatccgtatc tgatggcttg gaagcagaac 420 agcagctttc agaatatagg gggggccaat tcggcaacgg acggcgatat ggacattgct 480 tacgcactcc tgcttgcgga caagcagtgg ggaagcagcg gatcgattaa ttacctccag 540 gcagctaagg atatgatcaa tgcgatcatg agcaatgacg tgaatcagtc gcagtggacg 600 ctgcgcctag gcgattgggc aaccagcggc attttcgaca ccgccacgcg gccatcggat 660 ttcatgctga accatatgaa ggcattccgt gcggctaccg gcgatgcccg ttgggagaac 720 gtcattaaca aaacctatac gatcatcaac tccatctata acggttacag ctccaatacc 780 ggtttgcttc cggatttcgt cgtcatgtcg ggcggcaatt atcagcctgc ggcagcggaa 840 ttcctggagg gggcgaacga cggaaaatac tattacaatt cgtcccggac tccttggcgg 900 attacgaccg actatctgat gaccggcgat acgcgcgcgc tgaatcaatt gaacaagatg 960 aacacgttca ttaaatcagc cactagcagt aatccagcca acgtcaaggc agggtataac 1020 ctgaacggca ccgcgctggt gacatataac agtggggcgt tctatgctcc ttttggcgta 1080 agtgcgatga cttcgtccag ccaccagagc tggctgaatt cggtatggag ttacacggcg 1140 aacgcatctg cagagggata ttatgaggaa agcatcaagc tgttctcgat gatcgtcatg 1200 tcgggtaact ggtggacata ttaa 1224

【００２９】 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mix primer designed from N-terminal amino acid sequence (Ala 31-Gln 37) of cellulase from Bacillus sp KSM-N257. <400> 3 gcnaayaarc cnttyccnc 19

【００３０】 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mix primer designed from N-terminal amino acid sequence (Phe 35-Thr 42) of cellulase from Bacillus sp KSM-N257. <400> 4 ttyccncarc ayacntcnta ya 22

【００３１】 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisence primer based on nucleotide no. 465 to 491. <400> 5 aggagtgcgt aagcaatgtc catatcg 27

【００３２】 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sence primer based on nucleotide no. 662 to 687. <400> 6 tcatgctgaa ccatatgaag gcattc 26

【００３３】 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisence primer based on nucleotide no. 164 to 188. <400> 7 ttgctcttga ccgcattgtc catcg 25

【００３４】 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sence primer based on nucleotide no. 767 to 790. <400> 8 acagctccaa taccggtttg cttc 24

【００３５】 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisence primer based on nucleotide no. 221 to 246. <400> 9 tacgtaatat tgccctgtag ctgcag 26

【００３６】 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sence primer based on nucleotide no. 1079 to 1100. <400> 10 taagtgcgat gacttcgtcc ag 22

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の組換えアルカリセルラーゼ活性に及ぼ
すpHの影響を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA12 CA03 DA07 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC03 CC04 DD02 FF04E FF05E FF09E LL04 4B065 AA15Y AA19X AB01 AC14 AC15 BA02 CA31 CA57

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列又は該ア
   ミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換も
   しくは付加されたアミノ酸配列をコードするアルカリセ
   ルラーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 アルカリセルラーゼ遺伝子が、配列番号
   ２に示す塩基配列又は該塩基配列の１若しくは数個の塩
   基が欠失、置換もしくは付加された塩基酸配列を有する
   ものである請求項１記載のアルカリセルラーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 宿主が微生物である請求項４記載の形質
   転換体。