JP2002051790A - コリネ型細菌のアルギニンリプレッサー欠失株及びｌ−アルギニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コリネ型細菌のＬ−アルギニン生合成のリプ
レッサーを特定し、コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産
能を向上させること。 【解決手段】 Ｌ−アルギニン生合成のリプレッサー
を、同リプレッサーをコードする遺伝子を破壊すること
により欠失し、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するコ
リネ型細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを
生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することによ
り、Ｌ−アルギニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−アルギニン生
産能を有するコリネ型細菌及び同微生物を用いたＬ−ア
ルギニンの製造法に関する。Ｌ−アルギニンは、肝機能
促進薬、アミノ酸輸液及び総合アミノ酸製剤等の成分と
して、産業上有用なアミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるＬ−アルギニンの製
造は、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾー
ルアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の
薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラ
ニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまた
はＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特
開昭５４−４４０９６号）；ケトマロン酸、フルオロマ
ロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細
菌（特開昭５７−１８９８９号）；アルギニノールに耐
性を有するコリネ型細菌（特開昭６２−２４０７５
号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖
の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平２−１
８６９９５号）等を用いて行われている。

【０００３】一方、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アルギ
ニンの生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アルギ
ニンの生産能を増加させる種々の技術が開示されてい
る。例えば、エシェリヒア属に属する微生物由来のアセ
チルオルニチンデアセチラーゼ、Ｎ−アセチルグルタミ
ン酸−γ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｎ−アセ
チルグルタモキナーゼ、及びアルギニノサクシナーゼの
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとの組換え体
ＤＮＡを保有せしめたコリネバクテリウム属又はブレビ
バクテリウム属に属する微生物（特公平５−２３７５０
号）を用いてＬ−アルギニンを製造する方法等が開示さ
れている。

【０００４】また、コリネ型細菌では、いくつかのＬ−
アルギニン生合成系酵素の生成が、Ｌ−アルギニンによ
り抑制されていることが調べられている。さらに、Ｌ−
アルギニン生合成系酵素のいくつかは、Ｌ−アルギニン
による抑制を受けるが、Ｌ−アルギニン蓄積量が向上し
たコリネ型細菌の変異株では、これらの酵素のＬ−アル
ギニンによる抑制が解除されていることが報告されてい
る（Agric. Biol. Chem., 43(1), 105, 1979）。

【０００５】一方、エシェリヒア・コリでは、Ｌ−アル
ギニン生合成系のリプレッサー及びリプレッサーをコー
ドする遺伝子が特定されており（Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701）、またリプレッ
サータンパクと各種Ｌ−アルギニン生合成系遺伝子との
結合相互作用についても調べられている（Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. (1987), 84(19), 6697-701、J. Mo
l. Biol. (1992), 226,367-386）。

【０００６】しかしながら、コリネ型細菌では、Ｌ−ア
ルギニン生合成系のリプレッサータンパクは同定されて
いない。リプレッサータンパク遺伝子（argR）について
は、遺伝子データベースGenBankに、その塩基配列とそ
れによってコードされると想定されるアミノ酸配列が登
録されているが（AF049897）、これは前記アミノ酸配列
と公知のアルギニンリプレッサーとの相同性からargRと
命名されたものと考えられる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前述のように、コリネ
型細菌のＬ−アルギニン生合成系のリプレッサータンパ
ク及びその遺伝子が推定されているが、リプレッサータ
ンパク自体特定されておらず、機能等についても全く明
らかにされていない。本発明は、コリネ型細菌のＬ−ア
ルギニン生合成のリプレッサーを特定し、コリネ型細菌
のＬ−アルギニン生産能を向上させることを課題とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、遺伝子デ
ータベース中にargRとして登録されている遺伝子（GenB
ank accession AF049897）のホモログをコリネ型細菌か
ら単離し、同遺伝子をコリネ型細菌で増幅するとＬ−ア
ルギニン生産能が低下し、一方、同遺伝子を破壊すると
Ｌ−アルギニン生産能が向上することを見出し、コリネ
型細菌もエシェリヒア・コリと同様にＬ−アルギニン生
合成がリプレッサーによって抑制されていること、及び
前記のargRとして登録されている遺伝子が、当該リプレ
ッサーをコードしていることを確認し、本発明を完成す
る至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。

【０００９】（１）アルギニンリプレッサーが正常に機
能せず、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型
細菌。 （２）前記コリネ型細菌は、染色体上のアルギニンリプ
レッサーをコードする遺伝子が破壊されたことにより、
アルギニンリプレッサーが正常に機能しないことを特徴
とする（１）のコリネ型細菌。 （３）前記アルギニンリプレッサーは、配列番号１８に
示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列と相同性を有する
アミノ酸配列を有する（２）のコリネ型細菌。 （４）（１）〜（３）のいずれかのコリネ型細菌を培地
で培養し、培地中にＬ−アルギニンを生成蓄積せしめ、
これを該培地から採取することを特徴とするＬ−アルギ
ニンの製造法。

【００１０】本発明において「アルギニンリプレッサ
ー」とは、Ｌ−アルギニン生合成を抑制する作用を有す
るタンパク質であり、コリネ型細菌において同タンパク
質をコードする遺伝子の発現量が増加するとＬ−アルギ
ニン生産能が低下し、発現量が低下又は消失するとＬ−
アルギニン生産能が向上する。以下、アルギニンリプレ
ッサーをコードする遺伝子をargR遺伝子ともいう。ま
た、本発明においてＬ−アルギニン生産能」とは、本発
明の微生物を培地に培養したときに、培地中にＬ−アル
ギニンを蓄積する能力をいう。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明の微生物は、アルギニンリ
プレッサーが正常に機能せず、Ｌ−アルギニン生産能を
有するコリネ型細菌である。本発明のコリネ型細菌は、
アルギニンリプレッサーが正常に機能しないことにより
Ｌ−アルギニン生産能を有するものであってもよいし、
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌をアルギニ
ンリプレッサーが正常に機能しないように育種したもの
であってもよい。また、コリネ型細菌をアルギニンリプ
レッサーが正常に機能しないように育種した後に、Ｌ−
アルギニン生産能を付与したものであってもよい。

【００１２】コリネ型細菌は、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合
された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 25
5 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁な
ブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型
細菌の例として以下のものが挙げられる。

【００１３】コリネバクテリウム・アセトアシドフィラ
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリ
ウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・
グルタミカム） ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバ
クテリウム・グルタミカム） ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム

【００１４】Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細
菌としては、Ｌ−アルギニン生産能を有するものであれ
ば特に制限されないが、例えば、コリネ型細菌野生株；
サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−
β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型
細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒス
チジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性
を有するコリネ型細菌（特開昭５４−４４０９６号）；
ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸
に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭５７−１８９８９
号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特
開昭６２−２４０７５号）；Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪
酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌
（特開平２−１８６９９５号）等が挙げられる。

【００１５】具体的には、下記のような菌株を例示する
ことができる。 ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM P-4161） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（F
ERM P-7273） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM P-4939） ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM P-4948） ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（F
ERM BP-2228）

【００１６】AJ11169株及びAJ12092株は特開昭５４−４
４０９６号記載の２−チアゾールアラニン耐性株、AJ11
336株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノー
ル耐性及びサルファダイアジン耐性を有する株、AJ1134
5株は特公昭６２−２４０７５号記載のアルギニノール
耐性、２−チアゾールアラニン耐性、サルファグアニジ
ン耐性、及びヒスチジン要求性を有する株、及びAJ1243
0株は特開平２−１８６９９５号記載のオクチルグアニ
ジン耐性及び２−チアゾールアラニン耐性を有する株で
ある。AJ11169は、1977年８月３日に工業技術院（現産
業技術総合研究所）生命工学工業技術研究所（郵便番号
305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）にF
ERM P-4161の受託番号で寄託され、1999年９月27日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-68
92の受託番号で寄託されている。AJ12092は、1983年９
月29日に工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-7
273の受託番号で寄託され、1999年10月１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6906の受
託番号で寄託されている。AJ11336は、1979年４月25日
に工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-4939の
受託番号で寄託され、1999年９月27日にブダペスト条約
に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-6893の受託番号
で寄託されている。AJ11345は、1979年４月25日に工業
技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-4948の受託番
号で寄託され、1999年９月27日にブダペスト条約に基づ
く国際寄託に移管され、FERM BP-6894の受託番号で寄託
されている。AJ12430は、1988年11月26日に工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM BP-2228の受託番号で、
ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

【００１７】リプレッサーが正常に機能しないコリネ型
細菌は、argR遺伝子が、該遺伝子産物であるアルギニン
リプレッサーの活性が低下又は消失するか、又はargR遺
伝子の転写が低下または消失するように、改変すること
によって得られる。このようなコリネ型細菌は、例え
ば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiment
s in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labora
tory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima,
S., J. Bacteriol., 162, 1196(1985)）により、染色体
上のargR遺伝子を、正常に機能しないargR遺伝子（以
下、「破壊型argR遺伝子」ということがある）で置換す
ることによって行うことができる。

【００１８】染色体上の配列と相同性を有する配列を持
つプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で相
同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入された
プラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さら
に染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こ
すと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、こ
の時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が
染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと
一緒に染色体上から抜け落ちることもある。このような
菌株を選択することにより、染色体上の正常なargR遺伝
子が破壊型argR遺伝子と置換された菌株を取得すること
ができる。

【００１９】このような相同組換えによる遺伝子破壊技
術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度
感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、
薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたargR遺
伝子を含み、かつ、目的とするコリネ型細菌細胞内で複
製できないプラスミドを用いることによっても、argR遺
伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラス
ミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体
は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれてい
る。このマーカー遺伝子は、その両端のargR遺伝子配列
と染色体上のargR遺伝子との相同組換えによって組み込
まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択
することができる。

【００２０】遺伝子破壊に用いる破壊型argR遺伝子は、
具体的には、制限酵素消化及び再結合によるargR遺伝子
の一定領域の欠失、argR遺伝子への他のＤＮＡ断片（マ
ーカー遺伝子等）の挿入、または部位特異的変異法（Kr
amer, W. and Frits, H. J.,Methods in Enzymology, 1
54, 350 (1987)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシル
アミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nath
ans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(19
78)）によって、argR遺伝子のコーディング領域または
プロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個
の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさせ
ることにより、コードされるリプレッサーの活性を低下
又は消失させるか、又はargR遺伝子の転写を低下または
消失させることにより、取得することができる。これら
の態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりargR遺
伝子の一定領域を欠失させる方法、又はargR遺伝子へ他
のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点
から好ましい。また、argR遺伝子とその周辺領域を含む
プラスミドを鋳型とし、argR遺伝子の末端部又は周辺領
域に相当するプライマーを用いてPCR（ポリメラーゼ・
チェイン・リアクション）を行い、argR遺伝子の内部又
は全体を除く部分を増幅し、得られる増幅産物を環状化
することによって、argR遺伝子破壊用プラスミドを作製
することができる。後記実施例では、この方法によって
argR遺伝子を破壊した。

【００２１】argR遺伝子は、コリネ型細菌の染色体ＤＮ
Ａから、既知のargR遺伝子の塩基配列に基づいて作製し
たオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によ
って取得することができる。また、コリネ型細菌の染色
体ＤＮＡライブラリーから、既知のargR遺伝子の塩基配
列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブと
するハイブリダイゼーション法によって、argR遺伝子を
取得することができる。尚、本発明においては、argR遺
伝子は破壊型argR遺伝子の作製に用いるため、必ずしも
全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な
長さを有していればよい。

【００２２】argR遺伝子は、コリネ型細菌のargR遺伝子
と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば、由
来を特に制限されない。コリネ型細菌のargR遺伝子とし
て具体的には、配列番号１７に示す塩基配列を有するブ
レビバクテリウム・フラバムのargR遺伝子、及び、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムのargR遺伝子（GenBank
accession AF049897）が挙げられる。これらのargR遺伝
子は相同性が高く、argR遺伝子を破壊するコリネ型細菌
と種又は属が異なるコリネ型細菌のargR遺伝子であって
も、遺伝子破壊に用いることができると考えられる。本
発明において、配列番号１８に示すアミノ酸配列又は同
アミノ酸配列と相同性を有するアミノ酸配列とは、配列
番号１８に示すアミノ酸配列をコードするargR遺伝子
（例えば配列番号１７に示す塩基配列を有するargR遺伝
子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有するargR遺
伝子によってコードされるアミノ酸配列を意味する。

【００２３】PCRに用いるプライマーとしては、argR遺
伝子を増幅することができるものであればよく、具体的
には配列番号１９及び配列番号２０に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００２４】また、マーカー遺伝子としては、カナマイ
シン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。カナ
マイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリ
スのカナマイシン耐性遺伝子を含む公知のプラスミド、
例えばpDG783（Anne-Marie Guerout- Fleury et al., G
ene, 167, 335-337(1995)）からPCRにより増幅すること
により取得することができる。

【００２５】マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用
いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のargR遺伝子の適
当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質
転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ar
gR遺伝子破壊株が得られる。染色体上のargR遺伝子が破
壊されたことは、サザンブロッティングやPCR法によ
り、染色体上のargR遺伝子又はマーカー遺伝子を解析す
ることによって、確認することができる。前記カナマイ
シン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確
認は、カナマイシン耐性遺伝子を増幅することができる
プライマー（例えば配列番号１及び２に示す塩基配列を
有するオリゴヌクレオチド）を用いたPCRにより、行う
ことができる。

【００２６】上記のようにして得られるアルギニンリプ
レッサーが正常に機能せず、かつ、Ｌ−アルギニン生産
能を有するコリネ型細菌を培地で培養し、該培養物中に
Ｌ−アルギニンを生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−ア
ルギニンを採取することにより、Ｌ−アルギニンを効率
よく製造することができる。

【００２７】使用する培地は、微生物を用いたアミノ酸
の発酵生産に従来より用いられてきた周知の培地を用い
てかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及
び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地で
ある。

【００２８】炭素源としては、グルコース、シュクロー
ス、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷ
んの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトー
ルなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の有機酸類を用いることができる。

【００２９】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。

【００３０】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ₁、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。

【００３１】培養は好気的条件下で１〜７日間実施する
のがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは
５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使
用することができる。発酵液からのＬ−アルギニンの採
取は通常イオン交換樹脂法その他の公知の方法を組み合
わせることにより実施できる。

【００３２】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００３３】

【実施例１】エシェリヒア・コリとコリネ型細菌のシャ
トルベクター及び温度感受性ベクターの構築 はじめに、コリネ型細菌にargR遺伝子を導入するための
ベクター、及びコリネ型細菌のargR欠失株を作製するた
めの温度感受性ベクターを構築した。 ＜１＞ストレプトコッカス・フェカリスの薬剤耐性遺伝
子を持つベクターの構築 ストレプトコッカス・フェカリスのカナマイシン耐性遺
伝子を、同遺伝子を含む公知のプラスミドからPCRによ
り増幅した。ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている
（Trieu-Cuot,P. and Courvalin,P.:Gene 23（3）, 331
-341（1983））。この配列を基に配列番号１および２に
示すプライマーを合成し、pDG783（Anne-Marie Guerout
- Fleuryet al., Gene, 167, 335-337(1995)）を鋳型と
してPCRを行ない、カナマイシン耐性遺伝子とそのプロ
モーターを含むDNA断片を増幅した。

【００３４】上記DNA断片を宝酒造社製のSUPREC02にて
精製した後、制限酵素HindIIIとHincIIで完全分解し平
滑末端化した。平滑末端化は宝酒造社製のBlunting Kit
により行なった。このDNA断片と、配列番号３および４
に示すプライマーを用いてpHSG399(S.Takeshita et al
: Gene 61,63-74(1987)参照)を鋳型としてPCRを行って
得られた増幅産物を精製し平滑末端化したDNA断片と
を、混合し連結した。連結反応は宝酒造社製 DNA ligat
ion kit ver2にて行なった。連結したDNAを用いて、エ
シェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社
製）を形質転換し、IPTG（イソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド）10μg/ml、X-Gal（5-ブロモ-4-クロロ
-3-インドリル-β-D−ガラクトシド）40μg/ml及びカナ
マイシン25μg/mlを含むL培地（バクトトリプトン10g/
L、バクトイーストエキストラクト5g/L、NaCl 5g/L、寒
天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した青色
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株
を得た。

【００３５】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、105頁、培風館、1992年）を用
いてプラスミドを調製し、制限酵素地図を作成し、図１
に示す制限酵素地図と同等であるものをpK1と名付け
た。このプラスミドはエシェリヒア・コリ中にて安定に
保持され、宿主にカナマイシン耐性を付与する。また、
lazZ'遺伝子を含むため、クローニングベクターに適し
ている。

【００３６】＜２＞シャトルベクターpSFK6の構築 温度感受性複製制御領域の取得の材料として、エシェリ
シア・コリと、コリネ型細菌の双方の菌体中で自律複製
可能なプラスミドベクターを作製した。ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869より抽出したプ
ラスミドpAM330(特開昭58-67699号公報参照)を制限酵素
HindIIIで完全分解したのち平滑末端化し、これと、上
記pK1を制限酵素BsaAIで完全分解したものを、連結し
た。連結後のDNAを用いてブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムATCC13869を形質転換した。形質転換の
方法は、電気パルス法（特開平2-207791号参照）を用い
た。形質転換体の選択は、カナマイシン25μg/mlを含む
M-CM2Bプレート(ポリペプトン10g/L、酵母エキス10g/
L、NaCl 5g/L、ビオチン10μg/L、寒天15g/L、pH7.2)に
て行った。二晩培養後、コロニーを釣り上げ単コロニー
分離し、形質転換体とした。形質転換体からプラスミド
DNAを調製し、制限酵素地図を作成し、図２に示す制限
酵素切断地図と同一の制限酵素地図を持つものをpSFK6
と命名した。このプラスミドは、エシェリシア・コリと
コリネ型細菌中で自律複製でき、宿主にカナマイシン耐
性を付与する。

【００３７】＜３＞温度感受性複製制御領域をもつプラ
スミドの取得 pSFK6をインビトロでヒドロキシルアミン処理した。ヒ
ドロキシルアミン処理は、公知の方法（G. O. Humphery
s et al., Molec. Gen. Genet., 145, 101-108(1976)等
参照）によった。処理後のDNAを回収し、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムATCC13869株を形質転換
した。形質転換体は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2B
プレート上で低温(25℃)にて選択した。出現した形質転
換体を、同様の選択プレートにレプリカし、高温(34℃)
にて培養した。高温でカナマイシンを含む選択プレート
上で生育できない株１株を取得した。この株から、プラ
スミドを回収しp48Kと命名した。

【００３８】＜４＞温度感受性複製制御領域の塩基配列
の決定 野生型の複製制御領域を持つプラスミドpSFK6、および
温度感受性型の複製制御領域を持つプラスミドp48Kにつ
いて、それぞれの複製制御領域部分の塩基配列を決定し
た。塩基配列は、ABI社のDNA Sequencing Kitを用いてA
BI社の全自動シーケンサーABI310にて決定した。その結
果、野生型複製制御領域と、温度感受性変異型複製制御
領域の間には、６個の塩基置換があることが判明した。
pSFK6に含まれるコリネ型細菌中で機能する複製制御領
域部分（pAM330由来の全配列）の塩基配列を配列番号５
に、p48Kに含まれるコリネ型細菌中で機能する温度感受
性複製制御領域部分の塩基配列を配列番号７に示す。ま
た、これらの塩基配列中に存在するＯＲＦによってコー
ドされ得るアミノ酸配列を配列番号６及び８に示す。温
度感受性複製制御領域では、配列上の1255番目のCがT
に、1534番目のCがTに、1866番目のGがAに、2058番目の
GがAに、2187番目のCがTに、 3193番目のGがAに変異し
ている。このうちアミノ酸変異を伴うものは1534番目の
変異点のみであり、プロリンからセリンへの置換を引き
起こす。

【００３９】＜５＞温度感受性変異を有するシャトルベ
クターの構築 p48Kが持つ６個の変異を、一点ずつシャトルベクターpS
FK6に導入した（図３参照）。変異の導入は、公知の方
法（Mikaelian, I., Sergeant, A. Nucleic Acids Re
s., 20, 376 (1992)）によって行った。具体的方法を以
下に示す。1534番目のC→Tの変異を導入するために、配
列番号９および１０に示すプライマー（プライマー９，
１０）の組み合わせと、配列番号１１および１２に示す
プライマー（プライマー１１，１２）の組み合わせを用
いて、pAM330を鋳型としてPCRを行なった。得られた増
幅産物はそれぞれアガロースゲルで電気泳動後、ゲルか
ら回収することにより精製した。ゲルからのDNA断片の
回収は宝酒造社製のEASYTRAPVer.2にて行なった。精製
したDNAを1:1のモル比となるように混合し、これを鋳型
として配列番号１３および１４に示すプライマー（プラ
イマー１３，１４）を用いてPCR反応を行なった。増幅
産物は制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルにて
電気泳動後、およそ3.2KbのDNA断片を回収した。pSFK6
も同様に制限酵素MluIで完全分解し、アガロースゲルに
て電気泳動後、およそ3.8KbのDNA断片を回収した。得ら
れたDNA断片を混合して連結し、エシェリヒア・コリJM1
09のコンピテントセル（宝酒造社製）を用いて形質転換
を行い、カナマイシン25μg/mlを含むL培地に塗布し、
一晩培養後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー
分離し、形質転換株を得た。形質転換株からアルカリ法
を用いてプラスミドを調製し、塩基配列を決定し、配列
番号５に示す配列の1534番目のCがTに変異していること
を確認した。このプラスミドをpSFKT2と名付けた（図
３）。

【００４０】

【実施例２】argR遺伝子のクローニングとコリネ型細菌
での増幅効果 ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247（AJ14067）
の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１５（配列番号１７
の塩基番号1717から1741の配列）および配列番号１６
（配列番号１７の塩基番号2386から2362の配列に相補的
な配列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
（プライマー１５，１６）をプライマーとしてPCRを行
った。PCRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用
い、９８℃ １０秒、５８℃ １分、７２℃ ３分を１サ
イクルとして３０サイクル行った。得られた増幅断片
を、実施例１で得たシャトルベクターpSFK6のSmaIサイ
トに挿入し、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミド
pWRを得た。

【００４１】コリネ型細菌のＬ−アルギニン生産菌での
argR遺伝子の増幅効果を調べるため、pWRをＬ−アルギ
ニン生産菌ブレビバクテリウム・フラバムAJ113455株
（FERMBP-6894）に導入した。プラスミドの導入は、電
気パルス法（特開平2-207791号）を用いた。形質転換体
は、カナマイシン25μg/mlを含むCM2G寒天培地（グルコ
ース5g、NaCl 5g、寒天15gを純水1Lに含む。pH7.2）に
てカナマイシン耐性株として選択し、AJ11345/pWRを得
た。対照として、AJ113455株にpSFK6を同様にして導入
し、形質転換体AJ11345/pSFK6を得た。

【００４２】上記各菌株を、グルコース0.5g/dl、ポリ
ペプトン 1g/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含
む寒天培地にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得ら
れた菌体１エーゼを、グルコース4g/dl、硫酸アンモニ
ウム6.5g/dl、KH₂PO₄ 0.1g/dl、MgSO₄ 0.04g/dl、FeSO₄
0.001g/dl、MnSO₄ 0.001g/dl、ビタミンB₁ 5μg/dl、
ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量として45mg/d
l）を含む培地に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間
振とう培養を行った。各々の培養液中のＬ−アルギニン
蓄積量（濃度(g/dl)）を測定した結果を表１に示す。そ
の結果、argR増幅株では、ほとんどＬ−アルギニンを蓄
積しなくなった。このことから、argR遺伝子産物がアル
ギニンリプレッサーとして機能していることが示され
た。

【００４３】

【表１】表１ ───────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（g/dl） ───────────────────── AJ11345/pSFK6 1.3 AJ11345/pWR 0.2 ─────────────────────

【００４４】pWRにクローニングされた挿入断片の塩基
配列を決定した結果を配列番号１７に示す。同塩基配列
によってコードされ得るアミノ酸配列を配列番号１８に
示す。

【００４５】

【実施例３】コリネ型細菌のargR破壊株の構築及びアル
ギニンリプレッサー欠失の効果 ＜１＞argR破壊用プラスミドの作製 ブレビバクテリウム・フラバム野生株2247株（AJ1406
7）の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９（配列番号１
７の塩基番号４から28の配列）および配列番号２０（配
列番号１７の塩基番号4230から4211の配列に相補的な配
列）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（プラ
イマー１９，２０）をプライマーとしてPCRを行った。P
CRは、Pyrobest DNA polymerae（宝酒造）を用い、９８
℃ １０秒、５８℃ １分、７２℃ ３分を１サイクルと
して３０サイクル行った。得られた増幅断片を、クロー
ニングベクターpHSG399のマルチクローニングサイト内
のSmaIサイトに挿入した。

【００４６】挿入されたDNA断片からアルギニンリプレ
ッサーをコードしていると思われるORF全てを欠失させ
るために、配列番号２１（配列番号１７の塩基番号2372
から2395の配列）および配列番号２２（配列番号１７の
塩基番号1851から1827の配列に相補的な配列）に示す塩
基配列を有するオリゴヌクレオチド（プライマー２１，
２２）をプライマーとし、増幅断片が挿入されたpHSG39
9を鋳型をしてPCRを行った。PCR産物をセルフライゲー
ションすることにより、pssERを構築した。

【００４７】次に、pssERを制限酵素SmaIおよびSalIで
消化して得た断片と、実施例１で得た温度感受性プラス
ミドpSFKT2をSmaI、SalIで消化したものを連結すること
により、コリネ型細菌で自律複製能が温度感受性になっ
たargR破壊用プラスミドpssERTを得た。

【００４８】＜２＞相同組換えによるコリネ型細菌のア
ルギニンリプレッサー欠失株の取得 上記のようにして得たプラスミドpssERTを、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタムAJ13029株（FERM BP-5
189）に導入した。プラスミドの導入は電気パルス法
（特開平2-207791号）を用いた。本プラスミドは、ブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタム中で自律複製能
が温度感受性である為、本プラスミドが相同組換えによ
って染色体に組み込まれた株のみが、プラスミド複製の
非許容温度である34℃でカナマイシン耐性株として選択
できる。argR破壊用プラスミドが染色体に組み込まれた
株は、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2G培地プレート
（ポリペプトン10g、酵母エキス10g、グルコース5g、Na
Cl 5g、寒天15ｇを純水1Lに含む。pH7.2）にて、カナマ
イシン耐性株として選択した。この段階では、染色体由
来の正常なargR遺伝子と、プラスミド由来のORFが欠失
したargR遺伝子とが、プラスミド部分を挟んで染色体上
にタンデムに存在する。

【００４９】次に、組換え株を、再度相同組換えを起こ
させ、プラスミド複製の非許容温度34℃でカナマイシン
感受性になった株を選択することにより、プラスミド部
分とともにargR遺伝子の一方が脱落した株を選択した。
これらの株は、染色体上に正常なargR遺伝子が残された
株と、破壊型argR遺伝子が残された株とが存在する。こ
れらの中から、破壊型argR遺伝子のみを保持する株を選
択した。染色体上のargR遺伝子が破壊型であるかどうか
は、34℃でカナマイシン感受性になった株の染色体を調
製し、これを鋳型とし、配列番号１９および配列番号２
０に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライ
マー１９，２０) をプライマーとしてPCRを行い、親株
由来の染色体を鋳型にして同様にPCRを行ったものより
も、PCR産物が約600bp短くなることで確認することがで
きる。

【００５０】上記のようにして選択されたargR破壊株の
PCR産物のダイレクトシークエンスを行い、目的どおりa
rgR遺伝子が破壊されていることを確認し、AJ13029ΔR
株を得た。

【００５１】＜３＞argR破壊株によるＬ−アルギニンの
生産 AJ13029ΔR株を、グルコース0.5g/dl、ポリペプトン 1g
/dl、酵母エキス 1g/dl、NaCl 0.5g/dlを含む寒天培地
にぬりつけ、31.5℃で20時間培養した。得られた菌体１
エーゼを、グルコース3g/dl、硫酸アンモニウム6.5g/d
l、KH₂PO₄ 0.1g/dl、MgSO₄ 0.04g/dl、FeSO₄ 0.001g/d
l、MnSO₄ 0.001g/dl、ビタミンB₁ 300μg/dl、ビオチン
200μg/dl、大豆加水分解物（N量として165mg/dl）を含
み、NaOHでpH7.0に調整した培地に植菌し、31.5℃で24
時間シード培養を行った。

【００５２】上記シード培養液1mlを、グルコース4g/d
l、硫酸アンモニウム6.5g/dl、KH₂PO ₄ 0.5g/dl、MgSO₄
0.04g/dl、FeSO₄ 0.001g/dl、MnSO₄ 0.01g/dl、ビタミ
ンB₁ 5μg/dl、ビオチン5μg/dl、大豆加水分解物（N量
として45mg/dl）を含み、KOHでpHを7.0に調整した培地
に植菌し、フラスコにて31.5℃で50時間振とう培養を行
った。各菌株の培養液中のＬ−アルギニン蓄積量（濃度
(mg/dl)）を測定した結果を表２に示す。その結果、arg
R破壊株は、親株に比べて著量のＬ−アルギニンを生成
した。

【００５３】

【表２】表２ ───────────────────── 菌株 L-アルキ゛ニン蓄積量（mg/dl） ───────────────────── AJ13029 20 AJ13029ΔR 120 ─────────────────────

【００５４】

【配列表の説明】配列番号１：ストレプトコッカス・フ
ェカリスのカナマイシン耐性遺伝子増幅用プライマー 配列番号２：ストレプトコッカス・フェカリスのカナマ
イシン耐性遺伝子増幅用プライマー 配列番号３：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー 配列番号４：pHSG399のベクター部分増幅用プライマー 配列番号５：pSFK6の複製制御領域部分の塩基配列 配列番号６：pSFK6中のORFによってコードされ得るアミ
ノ酸配列 配列番号７：p48Kの複製制御領域部分の塩基配列 配列番号８：p48K中のORFによってコードされ得るアミ
ノ酸配列 配列番号９：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号10：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号11：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号12：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第１回目PCR用プライマー 配列番号13：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第２回目PCR用プライマー 配列番号14：pSFK6に1534番目のC→Tの変異を導入する
ための第２回目PCR用プライマー 配列番号15：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号16：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号17：argR遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列 配列番号18：前記ＤＮＡ断片がコードし得るアミノ酸配
列 配列番号19：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号20：argR遺伝子増幅用プライマー 配列番号21：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子
ORF以外の部分を増幅するためのプライマー 配列番号22：argR遺伝子を含むプラスミドのargR遺伝子
ORF以外の部分を増幅するためのプライマー

【００５５】

【発明の効果】本発明により、Ｌ−アルギニン生産能を
有するコリネ型細菌のＬ−アルギニン生産能を向上させ
ることができる。

【００５６】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc.（味の素株式会社） <120> コリネ型細菌のアルギニンリプレッサー欠失株及びＬ−アルギニンの製造 法 <130> P-8772 <140> <141> 2001-04-13 <150> JP2000-129167 <151> 2000-04-28 <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５７】 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 1 cccgttaact gcttgaaacc caggacaata ac 32

【００５８】 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying kanamycin resistant gene of Streptococcus faecalis <400> 2 cccgttaaca tgtacttcag aaaagattag 30

【００５９】 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 3 gatatctacg tgccgatcaa cgtctc 26

【００６０】 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Escherichia coli cloning vector pHSG399 <400> 4 aggccttttt ttaaggcagt tattg 25

【００６１】 <210> 5 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 5 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 ccctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacacccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca cct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gcg ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aag ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tcc tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcgaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc ttcggctagt ttttgcttct ccgctttgat gagttggtca acttcgtgtt 3998 gggagaggtc gtttttcacg atgcgtcgaa tgtggtcgtt gtgggtgctg agttggtgtg 4058 agaggtagtg gggttctggg atttcggcga gttggtcgag gttggtgtag tgcgggttgc 4118 ggcctggttg gttgggttcg ctggggaggt cgatgtatcc ggttgagtct ccggcgtggt 4178 tgaagtgaat taggcgttgg tagccgtatt cctggttggg gaggtacgac agaatgagga 4238 agtttggtgc ttctcctgca atgagtcgtg cgtgttcgta gttcggtact gggtcgtgct 4298 cggggagaat gttcttttgg gtcatggctt ctctttctgt tgctctgtaa gtccgtatgt 4358 gggcatggga aagccccggc aaccctttgg gtcaaccggg gctagatagt cgcttagaat 4418 ggcttctagg ctgcgtctcg gggtgtggc 4447

【００６２】 <210> 6 <211> 427 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 6 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Pro Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425

【００６３】 <210> 7 <211> 4447 <212> DNA <213> Brevibacterium lactofermentum <220> <221> CDS <222> (1318)..(2598) <400> 7 aagcttgtct acgtctgatg ctttgaatcg gacggacttg ccgatcttgt atgcggtgat 60 ttttccctcg tttgcccact ttttaatggt ggccggggtg agagctacgc gggcggcgac 120 ctgctgcgct gtgatccaat attcggggtc gttcactggt tcccctttct gatttctggc 180 atagaagaac ccccgtgaac tgtgtggttc cgggggttgc tgatttttgc gagacttctc 240 gcgcaattcc ctagcttagg tgaaaacacc atgaaacact agggaaacac ccatgaaaca 300 cccattaggg cagtagggcg gcttcttcgt ctagggcttg catttgggcg gtgatctggt 360 ctttagcgtg tgaaagtgtg tcgtaggtgg cgtgctcaat gcactcgaac gtcacgtcat 420 ttaccgggtc acggtgggca aagagaacta gtgggttaga cattgttttc ctcgttgtcg 480 gtggtggtga gcttttctag ccgctcggta aacgcggcga tcatgaactc ttggaggttt 540 tcaccgttct gcatgcctgc gcgcttcatg tcctcacgta gtgccaaagg aacgcgtgcg 600 gtgaccacga cgggcttagc ctttgcctgc gcttctagtg cttcgatggt ggcttgtgcc 660 tgcgcttgct gcgcctgtag tgcctgttga gcttcttgta gttgctgttc tagctgtgcc 720 ttggttgcca tgctttaaga ctctagtagc tttcctgcga tatgtcatgc gcatgcgtag 780 caaacattgt cctgcaactc attcattatg tgcagtgctc ctgttactag tcgtacatac 840 tcatatttac ctagtctgca tgcagtgcat gcacatgcag tcatgtcgtg ctaatgtgta 900 aaacatgtac atgcagattg ctgggggtgc agggggcgga gccaccctgt ccatgcgggg 960 tgtggggctt gccccgccgg tacagacagt gagcaccggg gcacctagtc gcggataccc 1020 cccctaggta tcggacacgt aaccctccca tgtcgatgca aatctttaac attgagtacg 1080 ggtaagctgg cacgcatagc caagctaggc ggccaccaaa caccactaaa aattaatagt 1140 tcctagacaa gacaaacccc cgtgcgagct accaactcat atgcacgggg gccacataac 1200 ccgaaggggt ttcaattgac aaccatagca ctagctaaga caacgggcac aacatccgca 1260 caaactcgca ctgcgcaacc ccgcacaaca tcgggtctag gtaacactga aatagaa 1317 gtg aac acc tct aag gaa ccg cag gtc aat gag ggt tct aag gtc act 1365 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 cgc gct agg gcg tgg cgt agg caa aac gtc atg tac aag atc acc aat 1413 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 agt aag gct ctg gcg ggg tgc cat agg tgg cgc agg gac gaa gct gtt 1461 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 gcg gtg tcc tgg tcg tct aac ggt gct tcg cag ttt gag ggt ctg caa 1509 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 aac tct cac tct cgc tgg ggg tca tct ctg gct gaa ttg gaa gtc atg 1557 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 ggc gaa cgc cgc att gag ctg gct att gct act aag aat cac ttg gcg 1605 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 gcg ggt ggc gcg ctc atg atg ttt gtg ggc act gtt cga cac aac cgc 1653 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 tca cag tca ttt gcg cag gtt gaa gcg ggt att aag act gcg tac tct 1701 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 tcg atg gtg aaa aca tct cag tgg aag aaa gaa cgt gca cgg tac ggg 1749 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 gtg gag cac acc tat agt gac tat gag gtc aca gac tct tgg gcg aac 1797 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 ggt tgg cac ttg cac cgc aac atg ctg ttg ttc ttg gat cgt cca ctg 1845 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 tct gac gat gaa ctc aag gca ttt gag gat tcc atg ttt tcc cgc tgg 1893 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 tct gct ggt gtg gtt aag gcc ggt atg gac gcg cca ctg cgt gag cac 1941 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 ggg gtc aaa ctt gat cag gtg tct acc tgg ggt gga gac gct gcg aaa 1989 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 atg gca acc tac ctc gct aag ggc atg tct cag gaa ctg act ggc tcc 2037 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 gct act aaa acc gcg tct aaa ggg tcg tac acg ccg ttt cag atg ttg 2085 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 gat atg ttg gcc gat caa agc gac gcc ggc gag gat atg gac gct gtt 2133 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 ttg gtg gct cgg tgg cgt gag tat gag gtt ggt tct aaa aac ctg cgt 2181 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 tcg tct tgg tca cgt ggg gct aag cgt gct ttg ggc att gat tac ata 2229 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 gac gct gat gta cgt cgt gaa atg gaa gaa gaa ctg tac aag ctc gcc 2277 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 ggt ctg gaa gca ccg gaa cgg gtc gaa tca acc cgc gtt gct gtt gct 2325 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 ttg gtg aag ccc gat gat tgg aaa ctg att cag tct gat ttc gcg gtt 2373 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 agg cag tac gtt cta gat tgc gtg gat aag gct aag gac gtg gcc gct 2421 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 gcg caa cgt gtc gct aat gag gtg ctg gca agt ctg ggt gtg gat tcc 2469 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 acc ccg tgc atg atc gtt atg gat gat gtg gac ttg gac gcg gtt ctg 2517 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 cct act cat ggg gac gct act aag cgt gat ctg aat gcg gcg gtg ttc 2565 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 gcg ggt aat gag cag act att ctt cgc acc cac taaaagcggc ataaaccccg 2618 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425 ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg gggcaaacta tgatgggtct 2678 tgttgttgac aatggctgat ttcatcagga atggaactgt catgctgtta tgtgcctggc 2738 tcctaatcaa agctggggac aatgggttgc cccgttgatc tgatctagtt cggattggcg 2798 gggcttcact gtatctgggg gtggcatcgt gaatagattg cacaccgtag tgggcagtgt 2858 gcacaccata gtgggcatga gtaataccta cgcgcgcgtg ggctagggct taacgcgcgt 2918 tttgccgtgc tgcggggcat acgttagcgc atacgctttt ttctgtgaaa cctttttgtg 2978 ttgttgtttc gtgttggttt cctttctgtt ggcggggcaa cttaacgcct gcgggggtgg 3038 ttgttgacgt taacgggggt agtttttatt cccctagtgg tttttcagta cgacaatcga 3098 gaaagacctg tttcagccag ttcgggtcat gttcgtcggt atggccacgt gcatagcgac 3158 cagttttcga gttcactggg atttttggtg catcaaacaa gatgtaggac aatgcggttt 3218 ctaggtctac tttttgcttt atgccgtaca agccccgtgg gtattcagcg attgattcca 3278 aggcggcttc ccagtcctgt tttgtgaagg actggcttag ttctaggtct gtgtctgggt 3338 agtactgctt gtttgtgtaa gcgccgttgg tgctcattga tgattccttt gaagtgtttg 3398 gagttcggct agtagtgcgg cgtatggtgc tgctttttgc tcgtgatagc tcgccttggc 3458 tatgaggtcg gctaggtagg tttccggggt gcctaggttg cgtaggtcta gcaaatcccg 3518 gtatgtggcc tgtgcgctgc gctggtggtg catacagtcg ttaagctggg cttttacgtc 3578 tgcgatgcgg tggcggttag gcatgttggt gtgcttcttc caagtactca cgggcgggtt 3638 ttgtgtatgc ctggcgtgat gcttctttga gctgttggag ttccgcttgg agtgcgggta 3698 gttcgtccgc gaactgcttg tggtactcgt atttctcttg ttcctgggcg atagcatttg 3758 cgttgaattg cagggcggtg agttcgtcca cgcgtcgttt tgctgcgttg gtcatggtgg 3818 cgtgccattt gcggttgtgg acgcggggtt caaggttgcg cacggctgct tcggctaggt 3878 tggtggctgc ttttttcagt gctcgggctt cccgttcctc gtccaacgag agcacctttg 3938 gtttgttggc ttcggctagt ttttgcttct ccgctttgat gagttggtca acttcgtgtt 3998 gggagaggtc gtttttcacg atgcgtcgaa tgtggtcgtt gtgggtgctg agttggtgtg 4058 agaggtagtg gggttctggg atttcggcga gttggtcgag gttggtgtag tgcgggttgc 4118 ggcctggttg gttgggttcg ctggggaggt cgatgtatcc ggttgagtct ccggcgtggt 4178 tgaagtgaat taggcgttgg tagccgtatt cctggttggg gaggtacgac agaatgagga 4238 agtttggtgc ttctcctgca atgagtcgtg cgtgttcgta gttcggtact gggtcgtgct 4298 cggggagaat gttcttttgg gtcatggctt ctctttctgt tgctctgtaa gtccgtatgt 4358 gggcatggga aagccccggc aaccctttgg gtcaaccggg gctagatagt cgcttagaat 4418 ggcttctagg ctgcgtctcg gggtgtggc 4447

【００６４】 <210> 8 <211> 427 <212> PRT <213> Brevibacterium lactofermentum <400> 8 Val Asn Thr Ser Lys Glu Pro Gln Val Asn Glu Gly Ser Lys Val Thr 1 5 10 15 Arg Ala Arg Ala Trp Arg Arg Gln Asn Val Met Tyr Lys Ile Thr Asn 20 25 30 Ser Lys Ala Leu Ala Gly Cys His Arg Trp Arg Arg Asp Glu Ala Val 35 40 45 Ala Val Ser Trp Ser Ser Asn Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gly Leu Gln 50 55 60 Asn Ser His Ser Arg Trp Gly Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Val Met 65 70 75 80 Gly Glu Arg Arg Ile Glu Leu Ala Ile Ala Thr Lys Asn His Leu Ala 85 90 95 Ala Gly Gly Ala Leu Met Met Phe Val Gly Thr Val Arg His Asn Arg 100 105 110 Ser Gln Ser Phe Ala Gln Val Glu Ala Gly Ile Lys Thr Ala Tyr Ser 115 120 125 Ser Met Val Lys Thr Ser Gln Trp Lys Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gly 130 135 140 Val Glu His Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Val Thr Asp Ser Trp Ala Asn 145 150 155 160 Gly Trp His Leu His Arg Asn Met Leu Leu Phe Leu Asp Arg Pro Leu 165 170 175 Ser Asp Asp Glu Leu Lys Ala Phe Glu Asp Ser Met Phe Ser Arg Trp 180 185 190 Ser Ala Gly Val Val Lys Ala Gly Met Asp Ala Pro Leu Arg Glu His 195 200 205 Gly Val Lys Leu Asp Gln Val Ser Thr Trp Gly Gly Asp Ala Ala Lys 210 215 220 Met Ala Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Met Ser Gln Glu Leu Thr Gly Ser 225 230 235 240 Ala Thr Lys Thr Ala Ser Lys Gly Ser Tyr Thr Pro Phe Gln Met Leu 245 250 255 Asp Met Leu Ala Asp Gln Ser Asp Ala Gly Glu Asp Met Asp Ala Val 260 265 270 Leu Val Ala Arg Trp Arg Glu Tyr Glu Val Gly Ser Lys Asn Leu Arg 275 280 285 Ser Ser Trp Ser Arg Gly Ala Lys Arg Ala Leu Gly Ile Asp Tyr Ile 290 295 300 Asp Ala Asp Val Arg Arg Glu Met Glu Glu Glu Leu Tyr Lys Leu Ala 305 310 315 320 Gly Leu Glu Ala Pro Glu Arg Val Glu Ser Thr Arg Val Ala Val Ala 325 330 335 Leu Val Lys Pro Asp Asp Trp Lys Leu Ile Gln Ser Asp Phe Ala Val 340 345 350 Arg Gln Tyr Val Leu Asp Cys Val Asp Lys Ala Lys Asp Val Ala Ala 355 360 365 Ala Gln Arg Val Ala Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Asp Ser 370 375 380 Thr Pro Cys Met Ile Val Met Asp Asp Val Asp Leu Asp Ala Val Leu 385 390 395 400 Pro Thr His Gly Asp Ala Thr Lys Arg Asp Leu Asn Ala Ala Val Phe 405 410 415 Ala Gly Asn Glu Gln Thr Ile Leu Arg Thr His 420 425

【００６５】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 9 aaacccgggc tacgtctgat gctttgaatc 30

【００６６】 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 10 tttgatcccc cgttaacgtc aacaacc 27

【００６７】 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 11 ttttcccggg agcttgccac accccgag 28

【００６８】 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 12 gggggtcatc tctggctgaa ttgg 24

【００６９】 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 13 gaggttttca ccgttctgca tgcc 24

【００７０】 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for introducing mutation to pAM330 <400> 14 aactcaccgc cctgcaattc aac 23

【００７１】 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 15 gcctaccgcg gcaaagaagt ggcag 25

【００７２】 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 16 gccttgaact aggggcgctt taagt 25

【００７３】 <210> 17 <211> 4235 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum <220> <221> CDS <222> (1852)..(2364) <400> 17 aaacccgggt tttcttctgc aactcgggcg ccgaagcaaa cgaggctgct ttcaagattg 60 cacgcttgac tggtcgttcc cggattctgg ctgcagttca tggtttccac ggccgcacca 120 tgggttccct cgcgctgact ggccagccag acaagcgtga agcgttcctg ccaatgccaa 180 gcggtgtgga gttctaccct tacggcgaca ccgattactt gcgcaaaatg gtagaaacca 240 acccaacgga tgtggctgct atcttcctcg agccaatcca gggtgaaacg ggcgttgttc 300 cagcacctga aggattcctc aaggcagtgc gcgagctgtg cgatgagtac ggcatcttga 360 tgatcaccga tgaagtccag actggcgttg gccgtaccgg cgatttcttt gcacatcagc 420 acgatggcgt tgttcccgat gtggtgacca tggccaaggg acttggcggc ggtcttccca 480 tcggtgcttg tttggccact ggccgtgcag ctgaattgat gaccccaggc aagcacggca 540 ccactttcgg tggcaaccca gttgcttgtg cagctgccaa ggcagtgctg tctgttgtcg 600 atgacgcttt ctgcgcagaa gttacccgca agggcgagct gttcaaggta cttcttgcca 660 aggttgacgg cgttgtagac gtccgtggca ggggcttgat gttgggcgtg gtgctggagc 720 gcgacgtcgc aaagcaagct gttcttgatg gttttaagca cggcgttatt ttgaatgcac 780 cggcggacaa cattatccgt ttgaccccgc cgctggtgat caccgacgaa gaaatcgcag 840 acgcagtcaa ggctattgcc gagacaatcg cataaaggac ttaaacttat gacttcacaa 900 ccacaggttc gccatttcct ggctgatgat gatctcaccc ctgcagagca ggcagaggtt 960 ttgaccctag ccgcaaagct caaggcagcg ccgttttcgg agcgtccact cgagggacca 1020 aagtccgttg cagttctttt tgataagact tcaactcgta ctcgcttctc cttcgacgcg 1080 ggcatcgctc atttgggtgg acatgccatc gtcgtggatt ccggcagctc acagatgggt 1140 aagggcgaga ccctgcagga caccgcagct gtattgtccc gctacgtgga agcaattgtg 1200 tggcgcacct acgcacacag caatttccac gccatggcgg agacgtccac tgtgccgctg 1260 gtgaactcct tgtccgatga tctgcaccca tgccagattc tggctgatct gcagaccatc 1320 gtggaaaacc tcagccctga agaaggccca gcaggcctta agggtaagaa ggctgtgtac 1380 ctgggcgatg gcgacaacaa catggccaac tcctacatga ttggctttgc caccgcgggc 1440 atggatattt ccatcatcgc tcctgaaggg ttccagcctc gtgcggaatt cgtggagcgc 1500 gcggaaaagc gtggccagga aaccggcgcg aaggttgttg tcaccgacag cctcgacgag 1560 gttgccggcg ccgatgttgt catcaccgat acctgggtat ccatgggtat ggaaaacgac 1620 ggcatcgatc gcaccacacc tttcgttcct taccaggtca acgatgaggt catggcgaaa 1680 gctaacgacg gcgccatctt cctgcactgc cttcctgcct accgcggcaa agaagtggca 1740 gcctccgtga ttgatggacc agcgtccaaa gttttcgatg aagcagaaaa ccgcctccac 1800 gctcagaaag cactgctggt gtggctgctg gccaaccagc cgaggtaaga c atg tct 1857 Met Ser 1 ctt ggc tca acc ccg tca aca ccg gaa aac tta aat ccc gtg act cgc 1905 Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val Thr Arg 5 10 15 act gca cgc caa gct ctc att ttg cag att ttg gac aaa caa aaa gtc 1953 Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln Lys Val 20 25 30 acc agc cag gta caa ctg tct gaa ttg ctg ctg gat gaa ggc atc gat 2001 Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly Ile Asp 35 40 45 50 atc acc cag gcc acc ttg tcc cgg gat ctc gat gaa ctc ggt gca cgc 2049 Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly Ala Arg 55 60 65 aag gtt cgc ccc gat ggg gga cgc gcc tac tac gcg gtc ggc cca gta 2097 Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly Pro Val 70 75 80 gat agc atc gcc cgc gaa gat ctc cgg ggt ccg tcg gag aag ctg cgc 2145 Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys Leu Arg 85 90 95 cgc atg ctt gat gaa ctg ctg gtt tct aca gat cat tcc ggc aac atc 2193 Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly Asn Ile 100 105 110 gcg atg ctg cgc acc ccg ccg gga gct gcc cag tac ctg gca agt ttc 2241 Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala Ser Phe 115 120 125 130 atc gat agg gtg ggg ctg aaa gaa gtc gtt ggc acc atc gct ggc gat 2289 Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala Gly Asp 135 140 145 gac acc gtt ttt gtt ctc gcc cgt gat ccg ctc aca ggt aaa gaa cta 2337 Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys Glu Leu 150 155 160 ggt gaa tta ctc agc ggg cgc acc act taaagcgccc ctagttcaag 2384 Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr 165 170 gcttgttaat cgcttgttaa tgcaggcagg taaggtataa cccgagtgtt ttttcgagga 2444 ataccaaccc tttcaacaca ataattttct ttaaacatcc ttgctgtcca ccacggctgg 2504 caaggaactt aaaatgaagg agcacacctc atgactaacc gcatcgttct tgcatactcc 2564 ggcggtctgg acaccactgt ggcaattcca tacctgaaga agatgattga tggtgaagtc 2624 atcgcagttt ctctcgacct gggccagggt ggagagaaca tggacaacgt tcgccagcgt 2684 gcattggatg ccggtgcagc tgagtccatc gttgttgatg caaaggatga gttcgctgag 2744 gagtactgcc tgccaaccat caaggcaaac ggcatgtaca tgaagcagta cccactggtt 2804 tctgcaatct cccgcccact gatcgtcaag cacctcgttg aggctggcaa gcagttcaac 2864 ggtacccacg ttgcacacgg ctgcactggt aagggcaacg accaggttcg tttcgaggtc 2924 ggcttcatgg acaccgatcc aaacctggag atcattgcac ctgctcgtga cttcgcatgg 2984 acccgcgaca aggctatcgc cttcgccgag gagaacaacg ttccaatcga gcagtccgtg 3044 aagtccccat tctccatcga ccagaacgtc tggggccgcg ctattgagac cggttacctg 3104 gaagatctgt ggaatgctcc aaccaaggac atctacgcat acaccgagga tccagctctg 3164 ggtaacgctc cagatgaggt catcatctcc ttcgagggtg gcaagccagt ctccatcgat 3224 ggccgtccag tctccgtact gcaggctatt gaagagctga accgtcgtgc aggcgcacag 3284 ggcgttggcc gccttgacat ggttgaggac cgtctcgtgg gcatcaagtc ccgcgaaatc 3344 tacgaagcac caggcgcaat cgcactgatt aaggctcacg aggctttgga agatgtcacc 3404 atcgagcgcg aactggctcg ctacaagcgt ggcgttgacg cacgttgggc tgaggaagta 3464 tacgacggcc tgtggttcgg acctctgaag cgctccctgg acgcgttcat tgattccacc 3524 caggagcacg tcaccggcga tatccgcatg gttctgcacg caggttccat caccatcaat 3584 ggtcgtcgtt ccagccactc cctgtacgac ttcaacctgg ctacctacga caccggcgac 3644 accttcgacc agaccctggc taagggcttt gtccagctgc acggtctgtc ctccaagatc 3704 gctaacaagc gcgatcgcga agctggcaac aactaagcca ccttttcaag catccagact 3764 agaacttcaa gtatttagaa agtagaagaa caccacatgg aacagcacgg aaccaatgaa 3824 ggtgcgctgt ggggcggccg cttctccggt ggaccctccg aggccatgtt cgccttgagt 3884 gtctccactc atttcgactg ggttttggcc ccttatgatg tgttggcctc caaggcacac 3944 gccaaggttt tgcaccaagc agagctactt tctgatgaag atctagccac catgctggct 4004 ggtcttgatc agctgggcaa ggatgtcgcc gacggaacct tcggtccgct gccttctgat 4064 gaggatgtgc acggcgcgat ggaacgcggt ctgattgacc gcgttggtcc tgaggtgggc 4124 ggccgtctgc gcgctggtcg ttcccgcaac gaccaggtgg caaccctgtt ccgcatgtgg 4184 gtccgcgacg cagtgcgcga catcgcgctg ggaacaaccg agcttgtcga c 4235

【００７４】 <210> 18 <211> 171 <212> PRT <213> Brevibacterium flavum <400> 18 Met Ser Leu Gly Ser Thr Pro Ser Thr Pro Glu Asn Leu Asn Pro Val 1 5 10 15 Thr Arg Thr Ala Arg Gln Ala Leu Ile Leu Gln Ile Leu Asp Lys Gln 20 25 30 Lys Val Thr Ser Gln Val Gln Leu Ser Glu Leu Leu Leu Asp Glu Gly 35 40 45 Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Leu Ser Arg Asp Leu Asp Glu Leu Gly 50 55 60 Ala Arg Lys Val Arg Pro Asp Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Val Gly 65 70 75 80 Pro Val Asp Ser Ile Ala Arg Glu Asp Leu Arg Gly Pro Ser Glu Lys 85 90 95 Leu Arg Arg Met Leu Asp Glu Leu Leu Val Ser Thr Asp His Ser Gly 100 105 110 Asn Ile Ala Met Leu Arg Thr Pro Pro Gly Ala Ala Gln Tyr Leu Ala 115 120 125 Ser Phe Ile Asp Arg Val Gly Leu Lys Glu Val Val Gly Thr Ile Ala 130 135 140 Gly Asp Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Arg Asp Pro Leu Thr Gly Lys 145 150 155 160 Glu Leu Gly Glu Leu Leu Ser Gly Arg Thr Thr 165 170

【００７５】 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 19 cccgggtttt cttctgcaac tcggg 25

【００７６】 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 20 gtcgacaagc tcggttgttc ccagc 25

【００７７】 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 21 cccctagttc aaggcttgtt aatc 24

【００７８】 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 22 gtcttacctc ggctggttgg ccagc 25

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpK1の構築過程を示す図。

【図２】プラスミドpSFK6の構築過程を示す図。

【図３】プラスミドpSFKT2の構築過程を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 13/10 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 森 由起子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA71 CA01 DA10 GA11 4B064 AE24 CA02 CA19 CC24 DA01 4B065 AA22X AA22Y AA24X AA24Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA44

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルギニンリプレッサーが正常に機能せ
   ず、かつ、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細
   菌。
2. 【請求項２】 前記コリネ型細菌は、染色体上のアルギ
   ニンリプレッサーをコードする遺伝子が破壊されたこと
   により、アルギニンリプレッサーが正常に機能しないこ
   とを特徴とする請求項１記載のコリネ型細菌。
3. 【請求項３】 前記アルギニンリプレッサーは、配列番
   号１８に示すアミノ酸配列又は同アミノ酸配列と相同性
   を有するアミノ酸配列を有する請求項２記載のコリネ型
   細菌。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を培地で培養し、培地中にＬ−アルギニンを
   生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴
   とするＬ−アルギニンの製造法。