JP2001525797A - ウイルスｒｎａへのミスコーディングリボヌクレオシドアナログの組込みによるウイルス変異の誘導 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、HIV及びHCVを含むRNAウイルス、又はRNA中間体を通じて複製するウイルスの変異を誘導するためのリボヌクレオシドアナログの同定及び使用に関する。ウイルスの変異比率の増加は、ウイルスの子孫世代の生存能力を減少させ、それによりウイルスの複製を阻害する。これらの方法及び関連する組成物に加えて、本発明は、変異誘発能力についてリボヌクレオシドアナログをスクリーニングするための方法及び組合せ化学ライブラリーを供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ウイルスRNAへのミスコーディングリボヌクレオシドアナログの組込みによるウ イルス変異の誘導 発明の背景 本発明は、HIV及びHCV、又はRNA中間体を通じて複製するウイルスを含むRNAウ イルスの変異を誘発するためのリボヌクレオシドアナログの同定及び使用に関す る。 RNAウイルスの病気は、AIDS、肝炎、呼吸管のライノウイルス感染、かぜ、は しか、及びポリオ等を含む人間の大部分のウイルスの病的状態及びウイルス病の 死亡の原因である。後天性免疫不全症候群（“AIDS”）は、現在、流行している 致死的なヒトの病気である。現在の評価では、合衆国において約100万人の生存 中の感染した個体及び世界で数千万人いることである。疫学的証拠は、この病気 がヒト免疫不全ウイルス、HIV-1又はHIV-2により引きおこされることを示す。 HIVは、いくつかの理由のため根絶するのが特に困難である。それは、その ウイルスがその遺伝子材料を感染した細胞のゲノムに永久的に組み込むこと、そ れが排他的に高い割合で複製し（Perelson，A.S.，Science 271:1582(1966)、変 異する（Larder，B.A.，Science 246:1155(1989)し、それにより免疫不活性化を 回避すること、及びそれが感染を制御するのに最も重要な免疫系構成物に特異的 に感染し、破壊することを含む。現在、感染の防止のための有効なワクチンはな く、プロテアーゼインヒビターに関する組み合わせ療法についての予備的な成功 例を除いて、この致死的病気の治療はほとんどない。更に、そのウイルスは迅速 に変異を発達させ、今日 までテストされた全ての化学療法剤に対して耐性を獲得している。 全ての現在、認可されている抗AIDS薬剤はヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素（ HIV RT）又はウイルスによりコードされるプロテアーゼ又はそれらの組合せを阻 害するようにデザインされている。HIV RTに対する化学物質は、HIV DNA合成を 終了させるデオキシヌクレオシドアナログ又は逆転写酵素を阻害する非ヌクレオ シドアナログである(Larder，B.A.，J.Gen.Virol．75:951(1994))。全てのAIDS 療法の導入概念は、薬剤に、ウイルスによりコードされたタンパク質の生産又は 成熟を妨害させることにより更なる複製を防止することである。不幸なことに、 これらの薬剤の治療効率は、耐性ウイルス変異の出現により一般的に低下する。 HIVの変異比率はヒト細胞の変異比率より100万倍大きいと評価されている。現在 、薬剤の組合せが個体においてウイルス負荷を減少させるのにより有効であるこ とが示されており、このウイルス負荷の削減が寿命を延ばすことが希望される（ Ho，D.，Science 272:1125(1996)）。循環するウイルスの減少が感染した個体に おいて薬剤耐性変異の発達を防止するであろうか否かが決定され続けている。更 に、プロテアーゼインヒビター(PRI)耐性ウイルスの出現を遅め又は防ぐ現在の 治療法の難しさは、それらが一慣して結びつきそうもないほどきびしく、従って 、PRI耐性ウイルスの広がりは時間とともにおこり、増加し、薬剤効能の期待を 急速に奪っている。更に、HIVの高い変異比率は、多重療法が個体に有効であり 得る一方、感染した集団内のHIVの遺伝的構成が変化し、いずれの広く用いられ る療法に対しても耐性になるであろうことを保証する。 同じく治療するのが難しいRNA中間体を通じて複製するRNA又はDNAウイルスに より引きおこされるいくつかの他の慢性的持続的病気がある。ヒトウイルス病の 例は、Ｂ及びＣ型肝炎、Ｔ細胞ヒト白 血病及び他の病気である。動物の重要なRNAウイルス病は、ネコ白血病及び免疫 不全、ヒツジのビスナ・マエジ（Visna maedi）、ウマ感染性貧血症、ヤギ関節 炎脳炎及びウシ白血病を含む。これらの病気に関連するウイルスはRNA依存性DNA ポリメラーゼにより複製されるが、RNAゲノムは哺乳動物RNAポリメラーゼにより 合成される。 Ｂ型肝炎は、RNA中間体を通してそのゲノムを複製するDNAウイルスにより引き おこされる(Summers及びMason，Cell 29:4003(1982))。有効なワクチンが予防法 として存在するが、慢性の持続性の感染のために効能のある治療法はない。現在 、ウイルスを保有する５千万の個体が保有者であり、慢性的に感染していると評 価される。Ｂ型肝炎の慢性的な感染は一次肝癌及び不変的に致死性の癌の217倍 の増加と関連している(Beasley及びHwang，Seminars in Liver Disease 4:113(1 984))。ヘアリーセル白血病はHTLV-1感染と関連しており、日本で流行している( Ehrlichら、Virology 186:619(1992))。RNA腫瘍ウイルスのこのヒト癌との関連 は、RNAウイルスの他のヒト癌との関係を予想し得るが、これは確立されている ところである。 最後に、いくつかの一般的なヒトの病気は、ウイルスによりコードされたRNA レプリカーゼにより複製されるRNAウイルスにより引きおこされる。このグルー プには、インフルエンザ(Zurcher，ら.，J.Gen.Virol．77:1745（1996）、Ｃ型 肝炎(Gretch，ら.，Ann.Intern.Med．123:321(1995)、デング熱（Becker，Virus -Genes 9:33(1994)、及びライノウイルス感染（Horsnell，ら.，J.Gen.Virol.， 76:2549(1995)が含まれる。ウイルスRNAレプリカーゼによるこれらのウイルスの 複製は誤りを生ずる傾向があり、これによりこれらのウイルスは迅速に進化し、 慣用的な薬剤又は免疫療法を逃 れる。現在、これらの病気のための有効な療法はない。インフルエンザに対する ワクチン接種は有効であり得るが、ウイルスゲノムの迅速な進化の結果、以前の 年にまん延した株において固定された変異により、毎年、新しいワクチンを作り 出さなければならない。Ｃ型肝炎の現在の治療はインターフェロンを用いるが、 それはめったに病気を治癒させない。 これにより、RNAウイルスが媒介する病気の有効な予防又は緩和についての必 要性がある。本発明は、この必要性を満足し、更に関連する利点を供する。 発明の概要 本発明は、ウイルス複製を阻害するための新しいストラテジーを供する。本発 明の方法において、ウイルスの変異比率を劇的に増加させるためにリボヌクレオ シドアナログを用いる。このウイルスの変異率の増加はウイルスの子孫形成の生 存性を減少させ、それによりウイルス複製を阻害する。これらの方法及び関連す る組成物に加えて、本発明は、変異誘発能についてリボヌクレオシドアナログを スクリーニングするための方法及び組合せ化学ライブラリーを供する。本明細書 に供される方法は、RNAウイルスを攻撃するための現在のアプローチに逆らうも のである。現在の方法はウイルス酵素及びウイルス核酸のホストDNAへの組込み を妨害又は阻害することに関するが、本発明はウイルスの複製における細胞及び ウイルスのRNAポリメラーゼの役割を標的にする。 本発明の方法の多くにおいて、リボヌクレアーゼアナログは、RNAポリメラー ゼによりウイルスゲノム核酸をコードするDNAに組み込まれる。好ましい実施形 態において、多重RNAヌクレオチドアナログはウイルスに感染した細胞に投与さ れる。 これにより、一つのクラスの実施形態において、本発明は、RNAヌクレオシド アナログをウイルスに感染した細胞に投与することによりウイルスの変異率を増 加させる方法を供する。その細胞は、培養におけるものでも動物、例えばヒト患 者に存在するものでもよい。アナログは、RNAポリメラーゼによりウイルスをコ ードするゲノム核酸のRNAコピーに組み込まれ、それによりウイルスの変異を誘 導する。 好ましい実施形態において、RNAヌクレオシドアナログは、１又は複数の天然 リボヌクレオシドを置換する。鋳型依存性ポリメラーゼはその鋳型中の相補性又 は非相補性ヌクレオシドの反対方向にリボヌクレオシドを組み込むであろう。次 の組み込まれたアナログの複製はウイルスゲノムを変異させるであろう。これは 、核酸の鋳型依存の複製において多様性を生じる。時間経過に伴い、これらの誘 導されたバリエーション（即ち突然変異）の蓄積が子孫ウイルスの生存性を損失 させる。 元来、RNAヌクレオシドアナログはRNAポリメラーゼにより天然の相補核酸の少 くとも約0.1％の効率でゲノム核酸のRNAコピーに組み込まれる。これにより、10 00塩基中に約１つの誤差率が誘導される。比較において、典型的なポリメラーゼ 誤差比率は10,000〜10,000,000の組み込まれた塩基中に１のオーダーである。 RNAヌクレオシド又はリボヌクレオシドは、関心のウイルスをコードするゲノ ム核酸のRNAコピーにポリメラーゼにより組み込まれた時に天然のリボヌクレオ シドを置換するであろうアナログであって、第２のリボヌクレオチドと相補的で ウイルスの変異を誘導するものであろう。典型的には、リボヌクレオシドアナロ グは、シチジン、ウリジン、アデノシン又はグアノシンのアナログのいずれかで あろうが、シチジン及びウリジンのアナログが最も好ましい。１つ のクラスの好ましいシチジンヌクレオシドアナログは、Ｎ⁴−アミノシチジン、 Ｎ¹−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシ チジン、５−ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロ キシエチル）シチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチ ル−Ｎ⁴−アミノシチジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５− （ヒドロキシアルキル）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチ ジングリコールからなる群から選択される。好ましいウリジンアナログのクラス は、５−ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリ ジン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴ −メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−ア ルキルウリジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジ ン、及び５−（チオアルキル）−ウリジンを含む。好ましいアデノシンアナログ のクラスは、１，Ｎ⁶−エテノアデノシン、３−メチルアデノシン、及びＮ⁶−メ チルアデノシンを含む。好ましいグアノシンアナログのクラスは、８−ヒドロキ シグアノシン、Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプ ロピルグアノシン、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８ −オキソ−グアノシン、２，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシ ンを含む。しかしながら、ヌクレオシドアナログは、天然のヌクレオチドに似て いないが、天然のヌクレオシドを置換し、ウイルスの変異を生じさせるであろう し、モデリング研究又は他の同様の情報に基づいて開発し、合成することができ る。例えば、相当するデオキシヌクレオシドアナログについて、Bergstromら（J .Chem.Soc.Perkin Trans.（1994）3029）を参照のこと。 好ましくは、RNAポリメラーゼは哺乳動物DNAポリメラーゼII(polII)である。 例えば、ヒト及びネズミpolIIである。任意に、ポリメラーゼは、RNAポリメラー ゼIIIであり得る。 １つのクラスの実施形態において、RNAヌクレオシドアナログを含むウイルス 粒子は本発明の特徴である。細胞中でのこれらのRNA核酸のコピーの複製は、細 胞のゲノムに組み込まれた変異したウイルス核酸を生じ得る。このような変異し たウイルス核酸の存在は、ウイルスの変異及び阻害の成功の程度の指標を供する 。変異したRNA核酸は、対応する天然の核酸を検出するためのプローブとして、 例えばノーザンブロットにおいて、又は対応するDNAへの翻訳の後、サザンブロ ットによっても用いることができる。同様に、変異されたウイルス粒子は、野生 型ウイルスに対する抗血清を検出するために、例えば生物サンプルでのウエスタ ン又はELISAアッセイにおいて用いることができる。 本発明は、複製されたウイルス核酸の高度に可変性の集団を含む細胞の集団も 供する。この高度に可変性のウイルスの集団は、ウイルスに感染した細胞への変 異原性ヌクレオシドアナログを投与し、そのウイルス集団の変異率を増加させる ことから生ずる。これにより、ウイルスの高度に可変性の集団は、ウイルスの変 異率がヌクレオシドアナログの投与により増加されたことのインジケーターであ る。その集団の多様性の測定は、ウイルス集団の生存性の評価を供する。かわり に、ウイルス集団の生存性は、細胞集団の健康のための予後のインジケーターで ある。例えば、ヒト患者におけるHIV集団についての低い生存性は、患者につい ての改善された見通しに相当する。更に、ウイルス核酸は、野生型ウイルスの存 在についての有用な診断インジケーターである、対応する天然の核酸を検出する ためのプローブとして、例えばサザン又はノーザンブロットにおい ても用いることができる。 一実施形態において、本発明は、ウイルスゲノム核酸、RNAアナログ、細胞mRN Aアナログ及びウイルスゲノムRNAアナログを含む細胞を供する。これらは、例え ばウイルス感染のために処理されるべき細胞である。これらの細胞は、例えば変 異ウイルスによる後の細胞感染において分子デコイとして機能する変異ウイルス を生産するために役立つ。変異ウイルスは、野生型ウイルスに対する抗血清の検 出のための診断試薬として、例えばELISAもしくはウエスタンアッセイ、又はサ ザンもしくはノーザンブロットにおいても役立つ。変異ウイルスは生存性が減少 されるので、それらは野生型ウイルスより少い病原性である。 ウイルスゲノム核酸は、細胞のゲノムに組み込まれたものであり得る。細胞ゲ ノムに組み込むウイルスの例は、これらに限らないがレトロウイルスを含む。１ つの特に好ましい実施形態においてウイルスはHIVである。１つの特に好ましい 実施形態においてウイルスはHIVである。他の好ましいウイルスは、HIV-1，HIV- 2，HTLV-1，HTLV-II、及びSIVを含む。あるいは、ウイルスゲノムはエピソーム のものであり得る。これらは、多くのヒト及び動物病原体、例えばフラビウイル ス、例えばデング熱、及び黄熱、フィロウイルス、例えばエボラウイルス、イン フルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、例えば、RSウイルス、はし か、おたふくかぜ、ピコルナウイルス、例えばエコーウイルス、マクサッキーウ イルス、ポリオウイルス、トガウイルス、例えば脳炎、コロノウイルス、風疹、 ブニヤウイルス、レオウイルス、例えばロタウイルス、ラブドウイルス、アレナ ウイルス、例えばリンパ球絨毛性髄膜炎並びに他のヒト及び動物のウイルスを含 む。標的化され得るレトロウイルスは、ヒトＴ細胞白血病（HTLV）ウイルス、例 えばHTLV-1及びHTLV-2、 成人Ｔ細胞白血病(ATL)、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1及びHIV-2並びに サル免疫不全ウイルス(SIV)を含む。 リボヌクレオシドアナログの変異誘発能力を検出するためのアッセイが供され る。アッセイにおいて、リボヌクレアーゼアナログは、細胞又はウイルスのRNA ポリメラーゼにより合成されたウイルスRNAに組み込まれ、その組み込みが子孫 ウイルスにおいて変異を引きおこすか否かに関して決定が行われる。特定の実施 形態において、ウイルスは、レトロウイルス、例えばHIV-1，HIV-2，HTLV-1、も しくはSIV、又はRNAウイルス、例えばＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎もしくはデ ング熱ウイルスである。 本発明のアッセイの他のクラスにおいて、細胞又はウイルスのRNAポリメラー ゼにより組み込まれるリボヌクレオシドアナログのためのスクリーニングの方法 が供される。本アッセイにおいて、RNAポリメラーゼは核酸テンプレートの存在 下でリボヌクレオシドとインキュベートされる。次に、リボヌクレオシドアナロ グの核酸ポリマーへの組込みが検出される。任意に、天然の（即ちＧ，Ａ，Ｕ、 及び／又はＣ）ヌクレオチドも核酸ポリマーに組み込まれる。その方法は、任意 に、アッセイにおけるリボヌクレオシドアナログ及びいずれかの天然リボヌクレ オシドのRNAポリマーへの組込みの比率を比較することを含む。 医薬組成物が供される。本組成物は、治療に有効な投与量の不適正対のRNAヌ クレオシドアナログ及び医薬として許容される担体を有する。好ましいRNAヌク レオシドアナログは先に特定されるものである。好ましい化合物は経口又は非経 口投与に適する。 動物においてウイルスの変異比率を増加させる方法が供される。本方法におい て、治療に有効な投与量のRNAヌクレオシドアナログが動物に投与される。例え ば、動物は、HIV-1，HIV-2，HTLV-1、Ａ 型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、デング熱ウイルスからなる群から選択されるウイ ルスが感染したヒト患者であり得る。好ましい実施形態において、RNAヌクレオ シドアナログは、動物のウイルスに感染した細胞中に存在するポリメラーゼによ り、ウイルスのゲノム核酸のRNAコピーに、天然の相補核酸の少くとも約0.1％の 効率の範囲で組み込まれる。この方法は、とりわけ、AIDS、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎 及びＴ細胞白血病のための治療を供する、非ヒト感染の治療も供される。これに は、これらに限らないが、ネコ白血病ウイルス感染、ネコ免疫不全ウイルス感染 、及び水疱性口内炎ウイルス感染が含まれる。 RNAヌクレオシド及びヌクレオチドアナログのライブラリーが供される。各々 のヌクレオシドアナログは、ウリジン、シチジン、グアノシン、アデノシン、Ｎ⁴ −アミノシチジン、Ｎ¹−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチ ジン、３−メチルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン 、５−（２−ヒドロキシエチル）シチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシ チジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、５−アミノシチジン、５−ニトロ ソシチジン、５−（ヒドロキシアルキル）−シチジン、５−（チオアルキル）− シチジン及びシチジングリコール、５−ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエ チルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジ ン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴− イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウリジン、５−ニトロソウリジン、５−（ ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び５−（チオアルキル）−ウリジン、１， Ｎ⁶−エテノアデノシン、３−メチルアデノシン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、 ８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン 、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキル グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８− アミノグアノシン及びそれらの誘導体からなる群から選択される基に共有結合し たランダムな化学置換基を含む。任意に、複数のヌクレオチドアナログが核酸に 重合される。そのライブラリーは、任意に、ヌクレオシドアナログを組み込むた めの細胞のRNAポリメラーゼを含む。そのライブラリーは、典型的には約５〜1,0 00,000の異なるアナログを含む。 変異誘発性リボヌクレオシドアナログを同定する方法が供される。本方法にお いて、複数のリボヌクレオシドアナログが、最初に、細胞又はウイルスのRNAポ リメラーゼを含む反応混合物に供される。RNAポリメラーゼはヌクレオチドアナ ログの組込みを許容する。リボヌクレオシドポリマーは、典型的に単離され、リ ボヌクレアーゼポリマーに組み込まれたリボヌクレオシドアナログの化学組成が 決定される。単離の方法は、電気泳動、カラムクロマトグラフィー、アフィニテ ィービーズ等を含む。単離されたポリマーの組成は、例えばリボヌクレオシドポ リマーを加水分解し、例えば質量分析又はNMRにより、そのポリマーの置換基を 評価することにより、決定される。 変異誘発性リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドを作る方法が供される。本 方法において、グアノシン、ウリジン、シチジン、アデノシン、Ｎ⁴−アミノシ チジン、Ｎ¹−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３− メチルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２ −ヒドロキシエチル）シチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴ −メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン 、５−（ヒドロキシアルキル）−シチジン、５− （チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５−ヒドロキシウリジン 、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ²−メチルウリジン 、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチルウリジン、Ｏ⁴−エ チルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウリジン、５−ニトロ ソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び５−（チオアルキル ）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノシン、３−メチルアデノシン、及びＮ⁶− メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶− エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ²−エテノグアノシン 、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２，Ｎ³−エテノグアノ シン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択されるリボヌクレオチド又 はリボヌクレオシドアナログが、例えば酵素フリーラジカルでの処理により、化 学的に修飾される。生じた化学的に修飾されたリボヌクレオシドアナログは、そ れがRNAポリメラーゼによりRNA分子に組み込まれたか否かを決定するためにテス トされ、その化学的に修飾されたアナログの変異誘発能力が測定される。 また、ウイルスの変異比率を増加させる方法であって、アデニン、シトシン、 グアニン、ウラシル及びチミンからなる群から選択される遊離塩基をウイルスが 感染した細胞に投与することを含む方法も本発明に含まれる。ここで、その塩基 は、ウイルスをコードするゲノム核酸のRNA又はDNAコピーにポリメラーゼにより 組み込まれる。その塩基は、第１の相補ヌクレオチドを有する第１の天然ヌクレ オチドに置き換わるが、その塩基は、第１のヌクレオチド以外の第２のヌクレオ チドにも相補的であり、それによりウイルスを変異させる。 本発明の方法を実施するための及び任意に本発明の組成物を含む キットも供される。例えば、容器並びに１又は複数の次の構成物：対照変異誘発 性RNAアナログ、テスト変異誘発性RNAアナログ、RNAポリメラーゼ、RNAポリメラ ーゼによりRNAアナログの組み込みを検出するための試薬が供される。任意に、 そのキットは、本発明の方法の実施を容易にするための説明書を含む。例えば、 １つのキットにおいて、対照変異誘発性アナログと比較してテスト変異誘発性ア ナログの変異誘発能力を検出するためのキット構成物の使用の説明書が供される 。 定義 他に示さなければ、本明細書全体に用いられる用語は、ウイルス学及び分子生 物学の分野において実施する者によりそれらに共通して関連する意味を有する。 以下の定義は、本発明とあわせて用いられる用語をより詳しく説明するために供 される。 “リボヌクレオシド”は、リボースに結合した、アデニン（Ａ）、グアニン（ Ｇ）、シトシン（Ｃ）、又はウラシル（Ｕ）のいずれかのヘテロ環式の窒素含有 塩基を含み；リン酸基の添加によりその化合物はリボヌクレオチドになる。ヌク レオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。重合したヌクレオチド、デオ キシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)は、その環境との細胞の又は生物の相互作 用を究極的に制御する遺伝情報を保存する。リボヌクレオシドは、全ての生物に おいて核酸のバルクを作り上げるRNAにおいて共通しているヌクレオシドである 。RNAのヌクレオシドは、１つのペントースの３’位及び次のペントースの５’ 位に結合したリン酸単位により一緒に連結している。 RNA中の４つの“天然ヌクレオチド”は、アデニン、グアニン、ウラシル又は シトシンを含む。互いに相補的なヌクレオチドは、そ れらの間に相補的な水素結合を形成する傾向があるものであり、特に、Ａに対す る天然の相補体はＵ、Ｕに対する天然の相補体はＡ、Ｃに対する天然の相補体は Ｇ、そしてＧに対する天然の相補体はＣである。 “核酸”は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌク レオチドポリマーであり、他に限定しなければ、天然ヌクレオチドのアナログを 包含する。 本明細書に用いる“リボヌクレオシドアナログ”は以下により詳細に定義され 、リボヌクレオシド及びそれらのトリホスフェートのアナログを含む。これらの 単量体単位はヌクレオシドアナログ（又は単量体がリン酸化されることを考慮す るなら“ヌクレオチド”）である。例えば、構造的基が、オリゴヌクレオチドへ の組込みのためにヌクレオチドのリボース又は塩基に任意に加えられる。例えば メチルもしくはアリル基がリボース上の２’−０位に、又はフルオロ基が２’− ０基に置き換わり、又はブロモ基がリボヌクレオシド塩基に加えられる。オリゴ ヌクレオチドアナログのホスホジエステル結合、又は“糖−ホスフェート骨格” は、例えばメチルホスホネート又はＯ−メチルホスフェートで置換され又は修飾 される。しかしながら、ヌクレオシドの端の保護基、例えば標準核酸合成の間に 用いられる保護基を除く天然のヌクレオシドであるヌクレオシドは本発明の目的 のためのヌクレオシドアナログに考慮されない。リボヌクレオシドアナログは、 以下に更に定義される。 “ゲノム核酸”は、ウイルス粒子によりパッキングされた天然の核酸ポリマー (RNA又はDNA)をコードする核酸と相同である核酸ポリマーである。典型的には、 パッケージングされた核酸はウイルス複製のために必要な構成物のいくつか又は 全てをコードする。ゲノム核酸は、任意に、ヌクレオチドアナログを含む。核酸 は、それらが 共通配列を有する核酸（“祖先の”核酸）からのその祖先の核酸の天然の又は人 工の修飾により得られる場合に相同である。レトロウイルスゲノム核酸は、任意 に、レトロウイルス粒子によりパッケージングされる能力のあるRNAをコードす る。このような核酸は、パッケージング部位を選択された核酸と組み換えにより 組み合わせることにより作ることができる。 標準的な核酸合成に利用される“核酸試薬”は、典型的には、リボースの３’ ヒドロキシル上に保護されたホスフェートを有する。これにより、核酸試薬は、 ヌクレオチド、ヌクレオチド試薬、ヌクレオシド試薬、ヌクレオシドホスフェー ト、ヌクレオシド−３’−ホスフェート、ヌクレオシドホスホルアミジト、ホス ホルアミジト、ヌクレオシドホスホネート、ホスホネート等として言及される。 ヌクレオチド試薬は、ホスホジエステル結合を形成するために、保護されたリン 酸基を有する。 本明細書に用いられる“保護基”は、他の反応部位で化学反応が行われる時に 分子内で１つの反応部位をブロックするようデザインされたいずれかの基をいう 。本明細書に用いられる保護基は、例えば引用により本明細書に組み込まれるGr eeneら（Protective Groups In Organic Chemistry，2nd Ed.，John Wiley & So ns，New York，NY，1991）に記載される基のいずれかであり得る。 “ウイルスが感染した細胞”は、ウイルス核酸が導入されている細胞である。 その核酸は、任意に、細胞のゲノムに組み込まれ、又は任意にエピソームのもの である。 ウイルス又は核酸の“変異（比）率”とは、例えばポリメラーゼによる、核酸 の複製に基づいておこる変化の数という。典型的には、これは、時間をおいて、 即ちウイルスの複製又は形成の回転の間におこる変化の数である。 “RNAポリメラーゼ”とは、予め存在するテンプレートポリヌクレオチド(DNA 又はRNA)に相補的であるポリリボヌクレオチド配列を生産する酵素をいう。RNA ポリメラーゼは、RNAウイルスポリメラーゼもしくはレプリカーゼ又はRNA細胞ポ リメラーゼのいずれかであり得る。“細胞ポリメラーゼ”は、細胞から得られる ポリメラーゼである。細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。そのポリメラ ーゼは、典型的には、RNAポリメラーゼ、例えばPolII又はPolIIIである。PolII 酵素が最も好ましい。“哺乳動物ポリメラーゼII”は哺乳動物から得られたRNA ポリメラーゼIIである。そのポリメラーゼは任意に天然に、又は人工的に（例え ば組み換えて）作られる。“ヒトポリメラーゼII”は、ヒト由来のRNAポリメラ ーゼIIである。そのポリメラーゼは、任意に、天然に、又は人工的に（例えば組 み換えて）作られる。“ネズミポリメラーゼII”は、マウス由来のRNAポリメラ ーゼIIである。そのポリメラーゼは、任意に、天然で、又は人工的に（例えば組 み換えて）作られる。 “細胞培養物”は、動物の外部にある細胞の集団である。これらの細胞は、任 意に、細胞バンク、動物、又は血液バンクから単離された一次細胞、又はこれら のソースのうちの１つから培養された二次細胞、又は広範囲に利用できる長期的 に人工的に維持された試験管内培養物である。 “生存能（力）の進行的喪失”とは、時間経過に伴うウイルスの集団の複製又 は感染能力の測定可能な減少をいう。 “HIV粒子”とは、HIVにより実質的にコードされるレトロウイルス粒子である 。非HIVウイルス又はその粒子中の細胞の成分の存在は、細胞膜からの出芽を典 型的に含むHIVの複製過程の一般的な結果である。特定の適用において、レトロ ウイルス粒子は、生じたレトロウイルス粒子の宿主の範囲を広げるために１超の ウイルス(し ばしばHIV及びVSV)からのウイルスタンパク質を同時発現することにより故意に “擬似分類(pseudotyped)”される。HIV粒子中の非HIV成分の存在又は欠如は粒 子の本質的特徴を変化させない。即ち、粒子は、HIV複製の一次産物としてなお 生産される。 “相同的に複製された核酸の高度に可変性の集団”は、核酸の関連する集団、 又は特定の核酸、例えばウイルスによる感染から見い出される核酸のクローン集 団からの天然又は人工的複製により得られた相同な核酸の集団である。相同な核 酸は、しばしば、それらの核酸の比較において、少くとも１％、典型的には少く とも５％、一般に少くとも10％、時々、少くとも20％、時折、少くとも30％、そ して時々少くとも40％又はそれ超の差を有する。ウイルス核酸の天然の複製は典 型的には、子孫ウイルスにおいて、0.1％未満の変化性を生ずることが認められ よう。これにより、上述のような核酸集団における１％又はそれ超の平均の差は 特定の細胞集団において複製されたウイルスの天然の集団と比べて高度に可変化 である。 以下に議論される方法が配列アラインメントを必要とする場合、このような比 較のための配列のアラインメントの方法は当該技術で公知である。比較のための 配列の最適なアラインメントは、Smith及びWaterman(1981)(Adv.Appl.Math．2:4 82)の局所的相同性アルゴリズムにより；Needleman及びWunsch(1970)(J.Mol.Bio l．48:443)の相同性アラインメントアルゴリズムにより；Pearson及びLipman(19 88)(Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85:2444)の類似性法についての調査により；これ らのアルゴリズムのコンピューター処理(例えばこれらに限らないがCLUSTAL(PC/ Gene program)(Intelligenetics，Mountain View，California)，GAP，BESTFIT ，FASTA、及びTFASTA Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Comput er Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，Wisconsin，USA)によ り行うことができ；CLUSTALプログラムは、Higgins及びSharp(1988)(Gene，73:2 37-244)及びHiggins及びSharp(1989)(CABIOS 5:151-153);Corpet,ら.，(1988)(N ucleic Acids Research 16，10881-90);Huang,ら.，(1992)(Computer Applicati ons in the Biosciences 8，155-65,)及びPearson,ら.，(1994)Methods in Mole cular Biology 24，307-31)により十分に開示される。典型的には、アラインメ ントは視察され、コンピューター補助による調整の後、手動で精密化される。 ヌクレオシドアナログの“ライブラリー”は１超の混合物又はアレイである。 その混合物又はアレイは、任意に、液体で又は固相基体上に存在する。アッセイ 構成物をアレイにおき、そのアレイの構成物の平行分析を行う方法が利用できる 。Fodorら.，(1991)(Science，251:767-777);Lipshutzら.，(1995)(BioTechniqu es 19（3）:442-447);Fodorら.，(1993)(Nature 364:555-556);及びMedl in(199 5)(Environmental Health Perspectives 244-246)を参照のこと。混合物は任意 に、マルチウエルプレート、例えば標準的96ウエルマイクロタイタープレートに おいてアッセイされる。液体混合物又は固相アッセイのいずれにおいても、ライ ブラリーは、いくつかのRNAアナログ、典型的には約１〜10,000,000、一般に約 ５〜約1,000,000のRNAアナログを含み得る。 図面の記載 図１Ａ及び１Ｂは、CEMx174細胞に対するリボヌクレオシドアナログ５−ブロ モシチジン（図１Ａ）及び５−ヒドロキシウリジン（図１Ｂ）の毒性アッセイを 示す。 図２は、以下の実施例５により詳細に記載されるような、HIV-1が感染したCEM 細胞におけるリボヌクレオシド（rN^*）テストのた めのプロトコルの道筋を示す。 図３は、４継代についての、５−ヒドロキシウリジンの存在下及び５−ブロモ シチジンの存在下又は対照の連続継代を示す。 詳細な記載 本発明は、細胞培養において及び治療において役立つウイルスの変異誘発を誘 導する新規方法に関する。この方法は、それが一般的なRNAウイルス及びRNA中間 体を有するDNAウイルスに対して役立つ方法である点で大きな利点がある。それ は特に、レトロウイルスに対して用いられる。なぜなら、他の治療アプローチと 異なり、その効能はウイルス自体の変異誘発性により妨害されない。我々の方法 は、部分的に、ウイルスRNAの及び宿主細胞メッセンジャーRNAの運命の固有の差 を利用する(Coffin，J.，Science 267:483(1995))。本発明の方法は、RNAポリメ ラーゼによりウイルスによりコードされた及び細胞によりコードされたmRNAの両 方に組み込まれたミスコーディングリボヌクレオシドを利用し、それによりゲノ ムウイルスの子孫コピーにミスコーディングを引きおこす。 本発明の方法は、レトロウイルス又はRNA中間体により複製される他のウイル スを標的化するのに用いる場合に特に有利である。ヒト細胞において、遺伝子材 料はDNAであり、それは、デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートの重合を 触媒するDNAポリメラーゼにより各々の細胞分割の間に複製される。DNAが含む情 報は、リボヌクレオシドトリホスフェートを重合するRNAポリメラーゼによりメ ッセンジャーRNAに翻訳される。新しく合成されたメッセンジャーRNAは細胞の機 能を行うタンパク質の合成を誘導する。レトロウイルスが細胞に感染した場合、 その同じ細胞のポリメラーゼが細胞のメッセンジャーRNA及びウイルスRNAを合成 する。RNAウイルス が媒介する病気の治療のために本明細書に記載される方法に関して、主な差は、 細胞のメッセンジャーRNAがタンパク質合成のために用いられ、短い半減期を有 することである。対照的に、ウイルスRNAはビリオンにパッケージングされ、新 しい細胞に感染するのに用いられる。結果として細胞のRNAでなくウイルスのRNA の変化が次の世代に引き継がれる。 本明細書に記載される方法により標的化され得るウイルスは、RNAウイルス及 びRNA中間体を通して複製するDNAウイルスを含む。例えば、本方法は、RNAウイ ルス、例えばＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウイルス、フラビウイルス、例えばデ ング熱、及び黄熱、フィロウイルス、例えばエボラウイルス、インフルエンザウ イルス、パラインフルエンザウイルス、例えば、RSウイルス、はしか、おたふく かぜ、ピコルナウイルス、例えばリノウイルス、エコーウイルス、マクサッキー ウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、（例えば脳炎を引きおこすトガウイ ルス）、コロノウイルス、風疹、ブニヤウイルス、例えばハンタウイルス、レオ ウイルス、例えばロタウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、例えばリン パ球絨毛性髄膜炎並びに他のヒト及び動物のウイルスを標的化するのに役立つで あろう。好ましいRNAウイルスは、Ｃ型肝炎、デング熱、インフルエンザ、及びR Sウイルスである。標的化され得るレトロウイルスは、ヒトＴ細胞白血病（HTLV ）ウイルス、例えばHTLV-1及びHTLV-2、成人Ｔ細胞白血病(ATL)、ヒト免疫不全 ウイルス、例えばHIV-1及びHIV-2並びにサル免疫不全ウイルス(SIV)、ネコ白血 病ウイルス（FeLV）及びネコ免疫不全ウイルス(FIV)を含む。 Ｃ型肝炎は、本発明の方法のために特によく適したウイルスである。それは、 別個の属、フラビウイルス（Flavivirus）ファミリーのヘパシウイルス（Hepaci virus ）に仮に分類される。それは約9 .5kbの大きさであり、広範囲の遺伝子型多様性を有する。培養された細胞におけ るウイルスの複製は不十分である傾向がある。チンパンジーは、テストのために 選択された動物モデルとして機能する。感染性cDNAクローンが得られる。ウイル スのためのゲノム構成は： 5’UTR（340nt）-ORF（9000nt）‐3’UTR（200〜300nt） ここで、“UTR”＝非翻訳領域 “ORF”＝オープンリーディングフレーム “nt”＝ヌクレオチドである。 オープンリーディングフレームは次の通り作製される： C-E1-E2−NS2-NS3-NS4−NS5 ここで、Ｃ＝RNA結合ヌクレオキャプシド E1／E2＝エンベロープグリコプロテイン NS2＝Zn₂及びNS3を伴うメタロプロティナーゼ NS3＝セリンプロテアーゼ、ヘリカーゼ NS4＝未知 NS5＝Ｎ末端は未知であるが、Ｃ末端はRNA依存RNAポリメラーゼである。 かぜウイルス、インフルエンザは、子供にクループ並びにより深刻な細菌性肺 炎、心臓又は神経関連症を導き得る。それは核内で複製するオルトミキソウイル スである。そのウイルス（例えばインフルエンザＡ、ATCC VR-98）は、Madin Da rbyイヌ腎細胞又はトリ胚細胞で培養することができる。 RSウイルスは幼児及び小さな子供の致死的な急性の呼吸感染の最も頻繁な原因 である。このような場合の25〜33％が深刻な入院を必要とする、それは約15kbの 大きさのパラミキソウイルスであり、極めて感染性である。株ATCC VR-955はHep 2細胞内で増殖することができ、ATCC VR-1040はVero細胞中で増殖することがで きる。 RNA中間体を通して複製するDNAウイルスはＢ型肝炎を含む。ウイルス病及びそ れらの複製に関する更なる情報は、White及びFenner（Medical Virology 4th ed ．Academic Press(1994)）並びにPrinciples and Practice of Clinical Virolo gy，ed．Zuckerman，Banatvala and Pattison，John Wiley and Sons（1994）に 見い出され得る。 本発明の方法は、高頻度でミスコードし、細胞中に存在するRNAポリメラーゼ により又はウイルスRNAポリメラーゼによりウイルスの核酸のゲノムコピーに組 み込まれるヌクレオシドアナログを利用する。宿主細胞メッセンジャーRNAもヌ クレオシドアナログを含むであろうし、tRNAと不適正対を形成してアミノ酸配列 の変化した細胞タンパク質を形成するであろうが、それは一時的な現象である。 メッセンジャーRNAによるミスコーディングは宿主細胞融合にそれほど有害でな く；これらの変化したmRNAは細胞内で短い寿命を有し、子孫細胞のゲノムに組み 込まれない。結果として、細胞mRNAによるコーディングの誤りは一時的であり、 次の細胞世代に引き継がれない。これらの毒性効果は各々の細胞分割に限られ、 蓄積しない。 対照的に、変化したヌクレオシドを含むウイルスRNAは、子孫ビリオン内に被 包される。感染した細胞において、ウイルスRNAは、レトロウイルスの場合、逆 転写され、そのDNA産物は細胞のゲノムに組み込まれるか、又はウイルス核酸は 直接、複製されて新しいウイルスRNAを作り出す。これらのアナログは高頻度で シスコードするので、逆転写反応のDNA産物又はウイルスRNAポリメラーゼのRNA 産物は非相補的ヌクレオチドを含む。結果として、ウイルスゲノムの変異は永久 保存され、各々のウイルス複製サイクルに蓄積される。対照的に、細胞のRNAはD NAに逆転写も変異RNAに複製もされず、これにより宿主ゲノムに変異を引きおこ さない。ウイルスの複 製の各々のサイクルで、ウイルスゲノム内の変異の数が鎖式に増加することを確 実にする。最後に、各々のウイルスゲノムの変異の数は大きいので、活性のある ウイルスによりコードされたタンパク質は生産されない。この方法は、宿主細胞 へ大きな毒性を引きおこすことなく、HIVのそれのような、大きなウイルス生存 能についての誤りのしきい値を超えるための特有の方法を供する。 RNAウイルスは排他的に高い比率で変異する。結果として、特定のウイルスを 定義する単一のヌクレオチド配列はなく、かわりに、RNAウイルスは共通の設立 物又は“共通”配列の周囲の配列のバリエーションを特徴とする準種(quasipeci es)として存在する。ビリオンの多くは、それらは欠損タンパク質を作り出す多 くの変異を有するので既に不活性である。ヌクレオチドアナログの組込みにより 引きおこされる変異の頻度の小さな増加は、かなり多くの誤り及び非感染性ウイ ルスの生産を導くであろう。HIVの場合、ゲノム内の誤りの頻度は約10^-3〜10^-4 であり、結果として、ウイルス複製は活性をウイルス子孫の生産のためのしきい 値の近くで機能し得る。Ｂ型肝炎の場合、そのコンパクトなゲノムは多重のタン パク質をコードし、これにより小さな誤りの増加でさえ許容されないであろう。 結果として、変異誘発の増加に基づく療法はウイルス集団を排除するのにかなり 有効であり得る。 レトロウイルス又は他のRNAウイルスの場合、修飾されたヌクレオチドが宿主 細胞酵素により組み込まれ、逆転写及び細胞質RNA複製の間にのみ変異を引きお こすという事実は、ヌクレオシドアナログに対してそれらを耐性にするウイルス 遺伝子の変異の発達からこのプロトコルを保護する。変異は宿主細胞RNAポリメ ラーゼにより導入されるが、コードされたウイルス酵素によっては導入されない 。本発明の方法は、それゆえ、それらが、特にウイルスゲノムの転 写のために細胞RNAポリメラーゼIIを用いるHIVの場合に、ウイルス耐性の発生を 避ける点で、部分的に特有である。RNAポリメラーゼIIを特定のアナログに対し て耐性にし得るヒトゲノムの変異は、ヒト細胞の変異はウイルスにおいて見い出 されない優れた変異修復過程により極めて低頻度でおこるのでまれであろう（De Mars，R.，及びHeld，K.R.，Humangenetik，16:87〜110(1972)。本発明の方法は 、細胞のDNAに組み込まれた変異誘発性デオキシリボヌクレオチドを用いない。R NAポリメラーゼIIをヌクレオチドアナログに対して耐性にし得るRNAに組み込ま れたリボヌクレオチドは、次の世代に伝達されないであろう。なぜなら機能的な ヒト遺伝子の形成を導く細胞のmRNAの逆転写について役割はないからである（Te min，H.M.，Cancer Res．48:1697(1988)）。ウイルス感染の過程でおこるウイル ス複製の複数ラウンドは、組み込まれたリボヌクレオシドアナログによる変異の 蓄積のための推進力となろう。 先に示したとおり、本発明の方法はウイルスの逆転写酵素に対するヌクレオシ ドアナログの選択のための理論的解釈に直感的に逆らう。ウイルスによりコード された酵素を標的にするアナログを選択するかわりに、本明細書に記載される方 法は、宿主細胞の酵素により組み込まれるリボヌクレオシドアナログを利用する 。これらのアナログはRNAポリメラーゼによる転写の間、ウイルスRNA及び宿主細 胞メッセンジャーRNAの両方に組み込まれる。そのアナログを含有するウイルスR NAは、新しい宿主細胞に感染するビリオンにパッケージングされる。理論に結び つけるつもりはないが、RNAが新しく感染した細胞内で逆転写され又は複製され る場合、それは非相補的ヌクレオチドをウイルス核酸に導入する。各々のウイル ス複製サイクルにおいて、ウイルスゲノム全体を通しての不正確なヌクレオチド の増加を確実にするであろう。要求される遺伝子内でおきる変 異は、機能を失った変異タンパク質を生じる。生存可能なウイルスの生産は各々 の回のウイルス複製で進行的に減少する。更に、非生存性変異ウイルスゲノムの 存在は、循環する標的細胞の相同的組換え又は最終的な自然のクリアランスによ り(HIV感染の場合)一体化したウイルスコピーの宿主細胞ゲノムを治癒する可能 性を与える。 本明細書のウイルスの変異率を増加させる方法は、RNAポリメラーゼによりウ イルスをコードするゲノム核酸のRNAコピーに組み込まれるRNAヌクレオシドアナ ログを用いる。ここで、そのアナログは第１の相補ヌクレオチドを有する第１の 天然のヌクレオチドに置き換わり、ここでそのアナログは前記第１のヌクレオチ ドでない第２のヌクレオチドに相補的であり、これにより不正確な塩基対を引き おこし、ウイルスの変異を誘導する。 本発明の好ましいヌクレオシドアナログは組み込まれ、ポリメラーゼにより伸 長される。一般に、このようなアナログは、それらのRNAへの組込みの後にポリ メラーゼ分子により伸長されるのを許容するホスホジエステル結合を有する。こ れにより、鎖の終了を引きおこす特定のウイルスインヒビター（例えば３’−ヒ ドロキシ基を欠くアナログ）と異なり、本発明の好ましいアナログは、それらの 組込みによりRNA合成を一般に終了させない非鎖ターミネーティングアナログで ある。かわりに、それらは、好ましくは、RNA産物に組み込まれ得るが、それら の組込みの位置において塩基対特性を有効に変え、それにより組込みの部位にお いてRNA配列の誤りを誘導する誤り誘導性アナログである。 細胞RNAポリメラーゼ、例えばヒトRNAポリメラーゼII及びウイルスポリメラー ゼ／複製による変化したヌクレオチドの組込み又は細胞キナーゼによるリボヌク レオシドアナログのリン酸化に関するパラメータの決定は、DNAポリメラーゼに よるデオキシヌクレオシ ドトリホスフェートの組込みのために用いられるものと同様の方法により行われ る（Boosalisら、J.Biol.Chem．262:14689〜14698(1987)）。選択された状況に おいて、ウイルスゲノムに導入された変異の頻度の直接の決定（Ji及びLoeb，Vi rol.，199:323-330（1994）を行うことができる。 RNAヌクレオシドアナログは細胞のポリメラーゼ又はウイルスのポリメラーゼ によりゲノム核酸のRNAコピーに、少くとも約0.1％、好ましくは少くとも約５％ 、最も好ましくは試験管内アッセイにおける等量のものと比べた時に天然の相補 性核酸のそれと等しい効率で組み込まれる。これにより、1000塩基中約１又はそ れ超の誤差率がウイルスの変異誘発を増加させるのに十分であろう。不正確な塩 基対形成を引きおこすリボヌクレアーゼアナログの能力は、アナログのRNAへの 組込みにより作られた変異の頻度及び性質をテスト及び検査することにより決定 することができる。例えば、溶解性RNAウイルス（例えばインフルエンザＡ）の 変異比率は約300倍、DNAウイルスより高い、Drake，PNAS，VSA 90:4171〜4175（ 1993）。しかしながら、レトロウイルスは溶解性RNAウイルスより低い平均比率 で見掛け上正常に変異させる。 例えば、HIVの場合、ウイルスRNA又は組み込まれたHIV DNAは逆転写酵素によ り複製され、次にDNAポリメラーゼが相補的プライマー及び全部で４つのデオキ シヌクレオシドトリホスフェートでPCR反応を用いて複製される。複製されたゲ ノムの領域は逆転写酵素遺伝子中の600ヌクレオチドセグメントに相当する。70 回のPCRの後のその複製されたDNA又はRNAは、そのプライマー配列を開裂する制 限酵素で処理されプラスミドに連結される。大腸菌のトランスフェクションの後 、個々のクローンが得られ、そのプラスミド内の増幅されたセグメントが配列決 定される。この領域内の変異は、R NAアナログの欠如下で同じウイルスの平行培養により得られた対照ウイルス配列 と個々の配列を比較するコンピューターによる分析により決定される。各々のヌ クレオチドのために、10回の連続のウイルス継代の後、又はウイルス検出のため の消滅の時点において決定が行われる。同様の手順が、関心の他のウイルスのた めに有効であろうし、当業者に直ちに明らかになろう。 細胞DNAポリメラーゼによる、逆転写酵素（又は他のウイルス酵素）による又 はDNAポリメラーゼによるアナログの組込みは、直接、又は別個に比較すること ができ、その別個のテストが後に比較される。関心のポリメラーゼの中でのアナ ログの組込みの比較は、ヌクレオチド組込みについての“マイナス”配列決定ゲ ルアッセイの改良型を用いて行うことができる。５’−³²Ｐ標識化プライマーは 、４つのリボヌクレオチドトリホスフェートのうちの３つ及びトリホスフェート 形態のアナログを含む反応において伸長させられる。そのテンプレートは、適切 には、RNA又はDNAのいずれであり得る。反応から省略されたヌクレオチドに相補 的であるテンプレートヌクレオチドを通るプライマーの伸長は、アナログの組込 みに依存し、それに比例するであろう。アナログの組込みの量は、１つの位置か ら次の位置へのシーケンシングゲル上に広がったオリゴヌクレオチドの割合の関 数として計算される。組込みは、オートラジオグラフィー、次のデンシトメトリ ー又はバンドの各々の切断及び液体シンチレーション分光法により放射能を計数 することにより決定される。 リボヌクレオシドアナログの変異誘発能力を検出するためのアッセイを同様に 行うことができる。アッセイにおいて、リボヌクレアーゼアナログは、RNAポリ メラーゼにより合成されたウイルスRNAに組み込まれ、その組込みが上述の手段 のいずれかにより子孫ウイ ルスに変異を引きおこすか否かを決定する。 本発明のリボヌクレオシドアナログを試験管内で又は生体内でウイルスが感染 した細胞に投与する場合、細胞の集団は、複製された相同なウイルス核酸の高度 に可変性の集団を含むように形成される。この高度に可変性の集団は、変異誘発 性ヌクレオシドアナログをウイルスが感染した細胞に投与し、そのウイルス集団 の変異率を増加させることから生ずる。これにより、ウイルスの高度に可変性の 集団は、ウイルスの変異率がヌクレオシドアナログの投与により増加されること のインジケーターである。集団の可変性を測定することは、ウイルス集団の生存 能力の評価を供する。かわりに、ウイルス集団の生存能力は細胞集団の健康のた めの診断的インジケーターである。例えば、ヒト患者におけるHIV集団について の低い生存能力は、患者のための改良された見通しに対応する。 好ましくは、選択された変異誘発性リボヌクレオシドアナログは水溶性であろ うし、標的細胞に迅速に侵入する能力を有する。一般的にあまり必要とされない が、脂溶性アナログも用いられよう。特にそれは血液−脳関門に浸透するために 必要である。リボヌクレオシドアナログは、細胞キナーゼによりリン酸化され、 DNAに組み込まれよう。選択されたアナログは、宿主細胞RNAポリメラーゼにより 又はRNAレプリカーゼにより複製するための鎖ターミネーターとしてより変異源 としてより有効でもあろう。 本発明に用いられるリボヌクレオシドアナログは、典型的には、シチジン、ウ リジン、アデノシン又はグアノシンのアナログである。このようなリボヌクレオ シドの各々はプリン又はピリミジン成分及びリボース成分から構成されると理解 される。天然のリボヌクレアーゼでそうであるように、モノマーの糖部分はリボ ースの２’−，３’−及び５’−にヒドロキシル基を有するであろう。本明細 書に用いる場合、用語“リボヌクレオシドアナログ”は、上述のヌクレオシドの モノ−、ジ−又はトリホスフェートも含むことを意味する。アナログの各々は、 RNAに組み込まれ、その中に伸長することができるであろうし、不正確な塩基対 形成を引きおこすであろうオリゴマーを生産するであろう。アナログが不正確な 塩基対形成を引きおこす能力は、上述のテストにより決定することができる。本 明細書の目的のため、“リボヌクレアーゼアナログ”の定義は、リバビリン(Poo nianら、J.Med.Chem．19:1017(1976))及び１−β−Ｄ−リボフラノシルイミダゾ ール４−カルボキサミドの５−ハロアナログ（Srivastavaら、J.Med.Chem．19:1 020（1976）はその定義から特に排除され、そして２’，５’−ビス−Ｏ−シリ ル化−３’−スピロ−置換化（TSAO）アデニン、ヒポキサンチン、Ｎ¹−アルキ ル−ヒポキサンチン又はキサンチン(Velazquezら、Int.Conf AIDS（Netherlands ）Jul 19〜24 1992 8（2）pA57（Abstract No.PoA 2324）を参照のこと)；１− 〔（２−ヒドロキシエトキシ）メチル〕−６−フェニルチオチミン(HEPT)(Tanak aら、J.Synthetic Organic Chemistry，Japan 49:1142(1991)を参照のこと)；及 びHIVの逆転写酵素により高効率で組み込まれ広げられるいずれかのヌクレオチ ドアナログ（全て米国特許第5,512,431に定義される）は標的のウイルスがHIVで ある場合に特にその定義が排除される。 本発明に用いられるシチジンアナログは、例えば、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ¹ −メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、エテノシチジン、３−メチルシチジン、Ｎ⁴− ジメチルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモ シチジン及びシチジングリコールであろう。アナログのいくつかは、商業的供給 元、例えばSigma Chemical Co（St.Louis，Missouri，USA）から購入することが でき、又は当業者に周知の方法により合成することができる。 上述の化合物のために、Ｎ⁴−アミノシチジン、エテノシチジン、及び３−メチ ルシチジンが市販される。シチジングリコール及び５−ヒドロキシシチジンは、 引用により先に組み込まれる米国特許第5,512,431に記載される方法と同様の方 法により合成することができる。従って、シチジングリコールは、チミジンのオ スミウムテトラオキシド酸化に関するチミジンについての公開された手順(Basu ら、Proc.Natl.Acad.Sci．86:7677〜7681(1989))に基づいて調製することができ る。同様に、室温での水性緩衝液中のオスミウムテトラオキシドでのシチジンの 処理は、HPLCで精製することができる５，６−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ シチジンを供する。５−ヒドロキシシチジンは、水中でのBr₂でのシチジンの処 理により調製することができる(Eatonら、Biochem.Biophys.Acta 319:281〜287( 1973)を参照のこと)。 Ｎ⁴−アミノシチジンは、出発材料として市販のシチジンを用いて、Negishiら (Nucleic Acid Res．11:5223(1983))の手順に従って調製することができる。Ｎ⁴ −アミノシチジンは、試験管内で及びAmesアッセイ(Negishiら、Biochemistry 2 4:7223，1985)において変異誘発性であることが示されている。リボヌクレオシ ドトリホスフェート誘導体は、CTPのヒドラジン及び重亜硫化ナトリウムでのCTP の処理により合成される。 Ｎ¹−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン及びＮ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジンは 、A.Nomura，K.Negishi，H.Hayatsu（Nucleic Acid sResearch 13:8893(1985)に 従って調製することができる。上述の化合物は、重亜硫酸塩の存在下でモノメチ ルヒドラジンでのシチジンの処理に基づき同時に形成される。要求される産物は 、RP-18 HPLCにより直ちに精製される。 Ｎ⁴−ジメチルシチジンは、Journal of the American Chemical Society，83:4755（1961）に従って調製することができる。ベンゾイルで保護さ れたウリジンは、ピリジン内の五硫化リンにより４−チオアナログにチエートさ れる。４−チオートリベンゾエートウリジンのジメチルアミンでの処理は、要求 されるＮ⁴−ジメチルシチジン産物を供する。 ５−ヒドロキシシチジン及び５−ブロモシチジンは次の通り調製することがで きる：シチジンを、Visser，D.W(1968)(Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry（Zurbach，W.W． & Tipson，R.S.，Eds）Vol.I，pp.428〜430，Inte rscience Publisher，New York)に従いその前駆体として用いた。シチジンは室 温でブロミド水溶液で処理し、次にピリジンを加え、ジオール中間体で脱水して 、要求される５−ヒドロキシシチジンヌクレオシドを供する。５−ブロモシチジ ンは、モノブロモ−ヒドロキシ中間体の脱水から同時に得られる。 本発明に役立つウリジン誘導体の例は、例えば、５−ヒドロキシウラシル、３ −ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ² −エチルウリジン、Ｏ⁴−メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブ チルウリジン等を含む。この群の誘導体の中で、３−メチルウリジンが市販され る。３−ヒドロキシエチルウリジンは、３−ヒドロキシエチルウリジンについて 記載されるように、エチレンオキシドでウリジンを処理することにより調製する ことができる（Bhanotら、J.Biol.Chem．47:30056（1994）を参照のこと）。同 様に、ウリジンのＯ²−アルキル及びＯ⁴−アルキル誘導体は、Ｏ²−アルキル及 びＯ⁴−アルキルチミジンを調製するのに用いられる方法の適切な改良により調 製することができる。特に、米国特許第5,512,431は、Ｏ⁴−メチルチミジン、Ｏ⁴ −エチルチミジン、Ｏ⁴−イソプロピルチミジン及びＯ⁴ −イソブチルチミジン（Xuら、Nucleic Acids Res．18:4061-4065（1990）の公 開された手順も参照のこと）。これらの合成の各々において、デオキシリボース 部分の３’−及び５’−ヒドロキシル基は、最初に、それらのｔ−ブチルジメチ ルシリルエーテルとして保護される。同じ様式で、ウリジンのリボース部分の３ つのヒドロキシ基（２’−，３’−及び５’−）は、単一ステップにおいて又は 後の保護ステップにおいて保護される。例えば、２’−及び３’−ヒドロキシル 基の両方の保護は、適切なアセトニドの形成により達成することができる。隣接 するジオールの付設のための他の基は引用により本明細書に組み込まれるGreene ら(PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，2nd ed.，John Wiley & Sons，N ew York，1991，Chap.2，pages 118-142)に見い出すことができる。３つのリボ ースヒドロキシ基の保護の後、アルキルエーテルのピリミジン環のＣ４位置への 導入は、上述の特許に記載されるように続けることができる。Ｏ²−アルキルウ リジンの調製は、典型的には、Ｏ²−アルキルチミジンの調製について概説され ている手順に従う（例えば、Singer，Biochemistry 28:1478〜1483（1989）、及 び本明細書に言及される引用文献を参照のこと）。 Ｎ³−（２−ヒドロキシエチル）ウリジンは、３−ヒドロキシエチルデオキシ ウリジンについて記載されるように、エチレンオキシドでウリジンを処理するこ とにより調製される(Bhanot，O.S.ら、J.Biol.Chem．47:30056(1994))。デオキ シヌクレオシドトリホスフェート誘導体は、試験管内アッセイにおいて変異誘発 性であることが示されている(Bhanot，O.S.，ら、J.Biol.Chem．47:30056(1994) )。 Ｏ⁴−メチルウリジン及びＯ4−アルキルウリジンは、Nucleic Acids Research 18:4061(1990)に従って調製することができる。 Ｏ⁴−メチルウリジンはウリジンの４−トリアゾロ誘導体から合成される。４− トリアゾロ基のメトキシドでの置換に基づき、要求されるＯ⁴−メチルウリジン を得ることができる。更に、付加的なＯ⁴−アルキル化ウリジンは、この例にお いて用いられるメトキシドを他のアルコキシドに置換することにより得ることが できる。 ５−ニトロソウリジン及び５−ニトロソシチジンは、Advanced Orgaric Chemi stry of Nucleic Acids，Z.Ahabarova及びA.Bogdanov，Editors，p.40，VCH，Ne w Yorkに従って調製することができる。HNO₃及び硫酸で処理され、次に脱保護さ れたヒドロキシル基で保護されたウリジン又はシチジンは対応する５−ニトロソ ウリジン又は５−ニトロソシチジンヌクレオシドを供する。 ５−アミノウリジン及び５−アミノシチジンは、Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Z.Ahabarova及びA.Bogdanov，Editors，p.40，VCH Publish ing Coに従って調製することができる。ウリジン又はシチジンの５−アミノ誘導 体は、対応する５−ニトロソウリジン又は５−ニトロソシチジンヌクレオシドの 還元から得られる。 ５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、５−（チオアルキル）−ウリジン、 ５−（ヒドロキシアルキル）−シチジン、及び５−（チオアルキル）−シチジン は、S.Sunら(Journal of Organic Che mistry 1996 61:5708(1996))に従って調 製することができる。ペルアシル化グルコースのピリミジンとのHilbert-Johnso nグリコシル化反応及びα−ウレイドメチレンラクトンの異性化は、５−（ヒド ロキシアルキル）−ウリジンを再成する。チオラクトンは、対応する５−（チオ アルキル）−ウリジンを供する。これらのヌクレオシドは、４−トリアゾール中 間体の開環を通して対応するシチジン誘導体に直接、変換される。 本発明に役立つアデノシン誘導体は、例えば、１，Ｎ⁶−エテノアデノシン、 ３−メチルアデノシン、及びＮ⁶−メチルアデノシンを含む。１，Ｎ⁶−エテノア デノシン及びＮ⁶−メチルアデノシンはSigma Chemical Coから市販される。 本発明に役立つグアノシン誘導体は、例えば、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶ −メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン 、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノ シン、２，Ｎ³−エテノグアノシン及び８−アミノグアノシンを含む。これらの 誘導体の各々は、米国特許第5,512,431の対応するデオキシグアノシン化合物に ついて役立つものと同様の方法を用いて調製することができる。特に、付加的保 護ステップ（及び脱保護ステップ）は、典型的には、保護されないヒドロキシル 基が要求される反応を妨害し得る反応のためにグアノシン誘導体の２’−ヒドロ キシル基をマスクするのに必要とされる。他の反応は、単に異なる出発材料を用 いることにより改良される。例えば、３，Ｎ₂−エテノグアノシンは、グアノシ ンを２’−デオキシグアノシンに置換することにより、Kusmicrekら（Chem.Res. Tox．５:634〜638(1992)）の手順に従って調製することができる。同様に、８− アミノデオキシグアノシンは、関連する２’−デオキシグアノシンについてLong ら（J.Oig.Chem．32:2751〜2756（1967）の手順を用いてグアノシンから調製す ることができる。 当業者は、他のリボヌクレアーゼ誘導体、例えばハロゲン化誘導体を、調製し 、本発明の方法に利用できることを理解するであろう。ラジカル反応を用いて他 の修飾を上述のリボヌクレオシドアナログにすることができる。適切なラジカル 反応の例は、酵素フリーラジカル、臭素フリーラジカル等に関するものを含む。 臭素フリーラ ジカルを臭素化リボヌクレオシド誘導体を作り出すのに用いる場合、そのアナロ グは、更に要求されるハロゲン化物でのブロミドの置換により塩素化又はフッ素 化誘導体に変換することができる。 本発明の方法に用いるために、上述のリボヌクレオシド誘導体は、好ましくは 、それらのモノ−、ジ−又はトリホスフェートとして調製することができよう。 リボヌクレオシドアナログのリン酸化は、典型的には、酵素法、化学法又は酵素 法及び化学法の組合せにより行われる。酵素リン酸化は、ホスホトランスフェラ ーゼ活性のソースとしてコムギ苗条抽出物の粗ソースを用いて行うことができる （Giziewiczら、Acta.Biocim.Pol．22:87〜98(1975);及びSugar，IN MOLECULAR ASPECTS OF CHEMOTHERAPY，Springer-Verlag，1991，pp.240-270を参照のこと） 。リン酸化は、Blackら（Biochemistry 32:11618〜11626(1993)）により記載さ れるようにヘルペスウイルスチミジンキナーゼ又はその変異体を用いても行うこ とができる。ヘルペスチミジンキナーゼは、広い基質特異性を有し、広範囲の種 々のヌクレオシドアナログをリン酸化する。生じたモノホスフェートの精製は、 HPLCを用いて達成することができる。 モノホスフェート誘導体のトリホスフェートへの変換は、典型的には、引用に より本明細書に組み込まれるHoardら、J.Am.Chem.Soc．87:1785〜1788（1965） に供されるもののような化学的方法を用いるであろう。 当業者に周知であるように、ヌクレオシド、リボヌクレオシド及びそれらのア ナログは、ラセミ体混合物として、又は１もしくは他のエナンチオマー種の優勢 率（典型的には70％、より好ましくは90％超、更により好ましくは約98％超の優 勢率）を有するエナンチオ特異的組成物として調製することができる。例えば、 （例えばＤ−リボースのかわりにＬ−リボースを組み込むことにより）非天然又 はＬ−エナンチオマーの配置が支配的であるエナンチオ特異的ヌクレオシドアナ ログ又はリボヌクレオシドアナログを得て、又は合成することができる。エナン チオ特異的ヌクレオシド組成物は、活性を更に最適化し、毒性を下げるために本 発明の文脈に用いることができる。詳述すると、本発明の文脈において活性を示 すラセミ混合物について、そのエナンチオ特異的組成物の１つは、典型的には、 他のものより大きな活性及び／又は大きな特異性（及びこれによりいずれの所定 濃度においても少い潜在的副作用）を示すであろう。このようなアナログのエナ ンチオ特異的組成物は、それゆえ、効能及び／又は特異性を最適化するために用 いることができる。 エナンチオ特異的アナログ（及び／又は他の構造バリエーション）も、本発明 の文脈に用いられるアナログの細胞内局在化に影響を与えるのに用いることがで きる。特に、エナンチオ特異的又は他の変異アナログは、このようなアナログの 取り込み又は細胞内局在化に関連する細胞組織によりより有効に処理され得る。 例えば、標的哺乳動物細胞（の細胞質内に局在化した及び／又は）により優先的 に取り込まれるアナログを用いることができる。再び詳述すると、本発明の文脈 において活性を示すラセミ体混合物について、そのエナンチオ特異的組成物の１ つは、典型的には、他のものより大きな細胞取り込み（及び／又は細胞質へのよ り大きな分画）を示すであろう。このような構造バリエーションは、アナログが 酵素、例えばヌクレオシドを組み込む前にヌクレオシドホスフェートに変換する ことができる細胞のキナーゼ、又は細胞の分解性酵素、例えばホスファターゼに より処理される効率に影響を与えるとも予想されよう。それによりより大きな活 性及び／又は安定性を示す組成物を単離することができる。 上述のリボヌクレオシドアナログ及びリボヌクレオシドアナログ トリホスフェートに加えて、本発明は、組み合わせの合成法を用いて調製される 特定の誘導体を利用するであろう。例えば、上述のモノマーの混合物は、標準的 な合成法を用いて保護することができ、次に１又は複数の化学的形質転換、例え ば脱水、光誘導化結合分割又は異性化、酸化、還元、アルキル化、アシル化等に かけることができる。次に、生じたリボヌクレオシドアナログの混合物は、脱保 護して各々のモノマーがRNAポリメラーゼII又はウイルスによりコードされたRNA レプリカーゼの１つにより鎖伸長反応を用いて合成の間に相補的ヌクレオシドト リホスフェートを置換する能力について評価することができる。リボヌクレアー ゼポリマーは、典型的には、単離され、リボヌクレオシドポリマーへ組み込まれ たリボヌクレアーゼアナログの化学組成が決定される。単離の方法は、電気泳動 、カラムクロマトグラフィー、アフィニティービーズ等を含む。単離されたポリ マーの組成は、例えばリボヌクレアーゼポリマーを加水分解し、例えば質量分析 又はNMRによりそのポリマーの置換基を評価することにより決定される。本発明 の目的のために、そのライブラリーは、典型的には、約５〜約100万の化学種を 含むであろう。好ましくは、そのライブラリーは、約100〜約10,000の化学種を 含むであろう。 本発明のリボヌクレオチドアナログは、好ましくは、細胞のRNAポリメラーゼ によりRNAに有効に組み込まれて広がり、不正確な塩基対形成を引きおこすもの であろう。このようなリボヌクレアーゼアナログは、それらがDNAポリメラーゼ によりDNA分子内に又は逆転写酵素によりDNA分子に直接、組み込まれ得るような ものでないことが更に好ましい。最後に、リボヌクレアーゼは、ポリメラーゼ活 性の強力なインヒビターでないことが更に好ましい。 同様に及びリボヌクレアーゼアナログに関連して、遊離塩基自体 、グアニン、シチジン、ウラシル、チミン、及びアデニンを、DNA又はRNAウイル スの変異誘発を誘導するために本明細書に記載される方法においてリボヌクレオ シドアナログのかわりに用いることができる。 本発明の方法を実施するため及び任意に本発明の組成物を含むキットも供する 。例えば、容器及び１又は複数の次の構成物：対照変異誘発性RNAアナログ、テ スト変異誘発性RNAアナログ、RNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼによりRNAアナ ログの組込みを検出するための試薬を含むキットを供する。任意に、そのキット は、本発明の方法の実施を容易にするための説明書を含む。例えば、１つのキッ トにおいて、対照変異誘発性RNAアナログと比較したテスト変異誘発性アナログ の変異誘発能力を検出するためのキット構成物の使用の説明書が供される。 ウイルス病の治療のためのリボヌクレオシドアナログの投与 動物においてウイルスの変異の変異率を増加させる方法を供する。本方法にお いて、治療に有効な量の変異誘発性RNAヌクレオシドアナログが動物に投与され る。例えば、動物は、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ及びＧ型肝炎ウイルス、フラビウイル ス、例えばデング熱及び黄熱、フィロウイルス、例えばエボラウイルス、インフ ルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、例えばRSウイルス、はしか、 おたふくかぜ、ピコルナウイルス、例えばリノウイルス、エコーウイルス、コク サッキーウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、例えば脳炎、コロノウイル ス、風疹、ブニヤウイルス、例えばハンタウイルス、レオウイルス、例えばロタ ウイルス、ラブドウイルス、アレナウイルス、例えばリンパ球絨毛性髄膜炎、ヒ トＴ細胞白血病（HTLV）ウイルス、例えばHTLV-1及びHIV-2、成人Ｔ細胞白血病 （ATL）、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1及びHIV-2及びサル 免疫不全ウイルス(SIV)からなる群から選択されるウイルスが感染したヒト患者 であり得る。 治療的適用のための好ましいアナログは、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ¹−メチル −Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５− ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル） シチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミ ノシチジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５−（ヒドロキシア ルキル）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール 、５−ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジ ン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴− メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アル キ−ルウリジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジ ン、及び５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノシン、３− メチルアデノシン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、 Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシ ン、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グア ノシン、２，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシン並びにそれら の誘導体を含む。好ましい実施形態において、RNAヌクレオシドアナログは、動 物のウイルスに感染した細胞中に存在するポリメラーゼにより、天然の相補核酸 の少くとも約0.1％の効率でウイルスのゲノム核酸のRNAコピーに組み込まれる。 上述のリボヌクレオシドアナログは、RNAウイルスの感染又は上述のRNA中間体を 通して複製するウイルスの感染の治療のためにヒト又は他の哺乳動物への投与の ための医薬として許容される担体に組み込むこと ができる。そのアナログは、１回の投与で、又はその他の投与のいずれかで、１ 回、又は２もしくはそれ超の回数で投与することができる。 抗ウイルス組成物は、好ましくは、経口、静脈内又は非経口投与及び他の全身 投与形態でヒト患者に投与されるが、感染の一次的部位により他の形態も適切で あり得る。当業者は、医師により用いられるべき個々の組成物のための適切な投 与プロトコルを理解するであろう。 本発明の医薬製剤又は組成物は、固体、半固体、又は液体、例えば懸濁液又は エーロゾル等の投与形態であり得る。好ましくは、本組成物は、正確な投与量の 単一投与に適した単位投与形態で投与される。本組成物は、要求される製剤によ り、動物又はヒト投与のための医薬組成物を調剤するのに一般に用いられるビヒ クルとして定義される。医薬として許容される、非毒性担体又は希釈剤も含み得 る。希釈剤は、その組合せの生物活性に影響を与えないように選択される。この ような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液 、及びハンクス溶液である。更に、医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバ ント；又は非毒性、非治療用、非免疫性安定剤等も含み得る。このような希釈剤 又は担体の有効量は、構成物の溶解度、生物活性等に関して医薬として許容され る製剤を得るのに有効である量である。 化合物の治療に有効な量は感染又はウイルスタイターの測定可能な減少を生ず る量、又はウイルス症状の主観的軽減又は臨床医もしくは他の資格のある観察者 により注視される、客観的に同定できる改善を供する量である。 本発明により用いられる化合物の投与量は、受容患者の年齢、体重、及び臨床 的状態、感染の位置及び程度並びに治療を行う臨床医 又は実施者の判断により種々であろう。例えば、本明細書に記載されるリボヌク レオシドアナログの投与量は、１日当り体重１キログラム当り約５ミリグラム（ mg／kg）〜約250mg／kg、好ましくは１日当り体重1kg当り約7.5〜100mg／kgの範 囲、最も好ましくは１日当り体重1kg当り約10〜約40mg／kgの範囲であり得る。 リボヌクレオシドアナログの好ましい投与量は、約１〜約1000μＭ、好ましく は約５〜約100μＭ、最も好ましくは約7.5〜約50μＭの化合物のピーク血漿濃度 を達成するように投与される。これは、例えば、約１〜約100mg／kgの活性アナ ログを含むボーラスとして塩類溶液中の投与成分の滅菌した0.1〜５％溶液の静 脈内注入により達成することができる。要求される血液レベルは、調節された連 続的又は断続的注入により維持することができる。好ましくは、その投与は、治 療結果が達成されるまで、又は副作用が治療の停止を正当化するまで、毎日、く り返される。 リボヌクレオシドアナログにより置換される天然のヌクレオチドの濃度を減少 させる薬剤と組み合わせて一緒に上述のリボヌクレオシドアナログを投与するこ とが更に有利である。好ましくは、これらの付加的薬剤は、同じビヒクル中で一 緒に投与されよう。天然リボヌクレオチドの合成のために必要な中間の代謝を妨 害する薬剤を投与することができよう。投与されるヌクレオチドアナログに相同 である天然ヌクレオシドの濃度を減少させることを確認するために化学分析を用 いることができよう。 本明細書に言及される全ての特許、出版物、及び特許出願は、引用により本明 細書に組み込まれる。以下の例は、詳述目的のために供され、本発明を限定する ものとして解釈すべきでない。 実施例 １．酸素フリーラジカルによるリボヌクレオシドアナログの修飾 上述の変異誘発性リボヌクレオシドは、塩基又は糖成分のいずれか上の異なる 結合した化学基のアナログを得るために化学的に修飾することができる。これら のアナログの化学修飾のための手順は有機化学の当業者に公知である。選択され たアナログは、酸素フリーラジカルを作り出す剤にかけられ（Feig，Dら、PNAS ，91，GG09〜6G13，1995）、又は多重の位置に小さな置換を導入するために特定 の化学修飾にかけられるであろう。変化したヌクレオチドは、クロマトグラフィ ー分離にかけられ、その化学構造は質量分析及び／又は核磁気共鳴により同定さ れるであろう。リボヌクレオシドは、HIVゲノム中の変異の導入について、及び 以下に概説されるような生存能の進行的な損失を引きおこすことについてテスト されよう。 ２．組合せ化学を用いる変異誘発性リボヌクレオシドトリホスフェートライブ ラリー 上述のヌクレオシドの変異誘発性リボヌクレオシドトリホスフェート誘導体並 びにウリジン及びシチジントリホスフェートは化学的に異なるライブラリーの合 成のためのコア化合物として用いられよう。組合せ型アッセイの例は、米国特許 第5,384,261、第5,143,854及びCheeら（Science 274:610〜614(1996)）に記載さ れる。個々のアナログは、この分野において広範囲に実施されるヌクレオチド化 合物の標準的方法によりミスコーディング置換を化学的に保護する反応にかけら れよう。その保護されるアナログは、これらに限られないが、脱水、照射、酸化 、還元、アルキル化及びこれらの組合せに関する一連の化学反応にかけられよう 。その後、生じた５超の100万未満の化学種のライブラリーを含む別個の産物の 混合物は、脱保護反応にかけられよう。そのアナログの混合物は、鎖伸長反応を 用いてRNAポリメラーゼII又はウイルスによりコードされたR NAレプリカーゼの１つにより合成の間、相補的ヌクレオシドトリホスフェートを 置換するその混合物の能力を測定することにより分析されよう。その伸長した産 物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけられよう。その組み込まれたヌク レオチドを含むバンドは単離されるであろうし、その遊離塩基に加水分解され、 伸長されたアナログは質量分析により同定されるであろう。 ３．５−ブロモシチジン、５−ヒドロキシシチジン及び５−ヒドロキシウリジ ンの合成 ５−ヒドロキシシチジン(^50HＣ)は、Visser，D.W.(Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry(Zorbachら.，Eds.)，Vol．1，pp．428〜430，Intersci ence Publishers，New York(1968))における手順のバリエーションを用いて合成 されよう。 塩基性条件下で達成される^50HＣ産物の脱アミノ化は、^50HＵを供するであろう 。かなり過剰な臭素の存在下において、対応する^5BrＣが得られるであろう。こ れらの修飾されたヌクレオシドのトリホスフェート形態^50HCTP，^5BrCTP及び^5BrU TPは、上述の反応においてＣのかわりに対応するCTPを用いても調製することが できるであろう。 要求される反応産物は、カラムクロマトグラフィー、後の熱いエタノールから の再結晶化を用いて他の反応産物から分離されよう。 ４．ヒト細胞に対する毒性についてのリボヌクレオシドアナログのテスト リボヌクレオシドアナログの存在下でHIVに感染したヒト細胞を培養すること により変異の誘導を研究する前に、我々は、細胞の生存能力への効果についてテ ストした。２つのリボヌクレオシドアナログを、それらのCEMx174細胞（ヒトリ ンパ球形質転換細胞系；例えばChenら、J.Virology 71:2705(1997)を参照のこと ）の生存能力への効果についてアナログ濃度及び培養の時間の関数としてテスト した。２mlの培養物中の１×10⁶の細胞を、５−ブロモシチジン、５−ヒドロキ シウリジンの連続希釈物と共に、又はアナログの欠如下（対照）で、14日まで、 インキュベートした。その培養物を２日ごとに分けて新しいアナログを示される 濃度で加えた。生存能を、２日毎に評価し、細胞の総数及びトリパンブルーを排 除する細胞の割合を決定した（図１Ａ及び１Ｂ）。毒性を避ける適切な投与量は その結果から確かめることができる。 ５．５−ヒドロキシウリジン、５−ブロモシチジンの存在下又は対照における HIV-1の連続的継代 リボヌクレオシドアナログの存在下における感染した細胞の継代の関数として のHIVにおける変異の蓄積を測定するためのプロトコルを図２に示す。約10⁶の感 染単位／mlを含むHIVの保存調製物を 、シンシチウム誘導アッセイ(Chesebro B．及びWehrly，K.，J.Virol．62:3779 〜3788(1988))により滴定した。そのウイルスを、テストリボヌクレオシドの存 在又は欠如下で１時間、先にインキュベートした0.012細胞（２×10⁵／ml）の多 重度で加えた。37℃で４時間の後、その感染した細胞をMg²⁺又はCa²⁺を含まない PBSで２回、洗い、示される濃度のアナログと共に0.5ml培地中に再度懸濁した（ 図３を参照のこと）。37℃で２日間、48ウェルプレートでインキュベーションを 行った。２日目後に、開始濃度の２分の１に達するのに対応するアナログの更な るアリコートを加えた。培養物を４日目に収集した。細胞を遠心により分離し、 その上清の10分の１を新しい未感染の細胞に加えた。この手順を４サイクルくり 返した。それはビリオンの感染性の損失がない限り30サイクル、続けられよう。 最初の４サイクルの間のウイルス生産を、Abbott抗原ELISAキット(Abbot Labora tories，Chicago，Illinois)でｐ24抗原を測定することにより確認した（図３Ａ ，Ｂ，Ｃ）。 30継代の終り又はウイルス感染性の喪失の前１サイクルに、ウイルスの変異誘 発は、ウイルスDNA及びRNAをクローン化し、配列決定することにより決定されよ う。貫通するヌクレオチド2193−2867に対応するHIV逆転写酵素のセグメントは 、30継代後に得られた細胞ペレット中のプロウイルスDNAから、又はウイルス生 産における再生可能なディミュニション（dimunition）の直前に得られた凍結細 胞から増幅されようし、DNAは迅速な溶解により調製され、プロウイルス荷重の 粗い評価がライゼートの終点希釈、その後のPfuポリメラーゼを用いるネスティ ドPCRにより決定されよう(Delwart，E.L．ら、Science 262:1257〜1261(1993)) 。再サンプリングの可能性なく各々のPCR反応から得ることができるクローンの 数が評価されよう(Liu，S.-Lら、Science 27):415〜416(1996))。PCRの 30サイクルは、外部プライマーで最初に行われ、次に内部プライマーを含む新し い反応混合物に希釈され、そして更に増幅の20サイクルが行われよう。内部プラ イマーは、HIVに相補的でなく、M13mp2DNAにクローン化するための制限部位をコ ードする５’末端配列を含むであろう。制限酵素消化の後、そのフラグメントは 先に同じ酵素で消化されたM13mp2DNAに連絡されよう。HIV挿入物のヌクレオチド 配列は、一本鎖Ｍ13プラスミドを配列決定することにより決定されよう。同様の 手順は、上清画分においてウイルスRNAで開始して行われよう。いくつかのアナ ログを同時に分析することが有利である。各々のアナログ及び対照のために、我 々は、約20のクローンを配列決定するであろう。対照と比較したアナログに露出 したウイルスの変異スペクトルの予想される変化は、アナログによる変異の導入 を確立するであろう。 ６．Ｃ型肝炎ウイルス／デング熱ウイルス Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)は主要なヒトの病原であり、本発明のアナログのため の適切な標的である。HCVはフラビビリダエ（Flaviviridae）ファミリーの（＋ ）鎖RNAウイルスである。HCVは試験管内で増殖させるのが困難なウイルスである が、リンパ芽細胞及び肝細胞系においていくつかの成功例が報告されている。HC Vに対するRNAアナログをテストするための代用として、このようなアナログは、 デング熱の原因であるフラビビリダエの他のメンバー、デング熱ウイルス及びそ の出血性変異体に対してテストすることができる。デングウイルスは、種々の一 次及び連続細胞培養において増殖する、ヒト(BSC-1)、サル(LLC-MK2，Vero、一 次肝臓サル)、ハムスター（BKH-21）、及び蚊の源の細胞が最も感受性がある７d exまでの収量及びプラーク形成が適切な条件下で得られる。 好ましいRNAアナログの１つは、試験管内変異誘発分析のために 用いることができる。適切な数の継代又はウイルス感染性の喪失の前の１サイク ルの終りに、ウイルスの変異誘発を、ウイルスRNAのクローニング及び配列決定 により決定することができる。RNAアナログによるウイルス変異誘発の組込みの 分析は、分析のためのウイルスゲノムのセグメントの選択の後にHIVについて記 載されるのと同様に決定することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/14 Ａ６１Ｐ 31/14 31/18 31/18 Ｃ０７Ｈ 19/167 Ｃ０７Ｈ 19/167 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 15/09 1/70 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 1/70 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ウイルスが感染した細胞に対するRNAヌクレオシドアナログを投与するこ とを含むウイルスの変異比率を増加させる方法であって、前記アナログがポリメ ラーゼにより前記ウイルスをコードするゲノム核酸のRNA複製物に組み込まれ、 前記アナログが第１の相補性ヌクレオチドを有する第１の天然のヌクレオチドに 取って代わり、ここで前記アナログは前記第１のヌクレオチドと異なる第２のヌ クレオチドに相補的であり、それにヒソウイルスの変異を誘導することを特徴と する方法。 ２．前記RNAヌクレオシドアナログがウラシルに取って代わることを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ３．前記RNAヌクレオシドアナログがアデニンに取って代わることを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ４．前記RNAヌクレオシドアナログがシチジンに取って代わることを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ５．前記RNAヌクレオシドアナログがグアニンに取って代わることを特徴とす る請求項１に記載の方法。 ６．前記RNAヌクレオシドアナログが、前記ポリメラーゼにより、前記ゲノム 核酸のRNA複製物に、天然の相補核酸の少くとも約0.1％の効率で組み込まれるこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記RNAヌクレオシドアナログが、リバビリン又は１−β−Ｄ−リボフラ ノシルイミダゾール−４−カルボキサミドの５−ハロアナログでないことを特徴 とする請求項１に記載の方法。 ８．前記RNAアナログが非鎖ターミネーティングアナログであることを特徴と する請求項１に記載の方法。 ９．前記ウイルスがHIVである場合、前記RNAヌクレオシドアナログは、HEPTも しくは２’，５’−ビス−Ｏ−シリル化−３’−スピロ−置換化（TSAO）アデニ ン、ヒポキサンチン、Ｎ’−アルキル−ヒポキサンチン、もしくはキサンチン、 又はHIVの逆転写酵素により高い効率で組み込まれ広げられるヌクレオシドアナ ログでないことを特徴とする請求項１に記載の方法。 10．前記ヌクレオシドアナログが、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒド ロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチ ジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシ チジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル ）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５− ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ² −メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチル ウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウ リジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び ５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルア デノジン、及びＮ⁵−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチ ルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ² −エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２ ，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択され ることを特徴とする請求項１に記載の方法。 11．前記ウイルスがレトロウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の 方法。 12．前記ポリメラーゼがヒトポリメラーゼIIであることを特徴とする請求項１ に記載の方法。 13．前記細胞が細胞培養にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。 14．前記細胞が動物内にあることを特徴とする請求項１に記載の方法。 15．前記ウイルスの変異比率の増加が前記ウイルスの生存能力の進行的な喪失 を作り出すことを特徴とする請求項１に記載の方法。 16．ウイルスが感染した細胞に対するRNAヌクレオシド42アナログの１超の種 を投与することを含む請求項１に記載の方法。 17．前記ウイルスが、Ｃ型肝炎、コロナウイルス、インフルエンザ、RSウイル ス及びデング熱からなる群から選択されるRNAウイルスであることを特徴とする 請求項１に記載の方法。 18．RNAヌクレオシドアナログを含むレトロウイルス粒子。 19．前記粒子がHIV粒子であることを特徴とする請求項18に記載のレトロウイ ルス粒子。 20．前記ヌクレオシドアナログが、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒド ロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチ ジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシ チジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル ）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５− ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ² −メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチル ウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウ リジ ン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び５− （チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルアデノ ジン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチルグ アノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ²− エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２， Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択される ことを特徴とする請求項18に記載のレトロウイルス粒子。 21．複製した相同なウイルス核酸の高度に変異性の集団を含む細胞の集団。 22．前記細胞が細胞培養にあることを特徴とする請求項21に記載の細胞の集団 。 23．前記ウイルス核酸がHIVレトロウイルスから得られることを特徴とする請 求項21に記載の細胞の集団。 24．ウイルスゲノムの核酸、RNAアナログ、細胞のmRNAアナログ及びウイルス ゲノムのRNAアナログを含む細胞。 25．前記ウイルスゲノムの核酸が細胞のゲノムに組み込まれることを特徴とす る請求項24に記載の細胞。 26．前記ウイルスゲノムの核酸がレトロウイルスの核酸であることを特徴とす る請求項24に記載の細胞。 27．前記ウイルスゲノムの核酸がHIV核酸であることを特徴とする請求項25に 記載の細胞。 28．前記ウイルスゲノムの核酸が、HIV-1，HIV-2，HTLV-1，HTLV-2，SIV，Ａ 型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びデング熱ウイルスからなる群から選択される ことを特徴とする請求項24に記載の細胞。 29．リボヌクレオシドアナログの変異誘発能力を検出する方法であって、該リ ボヌクレオシドアナログをポリメラーゼにより合成されたウイルスRNAに組み込 み、そして該組み込みが子孫ウイルスにおいて変異を引きおこすか否かを決定す ることを含む方法。 30．前記ヌクレオシドアナログが、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒド ロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチ ジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシ チジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル ）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５− ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ² −メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチル ウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウ リジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び ５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルア デノジン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチ ルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ² −エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２ ，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択され ることを特徴とする請求項29に記載の方法。 31．前記ウイルスがRNAウイルスであることを特徴とする請求項29に記載の方 法。 32．前記ウイルスがレトロウイルスであることを特徴とする請求項29に記載の 方法。 33．前記ウイルスが、HIV-1，HIV-2，HTLV-1，HTLV-2，SIV，Ａ型肝炎、Ｂ型 肝炎、Ｃ型肝炎、及びデング熱ウイルスからなる群から選択されることを特徴と する請求項29に記載の方法。 34．細胞のポリメラーゼにより組み込まれたリボヌクレオシドアナログについ てスクリーニングする方法であって、該細胞のポリメラーゼを前記リボヌクレオ シドアナログと共に、核酸テンプレートの存在下でインキュベートし、そして該 リボヌクレオシドアナログが重合されるか否かを決定することを含む方法。 35．前記細胞のポリメラーゼが細胞中に存在することを特徴とする請求項34に 記載の方法。 36．前記細胞のポリメラーゼを天然のリボヌクレオシドとインキュベートする ことを更に含むことを特徴とする請求項34に記載の方法。 37．前記リボヌクレオシドアナログ及び天然のリボヌクレオシドのRNAポリマ ーへの組込みの比率を比較することを更に含むことを特徴とする請求項34に記載 の方法。 38．前記ウイルスがレトロウイルスであることを特徴とする請求項34に記載の 方法。 39．前記細胞のポリメラーゼが哺乳動物polIIポリメラーゼであることを特徴 とする請求項34に記載の方法。 40．医薬として許容される担体と一緒に、治療に有効な量のRNAヌクレオシド アナログを含む医薬組成物であって、該アナログが、関心のウイルスに感染した 細胞において該ウイルスをコードするゲノム核酸のRNA複製物にポリメラーゼに より組み込まれたものであり、ここで前記アナログは、第１の相補的ヌクレオチ ドを有する第１の天然のヌクレオチドに取って代わり、ここで前記アナログは該 第１のヌクレオチドと異なる第２のヌクレオチドに相補的であるこ とを特徴とする医薬組成物。 41．前記ヌクレオシドアナログが、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒド ロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチ ジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシ チジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル ）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５− ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ² −メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチル ウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウ リジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び ５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルア デノジン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチ ルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ² −エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２ ，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択され ることを特徴とする請求項40に記載の医薬組成物。 42．経口投与に適することを特徴とする請求項40に記載の医薬組成物。 43．非経口投与に適することを特徴とする請求項40に記載の医薬組成物。 44．動物においてウイルスの変異比率を増加させる方法であって、該動物に、 治療に有効な量の変異誘発性リボヌクレオシドアナログを投与することを含む方 法。 45．前記ヌクレオシドアナログが、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒド ロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチ ジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシ チジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル ）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコール、５− ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ² −メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチル ウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウ リジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び ５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルア デノジン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチ ルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ² −エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２ ，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群から選択され ることを特徴とする請求項44に記載の方法。 46．前記RNAヌクレオシドアナログが、前記動物のウイルスに感染した細胞中 に存在するポリメラーゼにより、前記ウイルスのゲノム核酸のRNA複製物に、天 然の相補性核酸の少くとも約0.1％の効率で組み込まれることを特徴とする請求 項44に記載の方法。 47．前記動物が、HIV-1，HIV-2，HTLV-1，HTLV-2，Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型 肝炎及びデング熱ウイルスからなる群から選択されるウイルスに感染したヒト患 者であることを特徴とする請求項44に記載の方法。 48．前記動物が、AIDS、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｔ細胞白血病からなる群から選 択される病気を有するヒト患者であることを特徴とする請求項44に記載の方法。 49．前記動物が、ネコ白血病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、又は水疱性口 内炎ウイルスからなる群から選択される病気を有することを特徴とする請求項44 に記載の方法。 50．各々のヌクレオシドアナログが、ウリジン、シチジン、グアノシン、アデ ノシン、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴− エテノシチジン、３−メチルシチジン、５−ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチ ルシチジン、５−（２−ヒドロキシエチル）シチジン、５−クロロシチジン、５ −ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、５−アミノシチジン、 ５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキシアルキル）−シチジン、５−（チオアル キル）−シチジン及びシチジングリコール、５−ヒドロキシウリジン、３−ヒド ロキシエチルウリジン、３−メチルウリジン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ²−エチ ルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴−メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン 、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−アルキルウリジン、５−ニトロソウリジン、 ５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジン、及び５−（チオアルキル）−ウリジン 、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３−メチルアデノジン、及びＮ⁶−メチルアデノ シン、８−ヒドロキシグアノシン、Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノ シン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシン、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アル キルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、２，Ｎ³−エテノグアノシン、及び ８−アミノグアノシンからなる群から選択される基に連結したランダムな化学置 換基を含むことを特徴とするヌクレオシドアナログのライブラリー。 51．複数のヌクレオシドアナログが重合していることを特徴とする請求項50に 記載のライブラリー。 52．RNAポリメラーゼを更に含むことを特徴とする請求項50に記載のライブラ リー。 53．約５〜1,000,000の異なるアナログを含むことを特徴とする請求項50に記 載のライブラリー。 54．前記細胞のRNAポリメラーゼがヒトRNAポリメラーゼIIであることを特徴と する請求項50に記載のライブラリー。 55．変異誘発性リボヌクレオシドアナログを同定する方法であって、 複数のリボヌクレオシドアナログを供するステップと、 該リボヌクレオシドアナログの一部をRNAポリメラーゼを用いてリボヌクレオ シドポリマーに組み込むステップと、 該リボヌクレオシドポリマーを単離するステップと、 該リボヌクレオシドポリマーに組み込まれたリボヌクレオシドアナログの化学 組成を決定するステップと、 を含む方法。 56．前記リボヌクレオシドポリマーを加水分解するステップを更に含むことを 特徴とする請求項55に記載の方法。 57．前記ポリマーが電気泳動を用いて単離されることを特徴とする請求項55に 記載の方法。 58．前記リボヌクレオシドポリマーを加水分解してリボヌクレオシドアナログ モノマーを供するステップと、質量分析及びNMRからなる群から選択される技術 を用いて前記リボヌクレオシドアナログモノマーの構造を決定するステップと、 を更に含むことを特徴とする請求項55に記載の方法。 59．変異誘発性リボヌクレオシドアナログを作り出す方法であっ て、 ウリジン、シチジン、アデノシン、グアノシン、Ｎ⁴−アミノシチジン、Ｎ²− メチル−Ｎ⁴−アミノシチジン、３，Ｎ⁴−エテノシチジン、３−メチルシチジン 、５−ヒドロキシシチジン、Ｎ⁴−ジメチルシチジン、５−（２−ヒドロキシエ チル）シチジン、５−クロロシチジン、５−ブロモシチジン、Ｎ⁴−メチル−Ｎ⁴ −アミノシチジン、５−アミノシチジン、５−ニトロソシチジン、５（ヒドロキ シアルキル）−シチジン、５−（チオアルキル）−シチジン及びシチジングリコ ール、５−ヒドロキシウリジン、３−ヒドロキシエチルウリジン、３−メチルウ リジン、Ｏ²−メチルウリジン、Ｏ²−エチルウリジン、５−アミノウリジン、Ｏ⁴ −メチルウリジン、Ｏ⁴−エチルウリジン、Ｏ⁴−イソブチルウリジン、Ｏ⁴−ア ルキルウリジン、５−ニトロソウリジン、５−（ヒドロキシアルキル）−ウリジ ン、及び５−（チオアルキル）−ウリジン、１，Ｎ⁶−エテノアデノジン、３− メチルアデノジン、及びＮ⁶−メチルアデノシン、８−ヒドロキシグアノシン、 Ｏ⁶−メチルグアノシン、Ｏ⁶−エチルグアノシン、Ｏ⁶−イソプロピルグアノシ ン、３，Ｎ²−エテノグアノシン、Ｏ⁶−アルキルグアノシン、８−オキソ−グア ノシン、２，Ｎ³−エテノグアノシン、及び８−アミノグアノシンからなる群か ら選択されるヌクレオチドアナログを化学修飾して化学的に修飾されたリボヌク レオシドアナログを供するステップと、 該化学的に修飾されたアナログがRNAポリメラーゼによりポリリボヌクレオチ ド分子に組み込まれるか否かを決定するステップと、 該化学的に修飾されたアナログの変異誘発能力を測定するステップと、 を含む方法。 60．前記オリゴヌクレオチドを化学修飾するステップが、選択されたヌクレオ チドアナログを酸素フリーラジカルに露出することを含むことを特徴とする請求 項59に記載の方法。 61．容器並びに１又は複数の次の構成物：対照変異誘発性RNAアナログ、テス ト変異誘発性RNAアナログ、RNAポリメラーゼ、該RNAポリメラーゼによる前記RNA アナログの組込みを検出するための試薬、及び前記対照変異誘発性RNAアナログ と比べた前記テスト変異誘発性アナログの変異誘発能力を検出するためのキット 構成物の使用の説明書を含むキット。 62．動物においてウイルスの変異比率を増加させる方法であって、（ａ）ウイ ルスに感染した細胞に対する治療に有効な量のリボヌクレオシドアナログであっ て、該アナログはポリメラーゼにより前記ウイルスをコードするゲノム核酸のRN A複製物に組み込まれ、該アナログは第１の相補性ヌクレオチドを有する第１の 天然ヌクレオチドに取って代わり、該アナログは該第１のヌクレオチドと異なる 第２のヌクレオチドと相補的であるリボヌクレオシドアナログを、（ｂ）前記第 １の天然ヌクレオチドの濃度を減少させる薬剤と組み合わせて動物に投与するこ とを含む方法。 63．ウイルスの変異比率を増加させる方法であって、アデニン、シトシン、グ アニン、ウラシル及びチミンを含む群から選択される遊離塩基を、ウイルスに感 染した細胞に投与することを含み、ここで該塩基は、前記ウイルスをコードする ゲノム核酸のRNA又はDNA複製物にポリメラーゼにより組み込まれ、前記塩基は、 第１の相補性ヌクレオチドを有する第１の天然ヌクレオチドに取って代わり、前 記塩基は前記第１のヌクレオチドと異なる第２のヌクレオチドと相補的であり、 それによりウイルスの変異を誘導することを特徴とする方法。 64．請求項55に記載の方法により同定されるリボヌクレオシドアナログ。 65．前記RNAヌクレオシドアナログがエナンチオ特異的ヌクレオシドアナログ であることを特徴とする請求項１に記載の方法。 66．前記RNAヌクレオシドアナログがエナンチオ特異的ヌクレオシドアナログ であることを特徴とする請求項40に記載の医薬組成物。