JP2001522809A - 宿主由来タンパク質結合ｈｃｖ：医薬、診断薬および精製用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト蛋白アネキシンＶ、チューブリンおよびアポリポ蛋白ＢはＣ型肝炎ウイルスエンベロープ蛋白Ｅ１および／またはＥ２に結合するという知見、ならびにＣ型肝炎ウイルス感染を診断および治療するためのこれらのヒト蛋白の使用を記載する。ＨＣＶエンベロープ蛋白を豊富化させるためのこれらの蛋白の使用、ならびにＨＣＶのこれらのヒト蛋白への結合を阻害する分子の使用、ならびにＥ１および／Ｅ２結合ドメインを用いたワクチンも開示する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、ＨＣＶに関する有効な感染系の開発、およびヒトタンパク質アネキ
シンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク質ＢがＣ型肝炎ウイルスエンベロ
ープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２と結合するという知見に基づき、Ｃ型肝
炎ウイルスでの感染を診断し、治療するためのこれらのヒトタンパク質の使用に
関する。本発明はさらに、ＨＣＶエンベロープタンパク質を豊富化するための後
者タンパク質の使用およびＨＣＶのこれらのヒトタンパク質との結合を抑制する
分子、ならびにＥ１および／またはＥ２結合領域を用いるワクチンに関する。

【０００２】 発明の背景 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症は先進国および発展途上国のいずれにおい
ても主な健康問題である。世界の人口の約１ないし５％がこのウイルスに感染し
ていると推定され、慢性感染者は世界中で１億７５００万人にのぼる。ＨＣＶ感
染は、輸血に関連する肝炎の最も重大な原因であると考えられ、進行して慢性肝
障害になることが多い。さらに、ＨＣＶが肝細胞癌の誘発に関与するということ
も実証されている。したがって、信頼性のある診断法および有効な治療手段の需
要が高い。さらに、ＨＣＶで汚染された血液製剤についての感度の良い特異的な
スクリーニング法およびＨＣＶ培養の改良法が必要とされる。 ＨＣＶは、少なくとも３つの構造タンパク質および少なくとも６つの非構造タ
ンパク質をコードする約９．８キロベースの（＋）鎖ＲＮＡウイルスである。構
造タンパク質はまだ機能的には確認されていないが、１つのコアタンパク質およ
び２つのエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２からなると考えられる。Ｅ１タ
ンパク質は１９２個のアミノ酸からなり、ＨＣＶ遺伝子型に応じて５ないし６個
のＮ−グリコシル化部位を含み、一方、Ｅ２タンパク質は３６３ないし３７０個
のアミノ酸からなり、ＨＣＶ遺伝子型に応じて１１個までのＮ−グリコシル化部
位を含む（論評については、ＭａｅｒｔｅｎｓおよびＳｔｕｙｖｅｒ、１９９７
参照）。後者のエンベロープタンパク質は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バクロウイルス、酵母および哺乳動物発現系を用いる
組換え技術により産生されてきた。高等真核細胞および特に哺乳動物細胞培養物
における発現系の使用により、質の高いエンベロープタンパク質が得られる。す
なわち、これらはＨＣＶ患者から回収された抗体により有効に認識される（ Ｍ ａｅｒｔｅｎｓら、１９９４、ｄｅ Ｍａｒｔｙｎｏｆｆら、１９９６）。 生きたウイルスの標準化感染はＨＣＶの真核細胞との結合パラメータの研究に
ついての必要条件である。しかしながら、ＨＣＶによる真核細胞の調節可能な感
染には問題がある。この問題の部分的解決法として、ＨＣＶの生産的感染を支持
するＤａｕｄｉ細胞系が選択された（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）。しかしな
がら、感染させるための接種物から、Ｍｏｌｔ−４細胞およびＤａｕｄｉ細胞に
おいてさえも種々の結果が得られた。したがって、たとえばＨＣＶのその標的真
核細胞との相互作用を妨害する薬剤の開発に関する比較研究は困難である。した
がって、ＨＣＶによる真核細胞の有効で、信頼性のある感染を保証する方法が早
急に望まれる。

【０００３】 ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２は互いに相互作用して、ヘテロ
オリゴマー複合体を形成する。これらのＨＣＶエンベロープタンパク質の厳密な
役割はまだ解明されていないが、ウイルスの標的細胞との結合の原因であること
が示唆されている。実際、Ｅ２の高度に変化しうるアミノ末端（すなわち、超可
変領域Ｉ）を主に含むＥ２の標的細胞との結合は、何人かの著者により記載され
ている（Ｆａｒｃｉら、１９９６；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９４；Ｚｉｂｅｒｔ
ら、１９９５およびＲｏｓａら、１９９６）。さらに、いくつかの宿主タンパク
質がエンベロープタンパク質の一方または両方と結合することが証明されている
。例えば、シャペロンタンパク質カルネキシンはＥ１およびＥ２の両方と相互作
用し、そのために、両エンベロープタンパク質の正確なフォールディングを支持
することが証明されている（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｙｄｅｒら、１９９７）。さらに
、ラクトフェリンは、乳中に主に見られるタンパク質であるが、両エンベロープ
タンパク質と結合することが実証されている（Ｙｉら、１９９７ｂ）。しかしな
がら、この相互作用の役割は明らかでない。 Ｅ２と特異的に結合する２４ｋＤ ａ血漿膜タンパク質が記載されている［ＷＯ９７／０９３４９（Ａｂｒｉｇｎａ
ｎｉ）］。後者のタンパク質は、ＨＣＶについての細胞受容体であることが示唆
されている。さらに、肝臓内皮細胞およびマクロファージ上のマンノース受容体
ならびに肝臓細胞上のアシアログリコプロテイン受容体はＥ１およびＥ２タンパ
ク質によりＨＣＶの受容体として機能することが示唆されている［ＷＯ９２／０
８７３４（Ｒａｌｓｔｏｎら）］。加えて、患者の血清中のＨＣＶのＲＮＡは血
清のＬＤＬ−フラクションと結合してみられることが多い（Ｔｈｏｍｓｓｏｎら
、１９９２＆１９９３；Ａｇｎｅｌｌｏら、１９９６＆１９９７）。この発見の
特徴はまだ解明されていない。 いくつかのＨＣＶ−結合タンパク質があわせて文献に記載されている。しかし
ながら、ヒトタンパク質アネキシンＶ、アポリポタンパク質Ｂ、またはチューブ
リンのＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２との結
合に関する先行技術はない。また、ＨＣＶとＬＤＬ間の相互作用は関連するＬＤ
Ｌの成分、すなわち、タンパク質、脂質または糖質に関しても、関連するＨＣＶ
タンパク質の領域、すなわちエンベロープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２に
関して解明されていない。

【０００４】 アネキシンＶ（エンドネキシンＩＩともいう 胎盤抗凝血性タンパク質、ＰＰ
４またはリポコルチンＶ）は、アネキシンとして公知の、３２と６７ｋＤａの間
の分子量を有するＣａ²⁺−依存性リン脂質結合タンパク質に構造的に密接に関連
した科に属する（Ｋｌｅｅ、１９８８；Ｚａｋｓ ＆ Ｃｒｅｕｔｚ、１９９０
）。アネキシンＶは、例えば肝臓、脾臓、肺、腸および胎盤などの種々の組織に
おいてみられる（Ｗａｌｋｅｒら、１９９０）。該タンパク質は、 Ｃａ²⁺−依 存的に胎盤膜と結合し（Ｈａｉｇｌｅｒら、１９８７）、血液の凝固を抑制し（
Ｇｒｕｎｄｍａｎら、１９８８）、インビトロのホスホリパーゼＡ２活性を抑制
することが記載されている（Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、１９８８）。他の研究者らは
、アネキシンＶが一体の膜タンパク質のように挙動し、カルシウム選択性カチオ
ンチャンネルを形成することを証明している（Ｒｏｊａｓら、１９９０；Ｂｉａ
ｎｃｈｉら、１９９２）。 本発明者らは、ヒト肝臓血漿膜上に存在するアネキシンＶは、Ｂ型肝炎ウイル
ス（ＨＢＶ）のエンベロープ糖タンパクの１つである「小」ＨＢｓＡｇと特異的
にＣａ²⁺−依存的に結合することを最近実証した（Ｈｅｒｔｏｇｓら、１９９３
；ＷＯ９４／０１５５４）。ＨＢｓＡｇとアネキシンＶ間の受容体−リガンド関
係は、自然のヒト肝臓アネキシンまたは組換えアネキシンＶで免疫されたウサギ
、あるいはウサギ抗アネキシンＶ ＩｇＧのＦ（ａｂ’）₂フラグメントで免疫 されたニワトリはＨＢｓＡｇを特異的に認識する抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２
）を自発的に生じる（Ｈｅｒｔｏｇｓら、１９９４）という観察によりさらに支
持される。ＨＣＶはフラビビリデ（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科に属するＲＮ
Ａウイルスであり、ＨＢＶはヘパドナウイルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ
）科に属するＤＮＡウイルスであり、 アネキシンのＨＣＶのＥ１またはＥ２と の結合は全く予想されなかった。

【０００５】 チューブリンは、ほとんどの真核細胞においてみられる可溶性タンパク質であ
り、細胞中の微小管の主なタンパク質サブユニットである。微小管は、有糸分裂
および減数分裂紡錘体、および神経細胞の軸索の主要な成分である。微小管はさ
らに、受容体キャッピングなどの種々の細胞表面特性の維持における細胞内輸送
のいくつかの態様に関与し、細胞の全体の形態および内部細胞質構造を確立する
。ニューロンから抽出されたチューブリンは、約１００ｋＤａの二量体であり、
各二量体は２つのポリペプチド、α−チューブリン（５０ｋＤａ）およびβ−チ
ューブリン（５０ｋＤａ）からなり、これらは密接に関連したアミン酸配列を有
する（Ａｌｂｅｒｔｓら、１９８３）。 チューブリンはセンダイウイルスの転写に関与し（Ｔａｋａｇｉら、１９９６
）、単純ヘルペスウイルス１型（Ｈａｍｍｏｎｄら、１９９６）およびタバコモ
ザイクウイルス（ＭｃＬｅａｎら、１９９５）の細胞内輸送に関与することが証
明されている。チューブリンはさらに水疱性口内炎ウイルスのマトリックスタン
パク質と相互作用するらしい（Ｍｅｌｋｉら、１９９４）。 アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）は低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の主要
なタンパク成分である。その脂質−キャリア特性に関わらず、ａｐｏＢは新たに
合成されたトリグリセリド豊富な粒子の血漿中への分泌に関与し、さらにＬＤＬ
の取り込みおよび分解の原因である高親和性膜受容体に対するリガンドである（
Ｓｃａｎｕ、１９８７）。Ｅ１はＬＤＬとの結合に関与するが（Ｍｏｎａｚａｈ
ｉａｎら、１９９５）、直接相互作用するＥ１の特定の領域は明らかにされてい
ない。さらに、Ｅ１のＬＤＬとの結合がＬＤＬの脂質または糖成分あるいはタン
パク成分のいずれかにより媒介されるかどうかは明らかでない。

【０００６】 このように、ヒトタンパク質アネキシンＶ、チューブリンまたはａｐｏＢのＣ
型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２との結合がＨＣ
Ｖを診断するための信頼できる方法論的手段およびＨＣＶ感染を治療または予防
するための有効な治療薬の開発につながることを証明または示唆した先行技術は
存在しない。アネキシンおよびチューブリンは他のウイルスと相互作用すること
が記載されているが、特に記載されたウイルスはいずれもフラビウイルス（ｆｌ
ａｖｉｖｉｒｕｓ）またはペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）科に属さな
いので、ＨＣＶとの相互作用を示唆する証拠はない。

【０００７】 発明の目的 文献から、ＨＣＶの信頼できる診断法、信頼できるワクチン、および有効な治
療薬および予防薬が早急に望まれていることは明らかである。加えて、ＨＣＶで
汚染された血液製剤の感度の良い特異的なスクリーニング法およびＨＣＶの培養
の改良法が信頼できる感染プロトコルとならんで必要とされる。どのヒトタンパ
ク質がＨＣＶと結合するか、ＨＣＶについての推定受容体として機能するかを知
ることは、有効な診断手段および治療薬をデザインする助けとなる。この点で、
本発明は、ヒトタンパク質アネキシンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク
質ＢがＥ１およびＥ２タンパク質から構成されるそのエンベロープ複合体を介し
てＨＣＶと結合するという驚くべき発見に基づく。

【０００８】 したがって、本発明は、 ＨＣＶ感染症を治療するための組成物の調製、または ＨＣＶ感染症の診断法、または ＨＣＶタンパク質の精製法、または 細胞培養におけるＨＣＶの増殖法 に用いるためのアネキシンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク質Ｂからな
る群より選択されるヒトタンパク質、またはその機能的に等価な変異体またはフ
ラグメントを提供することを目的とする。 より詳細には、本発明は前記のタンパク質を提供することを目的とし、前記タ
ンパク質、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントはＨＣＶと、よ
り好ましくはＨＣＶのエンベロープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２と結合す
る。

【０００９】 加えて、本発明は前記のタンパク質を提供することを目的とし、前記アネキシ
ンＶ、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントはＥ１のアミノ酸３
０７−３２６および／またはＥ２のアミノ酸４１３−４６７と結合する。 加えて、本発明は前記のようなタンパク質を提供することを目的とし、前記チ
ューブリン、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントはＥ１のアミ
ノ酸１９２−３２６および／またはＥ２のアミノ酸３８４−６７３と結合する。 加えて、本発明は前記のようなタンパク質を提供することを目的とし、前記ア
ポリポタンパク質Ｂ、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントはＥ
１のアミノ酸１９２−２６３および／またはのアミノ酸２８８−３２６と結合す
る。 本発明はさらにＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２ペプチド、または機能的等価
物、またはその変異体を含み、前記のようなヒトタンパク質についての結合領域
を含む組成物を提供することを目的とし、前記組成物は予防または治療に用いる
ことができる。このような組成物はウイルスの生活環を直接妨害する抗体を生じ
させるために用いることができ、したがって非常に有効である。さらに、ペプチ
ドまたはその機能的等価物は自然の相互作用と競合し、したがってウイルス生活
環を直接抑制する薬剤として用いることができる。

【００１０】 前記のヒトタンパク質、またはそのいずれかの機能的に等価な変異体またはフ
ラグメント、および担体を含む、ＨＣＶでの感染を治療するために用いられる組
成物を提供することも本発明の目的である。組成物はＨＣＶの生活環における基
本的機能を標的とし、非常に有効で、あらゆるＨＣＶ遺伝子型に対して交差防御
性であることが期待される。 宿主タンパク質およびＨＣＶエンベロープタンパク質間の相互作用は本明細書
に開示された例（すなわち、チューブリン、アネキシンＶおよびアポリポタンパ
ク質Ｂ）に限定されないことは明らかである。 したがって、ＨＣＶエンベロープタンパク質と相互作用し、ＨＣＶでの感染を
治療するための薬剤の調製において用いることができるいずれかの宿主タンパク
質、またはその機能的等価な変異体またはフラグメント、あるいはＨＣＶでの感
染の診断法、あるいはＨＣＶタンパク質の精製法、あるいは培地におけるＨＣＶ
の増殖法を提供することは本発明の目的の一つである。

【００１１】 本発明はさらに体液のサンプル中でＨＣＶを前記のような宿主タンパク質、ま
たはその機能的等価な変異体またはフラグメントと接触させ、体液のサンプル中
でＨＣＶの前記の宿主タンパク質、またはその機能的等価な変異体またはフラグ
メントとの結合を確認することを含む、ＨＣＶへの暴露またはＨＣＶによる感染
の診断法を提供することを目的とする。例えば、ＨＣＶ粒子の捕捉および／また
は検出にａｐｏＢ、チューブリンおよび／またはアネキシンを用いることができ
る。 さらに、本発明は、ＨＣＶエンベロープタンパク質を含む組成物を前記のよう
なヒトタンパク質、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントと接触
させ、前記タンパク質、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントと
結合する組成物の部分を単離することを含むＨＣＶエンベロープタンパク質の精
製法を提供することを目的とする。 本発明はさらに、固体支持体、前記のようなヒトタンパク質または機能的に等
価な変異体またはそのフラグメント、および体液のサンプル中ＨＣＶと前記のよ
うなヒトタンパク質、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントの間
に形成された複合体の確認を可能にするような適当なマーカーを含んでなるＨＣ
Ｖの存在を検出するための分析キットを提供することを目的とする。

【００１２】 加えて、本発明は、前記のようなヒトタンパク質、または機能的に等価な変異
体またはそのフラグメントを過剰に発現する細胞を提供し、ＨＣＶで細胞を感染
させ、感染した細胞を培養することを含む、細胞培養物中でのＨＣＶの増殖法を
提供することを目的とする。 さらに、本発明は血漿、血清または他の生物学的液体中のＨＣＶの存在を減少
または除去するための方法であって、前記生物学的液体を前記のようなヒトタン
パク質、または機能的に等価な変異体またはそのフラグメントと接触させ、前記
生物学的液体を前記タンパク質、または機能的に等価な変異体またはそのフラグ
メントから分離することを含む方法を提供することを目的とする。 さらに、本発明は血漿、血清、または他の生物学的液体中の抗−ＨＣＶ抗体を
測定する方法であって、前記のようなヒトタンパク質、または機能的に等価な変
異体またはそのフラグメントとの結合のために生物学的液体中の抗体と既知量の
ＨＣＶエンベロープタンパク質間で競合的結合をさせ、結合したＨＣＶエンベロ
ープタンパク質の量を測定することを含む方法を提供することを目的とする。 本発明はさらに、ＨＣＶと前記のようなヒトタンパク質、または機能的に等価
な変異体またはそのフラグメント間の結合を調節する分子をスクリーンする法を
提供することを目的とする。

【００１３】 本発明はさらにＨＣＶと前記のようなヒトタンパク質、または機能的に等価な
変異体またはそのフラグメント間の結合を調節する分子を含む組成物を提供する
ことを目的とする。 本発明はさらに、精製されたＨＣＶ粒子を用いることによるＨＣＶについての
真核細胞のインビトロ感染法を提供することを目的とする。より詳細には、前記
ＨＣＶ粒子を含有する溶液を超遠心することによりＨＣＶ粒子を精製することで
ある。より詳細には、前記ＨＣＶ粒子を含有する体液を超遠心することによりＨ
ＣＶ粒子を精製することである。より詳細には、Ｄａｕｄｉ、Ｍｏｌｔ、Ｈｅｐ
Ｇ２、またはいずれかのインビトロのＢ−、Ｔ−マクロファージ、肝細胞または
肝癌細胞系を前記精製されたＨＣＶ粒子で感染させることである。 本発明はさらに、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質の含量に関する前記精製
ＨＣＶ粒子の特徴付けを目的とする。さらに、本発明はＥ１および／またはＥ２
に対する抗体の含量に関する前記精製ＨＣＶ粒子の特徴付けを目的とする。さら
に、本発明はＬＤＬの含量に関する前記精製ＨＣＶ粒子の特徴付けを目的とする
。さらに、本発明はアポリポタンパク質Ｂの含量に関する前記精製ＨＣＶ粒子の
特徴付けを目的とする。 本発明はさらにＨＣＶと真核細胞間の結合を調節する分子をスクリーニングす
るために用いられるインビトロウイルス感染系を提供することを目的とする。 加えて、本発明は前記のようなＨＣＶ粒子を精製し、前記のような宿主細胞を
感染させ、感染の多重度を測定することからなる、ＨＣＶへの暴露またはＨＣＶ
による感染の診断に用いられるウイルス感染系を提供することを目的とする。 最後に、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ないし６（表４）により定義される単
離されたＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２ペプチド、またはそのいずれかのフラ
グメントを提供することを目的とし、前記配列はアネキシンＶ、チューブリンお
よび／またはアポリポタンパク質Ｂと結合する。

【００１４】 本発明の目的はすべて以下に記載する態様と合致する。 表および図面の簡単な説明 表１はＨＣＶを含有する血清（４２および４６、「前」）およびそれ由来の接
種物（４２および４６、「後」）の特徴付けを示す（「Ｅ１／Ｅ２」＝Ｅ１およ
び／またはＥ２タンパク質のレベル；「ｐｏｓ」＝陽性；「ｎｅｇ」＝陰性；「
ｎｄ」＝測定せず；「遺伝子型」＝ＨＣＶの遺伝子型）。 表２は表１において特徴付けされた接種物４２および４６を用いてＤａｕｄｉ
Ｂ細胞を感染させた後に測定されたＨＣＶ−ＲＮＡのレベルを示す（「ＣＦ」
＝細胞フラクション；「ＳＮ」＝上清；「−」＝陰性；「＋」＝ＰＣＲの第二（
ネステッド（Nested））ラウンド後陽性；「＋（＋）」＝ＰＣＲの第一ラウンド
後わずかに陽性、ネステッドＰＣＲ後確定；「＋＋」＝ＰＣＲの第一ラウンド後
陽性）。 表３は異なる細胞系に対するＥ１またはＥ２の結合についてのＦＡＣＳ分析の
結果を示す（「−」＝結合なし；「（＋）」＝弱い結合［Ｓ（シグナル）／Ｎ（
ノイズ）：１〜２）；「＋」＝明らかな結合（Ｓ／Ｎ ２〜３）；「＋＋」＝強
い結合（Ｓ／Ｎ＞３）；ｎｄ＝測定されず）。 表４は、本発明において用いられるＥ１およびＥ２タンパク質フラグメントの
アミノ酸配列および対応するＳＥＱ ＩＤ ＮＯを列挙する。

【００１５】 発明の詳細な記載 本明細書において記載する本発明は、すでに出版された研究および係属中の特
許出願を参考にする。例えば、このような研究は、科学論文、特許または係属中
の特許出願を含む。前記または以下に記載するこれらの出版物および出願はすべ
て出典明示により本発明の一部とする。 本発明はＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１および／またはＥ２がヒトタンパ
ク質と結合するという知見に基づく。「結合する」なる用語は、Ｅ１および／ま
たはＥ２タンパク質がヒトタンパク質と物理的に結合し、相互作用することを意
味する。この点に関して、「結合領域」なる用語は、ヒトタンパク質と結合でき
るＥ１および／またはＥ２の特定のアミノ酸鎖を意味する。ウイルスタンパク質
のヒトタンパク質との結合は蛍光フローサイトメトリー、結合−、ＥＬＩＳＡ−
およびＲＩＡ−型分析または競合分析などのいずれかの当業界で公知の方法また
は分析法により証明することができる（実施例の項およびＨｅｒｔｏｇｓら、１
９９３参照）。

【００１６】 ＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２は前記（発明の背景参照）、Ｍ
ａｊｏｒおよびＦｅｉｎｓｔｏｎｅ（１９９７）およびＷＯ９２／０８７３４（
Ｒａｌｓｔｏｎら）に記載された十分に特質化されたＨＣＶタンパク質、または
そのフラグメント、または機能的に等価な変異体に関連する。前記フラグメント
および機能的に等価な変異体は本来以下に記載するようなヒトタンパク質と結合
する性質を有することは明らかである。さらに、ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ
２タンパク質の機能的に等価な変異体はあらゆるＨＣＶ遺伝子型、およびＨＣＶ
−関連ウイルス、たとえばＨＧＶ、ＧＢＶ−ＡおよびＧＢＶ−Ｂなどのいずれか
のＥ１および／またはＥ２エンベロープタンパク質に関連することは明らかであ
る。これらのタンパク質はＷＯ９６／０４３８５（Ｍａｅｒｔｅｎｓら）および
実施例の項に記載されたものにより得ることができる。 本発明において用いられるタンパク質は、ＨＣＶ遺伝子型１ｂ配列由来であり
、ｄｅ Ｍａｒｔｙｎｏｆｆら（１９９６）により記載されている。Ｅ１および
Ｅ２はいずれも截形タンパク質として哺乳動物細胞により産生され、Ｅ１（ａａ
１９２−３２６）およびＥ２（３８４−６７３）と表される。

【００１７】 「ヒトタンパク質」なる用語は、いずれかのヒトタンパク質（すなわち、多く
の天然の非常に複雑なアミノ酸の組み合わせ）、またはそのフラグメント（すな
わち、たとえばポリペプチドおよびペプチドなどの前記タンパク質由来のより少
ないアミノ酸のより簡単な組み合わせ）を意味し、これらはＨＣＶエンベロープ
タンパク質Ｅ１および／またはＥ２と結合する。これらのヒトタンパク質は、い
ずれかのヒト細胞または細胞系から、ＷＯ／９７０９３４９（Ａｂｒｉｇｎａｎ
ｉ）に記載されているものおよび本出願の実施例の項に記載されているような当
業界で公知のいずれかの方法により抽出でき、当業界で公知のいずれかの方法に
より特徴付けでき、配列決定できる。結果として、後者のタンパク質はさらにＭ
ａｎｉａｔｉｓら（１９８２）により記載されているような組換えＤＮＡ技術の
手段によっても産生することができる。本明細書において記載するような前記タ
ンパク質由来のポリペプチドおよびペプチドは当業界で公知の方法、たとえばＨ
ｏｕｂｅｎｗｅｙｌ（１９７４）およびＡｔｈｅｒｔｏｎ ＆ Ｓｈｅｐａｒｄ
（１９８９）により記載されているような古典的な化学合成、またはＭａｎｉａ
ｔｉｓら（１９８２）により記載されているような組換えＤＮＡ技術の手段によ
り調製することができる。「ポリペプチド」および「ペプチド」なる用語は、前
記タンパク質より少ないアミノ酸をその配列中に含むアミノ酸（ａａ）のポリマ
ーを意味し、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、脂肪酸などでの修飾な
どの転写後の修飾は意味しないが、除外もしないことは明らかである。例えば、
１またはそれ以上のａａ（天然でないａａも含む）類似体を含むポリペプチドお
よびペプチド、置換された結合を有するポリペプチドおよびペプチド、ポリペプ
チドおよびペプチドの突然変異体または天然の配列の変異体、システイン残基間
にジスルフィド結合を含むポリペプチドおよびペプチド、ならびに当業界で公知
の他の修飾がこの定義に含まれる。

【００１８】 より詳細には、本発明は周知のヒトタンパク質アネキシンＶ、チューブリンお
よびアポリポタンパク質Ｂ（発明の背景の項参照）、またはアネキシンＶ、チュ
ーブリンまたはアポリポタンパク質Ｂの機能的等価物またはフラクションであっ
て、ＨＣＶでの感染症を治療するための組成物、またはＨＣＶでの感染症の診断
法、またはＨＣＶタンパク質の精製法、または細胞培養物におけるＨＣＶの増殖
法において用いられるものに関する。「機能的等価物」なる用語は、ＨＣＶと結
合するアネキシンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク質Ｂのいずれかの明
らかな等価物、たとえばタンパク質のアネキシンファミリーの他のメンバーまた
はチューブリン−アルファまたはチューブリン−ベータ（発明の背景の項参照）
に関する。「機能的フラグメント」なる用語は、ＨＣＶと結合する前記定義のよ
うないずれかのポリペプチドまたはペプチドに関する。さらに、本発明はタンパ
ク質アネキシンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク質Ｂ、またはアネキシ
ンＶ、チューブリンおよびアポリポタンパク質Ｂの機能的等価物またはフラグメ
ントのＨＣＶ、特にＨＣＶエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２との結合に関
する。 より詳細には、本発明はチューブリンのＥ１のアミノ酸１９２−３２６および
Ｅ２のアミノ酸３８４−６７３との結合に関する。 本発明はさらにアネキシンＶのＥ１のアミノ酸３０７−３２６およびＥ２のア
ミノ酸４１３−４６７との結合に関する。 本発明はさらにアポリポタンパク質ＢのＥ１のアミノ酸１９２−２６３および
Ｅ２のアミノ酸２８８−３２６との結合に関する。 Ｅ１およびＥ２のアミノ酸領域は、ＭａｅｒｔｅｎｓおよびＳｔｕｙｖｅｒ（
１９９７）に記載されているＨＣＶポリタンパク質の開始メチオニンから始まる
ａａナンバリングを用いる典型的な遺伝子型１ｂ配列のａａナンバリングを参照
する。

【００１９】 本発明はさらに、前記のようなタンパク質、または機能的等価物またはその変
異体、および担体を含んでなる、ＨＣＶでの感染症を治療するための組成物に関
する。ＨＣＶでの感染症を治療するための組成物なる用語は、ＨＣＶでの感染症
、または他の非−Ａ、非−Ｂ型肝炎ウイルス、たとえばＨＧＶ、ＧＢＶ−Ａ、Ｇ
ＢＶ−Ｂ、または他の関連するウイルスでの密接に関連する感染症を予防、改善
または治療するための前記定義のいずれかのタンパク質、ポリペプチドまたはペ
プチドに関する。「ＨＣＶでの感染」なる用語は、ＨＣＶのいずれかの遺伝子型
または遺伝子型のいずれかの混合物での感染を意味することは明らかである。よ
り詳細には、ＨＣＶでの感染症を治療するための組成物とは、前記のようなタン
パク質、ポリペプチドまたはペプチドと医薬上許容される担体または賦形剤（い
ずれの用語も変換可能に用いることができる）とを含んでなる、ＨＣＶでの感染
を治療するための医薬組成物に関する。当業者に公知の適当な担体または賦形剤
は、生理的食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定化油
、オレイン酸エチル、生理的食塩水中５％デキストロース、等張性および化学的
安定性を向上させる物質、緩衝液および保存料である。他の適当な担体は、それ
自身組成物を受容する個人にとって有害な抗体の産生を誘発しないいずれかの担
体、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ
マーアミノ酸およびアミノ酸コポリマーを包含する。「医薬」は当業者の知識の
範囲内のいずれかの適当な方法で投与できる。投与の好ましい経路は非経口であ
る。非経口投与において、本発明の医薬は、前記のような医薬上許容される賦形
剤と組み合わせて溶液、懸濁液またはエマルジョンなどの注射可能な単位投与形
態に処方される。しかしながら、投与量および投与様式は個人に依存する。一般
に、医薬は本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、１μｇ／ｋｇ
と１０ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは１０μｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇの間、最
も好ましくは０．１と２ｍｇ／ｋｇの間の量で提供されるように投与される。連
続注入も用いることができる。その場合、医薬は５と２０μｇ／ｋｇ／分、より
好ましくは７と１５μｇ／ｋｇ／分の間の用量で注入することができる。

【００２０】 本発明はさらに、体液のサンプル中でＨＣＶを前記のようなタンパク質、また
は前記のような機能的に等価な変異体またはそのフラグメントと接触させ、体液
のサンプル中でＨＣＶの前記のようなタンパク質または前記のような機能的に等
価な変異体またはそのフラグメントとの結合を測定することを含むＨＣＶへの暴
露またはＨＣＶによる感染の診断法に関する。本発明において用いる「診断法」
なる用語は、当業界で公知のイムノアッセイ、たとえばビオチンおよびアビジン
またはストレプトアビジンを用いる分析、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降および凝集
検定を意味する。これらの分析法の詳細な記載は、ＷＯ９６／１３５９０（Ｍａ
ｅｒｔｅｎｓ ＆ Ｓｔｕｙｖｅｒ）およびＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）に記載されている。「体液」なる
用語は、血清、血漿、唾液、胃分泌物、粘液などの器官から得られるいずれかの
液体を意味する。 この点に関連して、本発明はさらに、固体支持体、前記のようなタンパク質ま
たは機能的に等価な変異体またはそのフラグメント、および体液のサンプル中の
ＨＣＶと前記のようなタンパク質、または機能的に等価な変異体またはそのフラ
グメントとの間に形成される複合体を決定できる適当なマーカーを含むＨＣＶの
存在を検出する検定キットに関する。「固体支持体」なる用語は、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）に記載され
ているような当業界で公知のいずれかの固体支持体を意味する。同様に、「適当
なマーカー」なる用語は、当業界で公知のいずれかのマーカーを意味する（ Ｃ ｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９２）
。

【００２１】 いくつかの生物学的液体は、凝集因子、血清アルブミン、成長ホルモンなどの
他の製品の供給源として用いられる。このような場合、供給源の生物学的液体は
ＨＣＶなどのウイルスにより汚染されていないことが重要である。したがって、
本発明はさらに血漿、血清、または他の生物学的液体中のＨＣＶの存在を減少ま
たは除去する方法に関し、該方法は、前記生物学的液体を前記のようなタンパク
質、または機能的に等価な変異体またはそのフラグメントと接触させ、前記生物
学的液体を前記のようなタンパク質、または機能的に等価な変異体またはそのフ
ラグメントから分離することを含む。「減少、除去または精製法」なる用語は、
当業界で公知のいずれかの方法に関する。 同様に、研究目的または工業的用途のためにＨＣＶなどのウイルスのエンベロ
ープタンパク質を精製することが重要である。したがって、本発明はさらに、Ｈ
ＣＶエンベロープタンパク質を含む組成物を前記のようなタンパク質、機能的に
等価な変異体またはそのフラグメントと接触させ、前記タンパク質または機能的
に等価な変異体またはそのフラグメントと結合する組成物の部分を単離すること
を含むＨＣＶエンベロープタンパク質の精製法に関する。「ＨＣＶエンベロープ
タンパク質を含有する組成物」なる用語は、ＨＣＶエンベロープタンパク質を含
有することができるいずれかの生物学的サンプルを意味する。 加えて、本発明は、前記のようなタンパク質、または機能的に等価な変異体ま
たはそのフラグメントを過剰に発現する細胞を提供し、細胞をＨＣＶで感染させ
、感染した細胞を培養することを含む細胞培養物中でのＨＣＶの増殖法に関する
。この点に関して、 Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ（１９９２）に記載されているような、前記のようなタンパク質また
は機能的に等価な変異体またはそのフラグメントで細胞を形質転換させる当業界
で公知のいずれかの方法を用いることができることは明らかである。同様に、形
質転換された細胞および／またはＨＣＶ−感染細胞を培養するための当業界で公
知のいずれかの方法を用いることができる（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）。「
過剰に産生する」とは、本発明のタンパク質および誘導体（すなわち変異体およ
びフラグメント）を正常な形質転換されていない細胞と比較してより多く発現す
る（すなわち、より多くのタンパク質および誘導体が発現される）宿主細胞を意
味する。

【００２２】 さらに、本発明は血漿、血清、または他の生物学的液体中の抗−ＨＣＶ抗体を
測定する方法に関し、該方法は、前記タンパク質または機能的に等価な変異体ま
たはそのフラグメントとの結合のために生物学的液体中の抗体と既知量のＨＣＶ
エンベロープタンパク質間に競合的結合を生じさせ、結合したＨＣＶエンベロー
プタンパク質の量を測定することを含む。本発明において用いる場合、「抗体」
なる用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を意味する。「モノ
クローナル抗体」なる用語は、均一な抗体数を有する抗体組成物を意味する。こ
の用語は抗体の種類または起源に関して制限しないし、その製造法を制限するこ
とも意図しない。加えて、「抗体」なる用語はさらに、イムノグロブリンのフレ
ームワーク領域の少なくとも一部がヒトイムノグロブリン配列および米国特許第
４９４６７７８号に記載されている一本鎖抗体由来であるヒト化抗体を意味し、 親抗体の抗原結合機能および特異性を保持するＦ_ab、Ｆ_(ab2)、Ｆ_vおよび他の フラグメントなどの抗体のフラグメントを意味する。「抗−ＨＣＶ抗体の測定法
」なる用語は、当業界で公知のいずれかの適当な方法を意味する。

【００２３】 本発明はさらに、これに限定されないが、ＨＣＶと前記のようなタンパク質、
または機能的に等価な変異体またはそのフラグメントとの結合を調節する抗体を
含む分子のスクリーニング法に関する。本発明において用いる場合、「分子をス
クリーンする方法」とは、スクリーニングに適した当業界で公知のいずれかの検
定法を意味する。特に、この用語は、ＷＯ９６／１３５９０に記載されているよ
うないずれかのイムノアッセイを意味する。本発明において用いる「調節」また
は「調節する」なる用語は、両方ともＨＣＶと前記のようなタンパク質間の結合
の増加調節［すなわち、活性化または刺激（例えば、アゴニスト化または増強）
］および減少調節［すなわち、阻害または抑制（たとえば、拮抗、減少または阻
害）］を意味する。「分子」なる用語は前記のようなポリペプチドを標的とする
かまたは結合させるいずれかの化合物はを意味する。「分子」なる用語は前記Ｈ
ＣＶペプチド［Ｅ１およびＥ２エンベロープタンパク質由来で、本明細書におい
て「Ｅ１およびＥ２結合領域（前記参照）と命名する］での予防接種に際し宿主
により産生される抗体に特異的に関する。実際、後者のＨＣＶペプチドはＨＣＶ
に対するワクチンまたはワクチン組成物において用いることができる。したがっ
て、本発明は、ヒトタンパク質についての結合領域を含む、ＨＣＶ Ｅ１および
／またはＥ２ペプチド、または前記のようなその機能的に等価な変異体、および
前記のような担体を含む、ＨＣＶでの感染を治療するかまたは予防するために用
いられる組成物に関する。以後「ワクチン組成物」と称する後者の組成物は、Ｃ
型肝炎ウイルスまたはそのいずれかの突然変異株またはいずれかの関連するウイ
ルス、たとえばＨＧＶ、ＧＢＶ−ＡまたはＧＢＶ−Ｂでの感染に対してヒトに予
防接種するための供給源として用いるために活性物質として前記のＨＣＶ由来ペ
プチドまたは前記のＨＣＶ−由来のペプチドの組み合わせを含む。「ワクチン組
成物」なる用語は部分的であっても完全であってもＨＣＶに対する防御を惹起で
きる免疫原性組成物に関する。「活性物質として」とは、ＨＣＶに対する防御を
惹起するワクチン組成物の成分に関する。活性物質（すなわち、本発明のペプチ
ド）は、ビオチニル化形態（ＷＯ９３／１８０５４において説明するような）お
よび／または製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．、Ｅｕｇ
ｅｎｅ、ＯＲ）の説明書にしたがってニュートラライト・アビジン（Ｎｅｕｔｒ
ａｌｉｔｅ Ａｖｉｄｉｎ）と複合体を形成するように用いることができる。こ
の点に関して、ワクチン組成物は、転写調節エレメントに操作可能に結合された
ポリペプチドモジュレーターをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドベ
クターを含むことは明らかである。本発明において用いる場合、「プラスミドベ
クター」は、結合している他の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。好ましい
ベクターは、それらが結合している核酸の自律的複製および／または発現が可能
なものである。一般に、これに限定されないが、プラスミドベクターは、そのベ
クター形態で染色体に結合していない円形二本鎖ＤＮＡループである。本発明に
おいて用いる場合、「ヌクレオチド配列」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）な
どのポリヌクレオチド、および適当ならばリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。この
用語はさらに、ヌクレオチド類似体から調製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれ
かの等価物、類似体、および一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖
ポリヌクレオチドを包含する。本発明において用いる場合、「転写調節エレメン
ト」なる用語は、基本的調節エレメントを含むヌクレオチド配列、すなわち、生
きた脊椎動物細胞中への導入に際し、細胞機構にポリヌクレオチドによりコード
される翻訳された産物を産生させることができるヌクレオチド配列である。「作
動可能に結合した」とは、成分がその通常の機能を果たすように並置されている
こと意味する。したがって、ヌクレオチド配列に操作可能に結合した転写調節エ
レメントは前記ヌクレオチド配列の発現を行うことができる。当業者は、異なる
転写プロモーター、ターミネーター、キャリアベクターまたは特定の遺伝子配列
をうまく用いることができることは理解できる。「ワクチン組成物」は活性物質
に加えて、それ自身組成物を受容する個人に対して有害な抗体の産生を誘発せず
、防御も惹起しない適当な賦形剤、希釈剤、担体および／またはアジュバントを
含むことにも注目すべきである。適当な担体は、典型的には大型のゆっくり代謝
される高分子、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコー
ル酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子である
。このような担体は、当業者には周知である。組成物の有効性を向上させる好ま
しいアジュバントは、これに限定されないが、水酸化アルミニウム、ＷＯ９３／
１９７８０に記載されている３−Ｏ−デアシル化モノホスホリルリピッドＡ、Ｗ
Ｏ９３／２４１４８に記載されているリン酸アルミニウム、米国特許第４６０６
９１８号に記載されているＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソ
グルタミン、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン
、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン２
（１’２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ
）エチルアミンおよびモノホスホリルリピッドＡを含有するＲＩＢＩ（Ｉｍｍｕ
ｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、無毒 化エンドトキシン、トレハロース−６，６−ジミコレート、および２％スクアレ
ン／Ｔｗｅｅｎ８０乳液中細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を包含する。
３成分ＭＰＬ、ＴＤＭまたはＣＷＳのいずれかを単独で用いても、２つづつ組み
合わせて用いてもよい。加えて、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）またはＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅ
ｘ）などのアジュバントを、ＱＳ２１および３−デ−Ｏ−アセチル化モノホスホ
リルリピッドＡ（ＷＯ９４／００１５３）、またはＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）
、またはポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］ベースのアジュ
バント（Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、またはブロッ
クコポリマーベースのアジュバント、たとえばＯｐｔｉｖａｘ（Ｖａｘｃｅｌ）
またはＧａｍｍａＩｎｕｌｉｎ（Ａｎｕｔｅｃｈ）、またはＧｅｒｂｕ（Ｇｅｒ
ｂｕ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）などの組み合わせを用いることができる。さらに
、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバ
ント（ＩＦＡ）をヒト以外の用途および研究目的で用いることができる。「ワク
チン組成物」はさらに、本来非毒性で非治療的である賦形剤および希釈剤、たと
えば水、生理的食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ
緩衝物質、保存料などを含有する。典型的には、ワクチン組成物は、注射可能な
、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される。溶液または懸濁液として
適当な固体形態、注射前の液体ビヒクルもさらに調製できる。アジュバント効果
を高めるために、製剤を乳化させたりリポソーム中に封入させることができる。
ポリペプチドもＩｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｘ中にサ
ポニン、たとえばＱｕｉｌ Ａ（ＩＳＣＯＭＳ）とともに配合することができる
。ワクチン組成物は、免疫学上有効量の本発明のポリペプチド、ならびに他のい
ずれかの前記成分を含む。「免疫学上有効量」とは、個人に対する単一用量であ
るいは連続の一部としての予防または治療に有効な量の投与を意味する。この量
は、治療される個人の健康状態および身体状態、治療される個人の分類学上の群
（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、個人の免疫システムの有効な免疫
応答を起こす能力、所望の防御の程度、ワクチン製剤、治療する医師の評価、感
染ＨＣＶの種類および他の適当な因子により変化する。この量は通常の試験によ
り決定できる比較的広範囲内である。通常、この量は、０．０１ないし１０００
μｇ／用量、特に０．１ないし１００μｇ／用量である。ワクチン組成物は通常
非経口的に、典型的には注射により、例えば皮下または筋肉内注射により投与さ
れる。他の投与方法について適当な更なる製剤は、経口製剤および坐剤を包含す
る。処方は、１回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールである。ワク
チンは他の免疫調節剤とともに投与することができる。ワクチンはさらに個人の
治療について有用であることが注目され、この場合、「治療用ワクチン」と称す
る。

【００２４】 さらに、本発明は、抗体を包含する分子を含有する組成物に関し、該分子は予
防接種に際し宿主自身により生成されるものであってもよく、ＨＣＶと前記のタ
ンパク質、または機能的に等価な変異体またはそのフラグメント間の結合を調節
するものである。「ＨＣＶおよび前記のようなタンパク質、機能的に等価な変異
体またはそのフラグメント間の結合を調節する分子」とは、前記のようなスクリ
ーニング法により得られるいずれかの分子を意味する。 加えて、ＨＣＶによる真核細胞の調節可能な感染は、真核細胞に対するＨＣＶ
の結合パラメータの研究に関する必要条件である。したがって、本発明は、豊富
化されたＨＣＶ粒子フラクションを用いるＨＣＶについての真核細胞のインビト
ロ感染法に関する。「インビトロ感染法」とは、細胞培養に基づいた分析系にお
いてウイルスの完全な複製サイクルを可能にするいずれかの方法を意味する。「
豊富化されたＨＣＶ粒子フラクション」とは、溶液中のＨＣＶ粒子であって、前
記ＨＣＶ粒子が非ＨＣＶ分子から分離されているものである。「豊富化された」
とは、前記ＨＣＶ粒子と前記非ＨＣＶ粒子の比がもとのサンプルと比較して、係
数１０、より好ましくは２０、より好ましくは５０、さらに好ましくは１００、
さらに好ましくは５００、さらに好ましくは１０³、最も好ましくは１０⁴増加し
ていることを意味する。「ＨＣＶ粒子」とは、少なくともＨＣＶ ＲＮＡおよび
／またはタンパク質を含むいずれかの複合体を意味し、前記複合体は真核細胞を
感染させることができる。 より詳細には、本発明は精製されたＨＣＶ粒子フラクションが前記ＨＣＶ粒子
を含有する溶液の超遠心により得られるインビトロ感染法に関する。「溶液の超
遠心」とは、当業界で公知で、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）に記載
されているような、スクロースなどの糖または塩化セシウム、塩化ナトリウムな
どの塩のクッションを通して溶液を遠心し、密度勾配遠心を平衡化させ、密度勾
配が確立され、前記ＨＣＶ粒子が遠心手段により等しい密度のフラクションへ移
動させられるか、または密度遠心により、前記ＨＣＶ粒子がその密度のためにペ
レット化されることを意味する。より詳細には、本発明は、前記のような体液が
ＨＣＶ粒子の起源として用いられるインビトロ感染法に関する。より詳細には、
本発明はＤａｕｄｉ、Ｍｏｌｔ、ＨｅｐＧ２、またはいずれかのＢ−、Ｔ−、マ
クロファージ、肝細胞または肝癌細胞のインビトロ感染法に関する。一般に、「
細胞」とは、ＨＣＶ粒子、ＨＣＶ関連粒子、たとえばＨＢＶ、ＧＢＶ−Ａ、また
はＧＢＶ−Ｂによる感染を許容するいずれかの細胞、細胞型、細胞系を意味する
。「Ｄａｕｄｉ細胞」とは、ＨＣＶ粒子による感染を許容する真核細胞を意味す
る（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）。より詳細には、本発明は、精製されたＨＣＶ粒
子フラクションがそのＥ１および／またはＥ２タンパク質、またはＥ１および／
またはＥ２に対する抗体、またはＬＤＬ、またはアポリポタンパク質Ｂの含量に
ついて特徴付けられる前記のようなインビトロ感染法に関する。「その含量につ
いて特徴づけられる」とは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＰＣＲ、インビトロ感染検定
、Ａｍｐｌｉｃｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）、またはい
ずれかの他の競合的ＰＣＲ、分枝ＤＮＡ（Ｃｈｉｒｏｎ）および本発明の実施例
の項に既裁されているような当業者に公知の前記ＨＣＶ粒子フラクションの量お
よび／または質を測定するいずれかの方法を意味する。本発明はさらに、ＨＣＶ
と真核細胞間の結合を調節するかまたはＨＣＶおよび関連ウイルスの複製のいず
れかの他の段階を干渉する分子をスクリーニングするために用いられる前記のよ
うなインビトロ感染法に関する。

【００２５】 加えて、本発明は、前記のような豊富化されたＨＣＶ粒子を含むＨＣＶへの暴
露またはＨＣＶによる感染を診断するための、前記のような宿主細胞を感染させ
、前記のような感染の数を測定する前記のようなインビトロ感染法の使用に関す
る。 加えて、本発明は、前記配列がアネキシンＶ、チューブリンおよび／またはア
ポリポタンパク質Ｂと結合する、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１ないし６（表４）により
定義される単離されたＨＣＶのＥ１および／またはＥ２ペプチドまたはそのいず
れかのフラグメントを提供することに関する。 最後に、本発明を特に有利な態様を記載する以下の実施例を参照して説明する
。しかしながら、これらの態様は例示的なものであり、本発明をなんら制限する
ものではないことに注意しなければならない。

【００２６】

【実施例】

実施例１：インビトロ感染および接種物の特徴付け ＨＣＶの複製機構において、第一段階の一つは、ウイルスの宿主細胞への侵入
である。この侵入は、精製された接種材料を用いるが、Ｔ細胞の接種に際するＨ
ＣＶの存在および分泌をモニターすることにより研究した。 感染について２つの接種物を２人の異なるドナー血清からスクロースクッショ
ンを通した沈降遠心により調製した。したがって、ＨＣＶ−陽性血液ドナーから
得られた血清の数を、ＨＣＶ−ＲＮＡについてＰＣＲ、エンベロープ抗体価およ
び遺伝子型１ｂ（これらの実験に用いたすべての組換えタンパク質、ペプチドお
よびモノクローナル抗体は１ｂ配列由来であるか、１ｂ配列指向であるので、こ
れにより比較研究を行うことができる）によりスクリーンした。高いＲＮＡ価お
よび低い抗体価を有する遺伝子型１ｂ由来の２種の血清を接種物調製のために保
持した。これらの血清に適用される精製は以下のプロトコルにしたがって血清成
分の大部分をスクロースクッションを通した超遠心によりペレット化されたウイ
ルスからおおまかに分離する：ＨＣＶ粒子を含有するヒト血清または血漿を５体
積のＴＥＮ（ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ８．０、ｍＭ ＥＤＴＡ、ｍＭ ＮａＣｌ）
を添加することにより希釈し、３４ｍｌの希釈された血清または血漿をＳＷ２７
ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中超遠心に適したポリアロマーチューブ（polyallo
mer tube）に入れた。２ｍｌのＴＥＮ ｐＨ８．０中２０％スクロースを慎重に
希釈された血清の下にピペットで移した。超遠心条件は、２８０００ｒｐｍで５
．５時間４℃でＳＷ２７ローター中で行った。遠心後、スクロースクッションを
含む上清を捨て、４００μｌの氷冷ＴＥＮ ｐＨ８．０をＨＣＶ−豊富化ペレッ
トに添加し、これを放置して一夜４℃で穏やかに溶解させた。溶解したペレット
をプールし、１５０μｌのアリコートに分割し、−７０℃で保存し、競合的ＰＣ
ＲによりＨＣＶ ＲＮＡ、抗−エンベロープ（Ｅ１およびＥ２）イムノグロブリ
ン、Ｅ１／Ｅ１タンパク質およびＬＤＬ含量について定量的に分析した。 ＬＤＬの含量は、市販の抗体をベースにしたサンドウィッチＥＬＩＳＡを用い
て測定した。モノクローナル２Ｂ４（Ｃａｐｐｅｌ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎ
ｉｋａ、Ｔｕｒｎｈｏｕｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を捕捉抗体として用い、ヤギ−抗
−ヒトＬＤＬポリクローナル血清（Ｓｉｇｍａ）を検出用に用いた。精製された
ヒトＬＤＬ（Ｃａｐｐｅｌ）を定量標準として用いた。 抗−Ｅ１／Ｅ２価をＥＬＩＳＡにより測定した。Ｅ１およびＥ２をマイクロタ
イタープレートに吸着させ、連続希釈のサンプルとともにインキュベートした後
、結合したＩｇＧをペルオキシダーゼで標識したウサギ−抗−ヒトＩｇＧ／Ｆｃ
（Ｄａｋｏ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）により検出した。 Ｅ１／Ｅ２タンパク質それ自身は、接種調製物の連続希釈をマイクロタイター
プレートに吸着させ、社内のＥ１およびＥ２に対するモノクローナル抗体混合物
（すなわち、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎ．Ｖ．、Ｇｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ
で本発明者らより入手できるもの）を用いてエンベロープタンパク質を検出する
ことにより測定した。ペルオキシダーゼで標識したヤギ−抗−マウスＩｇＧ／Ｆ
ｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて可視化を行った（結果は図１参照）。 ＰＣＲ力価をサンプルの連続希釈で測定した。より詳細には、Ｓｔｕｙｖｅｒ
ら（１９９６）により記載されているようなＨＣＶの５’ＵＴＲの増幅にＲＴ−
ＰＣＲを用いた。遺伝子型をＩＮＮＯ−Ｌｉｐａ ＨＣＶ ＩＩ（Ｉｎｎｏｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、Ｇｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて測定した。 接種物をさらにインビトロ感染分析により特徴づけた。したがって、細胞を感
染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１０で感染させた。異なる接種物を比較できるよう
にするために固定されたｍ．ｏ．ｉ．を用いた。ｍ．ｏ．ｉ．１０を得るために
必要な接種物の量を、１ＰＣＲ単位が１００ＲＮＡ分子（＝１００ＨＣＶビリオ
ン）に等しいという仮定に基づいて計算した。この感染実験を、すでにＨＣＶ感
染に対して許容性であることが報告されている（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）
Ｄａｕｄｉ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）を用いて行った。この感染は、以
下のプロトコルにしたがって行った：１）５．１０⁵細胞を血清を含まないＲＰ ＭＩ培地中に１０⁶細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ；２）接種物を添加してｍ．ｏ ．ｉ．１０を得；３）血清を含まないＲＩＰＭＩ培地を添加して、合計体積を１
ｍｌにし；４）感染物を３７℃で１６時間インキュベートし；５）細胞を血清を
含有するＲＰＭＩ培地で３回洗浄し；６）細胞を懸濁させ、細胞を９６ウェルプ
レート（１ウェルあたり２００μｌの体積で５＊１０⁴個の細胞）に接種し；７ ）細胞および上清を毎日採取し（＝１つのウェルを完全に収穫する）；８）細胞
培養物を必要なら分割する。上清および細胞の両方におけるウイルスの存在を前
記のようにＰＣＲにより測定した。 表１は半精製接種物（血清４２および４６、「後」で表す）中のＬＤＬおよび
Ｅ１／Ｅ２に対する抗体の両方の存在が、それらが由来する血清（血清４２およ
び４６、「前」で表す）と比較して２００−２０００倍減少したことを示す。最
終抗体含量、ＬＤＬ含量およびＰＣＲ力価は両方の接種物について類似していた
。Ｅ１／Ｅ２タンパク質の存在は、接種物４６においてのみ検出可能であった。
表２は、感染に同じ量のＨＣＶ−ＲＮＡを用いたが、検出可能な量のＥ１／Ｅ２
タンパク質を含む接種物（接種物４６）のみが検出可能な子孫ウイルスを産生す
ることを示す（すなわち、ＨＣＶ−ＲＮＡが検出できた）。接種物４６について
１０ないし１２日の期間中ＨＣＶ−ＲＮＡを細胞および培地の両方において検出
できた。一方、接種物４２は、感染後のはじめの４日間一過性の弱い（ネステッ
ドＰＣＲのみ陽性）シグナルを産生しただけであった。 これらのデータから、高いＲＮＡ価は多量の感染性ウイルスを反映するとは限
らないと結論づけることができる。検出可能な量のＥ１／Ｅ２タンパク質を含有
する接種物の調製は、宿主細胞の感染を得るために極めて重要である。後者の観
察は、ＨＣＶのウイルス侵入は、Ｅ１および／またはＥ２により媒介され、これ
らのタンパク質は宿主の細胞膜と直接相互作用しうることを示す。しかしながら
、接種物はＬＤＬを含まないわけではないので、ウイルスの取り込みはＬＤＬに
より媒介されることは除外できない。

【００２７】 実施例２：Ｅ１またはＥ２のＬＤＬとの相互作用 本発明者らは、組換えＥ１およびＥ２（末端切断タンパク質として哺乳動物細
胞中で発現され、産生された：Ｅ１のａａ１９２−３２６およびＥ２のａａ３８
４−６７３、Ｍａｅｒｔｅｎｓら（１９９４）およびｄｅ Ｍａｒｔｙｎｏｆｆ
ら（１９９６）に記載）の固体ＬＤＬに対する結合を測定した。ＬＤＬ（Ｃａｐ
ｐｅｌ）をマイクロタイタープレートに吸着させ、エンベロープタンパク質の結
合をビオチニル化タンパク質（ Ｅ１に加えて、推定内部疎水性領域が欠失した Ｅ２誘導体を試験した：ａａ２６３−２８８の欠失を有するＥ１ｓΔｂａｍ＝ａ
ａ１９２−３４０）。結合をペルオキシダーゼで標識したストレプトアビジンを
用いて検出する。 図２ＡはＥ１およびＥ１ｓΔｂａｍのみが濃度に依存し、可飽和的にＬＤＬと結
合することを示す。後者の結合はＥ１遺伝子型と関係ない（１ｂ、５および５型
を試験、データは記載していない）。さらにこの相互作用を特質化するために、
本発明者らはＬＤＬの主なタンパク質成分、すなわち、アポリポタンパク質Ｂの
Ｅ１に対する結合を測定した。図２ＢはＬＤＬ（前記参照）と同様に、Ｅ１およ
びＥ１ｓΔｂａｍのみがアポリポタンパク質Ｂ（これもＣａｐｐｅｌより購入）
と濃度に依存し、可飽和的に結合することを示す。以外にも、ＬＤＬおよびアポ
リポタンパク質Ｂとの結合実験においてＥ1について観察される結合曲線はほと んど同じである。このことは、Ｅ１のＬＤＬとの相互作用はアポリポタンパク質
Ｂによってのみ媒介され、ＬＤＬ中に存在するいずれかの脂質または他のタンパ
ク質成分でないことを証明する。この知見からＥ１の推定内部疎水性領域はＬＤ
Ｌとの結合に関与しないことがわかり、ＬＤＬとの相互作用は、脂質結合などの
疎水性会合に基づかないこともわかっている。 Ｅ１のアポリポタンパク質Ｂとの相互作用はＬＤＬ−受容体を介してのウイル
スの侵入に寄与するが、本発明者らの現在の成果から、Ａｇｎｅｌｌｏら（１９
９７）により主張されているように、これはＥ１のＬＤＬ受容体との直接結合に
関与しないことがわかる。一方、ＨＣＶのＥ１を介してのＬＤＬとの結合の結果
、ウイルス粒子が免疫攻撃から保護される。この結合におけるいずれかの干渉は
、ウイルスの生活環に影響し、病気の治療に用いることができる。

【００２８】 実施例３：Ｅ１およびＥ２の細胞との結合 ワクシニアウイルスによる真核細胞発現を用いて組換えＥ１およびＥ２タンパ
ク質を別々に産生した（ｄｅ Ｍａｒｔｙｎｏｆｆら、１９９６）。これらのタ
ンパク質の造血系起源からのいくつかのヒト細胞系との結合を示す（表３）。簡
潔に説明すると、５＊１０⁵細胞をビオチニル化Ｅ１またはＥ２（濃度範囲０− ２０μｇ）と４℃で結合させ、過剰のタンパク質を遠心により除去し、結合した
Ｅ１およびＥ２をＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンにより検出した。この
結合をフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦＡＣＳ
）で分析した。図３はこの結合がＥ１（ａ−ｅ）ならびにＥ２（ｆ−ｊ）の両方
に関して濃度依存性で、可飽和的であることを示す。表３は、このような結合は
ネズミ起源からのＢ−およびＴ−細胞についてはみられないので、結合が種特異
性であることを示す。

【００２９】 実施例４：細胞内Ｅ１およびＥ２結合タンパク質の同定 Ｄａｕｄｉ細胞から全細胞抽出物を調製した。簡潔に説明すると、細胞を１％
ＣＨＡＰＳ界面活性剤の存在下でＤｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて溶解させ
、細胞片を遠心により除去し、得られた上清をさらに細胞抽出物とする。 Ｅ１ またはＥ２結合タンパク質を捕捉するために抽出物をＥ１およびＥ２親和性カラ
ム上に親和性吸着させた。簡単に説明すると、これらのカラムを以下のようにし
て調製した：ストレプトアビジンを製造業者のプロトコル（Ｂｉｏｚｙｍ）にし
たがってアガロースミニ−リークと結合させ、その後、 Ｅ１またはＥ２をスト レプトアビジンと結合させる。細胞抽出物をカラムに通したのち、カラムをさら
に０．０５％ＣＨＡＰＳを用いて洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除
去した。結合したタンパク質の溶離を３段階溶離として行った。最初の溶離をｐ
Ｈ１１．５で行い、第二の溶離をｐＨ２．５で行い、溶離液は高ｐＨ（１１．５
）および強界面活性剤（１％Ｅｍｐｉｇｅｎ）と結合した。最後の溶離段階のみ
で、 Ｅ１およびＥ２の両方と結合する５５ｋＤａの単一のタンパク質を回収し た。最初のアルカリ溶離からのＳＤＳ−ＰＡＧＥから、タンパク質の全体の汚染
が回収されたのでこの段階が更なる洗浄として作用することが判明した。酸性溶
離はカラムからタンパク質を溶離できなかった（データは記載していない）。 １０⁹細胞からの１つに抽出物をＥ２カラムに通し、カラムを前記のように洗 浄し、溶離し、第３の溶離から得られたフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析
した。ゲルの染色をクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて行い、５
５ｋＤａバンドが出現した（図４）。７０ｋＤａに出現するさらなるバンドはＥ
２が結合しなかったカラムからも回収されたので（データは記載していない）、
非特異的結合タンパク質である。５５ｋＤａバンドはＣＢＢで可視化できたので
、このバンドは配列化に十分な物質を含有していたと考えられる。 ５５ｋＤａバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥから溶離させ、トリプシンで消化させ（
Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、得られたペプチドをＨＰＬＣ（Ｃ４ Ｖｙ
ｄａｃカラム、１．０×２５０ｍｍ）により分離した。配列化可能な物質を含有
するすべてのピークによりチューブリン−アルファまたはチューブリン−ベータ
が同定された。例として、チューブリン−アルファおよびチューブリン−ベータ
の同定に至った２つのピークの配列を以下に示す（チューブリン−アルファおよ
び−ベータ間の区別を可能にするアミノ酸に下線を施した）： ピーク６３ ＡＶＦＶＤＬＥＰＴＶＩＤＥ（チューブリン−アルファａａ６５
−７７と同定） チューブリン−アルファ ＡＶＦＶＤＬＥＰＴＶＩＤＥ チューブリン−ベータ ＡＶＬＶＤＬＥＧＴＭＤＳＶ ピーク５８ ＸＸＸＹＦＶＥＸＩＸＮＸＶ（チューブリン−アルファａａ３３
７−３４９と同定） チューブリン−ベータ ＮＳＳＹＦＶＥＷＩＰＮＮＶ チューブリン−アルファ ＲＴＩＱＦＶＤＷＣＰＴＧＦ 図５は、チューブリンに対する特異的モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用
いることにより、５５ｋＤａのＥ１結合タンパク質（第３の溶離から得る）がチ
ューブリンを含有することを確認した。さらに、この相互作用の特異性を免疫沈
降により確認した。２μｇのビオチニル化Ｅ１またはＥ２を１時間３７℃で５０
μｌのＴＢＳ_Mg.Ca＋０．０５％ ＣＨＰＡＳ（ ＴＢＳ_Mg.Caは：１０ｍＭ Ｔ ＲＩＳ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ₂、１ｍＭ ＭｇＣ ｌ₂、ｐＨ７．５である）中２μｇのチューブリンとともにインキュベートした 。５０μｌのＴＢＳ_Mg.Ca＋０．０５％ ＣＨＡＰＳ中のモノクローナル抗−α −チューブリンおよび抗−β−チューブリン（Ｓｉｇｍａ）の１／５００希釈液
を添加した（１時間、３７℃）。複合体を沈殿させるために、１００μｌのブロ
ックされた（０．０１％ＢＳＡ）タンパク質Ａガラスビーズ（ＢｉｏＰＲＯＣＥ
ＳＳＩＮＧ）を添加した（１時間、室温、混合）。ビーズをＴＢＳ_Mg.Ca ＋０．
０５％ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄後、結合した複合体を５０μｌのサンプル緩衝液
（３％ＳＤＳおよび１００ｍＭ ＤＴＴを含有）で９５℃、５分溶離させた。サ
ンプルをウェスタンブロットで分析し、アルカリホスファターゼで標識したスト
レプトアビジンによりＥ１またはＥ２を検出した。 ウェスタンブロット（図７）により、チューブリンの存在下でチューブリンに
対するモノクローナル抗体を用いた沈降の後のみでＥ１およびＥ２の明確な存在
が明らかになり、一方、対照実験（チューブリンの非存在下での沈降）では事実
上Ｅ１およびＥ２が存在しないことが判明した。

【００３０】 実施例５：Ｅ１またはＥ２のアネキシンとの相互作用 図６ＡおよびＢはアネキシンＶがＥ１およびＥ２の両方と結合することを示す
。図６はさらに、アネキシンＶのＥ１およびＥ２との相互作用はＥ１のアミノ酸
３０７−３２６（ペプチドＣ４Ｖ６、ただし、アミノ酸３２７−３４０は組換え
Ｅ１に含まれないので除外する）およびＥ２の４１３−４６７（ペプチドＣ１お
よびＣ２）にマップされた。相互作用部位はＥ１およびＥ２の比較的よく保存さ
れた領域で、したがってアネキシンＶのＥ１およびＥ２との相互作用は遺伝子型
１ｂに限定されず、他のＨＣＶ遺伝子型についても起こりうると結論できる。さ
らに、アネキシンＶは１３の公知のメンバーを含むアネキシン科のメンバーであ
るので、この科の他のメンバーもＨＣＶエンベロープタンパク質と相互作用する
ことができる。 図６に記載した実験を以下のようにして行った：ペプチドおよび組換えエンベ
ロープタンパク質の両方をビオチニル化し、ストレプトアビジンでコートしたマ
イクロタイタープレートに吸着させた。これらのプレートをさらにペルオキシダ
ーゼで標識したＡ−Ｖとともにインキュベートした。Ａ−Ｖのストレプトアビジ
ンとの結合をさし引き、残りの吸収をプロットした。 Ｅ１について、 Ｃ４Ｖ６
領域との結合は顕著で、Ｅ１自身について観察される結合に匹敵し、このペプチ
ドはＥ１と３０７−３２５の領域でのみ重複するので、 この領域はＥ１上のＡ −Ｖ結合部位を表すと考えられる。Ｅ２について、同様の結果が得られ、Ａ−Ｖ
の結合はペプチドＣ１およびＣ２について最も顕著であるので、これらのペプチ
ドがＡ−Ｖ結合中に含まれるＥ２の最も重要な領域を含むと考えられる。このよ
うなペプチド（以下に列挙）は、これらのペプチドにより誘発される抗体がウイ
ルスの生活環と直接相互作用するので有効なワクチン候補である。目的とするプ
ロセスをすべてのＨＣＶ遺伝子型のライフサイクルにおいて用いると仮定した場
合、これらはすべての遺伝子型と交差防御すると期待されるので、このような抗
体の誘発の結果、非常に有効なワクチンを得ることができる。 ペプチド アミノ酸領域 Ｖ１Ｖ２ １９２−２２６ Ｖ２Ｖ３ ２１２−２４４ Ｖ３Ｖ４ ２３０−２６３ Ｖ４Ｖ５ ２４０−２６３／２８８−３０３ Ｖ５Ｃ４ ２８８−３２７ Ｃ４Ｖ６ ３０７−３４０ Ｅ１ｓ １９２−３２５ ＨＶＲ Ｉ ３８４−４１５ ＨＶＲ１／Ｃ１ ３９５−４２８ Ｃ１ ４１３−４４７ Ｃ２ ４３０−４６７ ＨＶＲＩＩ ４６０−４８７ Ｃ３ ４８０−５１３ Ｃ４ ５００−５３０ １３／１７ ５２３−５６６ Ｃ５ ５６１−５９０ ２３／２７ ５７８−６２７ Ｃ６ ６２１−６４８ Ｃ７ ６４１−６７３ Ｅ２ｓ ３８４−６７３

【００３１】 文献一覧 Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecula
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【００３２】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はヒト血清４２および４６由来の精製された接種物におけるＥ１／Ｅ２タ
ンパク質の測定を示す。

【図２Ａおよび２Ｂ】 図２はマイクロタイタープレート上にコートされた固相ＬＤＬ（Ａ）またはア
ポリポタンパク質Ｂ１００（Ｂ）に対するエンベロープタンパク質Ｅ１．Ｅ１Δ
ｂａｍおよびＥ２の結合を示す。ビオチニル化エンベロープタンパク質の結合は
、ストレプトアビジンペルオキシダーゼにより検出された。

【図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅおよび３Ｆ】 図３はＥ１およびビオチニル化Ｅ２のＤａｕｄｉ細胞に対する結合の濃度依存
性を示す。結合は、ストレプトアビジンＦＩＴＣを用いてＦＡＣＳ分析により評
価した。図ａないしｅはＥ１の結合を示し、図ｆないしｊはＥ２の結合を示す。
各図面に関して、対照実験（エンベロープタンパク質が存在しない）の結果を細
い線と陰影を施した部分で表す。図ａおよびｆ、ｂおよびｇ、ｃおよびｈ、ｄお
よびＩ、ｅおよびｊはそれぞれ１、２、５、１０および２０μｇのＥ１またはＥ
２の結合を示す（太線で陰影なし）。

【図４】 図４は、タンパク質からのＳＤＳ−ＰＡＧＥはＤａｕｄｉ細胞の全溶解物が結
合するＥ２親和性カラムからの第三の溶離（アルカリ／界面活性剤）段階を溶出
することを示す。レーン１および３は分子量マーカー（上から下へ、１１３、６
７、４５、２９、１８、１２ｋＤａ）を表し、レーン２は溶出された物質を示す
。５５ｋＤａ（Ｅ２またはＥ１親和性カラムのみについて特異的）および７０ｋ
Ｄａ（Ｅ１またはＥ２なしでも親和性カラムから回収されるので特異的でない）
に注目。

【図５】 図５はチューブリンに対して特異的なモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いたウェスタ
ンブロットを示す。レーン１；チューブリン標準（Ｓｉｇｍａ）；レーン２およ
び５：分子量マーカー；レーン３：Ｅ１カラムからの溶離液；レーン４：Ｅ２カ
ラムからの溶離液。

【図６Ａおよび６Ｂ】 図６は、すべてビオチニル化され、ストレプトアビジンでコートされたマイク
ロタイタープレートに吸着された、アネキシンＶ（ペルオキシダーゼで標識）、
Ｅ１、Ｅ２、およびＥ１またはＥ２由来のペプチド（それぞれ６Ａおよび６Ｂ）
との結合を示す。

【図７】 図７はＥ１／チューブリン（右；レーン１：抗−チューブリンでのＥ１／チュ
ーブリン複合体の免疫沈降；レーン２：マーカー（１７５、８３、６２、４７、
３２）、レーン３（負の対照レーン）：チューブリンを添加しない抗−チューブ
リンを用いたＥ１沈降；レーン４：１００ｎｇの精製されたＥ１を含有する正の
対照レーン）、およびＥ２／チューブリン（左；レーン１：抗−チューブリンで
のＥ２／チューブリン複合体の免疫沈降；レーン２：マーカー（１７５、８３、
６２、４７、３２）、レーン３（負の対照レーン）：チューブリンを添加しない
抗チューブリンを用いたＥ２沈降、レーン４：１００ｎｇのＥ２マーカーを含有
する正の対照）の免疫沈降実験のウェスタンブロット分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/775 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/576 Ｚ 33/576 Ａ６１Ｋ 39/29 // Ａ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｌ 2/16 Ｚ Ａ６１Ｌ 2/16 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AA96X BB19 BB34 BD13 CA24 CA25 CA45 4C058 AA30 BB07 JJ01 JJ08 4C084 AA02 BA44 CA18 NA14 ZB332 4C085 AA03 AA08 BA92 CC21 EE01 GG03 GG04 GG08 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA01 EA20 EA31 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＣＶ感染を治療するための組成物の調製、または ＨＣＶ感染の診断法、または ＨＣＶタンパク質の精製法、または 細胞培養におけるＨＣＶの増殖法に用いられる、アネキシンＶ、チューブリンお
   よびアポリポタンパク質Ｂからなる群から選択されるヒトタンパク質の使用。
2. 【請求項２】 前記タンパク質がアネキシンＶ、チューブリンまたはアポリ
   ポタンパク質Ｂの機能的に等価な変異体またはフラグメントである請求項１記載
   のヒトタンパク質。
3. 【請求項３】 前記タンパク質がＨＣＶと結合する請求項１ないし２のいず
   れかに記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 前記アネキシンＶ、チューブリンまたはアポリポタンパク質
   Ｂ、またはその機能的に等価な変異体またはフラグメントがＨＣＶのエンベロー
   プタンパク質Ｅ１および／またはＥ２と結合する請求項１ないし３のいずれかに
   記載のタンパク質。
5. 【請求項５】 前記チューブリン、またはその機能的に等価な変異体または
   フラグメントがＥ１のアミノ酸１９２−３２６と結合する請求項１ないし４のい
   ずれかに記載のタンパク質。
6. 【請求項６】 前記チューブリン、またはその機能的に等価な変異体または
   フラグメントがＥ２のアミノ酸３８４−６７３と結合する請求項１ないし４のい
   ずれかに記載のタンパク質。
7. 【請求項７】 前記アネキシンＶ、またはその機能的に等価な変異体または
   フラグメントがＥ１のアミノ酸３０７−３２６と結合する請求項１ないし４のい
   ずれかに記載のタンパク質。
8. 【請求項８】 前記アネキシンＶ、またはその機能的に等価な変異体または
   フラグメントがＥ２のアミノ酸４１３−４６７と結合する請求項１ないし４のい
   ずれかに記載のタンパク質。
9. 【請求項９】 前記アポリポタンパク質Ｂ、またはその機能的に等価な変異
   体またはフラグメントがＥ１のアミノ酸１９２−２６３と結合する請求項１ない
   し４のいずれかに記載のタンパク質。
10. 【請求項１０】 前記アポリポタンパク質Ｂ、またはその機能的に等価な変
    異体またはフラグメントがＥ１のアミノ酸２８８−３２６と結合する請求項１な
    いし４のいずれかに記載のタンパク質。
11. 【請求項１１】 ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２タンパク質フラグメン ト、またはその機能的に等価な変異体と担体とを含んでなり、前記タンパク質フ
    ラグメントが請求項１ないし１０のいずれかに記載の宿主タンパク質についての
    結合領域を含む、 ＨＣＶ感染の治療に用いられる組成物。
12. 【請求項１２】 請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質と担体
    とを含んでなる、ＨＣＶ感染の治療に用いられる組成物。
13. 【請求項１３】 体液サンプル中のＨＣＶを請求項１ないし１０のいずれか
    に記載のタンパク質と接触させ、ついで、 体液サンプル中のＨＣＶの請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質と
    の結合を測定すること を含む、ＨＣＶへの暴露またはＨＣＶによる感染の診断法。
14. 【請求項１４】 ＨＣＶエンベロープタンパク質を請求項１ないし１０のい
    ずれかに記載のタンパク質と接触させ、ついで、 請求項１ないし１０のいずれかに記載の前記タンパク質と結合する組成物の部分
    を単離すること を含む、ＨＣＶエンベロープタンパク質の精製法。
15. 【請求項１５】 固体支持体、 請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質、および 体液サンプル中のＨＣＶと請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質の
    間に形成された複合体の測定を可能にする適当なマーカーを含むＨＣＶの存在を
    検出するための分析キット。
16. 【請求項１６】 請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質を過剰
    に産生する細胞を提供し、 細胞をＨＣＶで感染させ、ついで、 感染した細胞を培養すること を含む、細胞培地中でＨＣＶを増殖させる方法。
17. 【請求項１７】 血漿、血清、または他の生物学的液体中のＨＣＶの存在を
    減少または除去する方法であって、 前記生物学的液体を請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質と接触さ
    せ、ついで、 前記生物学的液体を請求項１ないし１０のいずれかに記載の前記タンパク質から
    分離すること を含む方法。
18. 【請求項１８】 血漿、血清、または他の生物学的液体中の抗−ＨＣＶ抗体
    を測定する方法であって、 請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク質との結合のために生物学的液
    体中の抗体と既知量のＨＣＶエンベロープタンパク質を競合的に結合させ、つい
    で、 結合したＨＣＶエンベロープタンパク質の量を測定すること を含む方法。
19. 【請求項１９】 ＨＣＶと請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパク
    質間の結合を調節する分子のスクリーニング法。
20. 【請求項２０】 ＨＣＶと請求項１ないし１０のいずれかに記載のタンパ ク質間の結合を調節する分子を含む組成物。
21. 【請求項２１】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションを用いることにより
    特徴付けられるＨＣＶについての真核細胞のインビトロ感染法。
22. 【請求項２２】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションが、前記ＨＣＶ粒子
    を含有する溶液の超遠心により得られる請求項２１記載のインビトロ感染法。
23. 【請求項２３】 前記溶液が体液である請求項２２記載のインビトロ感染法
    。
24. 【請求項２４】 真核細胞が、Ｄａｕｄｉ、Ｍｏｌｔ、ＨｅｐＧ２、または
    いずれかのＢ−、Ｔ−、マクロファージ、肝細胞または肝癌細胞である請求項２
    １ないし２３のいずれかに記載のインビトロ感染法。
25. 【請求項２５】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションがＥ１および／また
    はＥ２タンパク質について特徴付けられる請求項２１ないし２３のいずれかに記
    載のインビトロ感染法。
26. 【請求項２６】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションがＥ１および／ま たはＥ２に対する抗体の含量について特徴付けられる請求項２１ないし２３のい
    ずれかに記載のインビトロ感染法。
27. 【請求項２７】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションがＬＤＬの含量に ついて特徴付けられる請求項２１ないし２３のいずれかに記載のインビトロ感染
    法。
28. 【請求項２８】 豊富化されたＨＣＶ粒子フラクションがアポリポタンパ ク質Ｂの含量について特徴付けられる請求項２１ないし２３のいずれかに記載の
    インビトロ感染法。
29. 【請求項２９】 ＨＣＶと真核細胞間の結合を調節する分子についてのスク
    リーニングのための、請求項２１ないし２３のいずれかに記載のインビトロ感染
    法の使用。
30. 【請求項３０】 請求項２１ないし２８のいずれかに記載のＨＣＶ粒子を豊
    富化し、 請求項２１ないし２８のいずれかに記載の宿主細胞を感染させ、ついで、 感染の多重度を測定すること を含む、ＨＣＶへの暴露またはＨＣＶによる感染を診断するための、請求項２１
    ないし２３のいずれかに記載のインビトロ感染法の使用。
31. 【請求項３１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１、２、３、またはそのいずれかのフ
    ラグメントとして定義され、前記配列がアネキシンＶ、チューブリンおよび／ま
    たはアポリポタンパク質Ｂと結合する単離されたＥ１ペプチド。
32. 【請求項３２】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ４、５、６、またはそのいずれかのフ
    ラグメントとして定義され、前記配列がアネキシンＶ、チューブリンおよび／ま
    たはアポリポタンパク質Ｂと結合する単離されたＥ２ペプチド。