JP2001518309A

JP2001518309A - 甲状腺刺激抗体の生物検定

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Publication number: JP2001518309A
Application number: JP2000513971A
Authority: JP
Inventors: ルドゲイト，マリアン，エリザベス
Original assignee: ユニヴァーシティオヴウェールズカレッジオヴメディスン
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-09-29
Publication date: 2001-10-16
Also published as: AU9356398A; EP1019537A1; WO1999016902A1; US6984520B1; ES2317671T3; DE69840268D1; ATE415487T1; GB9720693D0; EP1019537B1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＴＳＨの存在下または非存在下で、ＴＳＨ‐Ｒ自己抗体またはＴＳＨを簡便に検定する方法を提供する。この方法で使用するキット、レポーターカセット、および生物材料をも提供する。【解決手段】ＴＳＨ−Ｒ自己抗体またはＴＳＨの検定方法であって、ＴＳＨの存在下または非存在下で、レポーターカセットに感染したヒトＴＳＨ−Ｒを発現するクローンからの細胞と試験試料を接触させ、前記レポーターカセットが、（ｉ）対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき、測定可能な応答を生じうる反応物たとえば酵素と、（ｉｉ）サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答要素（ＣＲＥ）を含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを含み、ｃＡＭＰ濃度が反応物の発現によって変動するステップを含むことを特徴とする検定方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、甲状腺刺激ホルモン受容体に対する抗体を測定する検定、そのため
の検定キット、および、特にａ−ルシフェラーゼｃＤＮＡに感染した細胞株の検
定におけるその使用に関する。

【０００２】甲状腺刺激ホルモン受容体（以下、‘ＴＳＨ−Ｒ’と略記する）は、甲状腺細
胞の機能と増殖との両方を制御することが知られており、また、甲状腺刺激ホル
モン（ＴＳＨ）によって刺激される。ＴＳＨ−ＲはまたＴＳＨの受容体への結合
を抑制する自己抗体に対する標的である。これらの自己抗体は、ＴＳＨの作用を
抑制する（ＴＢＡｂ）（すなわち、低刺激薬または抑制物質として作用するＴＳ
Ｈ拮抗物質）か、または、ＴＳＨに対する作用物質として作用することにより甲
状腺（ＴＳＡｂ）を刺激（過剰刺激）する。

【０００３】ＴＳＡｂによる刺激はグレーヴズ病（ＧＤ）において作用する機構であると考
えられており、またＴＢＡｂによる抑制は内因性粘液水腫における場合であると
考えられている。甲状腺機能亢進グレーヴズ病の患者はＴＳＨの作用を模擬し、
アデニルシクラーゼの慢性的な刺激をもたらす抗体を生成させ、一方、内因性粘
液水腫の患者の一部における自己抗体もＴＳＨ−Ｒに結合することができるが、
それにも関わらず、これは細胞内サイクリックアデノシン3'、５‘−モノリン酸
（ｃＡＭＰ）の増大をもたらさない。

【０００４】ＴＳＨ−Ｒ自己抗体を測定するために多くの検定法が開発されている。もっと
も広く使用されているのは放射線受容体検定であり、この方法では、ウシの¹²⁵ Ｉ−ＴＳＨの界面活性剤可溶化ブタＴＳＨ−Ｒへの結合がＴＳＨ−Ｒ自己抗体の
保持が疑われる患者からの免疫グロブリンまたは血清によって抑制される。この
検定法における主要な問題はヒトのものでない抗原を使用するということであり
、また結合を測定するモノであって生物活性を測定するものでなく、したがって
ＴＳＡｂとＴＢＡｂとが区別できないということである。

【０００５】明らかに刺激と抑制とを区別できるのが望ましく、したがってＴＳＨ（または
そのＴＢＡｂによる抑制）またはＴＳＡｂの効果たとえばｃＡＭＰの増大を測定
する生物検定法の開発の試みがいくつかなされた。この検定は甲状腺切片または
甲状腺細胞の培養によって実施することができ、グレーヴズ病患者が陽性である
ときの最大百分率として定義される最大感度は検定を低浸透圧（塩化ナトリウム
を含まない）培地中で行う場合に実現される。放射線受容体検定も生物検定も生
物学的試料の利用可能度が小さいことによる障害がある。これを克服するために
ネズミの甲状腺細胞株（ＦＲＴＬ−５）が開発されたが、この場合には種の違い
が問題になりうる。ＴＳＨ−Ｒの最近のクローン化と配列決定とにより、組換え
で作られるヒトＴＳＨ−Ｒに無制限でアクセスできるようになった。

【０００６】Ｌｉｂｅｒｔらが、Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５（３）１２５０−１２５５（１９８９）で述べているように［本明細書におけ
る引用は、すべての記載事項およびそれらの文献の引用文献を本明細書に組み込
むものとする］、イヌの甲状腺刺激ホルモン受容体の以前行われたクローン化に
より、ヒトＴＳＨ−ＲのｃＤＮＡクローンの分離によるヒトＴＳＨ−Ｒの分子特
性の決定、コード化ポリペプチドの一次構造の解析、および、組換え分子がグレ
ーヴズ病および特発性粘液水腫の患者に見られる自己抗体に結合するという証明
を得ることへの道が開かれた。イヌのＴＳＨ−ＲのｃＤＮＡ（２．８ｋｂ断片）
がヒトの甲状腺ＤＮＡライブラリーを混成するのに使用された。得られるクロー
ンの配列決定により、イヌのＴＳＨ−Ｒと９０．３％の類似性を有する７４４の
アミノ酸ポリペプチドをコード化する２２９２のヌクレオチド残基オープンリー
ディングフレームが得られた。ＣＯＳ−７細胞のｐＳＶＬベクターへのコード化
配列のトランスフェクションにより、蛋白質がＴＳＨに特異的に結合する能力が
確認できた。

【０００７】ヒトＴＳＨ−Ｒのコード化領域を含むｐＳＶＬベクターのモンゴルキヌゲネズ
ミ（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ）の卵巣（ＣＨＯ）細胞への同時トランス
フェクションにより、ｃＡＭＰ蓄積によりＴＳＨまたはＴＳＡｂに特に応答する
細胞株が選択された（Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ
．１７１（３）１０４４−１０５０（１９９０）においてＰｅｒｒｅｔらにより
、報告されている）。ＴＳＨ媒介ｃＡＭＰ蓄積に対する用量反応曲線がクローン
ＪＰ１４、ＪＰ２６およびＪＰ２８に関して報告されており、細胞あたりの受容
体の数はクローンＪＰ１４およびＪＰ０９で最大であることがわかっている。

【０００８】この研究により、自己抗体のみの存在下（ＴＳＡｂ）またはＴＳＨ（ＴＢＡｂ
）の存在下で、ヒトＴＳＨ−Ｒを安定的に感染させたＣＨＯ細胞においてｃＡＭ
Ｐの産生を測定する生物検定の可能性が生じた（Ｌｕｄｇａｔｅら、Ｍｏｌｅｃ
．＆Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．７３Ｒ１３−Ｒ１８）。しかし、そのような検定は日常業務で使用するのに十分なほど簡便でない。何故なら、検定の実
施に数日を要し、特にＲＩＡによって生成されるｃＡＭＰの最終検出という点で
は特にそうであり、また組織培養設備が必要であるからである。

【０００９】したがって、本発明はＴＳＨ−Ｒ自己抗体またはＴＳＨの検定方法であって、
（ａ）ＴＳＨの存在下または非存在下で、試験試料をレポーターカセットに感染
したヒトＴＳＨ−Ｒを発現するクローンからの細胞と接触させ、前記レポーター
カセットは対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき測定可能な応答を生じう
る反応物たとえば酵素とサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答要素（ＣＲＥ）を
含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを包含し、その際、ｃＡＭＰ濃度が反応物
の発現によって変動する。のステップを含むことを特徴とする検定方法を提供する。

【００１０】この検定方法は、好ましくは、さらに、（ｂ）前記のように接触させられる細胞に、対応する基質を加える。のステップを含む。

【００１１】この検定方法は、より好ましくは、さらに、（ｃ）基質にさらされる細胞における応答を測定し、（ｄ）試験ステップ（ｃ）からの応答を、ステップ（ａ）から（ｃ）が実施され
た標準または正常試料からの応答と比較する。のステップを含む。

【００１２】したがって、本発明は特にＴＳＨ−Ｒ自己抗体またはＴＳＨの検定方法を提供
するものであって、（ａ）試験試料を、レポーターカセットに安定感染したヒトＴＳＨ−Ｒを発現す
るクローンからの細胞と接触させ、前記レポーターカセットが対応する基質に接
触したとき測定可能な応答を生じうる反応物とｃＡＭＰ応答要素を含むプロモー
ターとの両方のｃＤＮＡを包含し、その際、ｃＡＭＰ濃度が反応物の発現によっ
て変動し、（ｂ）前記のように接触させられる細胞に、対応する基質を加え、（ｃ）基質にさらされる細胞における応答を測定し、（ｄ）試験ステップ（ｃ）からの応答を、ステップ（ａ）から（ｃ）が実施され
た標準または正常試料からの応答と比較すること、次のステップを含む検定方法を提供する。

【００１３】本発明の検定方法においては、一つまたはそれ以上のステップ、例えばここで
定義するステップ（ａ）〜（ｄ）において使用する反応物すべてを一緒に投入す
ることができる。ステップ（ａ）〜（ｄ）という発現は各ステップが順次に実施
されるかまたは検定における各成分が互いに個別に接触しなければならない、と
いうことのみを意味すると解釈してはならない。たとえば、ステップ（ａ）〜（
ｄ）の二つ以上を実質的に同時に実施することができ、かつ／または、使用する
すべての反応物を一つのステップで一緒に投入することができる。この検定方法
またはそのステップの任意の組合せは、手動操作の、部分自動化のまたは完全自
動化の手段によって実施することができる。

【００１４】適当なレポーターカセット（ステップ（ａ）に述べられている）は、酵素活性
により、色変化、蛍光発光変化または光放射を生じるようなものである。そのよ
うな酵素の例としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、β
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシ
ダーゼまたは緑色蛍光蛋白質が含まれる。

【００１５】レポーター遺伝子のサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）は、好ましくはあ
る数の縦列反復として、ＣＲＥ共通配列ＴＧＡＣＧＴＣＡを含む任意のプロモー
ター配列または合成オリゴヌクレオチドとすることができる。適当なプロモータ
ーは、Ｋａｙらが、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３４（２）５６８−５７３（１９９４）において述べている縦列ｃＡＭＰ応答要素を含む糖蛋白ホルモンア
ルファサブユニットに対するものである。もう一つの例は、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅ
ｅらがＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ５（１）１００−１０
９（１９９１）において述べているＣＡＴ酵素を駆動するカセットである。

【００１６】しかし、好ましくは、本発明による検定は、ステップ（ａ）においてはｃＡＭ
Ｐ応答要素を含むプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼｃＤＮＡの使
用、およびステップ（ｂ）においてはルシフェリンの使用を含む。このことは、
ステップ（ｃ）と（ｄ）において測定される応答がルシフェリン化細胞からの光
出力であるということを意味する。好ましくは、ルシフェラーゼはホタルルシフ
ェラーゼであるが、レニラルシフェラーゼ等も適当である。

【００１７】もっとも好ましくは、レポーターカセットはα−ルシフェラーゼであり、これ
は、前述のように、糖蛋白ホルモンαサブユニットに対するプロモーターによっ
て駆動されるルシフェラーゼｃＤＮＡである。たとえば、Ｍａｘｗｅｌｌらが、
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７２７６−８０（１９８９）において述べている
ように導入された糖蛋白ホルモンαサブユニットプロモーターを有するプラスミ
ドｐＡ３ｌｕｃを使用することができる。したがって、α−ルシフェラーゼはプ
ラスミドｐＡ３ｌｕｃ内の糖蛋白ホルモンαサブユニットプロモーターの５´側
面配列（ｆｌａｎｋｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ）の８４６の塩基対とエクソン１
の４４の塩基対である。あるいは、ＣＲＥ含有配列をたとえばＰｒｏｍｅｇａ社
のｐＧＥＭ−ｌｕｃベクターのような市販のルシフェラーゼレポーター系内にサ
ブクローン化することができる。さらなる代替法は、複数のプラスミド、たとえ
ばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社が販売している系（ＣＲＥＢレポーティング系Ｎｏ．
２１９０１０）におけるもの、の使用である。この系はｃＡＭＰの増大後にルシ
フェラーゼの応答を測定することを可能にするプラスミドを含む。あるいはＣＲ
Ｅとは異なる誘導プラスミドを含むことができる。

【００１８】上記の細胞は、上で引用したＰｅｒｒｅｔらが引用した文献に述べてあるよう
にして得ることができる。そのほかに、ヒトＴＳＨ−Ｒを真核生物細胞または細
胞株内へのトランスフェクション用にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎＶｉｔｒｏｇ
ｅｎ、その他が市販しているいずれの真核生物発現ベクター（ｐＳＶＬが一例）
内にもサブクローン化することができる。選択性のためにもっと最近開発された
同一のプラスミド内に抗生物質に耐性のある遺伝子を組み込んだ二重（ｄｕａｌ
）ベクターを使用することができ、プラスミドとしてはたとえばｐｃＤＮＡＩＩ
Ｉ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎが販売している）を用いることが出来る。あるいは、
選択のために分離プラスミドを使用することができる。

【００１９】この検定（ステップ（ａ））で使用する細胞は、好ましくは、前記文献でクロ
ーンＪＰ０９と特定され、細胞あたり１０⁵程度のヒトＴＳＨ−Ｒに安定感染した（すなわち、発現する）ものである。より好ましくは、これらの細胞は、α−
ルシフェラーゼｃＤＮＡとピューロマイシン耐性コード化プラスミドたとえばｐ
ＳＶ₂Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈが販売している）との両方に同時感染していて、ピューロマイシンによる検定細胞の選択を許容するようなものである。この場
合、生き残り細胞をＴＳＨに応答するルシフェラーゼ活性に関して試験する。あ
るいは、これらのプラスミドのいずれかで一時的に感染させた細胞を使用するこ
とができる。

【００２０】したがって、本発明は、たとえばＣＨＯ細胞内で発現されるヒトＴＳＨ−Ｒを
含む生物検定を提供するものであり、改良点は、ｃＡＭＰ用のＲＩＡの代わりに
ＣＲＥを含むプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子からの光出
力の測定を含む。そうすることにより、検定がより速くなり、血清を細胞に接触
させる時点から計算のためのデータを得る時点までの一日の勤務時間内にＴＳＡ
ｂの完全評価が可能になる。さらに、この検定は未分別の血清に関して実施する
ことができ、試料調整の必要がない。

【００２１】好ましくは、細胞は、凍結乾燥（フリーズドライ）するか、凍結するかまたは
ゲルに含まれるようにして個別容器に入れて提供するようにし、一回の検定あた
り一つの容器を使用する。あるいは、貯蔵のために細胞を凍結するかまたはゲル
（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ^TM）の中に取り込むことができる。

【００２２】非凍結乾燥細胞を使用すべき場合、使用中にウェル（ｗｅｌｌ）に接種する細
胞の数を補正する方法による検定を提供するために他の同時トランスフェクショ
ンを実施することができる。レニラルシフェラーゼカセットは、構成性であって
、ホタルルシフェラーゼとは異なる基質要件を有するので、そのような方法がと
られる。違いが細胞数の変化に反映されてもそれぞれのウェルから同じ値が得ら
れることが期待される。このトランスフェクションに適当なプラスミドはＰｒｏ
ｍｅｇａが販売しているレニラルシフェラーゼプラスミドＮｏ．Ｅ２２４１であ
る。これは、レニラルシフェラーゼから上流にヘルペスシンプレックスウイルス
チミジンキナーゼプロモーターを含み、以上のように構成的に発現される。

【００２３】さらに、凍結乾燥した細胞でなく未処理細胞を使用する場合には、細胞培地に
使用した血清中に存在するいかなるＴＳＨの存在によっても検定結果がゆがめら
れるのを防ぐために、血清は検定の約２４時間前に木炭ストリッピングにより除
去すべきである。

【００２４】さらに、ＲＩＡの場合と同様に、ＴＳＨの応答性は無塩（すなわち、ＮａＣｌ
を含まない）条件下で低下する。検定感度をさらに高めるために、たとえばホス
ホジエステラーゼインヒビターのような試薬を添加することができる。

【００２５】したがって、さらに、本発明は、対応する基質に接触したとき測定可能な応答
を生じうる反応物たとえば酵素とｃＡＭＰ応答要素を含むプロモーターとの両方
のｃＤＮＡを含むレポーターカセットを提供する。ｃＡＭＰの濃度が前記の基質
の発現によって変動し、特に反応物がルシフェラーゼである場合にはそうである
。

【００２６】したがって、本発明は、さらに、対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき
測定可能な応答を生じうる反応物たとえば酵素と、ＣＲＥを含むプロモーターと
の両方のｃＤＮＡを含むレポーターカセットに（好ましくは、安定して）感染し
たヒトＴＳＨ−Ｒを発現するクローンからの細胞；そのクローン；（好ましくは
、安定して）感染したヒトＴＳＨ−Ｒを発現するｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ；およ
び、対応する基質に接触したとき測定可能な応答を生じうる反応物たとえば酵素
とＣＲＥを含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを含むレポーターカセットに（
好ましくは、安定）感染したヒトＴＳＨ−Ｒを提供する。

【００２７】本発明による検定は、好ましくは、通常の医薬生化学研究室または病院の病理
学もしくは診断研究室で迅速かつ簡便に結果を得ることができるようにするキッ
トを用いる手段によって実施する。したがって、さらに、本発明は本発明の検定
特に生物発光検定を実施するためのキットを提供する。このキットは、（ａ）（ｉ）対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき測定可能な応答を生じ
うる反応物たとえば酵素と、（ｉｉ）ｃＡＭＰの濃度が反応物の発現によって変
動するｃＡＭＰ応答要素を含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを含むレポータ
ーカセットに感染したヒトＴＳＨ−Ｒを発現するクローンからの細胞；（ｂ）検定のための標準試料；（ｃ）細胞を培養および／または再構成する培地；及び（ｄ）本発明による検定を実施するための説明を含む。

【００２８】対応する蛋白質とそれに関連する反応物、および、応答測定を実施する手段を
も前記キットの一部として提供することができる。たとえば、前記のキットは、
さらに（ｅ）細胞溶解のための緩衝剤；および／または、（ｆ）レポーターカセットのための緩衝剤、好ましくは、ルシフェラーゼ緩衝剤
；および／または、（ｇ）緩衝剤中に対応する基質、好ましくは、蛋白質、より好ましくは、ルシフ
ェリン；および、選択的に照度計を含むことができる。

【００２９】あるいは、たとえば、この検定にルシフェラーゼ／ルシフェリンを使用する場
合、別のＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手できるものの一つのような市販のキットを使用することができる。これらの史上から入手できるキッ
トには、ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであるＮｏ．Ｅ１４８３、およ
び、レニラルシフェラーゼをも使用している二重ルシフェラーゼ系Ｎｏ．Ｅ１９
１０を含む。

【００３０】本発明による検定方法およびそのためのキットは、自己免疫甲状腺疾患、非自
己免疫甲状腺疾患、甲状腺に起因しない自己免疫、および、多内分泌腺疾患から
選択される条件または疾患との関係によって使用することができる。前記検定方
法およびキットは、たとえば、妊婦、甲状腺機能正常で眼疾の人、ならびに、ア
ミオダロンおよび／またはリチウム塩を投与されている人から選択される患者の
選別に使用することができる。本発明による検定方法またはキットは、ＴＳＡｂ
またはＴＢＡｂの測定、または、置換または修飾して標識を含むような一つまた
はそれ以上の以上のアミノ酸を有することなどにより配列の一部が修飾されたＴ
ＳＨ−Ｒに対する自己抗体を測定するのに適当である。

【００３１】以下、本発明を下記の非限定の実施例を参照して説明する。

【００３２】実施例１ＴＳＨおよびＴＳＨ−Ｒ自己抗体用発光検定で使用する細胞の調整 −ホタルルシフェラーゼの使用ＡＴＣＣＮｏ．ＣＣＬ６１から得られる、モンゴルキヌゲネズミ（Ｃｈｉｎ
ｅｓｅｈａｍｓｔｅｒ）の卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）に、標準プロトコル（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇ
ｙ，１９９６，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．の９．１．４節
に記載）を用いて、ｐＳＶ₂Ｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）およびヒトＴＳＨ−Ｒ遺伝子ｐＳＶＬ−ｈＴＳＨＲを担う真核生物発現ベクター（Ｇ．Ｖ
ａｓｓａｒｔ（ベルギー、ブリュッセル、ＩＲＩＲＩＩＮ）から入手可能）によ
りＰｅｒｒｅｔら（１９９０、前掲）が述べているようにしてリン酸カルシウム
同時トランスフェクションを実施した。４００μｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇ
ｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）によって、細胞を分離し、限界希釈することに
よりクローン発生させた。クローンＪＰ０９をこの方法によって分離した（また
Ｇ．Ｖａｓｓａｒｔ教授からも入手可能）。このクローンはＴＳＨ結合実験（Ｃ
ｏｓｔａｇｌｉｏｌａＳ、ＳｗｉｌｌｅｎｓＳ、ＮｉｃｃｏｌｉＰ、Ｄｕｍｏ
ｎｔＪ、ＶａｓｓａｒｔＧ、ＬｕｄｇａｔｅＭがＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌＭｅｔａｂ７５１５４０以下参照（１９９２）で述べている）の査定によれば細胞あたり約１０⁵の受容体を発現する。

【００３３】ＪＰ０９細胞を、３７℃、５％の二酸化炭素を含む空気中で１０％胎児子ウシ
血清を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地に保持した。

【００３４】クローンＪＰ０９細胞を、ふたたび前記の標準的なリン酸カルシウム法により
、ピューロマイシン耐性遺伝子（特に、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、その他から入手可能）と、ｐＡ３Ｌｕｃ（イギリス、ケンブリッジ大学
Ｖ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅから入手可能）を運ぶ真核生物発現ベクターとを導入
して同時感染させた。細胞を、２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で選択し
、限界希釈することによりクローン発生させた。クローンについてウシのＴＳＨ
（Ｓｉｇｍａ、Ｔ８９３１から）に対する応答光出力を試験した（実施例３参照
）。良好なＴＳＨ応答を示すクローンについて１パネルの正常なヒトの血清によ
り試験した。この場合の選択基準は１．５相対光単位以下という低い光出力であ
る。

【００３５】実施例２ＴＳＨおよびＴＳＨ‐Ｒ抗体の発光検定で使用する細胞の調整 −ホタルおよびレニラルシフェラーゼの使用実施例１の方法に従ったが、ピューロマイシン耐性遺伝子を巻き込んで第二の
同時トランスフェクションのあと、もう一回の同時トランスフェクションを標準
的なリン酸カルシウム法を繰り返すことにより実施した。ただし、代りにヒグロ
マイシン耐性遺伝子（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）およびレニラルシフ
ェラーゼプラスミドＥ２２４１（Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能）を運ぶ真核生物
発現ベクターを用いた。

【００３６】実施例３（ｉ）ＴＳＨの対生物活性、および（ｉｉ）甲状腺刺激（ＴＳＡｂ）または（
ｉｉｉ）抑制（ＴＢＡｂ）抗体の測定のための検定細胞用培地はＲＰＭＩ、１０％の胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）、１％グルタミン
、１％ピルビン酸塩、２％ペニシリン／ストレプトマイシン（および、検定のた
めに細胞を増殖させる場合は２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン）であった。
９６個のウェルプレートに例１によって調整した５×１０⁴の細胞を接種し、３７℃の水飽和のインキュベーター内で一晩（約１６時間）培養した。次に、これ
をＦＣＳの代りに１０％の木炭ストリップした子ウシ血清を含む培地（Ｇｉｂｃ
ｏから入手可能）内で第二の晩培養した。基底の光出力を木炭ストリップした血
清１０％を含む培地１００μｌの存在下で三つのウェルの中で測定した。標準（
下記参照）および試験試料は木炭ストリップした子ウシ血清１０％を含む培地の
最終体積１００μｌに対して患者血清１０％の態様である。基底、標準および試
験試料のインキュベーション時間は前記のように２〜３時間である。最終結果は
、標準：基底の比、または、試験資料：基底の比によって得られる相対光単位（
ＲＬＵ）で表した。

【００３７】ＴＳＨ対生物活性：この試験は、ラジオイムノアッセイで測定した場合に大き
い循環ＴＳＨ濃度を有するが低い循環遊離Ｔ４を有していて、欠陥ＴＳＨによる
甲状腺機能低下を示すような患者に対してのものである。標準試料は、十分に特
徴づけられた甲状腺機能正常および生物活性を増大する甲状腺機能低下血清試料
である。

【００３８】ＴＳＡｂ測定は甲状腺中毒患者に対して実施される。標準試料は、正常なヒト
の血清のプール（光出力が１．５ＲＬＵ以下）、ｂＴＳＨおよび活性の増大した
血清を含む十分に特性のわかったＴＳＡｂである。

【００３９】ＴＢＡｂ測定は、（ｉ）と同じ患者について実施されるが、検定ウェルは１ｍ
Ｕ／ｍｌのｂＴＳＨをも含む。標準試料はプールされた血清＋１ｍＵ／ｍｌのｂ
ＴＳＨおよび活性の大きな血清を含むよく特徴づけられたＴＢＡｂである。

【００４０】光出力の測定インキュベーション時間の経過後、ウェルから表面浮遊物を除去し、細胞をリ
ン酸塩緩衝生理食塩水で二回洗浄した。ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎが市販しているキットｎｏ.Ｅ１４８３を使用し、その製造者の指示にしたがって光出力を測定した。この指示には、溶解緩衝剤（ＰｒｏｍｅｇａＮｏ．Ｅ１５１３）中での細胞の処理、ホタルルシフェラーゼ反応物の添加および照度計
による光出力の測定が含まれる。

【００４１】この検定で使用する細胞が、細胞数／ウェルの標準化法を与えるためにレニラ
ルシフェラーゼをも構成的に発現する（例２で調整したように）場合は、Ｐｒｏ
ｍｅｇａの二重ルシフェラーゼ系Ｎｏ．Ｅ１９１０を使用する。この場合、前記
のようにホタルルシフェラーゼを測定し、次いで、発光信号を抑制するための反
応物を加え、次いで、レニラルシフェラーゼ反応物が加えられ、そして二回目の
読み取りを行った。

【００４２】実施例４検定のためのｌｕｌｕ１細胞の選択と使用ＪＰ０９細胞に、５μｇのｃＡＭＰ−ルシフェラーゼと２μｇのｐＢＡＢＥピ
ューロマイシン耐性プラスミドかまたはピューロマイシン耐性プラスミドのいず
れか一方のみを用いて実施例１に述べたように標準的なリン酸カルシウム法トラ
ンスフェクションを行った。ｃＡＭＰ−ルシフェラーゼは、糖蛋白ホルモンαサ
ブユニツトプロモーターの５´側面領域の８４６ｂｐとエクソン１の４４ｂｐで
あり、該プロモーターは、（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅらが、ＭｏｌＥｎｄｏｃｒ
ｉｎ５１００−１１０（１９９１）に述べているように）ホタルルシフェラー
ゼ遺伝子に結合した縦列の二つのｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）を含む。（例３で
述べたように）ピューロマイシン耐性細胞のプールを６個のウェルプレートにお
いて得て、選択し、ウシのＴＳＨに応答する光出力を試験した。クローニングリ
ングを用いてコロニーを分離した。

【００４３】（ａ）ｌｕｌｕ１の選択選択したクローンを、ＦＣＳの代りに１０％の木炭ストリップｄｑ子ウシ血清
（Ｓｉｇｍａ）を含む培地で一晩培養し、次いで、いろいろな濃度のウシＴＨＳ
を用いて４時間のインキュベーションを行った。ルシフェラーゼレポーター検定
（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりＢｅｒｔｈｏｌｄ照度計を使用して光出力を測定した
。結果をＴＳＨ存在下での光出力：ＴＳＨ非存在下での光出力の比として計算し
、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。次に、ＴＳＨに対して良好な応答を示すクロ
ーンを限界希釈することによりクローン処理し、ウシおよびヒトＴＳＨならびに
国際ＴＳＡｂ標準９０／６７２を用いて再試験した。

【００４４】（ｂ）基準範囲の決定約２×１０⁴のｌｕｌｕ１細胞を、９６個のウェルプレートに接種し、検定の前日に１０％の木炭ストリップした子ウシ血清を含む１００μｌ／ウェルのＨ
ａｍ’ｓＦ１２に切り替えた。チログロブリンおよびチロペルオキシダーゼ抗体に対して陰性で、甲状腺疾患の病歴の知られていない人々からの３４個の甲状
腺機能正常血清１０μｌを各ウェルに直接加え、３７℃で４時間インキュベーシ
ョンすることによって二重に試験した。細胞を前記（ａ）で述べたようにして検
定した。ただし、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ９６ウェルプレート照度計を使用した。結果を各の血清の存在下での光出力：血清の非存在下での光出力の比としてＲＬＵ
単位で表した。次いで、この３４個の血清をプールし、陰性対照とした。

【００４５】１００個の治療したＧＤの患者からの血清、市販のＴＢＩＩ（ＴＳＨ‐Ｒ）検
定（ＴＲＡＫ、ＢＲＡＨＭＳＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ベルリン；切り捨ては
９単位、そして、機能検定感度および検出上限はそれぞれ８および４０５ＴＲＡ
Ｋ単位）の５０個の陰性血清および５０個の陽性血清を二重に検定した。血清は
ウェルに直接１０μｌ加えた。検定は、２０個の橋本病、２７個の多結節性（８
個は中毒性）甲状腺腫、２０個の全身エリテマトーデスおよび１２個のリウマチ
因子陽性関節炎の血清に関しても実施した。すべての結果は前記（ａ）と同様に
ＲＬＵ単位で計算した。

【００４６】（ｃ）発光／ＲＩＡで測定されたｃＡＭＰの比較４４個の前記のＧＤ血清、（３５個のＴＢＩＩ（ＴＳＨ‐Ｒ）陽性）およびＴ
ＳＡｂ標準を、培地内に放出されたｃＡＭＰをＲＩＡによって測定する従来から
の生物検定によっても検定した。ｌｕｌｕ１に９６個のウェルプレートで接種し、２ｍＭＩＢＭＸおよび１０μｌの個人のＧＤまたはプールしてあった甲状腺機能正常血清を含む１００μｌ／ウェルの無塩Ｈａｎｋ培地中で検定を実施し
た。ｃＡＭＰを、ＬｕｄｇａｔｅらがＥｘｐＣｌｉｎＥｎｄｏ１００７
３−４で述べているような、ｃＡＭＰ［³Ｈ］検定装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって測定した。結果を下記の表（表１）に示す。この表において、「＾」は背
景光放射を除去した照度計読み取り値の平均（ｎ＝３）、（かっこ内は平均値の
標準誤差）、「^★」は平均（ｎ＝２）ｐｍｏｌｃＡＭＰ、（かっこ内は平均値の標準誤差）である。

【００４７】

【表１】

【００４８】治療ＧＤにおけるＴＳＡｂの検出上限１．４５ＲＬＵは、３４個の甲状腺機能正常試料分析（範囲０．９６〜１
．４８ＲＬＵ）の９７．５百分位数から導出した。ＧＤ血清を生理的条件で検定
した場合、ＴＢＩＩ陰性血清の６６％およびＴＢＩＩ陽性血清の８０％が発光検
定において１．５ＲＬＵ以上を示し、この範囲の値は各種疾患グループの対照血
清ではわずか４％に関してのみ得られた。

【００４９】１００個のＧＤ血清を用いて計算した検定内変動は１１．９％であり、対の分
析による二つの独立の検定で測定した１００個のＧＤ試料から計算した検定間の
変動は１４．６％であった。

【００５０】血清のうち３３個が発光検定で陽性、２７個がＲＩＡで陽性、７個が両検定で
陰性、６個がＲＩＡでは陽性であるが発光検定では陰性であった。１００個のＧ
Ｄ血清のＴＳＨ‐Ｒ抗体についての三重の検定で得られた結果を下記の表（表２
）に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】本発明の発光検定は使用した条件下では従来のｃＡＭＰのＲＩＡ測定に比して
良好な結果を示した。これはおそらく光出力による間接測定により応答が増幅さ
れるためであると考えられる。標準試料の挙動がこれを示している。すなわち、
発光検定の場合、光出力は正常なプールのそれの約１０倍であるが、一方ＲＩＡ
の場合わずか７倍の増大しか示さない。

【００５３】やはりここで観察されたところでは、ＴＳＨ応答性は無塩（ＮａＣｌを含まな
い）条件下で低下し、予備的な研究によれば発光検定は等張性の場合に比してＴ
ＳＡｂの測定感度は高いがＴＳＨ測定感度は低い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA55 CA04 CA05 DA05 GA19 HA15 4B063 QA01 QA05 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR02 QR42 QR77 QS28 QS33 QS36 QX01 QX07 4H045 AA10 AA30 CA40 DA30 DA76 EA50 EA55

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＴＳＨ−Ｒ自己抗体またはＴＳＨの検定方法であって、（ａ）ＴＳＨの存在下または非存在下で試験試料をレポーターカセットに感染し
たヒトＴＳＨ−Ｒを発現するクローンからの細胞と接触させ、前記レポーターカ
セットが、（ｉ）対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき測定可能な応答を
生じうる反応物たとえば酵素と、（ｉｉ）サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答
要素（ＣＲＥ）を含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを有し、その際ｃＡＭＰ
濃度が反応物の発現によって変動するステップを含むことを特徴とする検定方法
。
【請求項２】さらに、（ｂ）前記のように接触させられる細胞に、対応する基質を加えるステップを含
むことを特徴とする請求項１記載の検定方法。
【請求項３】さらに、（ｃ）基質にさらされる細胞における応答を測定し、そして（ｄ）試験ステップ（ｃ）からの応答とステップ（ａ）から（ｃ）が実施された
標準または正常試料からの応答とを比較することを含むことを特徴とする請求項
２記載の検定方法。
【請求項４】測定可能な応答が色変化、蛍光発光変化または光放射である
ことを特徴とする請求項１から３の中のいずれか１つに記載の検定方法。
【請求項５】反応物がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）、ホタルルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび緑
色蛍光蛋白から選択されることを特徴とする請求項４記載の検定方法。
【請求項６】レポーターカセットのサイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ
）がＣＲＥ共通配列ＴＧＡＣＧＴＣＡを含むプロモーター配列または合成オリゴ
ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１から５の中のいずれか１つに記載
の検定方法。
【請求項７】サイクリックＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）がＣＲＥ一致配列Ｔ
ＧＡＣＧＴＣＡの縦列反復を含むことを特徴とする請求項６記載の検定方法。
【請求項８】プロモーターが縦列ｃＡＭＰ応答要素を含む糖蛋白ホルモン
アルファサブユニットに対するものであることを特徴とする請求項１から７の中
のいずれか１つに記載の検定方法。
【請求項９】プロモーターがＣＡＴ酵素を駆動するカセットを含むことを
特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の検定方法。
【請求項１０】ステップ（ａ）においてｃＡＭＰ応答要素を含むプロモータ
ーによって駆動されるルシフェラーゼｃＤＮＡを使用し、ステップ（ｂ）におい
てルシフェリンを使用し、またステップ（ｃ）においてルシフェリン化細胞から
の光出力を測定することを含むことを特徴とする請求項３記載の検定方法。
【請求項１１】レポーターカセットがα−ルシフェラーゼを含むことを特徴
とする請求項１から１０の中のいずれか１つに記載の検定方法。
【請求項１２】使用されるすべての反応物が一つ以上のステップで一緒にさ
れかつ／またはステップ（ａ）〜（ｄ）の二つ以上が実質的に同時に実施される
ことを特徴とする請求項１から１１の中のいずれか１つに記載の検定方法。
【請求項１３】手操作の、部分自動化のまたは完全自動化の手段により実施
されることを特徴とする請求項１から１２の中のいずれか１つに記載の検定方法
。
【請求項１４】請求項１から１３の中のいずれか１つに記載の検定を実施す
るためのキット。
【請求項１５】（ａ）対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき測定可能
な応答を生じうる反応物たとえば酵素とサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）応答要
素（ＣＲＥ）を含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡを有し、その際ｃＡＭＰの
濃度が反応物の発現によって変動するレポーターカセットに感染したヒトＴＳＨ
−Ｒを発現するクローンからの細胞；（ｂ）検定のための標準試料；（ｃ）細胞を培養および／または再構成する培地；及び（ｄ）検定を実施するための説明、を含むことを特徴とする請求項１４記載のキット。
【請求項１６】さらに、（ｅ）細胞溶解のための緩衝剤；および／または、（ｆ）レポーターカセットのための緩衝剤、好ましくはルシフェラーゼ緩衝剤；
および／または、（ｇ）緩衝剤中の対応する基質好ましくはルシフェリン；および、随意に照度計を含むことを特徴とする請求項１５記載のキット。
【請求項１７】レポーターカセットがプラスミドｐＡ３ｌｕｃを含み、該プ
ラスミドが該プラスミドに導入された糖蛋白ホルモンαサブユニットプロモータ
ーを含むことを特徴とする請求項１４から１６の中のいずれか１つに記載のキッ
ト。
【請求項１８】ＣＲＥ含有配列が市販のルシフェラーゼレポーター系たとえ
ばｐＧＥＭ−ｌｕｃ内にサブクローン化されていることを特徴とする請求項１４
から１７の中のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１９】レポーターカセットが複数のプラスミドを含むことを特徴と
する請求項１４から１７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２０】ヒトＴＳＨ−Ｒが真核発現ベクター内にサブクローン化され
ていることを特徴とする請求項１４から１７の中のいずれか１つに記載のキット
。
【請求項２１】前記真核発現ベクターがｐＳＶＬであることを特徴とする請
求項２０記載のキット。
【請求項２２】ＴＳＨ−Ｒが、同じプラスミド内に抗生物質耐性遺伝子を含
む二重ベクター内にサブクローン化されていることを特徴とする請求項２０記載
のキット。
【請求項２３】二重ベクターがｐｃＤＮＡＩＩＩを含むことを特徴とする請
求項２２記載のキット。
【請求項２４】要素（ａ）のための細胞がここで明記するクローンＪＰ０９
からのものであり、該クローンが細胞あたり１０⁵の程度のＴＳＨ−Ｒに安定に感染していることを特徴とする請求項１４から２３の中のいずれか１つに記載の
キット。
【請求項２５】前記細胞がα−ルシフェラーゼｃＤＮＡとピューロマイシン
耐性コード化プラスミドとの両方に同時感染していることを特徴とする請求項２
４記載のキット。
【請求項２６】前記細胞が凍結乾燥（フリーズドライ）され、凍結されある
いはゲルに含まれ、そして個別容器で提供されることを特徴とする請求項１４か
ら２５の中のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２７】前記細胞が、さらに、使用中にウェル内で接種された細胞の
数を補正する方法による検定を提供するために同時感染させられていることを特
徴とする請求項１４から２５の中のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２８】前記細胞が、さらに、レニラルシフェラーゼプラスミドによ
り同時感染させられていることを特徴とする請求項２７のキット。
【請求項２９】自己免疫甲状腺疾患、非自己免疫甲状腺疾患、甲状腺に起因
しない自己免疫および多内分泌腺疾患から選択される病気または疾患に関して使
用されることを特徴とする請求項１から２８のいずれか１つに記載の検定方法ま
たはキット。
【請求項３０】妊婦、甲状腺機能正常眼疾の人ならびにアミオダロンおよび
／またはリチウム塩を投与されている人から選択される患者の選別に使用される
ことを特徴とする請求項１から２９の中のいずれか１つに記載の検定方法または
キット。
【請求項３１】ＴＳＡｂまたはＴＢＡｂを測定するか、または、置換されも
しくは他の修飾がなされて標識を含む一つまたはそれ以上の以上のアミノ酸を有
することなどによって配列の一部が変更されたＴＳＨ−Ｒに対する自己抗体を測
定することを特徴とする請求項１から３０の中のいずれか１つに記載の検定方法
またはキット。
【請求項３２】対応する基質に接触したとき測定可能な応答を生じうる反応
物たとえば酵素とｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）を含むプロモーターとの両方のｃ
ＤＮＡを有し、増大するｃＡＭＰ濃度が基質の発現によって変動することを特徴
とするレポーターカセット。
【請求項３３】反応物酵素がルシフェラーゼであることを特徴とする請求項
３２記載のレポーターカセット。
【請求項３４】請求項３２または３３記載のレポーターカセットに感染して
いるヒトＴＳＨ−Ｒを発現することを特徴とするクローン。
【請求項３５】請求項３４記載のクローンによって生成されることを特徴と
する細胞。
【請求項３６】請求項３２または３３記載のレポーターカセットに感染して
いるヒトＴＳＨ−Ｒを発現することを特徴とするｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ。
【請求項３７】対応する基質たとえば蛋白質に接触したとき測定可能な応答
を生じうる反応物たとえば酵素とＣＲＥを含むプロモーターとの両方のｃＤＮＡ
を含むレポーターカセットに感染していることを特徴とするヒトＴＳＨ−Ｒ。