JP2001517634A

JP2001517634A - 神経栄養活性を有するサイトカイン

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Publication number: JP2001517634A
Application number: JP2000512560A
Authority: JP
Inventors: クラウスウンシッカー; イェンスポール; ミヒャエルパウリスタ; ロルフベヒトルド
Original assignee: バイオファームゲゼルシャフトツアバイオテクノロジシェンエントヴィックルングウントツムフェルトリーブフォンファルマカエムベーハー
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2001-10-09
Also published as: AU1024899A; EP1011712B1; CA2301693A1; ES2214743T3; US6790824B1; DE69821629D1; WO1999015191A2; EP1011712A2; WO1999015191A3; DE69821629T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、神経栄養活性を有する薬学的組成物に関し、該組成物は、生物学的に活性な量の少なくとも２種のサイトカインを含み、ここで少なくとも１種の該サイトカインはBMP、GDF、TGF-βまたはGDNFである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、哺乳動物における末梢および／または中枢神経系(CNS)疾患を治療するための、神経栄養活性を有する薬学的組成物に関する。

【０００２】 GDF-5は、骨形態形成タンパク質様分子であり、トランスフォーミング成長因子ベータ(TGF-β)スーパーファミリーの他のメンバーと同様に、神経栄養機能に
関わっている。例えば、TGF-β1、-β2、および-β3、並びにアクチビンA、骨形
態形成タンパク質(BMP)-2、-4、-6、-7、-12、グリア細胞系由来の神経栄養様因
子(GDNF-様)、およびGDF-5は全て、様々なメカニズムにより、中脳ドパミン作動
性ニューロンの生存をインビトロで増進することを示す。GDNFは、広域スペクト
ルの末梢ニューロンにも作用する。

【０００３】中脳ドパミン作動性ニューロンに関する神経栄養因子としてのGDNFの発見は、
例えばパーキンソン病のような神経変性疾患の治療に関連性を有し得る、新規な
分子の探求におけるホールマークであった。GDNFの重要性は、非ヒト霊長類を含
むPDの幾つかの動物モデルでのその有効性、中枢神経系(CNS)のニューロンにおける遍在性発現、および応答性ニューロン・ポピュレーションのその広域化スペ
クトルによって更に強調される。GDNFは、GPI連結したαレセプターGDNFRαと協
働して、チロシンキナーゼ・レセプターc-retを介してシグナル伝達する。GDNF は、TGF-βスーパーファミリーのメンバーであり、その最も近縁の関連物はニュ
ールチュリン(neurturin)である。GDNFまたはc-Ret遺伝子の標的化突然変異体は
、GDNFが腎臓、腸神経系の主要部分および交感神経上頸神経節の発生に本質的に
必要とされることを示した。しかしながら、GDNFは、低密度解離培養物および定
められた培地中では、最末梢ニューロンの生存を支持しない。GDNFが集密な(enr
iched)末梢自律および感覚ニューロンの生存を増進することを示したフォローア
ップ実験は全て、培養期間全体を通して、血清を用いて行われた。さらに、GDNF
のドパミン栄養性(dopaminotrophic)効果が、極めて複雑な培養システムで確立され、そこでは、その最も顕著な効果は培養の７日目まで明らかにならなかった
。

【０００４】 TGF-βsは、広く分布し関連的に作用するサイトカインであり、発生および細胞サイクル・コントロールに顕著な役割を有する。TGF-βsは、例えば、運動ニューロン、感覚および中脳ドパミン作動性ニューロンのニューロン生存の調節に
関与している。しかしながら、TGF-βは、例えば感覚ニューロンのような高度に
集密な血清を含まないニューロン培養物に対して、皆無またはぎりぎりの効果し
か示さないことが注目されるべきである。

【０００５】従って、本発明に横たわる技術的問題は、哺乳動物における末梢および／また
は中枢神経系(CNS)疾患を治療するために、改善された神経栄養活性を有する新規なシステムを提供することである。

【０００６】上記の技術的問題の解決は、請求の範囲に特徴付けられる実施態様によって達
成される。

【０００７】特に、本発明は、神経栄養活性を有する薬学的組成物に関し、該組成物は、生
物学的に活性な量の少なくとも２種のサイトカインまたは機能的に活性なその誘
導体もしくはその一部ならびに、必要に応じて薬学的に許容される担体および／
または希釈剤を含み、ここで、該サイトカインの少なくとも１種は、BMP、GDF、
TGF-βまたはGDNFである。用語「BMP」は、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-1
1およびBMP-12を含む。用語「TGF-β」は、TGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3を含
む。用語「GDNF」は、GDNF、ニュールチュリンおよびペルセフィン(persephin) を含む。用語「機能的に活性な誘導体」および「機能的に活性な一部」は、それ
ぞれのサイトカインの生物学的機能の少なくとも１部を示すタンパク質性化合物
を指す。本発明による薬学的組成物中で使用されるサイトカインは、GDF-5、GDF
-6、GDF-7、GDF-8およびGDF-9のようなGDF、GDNF、TGF-αまたはTGF-β、例えば
TGF-β1、TGF-β2もしくはTGF-β3のようなTGF、アクチビンA、BMP-2、BMP-4、B
MP-6、BMP-7、BMP-11、BMP-12のようなBMP、BDNF、NGF、NT-3またはNT-4のようなニューロトロフィン、EGF、CNTFおよびFGF-2のようなFGFからなる群から選択され得る。

【０００８】本発明の好ましい実施態様では、薬学的組成物は、以下の組合せを含む：GDF-
5およびNGFまたはNT-3またはGDNF、TGF-βおよびGDNFまたはFGF-2またはCNTFまたはNT-3またはNGF、NGFおよびBMP-4またはBMP-12、NT-3およびBMP-2またはBMP-
7またはBMP-12。

【０００９】驚くべき事実として、BMP、GDF、TGF-βおよびGDNFの少なくとも１種が上記の
薬学的組成物中に存在する場合には、例えばGDFおよび／またはGNDFを含まない公知の組成物と比較して、増大した神経栄養活性を生じる相乗効果が観察され得
る。

【００１０】本発明による薬学的組成物は、哺乳動物における、特にヒトにおける末梢およ
び／または中枢神経系疾患、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ALS もしくは他の痴呆、他の中枢神経系の神経変性疾患、および糖尿病を含む末梢ニ
ューロパシー、シスプラチニウム(cisplatinium)または他の遺伝性もしくは後天
性末梢神経疾患の治療に使用され得る。

【００１１】下記の実施例は、本発明を例示する：１． NT-3またはNGFを用いた、GDF-5およびBMPそれぞれとの間の相乗効果ニワトリ胚の背根神経節(DRG)の解離培養物を、KrieglsteinおよびUnsicker(N
eurochem. Res., 21(7) (1996) 843-850)に詳細に記載されるように生じさせた。簡単に述べると、白色レグホーンヒヨコ胚(第８日)からのDRGsを、Ca²⁺-Mg²⁺ を含まないハンクス平衡塩類溶液中で切開した。0.08%トリプシン中で15分間インキュベーション後、神経節を粉砕によって解離させた。細胞を、ポリオルニチ
ン-ラミニンでコートされた96ウェルのマイクロタイタープレート(A/2 Costar) 中に、1,200細胞／ウェルの密度で播いた。成長因子を、プレーティングする時点で、0.25%ウシ血清アルブミン、N1添加物および100 U/mlペニシリンを補足した最終体積50 mlのダルベッコ変法イーグル培地に適用した。陽性コントロールとして、神経成長因子(NGF)を5 ng/mlの飽和濃度で使用した。5% CO2を含む湿潤
化した雰囲気中で、37℃で48時間インキュベーション後、培養物を2.5%グルタル
アルデヒドで固定した。ニューロン細胞を、それらの相明度およびニューライト
保持形態で同定し、位相差顕微鏡を用いて、全表面積の30%以内でカウントした。実験の最初のセットで、我々は、骨形態発生タンパク質ファミリーの幾つかの成長因子の生存増進効果をテストした。広範囲の連続希釈物を用いたGDF-5およびBMPそれぞれの用量応答分析は、調べられたGDF-5および全BMPsが、用量依存
性の飽和可能な様式で、しかし異なる規模で、生存する感覚ニューロン数を増加
させることを明らかにした(図１および２)。例えば、GDF-5は、ニューロン細胞数において約２倍の増加を誘導し得(20 ng/mlの飽和濃度で)、約20%のNGF効果に
対応する(図１)。BMP-4およびBMP-7は、最大のNGF効果の約35%を示し(それぞれ図2BおよびD)、BMP-2、-6、-11および-12も、有意な効果を有した(それぞれ図2A
、C、EおよびF)。

【００１２】神経栄養因子は、ニューロン生存度を測定するのに、細部まで適合した調和性
および帰結をもって作用することが仮定された。図３に示されるように、2.5 ng
/ml NT-3を様々な濃度のGDF-5に添加すると、DRGニューロン生存度をNT-3レベル
以上に有意に増加し、NT-3およびGDF-5が相乗作用し得ることを示した。飽和濃度で添加されたとき、その２つの因子は、それぞれ単独での因子レベル以上にニ
ューロン数を有意に増加し得なかった。このことは、GDF-5およびNT-3が、同一または大きくオーバーラップするニューロン・ポピュレーションに影響すること
を示す。対照的に、GDF-5(20 ng/ml)をNGF(5 ng/ml)に添加すると、それぞれ単独の因子で得られる上記の数値以上に、ニューロン細胞数を有意に増加した(図３)。これは、GDF-5およびNGFが、我々のDRG培養システムでは、異なるニューロ
ン・ポピュレーションを増進し得ることを示す。

【００１３】調べられた全ての他の成長因子[脳で誘導される神経栄養因子、BDNF；ニューロトロフィン-4、NT-4；TGF-β1および-β3、GDNF、表皮成長因子、EGF；トラン
スフォーミング成長因子a、TGF-α；線維芽細胞成長因子-2、FGF-2]は、任意の供試濃度でGDF-5と共に添加したとき、相乗効果または相加効果も示す(図４)。

【００１４】図5Aに示されるように、NGFは、GDF-5、BMP-4、またはBMP-12と組合せると、D
RGニューロンの生存度を、単一の因子で維持されるレベルを越えて有意に増加し
た。GDF-5およびBMP-12は、単独で添加されるとき、非常に小さなニューロン・ポピュレーションの生存を増進した。しかしながら、NGFと組合せたとき、細胞数の増加は、単独の添加で説明され得たよりも有意に高かった。従って、これら
のデータは、GDF-5およびBMP-12が、NGF効果を増強することを示す。BMP-4のNGF
との組合せも、有意な効果を示す。図5Bは、GDF-5およびBMPsの増進効果も、NT-
3に関して有意であることを証明している。GDF-5、BMP-2、-7および-12は、NT-3
の増進効果を有意に強化した。GDF-5およびこれらのBMPsがNT-3と一緒である場合、結果は、それらが、多大に非オーバーラップのニューロン・ポピュレーショ
ンの生存度を増進することを示す。BMPsおよびBDNF、NT-4、またはGDNFとの組合
せ処理は、これらの因子が、多大にオーバーラップするニューロン・ポピュレー
ションの生存度を増進することを示す。

【００１５】本データは、GDF-5およびBMPsの末梢感覚ニューロンのポピュレーションに対する生存増進効果を実証し、GDF-5およびBMPsの多重機能が神経栄養因子としての能力を含むという証拠を追加する。さらに、GDF-5およびBMPsは、ニューロトロピンに支持されるDRGニューロンの生存度に相乗的に影響し得る。NGFとBMPsの
相加効果は、BMPに支持されるDRGサブポピュレーションが、NGF依存性よりもむしろ、NT-3またはBDNF依存性のDRGニューロンを含むことを示す。NT-3に関する要件を有するDRGニューロンは、筋肉から脊髄までの固有受容インプットを仲介する大きな感覚ニューロンのカテゴリーに属する。BDNF依存性感覚ニューロンは
、恐らく不均一のポピュレーションを含む。両方のポピュレーションとも、初期
発生四肢において、それらの局在と一致するGDF-5およびBMPsに関する推定的ターゲットであり得る。TGF-βsが幾つかのニューロトロフィンと相乗作用し得るという明らかになる証拠に関連すると、本データは、そのような特性がGDF-5およびBMPsにも帰属され得ることを示す。本データは、GDF-5およびBMPsが、感覚ニューロンを支持するのに要求されるニューロトロフィンの用量を有意に低下し
得るという認識とも一致する。ニューロトロフィンは、現在、幾つかの形態の末
梢ニューロパシーに関して、臨床試験に入っている。従って、本発明による薬学
的組成物は、ニューロトロフィンの適用に関する、特にNT-3に応答するニューロ
パシーにおいて適用性を有する。

【００１６】２． TGF-βの他の神経栄養因子およびニューロトロフィンとの相乗効果末梢および中枢神経系ニューロンの幾つかのポピュレーションに対するGDNFの神経栄養活性はインビトロおよびインビボで本質的にTGF-βを要求する。

【００１７】 GDNFは、培養された中脳ドパミン作動性ニューロン、運動ニューロン、並びに
末梢自律および感覚ニューロンに関する強力な神経栄養因子として提案されてい
る。上記培養システムの全ては、有意な細胞複雑性および／またはコントロール
されない栄養条件をもたらす血清の使用を共有する。殆ど全ての細胞タイプなら
びに血清の周知の成分は、TGF-βである。例えば、B49細胞(それからGDNFは単離
された)、BHK、COS細胞および3T3線維芽細胞(それらは、トランスフェクション実験でしばしば使用される)のコンフルエントな培養物は、その生物学的活性で測定すると、24時間以内に、0.2〜0.4 ng/mlのTGF-βをそれらの培養培地に分泌
する。ウシ胎児血清およびウマ血清の異なるバッチは、様々であるが有意な量の
TGF-β(10%血清を含む培養培地中で0.1-0.2 ng/ml)を含む。

【００１８】ヒヨコ毛様体(ciliary)神経節ニューロンを例として用いると、図6Aは、10%ウ
マ血清を補足されたGDNFが、24時間で、CNTF(5 ng/ml)の飽和濃度と同じくらい効果的にニューロンを維持することを示す。しかしながら、TGF-βに対する中和
抗体(10μg/ml、1 ng/mlのTGF-βイソ型-β1、β-2、およびβ-3の＞95%を中和することが公知)と共に予めインキュベートされていた培養培地を投与すると、G
DNFの効果を有意に低下させたので、GDNFがその栄養効果を発揮するにはTGF-β を必要とすることを示す。この認識に一致して、血清含有培地から充分に定義さ
れた培養培地に切り替えると、GDNFとTGF-β(それぞれ、2 ng/mlの飽和量で)の両方とも、ぎりぎりの生存増進効果しか示さなかった。

【００１９】しかしながら、組合せたとき、２つの因子は、CNTFと同じくらい有効にニュー
ロンを増進した。GDNFとTGF-βの相乗効果に要求される用量応答関係を測定する
ために、それぞれ単独の因子を2 ng/mlの濃度で、他のものの連続希釈物と組合せて滴定した。図6Bに示されるように、2 ng/mlの他の因子と組合せたいずれかの因子60 pg/mlは、EC₅₀を示した。0.25 ng/mlと2 ng/mlとの組合せは、既に飽和効果を引き出した。TGF-βの全イソ型(TGF-β1、-β2、および-β3)は、使用された条件下で一致して同等に有効であった(示さない)。

【００２０】 GDNFとTGF-βの相乗効果が末梢ニューロンの他のポピュレーションにも適用さ
れるかどうかを調べるために、胚日数(E)８の胚から単離したヒヨコの感覚(DRG)
および脊椎傍交感ニューロンを用いて、同一の実験を行なった。図6Cおよび6Dに
示されるように、GDNFおよびTGF-βは、血清を含まない培養物に共同投与された
とき、飽和濃度のNGF(5 ng/ml)によって支持されたように、感覚および交感ニュ
ーロンをそれぞれ維持した。再度、10%ウマ血清がTGF-βに替えられた。

【００２１】上記の効果が、僅かな発生時間枠に限定されるのを排除するために、同じセッ
トの実験を、E10およびE12ヒヨコ胚からの毛様体、感覚DRGおよび交感ニューロンに対して行なった。図7A-Fは、全ての齢で、全てのニューロン・ポピュレーシ
ョンにおいて、研究されたGDNFとTGF-βの共同投与が、CNTFまたはNGFそれぞれの生存増進効果を模倣したことを示す。

【００２２】図８に示されるように、GDNFとTGF-βはそれぞれ、ドパミン作動性ニューロン
の生存度を、非処理コントロール培養物の160%および200%でそれぞれ増進した。
因子の組合せは、約0.2 ng/mlの量の内因性TGF-βの存在と一致する生存度を更には増強しなかった。TGF-βへの中和抗体(10 μg/ml)を添加すると、GDNFの栄養効果を排除した。従って、TGF-βは、GDNFが、その神経栄養の可能性を末梢お
よび中枢神経系ニューロンの両方に対して発揮可能とするのに必要とされる。

【００２３】 GDNFは、インビボでその神経栄養活性を確立するのにTGF-βを要求したことを
証明するために、ラット副腎髄質の一側性の外科的破壊を用いて、成長したラッ
ト脊髄中の神経節前ニューロンが、それらの副腎クロム親和性標的細胞から取ら
れた。BlottnerおよびBaumgarten(Exp. Neurol. 118(1992)35-46)に既に示されるように、このタイプの標的採取は、副腎髄質への全ての神経節前ニューロンの
死を４週間で生じる。図9a-cに見られ得るように、神経節前ニューロンは、GDNF
レセプターcRetおよびGFR-α1を発現する。図9dは、僅かなゲルフォーム中の1 μg GDNFを髄質摘出された副腎に投与することによる、神経節前ニューロンの標
的の置換は、４週間後にニューロンを充分に保護したことを示す。図9eに示され
るように、TGF-β−中和抗体の共同投与は、GDNFの保護効果を妨げた。これは、
内因性TGF-βの存在が、GDNFのインビボでの栄養効果を可能とするのに必須であ
ることを示す。

【００２４】 TGF-βはGDNFR-αを安定化または補給することによりGDNFと相乗作用する TGF-βと協働するGDNFによって使用される特異的シグナル伝達経路の詳細を特
徴付ける手始めとして、GDNF/c-ret-仲介シグナル伝達における初期の事象として示されたPI-3キナーゼの活性化が関与したかどうかの問題に関して、更なる研
究が行なわれた。図10Aは、特異的PI-3キナーゼ阻害剤であるワートマンニン(Wo
rtmannin)が、 TGF-βと組合せたGDNFの培養毛様体ニューロンに対する生存増進
効果を、０.25 μMで完全に廃したことを示す。ワートマンニンは、CNTFの生存増進効果を障害せず、PI-3キナーゼの活性化が、CNTFのではなくGDNF/TGF-βの生存増進効果を仲介するのに、本質的な事象であることを示す。さらに、この結
果は、ワートマンニンが、生存度を非特異的に低下しなかったことを示す。

【００２５】さらなる問題は、TGF-βが、GPI連結GDNFR-αの安定化および補給に関与し得るかどうかということであった。ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパ
ーゼC(PIPLC)を0.1 U/mlの濃度で使用して、プレーティング前に、解離した毛様
体ニューロン上のGPI固着レセプターを加水分解した。この手順は、CNTFの生存増進効果(それは、GPI固着GPARαを利用する)を、FGF-2の生存増進効果に影響す
ることなく、効果的に低下させた(図10B)。GPI連結レセプターの加水分解は、そ
れをTGF-βと組合せると、GDNFの生存増進効果を有意に低下した。しかしながら
、PIPLC前処理がTGF-β(2 ng/ml TGF-β1)の存在下で行なわれたとき、GDNFの生
存増進効果は維持された(図10B)。これらのデータは、αレセプター成分の安定化および／または補給における、GDNFの神経栄養効果およびTGF-βの可能性のあ
る役割における、GPI連結レセプター成分の本質的な関与を示す。

【００２６】 TGF-βはFGF-2、CNTFおよびニューロトロフィンの神経栄養作用も仲介する線維芽細胞成長因子(FGF)-2は、腹側中脳におけるドパミン作動性ニューロンに
関する、神経栄養因子として作用することが公知である。初期の研究は、FGF-2 によって発揮される神経栄養効果が、主として間接的であり、中脳神経節によっ
て仲介されることを示唆した(EngeleおよびBohn、J. Neurosci. 11 (1991)3070-
3078)。TGF-βは、大膠細胞の生成物であることが公知であるので、TGF-β中和抗体が、胚中脳床から誘導された培養ニューロンに対するFGF-2の神経栄養効果を廃し得るかどうか試験された。図12は、培養ニューロンをFGF-2(10 ng/ml)を用いて処理すると、陰性コントロール(培地のみ)と比較して、細胞生存度に1.7 倍の増加をもたらしたことを示す。対照的に、TGF-β1/-β2/-β3に特異的である抗体を添加すると、FGF-2の生存増進効果を完全に廃した。これらのデータは、腹側中脳におけるドパミン作動性ニューロンに対するFGF-2の神経栄養効果が、TGF-βによって仲介されることを示す。

【００２７】 TGF-βは、ヒヨコ毛様体神経節(CG)ニューロン生存のコントロールにおいて、
FGF-2およびCNTFと相乗的に作用し得た。TGF-βイソ型-β1/-β2/-β3を認識する抗体を使用して、CNTFまたはFGF-2それぞれで処理したCGニューロンの培養物中で、TGF-βを免疫中和した(図13)。TGF-βの中和は、CNTFまたはFGF-2に仲介されるニューロン生存度を40〜60%低下させた。これらのデータは、培養されたC
Gニューロンから放出されるTGF-βが、外因性神経栄養因子と相乗作用してニューロン生存を確実にすることを示す。

【００２８】 CNTFは、神経形成性(neuropoetic)サイトカインのファミリーのメンバーと共に、レセプターおよびシグナル伝達成分を共有し、それらのメンバーは、白血病
阻害因子(LIF)、オンコスタチンM(OSM)、およびインターロイキン-6(IL-6)を含む(StahlおよびYancopoulos、J. Neurobiol. 25(1994) 1454-1466)。図14Aに示されるように、TGF-βsは、CGニューロン生存増進に関して、CNTFの非飽和濃度の効力を明らかに増強した。OSM、LIF、およびIL-6は、CGニューロンを支持し
なかったし、TGF-βの更なる添加は、これらのサイトカインの効果を、バックグ
ラウンド・レベルを越えて増加しなかった。ニューロトロフィンは、CGニューロ
ンに関する確立された栄養因子ではない(Collins、Brain Res. 467 (1988) 111-
116)。しかしながら、TGF-βと組合せると、NGFおよびNT-3は両方とも、CNTF-プ
ラトーの35〜40%で生存度を増進した(図14B)。CGニューロンに対してNGFおよびN
T-3のシグナリングを可能にするtrkAレセプターの発現は、まだ示されていないが、提示されたデータは、TGF-βがCGニューロン上で、ニューロトロフィン・レ
セプター仲介シグナリングと協働し得ることを示す。

【００２９】実験手順材料 CMF：Ca²⁺/Mg²⁺を含まないハンクス平衡塩類溶液、DMEM：ダルベッコ変法イー
グル培地、およびPSNは、Gibcoから購入した。ポリL-オルニチン、ラミニン、A2
3187、カルバコール、およびベラパミルは、Sigmaから購入し、ウシ血清アルブミン(BSA)は、Serva(ハイデルベルグ、ドイツ)から購入し、PIPLCはBoehringer
Mannheim(ドイツ)から購入した。

【００３０】ウマ血清(HS)はGibcoから購入し、ウシ胎児血清(FCS)のバッチ１および２はPA
Aから購入し、FCSのバッチ３および４はEuroから購入し、FCSのバッチ５および６はPANから購入した。

【００３１】成長因子成長因子は、Boehringer Mannheim(NGF、2.5 S NGFおよび組換えヒト(rh)LIF)
、IC Chemikalien(組換えラット(rr) CNTF、rh GDNF、rhオンコスタチンM(OSM) 、rh IL-6、rh NT-3、rh NT-4およびrh BDNF)およびGenetics Institute, Inc.(
rh BMP-2、rh BMP-4、rh BMP-6、rh BMP-7、rh BMP-11およびrh BMP-12)から得た。図５に従う実験のために、GDF-5をBIOPHARMから購入し、或いは、それは記載される(Krieglsteinら、J. Neurosci. Res., 42(5)(1995) 724-732)ように作製した。図12に従う実験のためのRh FGF-2は、Progenから得、他の全ての実験の
ためにはIC Chemikalienから得た。凍結乾燥された因子を培養培地(下記)中に再
懸濁し、最終濃度1 μg/ml とし、50-100μlのアリコート中で使用するまで-70 ℃で貯蔵した。

【００３２】抗体 TGF-β1、2、3に対する中和抗体をGenzymeから購入し、GDNFに対するものはSa
nta Cruz Biotechnologyから購入した。

【００３３】 TGF-β1およびGDNFに対するアガロース複合体化抗体を、Santa Cruz Biotechn
ologyから購入した。ペルオキシダーゼ複合体化α-ウサギ抗体を、Sigmaから購入した。

【００３４】図１、３、４、６、７、８および11に従う実験のための動物受精した白色レグホーン鶏卵を、地元の養鶏場から得て、加湿した卵チャンバ
ー中で37.8℃でインキュベートした。

【００３５】図２、５および12-14に従う実験のための動物受精した白色レグホーン鶏卵を、地元の養鶏場から得て、加湿した卵チャンバ
ー中でE8まで38℃でインキュベートした。

【００３６】図１、３、４、６、７、８および11に従う実験のための細胞培養神経栄養活性のアッセイ：胚日数(E)８、10、12の、ヒヨコ胚毛様体(CG)、背根(DRG)、および交感(SG)神
経節を切開し、神経根および結合組織からはずし、CMF中に集めた。神経節をトリプシン(ICN)中でインキュベートし、洗浄し、火で仕上げたパスツールピペットを用いて粉砕することによって解離した。

【００３７】培養物を、ポリL-オルニチンおよびラミニンでプレコートされた96ウェルのマ
イクロタイタープレート(Costar、A/2)に、N1添加物、0.25% BSA、および0.1% P
SN(DME/N1)を補足したDMEM中1,200-1,500細胞/ウェルの密度で、セットアップし
、5% CO₂インキュベーター中で37℃でインキュベートした。

【００３８】適当な時間に(CG: 24h、DRG: 48h、SG: 72h)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2
.5%グルタルジアルデヒド添加により、培養物を固定した。位相差顕微鏡を用いて、表面積の30%を直接カウントすることにより、生存ニューロンの数を測定した。

【００３９】 PIPLCによる処理：ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)は、グリコシル- ホスファチジルイノシトール(GPI)結合を特異的に開裂する酵素である。

【００４０】ヒヨコ胚毛様体神経節ニューロン(E8)を単離し、上述のように播いた。ニュー
ロンを、I)100 mU PIPLC、またはII)100 mU PIPLC + 2 ng/ml TGFβと共に、或
いはIII)酵素なしで、１時間37℃でインキュベートし、続いて、成長因子を加え
た。生存ニューロンの数を、24時間後に測定した。

【００４１】クロム親和性細胞の調製および放出研究：ウシ副腎髄質クロム親和性細胞の単離を、Unsickerら(Neuroscience 5(1980)
1445-1460)に本質的に記載されるように、コラゲナーゼ消化およびパーコール勾
配遠心分離法により行なった。クロム親和性細胞を、25cm²のプラスチック製培養フラスコ(Falcon)に１×10⁶細胞/mlの密度で播き、日常的に少なくとも90-95%
の純度を有した。培養培地は、DME/N1からなり、刺激研究のために、培養培地は
30h後に、予め温められていたI)カルバコール(100μM)またはII)カルバコール(1
00μM)プラスベラパミル(10μM)またはIII)カルシウムイオノフォアA23187(2μM
)を含んでいたかまたはIV)添加剤を含まない刺激用緩衝液と交換し、15分間37℃
でインキュベートされた。刺激用緩衝液を集めた後、HPLCによるカテコールアミ
ン類の測定(Mullerら、J. Neurosci. Methods 4 (1981) 39-52ページ)用のアリコートを取り除き、残りをタンパク質分析のために調製した。

【００４２】細胞系：細胞系B49、3T3およびCOSを、1% PSMとともに10% FSC/DMEM中で成長させ、細胞系BHKを、プラスチック製培養フラスコ内で、DMEM/F 12中で5% FCSおよび1% P
SNとともにセットアップした。

【００４３】これらの異なる細胞系の馴化培地を集め、アリコートを-80℃で貯蔵し、その後、TGFβ活性を測定するためMLEC-バイオアッセイ用に調製した。

【００４４】ウシのクロマフィン粒からのタンパク質ウシのクロマフィン粒の単離は、Winklerらのプロトコール(Handbook of Phys
iology、第７節、第６巻、pp.321-339)に従った。粒を、10 mMリン酸緩衝液(pH
7.2)中で凍結解凍サイクルにより溶解し、可溶性タンパク質を100,000 gで30分間超遠心分離することによって膜から分離した。次に、上清を、3.5 kDaカットオフを有する膜チューブ(Spectropor)を用いて、10 mMリン酸緩衝液、pH 7.2に対して終夜透析した。アリコートを-80℃で貯蔵した。

【００４５】アガロース複合体／ウェスタンブロットクロム親和性細胞からの、添加物を含む又は含まない、1 mlの刺激用緩衝液に
、10 μlの抗体アガロース複合体を添加し、4℃で終夜、混合しながらインキュベートした。ペレットをPBSで洗浄し、続いて、50 μlの電気泳動用サンプル緩衝液中に再懸濁し、2分間煮沸した。サンプルを、12.5% SDS-PAAゲル上での電気
泳動によって分離し、ニトロセルロース膜(Hybond、Amersham)に移した。ニトロ
セルロース膜を、Tris緩衝生理食塩水(TBS、pH 7.3)中3%低脂肪ミルク粉末/0.1%
BSAによりブロックし、一次抗体(0.1% BSA/TBS中、1:200)とともに、その後、ペルオキシダーゼ複合体化二次抗体(0.1% BSA/TBS中、1:2000)とともに、終夜４
℃でインキュベートした。最後に、Amershamの増強化学発光(ECL)検出システムを用いて、膜を発色させた。

【００４６】 TGF-β'sに関するアッセイ TGF-β活性の測定は、ミンク肺上皮細胞(MLEC)(米国、ニューヨーク、ニューヨーク大学のDr. Rifkinの好意により提供)バイオアッセイ(Abeら、Anal. Bioch
em. 216(1994) 276-284)を用いて行なった。トランスフェクトされたMLEC培養物
を、96ウェルのマイクロタイタープレート(Costar)中で、10% FCSおよびゲネチシン(250μg/ml)を含むDMEM(高グルコース)中1.6×10⁴細胞/ウェルの密度でセッ
トアップし、5% CO₂インキュベーター内で37℃で３h付着させた。続いて、培地を、(HClで活性化された)DME/N1中100 μlの供試サンプルで置き換え、5% CO₂イ
ンキュベーター内で終夜37℃でインキュベートした。細胞を、PBSで２回洗浄し、100 μlの溶解用緩衝液(Promega)を用いて2-3h、室温で用いて溶解した。TGF β活性を測定するために、80 μlのライゼートを試験管に移し、100 μlのルシフェラーゼ試薬(Promega)注射により、ルミノメーター(Lumat、ベルトホルド/ド
イツ)を用いて分析した。ルシフェラーゼ活性は、相対的光単位(RLU)として報告
し、全てのアッセイは３重で行なった。

【００４７】統計統計的比較は、MicroCalOriginソフトウェアに含まれる、１方向ANOVAにより行なった。差は、^*P＜0.05、^**P＜0.005、および^***P＜0.0005で、統計的に有意
であると見なした。

【００４８】図２、５および12-14に従う実験のための細胞培養物ニワトリ胚の背根神経節(DRGs)の解離された培養物を、KrieglsteinおよびUns
icker(Dev. Brain. Rees. 93 (1996) 10-17)に詳細に記載されるように、生じさ
せた。簡単に述べると、DRGsを、Ca²⁺-Mg²⁺を含まないハンクス平衡塩類溶液(CM
F)中で切開した。0.08%トリプシン(BioWhittaker)中で15分間インキュベーション後、神経節を、火で仕上げたパスツールピペットを用いて、穏やかな粉砕によ
り解離させた。懸濁液中細胞(ニューロン/非ニューロン比 1:2)を、ポリオルニチン-ラミニンでコートされた96ウェルのマイクロタイタープレート(A/2 Costar
)中に1,200細胞/ウェルの密度で播いた。成長因子を、0.25%ウシ血清アルブミン
、N1添加物(Bottensteinら、Exp. Cell Res. 125(1980) 183-190)および100 U/m
lペニシリンを補足した最終体積50 μlのダルベッコ変法イーグル培地中に、プレーティングの時点で適用した。陽性コントロールとして、神経成長因子(NGF) を、10 ng/mlの飽和濃度で使用した。5% CO₂を含む加湿雰囲気中で、37℃で48時
間インキュベーション後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中2.5%グルタルアルデヒドを用いて、培養物を固定した。ニューロン細胞を、それらの相明度およびニュ
ーライト含有形態によって同定し、位相差顕微鏡を用いて全表面積の30%以内でカウントした。全ての実験は、２つの独立した実験中で、少なくとも３重で行な
った。データは、平均値±SEMで示される。統計学的比較は、スチューデント２重t-検定、ANOVAおよびMicrocalOriginソフトウェアを用いて行なった。差は、^* P＜0.05、^**P＜0.01、および^***P＜0.00１で、統計的に有意であると見なした。

【００４９】インビボでの神経節前ニューロン保護に関するアッセイ副腎髄質摘出を、成長した雄Hanover-Wistarラットに行なった。副腎髄質クロ
ム親和性細胞を神経支配する脊髄中の神経節前ニューロンを、ファストブルーま
たはフルオロゴールド(FG)で逆行性追跡することにより同定した。因子(それぞれ1 μg)を、片側髄質摘出された副腎にインプランテーションする前に、ゲルフ
ォーム(Spongostan、Ferrosan、ソエブルグ(Soeburg)、デンマーク)に浸けた。F
G 標識された神経節前ニューロンの数を、術後４週間に、脊髄セグメントT7-T10
にかけて、長軸切片の完全なシリーズの細胞カウントにより測定した。はっきり
と見える核を含む明るく蛍光を発するニューロンのみを、カウントした。トータ
ル数は、Abercombie式に従い、裂けた核の二重カウントの可能性について校正し
た。偽手術した動物中で非病巣側に生存する副腎髄質への神経節前ニューロンの
数を、100%としてセットした。データは、平均値±SEMで示され、群間差の統計的
有意さは、スチューデントt-検定によって決定された。

【００５０】 In situハイブリダイゼーション In situハイブリダイゼーションを、Arumaeら(J. Cell Biol. 122 (1993) 10
53-1065)に本質的に記載されるように、胸髄のパラフィン切片に対して行なった
。プローブは、ラットGFRα-1、ヌクレオチド294-1039、およびマウスcRet、ヌクレオチド2534-3217から誘導した。ハイブリダイゼーション後、全ての切片を浸漬し、2-3週間露出し、ヘマトキシリンで対比染色し、風乾し、DPX中に包埋し
た。センス配向に関するプローブを用いると、ハイブリダイゼーション・シグナ
ルは、検出されなかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】 E8ヒヨコDRGの培養物における、GDF-5およびNGFの用量応答曲線の比較。データは、３重の培養物による３つの独立した実験からの平均値±SEMとして示される。^*P＜0.05；^**P＜0.01は非治療の陰性コントロール値と有意に異なる。

【図２】図１と同じ実験であるが、(A)BMP-2、(B)BMP-4、(C)BMP-6、(D)BMP-7、(E)BMP
-11および(F)BMP-12が、それぞれの組成物中で使用されることを例外とする。

【図３】連続的希釈範囲でのGDF-5、及び一定濃度2.5 ng/mlのNT-3によるE8 DRGニュー
ロンの48時間の共同処理 (-・-)。比較のために、GDF-5(-△-)並びにNT-3(.... 黒四角...)の連続希釈物が示されている。生存ニューロンは、少なくとも２つの
独立した実験の３重の測定でカウントされた。示された数値は、平均値±SEMである。有意差は、GDF-5プラスNT-3(2.5 ng/ml)後のニューロン数と個々の因子と
の間の比較から誘導された。^*P＜0.05；^**P＜0.01。

【図４】一定濃度20 ng/mlでのGDF-5添加を有し又は有さずに、飽和濃度の様々な栄養因子の存在下に、48時間培養されたE8 DRGニューロンの生存。数値は、３重測定
を有する少なくとも２つの独立した実験の平均値±SEMを示す。^*P＜0.05はNGF単
独で処理したニューロン数との有意差。

【図５】別々に適用された又は上記のBMPsと組合せた、飽和濃度の(A)NGF(10 ng/ml)ま
たは(B)NT-3(10 ng/ml)の存在下に、48時間培養されたE8ヒヨコDRGニューロンの
生存。培養物は、48時間処理した。示された数値は、少なくとも２つの独立した
実験の４重測定の平均値±SEMである。^*P＜0.05はNGFまたはNT-3単独で処理した
ニューロン数との有意差。

【図６】 GDNFおよびTGF-βの相乗作用による、末梢自律および感覚ニューロンの生存。
A、ヒヨコ毛様体神経節(CG)ニューロン；B、GDNFおよびTGF-βの組合せ作用に関
する用量応答曲線；C、ヒヨコ背根神経節(DRG)ニューロン；D、ヒヨコ交感神経節(SG)ニューロン。それぞれの神経節からのニューロンを、８日胚(E8)で単離し
、上記の条件下で成長させた。ニューロンを、血清含有培地(灰色棒；A、C、D) または血清を含まない培地(白色棒；A、B、C、D)で維持した。10%ウマ血清の存在下では、飽和濃度のGDNFを添加すると、３つのニューロン・ポピュレーション
それぞれの生存度を、血清を含まない培養培地に神経栄養因子をそれぞれ(CGニューロンにはCNTF、DRGニューロンおよびSGニューロンにはNGF)添加して得られるものと同一のレベルで増進した。TGF-β1、-β2、および-β3に対する中和抗体を添加すると、ニューロン生存度を血清単独添加で見られるレベルまで低下さ
せ、GDNFがその生存増進効果を達成するには血清中にTGF-βを必要とすることを
示した。血清を含まない条件では、GDNFおよびTGF-β1は、単独で添加されるとき、実質的にいかなる生存増進効果も有さなかった。しかしながら、最適濃度で
組合せられるとき、両方の因子は、確立された神経栄養因子CNTFおよびNGFそれぞれで達成されたものと同一のレベルで、ニューロン生存を可能にした。

【図７】ヒヨコE10(A,B,C)およびE12(D,E,F)胚のそれぞれの神経節からのニューロンを
用いて、図１のように行なわれたアッセイ。データは、GDNF/TGF-β相乗作用が、発生のより進んだ段階でのニューロンにも適用されることを示す。

【図８】ラット胚中脳ドパミン作動性ニューロン(E14)に対するGDNFの生存増進効果は、TGF-βの存在に依存する。解離培養物を、GDNF(10 ng/ml)により、抗TGF-β1 、-β2、-β3(10 μg/ml)の存在下にGDNFにより、TGF-β3(2 ng/ml)により、或いは、いかなる成長因子の添加もなしに(コントロール)、培養物中で８日間処理
した。ドパミン作動性ニューロンの数を、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫応
答性ニューロンの数をカウントすることにより測定した。

【図９】 GDNFは、その神経栄養効果を確立するために、インビボでTGF-βを必要とする
。副腎髄質(a)に対する逆向性標識した神経節前(IML)ニューロンは、cRet(b)およびGFRα-1(c)mRNAを発現する。副腎髄質摘出によって生じる神経節前ニューロ
ンの細胞死は、GDNFの副腎キャビティ(d)への置換によって、充分に防止される。中和TGF-β抗体の共同適用は、GDNF(e)によるニューロン保護を、有意に低下する。LF、脊髄の側索。棒＝100μm。

【図１０】 GDNFおよびTGF-βの相乗作用に横たわるメカニズム。(A)ワートマンニン(Wort
mannin)は、IP3キナーゼの特異的阻害剤であり、ヒヨコ毛様体神経節ニューロン
のGDNF/TGF-βに仲介される生存を廃し、IP3キナーゼが、GDNFおよびTGF-βの組
合せ作用のシグナル伝達における本質的なメディエイターであることを示す。(B
)PIPLCは、原形質膜からGPI固着サイトカイン・レセプターを遊離し、予測されたように、CNTFがシグナル伝達のためにGPI固着αレセプターを使用するので、ヒヨコ毛様体神経節ニューロンに対してCNTFの生存増進効果を妨げる。PIPLCは、FGF-2の生存増進効果を妨げず、FGF-2はシグナル伝達のためにαレセプターを
使用しない。単離された毛様体ニューロンをPIPLCで処理すると、GDNFおよびTGF
-βの生存増進効果を有意に低下させ、GDNFシグナル伝達におけるGPI連結GDNFα
レセプターの本質的役割と一致する。単離された毛様体ニューロンにPIPLCおよびTGF-β両方を添加すると、GDNFαレセプターを保護し、GDNFおよびTGF-βの相
乗的神経栄養作用が、GDNFαレセプターに対するTGF-βの保護作用によるかもし
れないことを示す。

【図１１】クロマフィン粒の可溶性タンパク質は、ヒヨコ毛様体神経節ニューロンの生存
を、飽和濃度のCNTF(10 ng/ml)で達成されるものと同一のレベルで増進する。GD
NF(20 μg/ml)またはTGF-βsであるTGF-β1、-β2および-β3(10 μg/ml)のいず
れかに対する中和抗体を添加すると、VPの増進効果を有意に低下する。両方の抗
体を添加すると、VP(0,5 ng/ml)の神経栄養効果を完全に廃し、GDNFおよびTGF- βが、VP中に含まれる、長い間探し求められてきた毛様体神経栄養性タンパク質
であることを示す。

【図１２】中脳ニューロン培養物中で、内因性TGF-βを中和する効果。TGF-β1/-β2/-β
3(10 μg/ml)に対する中和抗体の存在下または非存在下での、FGF-2(10 ng/ml) または培地のみ(コントロール)で処理された培養物中での８日後の、中脳培養物
(E14/DIV8)の生存TH免疫応答性ニューロンの数。データは、平均値±SEM(n=3)で
示され、P値は、コントロール培養物と比較して、増加した生存度に関して^***P ＜0.001であり、抗体処理後の低下した生存度に関しては+P＜0.05または+++P＜0
.001である。

【図１３】内因性TGF-βを中和すると、ヒヨコCGニューロンに対するCNTFおよびFGF-2の生存増進効果を低下する。培養物を、表示濃度でのCNTF(A)またはFGF-2(B)による単独処理(-●-)、或いは、TGF-β1、-β2、-β3(1μg/ml)に対する中和抗体と
組合せて処理した(-黒四角-)。データは、平均値±SEM(n=3)で示される。P値は、^*P＜0.05であり；成長因子単独処理と比較して、成長因子プラス抗TGF-βの組
合せでは低下した生存に関して^**P＜0.01である。

【図１４】 TGF-βは、CNTF、NGFおよびNT-3に対するヒヨコCGニューロンの応答性を誘導する。培養物を、TGF-βの非存在下または存在下(2.5 ng/ml)に、(A)CNTF(5また
は0.3 ng/ml)、オンコスタチンM、LIF、IL-6(10 ng/mlで)、または(B)NGF、NT-3
、NT-4で処理した。データは、CNTFプラトー生存度のパーセントとして、平均値
±SEM(n=3)で示される。^*P＜0.05であり、対応する単一因子単独処理と比較して
、TGF-β3との組合せで増加した生存に関して^**P＜0.01である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月１４日（２０００．３．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パウリスタミヒャエルドイツ国デー−69181 ライメンヴィンゲルトシュトラーセ 10 (72)発明者ベヒトルドロルフドイツ国デー−69126 ハイデルベルクカール−ツックメイヤー−シュトラーセ 21 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 DA01 DB59 DB60 ZA022 ZA152 ZA162 ZA202

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生物学的に活性な量の少なくとも２種のサイトカインまたは
機能的に活性なその誘導体またはその一部ならびに必要に応じて薬学的に許容さ
れる担体および／または希釈剤を含み、前記サイトカインの少なくとも１種がBM
P、GDF、TGF-βまたはGDNFである、神経栄養活性を有する薬学的組成物。
【請求項２】サイトカインがGDF、GDNF、TGF、アクチビンA、BMP、BDNF、
NGF、NT、EGF、EGF、CNTFおよびFGFからなる群から選択される、請求項１に記載
の薬学的組成物。
【請求項３】 GDF-5およびNGFを含む、請求項１または２に記載の薬学的組
成物。
【請求項４】 GDF-5およびNT-3を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】 GDNFおよびTGF-βを含む、請求項１または２に記載の薬学的
組成物。
【請求項６】 GDF-5およびGDNFを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項７】 TGF-βおよびFGF-2を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項８】 TGF-βおよびCNTFを含む、請求項１または２に記載の薬学的
組成物。
【請求項９】 TGF-βおよびNT-3を含む、請求項１または２に記載の薬学的
組成物。
【請求項１０】 TGF-βおよびNGFを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】 BMP-4およびNGFを含む、請求項１または２に記載の薬学的
組成物。
【請求項１２】 BMP-12およびNGFを含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】 BMP-2およびNT-3を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】 BMP-7およびNT-3を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】 BMP-12およびNT-3を含む、請求項１または２に記載の薬学
的組成物。
【請求項１６】哺乳動物における末梢および／または中枢神経系(CNS)の疾患を治療するための、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
【請求項１７】中枢神経系(CNS)疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、ALSまたは他の痴呆、中枢神経系の神経変性疾患および糖尿病を含む末梢ニユーロパシー、シスプラチニウム(cisplatinium)または他の遺伝性もしくは後天
性末梢神経疾患である、請求項１６に記載の薬学的組成物。