JP2001517221A - 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 この発明は、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列と、プロモーター／調節配列、第IX因子をコードし且つ5'および3'非翻訳領域を伴う単離DNAと、転写停止シグナルとを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターを含んでなる組成物、およびその使用方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 血友病の治療のための遺伝子治療で使用する方法と組成物 発明の分野 本発明は、血流中のタンパク質の欠損が関与する疾患の治療のための遺伝子治 療法である。 発明の背景 血液凝固の過程には、カスケード様式に作用して凝血塊を形成させる血液凝固 タンパク質として知られている一連のタンパク質が関与する。血友病は、血液凝 固因子をコードする遺伝子が、そのコードされるタンパク質がカスケード過程で 正常に機能しないような突然変異を有する、ヒトおよび他の哺乳動物の疾患であ る。具体的には、遺伝性疾患である血友病Ｂは、血液凝固タンパク質である第IX 因子（F.IX）をコードする遺伝子の突然変異を特徴とする。F.IXは、Highらが総 説を書いている（1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（High とRoberts編，Marcel Dekker，Inc.）中の"Factor IX"）。 アデノウイルスベクターは遺伝子治療で周知であり、該ウイルスを免疫抑制剤 とともに投与した時、免疫不全マウスまたは免疫適格マウスで高レベルのイヌ第 IX因子を発現するのに使用されている。免疫抑制剤の非存在下でアデノウイルス ベクターを免疫適格マウスに投与すると、これらのベクターは強い炎症性および 細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答を誘導（Daiら、1995，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 92:1401-1405）し、これが治療の有効な作用を無効にする。さらに、複 製欠陥アデノウイルスを筋肉内注入すると、トランスジーンが自己タンパク質（ すなわち宿主タンパク質）をコードするなら強い宿主免疫応答が回避されるよう にトランスジーンが長期発現を提供することを示唆する報告がある（Tripathyら 、1996，Nature Med．2:545-550;Yangら、1996，Hum．Mol．Genet．5:1703-1712 ）。すなわち遺伝子治療の分野において、骨格筋へアデノウイルスベクターを直 接注入した後の選択されたトランスジーンのin vitro発現で大きな進歩があるが 、これらの免疫学的研究を考慮すると、アデノウイルスベクターの使用は遺伝 子治療の最適の治療法ではないかもしれない。 レトロウイルスベクターもまた、血友病Ｂ治療のモデルとして実験的に使用さ れている。しかしこれらのベクターからのF.IXの発現レベルはあまりにも低く、 治療的価値がないと報告されている（Kayら、1993，Science 262:117-119）。 マウスの筋肉に注入されたプラスミドDNAは、エリスロポエチン（Epo）を直接 発現させることが実証されている（Tripathyら、1996，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 93:10876-10880）が、この遺伝子治療法は治療効果を示すためには明らか に、循環中で（Epoに比較して）比較的高レベルが必要とされるF.IXのような遺 伝子産物の発現には充分に効率的ではない。 アデノ関連ウイルス（adeno-associated virus;AAV）は、筋肉への遺伝子の送 達のためのアデノウイルスの代替ビヒクルである。組換えAAV（rAAV）はウイル スタンパク質をコードする配列を含有せず、宿主細胞の染色体DNAに組み込まれ る能力を有する（Carter，1992，Curr．Opin．Biotech．3:533-539;Skulimowski ら、1995，Method Mol．Genet．7:7-12）。野生型AAVまたはヘルパーアデノウイ ルスにより大きく汚染されていない純粋なrAAVの産生を促進する産生法および精 製法が、現在利用できる（Skulimowskiら、1995、前述；Fisherら、1996，J．Vi rol．70:520-532；Samulskiら、1989，J．Virol．63:3822-3828）。本明細書に 記載したように、哺乳動物へのアデノウイルスの投与は前記の免疫学的問題を伴 う。 肝細胞や気道上皮細胞についてはヘルパーウイルスの非存在下ではrAAVによる in vivo形質導入の効率は低い（Fisher，1996、前述）が、ニューロン（Kaplitt ら、1994，Nature Genet．8:148-154）や骨格筋繊維（Xiaoら、J．Virol．70:80 98-8108）のような有糸分裂後の特定の細胞は、このベクターで有効に形質導入 される。1.5年までのlacZの安定な発現が報告されている（Xiaoら、前述）。ア デノウイルスベクターとは対照的に、免疫適格動物にrAAVを筋肉内注入しても、 形質導入された筋肉繊維に対してCTL応答は起こらず、細胞内lacZ遺伝子産物に 対する循環抗体も存在しない。 rAAVの筋肉内注入後の分泌タンパク質Epoの発現がKesslerら（1996，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 93:14082-14087）で報告されている。しかし報告されたタ ンパク質発現のレベルは、F.IXが仲介する治療効果に必要なレベルより１桁〜２ 桁低かった。 血友病の現在の治療法では、出血が起きると必ず凝固因子濃縮製剤を静脈内に 注入する。この治療法は面倒で不便でかつ高価である。濃縮製剤だけで平均的患 者は毎年約100,000ドル支払う。さらに濃縮製剤は間欠的に患者に投与されるだ けであるため、タイミングよく投与治療しないと致命的となる生死に関わる出血 の危険が残る。 治療効果が達成されるように、血友病を有する哺乳動物特に血友病を有するヒ トにF.IXを投与する方法に対する長年のかつ深刻なニーズがある。本発明はこの ニーズを満たすものである。 発明の概要 本発明は、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列(ade no-associated virus inverted terminal repeat)、プロモーター／調節配列と 、第IX因子をコードし且つ5'および3'非翻訳領域を伴う単離DNAと、転写停止シ グナルとを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターを含んでなる組成物に関 する。 １つの態様において本組成物は、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部をさら に含む。好適には第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbの 長さである。 別の態様において、第IX因子をコードする単離DNAは、そのコードされた第IX 因子をコラーゲンIVに結合できなくする突然変異を有する。 １つの実施形態において突然変異DNA中の突然変異は、成熟F.IXの初めから５ 番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする。 さらに別の態様において本組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含む 別の態様においてプロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即時型初 期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレ アチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される。さらに 転写停止シグナルはSV40転写停止シグナルである。 また本発明には、少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配 列と、プロモーター／調節配列と、第IX因子をコードし且つ5'および3'非翻訳領 域を伴う単離DNAと、転写停止シグナルとを含有するベクター、ならびに、使用 説明書を含むキットが包含される。 本発明はまた、哺乳動物の血友病の治療法を含む。この方法は、少なくとも２ つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列、プロモーター／調節配列、第 IX因子をコードし且つ5'非翻訳領域および3'非翻訳領域を伴う単離DNA、および 転写停止シグナルを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターと、薬剤学的に 許容される担体とを含んでなる組成物を哺乳動物の筋肉組織に投与することを含 む。 １つの態様において組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少なく とも２つの部位に組成物を注入することにより投与される。 好適な実施形態において組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少 なくとも６つの部位に組成物を注入することにより投与される。 別の態様において組換えアデノウイルスベクターは、哺乳動物１匹当たり約１ ×10⁸〜約５×10¹⁶のウイルスベクターゲノムの用量で投与される。 好適な実施形態において哺乳動物はヒトであり、第IX因子はヒト第IX因子であ る。 さらに別の態様においてプロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即 時型初期プロモーター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋 肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される。 別の態様において本組成物はさらに、第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部を 含む。好ましくは第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbで ある。 さらに別の態様において第IX因子をコードする単離DNAは、そのコードされた 第IX因子がコラーゲンIVに結合できなくなるようにする突然変異を含む。 好適な実施形態において突然変異されたDNA中の突然変異は、成熟F.IXの初め から５番目のアミノ酸位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする。 さらに好ましくは哺乳動物はヒトである。 図面の簡単な説明 図１は、マウスにAAV-hF.IXを筋肉内注入した後の時間の関数としての、実験 マウスの血漿中のヒトF.IX（hF.IX）の濃度の分析を示す一連のグラフである。 各線は個々のマウスを示す。 図1Aは、２×10¹¹のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM） 注入後のC57BL/6マウスを示す。 図1Bは、２×10¹¹のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM） 注入後のRaglマウスを示す。マウスo-oは、注入の５週間後に外傷性瀉血後に死 んだ。 図1Cは、１×10¹⁰のウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝４）の筋肉内（IM） 注入後のRaglマウスを示す。 図２は、２×10¹¹のAAV-hF.IXウイルスベクターゲノム／動物（ｎ＝３）の筋 肉内（IM）注入後のC57BL/6マウス中の循環（血漿）抗hF.IX抗体の量の経時変化 試験を示すグラフである。抗体のレベルは、標準物質としてマウスモノクローナ ル抗hF.IX（Boehringer Mannheim）を使用してELISAで測定した。各線は個々の 動物を示す。 図３は、種々のウイルスベクターを筋肉内（IM）注入した後のC57BL/6マウス の血漿中のhF.IXに特異的な抗体の存在を示すウェスタンブロットの図である。 レーン１は、AAV-lacZを筋肉内（IM）注入した動物であり、注入後18日目に採血 した血清を使用した。レーン２は、組換えアデノウイルス−hF.IX(Walterら、１ 996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:3056-3061）を筋肉内（IM）注入した動物 であり、注入後20日目に採血した血清を使用した。レーン３〜10は、AAV-hF.IX を筋肉内（IM）注入した動物である。レーン３〜７は、注入後11、18、32、54、 および60日目に分析した同じ動物である。レーン８〜10は、注入後18日目に分析 した異なる動物である。 図４は、C57BL/6マウスの前脛骨筋の免疫蛍光染色（hF.IXに対する抗体を使用 した。）を示す一連の図である。パネルＡは注入しなかった筋肉を示す。パネル Ｂ、Ｃ、およびＤは、AAV-hF.IXを注入してから３ケ月後に染色した筋肉を示す 。注入部位当たり3.3×10¹⁰のウイルスベクターゲノムをインキュベートした。 倍率は200×である。 図５は、AAV-hF.IXを注入したC57BL/6マウスの前脛骨筋の筋肉切片の免疫蛍光 染色を示す一連の図である。分析は、注入後３月目に行なった。筋肉切片を、hF .IXに特異的なFITC結合抗体とコラーゲンIVに対するローダミン結合抗体複合体 を用いて同時染色した。パネルＡは、筋肉繊維と間質腔(interstitlal space)中 のhF.IXの存在を示すFITC（緑）の蛍光を表す。パネルＢは、筋肉繊維の細胞外 マトリックス中のコラーゲンIVを示すローダミン（赤）の蛍光を表す。パネルＣ は、両方の蛍光標識の同時励起を示す。hF.IXとコラーゲンIVは筋肉組織中で同 じスペースをしめることを示す、間質腔中の黄色シグナルの存在に注意されたい 。倍率は400×である。 図６は、AAV-hF.IXを注入した筋肉から単離したDNAの分析である。 図6Aは、２つのAAV-hF.IXベクターゲノムの頭尾（head-to-tail）縦列繰り返 しを示す図である。AAV逆方向末端繰り返し（ITR）配列、CMVプロモーター／エ ンハンサー（CMV）、コーディング配列を含有するヒトF.IX cDNA、および228塩 基対(bp)の3'非翻訳領域、イントロンＩの1.4kb部分、サルウイルス40ポリアデ ニル化シグナル（SV40）、および２つのゲノムの接合(junction)部位（Ｊ）を図 に示す。イントロンＩからの1.2kbのEcoRV-EcoRI断片とCMVプロモーターから得 られた0.7kbのBglII断片を、サザンブロットハイブリダイゼーションのプローブ として選択した。プライマー005（正方向プライマー）、013および017（ともに 逆方向プライマー）の結合部位の相対的位置も示す。 図6Bは、AAV-hF.IX注入の６週間後のRaglマウスの筋肉から単離されたゲノムD NAのサザンブロットハイブリダイゼーションの図である。hF.IXのイントロンＩ からの放射性標識EcoRV-EcoRI断片をプローブとして使用した。レーン１は、pAA V-F.IXプラスミドDNAである。レーン２と３は、AAV-hF.IXを注入したマウスから 単離したDNAである。レーン４と５は、非注入動物から単離したＤＮＡである。 レーン１、２および４は、EcoRVで消化したDNAである。レーン３と５は未消化DN Aである。レーン２〜５にレーン当たり15μgのゲノムDNAを加えた。DNAを１％ア ガロースゲルで分離した後ナイロン膜上に移した（Schleicher and Schuell）。 端のサイズマーカーは、１kb DNAラダー（ladder)断片を示す。 図6Cは、PCRにより増幅したAAV-hF.IXの頭尾（head-to-tail）コンカテマー（ concatamer）の接合部（junction）断片のサザンブロットハイブリダイゼーショ ンの図である。プライマー対005-013（奇数レーン）またはプライマー対005-017 （偶数レーン）を使用してゲノムDNAから増幅したPCR産物を示す。レーン１と２ は注入しなかった動物である。レーン３〜６は、AAV-hF.IXを筋肉内（IM）注入 したC57BL/6マウスである。レーン７〜10はAAV-hF.IXを筋肉（IM）内注入したRa glマウスである。PCR産物は、前脛骨筋（レーン３、４、７および８）または大 腿四頭筋（レーン５、６、９および10）のDNAから得られたDNAから得られた。レ ーン11と12は、頭尾（head-to-tail）配置で組み込まれたAAV-lacZの少なくとも ２つのモノマーコピーを含有する細胞株10-3.AV5から得られたDNAから得られたP CR産物である。PCR産物を２％アガロースゲルで分離後ナイロン膜にブロットし た。CMVプロモーターから得られた0.7kb BglII断片をプローブとして使用した。 注入して６〜８週間後にゲノム筋肉DNAを単離した。 図７は、AAV-cF.IX（すなわち、AAVベクター中のイヌF.IX）の略図である。 図８は、それぞれイヌB45に８×10¹¹のおよびイヌB46に１×10¹³のAAV-cF.IX を筋肉内注入した後の時間の関数としての全血液凝固時間（WBCT）を示す一連の グラフである。血液試料が60分以内に完全に凝固しなかったなら、WBCTは65分と した。星印（^*）は部分的凝固を示す。未治療の血友病ＢのイヌのWBCTは＞60分 （点線）であり、正常なイヌでは６〜８分（破線）の範囲である。縦の矢印は、 出血に対して正常な血漿で治療したことを示す。 図９は、イヌB45とB46から得られた血漿試料の活性化部分トロンボプラスチン 時間（aPTT）による凝固時間を示す一連のグラフである。正常のイヌ：13〜18秒 （破線）。未治療の血友病Ｂのイヌ：50〜80秒（点線）。縦の矢印は出血に対し て正常な血漿で治療したことを示す。 図10は、血友病ＢのイヌB45とイヌB46にそれぞれ８×10¹¹のAAV-cF.IXまたは １×10¹³のAAV-cF.IXを筋肉内注入した後のイヌ第IX因子の血漿レベルを示す一 連のグラフである。イヌ第IX因子濃度はELISAにより測定した。縦の矢印は出血 に対して正常な血漿で治療したことを示す。第９週〜12週のB46での高値は、部 分的に正常な血漿による治療のためである。 図11は、イヌB45の骨格筋中のcF.IXの免疫蛍光染色を示す一連の図である。パ ネルＡ：注入しなかった筋肉。パネルＢ〜Ｄ：第７週に５×10¹⁰のAAV-cF.IXの １つの注入部位から得られた前脛骨筋。 図12は、AAV-mF.IX（すなわち、AAVベクター中のマウスF.IX）の略図である。 図13は、mF.IXに特異的なマウス血漿中の抗体の検出のためのウェスタンブロ ットの図である。mF.IXをニトロセルロース膜に移し、種々のマウス血漿試料の 存在下でインキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG とともにインキュベートし、ECLで検出した。レーン１−Ad-hF.IXの静脈内注入 後にhF.IXに特異的な抗体が生じた血友病Ｂマウスからの、CD-1バックグランド に対して出血して得られた血漿。これらの抗体はマウス第IX因子と交差反応した 。レーン２〜10−AAV-mF.IXを筋肉内注入したマウスから得られた血漿。レーン ２〜４−BALB/cマウス。レーン５〜７−C57BL/6マウス。レーン８〜10−CD-1マ ウス。すべての試料は、注入の60日後にマウスから得られた。 発明の詳細な説明 本発明は、遺伝子送達ビヒクルとしてrAAVベクターを使用して哺乳動物の筋肉 組織にhF.IXを送達すると、筋肉組織中で治療レベルのhF.IXが長期間発現される という知見に基づく。発現されたタンパク質は、長期間哺乳動物の血漿中に存在 し、従って血友病Ｂを有する哺乳動物にとって非常に大きな治療的利益がある。 本発明は、血友病Ｂの治療のためのF.IXの送達のみに限定されない。むしろ本 発明は、他の血液凝固因子をコードするAAVベクターを包含し、これは本発明の 方法を使用して、血友病の治療のために血友病を有する哺乳動物の細胞に送達さ れる。すなわち本発明は、血友病Ａの治療のために哺乳動物への第VIII因子の送 達（Tuddenham，1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（High とRoberts編、Marcel Dekker，Inc.）中の"Factor VIII"）；第VII因子欠損の治 療のための第VII因子の送達（Petersenら、1995，Molecular Basis of Thrombos is and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker，Inc.）中の"Factor VI I"）；第Ｘ因子欠損の治療のための第Ｘ因子の送達(Watzkeら、1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker，Inc .）中の"Factor X"）；第XI因子欠損の治療のための第XI因子の送達（Fukikawa ら、1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編 、Marcel Dekker，Inc.）中の"Factor XI"）；第XIII因子欠損の治療のための第 XIII因子の送達（Laiら、1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasi s（HighとRoberts編、Marcel Dekker，Inc.）中の"Factor XIII"）；プロテイン Ｃ欠損の治療のためのプロテインＣの送達（Suzukiら、1995，Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis（HighとRoberts編、Marcel Dekker，Inc.）中の "Protein C"）を包含する。 哺乳動物の細胞への上記タンパク質のそれぞれの送達は、まず所望のタンパク 質をコードするDNAを含むAAVベクターを作成し、次にこのベクターを哺乳動物に 投与することにより行われる。すなわち本発明は、第XI因子、第VIII因子、第Ｘ 因子、第VII因子、第XI因子、第XIII因子、またはプロテインＣのいずれか１つ をコードするDNAを含むAAVベクターを含む。本発明があれば、これらのタンパク 質をコードするDNAを含むAAVベクターの作成は、当業者には明らかであろう。 さらに本発明は、血液凝固タンパク質をコードする単離されたDNAを含むrAAV ベクターのみに限定するように解されるべきではない。むしろ本発明は、他のタ ンパク質をコードし、好ましくは哺乳動物の筋肉組織に投与されるDNAを含むrAA Vベクターを含む。すなわち本発明は、哺乳動物の他の病状の治療に有用な遺伝 子産物をコードするDNAを含むと解されるべきである。このようなDNAおよび関連 する病状は以下のものを含むがこれらに限定されない：グリコーゲン貯蔵欠陥タ イプ1Aに関連する、グルコース-6-ホスファターゼをコードするDNA；ペプク（Pe pck）欠損に関連する、ホスホエノールピルベート−カルボキシキナーゼをコー ドするDNA；ガラクトース血症に関連する、ガラクトース-1-ホスフェートウリジ ルトランスフェラーゼをコードするDNA；フェニルケトン尿症に関連する、フェ ニルアラニンヒドロキシラーゼをコードするDNA；メープルシロップ尿症に関連 する、分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼをコードするDNA；チロシン血症タイ プＩに関連する、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼをコードするDNA；メ チルマロン酸血症に関連する、メチルマロニル-CoAムターゼをコードするDNA； 中鎖アセチルCoA欠損に関連する、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼをコードする DNA；オルニチントランスカルバミラーゼ欠損に関連する、オルニチントランス カルバミラーゼをコードするDNA；シトルリン血症に関連する、アルギニノコハ ク酸シンセターゼをコードするDNA；家族性高コレステロール血症に関連する、 低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするDNA；クリグラー-ナジャー (Crigler-Najjar)病に関連する、UDP-グルコウロノシルトランスフェラーゼをコ ードするDNA；重症複合免疫不全症に関連する、アデノシンデアミナーゼをコー ドするDNA；通風とレッシュ-ナイハン（Lesch-Nyan）症候群に関連する、ヒポキ サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするDNA；ビオチ ニダーゼ欠損に関連する、ビオチニダーゼをコードするDNA；ゴーシェ病に関連 する、β−グルコセレブロシダーゼをコードするDNA；スライ(Sly)症候群に関連 する、β−グルクロニダーゼをコードするDNA；ツェルヴェーガー(Zellweger)症 候群に関連する、ペルオキシソーム膜タンパク質70kDaをコードするDNA；急性間 欠性ポルフィリン症に関連する、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼをコードす るDNA；α-1アンチトリプシン欠損（肺気腫）の治療のためのα₁アンチトリプシ ンをコードするDNA；サラセミアまたは腎不全による貧血の治療のためのエリス ロポエチンをコードするDNA；および、糖尿病の治療のためのインスリンをコー ドするDNA。このようなDNAおよび関連疾患は、Kayら（1994，T.I.G．10:253-257 ）とParker Ponder（1996，Gene Transfer in Cardiovascular Biology:Experim ental Approaches and Therapeutic Implications”（Keith March編）中の"Gen e Therapy for Blood Protein Deficiencies"）の総説がある。 明瞭にするためにかつ最良の実施形態の要件を満たすために、以後の説明は哺 乳動物の筋肉組織に送達する好適なタンパク質として第IX因子を例示する。 本発明はまた、本発明のrAAVベクターをコードするhF.IXを哺乳動物の筋肉組 織の複数の部位に注入すると、哺乳動物でhF.IXの高レベルの長期の発現が起き 、哺乳動物に対して治療上の利益を提供するという知見に基づく。 本発明はさらに、hF.IXは哺乳動物の筋肉組織中の間質腔のコラーゲンIVに結 合するという追加の知見に基づく。本発明のrAAVベクターを介して哺乳動物の筋 肉組織に突然変異型のhF.IX（この突然変異型はコラーゲンIVに結合しない）を 送達することも、血友病を有する哺乳動物に対して治療上の利益を提供する。 本発明は、血友病の治療に使用するためのF.IXまたはその生物活性のある断片 をコードするDNAを含むrAAVベクターを含む。 本発明はまた、血友病Ｂを有する哺乳動物好ましくはヒトの治療法を含む。こ の方法は、本発明のrAAVベクターを哺乳動物の筋肉組織に投与することを含む。 本発明のrAAVベクターは、いくつかの基本的なDNA要素を含む。これらのDNA要 素は、少なくとも２コピーのAAV ITR配列、プロモーター／エンハンサー要素、 転写停止シグナル、F.IXまたはその生物活性を有する断片をコードするDNAをフ ランキングするいずれの必要な5'または3'非翻訳領域、を含む。本発明のrAAVベ クターはまたイントロンIの一部を含む。また、本発明のrAAVベクターは随時、 コラーゲンへの突然変異F.IXの結合が実質的に低下しているかまたは完全に排除 されるように、突然変異を含有するF.IXをコードするDNAを含む。これらの要素 を詳細に説明する。 ベクターは、多くの異なるタイプの細胞において異種遺伝子の高レベル発現を 駆動させることができる無差別プロモーターを含むプロモーター／調節配列を含 む。このようなプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）即時型初期プロ モーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルスプロモーター／エンハンサー 配列などを含むがこれらに限定されない。本発明のrAAVベクター中のプロモータ ー／調節配列は、好ましくはCMV即時型初期プロモーター／エンハンサーである 。しかし異種遺伝子の発現を駆動させるのに使用されるプロモーター配列は、誘 導性プロモーター（例えばステロイド誘導性プロモーターがあるがこれらに限定 されない）、組織特異的プロモーター（例えば、筋肉組織特異的な骨格筋α−ア クチンプロモーター、および筋肉クレアチンキナーゼプロモーター／エンハンサ ーなどがあるが、これらに限定されない）などでもよい。 本明細書において用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配 列に作動可能なように結合された遺伝子の発現に必要なDNA配列を意味する。あ る場合には、この配列はコアプロモーター配列でもよく、他の場合はこの配列は また、エンハンサー配列および誘導性／抑制性にまたは組織特異的に遺伝子の発 現に必要な他の調節要素を含んでもよい。 本明細書において２つのDNAが「作動可能なように結合」しているという説明 は、１本鎖または２本鎖DNAが２つのDNAのそれぞれからなり、このDNA配列の少 なくとも１つがもう一方の配列により特徴付けられる生理学的作用を示すことが できるように、DNA内で２つのDNAが配置されていることを意味する。 本発明のrAAVベクターはまた転写停止シグナルを含む。転写停止シグナルは本 発明のベクター中に含まれてよいが、好ましくは転写停止シグナルはSV40転写停 止シグナルである。 このベクターはまたイントロンＩの一部を含む。hF.IXの配列についてイント ロンＩは、PvuII部位（ヌクレオチド番号1098）までのイントロンの5'末端と、 ヌクレオチド番号5882のPvuII部位で始まりエキソン２との接合部まで伸びるイ ントロンの3'末端とを含むDNAの断片である（Yoshitakeら、1985，Biochemistry 24:3736-3750；Kurachiら、1995，J．Biol．Chem．270:5276-5281；Jallatら、 1990，EMBO J．9:3295-3301）。 F.IXをコードするプラスミドまたはウイルスベクター中にイントロン要素を含 めることはF.IXの発現を、イントロン要素の非存在下でのプラスミドまたはウイ ルス要素でのF.IXの発現と比較して、２〜10倍増強させる（Kurachiら、1995、 前述）。AAVベクターは典型的には、一般に約４kb〜約4.8kbである規定のサイズ 範囲を有するDNAの挿入体を受け入れ、F.IX遺伝子のコーディング領域は約1.5kb を含む。すなわち、AAVベクターについて許容されるDNAの必要な長さを達成する ために挿入体断片中に追加のDNAを含むことが必要である。F.IXイントロンＩ断 片はこの要件を満たし、AAVベクターゲノムのバックグランドに位置するF.IXの 発現を増強する。すなわち、本発明は本発明のrAAVベクター中にイントロンＩ配 列を含めることに限定されず、イントロンＩの一部の代わりに他のイントロンま たは他のDNA断片配列を包含すると解されるべきである。 本明細書で使用される用語「イントロンの一部」とは、約0.3kb〜約1.7kbの長 さのヌクレオチドを有するイントロンＩの領域を意味し、この領域はイントロン Ｉの一部の非存在下でのF.IXの発現と比較すると、プラスミドまたはウイルスベ クター鋳型上でF.IXの発現を少なくとも約1.5倍上昇させることを意味する。好 ましくは本発明において有用なイントロンＩの一部は、約1.4kbの長さである。 本発明のrAAVベクターはまた、hF.IX DNA配列をフランキングするDNAの5'およ び3'非翻訳領域を含む。実験例のセクションに例示するrAAV-hF.IXベクターにお いて、hF.IX配列をフランキングする5'非翻訳領域は以下の通りである：F.IX配 列の5'末端で、配列GGTACCを有するKpnI部位まで3'末端でCMVプロモーターエン ハンサー配列が続く。この領域のすぐ下流に、配列AGATCTCCACC［配列番号１］ を有する短いポリリンカー配列が続き、これ自身はすぐ下流に、アミノ酸番号-4 6で始まるhF.IX配列（このコドンはYoshitakeら（1985、前述）の番号付けに従 うATGである）が続く。 実験の詳細のセクションで例示されるrAAV-hF.IXベクターにおいて、hF.IX配 列をフランキングする3'非翻訳領域は以下の通りである：翻訳停止シグナルの末 端で、SV40ポリＡシグナル配列にスプライシングされるhF.IXの3'非翻訳領域の 最初の228ヌクレオチドが存在する。 特にhF.IX以外のタンパク質をコードするDNAが本発明のrAAVベクターで使用さ れる時、DNAの他の5'および3'非翻訳領域がhF.IXの場合に記載したものの代わり に使用される。 本発明の好適なrAAVベクターはまた、F.IXまたは生物活性のあるF.IX断片をコ ードする単離されたDNAを含む。F.IXをコードするDNAは好ましくはhF.IXである が、本発明は既知または未知のすべての啼乳動物F.IX配列を含むと解されるべき である。F.IX配列の例は以下の論文に記載されている：Yoshitakeら、1985、前 述；Kurachiら、1995、前述；Jallatら、1990、前述；Kurachiら、1982、Proc． Natl．Acad．Sci．USA 79:6461-6464；Jayeら、1983，Nucl．Acids Res．11:232 5-2335；Ansonら、1984、EMBO J．3:1053-1060：Wuら、1990，Gene 86:275-278 ；Evansら、1989、Blood 74:207-212；Pendurthiら、1992，Thromb．Res．65:17 7-186；Sakarら、1990，Genomics 1990，6:133-143；およびKatayamaら、1979， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76:4990-4994。すなわち本発明は、F.IXは本明細 書に記載のhF.IXと実質的に同様に機能する、ヒト以外の晴乳動物からのF.IX遺 伝子も含むと解されるべきである。好ましくはF.IXをコードする遺伝子を含むヌ クレオチド配列は、本明細書に記載されその配列はYoshitakeら（1985、前述） が提供しているhF.IXをコードする遺伝子と、約50％相同であり、より好ましく は約70％相同であり、さらに好ましくは約80％相同であり、最も好ましくは約90 ％相同である。 用語「コードするDNA」は、所望のタンパク質をコードするDNA配列と実際のコ ーディング配列に伴う5'または3'非翻訳領域を含む。 さらに本発明は、本発明の遺伝子治療法において、コードされる変異体または 突然変異体を完全長hF.IXとして治療上有効にするか、または完全長hF.IXよりさ らに治療上有効にする、野生型hF.IX DNA配列の天然に存在する変異体または組 換え法で得られた突然変異体を含む。 例えば本明細書に記載の実験から明らかなように、コラーゲンIVは、rAAVベク ターを介して哺乳動物の筋肉組織に導入されるhF.IXを捕捉するのに役立つ。従 ってこのように導入されたhF.IXの一部は、コラーゲンIVにより筋肉組織中の間 質腔中に保持されるため、血液凝固に参加するためには利用不能である。コード されるタンパク質がコラーゲンIVに結合しないように、hF.IX DNAの配列に突然 変異を導入することは可能である。そのような突然変異体は本発明の遺伝子治療 法において、筋肉組織の間質腔中に捕捉されない型のhF.IXをコードする点で、 血友病の治療に有用である。好ましくは成熟タンパク質の最初から５番目のアミ ノ酸位置にあるリジンの代わりにアミノ酸アラニンを含むhF.IXタンパク質をコ ードする突然変異体hF.IX遺伝子は、コラーゲンIVに対するhF.IXの結合を低下ま たは排除するために、本発明のrAAVベクターで有用である。 本発明はまた、hF.IX生物活性を保持するhF.IXの変異体をコードするDNAを含 む。そのような変異体（すなわち、hF.IXのタンパク質またはポリペプチドの類 似体）は、タンパク質またはポリペプチドが、本明細書に記載の方法での使用の 適合性を向上させる追加の性質を有するように、組換えDNA技術を使用して修飾 されているかまたは修飾されてよいタンパク質またはポリペプチド（例えば、血 漿中のタンパク質に安定性の向上とタンパク質の比活性の向上を与える変異体が あるが、これらに限定されない）を含む。類似体は、保存的アミノ酸配列の差異 もしくは配列に影響を与えない修飾、またはその両方により、天然に存在するタ ンパク質またはペプチドとは異なってもよい。例えば、タンパク質またはペプチ ドの１次配列を変化させるが通常はその機能を変化させない保存的アミノ酸の変 化を作成してもよい。保存的アミノ酸置換は、典型的には以下の群内の置換を含 む： グリシン、アラニン； バリン、イソロイシン、ロイシン； アスパラギン酸、グルタミン酸； アスパラギン、グルタミン； セリン、スレオニン； リジン、アルギニン； フェニルアラニン、チロシン。 好ましくはhF.IX類似体のアミノ酸配列は、Yoshitakeら（1985、前述）が記載 したhF.IXのアミノ酸配列と、約70％相同であり、より好ましくは約80％相同で あり、さらに好ましくは約90％相同であり、さらに好ましくは約95％、最も好ま しくは約99％相同である。 本明細書で使用される「相同」とは、２つのポリマー分子の間、例えば２つの 核酸分子（例えば、２つのDNA分子または２つのRNA分子）の間、または２つのポ リペプチド分子の間の、サブユニット配列の類似性を意味する。２つの分子の両 方のサブユニット位置が同じモノマーサブユニットで占められる時（例えば、も し２つのDNA分子のそれぞれの位置がアデニンで占められるなら）、これらはそ の位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、一致するかまたは相同的な位 置の数の直接の関数であり、例えば２つの化合物の配列中の位置の半分（例えば 、10サブユニットの長さのポリマー中の５つの位置）が相同であるなら、２つの 配列は50％相同であり、位置の90％（例えば、10のうち９）が一致しているかま たは相同であるなら、２つの配列は90％の相同性を有する。例えば、DNA配列3'A TTGCC5'と3'TATGCG5'は50％相同である。 F.IXの突然変異体または変異体型の作成のために、任意の数の方法が使用され る。例えばからコラーゲンIVに結合しないhF.IXの突然変異体型の作成は、任意 の分子生物学のマニュアル、例えばSambrookら（1989，Molecular Cloning:A La boratory Manual，Cold Spring Harbor，NY）に記載の通常の組換えDNA技術を 使用して、プラスミド鋳型上のF.IX遺伝子に欠失、置換または挿入突然変異を導 入することにより行われる。こうして作成した突然変異体F.IXを発現させ、得ら れるタンパク質を、例えばCheungら（1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:11 068-11073）が記載したようなコラーゲンIV結合アッセイを用いて、コラーゲンI Vへの結合能力を評価する。次にコラーゲンIVに結合しない突然変異タンパク質 を、本明細書で定義したようにF.IX生物活性について試験する。コラーゲンIVに 結合しないがF.IX生物活性を保持する突然変異F.IXタンパク質をコードするDNA は、本発明のrAAVベクターでの使用に適している。 ボリペプチドをコードするDNA配列を変化させてタンパク質またはポリペプチ ド中にアミノ酸の変化を導入する方法は、当該分野で周知であり、Sambrookら（ 1989、前述）にも記載されている。 本明細書において「単離核酸」とは、天然に存在する状態でフランキングする 配列から分離された核酸配列、セグメント、または断片［例えば通常その断片に 隣接する配列（例えば、天然のゲノム中の断片に隣接する配列）から除去されて いるDNA断片］を意味する。この用語はまた、核酸を自然に伴う他の成分（例え ば、細胞中に自然に伴うRNAまたはDNAまたはタンパク質）から実質的に精製され た核酸にも当てはまる。この用語は従って、例えばベクター中に；自律的に複製 するプラスミドまたはウイルス中に；または原核生物または真核生物のゲノムDN A中に取り込まれているか；または他の配列から独立して別の分子として（例え ば、PCRまたは制限酵素消化により産生されるcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断 片として）存在する、組換えDNAを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列 をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。 本明細書において「生物活性のあるF.IX」とは、血液凝固測定法で血液の凝固 を仲介することができるF.IXタンパク質を意味する。血液凝固測定法は当該分野 で周知であり、例えばWalterら（1996、前述）およびHathawayとGoodnight（199 3，Disorders of Hemostasis and Thrombosis:A Clinical Guide，pp.21-29のLa boratory Measurement of Hemostasis and Thrombosis）に記載されている。 本明細書においてF.IXについて「治療効果」とは、出血後の哺乳動物の血液の 凝固を意味する。 本発明は、実験例で例示される特定のrAAVベクターに限定されず、本発明は任 意の適当なAAVベクター（例えば、AAV-1、AAV-3，AAV-4，およびAAV-6などに基 づくベクターを含むが、これらに限定されない）を含む。 また本発明には、血液凝固測定法で血液の凝固を仲介する治療効果を提供する のに有効な量で、血友病を有する哺乳動物を治療する方法も含まれる。この方法 は、哺乳動物にF.IXを含むrAAVベクターを投与することを含む。好ましくは哺乳 動物はヒトであり、ｒＡＡＶベクターは、アミノ酸番号５（成熟タンパク質の最 初から付けた番号）はリジンの代わりにアラニンであるような突然変異を随時含 むhF.IXを含む。 本発明によれば、血友病を有する哺乳動物の治療にはいくつかの方法があるこ とが知見された。本発明の１つの方法において、F.IXを含むrAAVベクターの調製 物が、投与当たり１つの部位で動物の筋肉組織に注入され、別の方法では、rAAV の調製物が動物の筋肉組織に同時にまたは数時間かけて複数の筋肉組織部位に注 入される。後者の場合、方法がウイルスベクターゲノムを同時に複数注入を含む 時、筋肉組織の異なる領域がrAAVベクターを同時に受けるように複数の送達注入 装置が使用される。 典型的には、１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は 約１×10⁸〜約５×10¹⁶の範囲である。好ましくは１回の注入で投与されるウイ ルスベクターゲノム数／哺乳動物は約１×10¹⁰〜約１×10¹⁵の範囲であり、より 好ましくは１回の注入で投与されるウイルスベクターゲノム数／哺乳動物は約５ ×10¹¹〜約５×10¹⁵の範囲であり、最も好ましくは１回の注入で投与されるウイ ルスベクターゲノム数／哺乳動物は約５×10¹³〜約５×10¹⁴の範囲である。 本発明の方法が、複数の部位への同時注入または数時間（例えば、約１時間未 満から約２または３時間まで）にわたって異なる筋肉部位への注入を含むいくつ かの複数の部位への注入を含む時、投与されるウイルスベクターゲノムの総数は 、単一部位注入法で記載のものと同じである。 単一部位への注入で本発明のrAAVベクターを投与するには、ウイルスの懸濁液 が直接筋肉内に注入される。 複数の部位への注入のためには、針が哺乳動物の筋肉組織に挿入される。実質 的に連続的に針のトラックに沿って、１回の注入で一連の筋肉内部位が注入され るようにベクターは注入され、従って各部位は前の部位よりさらに筋肉組織内の 位置にある。各注入は、針のトラックに沿って約５〜約30部位を標的とし、患者 は全部で約50回の注入を受ける。従ってこの方法は、麻酔下で行うことが好まし い鍼療法に似ている。 rAAVの複数の部位への注入はまた、結核感染の検出に通常使用されるような複 数注入装置を使用して行われる。 哺乳動物への投与のために、F.IXを含むrAAVベクターは薬剤学的に許容される 担体（例えば、pH約7.8のヘペス緩衝化食塩水）に懸濁される。他の有用な薬剤 学的に許容される担体には、グリセロール、水、食塩水、エタノール、および他 の薬剤学的に許容される塩（例えばリン酸塩、および有機酸の塩）があるが、こ れらに限定されない。これらのおよび他の薬剤学的に許容される担体の例は、Re mington's Pharmaceutical Science（1991，Mack Publicaion Co.，New Jersey ）に記載されている。 本発明のrAAVベクターはまた、例えば乾燥した塩調製物中のベクターの凍結乾 燥調製物、ベクター／塩組成物の懸濁のための無菌水、およびベクターの懸濁と その哺乳動物への投与のための説明書とを含むキットの形で提供されてもよい。 以下の実験例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は例示目 的で提供されるのみであり、特に明示しない場合は決して本発明を限定するもの ではない。すなわち本発明は、決して以下の実施例に限定されるものではなく、 本明細書の教示の結果として明らかになるすべての変形も包含するものと解され るべきである。実施例１：組換えアデノ関連ウイルスの筋肉内注入後のヒト血液凝固第IX因子の 安定な遺伝子導入と発現 本実施例に記載の実験は以下のように要約される。ヒトF.IXを発現する組換え AAV（rAAV）ベクターの筋肉内注入が治療的レベルのヒトF.IXの発現を指令でき るかどうかを調べるために、以下の実験を行なった。hF.IXを発現する高力価（1 0¹²〜10¹³ベクターゲノム／ml）のrAAVを調製し、精製し、C57BL/6マウスとRagl マウスの後ろ足の筋肉内に注入した。免疫適格C57B/6マウスで、注入の３ヶ月後 に採取した筋肉の免疫蛍光染色はhF.IXタンパク質の存在を証明し、筋肉DNAのPC R解析はAAV DNAについて陽性であったが、マウス血漿中にhF.IXは検出されなか った。さらにこれらのマウスがhF.IXに対する循環抗体を産生することが観察さ れた。リコンビナーゼ活性化遺伝子の突然変異を有し従って機能的Ｂ細胞とＴ細 胞が欠如したRaglでの追跡実験で、筋肉のDNA解析により同様の結果が見られた が、これらのマウスは血漿内に治療的レベル（200〜350ng/ml）のhF.IXも証明し た。hF.IX発現の経時変化は、数週間にわたってレベルが徐々に上昇した後プラ トー（最初の注入後約６ヶ月安定である）に達することを証明している。他の実 験では、筋肉繊維間の間質腔でhF.IXとコラーゲンIVの同時局在が観察された。 コラーゲンIVはhF.IX結合タンパク質として同定された。すなわちこの知見は、h F.IXの免疫蛍光染色の異常パターンを説明している。これらの実験は、筋肉内注 入後の治療的レベルのhF.IXの安定な発現を指令するのにrAAVを使用することが でき、これは血友病Ｂを有する患者の治療のための実用的な方策であることを示 している。 この実施例で提示した実験で使用した材料と方法と以下に記載する。rAAV の産生と精製 Fisherら（1996、前述）が記載したように、F.IXシスプラスミド（pAAV-FIX） とトランス作用性プラスミドpAAV/Ad（Skulimowskiら、1995、前述）を、E1欠失 アデノウイルスを感染させたヒト胚腎（293）細胞中に同時トランスフェクショ ンさせて、組換えAAVを作成した。pAAV-FIXはpsub201（Skulimowskiら、1995、 前述）から得られ、CMVプロモーター／エンハンサー、イントロンＩの1.4kb断片 を含むヒトF.IXコード配列（Kurachiら、1995、前述）、およびSV40ポリアデニ ル化シグナルを、AAV ITR配列にフランキングされて含有する。AAV repとcap遺 伝子機能は、pAAV/Adによりトランスで供給された。E1欠失アデノウイルスは、 ヘルパーウイルスによるrAAVストックの混入の可能性の同定を促進するために、 lacZまたはアルカリ性ホスファターゼレポーター遺伝子を含有する。トランスフ ェクションの48時間後超音波処理して細胞を溶解し、放出されたウイルス粒子を 、Fisherら（1996、前述）が記載したようにCsCl密度勾配遠心分離を４回行って 精製した。 AAV-hF.IX粒子の密度は、1.37〜1.40g/mlであった。精製したAAV-hF.IXの力価 を、CMVプロモーターまたはイントロンＩ配列に特異的なプローブを使用してス ロットブロットハイブリダイゼーションにより測定した。対照は、既知濃度のpA AV-hF.IXプラスミドDNAの標準物質を含む。in vitroで細胞を形質導入するAAV-h F.IXの能力を、増殖しているHeLa細胞を形質導入し、感染後36時間目の培養上清 中のhF.IXの濃度をhF.IXに特異的なELISA（Walterら、1996、前述）で測定して 確認した。AAV-hF.IX（10¹²〜10¹³ゲノム/ml）を、５％グリセロールを含有する ヘペス緩衝食塩水（pH7.8）中で-79℃で保存した。 Fisherら（1996、前述）が記載したように293細胞の形質導入後にアルカリ性 ホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼについて染色して解析すると、精製 したAAV-hF.IXにはいつも、検出可能な混入アデノウイルスはなかった。野生型A AVは、AAV-hF.IXの10⁹ゲノム当たり＜１感染単位で検出された。 野生型AAVの測定は以下のように行なった：チャンバースライド上で増殖させ た293細胞をアデノウイルスと精製AAV-hF.IXのアリコートとで同時感染させた。 感染後24時間目に免疫蛍光染色のために細胞を固定した。AAVキャプシドタンパ ク質に対するマウスモノクローナル抗体（American Research Products，Belmon t，MA）を１次抗体とし、１：40希釈の抗マウスIgG（DAKO Corporation、Carpin teria，CA）を２次抗体とした。動物実験 rAAVの筋肉内注入用に選択したマウス株は、C57BL/6（Charles Rlver Laborat ories，Wilmington，MA）、ならびにB6、129およびRagl（Jackson Laboratories ，Bar Harbor，Maine）であった。雌のマウス（４〜６週齢）を、ケタミン（70m g/kg）とキシラジン（10mg/kg）を腹腔内注入して麻酔し、後肢を縦に１cm切開 した。AAV-hF.IX（ヘペス緩衝化食塩水（pH7.8）中２×10¹¹または１×10¹⁰ウイ ルスベクターゲノム／動物）を、ハミルトン（Hamilton）シリンジを使用して各 脚の前脛骨筋（25μl）と四頭筋（50μl）に注入した。4-0 Vicryl縫合で切開部 分を閉じた。７日間隔で眼窩後神経叢（retro-orbital plexus）から血液試料を ミクロヘマトクリット毛管に集め、血漿をELISAによりhF.IXについて測定した。 免疫蛍光染色とDNA解析のために、選択した時点で動物を屠殺し、注入した筋肉 組織と注入していない筋肉組織を切り出した。組織をO.C.T.包埋化合物（Miles Corporation，Elkart，Indiana）中に入れ、液体窒素で冷却したイソペンタンで ７秒間スナップ凍結し、直ちに液体窒素に移した。hF.IX の測定 マウス血漿中のヒトF.IX抗原を、Walterら（1996、前述）が記載したようにEL ISAにより評価した。このELISAはマウスF.IXとは交差反応しなかった。すべての 試料は二重測定で評価した。注入したマウスの筋肉から得られたタンパク質抽出 物を、ロイペプチン（0.5mg/ml）を含有するPBS中で筋肉を砕いて次に超音波処 理して調製した。細胞破片を微量遠心分離により除去し、タンパク質抽出物の１ ：10希釈物をELISAでhF.IXについて測定した。AAV-lacZ注入筋肉から得られた抽 出物を陰性対照として使用した。タンパク質濃度をBIORADプロテインアッセイ（ Bio-Rad，Hercules，CA）で測定した。組織切片の免疫蛍光染色 筋肉組織の凍結切片（６μg）を、PBS（pH7.4）中の３％パラホルムアルデヒ ド中で15分固定し、PBSで５分リンスし、メタノールで10分インキュベートし、P BSで３回洗浄し、次にPBS／３％BSAで１時間ブロックした。 組織切片を、PBS/１％BSAで１：1000希釈した親和性精製したヤギ抗ヒトF.IX 抗体（Affinity Biologicals，Hamilton，Ontario，Canada）の存在下で一晩イ ンキュベートした。PBS/１％BSAで10分間の洗浄を３回行なった後、２次抗体を ９０分間適用した。この抗体の調製物は、PBS/１％BSAで１：200希釈したFITC− 結合ウサギ抗ヤギIgG（DAKO Corporation、Carpinteria，CA）を含有した。PBS/ １％BSAでさらに３回洗浄後、切片を蒸留水でリンスし、空気乾燥し、Fluoromou nt Gマウントメディウム（Fisher Scientific）でマウントした。すべてのインキュ ベーション工程は室温で行なったが、１次抗体とのインキュベーションは４℃で 行なった。ウサギ抗ヒトコラーゲンIVを１次抗体（Chemicon，Temecula，CA）と して１：500希釈で、そしてFITC−結合抗ウサギIgGを２次抗体として、切片を染 色した時に同じプロトコールを使用した。 同時局在化試験のために、FITCに結合したヤギ抗hF.IX抗体（Affinity Biolog icals）を、抗コラーゲンIV抗体と同時に適用した。ローダミン結合抗ウサギIgG （Chemicon）を使用して、コラーゲンIV抗体複合体を検出した。Nikon FXA顕微 鏡を使用して蛍光顕微鏡観察を行なった。循環抗hF.IX抗体についての試験 AAV-hF.IXを筋肉内注入したC57BL/6マウスの血漿試料を、ELISAを使用してhF. IXに対する抗体の存在について試験した。マイクロタイタープレートをhF.IX（0 .1M NaHCO₃中１μg/ml、pH9.2）でコーティングした。希釈した血漿試料（１：1 6）を二重測定で適用し、hF.IXに反応性である抗体を、西洋ワサビペルオキシダ ーゼ−結合抗マウスIgG（Zymed，San Francisco，CA）を１：2000希釈で使用し て検出した。緩衝液条件は既に記載されている通りである（Walterら、1996、前 述）。抗hF.IX抗体のレベルは、最終濃度１μg/mlに希釈したマウス抗hF.IXモノ クローナル抗体（Boehringer Mannheim）の吸光度値の比較により推定した。 抗hF.IX抗体の存在はまた、ウェスタンブロット解析により評価した。これら はDaiら（1995、前述）が記載したように行なったが、西洋ワサビペルオキシダ ーゼ結合ヤギ抗マウスIgG抗体（Boehringer-Mannheim）を２次抗体として使用し 、増強化学発光（ECL）試薬（Amersham，MA）とのhF.IX抗体複合体の検出を促進 した。マウス血漿の試料は１：500希釈した。DNA 解析 Sambrookら（1989、前述）に記載のように、注入した筋肉組織からゲノムDNA を単離した。rAAV縦列繰り返し配列の頭尾接合部（head-to-tail junction）を 増幅するためにPCR反応を行なった。正方向プライマー005（5'-ATAAGCTGCAATAAA CAAGT-3'［配列番号２］はSV40ポリアデニル化シグナル（塩基対8014〜8033位） にアニーリングし、逆方向プライマー013（5'-CATGGTAATAGCGATGACTA-3'［配列 番号３］）と017（5'-GCTCTGCTTATATAGACCTC-3'［配列番号４］）は、CMVプロモ ーター（塩基対4625〜4606位と4828〜4809位）にアニーリングする。1.5mM MgCl₂ と0.5μMのプライマー対005/013または005/017を含む総反応量100μl中で100ng のゲノムDNAを使用して、PCR反応を行なった。初期の変性工程（94℃で４分）後 、以下のプロフィール：すなわち94℃で１分変性、52℃で１分アニーリング、お よび72℃で90秒伸長（最終サイクルの間は10分）を35サイクル行なった。PCR産 物を、T/Aクローニングキット（Invitrogen，San Diego，CA）を使用してDNA配 列解析のためにクローン化した。CMVプロモーター（PCR断片とのハイブリダイゼ ーション用）またはAAV-hF.IX中に存在するようなhF.IXのイントロンＩ（マウス のゲノムDNAとのハイブリダイゼーション用）に特異的な³²Ｐ−dCTPランダムプ ライム標識プローブを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーションを行な った。 この実施例に示した実験の結果を説明する。免疫適格マウスでのhF.IXの発現 in vivo実験のために選択した組換えAAVベクターは、CMV極早期遺伝子プロモ ーター／エンハンサーとSV40転写停止シグナルの制御下でヒトF.IX cDNA（イン トロンＩの一部を含有する）を含有する。この発現カセットはAAV ITR配列でフ ランキングされ、AAVタンパク質コード配列を完全に欠如する。 免疫適格C57BL/6マウスにAAV-hF.IXを筋肉内注入した後、hF.IXは、注入した 動物の血漿中に一時的に検出されたかまたは全く検出されなかった（図1A）。同 じ血漿試料をhF.IXに特異的な抗体について試験した時、すべての注入動物で注 入後１１日目に開始して強い抗体応答が観察された（図２と３）。実験の期間中 、高レベルの循環抗体が持続した。 注入後１ヶ月目に屠殺した動物の注入した筋肉（前脛骨筋と四頭筋）からのタ ンパク質抽出物は、1.8〜2.1ngのhF.IX／mg組織(40〜50ng hF.IX／mgタンパク質 ）の存在を示した。この知見（すなわち、タンパク質抽出物についてELISAで証 明された筋肉組織中のhF.IXの存在）は、組織切片についての免疫蛍光試験によ り確認された。図４のパネルＢ〜Ｄは、注入後３ヶ月目のC57BL/6マウスの筋 肉繊維中のヒトF.IXの発現を示す。hF.IXは筋肉繊維自体に存在するのみでなく 、それが蓄積すると思われる繊維の間の間質腔にも存在することに注意されたい 。 筋肉組織中のhF.IXの上記間質染色パターンは、ヒトコラーゲンIVに特異的な ポリクローナル抗体を使用して同じ組織で見られたものと同じであった（図５、 パネルＢ）。hF.IXとコラーゲンIVの抗体染色の同時局在は、２つの異なる蛍光 標識物を使用する同時染色実験で確認された（図５、パネルＣ）。コラーゲンIV はin vitroでhF.IXに結合することが報告されている（Cheungら、1996、前述） 。第IX因子は注入していない筋肉では検出されず（図４、パネルＡ）、AAV-lacZ を注入した筋肉でも検出されなかった。 上記の組織切片でもヘマトキシリン−エオシン染色で解析した切片でも、組換 えアデノウイルスを注入した骨格筋について記載したような、炎症または広範な 組織傷害は観察されなかった。免疫不全マウスにおけるhF.IXの発現 C57BL/6マウスについて上述した方法を使用して、Raglの筋肉組織にAAV-hF.IX を送達した。これらのマウスは、リコンビナーゼ活性化遺伝子１の突然変異につ いてホモ接合性である。従ってRaglマウスは、機能的に重症複合免疫不全症（SC ID）マウスと同等であり、成熟Ｂ細胞やＴ細胞を産生しない。 Raglマウス１匹当たり２×10¹¹ウイルスベクターゲノムの用量により、マウス 血漿中でhF.IXの安定な発現が得られた（図1B）。注入の２週目まずELISAにより ヒトF.IXが検出され、以後徐々に上昇した。200〜350ng hF.IX/mlマウス血漿の 用量で注入後５〜７週目に、血漿レベルはプラトーに達した。このレベルは実験 の期間（これは注入後４ヶ月まで延長された）中維持された。全部で１×10¹⁰ウ イルスベクターゲノムを注入すると、hF.IXの発現は２×10¹¹のゲノムを注入後 に観察されたものより３〜４倍低かった。しかしより低い用量を使用しても、あ る動物では治療レベル（＞100ng/ml）が達成された（図1C）。これらの結果は、 より低い用量のAAV-hF.IXを動物に投与して治療効果を達成することが可能であ る、という事実を確立している。さらにこの結果は、ウイルスのある閾値用量で 、あらゆる所与の注入部位がウイルスで飽和され、閾値レベルより上の量の ウイルスを注入しても、血漿中の循環hF.IXの量は比例して増加することはない ことを示唆する。従って血漿中の循環hF.IXの量を増加させるためには、異なる 筋肉の部位に少量のウイルスを複数回投与することが好ましい。骨格筋中に導入されたDNAの解析 注入した筋肉組織から得られたゲノムDNAを、注入の６〜８週間後に単離した 。組織中に導入したベクターDNAの存在は、DNAをEcoRVで消化（これは、完全な1 .4kbイントロンＩ配列を含有するベクター構築物から1.8kbの断片を放出する） して証明した。イントロンＩに特異的なプローブはこの断片にハイブリダイズし た（図6B、レーン２、３）が、注入しなかったマウスから得られたマウスDNAと は交差ハイブリダイズしなかった（レーン４、５）。消化しなかったDNA（図6B 、レーン３）は、高分子量DNA中でハイブリダイゼーションシグナルを示した。 さらに形質導入した細胞（図4A）中に存在する組換えAAVの頭尾コンカテマーの 接合部配列を増幅するために設計したPCRプライマーは、AAV-hF.IX形質導入組織 （免疫不全および免疫適格動物の前脛骨筋と四頭筋）から単離した筋肉DNA中の これらの配列をうまく増幅した。 CMVプロモーター／エンハンサー配列に特異的なプローブを使用するサザンブ ロットハイブリダイゼーションにより、このPCR産物を視覚化した（図6C、レー ン３〜10）。プライマー対005-013は1.0kb以下の断片を増幅し、プライマー対00 5-017は1.2kb以下の断片を増幅した。予測したようにこれらのPCR反応は、前記 サイズの明確なバンドを産生しなかったが、最大のサィズを有する一連の増幅産 物を産生した。この結果は、これらの縦列繰り返し配列中に存在するAAVゲノム の不正確な結合により予測できた（McLaughlinら、1988，J．Virol．62:1963-19 73）。この不正確な結合は、クローン化したPCR産物のDNA配列決定から確認され るように、ジャンクション部位でのITR配列の種々の欠失のために生じる。 本明細書に示したデータは、血友病Ｂを有する患者の遺伝子治療プロトコール の開発についていくつかの意昧を有する。まず本明細書に記載の実験で得られた hF.IXの発現レベルは、ヒトで治療効果を達成するのに充分であり、産生され得 るrAAVの量によってのみ限定される。第２にこれらのデータから、単一部位への 注入より複数の筋肉内部位への注入が好ましいことは明らかである。筋肉組織は 豊富にあるため、これは、AAVベクターを使用して血友病の患者を治療するため の障害とはならない。 本明細書に記載のhF.IXの発現の経時変化は、hF.IXを発現するアデノウイルス ベクターを使用した時観察されるものとは非常に異なる。後者の場合、ほとんど 瞬的に治療法レベルのhF.IXが達成される（Walterら、1996、前述；Kayら、1994 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2353-2357）。しかしこのアプローチの免疫 学的結果は好ましくない。AAV-hF.IXの場合、数週間にわたって血漿hF.IXレベル が徐々に上昇することは、患者が筋肉内AAVベクター治療近辺の極初期にはhF.IX 濃縮物の使用を続けることが好ましいことを示す。これは治療の障害にはならな い。外から投与したhF.IXのt1/2は約12時間であり、このため血漿hF.IXレベルは 、トランスジーンの発現の結果として上昇する前にベースラインに戻る。さらに クロススピーシズの境界（cross-species boundary）を超えないなら、筋肉組織 中のrAAV導入したトランスジーンの発現は長期間続く（Kesslerら、1996、前述 ）。これらのすべての理由のために、血友病Ｂを有する患者にhF.IXを発現するr AAVベクターを投与することは、この疾患の治療の実現可能な方策である。 また、上記以外にhF.IXがコラーゲンIVと同時局在するという観察結果は、血 友病Ｂを有する患者の治療にとって重要な意昧を有する。この知見は、F.IXで見 られる染色パターンに関するのみでなく、循環中への筋肉細胞合成F.IXの輸送効 率が低いという従来報告されている知見を説明しているようであるために興味深 い。間質腔中のコラーゲンIVがhF.IXの高親和性結合部位になるなら、この領域 は実際に筋肉中で合成されたhF.IXの「シンク」として機能するかも知れない。 しかしコラーゲンIVによる間質腔中のhF.IXの捕捉は明らかに、Raglマウスでの 実験が証明するように、遺伝子治療に対して超えられない障害ではない。さらに 前記したように、hF.IXをコラーゲンIVに結合可能にする突然変異を含むhF.IXを コードするAAV-hF.IXベクターを作成することは可能であり、こうしてこの潜在 的な欠点を克服することができる。実施例２：血友病Ｂを有するイヌでの試験 本実施例に示す実験は以下のように要約される。 これはモデル研究に基づくと、タンパク質を不安定にすると思われるF.IX遺伝 子の触媒ドメイン中の点突然変異を有するイヌは、重症の血友病Ｂを有する（Ev ansら、1989、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:10095-10099）。３匹のそのよ うなイヌに、イヌF.IX（cF.IX）遺伝子を有するAAV-cF.IXを筋肉内注入した。イ ヌB45に８×10¹¹のAAV-cF.IXを投与すると、F.IXの血漿レベルがちょうど検出の 閾値になった（約１〜３ngイヌF.IX/ml血漿）。ベクター投与後種々の時点で、 全血凝固時間（WBCT）は一時的に短くなった。注入の16週後に開始して、WBCTの 持続性の部分的な補正が観察され、非常に低レベルの血漿cF.IXが少なくとも６ ヶ月続くことが観察された。生検した筋肉から得られた切片の免疫蛍光染色を行 うと、形質導入した筋肉繊維中のcF.IXの発現が観察された。ウェスタンブロッ ト解析、ELISA、または凝固インヒビタースクリーニングを行っても、cF.IXに特 異的な抗体の産生の証拠は得られなかった。イヌB46に１×10¹³のAAV-cF.IXを筋 肉内注入すると、cF.IXの血漿レベルが約17ng cF.IX／mlとなり、これは注入後 ９週目に観察された。WBCTの部分的修正はまず注入後２週目に観察され、以後安 定であった。正常な血漿による治療がない場合の最も短いWBCT（16分）は８週目 に測定された。凝固時間の改善はaPTTアッセイによって確認され、注入後７週目 に低下は明らかであった。ここでも、cF.IXに特異的な抗体の産生の証拠はなか った。止血パラメータの改善にもかかわらず、今日までに達成されたcF.IXのレ ベルは正常な場合の＜１％であり、これらの治療されたイヌが出血を経験したこ とは驚くべきことではない。増加した用量のF.IXをイヌに投与すると治療的効果 が達成されるであろう。実際最近イヌB48に７×10¹³のAAV cF．IXを筋肉内注入 したが、まだプラトーレベルに達していない。このイヌは、cF.IXに対して非阻 害性抗体を産生した。この抗体はまず注入の14日後に検出され、注入の42日後に 消失した。抗体の消失と一致して、WBCTは15〜20分の範囲まで短くなり、これは 以後45日間維持された（すなわち、合計90日間の観察）。すべてのイヌは現在試 験中である。Ａ．AAVベクター中のイヌF.IXの筋肉内投与 本実施例に示す実験で使用した材料と方法を説明する。ウイルスベクター 図７に略図で示すようにAAV-cF.IXを作成した。このベクターは、以下の発現 カセットをフランキングするAAV逆方向末端繰り返し配列（ITR）を含有する：サ イトメガロウイルス極早期エンハンサー／プロモーター（P[CMV]）、CMVスプラ イスドナー／β-グロビンスプライスアクセプター（βglob）、ヌクレオチド256 5位のEcoRI部位までのcF.IX cDNA、およびヒト成長ホルモンポリアデニル化シグ ナル（hGH）。cF.IX の機能的完全性 ビタミンＫ（6μg/ml培地）の存在下での293細胞の一過性トランスフェクショ ンを使用して、cF.IX構築物が機能性cF.IXの発現と分泌を指令することを証明し た。cF.IXの存在は、トランスフェクション後96時間目の培地で評価し、調整培 地の添加後のF.IX欠損ヒト血漿のaPTT凝固時間の短縮によっても確認された。AA V-cF.IXの異なる調製物を、293細胞により、E1欠失アデノウイルスの存在下また は非存在下で種々の感染多重度で同数のベクターと比較した。産生されたcF.IX の量は、試験した異なる調製物について同様であった。アデノウイルスの非存在 下で感染多重度４×10³でAAV-cF.IXで形質導入した293細胞は、1.2μｇのcF.IX ／ml培地／24時間を産生した。１ウェルあたり９×10⁹のAAV-cF.IXで形質導入し た24ウェルプレート中の分化させたマウスC2C12筋管は、感染後８〜15日目に測 定した時、30〜80ng cF.IX／ml培地／24時間を産生した。血友病Ｂのイヌ イヌの第IX因子遺伝子の触媒性ドメインの点突然変異についてヘミ接合性であ る雄とホモ接合性である雌からなる重症の血友病Ｂを有するイヌのコロニーが、 University of North Carolina（Chapel Hill）で20年以上維持されている（Eva nsら1989、Blood 74:207-212）。これらのイヌの止血パラメータは充分記載され ており、血漿F.IX抗原の欠如、全血凝固時間が＞60分（正常なイヌは６〜８分） 、および50〜80秒の活性化部分トロンボプラスチン時間の延長（正常なイヌは13 〜18秒）を含む。これらのイヌは、再発する自発性の出血を経験している。典型 的には大きな出血は、10ml/kgの正常イヌ血漿の単回静脈内注入によりうまく管 理されているが、たまに出血を制御するために繰り返し注入が必要なこともある 。筋肉内注入 全身麻酔下で雄の血友病Ｂのイヌ（B45とB46）と雌の血友病のイヌB48（すベ て同腹子）に、AAV-cF.IXを経皮注射した。この操作の間、動物には正常イヌ血 漿を投与しなかった。 表１ 血液試料の分析 全血凝固時間（WBCT）は、血漿中のcF.IXについてELISAのように評価した。EL ISAの感度は３ng/mlまでである。cF.IXに特異的な抗体はELISAとウェスタンブロ ットにより測定した。活性化部分トロンボプラスチン時間（aPTT）を測定した。 凝固インヒビタースクリーニングも行なった。治療した血友病のイヌと正常なイ ヌから得られた血漿を等量混合し、37℃で２時間インキュベートした。aPTT凝固 時間が対照より３秒以上長い場合、インヒビターのスクリーニングは陽性とした （正常イヌ血漿はイミダゾール緩衝液とインキュベートし、治療前の血友病イヌ 血漿は正常イヌ血漿とインキュベートした）。AAVベクターに対する中和抗体力 価を評価した。免疫蛍光染色 イヌB45から得られた生検した筋肉を、冷凍バイアル中のOptimal Cutting Tem perature TM(OCT)(Tissue-TeK（登録商標）)OCT4583 Compound（Sakura Finetek ，Torrance CA）中に入れ、液体窒素で冷却した2-メチルブタン中で７〜10秒間 急速凍結し、次に直ちに液体窒素に移し、以後-80℃で保存した。凍結筋肉の凍 結切片を、１次抗体として１：100希釈のウサギ抗cF.IX（Affinity Biologicals ）と２次抗体として１：30希釈のフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結 合ブタ抗ウサギIgG（Dako Corp.）を使用して、本明細書に記載のように染色し た。凍結切片はまた、ヘマトキシリンとエオシン（H & E）染色のための使用し た。ベクター放出（shedding） スワブを採取し、試料を組織培養培地に再懸濁した。スワブ試料は、涙、鼻、 直腸、唾液、および尿である。血清試料も採取した。Centricon-100バイアルを 使用して試料を最終容量200μlに濃縮し、Qiamp血液キット（Qiagen）を使用し てDNAを抽出した。DNAを200μlのTEで溶出し、10μlを、最終容量50μl中のAmpl iTaq PCRキット（Perkin Elmer）を使用してPCR増幅のために使用した。PCRプラ イマーは以下の通りである：上流プライマー、cF.IXのcDNA中の配列に基づく5'- ATA GCA GCT ACA ATC CAG CTA CCA TTC TGC-3'［配列番号５］、および下流プラ イマー、β-グロビンスプライスアクセプターの配列から得られる5'-TGG TAT CC C GTA GTA CAG GAA CAA ACC ACC-3'［配列番号-６］。これらのプライマーによ り増幅したPCR産物は698塩基対であった。95℃で２分間変性後、95℃／60℃／72 ℃でそれぞれ30秒／30秒／１分を40サイクル行い、次に72℃で７分インキュベー トした。PCR産物を、臭化エチジウムの存在下でアガロースゲル電気泳動により 視覚化した。 本明細書に示す実験の結果を以下に説明する。 イヌB45に８×10¹¹のAAV-cF.IXを筋肉内（IM）注入すると、止血パラメータに 一貫性のない影響を与えた。全血凝固時間（WBCT）は変動しており、断続的に約 20分〜＞60分の範囲で変動した（図８）。活性化部分トロンボプラスチン時間（ aPTT）は、３週目の１つの値（これは48秒であった）を除いて50秒より大きか った（図９）。ELISAで評価したcF.IXのレベルは、ベクター注入の３週目から開 始して検出閾値（１〜３ng/ml）であった（図10）。投与の７週後に注入部位の 筋肉生検を行い、特異的免疫蛍光染色によりcF.IXの筋肉内産生を確認した（図1 1）。生検前の出血は、46日と47日に正常のイヌ血漿で治療することによりうま く管理された。注入の16週後に開始して、WBCTの持続性部分的補正が観察された 。 高用量のAAV-cF.IX（１×10¹³）の筋肉内投与後に、イヌB46は止血パラメータ の大幅な改善を示し、これはELISAによるcF.IXの血漿レベルの持続的増加と相関 した。WBCTは、ベクター投与の２週後に開始して絶えず20分より低く、ベクター 注入の12週後に16分の最下点に達した（図８）。活性化部分トロンボプラスチン 時間（aPTT）は７週目までに43秒まで低下し、次に上昇した（図９）。ELISAで 評価した血漿cF.IX抗原濃度は、注入後最初の９週間にかけて増加し、約17ng/ml のレベルに達した（図10）。第10週の間、このイヌは右の肩甲骨領域で出血し、 これは正常イヌ血漿を繰り返し注入することにより解消した。出血後の３週間の より高いcF.IX値は血漿注入による可能性がある（図10）。 イヌB48には最も高い筋肉内用量のAAV-cF.IX（７×10¹³）を投与した。このイ ヌはベクター投与後注入部位から出血し、４日目に正常イヌ血漿を投与した。注 入後４週目（血漿注入により影響されない時点）に入手できたデータは、低下し たWBCT（21.5分）とイヌ第IX因子レベル（15ng/ml）を示した。このイヌはまだ 試験中であり、まだプラトーレベルに達していない。本明細書に記載のように、 このイヌはcF.IXに対する非阻害性抗体を一時的に合成した。 イヌB45とB46は、治療前にAAVキャプシドに特異的な測定可能な中和抗体は示 さなかった。各イヌで、ベクター投与後の７日目に高力価の抗AAV中和抗体（10³ 〜10⁴）が生じ、試験期間中持続した（B45とB46についてそれぞれ17週と８週） 。 イヌB45ではcF.IXに特異的な抗体を検出するための分析（ウェスタンブロッテ ィング、ELISA測定法、および凝固インヒビタースクリーニングを含む）は、第 ７、13、17および20週で陰性であった。高用量イヌB46は、ELISAで測定した時９ 週目までcF.IXに特異的な抗体は検出されなかった。 PCRにより検出したウイルス放出は、イヌB45から得られた１日目の血清、直腸 、および唾液試料と、イヌB46の１日目の血清で陽性であった。得られた他のす ベて試料は、治療前と注入後の＞１日は陰性であった。 表２．筋肉内注入を受けたイヌから得られた結果 正常イヌ血漿で治療後は出血は解消した。 *正常なイヌ：13.5〜17秒。未治療血友病イヌ：50〜80秒。 †AAVベクターと同時に注入した炭素粒子は、連続切片のH & E染色スライドで見 られた。 本実施例に示したデータは、血友病Ｂを有するイヌが、AAV-cF.IXの筋肉内単 回投与後に持続性血漿レベルのcF.IXを合成することができることを証明してい る。長期（＞４ヶ月）の全身のcF.IXレベルは、止血パラメータの中程度の改善 に関連していた。しかし治療したイヌは自発性の出血を経験し、これらのレベル が治療量以下であることを示している。イヌB46でプラトーレベルまでの延長し た経時変化とこれらのイヌにおける用量応答の示唆は、イヌとマウスモデルの間 の類似性を証明している。形質導入したイヌの筋肉により分泌されるF.IXは、WB CTとaPTTの短縮に基づき、生物活性がある。要約すると、血友病Ｂを有するこれ らのイヌでのAAV-cF.IXの筋肉内投与は充分許容される。Ｂ．AAVベクター中のcF.IXの門脈投与 この実施例に示した実験で使用した材料と方法を以下に記載する。ウイルスベクター 通常の分子生物学的技術を使用してAAV-EF1α-cF.IXを作成した。このベクタ ーは、ヒト伸長因子１α遺伝子（EF1α）の2.5kb断片を含有し、これはエンハン サー、プロモーター、第１のエキソンおよび第１のイントロン、ならびにエキソ ン２の非コード領域の一部を含む。EF1αプロモーターを含有するベクターは門 脈投与後にトランスジーン発現の上昇を示すため、EF1αプロモーターを選択し た。EF1αのこの領域は、cF.IX cDNAとヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナ ル（hGH）の上流（1731ntのEcoRI部位まで）に位置する。全発現カセットは、AA V逆方向末端繰り返し配列（ITR）によりフランキングされる。このベクターの機 能的完全性は、293細胞中で産生されるF.IXのELISA解析により証明された。門脈投与 全身麻酔下で血友病イヌＢ44の腹部を無菌手術により開き、門脈に３×10¹²の AAV-EFI-cF.IXの単回注入を行なった。正常イヌ血漿の静脈内投与により、この イヌを手術周辺時期の出血から保護した。イヌに鎮静剤を与え、挿管して全身麻 酔を誘導し、腹部の毛を剃り、準備した。開腹後脾臓を手術フィールドに移した 。脾臓静脈をさがし、静脈の小さい末端の切り目の近くでゆるく縫合した。静脈 に迅速に誘導針を挿入し、次に縫合をゆるめ、門脈分岐の近くの静脈内位置に5F カニューレを通した。止血の確保後、カテーテルバルーンをふくらませ、PBS中 で希釈した約5.0mlのベクターを５分間隔で門脈中に注入した。ベクター注入後 、食塩水5.0mlを注入した。バルーンをしぼませ、カニューレを取り出し、静脈 止血を確保した。次に脾臓を戻し、出血血管を焼灼して手術の傷を閉じた。手術 に充分耐えた動物から抜管した。 筋肉内注入について本明細書に記載したように血液試料を分析した。 本明細書に示した実験の結果を以下に説明する。 循環F.IXの証拠はELISAによって検出されず、動物に注入後４ヶ月まで止血パ ラメータに及ぼす作用は明らかではなかった。 動物にベクターを投与後に急性または慢性の毒性の臨床的症状は明らかではな く、このベクターの血管内注入が充分許容され、おそらく非毒性であることを示 している。インヒビターは検出されなかった。実施例３：AAV-mF.IXの筋肉内注入後のマウス中のインヒビターの欠如 哺乳動物にAAV-hF.IXを筋肉内投与すると、その哺乳動物中でF.IXに対するイ ンヒビターが出現するリスクが伴う。F.IX合成の通常の部位は肝臓である。異所 性発現に基づくアプローチについて当然懸念されることは、生合成により、タン パク質が非機能的または免疫原性（例えば翻訳後プロセシングの変化によって） になるような変化がタンパク質中に生じるかどうかである。この可能性を試験す るために、３つの株の免疫適格マウスの筋肉にAAV-マウスF.IX（mF.IX）を投与 し、自己のトランスジーン産物に対する抗体が生成するかどうかを調べてマウス を評価した。マウスで抗mF.IX抗体（すなわち、インヒビター）が出現しなかっ たことを証明するために、２つの方法を使用した。AAV-mF.IXに対する抗体の存 在は、ウェスタンブロッティングにより評価した。この方法では抗AAV-mF.IX抗 体は検出されなかった。マウスでインヒビターが合成されるかどうかを評価する ために凝固インヒビタースクリーニングを使用し、この試験でも、これらの動物 でインヒビターが合成されないことが確認された。マウス筋肉中でmF.IXが合成 されるとタンパク質が産生され、これは自己タンパク質として免疫系により観察 された。すなわちこのアプローチの使用（すなわち、AAVベクターを使用する筋 肉組織へのF.IXの送達）は、血友病の治療の臨床的に有効な方法である。 この実施例に示した実験で使用される材料と方法を以下に説明する。ウイルスベクター AAV-mF.IX（図12）は、以下の発現カセットをフランキングする２つのAAV逆方 向末端繰り返し配列（ITR）を含有した：サイトメガロウイルス極早期エンハン サー／プロモーター（P[CMV]）、CMVスプライスドナー／β-グロビンスプライス アクセプター（βglob）、2.7kbのマウス第IX因子cDNA、およびヒト成長ホルモ ンポリアデニル化シグナル（hGH）。mF.IX cDNA（Wuら、1990，Gene 86:275-278 ）は、PCRにより導入された多くのエラーを含有した。野生型配列を回復するた めに部位特異的突然変異誘発を使用し、これはDNA配列決定により確認された。 このベクターによりコードされるmF.IXの機能的完全性は、293細胞株84-31を形 質導入し、aPTT測定法でビタミンＫ含有調整培地を評価して試験した。形質導入 した細胞から得られた上清をmF.IX欠失血漿に添加すると、凝固時間が短縮した 。対照細胞から得られた上清を使用した時は、これは起きなかった。動物操作方法 免疫適格な５月齢の老齢な雌のCD-1マウス、５月齢の雌のC57BL/6マウス（Cha rles River Breeding Laboratories，Wilmington，MA）および５週齢の雄の老齢 なBALB/cマウス（The Jackson Laboratories）（各株についてｎ＝３）をこの試 験で使用した。マウスの後肢両方の前脛骨筋と四頭筋に、本明細書に記載の総用 量１×10¹¹のAAV-mF.IXを注入した。同腹子に同じ方法で２×10¹¹のAAV-mF.IXを 注入した。眼窩後出血を使用して、既に記載されている（Walterら、1996、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 93:3056-3061）ように血漿試料を集めた。血漿試料のウェスタンブロット解析によるマウス抗体の検出 SDS-PAGEゲルで100ngのhF.IX（Mononine**血漿由来第IX因子、Armour）または mF.IX（安定にトランスフェクションした293細胞から得られた組織培養培地から 精製した）を分離し、次にタンパク質をHybond-ECL膜（Amersham）に移して、ウ ェスタンブロットを行なった。BLOTTO（５％無脂肪乾燥ミルク、10mMトリス−塩 酸、ｐＨ8.0、２mM CaCl₂、0.05％ツイーン−20）を使用してブロッキングを２ 時間行なった。BLOTTOで１：200希釈した血漿試料を、膜とともに１時間インキ ュベートした。BLOTTOで１：1000希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ 抗マウスIgG（Boehringer Mannheim）を２次抗体とした。抗第IX因子をECL検出 とフィルム現像（Amersham）により視覚化した。このウェスタンブロットの陽性 対照血漿は、ヒト第IX因子の遺伝子を含有するアデノウイルスベクター（Kungら 、1998，Blood 91:784-790）の静脈内注入後、mF.IXとhF.IXの両方に対して抗体 を産生した血友病Ｂマウスから得られた。aPTT 測定法 尾静脈から出血中にクエン酸緩衝液中にマウス血漿を集めた。aPTT測定の凝固 時間測定は、50μlのaPTT試薬（Organon Teknika，Durham，NC）を50μlのマウ ス血漿と混合することにより行なった。混合物を37℃で３分インキュベートし、 50μlの25mM CaCl₂を加えた。凝固時間はフィブロメーター（BBL FibroSystem） を使用して測定した。凝固インヒビタースクリーニング ベクターを注入したマウスから得られた血漿を等量の正常プールマウス血漿と 混合し、37℃で２時間インキュベートした。アリコートを取り、aPTT試薬と混合 した。aPTT凝固時間が対照より３秒以上長い場合、インヒビターのスクリーニン グは陽性とした（正常イヌ血漿はイミダゾール緩衝液とインキュベートした）。 本実施例に示した実験の結果を以下に説明する。 AAV-mF.IXを注入したマウスは、注入後18日目と60日目にウェスタンブロッテ ィング法により測定した時、いずれもmF.IXに特異的な抗体を産生しなかった（ 図13、レーン２〜10）。ベクターを注入したすべてのマウスの血漿試料のaPTTに よる凝固時間は、注入後60日目に測定した時正常範囲（約25秒）内であった。注 入マウスについてのインヒビター測定でもインヒビターの欠如が証明された。AA V-hF.IXを注入した対照マウスはすべて、注入後最初の２週以内にhF.IXに特異的 な抗体を産生し、これらの動物の免疫適格性を証明していた。 これらのデータは、AAV-F.IXを注入されたマウスはF.IXに対するインヒビター を合成しなかったことを確認している。実施例４：骨格筋により産生されるヒト第IX因子の生化学的解析 F.IX合成の自然の部位は肝細胞内である。本明細書に記載の実験アプローチは 、F.IX産生の部位として骨格筋の筋管を標的としている。ヒトF.IXは、細胞をAA V-CMV-hF.IXでトランスフェクションした後に組織培養で維持したヒト筋管の調 整培地から精製される。今日までに行われた予備試験は、これらの細胞中ではＮ −末端で筋管合成F.IXが正しくプロセシングされており、γ−カルボキシル化さ れていることを示している。さらに調整培地はヒトF.IX欠損血漿に加えられる時 aPTTを修正する。実施例５：ヒトへのAAV-hF.IX投与の臨床的プロトコールの要約 凝固因子濃縮物で治療した患者の臨床的研究は、循環凝固因子のレベルの小さ な上昇が疾患の罹患率と死亡率のほとんどを防止するのに充分であることを証明 した。最も包括的なデータは、スエーデンの予防研究（Lofqvistら、1997，J．I nt．Med．241:395-400）中に含まれ、ここでは1958年以来スエーデンの多くの血 友病患者は、出血に応答してではなく定期的に凝固因子を注入する処方で維持さ れている。遺伝子治療の目標は、正常の１％より大きいF.IXの一貫したレベルを 維持することである。重症の血友病（特に血友病Ｂ）を有する患者の治療法とし て本明細書に記載の遺伝子治療は、患者の血流中で一定且つ治療的レベルのF.IX を維持するという充分証明された利点を提供している。 フェーズＩ臨床試験では、最初の治験を、インヒビターの出現の履歴がなくそ の寿命が疾患のために縮められる重症の患者（すなわち、F.IXの循環レベルが正 常の１％未満である）に限定するように提唱されている。 試験中、筋肉内投与されるAAV-F.IXの患者間の用量の増加の安全性が追跡され る。局所的および全身的なベクターの送達に関連する毒性が評価される。本明細 書に記載のプロトコールに従って、トランスジーン産物の生物学的および生理的 活性を測定することにより各用量群の薬効が追跡される。注入部位でのF.IX遺伝 子およびタンパク質発現の存在を検出するために、分析が行われる。 初期の試験では、少なくとも12名の患者が含まれる。これらの患者は、３名ず つの群に割り当てられ、各群の各患者は同じ用量のAAV-hF.IXを投与される。第 １群の患者は、ラットでの毒性を決定するための試験結果に基づき総量が投与さ れる。ラット毒性試験は、フェーズＩ臨床治験の開始前に、認可された動物毒性 試験プロトコールに従って行われる（21 C.F.R．§58中のFood and Drug Admini stration Good Laboratory Practices）。患者の出発用量は、ラットへの投与で 許容できない毒性を生じる最低用量より、キログラムベースで少なくとも10倍低 い。ラットに投与した最も高い用量で毒性が観察されないなら、ヒト患者の出発 用量は、この最も高い用量より少なくとも10倍低い。第１群の患者で用量限定性 の毒性および遺伝子発現の証拠が観察されず、かつ最後の患者の治療後少なくと も８週が経過した後、第２群の患者が第１群の患者の用量より１対数高い用量で 治療される。用量限定性の毒性または発現が観察されないなら、用量限定性の毒 性の不在下で発現が観察されるまでこのスケジュールが繰り返される。次に許容 されない毒性の不在下で生物学的および生理的効果の証拠があるまで、半対数ず つの増分で用量が増加される。 ベクター投与前の２時間以内に患者に、患者のF.IXレベルを100％に上げると 計算される用量の高度に精製した凝固F.IX濃縮物を注入する。筋肉内注入は、病 院のプロトコールに従って意識的な鎮静の形で麻酔下で行われる。各注入部位に 0.5mlの容量が投与される。ベクター濃度と注入部位の数は、用量に関連して変 化する。低用量群では約６部位に注入され、最も高い用量群では約20部位に注入 される。患者は２〜３日間入院する。イヌでの研究は、注入後24時間を超えても ベクターの放出がないことを示す。しかし入院の間標準的逆隔離法が行われる。 追跡治療において患者は、ベクター注入後の約12時間目に正常の50％のレベル を達成するためにF.IX濃縮物を投与され、臨床的評価に依存して以後３〜７日間 24時間毎に投与される。 本明細書で引用した各々のおよびすべての特許、特許出願ならびに刊行物の開 示内容は、その全体を参照することにより本明細書の一部とする。 本発明を具体的な実施形態について開示したが、本発明の精神および範囲を逸 脱することなく、本発明の他の実施形態や変更形態が当業者には明らかであろう 。添付の請求の範囲は、そのような実施形態や同等の変更形態のすべてを含むも のと解するべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハーゾグ，ローランド，ダブリュ. アメリカ合衆国 19036 ペンシルバニア 州，グレンオルデン，イースト グレンオ ルデン アベニュー 100

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも２つのアデノ関連ウイルス逆方向末端繰り返し配列と、プロモー ター／調節配列と、第IX因子をコードし且つ5'および3'非翻訳領域を伴う単 離DNAと、転写停止シグナルとを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクタ ーを含んでなる組成物。 ２．第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部をさらに含む、請求項１記載の組成物 。 ３．前記第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbの長さであ る、請求項２記載の組成物。 ４．前記第IX因子をコードする単離DNAは、コードされた第IX因子をコラーゲンI Vに結合できなくする突然変異を有する、請求項１記載の組成物。 ５．前記突然変異DNA中の突然変異は、成熟F.IXの初めから５番目のアミノ酸位 置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする、請求項４記載の組成 物。 ６．薬剤学的に許容される担体をさらに含む、請求項１記載の組成物。 ７．前記プロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即時型初期プロモー ター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチン キナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される、請求項１ 記載の組成物。 ８．前記転写停止シグナルはSV40転写停止シグナルである、請求項１記載の組成 物。 ９．請求項１記載のベクターと使用説明書とを含むキット。 10．哺乳動物の血友病の治療方法であって、少なくとも２つのアデノ関連ウイル ス逆方向末端繰り返し配列、プロモーター／調節配列、第IX因子をコードし 且つ5'非翻訳領域および3'非翻訳領域を伴う単離DNA、ならびに転写停止シ グナルを含有する組換えアデノ関連ウイルスベクターと、薬剤学的に許容さ れる担体とを含んでなる組成物を該哺乳動物の筋肉組織に投与することから なる上記方法。 11．前記組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少なくとも２つの部 位に前記組成物を注入することにより投与される、請求項10記載の方法。 12．前記組換えアデノ関連ウイルスベクターは、筋肉組織の少なくとも６つの部 位に前記組成物を注入することにより投与される、請求項11記載の方法。 13．前記組換えアデノ関連ウイルスベクターは、哺乳動物１匹当たり約１×10⁸ 〜約５×10¹⁶個のウイルスベクターゲノムの用量で投与される、請求項10記 載の方法。 14．前記哺乳動物はヒトであり、前記第IX因子はヒト第IX因子である、請求項10 記載の方法。 15．前記プロモーター／調節配列は、サイトメガロウイルス即時型初期プロモー ター／エンハンサー、骨格筋アクチンプロモーター、および筋肉クレアチン キナーゼプロモーター／エンハンサーよりなる群から選択される、請求項10 記載の方法。 16．前記組成物は第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部をさらに含む、請求項10 記載の方法。 17．前記第IX因子遺伝子のイントロンＩの一部は、約0.3kb〜約1.7kbである、請 求項16記載の方法。 18．前記第IX因子をコードする単離DNAは、コードされた第IX因子がコラーゲンI Vに結合できなくなるようにする突然変異を含む、請求項10記載の方法。 19．突然変異されたDNA中の突然変異は、成熟F.IXの初めから５番目のアミノ酸 位置にあるリジンの代わりにアラニン残基をコードする、請求項18記載の方 法。 20．前記哺乳動物はヒトである、請求項10記載の方法。