JP2001516216A

JP2001516216A - 非相同ｄｎａ配列のシャッフリング

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Publication number: JP2001516216A
Application number: JP54004498A
Authority: JP
Inventors: ベーデルボーシェルト，トーベン; クレッシュマー，ティトゥス; アール．シェリー，ジョエル
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1997-03-18
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 2001-09-25
Also published as: AU6611698A; EP1015575B1; DK1015575T3; IL131986A0; DE69841674D1; ATE468394T1; CA2284097A1; EP1015575A1; AU738461B2; WO1998041623A1; NZ337910A

Abstract

(57)【要約】本発明は、特に非相同ポリヌクレオチド配列をシャッフリングする新しい方法、それから得られる希望する生物活性を有する新しい組換えタンパク質をスクリーニング及び／又は選択する新しい方法に関し、そして特には、希望する特性を呈する新規プロテアーゼの生産及び同定に関する。本方法は、以下の過程を含んでいる：ｉ）注目する非相同配列間で、少くとも１つの保存領域を同定すること；ii）注目する各非相同配列の、前記保存領域を含んでいる断片を作成すること、好ましい態様では、前記保存領域の部分をプライマーとして用いて作成すること；iii）前記保存領域を相同連結点として用いて、前記断片をシャッフリング／組換えすること。

Description

【発明の詳細な説明】非相同DNA配列のシャッフリング発明の分野本発明は、特に非相同ポリヌクレオチド配列をシャッフリング(shuffling)する新しい方法、それから得られる希望する生物活性を有する新しい組換えタンパク質をスクリーニング及び／又は選択する新しい方法に関し、そして特には、希望する特性を呈する新規プロテアーゼの生産及び同定に関する。発明の背景一般的には、特定の生物活性を有するタンパク質は、生物の属間で多様性を示し、しかも同種生物間においても差異が存在することが知られている。この多様性は、ゲノムレベルでは一層顕著である。基本的に同じ生物活性を有するタンパク質をコードする遺伝子間の天然の遺伝的多様性は、自然界において長年に亘って生じてきた。この多様性は、当生物の環境に対して、コードされるタンパク質の自然の最適化を反映している。しかし、一般的には、天然の生物活性分子は、人間が設定する種々の使用状況、特に工業目的で使用される状況に対しては最適化されていない。従って、目的とする使用状況に対して最適な生物活性を有するタンパク質を同定することは、工業上興味深い。このことは、長年の間、天然の生物資源のスクリーニング、又は変異誘発を利用して行われてきた。例えば、洗剤中に用いる酵素の技術分野では、例えば天然のプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼの洗浄及び／又は食器洗浄の性能は、それらの酵素のインビトロ改修によって有意に改良されてきた。ほとんどの場合、アミノ酸の型又は、成熟型酵素の２次構造若しくは３次構造におけるアミノ酸の位置に基づいて選択された特異的アミノ酸残基における置換、欠損又は挿入を導く部位特異的変異誘発によって、それらの改良がなされてきた（例えば米国特許4,518,584参照）。従来技術遺伝的多様性を創作する多数の方法、例えば、部位特異的又はランダム変異誘発による方法が、科学文献及び特許出願において提唱及び記載されている。これに関する参考文献の詳細は、WO95/22625の関連技術の章に見られ、そこで総説が記載されている。相同DNA配列をシャッフリングする１つの方法が、Stemmerによって記載されている(Stemmer，(1994)，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，Vol．91，10747-10751;S temmer，(1994)，Nature，Vol．370，389-391)。この方法では、インビトロのPC R技術を用いることによって相同DNA配列をシャッフリングする。シャッフリングしたDNA配列を含んでいる陽性組換え遺伝子を、発現タンパク質の改良された機能に基づいて、DNAライブラリーから選択する。 WO95/22625が、本発明の「遺伝子シャッフリング」に最も適当な参考文献と思われる。WO95/22625では、相同DNA配列をシャッフリングする方法が記載されている。WO95/22625に記載されている方法の重要な工程は、相同な鋳型二本鎖ポリヌクレオチドを、希望する長さのランダムな断片に切断し、次にこれらの断片を完全長の相同遺伝子に再集合することである。しかし、前記WO95/22625の方法に固有の欠点は、その方法によって生じた多様性が、（WO95/22625で規定した）相同遺伝子配列を使用するために限定されることである。 WO95/22625の方法の別の欠点は、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドの切断によってランダムな断片が生成することである。注目する別の参考文献は、WO95/17413であり、これには、合成二本鎖断片の組換え又はPCRで作成した配列の組換えによるDNA配列の組換えによって、遺伝子又はDNAをシャッフリングする方法が記載されている。WO95/17413に記載された方法では、組換えを行う異なった配列間のハイブリダイゼーションが可能となるために十分に相同な配列を有するDNA配列間で、組換えを行う必要がある。従って、WO95/17413にも、生じた多様性が比較的に限定される欠点がある。本発明は、WO95/22625に記載された様な、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドの切断によってランダムな断片を生成させる過程を全く含まない。しかも、WO95/22625は、相同遺伝子のシャッフリングに関するものであるが、本発明は、非相同遺伝子のシャッフリングに関する。発明の要約本発明によって解決する課題は、注目する非相同配列をシャッフリング／組換えする方法を提供して、相同DNA配列だけをシャッフリングする際の制限を回避することである。この解決では、シャッフリングする非相同配列間で、十分な相同性を有する、少くとも１つの「保存配列領域」を、前記非相同配列間の「連結点」として使用する。従って、本発明の第１点目は、以下の過程：ｉ）注目する非相同配列間で、少くとも１つの保存領域を同定すること； ii）注目する各非相同配列の、前記保存領域を含んでいる断片を作成すること；及び、 iii）前記保存領域を、相同な連結点として利用して、前記断片をシャッフリング／組換えすること；を含んでいる、注目する非相同配列をシャッフリングする方法に関する。本発明の２点目は、第１点目の過程に加えて、更に以下の過程： iv）過程iii）由来の多数の異なったシャッフリングされた配列によってコードされる多数の異なった組換えタンパク質を発現させること；及び、ｖ）希望する活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を得るために、適当なスクリーニング又は選択システムによって、過程iv）の多数の異なった組換えタンパク質をスクリーニング又は選択すること；を含んでいる、希望する生物活性を有するシャッフリングされたタンパク質を生産する方法に関する。用語「保存領域」とは、前記非相同配列間で、比較的に高い配列同一性が存在する配列領域（好ましくは少くとも10bpからなる）を意味する。前記非相同配列間で、「連結点」として利用される保存領域であるためには、非相同配列間の前記保存領域内の配列同一性が、ハイブリダイゼーションする地点（「連結点」）としての前記保存領域を介して、非相同配列がハイブリダイズすることができるほどに十分に高い必要がある。図面の簡単な説明図１は、本発明の一般的な概念を示している。ａ）黒箱は、注目する配列における相互に共通の保存領域を指し、ｂ）「ａ，ａ’，ｂ，ｂ’など」と表示されたPCRプライマーは、前記保存領域に対するプライマーであり、プライマー（ａ’とｂ）、（ｂ’とｃ）などは、好ましくは少くとも10bpの配列重複を含み、そして、ｃ）プライマー「ｚ」及び「ｚ’」は、本発明の方法によってシャッフリングされた注目する配列の配列領域のフランキング部分に対するプライマーである。図２は、５つのプロテアーゼ（スブチラーゼ）のDNA配列を整列したものである。そこには、保存領域の番号、例えば１番〜５番の共通部分配列がある。図３は、異なったリパーゼの整列を示している。定義本発明を詳細に説明する前に、以下の用語を定義する。「シャッフリングする」：用語「シャッフリングする」は、入力としてのDNA 配列（すなわち出発点としての注目DNA配列）に比べて、多数の交換されたヌクレオチドを有する出力としてのDNA配列（すなわちシャッフリング工程を経たDNA 配列）を生成するために、２つ以上の注目するDNA配列間でヌクレオチド配列を組み換えることを意味する。あるいは、用語「シャッフリングする」は「組換える」と言い換えてもよい。「DNA配列の相同性」：本明細書では、DNA配列の相同性の程度は、２つの配列間の同一の程度として決定され、１つ目の配列の２つ目の配列からの派生性を示す。この相同性は、当業界に周知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラム内にあるGAPを用いて適切に決定される（Progra m Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Com puter Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman ，S.B．and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology 48，443-45 3）。「相同の」：用語「相同の」とは、１つの一本鎖核酸配列が、相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズすることができることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、多数の因子、例えば配列間の同一性の程度、並びにハイブリダイゼーション条件、例えば以下で検討する温度及び塩濃度に依存するだろう。 DNA配列比較のための以下の設定：GAP creationpenalty 5.0及びGAP extensio n penalty 0.3にてコンピュータプログラムGAP(前出)を用いると、本明細書では、２つのDNA配列が、相互に、少くとも50％、より好ましくは少くとも60％、より好ましくは少くとも70％、より好ましくは少くとも80％、より好ましくは少くとも85％、そしてさらに好ましくは少くとも90％の同一性を有する場合に、（以下に定義する中度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で）ハイブリダイズすることができると考えられる。「非相同の」：２つのDNA配列の１つが、別の１つの配列の任意の部分配列に対して50％超、より好ましくは70％超、より好ましくは80％超、より好ましくは 85％超、より好ましくは90％超、そしてさらにより好ましくは95％超の同一性を有さない少くとも40bpの部分配列を含んでいる場合、この２つのDNA配列は非相同であるという。この最初の部分配列は、より好ましくは少くとも60bp、より好ましくは少くとも80bp、さらにより好ましくは120bp、そしてより好ましくは少くとも500bpである。「ハイブリダイゼーション」：２つ以上の注目するDNA配列がハイブリダイズするか否か決定するために適する実験条件は、本明細書では、以下に詳細に記載する様に、中度のストリンジェント条件でのハイブリダイゼーションとして定義される。低ストリンジェントな条件下での２つの注目するDNA配列間のハイブリダイゼーションの実験工程は、ハイブリダイズするDNA断片を含んでいるフィルターを、５×SSC(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム、Sambrook et al．1989)中で1 0分間前もって浸漬すること、このフィルターを、５×SSC、５×デンハルト溶液、0.5％ SDS及び100μｇ／ml変性分断サーモン精子DNAを含む溶液中でプレハイブリダイゼーションすること、そして、ランダムプライマー法で³²Ｐ−dCTP標識した10ng／mlのプローブ（DNA配列）（比活性＞１×10⁹cpm／μｇ）（Feinberg ，A.P．and Vogelstein，B．（1983）Anal．Biochem．132：6-13）を加えた前記溶液中で12時間約45℃でハイブリダイゼーションすることを含んでいる。次に、このフィルターを２×SSC及び0.5％SDS中で30分間２回、少くとも55℃で、より好ましくは少くとも60℃で、そしてさらにより好ましくは少くとも65℃（高ストリンジェント）で洗浄する。前記条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子を、Ｘ線フィルムを用いて検出する。「整列」：本明細書では、多数のDNA及び／又はアミノ酸配列の「整列」に関して、用語「整列」とは、注目する配列間で、相同／同一な、相互／共通の配列を同定するために、それらの注目する配列を整列することを意味する。この手段は、注目する配列間で共通の「保存領域」（下記参照）を同定するために用いられる。この整列は、当業界に周知のコンピュータプログラム、例えばGCGプログラム内にあるPILEUPを用いて適切に実行される（Program Manual for the Wisco nsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Scien ce Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711）(Needleman，S.B．and Wunsch，C. D.，(1970)，Journal of Molecular Biology 48，443-453)。「保存領域」：本明細書では、注目のDNA及び／又はアミノ酸間の「保存領域」に関して、用語「保存領域」とは、２つ以上の注目配列の相互に共通の配列であって、それらは、２つ以上の注目の非相同配列間で、比較的高い配列同一性を有する。本明細書では、保存領域は、好ましくは少くとも10塩基対（bp）、より好ましくは少くとも20bp、そしてさらにより好ましくは少くとも30bpである。 DNA配列比較のために以下の設定：GAP creation penalty 5.0及びGAP extensi on penalty 0.3にてコンピュータプログラムGAP(前出)を用いた場合、２つ以上の注目する非相同配列間で、保存領域内のDNA配列の同一性の程度は、好ましくは少くとも80％、より好ましくは少くとも85％、より好ましくは少くとも90％、そしてさらにより好ましくは少くとも95％である。「プライマー」：本明細書では、特にPCR反応において、用語「プライマー」は、当業界に既知の一般的で標準的な説明（“PCR A practical approach”IRL Press(1991)に従って定義及び作成されるプライマー（特に「PCRプライマー」）のことである。「配列に対するプライマー」：用語「配列に対するプライマー」とは、注目する配列部分に対する配列同一性が少くとも80％、より好ましくは少くとも90％となる様に作成されたプライマー（好ましくはPCR反応に用いるもの）を意味し、このプライマーが「配列に対する」プライマーである。「配列重複伸長PCR反応(SOE-PCR)」：用語「SOE-PCR」は、当業界に既知の標準的なPCR反応方法であり、本明細書では、これは、当業界に周知な標準方法（“PCR A practical approach”IRL Press(1991)に従って定義及び実行される。「フランキング」：本明細書では、PCR断片中に含まれるDNA配列に関して、用語「フランキング」とは、PCR断片の５’及び３’の両末端部分に存在する最も外側の末端部分配列を意味する。「スブチラーゼ」：セリンプロテアーゼとは、ペプチド結合の加水分解を触媒し、そしてその活性部位にセリン残基が本質的に存在する酵素である(White，Ha ndler and Swith，1973”Principles of Biochemistry，“5 th Ed.，McGraw-Hi ll Book Company，NY，pp．271-272)。細菌のセリンプロテアーゼの分子量は、20,000〜45,000ダルトンの範囲である。これらの酵素は、ジイソプロピルフルオロホスフェートによって阻害される。これらは、単一の末端エステルを加水分解し、その活性は、真核生物のセリンプロテアーゼであるキモトリプシンに類似する。このサブグループを意味するより狭義な用語「アルカリプロテアーゼ」は、それらのセリンプロテアーゼのいくつかの至適pHが高いこと、すなわちpH9.0〜11.0であることを反映している（概説としてPriest（1977）Bacteriological Rev．41，711-753参照）。スブチラーゼと仮りに称するセリンプロテアーゼのサブグループが、Siezen e t al.，Protein Engng．4（1991）719-737で提唱されている。これらは、以前にスブチリシン様プロテアーゼと称された40超のセリンプロテアーゼのアミノ酸配列の相同性分析から定義される。発明の詳細な説明注目する非相同配列をシャッフリングする方法好ましい態様では、本発明の前記した第１点目の過程ii）において作成される断片を、PCR技術によって作成する。従って、本発明の１つの点として、以下の過程を含んでいる、本発明の第１点目に係る、注目の非相同DNA配列をシャッフリングする方法がある：ｉ）２つ以上の非相同配列において、１つ以上の保存領域（以下“Ａ，Ｂ，Ｃ ”などと記す）を同定すること； ii）ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のための少くとも２組のPCRプライマー（各組は、センス及びアンチセンスプライマーを含む）を作成すること、ただし、１つ目の組では、センスプライマー（これを「ａ」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の５’配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ａ’」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の３’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、そして２つ目の組では、センスプライマー（これを「ｂ」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の５’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ｂ’」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の３ ’配列領域に対するものであり、これらのプライマーの組「ａ」及び「ａ’」、並びに「ｂ」及び「ｂ’」の間の領域で指定されるこの２つの配列領域（この両方の領域は、実際のプライマー配列を含んでいる）は、保存領域内に少くとも10塩基対（bp）の相同な配列重複を有し； iii）過程ｉ）において同定された注目する１つ以上の保存領域のために、過程ｉ）の非相同DNA配列を鋳型として、２回のPCR増幅反応を行うこと、ただし、そのPCR反応の１つでは、過程ii）において決定した５’プライマー組（例えば「ａ」、「ａ’」）を使用し、そして２つ目のPCR反応では、過程ii）において決定した３’プライマー組（例えば「ｂ」、「ｂ’」）を使用し； iv）過程ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のために、過程iii）で記載した様に作成したPCR断片を単離すること；ｖ）過程iv）で単離した２つ以上のPCR断片を混合し、そしてこれらの単離したPCR断片を鋳型として用いて、配列重複伸長PCR反応(SOE-PCR)を行うこと；及び、 vi）過程ｖ）で得られたPCR断片を単離すること、ただし、この単離したPCR断片は、過程iv）で単離したPCR断片からシャッフリングされた混合物を含んでいる多数の異なったシャッフリングされた配列を含んでいて、これらのシャッフリングされた配列は、過程ii）の相同配列重複に由来する部分DNA配列が、過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して少くとも80 ％の同一性を有することを特徴とする。希望する生物活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を作成する方法本発明の２つ目の点は、直前の過程ｉ）〜vi）に加えて、以下の過程を更に含んでいる、希望する生物活性を有するシャッフリングされたタンパク質を生産する方法に関する： vii）過程vi）の多数の異なったシャッフリングされた配列によってコードされる多数の異なった組換えタンパク質を発現すること；及び、 viii）希望する活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を得るために、適当なスクリーニング又は選択システムによって、過程vii）の多数の異なった組換えタンパク質をスクリーニング又は選択すること。非相同DNA配列本発明の方法は、注目する全ての非相同DNA配列を本質的にシャッフリングするために用いられる。好ましくは、この方法は、酵素活性、例えばアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ及びプロテアーゼ活性をコードする非相同DNA配列をシャッフリングするために用いられる。本発明の別の利点は、異なった活性、例えば異なった酵素活性をコードする非相同配列をシャッフリングすることが可能となることである。本発明の方法は、プロテアーゼ活性、特にスブチラーゼ活性をコードする非相同DNA配列をシャッフリングするために特に適している。多数のスブチラーゼのDNA配列が当業界で公開されている。本明細書では、これらのスブチラーゼDNA配列の多数が、非相同DNA配列であり、これらは、当業界で現在既知のシャッフリング方法（WO95/17413，WO95/22625）でシャッフリングするには、相互にあまりに非相同的であると一般に考えられている。しかし、本発明の方法では、これらの配列をシャッフリングすることが可能となる。更に詳細には、本明細書の実施例（下記）を参照する。更に、本発明は、異なったリパーゼ配列をシャッフリングするために適する。更に詳細には、本明細書の実施例（下記）を参照する。鋳型として用いる非相同DNA配列を、事前に、適当なベクター、例えばプラスミドにクローン化する。あるいは、注目のDNA配列を含んでいることが知られている微生物に対して、当業界の既知の標準的PCR方法に従って直接にPCR反応を行う。非相同配列の１つ以上の保存領域の同定標準的なコンピュータプログラム（前出）によって非相同配列の整列化を行なって、保存領域の同定を行うことができる。あるいは、完全に新しい配列に対して本方法を行うこともでき、この場合、適切な「保存領域」として、その特定のクラスのタンパク質において保存領域であることが当業界において知られている保存領域を選択する。例えば本方法は、活性部位アミノ酸周辺領域が非常に保存されていることが知られているスブチラーゼ配列において、その全く未知な配列をシャッフリングするために用いられる。それらの保存領域に対するプライマーを用いて、新しい未知の菌株に対して、PCR反応を直接行うことができる。PCR プライマー当業界の標準的な方法に従って、本PCRプライマーを作成する。好ましくは、これらは10−75塩基対（bp）の長さを有する。相同配列重複本発明の請求項３の過程ii）において、プライマーの組「ａ」及び「ａ’」、並びに「ｂ」及び「ｂ’」の間の領域によって規定される２つの配列領域（この両方の領域は、実際のプライマー配列を含んでいる）は、保存領域内の少くとも 10塩基対（bp）の相同配列重複を有する。この相同配列重複は、より好ましくは少くとも15bp、より好ましくは少くとも 20bp、そしてさらにより好ましくは少くとも35bpである。請求項３の過程ii）の相同配列重複は、この請求項の過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して少くとも80％の同一性、より好ましくは少くとも90％の同一性、さらにより好ましくは少くとも95％の同一性を有する。PCR 反応特に言及しない場合、本発明で行われるPCR反応は、当業界に既知の標準方法に従って行われる。用語「PCR断片の単離」とは、PCR断片を含んでいる分画を含んで意味する。しかし、好ましくは、PCR断片を、余ったプライマー、ヌクレオチドなどが取り除かれた程度にまで単離する。更に、請求項３の過程ｖ）の、SOE-PCR反応に用いる断片を、この請求項の過程iii）に記載したPCR増幅以外の方法によって作成することもできる。過程ｖ）のSOE-PCR反応に用いるのに適した断片を、例えば、適当な部位（例えば、過程ｉ）で同定した保存領域の各部位に位置する制限部位）を切断する制限酵素によって、適当な断片に切断することによって作成することもできる。過程ｖ）のSO E-PCRに用いる適当な断片を作成するこの様な代替方法も、本発明の範囲とみなす。本発明の態様では、PCRによるDNA断片を、低、中または高頻度にランダム突然変異を生じさせる条件下で調製する。低頻度の突然変異を得るために、（DNA断片を含んでいる）DNA配列を、標準的なPCR増幅方法（US 4,683,202またはSaiki et al．，(1988)，Science 239，487 -491）に従って調製することができる。中または高頻度の突然変異は、ヌクレオチドの誤った組込みを増加させる条件下でPCR増幅を行うことによって、例えば、Deshler， (1992)，GATA 9(4)，103-106；Leung et al.，(1989)，Technique，vol．1，No ．1，11-15の記載通りに行うことによって達成される。最終的なシャッフリングされた配列本発明の利点の１つは、本発明の請求項３の過程vi）における最終的な「シャッフリングされた配列」は、この請求項の過程ｉ）における元々の注目する非相同配列に本来的に由来する配列情報のみを含んでいることである。本発明では、１つ以上の非相同配列を組換えるために人工的に作られた「リンカー配列」を用いない。これは、例えば、タンパク質内の異なるドメインをシャッフリングすることができる当業界に既知の方策であって、各ドメインは、異なった非相同配列によってコードされる（WO95/17413）。従って、本発明の方法は、（本発明の第１の点から第３の点において）過程ii ）の相同配列重複に由来する部分DNA配列、そしてシャッフリングされた配列の各々が、過程ｉ）の元々の非相同配列に本来的に由来する配列情報のみを含んでいることを特徴とする（すなわち、過程ii）の前記「相同配列重複」は、過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して、少くとも8 0％の同一性を有する）。より好ましくは、過程ii）の「相同配列重複」は、過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して、少くとも90％の同一性、さらにより好ましくは少くとも95％の同一性、そして最も好ましくは100％の同一性を有する。シャッフリングされた配列からの組換えタンパク質の発現本発明のシャッフリングされた配列によってコードされる組換えタンパク質の発現を、当業界に既知の標準的な発現ベクター及びそれに対応する発現系を用いて行うことができる。適当なスクリーニング又は選択システム本発明の２つ目の点は、希望する生物活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を生産する方法に関する。適当なスクリーニング又は選択システムは、希望する生物活性に依存する。希望する生物活性をスクリーニング又は選択する多数の適当なスクリーニング又は選択システムが当業界で報告されている。例えば、Strauberg et al.，Biot echnology 13：669-673（1995）には、カルシウム非依存的な安定性を有するスブチリシン変異体をスクリーニングするシステムが記載されていて；Bryan et a l.，Proteins 1：326-334（1986）には、強化された温度安定性を有するプロテアーゼをスクリーニングするシステムが記載されていて；そしてWO97/04079には、洗剤中で強化された洗浄能を有するリパーゼをスクリーニングするシステムが記載されている。本発明の好ましい態様には、希望する生物活性が、食器洗浄または衣類洗浄用洗剤における性能である組換えタンパク質をスクリーニング又は選択することが含まれる。適当な食器洗浄用又は衣類洗浄用洗剤の例が、WO97/04079及びWO95/3 0011に開示されている。以下の実施例において、本発明をより詳細に記載するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。材料及び方法菌体大腸菌株：DH10B（Life Technologies）バチルス・スブチリス株：DN1885 amyE。バチルス・スブチリス168RUB200の誘導株（J．Bacteriology 172：4315-4321(1990)）。プラスミド pKH400：スブチラーゼ309をコードする合成遺伝子を含んでいる、大腸菌−バチルス・スブチリスのシャトルベクターであるpJS3（Jacob Schiodt et al.，Pr otein and Peptide letters 3：39-44(1996)）から、位置1841及び3992に２つBa mHＩ部位を導入して、pKH400を作成した。シャッフリングするために用いるプロテアーゼ配列 GenBankのアクセス番号A13050_1，D26542，A22550、そしてSwiss-Protのアクセス番号SUBT_BACAM Poo782、及びPD498(特許出願WO96/34963)。一般的な分子生物学的方法特に言及しない場合、分子生物学の標準的方法を用いてDNA操作及び形質転換を行った(Sambrook et al．(1989)Molecular cloning：A laboratory manual，C old Spring Harbor lab.，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel，F.M．et al．(ed s.)“Current protocols in Molecular Biology”．John Wiley and Sons，1995 ；Harwood，C.R.，and Cutting，S.M．（eds.）“Molecular Biological Method s for Bacillus”．John Wiley and Sons，1990)。 DNA操作用の酵素を、供給元の説明書に従って用いた。DNA 操作用の酵素特に言及しない場合、DNA操作用の全ての酵素、例えば制限酵素、リガーゼなどを、New England Biolabs，Inc．から入手した。実施例実施例１Ａ）ベクターの作成１）プレプロ配列の増幅完全長の酵素A13050_1(GenBank)，SUBT_BACAM P00782(Swiss- Prot)，D26542(GenBank)，A22550（GenBank）、及びPD498(特許出願WO96/34963) をコードするプラスミドDNAを含んでいる宿主細胞を出発材料とした。標準的なm ini-prep法によってプラスミドDNAを単離して、精製DNAを得た。これらのDNAを鋳型として、５つの標準的なPCR反応を行い、各々のプレプロ配列を増幅した。校正機能付きのPwo DNAポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)、並びに各プレプロ配列のＮ末端及びＣ末端に対する以下のプライマー組を用いて、これらの断片を作成した：鎖長300−400bpの得られたDNA断片を、アガロースゲル電気泳動とゲル抽出（Q IAGEN）によって精製し、そしてスプライス−バイ−オーバーラップエクステンションPCR(splice-by-overlap extension PCR，SOE-PCR)によって集合させた。２）SOE-PCR 個別にSOE-PCRを行って、前記プレプロ配列をベクターpKH400のプロモーターの３’部分に接続した。このプロモーターの３’部分を、鋳型としての１ngのpK H400及び以下のプライマーを用いて、Pwo DNAポリメラーゼによる標準的PCRを行って得た：生じた160bpの断片をゲルによって精製した。次に、標準的な条件（Pwo DNAポリメラーゼ）下で、５つのプレプロ配列の各々と、等モル量の前記プロモーターの３’部分との混合物を鋳型として、SOE-PCRを各々行った。以下の集合用のプライマーを用いた：得られた断片をゲルで精製した。３）プレプロ配列のpKH400シャトルベクターへの挿入 pKH400ベクターをPmeＩ及びAcc 65Ｉで切断して、その中にあるリンカー配列を取り除いた。２）で精製した５つのSOE-PCR断片も同酵素で切断し、ゲルで精製した。SUBT_BACAM P00782に由来するSOE-PCR断片配列中には、PmeＩ部位が存在するので、この断片は部分切断されるので、特に注意が必要であった。標準的な連結混合液中で、各プレプロ配列をpKH400ベクターに連結した。これらのベクターによって大腸菌DH10Bを形質転換した後、アンピシリン含有培地上でコロニーを選択した。制限切断によって、適切に形質転換された細胞を同定し、そして配列を決定した。得られたこれらのベクターをpTK4001−4005とした。Ｂ）プロテアーゼA13050_1(GenBank)，SUBT_BACAM P00782(Swiss-Prot)，D26542 (GenBank)，A22550(GenBank)、及びPD498(WO96/34963)の小断片の調製１） mini-prep法で調製した各プロテアーゼ遺伝子のDNA0.5μｌを鋳型として、標準的なPCR反応を行った。これらの５つのプロテアーゼ遺伝子を各々６つの断片（Ｉ−VI）に分断するために、30回のPCR反応を行う（図１参照）。Ampli-T aqポリメラーゼ（５Ｕ）、及び以下のプライマー組（かっこ内の各数字は、A225 50のアミノ酸の位置に対応する）を用いた。プライマー名に、＃．１，＃．２などの表記がある場合、それらの等モル量を混合したものを、PCR反応における１つのプライマーとして用いた。 40〜60℃の範囲のアニ−リング温度で、30サイクル反応した後、増幅した断片をゲルで精製して、回収した。２）小断片をランダムに集合させるためのSOE-PCR 等モル量の各精製断片を混合したものを鋳型として、Ampli-Taqポリメラーゼを用いた標準的なSOE-PCRを行って、集合させた。以下のものを、外側のプライマーとして用いる：更に、以下のプライマー対：及びを用いることもできる。アニーリング温度を40℃〜70℃とする。考えられる全ての組合せの断片を連続的に再集合させることによっても、本再集合を行うことができる。例えば、試験管１で、プライマー組Ｉ（前記B1-2参照）を用いたPCRによって得た全７つの断片を混合し、試験管２で、プライマー組I Iを用いたPCRで得た断片を混合し、試験管３で、プライマー組IIIを用いたPCRで得た断片を混合し、試験管４で、プライマー組IVを用いたPCRで得た断片を混合し、試験管５で、プライマー組Ｖを用いたPCRで得た断片を混合し、そして試験管６で、プライマー組VIを用いたPCRで得た断片を混合する。次に、試験管１と２の一定量を混合したものを鋳型として、対応する外側のプライマーを用いて初回のSOE-PCRを行う。同様のことを、試験管３と４、及び試験管５と６の混合液を用いて行う。各々の場合の外側のプライマー対は、断片１と２の場合にはTiK134．＃／125.＃であり、断片３と４の場合にはTik126．＃／ 129.＃であり、そして断片５と６の場合にはTiK130．＃／135.＃である。長さ約 340，260及び280bpの増幅して集合させた各断片を、アガロースゲル電気泳動で精製する。２回目のSOE-PCRでは、得られた断片を混合して、外側のプライマー対としてTiK134．＃／135.＃を用いて集合させる。得られた完全長のプロテアーゼ遺伝子を前記通りゲルで精製する。別の例では、試験管１，２及び３の一定量を混合して、プライマー対TiK134．＃／127.＃を用いて初回のSOE-PCRを行い再集合させる。試験管４，５及び６の一定量も混合して、プライマー対TiK128．＃／135.＃を用いてSOE-PCRを行い再集合させる。長さ約450bpの生成断片を前記通り精製し、混合し、外側のプライマー対TiK134．＃／135.＃を用いて２回目のSOE-PCRを行い再集合させる。得られた完全長のプロテアーゼ遺伝子を前記通りゲルで精製する。原理的には、全ての組み合せの断片を、別個のSOE-PCRで集合させることができる。更にSOE-PCRを繰り返して、得られた集合単位を、より大きな集合単位にして、最後に完全長の遺伝子を得る。この目的で行うSOE-PCRの総数は、実験性能によってのみ制限される。SOE-PCRに固有の唯一の必要条件は、集合させる断片が、前記通りの配列重複を含んでいなければならないことである。Ｃ）ライブラリー＃１を作成するための、SOE-PCRで得られた完全長のプロテアーゼハイブリッドのクローニング過程Ｂ２）で得られた完全長のプロテアーゼハイブリッド遺伝子、及び、過程Ａ３）で得られた、新しく作成されたシャトルベクターpTK4001−4005を、個別にAcc 651及びMluＩで切断する。標準的な連結方法で、各プロテアーゼ遺伝子を、５つのベクターpTK4001−4005の各々に連結して、これによって大腸菌DH10Bを形質転換する。適切に形質転換された細胞をアンピシリンによって選択する。これらの菌株のDNAを調製し、ライブラリー＃１とする。このライブラリーは、約1 0⁶個の独立した形質転換体を含む。Ｄ）ライブラリー＃１のスクリーニングライブラリー＃１の一定量を用いて、バチルス菌細胞DN1885を形質転換する。希望する特性を有する形質転換体をスクリーニングする。この過程Ｄ）の方法に従って希望する特性について選択するために、標準的なプロテアーゼ活性検査を用いることによって、希望する特性を有する多数の新しくシャッフリングされたスブチリシンを同定した。この結果を、以下の表１に示す。プロテアーゼ：アルカラーゼ（Alcalase）：A13050_1（GenBank） BPN’：P00782（SwisProt）エスペラーゼ（Esperase）：D26542（GenBank）サビナーゼ（Savinase）：A22550（GenBank） PD498：WO96/34963 JA16：WO92/17576 PD138：WO93/18140 プロテアーゼ活性を有する23個の菌株が同定され、その内12個が異なるものであった。菌株８，９，18，20，23が同一で、菌株６，15，21が同一で、菌株12， 14が同一で、菌株10，13が同一で、そして菌株４，７が同一であった。成熟型酵素７に関しては、差異が認められた。表１から、本発明の方法によって、かなり遠位の関係にあるタンパク質の組み合せから成る活性タンパク質を得ることができることが判った。実施例２真菌リパーゼ由来のPCR断片を増幅するために、実施例１と同じ方法を用いることができる。以下の真菌に由来する真菌リパーゼを、Geneworksの整列プログラム（以下のパラメーターを用いる：cost to open a gap=５，cost to lengthen a gap＝25 ，Minimum Diagonal 1Length＝４，Maximum Diagonal Length＝10，Consensus c utoff＝50％）を用いて整列させる：Rhizomucor Miehei（Swiss Prot：LIP_RHIM I)，Rhizop us Delemar(Swiss Prot：LIP_RHIDL)，Penecillium camenbertii（Swiss Prot： MDLA_PENCA）Absidia reflexa（WO96/13578）及びHumicola lanuginosa(US 5536 661)。シャッフリングするAbsidia(Absidia)，Rhizopus（LIP_RHIDL）及びRhizomuco r(LIP_RHIMI)のリパーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーを以下に示す。Ｎ： IUPAC命名法に従い全４個の塩基（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ）を意味する。組１）組２）組３）組４）組５）シャッフリングするHumicola lanuginosa(Humicola)及びPenicillium camenbe rtii(MDLA_PENCA)のリパーゼ遺伝子を増幅するためのプライマーを以下に示す。組１）組２）組３）組４）組５）組６）組７）全５個の遺伝子をシャッフリングするためのプライマーを以下に示す：組１）組２）組３）組４）組５）組６）組７） SOE-PCRのために、最初のプライマー組の５’プライマー、及び最後のプライマー組の３’プライマーを用いることができる。次に、SOE-PCR断片を、リパーゼの５’及び３’末端部分がPCRで作成された場合、その５’及び３’末端部分と連結することができる。この５’末端部分は、注目する遺伝子の５’末端部分に対する特異的な５’プライマー（５’末端にBamHＩ部位配列を含む）、及び、３’プライマーとして、最初のプライマー組の５’プライマーに由来する相補的配列を用いたPCRによって作成される。前記の３’末端部分は、注目する遺伝子の３’末端部分に対する特異的な３’プライマー（５’末端にXbaＩ部位配列を含む）、及び、５’プライマーとして、最後のプライマー組の３’プライマーに由来する相補的配列を用いたPCRによって作成される。注目する遺伝子の特異的な５’及び３’プライマーを用いて、２回目のSOE-PC Rを行って、その完全な配列を作成する。得られた遺伝子を、BamHＩ−XbaＩ断片として、酵母ベクターpJSO26にクローン化することができる（WO97/07205参照）。実施例３シュードモナス菌のリパーゼのPCR断片を増幅及び組換えするために、実施例２と全く同様の方法を行うことができる。前記の「全く同様の方法」では、実施例２の場合とは少し異なるベクターを用いることが有利であろう。以下に示す配列及びプライマーの情報に基づいて、本発明のシャッフリング方法に従って以下に示すシュードモナス菌のリパーゼを組換えるために、実施例２に比べてベクターなどを改変することは、当業者にとって当然である。以下に示すシュードモナス菌のリパーゼを、Geneworksの整列プログラム（次のパラメーターを用いる：cost to open a gap＝５，cost to lengthen a gap＝ 25，Minimum Diagonal 1Length＝４，Maximum Diagonal Length＝10，Consensus cutoff＝50％）を用いて整列させる。シュードモナス菌のリパーゼ Pseudomonas aeruginosa TE3285（file ate3285d） Pseudomonas pseudoalcaligenes M1(Lipomaxwt)（file pseudmld） Pseudomonas sp．SD705(mature)（file spsd705d） Pseudomonas wisconsinensis（file wisconsd） Proteus vulgaris K80（file provulgd） Pseudomonas fragi IFO 12049（file fr12049d）。シュードモナス菌のリパーゼをシャッフリングするために適するプライマーを以下に示す。Ｉはイノシンを表し、数字は、整列下での位置を指し、Ｓはセンス鎖を意味する。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドも使われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者シェリー，ジョエルアール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デービス，アンダーソンロード 916

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の過程を含んでいる、注目する非相同配列をシャッフリングする方法：ｉ）注目する非相同配列間で、少くとも１つの保存領域を同定すること； ii）注目する各非相同配列の、前記保存領域を含んでいる断片を作成すること；及び、 iii）前記保存領域を、相同な連結点として利用して、前記断片をシャッフリング／組換えすること。２．請求項１の過程に加えて、更に以下の過程を含んでいる、希望する生物活性を有するシャッフリングされたタンパク質を生産する方法： iv）請求項１の過程iii）由来の多数の異なったシャッフリングされた配列によってコードされる多数の異なった組換えタンパク質を発現させること；及び、ｖ）希望する活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を得るために、適当なスクリーニング又は選択システムによって、過程iv）の多数の異なった組換えタンパク質をスクリーニング又は選択すること。３．以下の過程を含んでいる、少くとも１つの保存領域を有する非相同性DNA 配列をシャッフリングする請求項１の方法：ｉ）２つ以上の非相同配列において、１つ以上の保存領域（以下“Ａ，Ｂ，Ｃ ”などと記す）を同定すること； ii）ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のための少くとも２組のPCRプライマー（各組は、センス及びアンチセンスプライマーを含む）を作成すること、ただし、１つ目の組では、センスプライマー（これを「ａ」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の５’配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ａ’」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の３’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、そして２つ目の組では、センスプライマー（これを「ｂ」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の５’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ｂ’」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の３ ’配列領域に対するものであり、これらのプライマーの組「ａ」及び「ａ’」、並びに「ｂ」及び「ｂ’」の間の領域で指定されるこの２つの配列領域（この両方の領域は、実際のプライマー配列を含んでいる）は、保存領域内に少くとも10塩基対（bp）の相同な配列重複を有し； iii）過程ｉ）において同定された注目する１つ以上の保存領域のために、過程ｉ）の非相同DNA配列を鋳型として、２回のPCR増幅反応を行うこと、ただし、そのPCR反応の１つでは、過程ii）において決定した５’プライマー組（例えば「ａ」、「ａ’」）を使用し、そして２つ目のPCR反応では、過程ii）において決定した３’プライマー組（例えば「ｂ」、「ｂ’」）を使用し； iv）過程ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のために、過程iii）で記載した様に作成したPCR断片を単離すること；ｖ）過程iv）で単離した２つ以上のPCR断片を混合し、そしてこれらの単離したPCR断片を鋳型として用いて、配列重複伸長PCR反応(SOE-PCR)を行うこと；及び、 vi）過程ｖ）で得られたPCR断片を単離すること、ただし、この単離したPCR断片は、過程iv）で単離したPCR断片からシャッフリングされた混合物を含んでいる多数の異なったシャッフリングされた配列を含んでいて、これらのシャッフリングされた配列は、過程ii）の相同配列重複に由来する部分DNA配列が、過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して少くとも80 ％の同一性を有することを特徴とする。４．以下の過程を含んでいる、希望する生物活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を生産する請求項２の方法：少くとも１つの保存領域を有する非相同DNA配列をシャッフリングして、タンパク質をコードする配列を得ることで、ｉ）２つ以上の非相同配列において、１つ以上の保存領域（以下“Ａ，Ｂ，Ｃ ”などと記す）を同定すること； ii）ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のための少くとも２組のPCRプライマー（各組は、センス及びアンチセンスプライマーを含む）を作成すること、ただし、１つ目の組では、センスプライマー（これを「ａ」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の５’配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ａ’」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の３’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、そして２つ目の組では、センスプライマー（これを「ｂ」と称する）は、前記保存領域のセンス鎖の５’配列領域に対するか、または少くとも部分的に前記保存領域内にある配列領域に対するものであり、アンチセンスプライマー（これを「ｂ’」と称する）は、前記保存領域（例えば保存領域「Ａ」）のセンス鎖の３’配列領域に対するものであり、これらのプライマーの組「ａ」及び「ａ’」、並びに「ｂ」及び「ｂ’」の間の領域で指定されるこの２つの配列領域（この両方の領域は、実際のプライマー配列を含んでいる）は、保存領域内に少くとも10塩基対（bp）の相同な配列重複を有し； iii）過程ｉ）において同定された注目する１つ以上の保存領域のために、過程ｉ）の非相同DNA配列を鋳型として、２回のPCR増幅反応を行うこと、ただし、そのPCR反応の１つでは、過程ii）において決定した５’プライマー組（例えば「ａ」、「ａ’」）を使用し、そして２つ目のPCR反応では、過程ii）において決定した３’プライマー組（例えば「ｂ」、「ｂ’」）を使用し； iv）過程ｉ）で同定された１つ以上の保存領域のために、過程iii）で記載した様に作成したPCR断片を単離すること；ｖ）過程iv）で単離した２つ以上のPCR断片を混合し、そしてこれらの単離したPCR断片を鋳型として用いて、配列重複伸長PCR反応(SOE-PCR)を行うこと；及び、 vi）過程ｖ）で得られたPCR断片を単離すること、ただし、この単離したPCR断片は、過程iv）で単離したPCR断片からシャッフリングされた混合物を含んでいる多数の異なったシャッフリングされた配列を含んでいて、これらのシャッフリングされた配列は、過程ii）の相同配列重複に由来する部分DNA配列が、過程ｉ）の元々の１つ以上の非相同DNA配列の１つ以上の部分配列に対して少くとも80 ％の同一性を有することを特徴とし；更に、 vi）過程vi）の多数の異なったシャッフリングされた配列によってコードされる多数の異なった組換えタンパク質を発現すること；及び、 viii）希望する活性を有する１つ以上の組換えタンパク質を得るために、適当なスクリーニング又は選択システムによって、過程vii）の多数の異なった組換えタンパク質をスクリーニング又は選択すること。５．前記の注目する非相同配列が酵素をコードしている、請求項１〜４のいずれか一項の方法。６．前記酵素が、プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にはスブチラーゼであるか；又はリパーゼである、請求項５の方法。７．前記の過程iii）で行われるPCR増幅を、低、中、または高頻度のランダム変異誘発が生じる条件下で行う、請求項３又は４の方法。８．前記の希望する活性が、食器洗浄用又は衣類洗浄用洗剤における前記組換えタンパク質の性能を向上させる活性である、請求項２又は４の方法。