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JP2001514906A - 核酸種を検出または定量するための方法および組成物 - Google Patents

核酸種を検出または定量するための方法および組成物

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JP2001514906A
JP2001514906A JP2000509878A JP2000509878A JP2001514906A JP 2001514906 A JP2001514906 A JP 2001514906A JP 2000509878 A JP2000509878 A JP 2000509878A JP 2000509878 A JP2000509878 A JP 2000509878A JP 2001514906 A JP2001514906 A JP 2001514906A
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nucleic acid
sequence
array
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JP2000509878A
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ドルマナック，ラドジェ
ドルマナック，スネザナ
バイドヤ，ナラヤン
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ハイセック，インコーポレーテッド
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Priority claimed from US08/947,779 external-priority patent/US20020034737A1/en
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、基体に固定されたプローブのアレイおよび多数の標識プローブを用いて標的核酸種を検出する方法を提供する。本発明はまた、物理的性質に基づいて多数のセットに分類できる離散粒子に結合されたオリゴヌクレオチドプローブに関する。異なるプローブがそれぞれのセットの離散粒子に結合され、プローブの正体は離散粒子をその物理的性質から同定することで決定される。本発明はさらに、相補的ポリヌクレオチド鎖の結合を不安定にする（結合エネルギーを低下させる）薬剤または相補的ポリヌクレオチド鎖間の結合の安定性を高める（結合エネルギーを増大させる）薬剤を使用する方法に関する。図面はプローブアレイを大量生産するための装置の概略図である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 関係出願へのクロス参照 本出願は、1997年8月15日出願された米国特許出願第08/912,885号の一部継続 、かつ1997年10月9日出願された米国特許出願第08/947,779号の一部継続、かつ1
997年7月14日出願された米国特許出願第08/892,503号の一部継続、かつ1997年3 月4日出願された米国特許出願第08/812,951号の一部継続、かつ1997年1月16日出
願された米国特許出願第08/784,747号の一部継続である。
【０００２】 発明の分野 本発明は全体的には核酸分析のための方法および装置（apparatus）に関し、 特定的には核酸分析の方法および装置（apparati）に関する。
【０００３】 背景 核酸サンプル中の４種の核酸の配列を決定する速度は、分子生物学、医薬、お
よび生物工学の一層の進歩にとって主な技術的障害である。ゲル中で核酸分子を
分離する核酸配列決定法は、1978年以来使われている。核酸配列決定のための他
の実証された方法はハイブリダイゼーションによる配列決定（SBH）である。
【０００４】 ヌクレオチド配列（すなわち、サンプルのA、G、CおよびTヌクレオチドの順序
）を決定する伝統的な方法は、無作為な末端をもち、異なる標識を付した核酸断
片の混合物を調製し、特異的なヌクレオチドで分解し、または複製鎖のジデオキ
シ鎖末端によって行われる。その後、1〜500bpの範囲の得られた核酸断片をゲル
上で分離して、隣接サンプルが１個のヌクレオチドだけ長さが異なるバンドのラ
ダーを作製する。
【０００５】 SBHのアレイに基くアプローチは、核酸分子の分離、分解、合成またはイメー ジングにおける単一塩基分解を必要としない。長さがK塩基の短いオリゴヌクレ オチドの誤対合を識別するハイブリダイゼーションを使って、標的核酸に対して
構成K-merオリゴヌクレオチドのリストを決定することができる。標的核酸に対 する配列を、ユニークにオーバーラップしてスコアされるオリゴヌクレオチドに
より構築することができる。
【０００６】 ハイブリダイゼーションにより配列決定を達成するために複数のアプローチを
利用できる。SBHフォーマット１と呼ぶプロセスでは、核酸サンプルをアレイし 、標識プローブをサンプルとハイブリダイズさせる。同じサンプル核酸のセット
をもつレプリカ膜（replica membranes）をいくつかのプローブの平行スコアリ ングに使うことができるし、そして／またはプローブを多重化することができる
。核酸サンプルをナイロン膜または他の適当な支持体上でアレイしてハイブリダ
イズさせることができる。それぞれの膜アレイを何回も再使用することができる
。フォーマット１は、多数のサンプルのバッチ処理用に特に効率的である。
【０００７】 SBHフォーマット２では、プローブをそれぞれの配列に対応する基体上の位置 にアレイし、標識した核酸サンプル断片をアレイしたプローブにハイブリダイズ
させる。この場合、ある断片に関する配列情報を、全アレイ配列プローブとの同
時ハイブリダイゼーション反応で決定することができる。他の核酸断片を配列決
定するために、同じオリゴヌクレオチドアレイを再使用することができる。該ア
レイはスポットすることにより、またはプローブのin situ合成によって作製す ることができる。
【０００８】 SBHフォーマット３では、２セットのプローブを使う。１つの実施様態では、 １つのセットは既知の位置をもつプローブのアレイの形であることができ、そし
て他の標識したセットはマルチウエルプレート中に貯えることができる。この場
合、標的核酸を標識する必要はない。標的核酸および１つ以上の標識プローブを
アレイしたプローブセットに加える。もし１つの結合されたプローブと１つの標
識プローブが両方とも標的核酸に近接してハイブリダイズすれば、それらは共有
結合により連結反応し、連結反応したプローブの長さの合計に等しい検出配列を
生成する。該プロセスにより、長い核酸断片、例えば完全な細菌ゲノムを、核酸
が小片にサブクローニングすることなく配列決定することが可能になる。
【０００９】 本発明において、SBHは、１つ以上の核酸サンプルの効率的な同定および配列 決定に応用される。該方法は、核酸診断、法医学、および遺伝子マッピングに多
くの応用がある。それはまた、遺伝子障害および他の形質に関連する変異を同定
し、生物多様性を評価し、そして核酸配列に依存する多くの他の型のデータを作
るために使うことができる。
【００１０】 発明の概要 本発明は、標的核酸種を検出する方法であって、基体に固定されたプローブの
アレイと多数の標識されたプローブを用意し、ここに各標識プローブは標的核酸
の第１部分に相補的である第１核酸配列を有するものが選択され、そしてここに
基体に固定された少なくとも１つのプローブの核酸配列は標的核酸配列の第２部
分に相補的でありかつ該第２部分は該第１部分に隣接しており；プローブ配列を
相補的配列とハイブリダイゼーションするのに適当な条件下で、標的核酸をアレ
イに添加し；標識プローブをアレイに導入し；基体に固定したプローブを標的核
酸とハイブリダイズさせ；標識プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ；標識
プローブを、アレイ中の隣接してハイブリダイズしたプローブに固定させ；そし
てアレイ中のプローブに固定した標識プローブを検出するステップを含む上記方
法を提供する。本発明の好ましい方法によると、基体に固定されたプローブのア
レイはプローブの普遍的セットを含む。本発明の他の好ましい様態では、基体に
固定された少なくとも２つのプローブが標的核酸配列のオーバーラップする配列
を定義し、さらに好ましくはすくなくとも２つの標識プローブが標的核酸配列の
オーバーラップする配列を定義する。そしてさらに本発明の他の様態によると、
既知配列の標的核酸を検出する方法であって、核酸サンプルを固体基体に結合し
た固定オリゴヌクレオチドプローブの１セットとハイブリダイゼーション条件下
で接触させ、ここに該固定プローブは上記標的核酸配列の異なる部分と特異的ハ
イブリダイゼーションの能力があり；標的核酸を溶液中の標識オリゴヌクレオチ
ドプローブの１セットとハイブリダイゼーション条件下で接触させ、ここに該標
識プローブは固定プローブに隣接した上記標的核酸配列の異なる部分と特異的ハ
イブリダイゼーションする能力があり；該固定プローブを、標的配列上の固定プ
ローブにすぐ隣接する標識プローブに（例えばリガーゼで）共有結合で接続し；
連結反応してない標識プローブを除去し；標的核酸の存在を固定プローブに結合
された上記標識プローブの存在を検出することによって検出するステップを含ん
でなる上記方法が提供される。本発明はまた、細胞型、組織または組織混合物内
に部分的または完全に配列決定された遺伝子のセットのメンバーの発現を決定す
る方法であって、配列決定された遺伝子に特異的な固定されかつ標識されたプロ
ーブの対を定義し；非標識の核酸サンプルと対応する標識プローブを１つ以上の
固定したプローブのアレイとハイブリダイズさせ；隣接するハイブリダイズした
標識されかつ固定されたプローブ間に共有結合を形成させ；連結反応してないプ
ローブを除去し；そして、アレー中の予め特定した位置に結合した標識プローブ
の検出により配列決定された遺伝子の存在を決定するステップを含んでなる上記
方法を提供する。本発明のこの様態の好ましい実施様態では、標的核酸は感染剤
の存在を同定するであろう。
【００１１】 さらに、本発明は、ナイロン膜（該ナイロン膜上にオリゴヌクレオチドプロー
ブの複数のサブアレイがあり、該サブアレイは複数の個別スポットを含んでなり
、ここに各スポットは同じ配列の複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んでな
る）；および複数の疎水性バリアー（ナイロン膜上のサブアレイ間に位置し、そ
れにより隣接サブアレイ間の交叉汚染を防止する）を含んでなるオリゴヌクレオ
チドプローブのアレイを提供する。
【００１２】 さらに、本発明は、標的核酸の第１末端および第２末端を有する反復配列の配
列を決定する方法であって、(a)複数の様々な長さのスペーサーオリゴヌクレオ チドであって、該反復配列を含んでなるスペーサーオリゴヌクレオチドを用意し
、；(b)反復配列の第１末端に隣接することが知られている第１オリゴヌクレオ チドを用意し；(c)その１つが反復配列の第２末端に隣接する複数の第２オリゴ ヌクレオチドであって、標識されている複数の第２オリゴヌクレオチドを用意し
；(d)第１および複数の第２オリゴヌクレオチド、ならびに複数のスペーサーオ リゴヌクレオチドの１つを、標的核酸にハイブリダイズすること；(e)ハイブリ ダイゼーションしたオリゴヌクレオチドを連結反応させること；(f)連結反応し たオリゴヌクレオチドを連結反応してないオリゴヌクレオチドから分離すること
；そして(g)連結反応したオリゴヌクレオチド中の標識を検出するステップを含 んでなる上記方法を提供する。
【００１３】 そしてさらに、本発明は、標的核酸内の第１末端および第２末端を有する分枝
点（branch point）配列の配列決定する方法であって、(a)分枝点配列の第１部 分と相補的である第１オリゴヌクレオチドを用意し、ここに該第１オリゴヌクレ
オチドは分枝点配列の第１末端から少なくとも１つのヌクレオチドだけ伸長し；
(b)標識されかつ分枝点配列の第２部分と相補的である複数の第２オリゴヌクレ オチドを用意し、ここに複数の第２オリゴヌクレオチドは分枝点配列の第２末端
から少なくとも１つのヌクレオチドだけ伸長し、かつここに分枝点配列の第２末
端から伸長する第２オリゴヌクレオチドの該部分は分枝点配列から生じる複数の
配列と相補的である配列を含んでなり；(c)第１オリゴヌクレオチドおよび複数 の第２オリゴヌクレオチドの１つを標的DNAとハイブリダイズし、；(d)ハイブリ
ダイズしたオリゴヌクレオチドを連結反応させ；(e)連結反応したオリゴヌクレ オチドを連結反応していないオリゴヌクレオチドから分離し；そして(f)連結反 応したオリゴヌクレオチドの標識を検出するステップを含んでなる上記方法を提
供する。
【００１４】 そしてさらに、本発明は、標的核酸にネガティブであると予測されるプローブ
を使って配列を確める方法を提供する。その場合、標的の配列は、標的核酸を「
ネガティブ」プローブとハイブリダイズさせてこれらのプローブが標的核酸と完
全な対合を形成しないことを確めることによって、確められる。
【００１５】 そしてさらに、本発明は、プローブを配列情報を失うことなくハイブリダイゼ
ーション反応において多重化できるように、異なる標識と複合体化したオリゴヌ
クレオチドプローブを使って核酸を分析する方法を提供する（すなわち、異なる
プローブの標的とのハイブリダイゼーションを識別できるように、異なるプロー
ブは異なる標識を有する）。好ましい実施様態では、該標識は放射性同位体、ま
たは蛍光分子、または酵素、または電気泳動質量標識である。さらに好ましい実
施様態では、異なる標識を付したオリゴヌクレオチドプローブをフォーマットII
I SBHで使用し、多重プローブ（２つ以上で、１つのプローブは固定したプロー ブである）をお互いに連結反応させる。
【００１６】 そしてさらに、本発明は、サンプル中に標的が相同的な核酸と比較して非常に
小量で存在するとき、既知の配列を有する標的核酸の存在を検出する方法を提供
する。好ましい実施様態では、該標的核酸は、多数のソース由来の核酸を有する
サンプル中に非常に低頻度で存在する対立遺伝子である。代りの好ましい実施様
態では、該標的核酸は変異配列を有し、かつ核酸のサンプル内に非常に低頻度で
存在する。
【００１７】 そしてさらに、本発明は、シングルパスのゲル配列決定を使って標的核酸の配
列を確める方法を提供する。シングルパスのゲル配列決定のためのプライマーは
、SBHにより得た配列から誘導し、これらのプライマーを標準サンガー（Sanger ）配列決定反応に使って標的核酸のゲル配列情報を提供する。その後、シングル
パスゲル配列決定により得た配列をSBHで誘導した配列と比較して、該配列を確 める。
【００１８】 そしてさらに、本発明は、シングルパスゲル配列決定を使って分枝点を解明す
る方法を提供する。シングルパスゲル配列決定反応のためのプライマーをSBH配 列決定の第１ラウンド後に得たSfsの末端から同定し、そしてこれらのプライマ ーを標準サンガー配列決定反応に使って、Sfsの分枝点を通過するゲル配列決定 情報をあたえる。その後、Sfsを、分枝点を通過するサンガー配列決定結果をSfs
と比較して整列させ、隣接するSfsを同定する。
【００１９】 そしてさらに、本発明は、SBH反応の前に該PCR産物を精製しないで、PCRによ り標的核酸を含むサンプルを調製する方法を提供する。SBHフォーマットIで、粗
PCR産物を前精製することなく基体に添加し、標識プローブの導入前に該基体を 洗浄することができる。
【００２０】 そしてさらに、本発明は、標的核酸を分析する方法および装置を提供する。該
装置は、所望の時間、一緒に混合した核酸の２つのアレイを含んでなる。好まし
い実施様態では、１つのアレーの核酸は標識される。さらに好ましい実施様態で
は、ある材料を２つのアレイ間に配置し、この材料がアレイ中の核酸の混合を防
止する。この材料を取除くかまたは浸透できるようにすると、２つのアレイの核
酸はお互いに混合される。代りの好ましい実施様態では、１つのアレイの核酸は
標的核酸であり、他のアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである。他の
好ましい実施様態では、両アレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである。
他の好ましい実施様態では、１つのアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブ
および標的核酸であり、他のアレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブである
。他の好ましい実施様態では、両アレイの核酸はオリゴヌクレオチドプローブお
よび標的核酸である。
【００２１】 上に記載の装置を使う本発明の１つの方法は、基体に固定された核酸のアレイ
を用意し、核酸の第２アレイを用意し、第２アレイ中の核酸が固定されたアレイ
の核酸と接触することを可能にする条件をあたえ、ここに核酸のアレイの１つは
標的核酸であり他のアレイはオリゴヌクレオチドプローブであり、そして該ハイ
ブリダイゼーション結果を分析するステップを含んでなる。好ましい実施様態で
は、固定されたアレイは標的核酸であり、第２アレイは標識オリゴヌクレオチド
プローブである。さらに好ましい実施様態では、２つのアレイ間に配置されたあ
る材料があり、該材料を取除くかまたは核酸へ浸透できるようにするまで核酸の
混合を防止する。
【００２２】 上に記載の装置を使う本発明の第２の方法は、核酸プローブの２つのアレイを
用意し、プローブの２つのアレイがお互いにおよび標的核酸と接触することを可
能にする条件をあたえ、標的核酸上で隣接しているプローブを一緒に連結反応さ
せ、そして該結果を分析するステップを含んでなる。好ましい実施様態では、１
つのアレイのプローブは固定されかつ他のアレイのプローブは標識されている。
さらに好ましい実施様態では、２つのアレイの間に配置されたある材料があり、
該材料を取除くかまたはプローブへ浸透できるようにするまでプローブの混合を
防止する。
【００２３】 そしてさらに、本発明は、その上にオリゴヌクレオチドプローブが固定されて
いる基体を提供し、ここに各プローブは隣接プローブからサンプル溶液の流動に
抵抗する物理的バリアーにより分離されている。好ましい実施様態では、該物理
的バリアーは疎水性材料で作られている。
【００２４】 そしてさらに、本発明は、物理的バリアーにより分離されたオリゴヌクレオチ
ドプローブのアレイを作る方法を提供する。好ましい実施様態では、材料を添加
するインクジェットヘッドを使って基体にグリッドを添加し、アレイの反応容積
を削減する。
【００２５】 そしてさらに、本発明は、その上にオリゴヌクレオチドを固定して３次元アレ
イを形成する基体を提供する。３次元アレイは、プローブ結果を読取る高分解（
各レベルは比較的低密度のプローブ／cm2を有する）と３次元空間の高情報含量 （多重レベルまたはプローブ）を合わせもつ。
【００２６】 そしてさらに、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブを固定する基体を提供
し、ここに該オリゴヌクレオチドプローブはスペーサーを有し、そしてここに該
スペーサーは基体とオリゴヌクレオチドプローブの情報部分（例えば、標的と結
合し配列情報を与えるオリゴヌクレオチドプローブの部分）の間の距離を増加す
る。好ましい実施様態では、スペーサーはリボース糖類およびホスフェートを含
んでなり、ここに該ホスフェートはリボース糖類と5'および3'ヒドロキシル基を
介してエステルを形成することによりリボース糖類をポリマーに共有結合で結合
している。
【００２７】 そしてさらに、本発明は、単独の代表的クローンを配列決定の各群から選択で
きるように、cDNAクローンを類似または同一配列の群中にクラスター化する方法
を提供する。好ましい実施様態では、クラスター化の方法は、複数のクローンの
配列決定に使われ、各クローンを複数のオリゴヌクレオチドプローブに照会し；
各クローンと結合するプローブおよび各プローブのシグナル強度を決定し；類似
のプローブに類似の強度で結合するクローンを同定することによって、クローン
を複数の群にクラスター化し；そして各群から少なくとも１つのクローンを配列
決定するステップを含んでなる。さらに好ましい実施様態では、複数のプローブ
は約50〜約500の異なるプローブを含んでなる。他のさらに好ましい実施様態で は、複数のプローブは約300の異なるプローブを含んでなる。最も好ましい実施 様態では、複数のクローンは複数のcDNAクローンである。
【００２８】 そしてさらに、本発明は、離散粒子と（共有結合でまたは非共有結合で）複合
体化されたオリゴヌクレオチドプローブに関係し、該粒子は物理的性質に基いて
複数のセットに分類される。好ましい実施様態では、異なるプローブを各セット
の離散粒子に結合させ、プローブの同一性を離散粒子の物理的性質を同定するこ
とにより決定する。代りの実施様態では、プローブをプローブの物理的性質に基
いて同定する。物理的性質は、離散粒子を識別することに使うことができるどの
物理的性質も含み、例えば、サイズ、蛍光性、放射能、電磁荷、または吸光度を
含み、または標識を染料、放射性核種、またはEMLのような粒子に結合させるこ とができる。好ましい実施様態では、離散粒子は粒子のサイズ、電荷、蛍光、ま
たは吸光度を検出するフローサイトメーター（flow cytometer）により分離され
る。
【００２９】 本発明はまた、離散粒子と複合体化したプローブを使って標的核酸を分析する
方法にも関係する。これらのプローブは、上に記載のどの方法にでも、離散粒子
の物理的性質によりプローブを同定する修正をして使うことができる。これらの
プローブはまた、フォーマットIIIアプローチを使うことができ、この場合、「 遊離した（free）」プローブは標識により同定し、そして離散粒子に複合したプ
ローブは物理的性質により同定する。好ましい実施様態では、該プローブは、SB
Hを使い標的核酸の配列決定をするために使う。
【００３０】 本発明はまた、相補的ポリヌクレオチド鎖の結合を不安定化する（結合エネル
ギーを低下させる）か、または相補的ポリヌクレオチド鎖間の結合を安定化する
（結合エネルギーを増加する）薬剤を使う方法に関係する。好ましい実施様態で
は、該薬剤はトリアルキルアンモニウム塩、塩化ナトリウム、リン酸塩、ホウ酸
塩、ホルムアミド、グリコール、ジメチルスルホキシド、およびジメチルホルム
アミドのような有機溶媒、尿素、グアニジニウム、ベタインのようなアミノ酸類
似体、スペルミジンおよびスペルミンのようなポリアミン、またはホスフェート
骨格の負電荷を中和する他の正に荷電した分子、ドデシル硫酸塩ナトリウムおよ
びナトリウムラウリルサルコシネートのような洗剤、小溝／主溝（minor/major
groove）結合剤、正に荷電したポリペプチド、およびアクリジンのようなインタ
ーカレート剤（intercalating agent）、エチジウムブロミド、ならびにアント ラシンである。好ましい実施様態では、相補的ポリヌクレオチドの対のTmを低下
または上昇させるために薬剤を使う。さらに好ましい実施様態では、相補的ポリ
ヌクレオチドの対のTmを低下または上昇させるために該薬剤の混合物を使う。最
も好ましい実施様態では、相補的ポリヌクレオチドの誤対合と完全な対合との区
別を向上させるために薬剤もしくは薬剤の混合物を使う。好ましい実施様態では
、AT塩基対からの結合エネルギーがGC塩基対の結合エネルギーとほぼ等しくなる
ように単数または複数の薬剤を加える。これらの相補的ポリヌクレオチドの結合
のエネルギーは、ポリヌクレオチド骨格のホスフェート基の負電荷を中和もしく
は遮蔽する薬剤を加えることによって、増加させることができる。
【００３１】 好ましい実施様態の詳細な説明 SBHフォーマット１は、大きいサンプルのセットの同時分析に適している。膜 の小片を使って、大アレイ上の数千のサンプルの平行スコアリングを、数千の独
立したハイブリダイゼーション反応で実施することができる。DNAの同定は、１ 反応当り1〜20個のプローブに関わりうるし、ある場合には、変異の同定は各サ ンプルに対して特定的に選択されたまたは設計された1000以上のプローブに関わ
りうる。変異DNAセグメントの性質の同定のために、ハイブリダイゼーションの 第１ラウンドで検出した各変異に対して特定のプローブを合成または選択するこ
とがありうる。
【００３２】 DNAサンプルを、適当なスペーサーで分離した小アレイ中で調製することがで き、そしてマルチウエルプレートにアレイすることができるオリゴヌクレオチド
のセットから選択されるプローブで、該DNAサンプルを同時に試験することがで きる。小アレイは１つ以上のサンプルからなることができる。それぞれの小アレ
イ中のDNAサンプルは、変異体または個別の配列サンプルを含むことができる。 継続した小アレイをさらに大きいアレイに組織することができる。このような、
さらに大きいアレイは同じ小アレイの複製物を含むことができるし、または異な
るDNA断片サンプルのアレイを含むことができる。プローブの普遍的セットは、D
NA断片を予め規定した精度で（例えば各塩基対（「bp」）を読むことの重複性（
redundancy）について）分析するために十分なプローブを含む。これらのセット
は、１つの特定の断片に必要であるより多いプローブを含むことができるが、数
千の異なる配列のDNAサンプルを試験するに必要であるより少ないプローブを含 むことができる。
【００３３】 DNAもしくは対立遺伝子同定および診断配列決定プロセスは、 1) 手のこんだ、代表的なまたは普遍的なセットから、複数の小アレイのそれ
ぞれとハイブリダイズさせるプローブのサブセットの選択； 2) 平行して分析するアレイのそれぞれの各サブアレイに、第１プローブを加
えること； 3) ハイブリダイゼーションを実施し、ハイブリダイゼーション結果のスコア
リングをすること； 4) 先に使ったプローブを脱離させること； 5) スコアリングする残りのプローブに対して、ハイブリダイゼーション、ス
コアリング、脱離のステップを繰返すこと； 6) 取得した結果を処理して、最終分析を得るかまたはハイブリダイズする追
加のプローブを決定すること； 7) ある特定のサブアレイについて追加のハイブリダイゼーションを実施する
こと；および 7) データの完全なセットを処理し、最終分析を得ること のステップを含むことができる。
【００３４】 本アプローチは、１つの型（例えば、DNA、RNA）の少数の核酸サンプルの迅速
な同定と配列決定を提供し、また予め合成した管理可能なサイズのプローブセッ
トを使って、サブアレイの形の多くのサンプル型の平行分析を提供する。２つの
アプローチを組み合わせて、DNA同一性の決定用、DNA診断用、および変異体同定
用の、効率的で用途の広いプロセスを作ることができる。
【００３５】 既知配列の同定のために、より短いプローブの小セットをより長いユニークな
プローブの代りに使うことができる。このアプローチで、スコアすべきプローブ
はより多いが、プローブの普遍的セットをどのタイプの配列もカバーするように
合成することができる。例えば、６-merのフルセットは、4096プローブだけを含
み、７-merの完全セットは16,384プローブだけを含む。
【００３６】 DNA断片の完全配列決定は、２つのレベルのハイブリダイゼーションで実施す ることができる。１つのレベルは、少なくとも1回どの塩基もみなカバーするに 十分なプローブセットのハイブリダイゼーションである。この目的のために、標
準サンプル用にある特定のプローブセットを合成することができる。このような
プローブセットによるハイブリダイゼーションの結果は、非標準サンプルで変異
（相異）が起っているかどうか、およびどこで起っているかを明らかにする。さ
らに、このプローブセットは、「ポジティブ」プローブのハイブリダイゼーショ
ン結果を確めるための「ネガティブ」プローブを含む。変化の同一性を決定する
ために、追加の特異的プローブを該サンプルにハイブリダイズさせることができ
る。この追加のプローブセットは「ポジティブ」（変異配列）および「ネガティ
ブ」の両方のプローブを有し、そして配列変化はポジティブプローブにより同定
され、かつネガティブプローブにより確められるであろう。
【００３７】 他の実施様態では、普遍的セットからの全プローブをスコアすることができる
。普遍的プローブセットにより、２ステップのプロセスで、時間の望ましくない
消費をすることなく、サンプル当り比較的小数のプローブのスコアリングが可能
になる。ハイブリダイゼーションプロセスは、最初にハイブリダイズするプロー
ブの最適サブセットを計算する第１ステップ、そして、その後、得られた結果に
基いて、普遍的セットのプローブの中からスコアする追加のプローブを決定する
第２ステップの逐次的プロービングによることができる。両方のプローブセット
は、セット中にポジティブプローブを確めるための「ネガティブ」プローブを有
する。さらに、その後、得られた配列は、該サンプルをSBH結果から同定した「 ネガティブ」プローブセットとハイブリダイズすることにより、別のステップで
確めることができる。
【００３８】 SBH配列の構築において、分析したDNA断片中に機会または生物学的理由により
繰返し存在するK-1オリゴヌクレオチドは、特別な考慮がなされるべきであろう 。もしさらなる情報がなければ、全ての塩基対が数回読まれるように、DNAの比 較的小さい断片を完全に構築することができる。
【００３９】 比較的長い断片の構築においては、ポジティブにスコアされるK-1配列のプロ ーブセット（すなわち、プローブ長より短い配列）が反復して存在するために曖
昧さが生じうる。この問題は、もし変異または類似の配列を決定する場合は存在
しない（すなわち、K-1配列は同一に繰返されない）。１つの配列の知識をテン プレートとして使い、ポジティブプローブをアレイして未知配列が該テンプレー
トにベストフィットを示すことにより、類似であることがわかっている配列（例
えば、データベース中のその存在より）を正しく構築することができる。
【００４０】 サンプルのアレイの使用により、１つのシングルサンプルについてまたは小さ
いセットのサンプルについての多くのオリゴヌクレオチドの継続的スコアリング
を回避することができる。このアプローチにより、ただ１つの物理的オブジェク
トの操作によって、平行してより多くのプローブのスコアリングが可能になる。
1000bp長さのDNAサンプルのサブアレイを比較的短い時間に配列決定することが できる。もし該サンプルを１アレイに50サブアレイでスポットし、該アレイを10
回再プローブすると、500プローブをスコアすることができる。変異の存在のた めのスクリーニングでは、各塩基を３回カバーするに十分なプローブを使うこと
ができる。もし変異が存在すれば、いくつかのカバーするプローブが影響を受け
るであろう。ネガティブプローブの同一性の情報を使うと、２塩基精度で変異を
マッピングすることができる。この方法でマッピングした１つの塩基の変異を解
明するために、さらに15プローブを用いることができる。これらのプローブは、
（欠失と挿入が関ってないと仮定して）２つの疑問ある位置に対するどの塩基組
合わせもカバーする。これらのプローブを、1サイクルに所与のサンプルを含有 する50サブアレイについてスコアリングさせる。多重標識カラースキーム（すな
わち多重化）の実施では、異なる蛍光染料のような異なる標識をそれぞれ有する
2〜6プローブをプールとして使い、それによりハイブリダイゼーションのサイク
ル数を削減し、配列決定プロセスを短縮することができる。
【００４１】 さらに複雑な事例では、２つの近接した変異または挿入がありうる。それらは
もっと多いプローブで扱うことができる。例えば、３塩基挿入は64プローブで解
決することができる。最も複雑な場合は、数ステップのハイブリダイゼーション
でアプローチし、前のハイブリダイゼーションの結果に基いて新しいプローブセ
ットを選択することができる。
【００４２】 もし分析するサブアレイが数十または数百の１つの型のサンプルを含むならば
、それらのいくつかは１つ以上の変化（変異、挿入、または欠失）を含有しうる
。変異が存在する各セグメントに対して、特定のプローブセットをスコアするこ
とができる。サンプルの１つの型に対してスコアすべきプローブの全数は数百で
ありうる。複製アレイの平行スコアリングにより、比較的少ないサイクル数で数
百のプローブのスコアリングが可能になる。さらに、適合性のあるプローブをプ
ールすることができる。ポジティブハイブリダイゼーションを、特定のDNAセグ メントをチェックするために選択されたプローブに割りあてることができる。何
故なら、これらのセグメントは通常、構成塩基の75%が異なるからである。
【００４３】 より大きいより長いプローブセットを使うことにより、より長い標的を分析す
ることができる。これらの標的はエキソンクローンのプールのような断片のプー
ルを代表することができる。
【００４４】 特異的ハイブリダイゼーションスコアリング法を用いて、二倍体染色体セット
からの配列決定すべきゲノムセグメント中の変異体の存在を定義することができ
る。２つの変形があり；i)１つの染色体からの配列は既知の対立遺伝子を表し、
他の染色体からの配列は新しい変異を表す場合；または、ii)染色体の両方とも 新しいが異なる変異体である場合である。両ケースとも、変化をマッピングする
よう設計された走査ステップは、変異位置で２倍の最大シグナル差を与える。さ
らに、該方法を使って、ある遺伝子のどの対立遺伝子が個体（individual）によ
り運ばれ、そして該個体はその遺伝子に対してホモ接合性かヘテロ接合性かを同
定することができる。
【００４５】 第１のケースで要求される２倍のシグナル差のスコアリングは、対応シグナル
をホモ接合性およびヘテロ接合性対照と比較することにより効率的に実施するこ
とができる。このアプローチにより、所与のサンプルの各特定プローブに対する
ハイブリダイゼーションシグナルの相対的減少を決定することが可能になる。こ
れは、同じ完全な対合標的を有する異なる核酸断片とハイブリダイズした特定の
プローブに対して、ハイブリダイゼーション効率が２倍以上変化しうるので、重
要である。さらに、異なる変異部位は、オリゴヌクレオチドプローブの数に依存
して１つ以上のプローブに影響を与えることができる。２〜４個の継続的プロー
ブに対するシグナルの低下は、変異部位のさらに著しい徴候を与える。結果は、
選択されたプローブの小さいセットで試験してチェックすることができ、その中
で誤対合を含有する二本鎖から来るシグナルより平均で8倍強い完全な対合シグ ナルを与える１つまたは少数のプローブが選択される。
【００４６】 分配した膜により、所与の配列型を表す比較的多数のサンプルまたは比較的小
数のサンプルで表される多くの異なる型のサンプルに適合する、非常に柔軟性の
ある実験組織が可能になる。4〜256サンプルの範囲を特に効率的に取扱うことが
できる。この範囲内のドット数のサブアレイを、オリゴヌクレオチドの貯蔵と標
識付けのために使う標準マルチウエルプレートの構造とサイズに整合するように
設計することができる。サブアレイのサイズを、異なるサンプル数に調節するか
、または少数の標準サブアレイサイズを使うことができる。もしある型の全ての
サンプルが１つのサブアレイに適合しないのであれば、追加のサブアレイまたは
膜を使って同じプローブで処理することができる。さらに、各サブアレイに対す
る複製数を調節して、同定または配列決定の完了のための時間を変えることがで
きる。
【００４７】 本明細書で使われる「中間断片（intermediate fragment）」は、長さで5〜10
00塩基、そして好ましくは長さで10〜40bpのオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４８】 フォーマット３では、既知配列のオリゴヌクレオチドプローブの第１セットは
、それらがそれぞれ相補的な配列を有する核酸とハイブリダイズすることを許容
する条件下で、固体支持体上に固定する。標識した、第２のオリゴヌクレオチド
プローブセットは溶液で用意される。該プローブは、セット内およびセット間の
両方とも、同じ長さまたは異なる長さであってよい。配列決定される核酸または
それらの中間断片は、２本鎖形で（特にrecAタンパク質が存在して非変性条件下
のハイブリダイゼーションが可能なとき）または１本鎖で、そして様々な相補性
の程度のハイブリッドを可能とする条件下で（例えば、フル対合と１塩基対誤対
合ハイブリッドの間の区別を可能とする条件下で）、第１プローブセットに添加
することができる。配列決定される核酸またはそれらの中間断片は、第１プロー
ブセットに、第２のプローブセットの前、後、または同時に添加することができ
る。標的の隣接部位に結合するプローブを一緒に結合させる（例えば、スタッキ
ング相互作用によって、またはリガーゼもしくは隣接プローブ間に化学結合を形
成する他の方法によって）。隣接プローブを結合させた後、表面に第１のプロー
ブセットのメンバーへの化学結合によって固定化されない断片およびプローブは
、例えばハイブリッドを融解する高温（100℃以下）洗浄液を使って洗浄除去さ れる。その後、第２セットからの結合したプローブは、用いた標識（例えば、化
学発光、蛍光、放射性、酵素、濃度測定、または電気泳動質量の標識であること
ができる）に適した方法を使って検出することができる。
【００４９】 本明細書で、ヌクレオチド塩基は、もしそれらが、規定した条件下で水素結合
により安定な２本鎖を形成すれば、「対合する（match）」かまたは「相補的（c
omplementary）」である。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイで共通して
用いられる条件下で、アデニン（「A」）はチミン（「T」）と対合するが、グア
ニン（「G」）またはシトシン（「C」）とは対合しない。同様に、GはCと対合す
るが、AまたはTとは対合しない。イノシンまたは普遍的塩基（Universal Base）
（「M」塩基, Nicholsら, 1994）のようなより低い特異性によって水素結合をす
る他の塩基、またはメチル化した塩基（methylated bases）のような他の修正し
た塩基は、例えば、規定した条件下でそれらが安定な２本鎖を形成する塩基と相
補的である。プローブは、もし該プローブ中の各塩基が核酸中の塩基と水素結合
により２本鎖を形成してワットソン・クリック（Watson and Crick）塩基対形成
ルール（すなわち、周辺の配列影響がなく、形成された２本鎖が特定のプローブ
に対して最大の結合エネルギーをもつ）により配列されれば、「完全に相補的（
perfectly complementary）」であると言われるかまたは「完全な対合（perfect
match）」であると言われる。「完全に相補的」および「完全な対合」はまた、
類似体または修正したヌクレオチドを有するプローブを包含することを意味する
。類似体または修正ヌクレオチドに対する「完全な対合」は、類似体または修正
ヌクレオチドに対して選択される「完全な対合ルール」（例えば、特定の類似体
または修正ヌクレオチドに対して最大結合エネルギーをもつ結合対）により判断
される。「ルール」による結合対を形成しないプローブ中の各塩基は、規定され
たハイブリダイゼーション条件下で「誤対合（mismatch）」であると言われる。
【００５０】 各プローブが配列決定される核酸に完全な対合であるプローブのリストを構築
することができる。その後、このリスト上のプローブを分析して最大オーバーラ
ップ順に整列させる。この整列は、第１プローブをリスト上の他のプローブのそ
れぞれと比較することにより実施して、どのプローブが第２プローブの5'末端の
塩基の配列と同一の塩基の最長配列をもつ3'末端を有するかを決定することがで
きる。その後、第１および第２プローブをオーバーラップさせることができ、そ
して該プロセスを繰返すことができ、第２プローブの5'末端を全ての残りのプロ
ーブの3'末端と比較しかつ第１プローブの3'末端を全ての残りのプローブの5'末
端と比較する。該プロセスは、他のプローブとオーバーラップしていないリスト
上のプローブが無くなるまで続けることができる。あるいは、１つ以上のプロー
ブをポジティブプローブのリストから選択することができ、１セット以上のオー
バーラップしたプローブ（「配列核（sequence nucleus）」）を平行して作製す
ることができる。配列構築のどちらものこのようなプロセスに対するプローブの
リストは、配列決定される核酸に完全に相補的であるプローブの全てのリストで
あることができ、またはそれらのどれかのサブセットであることができる。
【００５１】 プローブの5'および3'末端をオーバーラップさせてさらに長い配列の伸展部（
stretches）を作製することができる。プローブ構築のこのプロセスを、分枝点 （あるプローブが該断片中で繰返される）、プローブより長い反復配列、または
非クローニングセグメントのために曖昧さが起るまで続ける。２つの曖昧さの間
の配列の伸展部を、サブクローン配列（Sfs）の断片とよぶ。プローブとの適当 な代替オーバーラップが利用可能なために配列構築に曖昧さが起ると、オーバー
ラップ代替物の部位をまたがるさらに長いプローブによるハイブリダイゼーショ
ン、競争ハイブリダイゼーション、代替物末端と曖昧さの部位をまたがるプロー
ブの末端対との連結反応、またはシングルパスゲル分析（Sfsの曖昧な整列をつ くるために）を使うことができる。
【００５２】 以上の方法を用いることにより、ハイブリダイゼーションのパターン（核酸サ
ンプルの同一性に関係し得て、核酸サンプルを同定するサインの役割を果す）か
ら、オーバーラップまたは非オーバーラッププローブまで、さらに、構築された
Sfsを経て、そして中間断片またはソースDNA分子全体（例えば、染色体）に対す
る完全配列までの所望のレベルの配列を得ることができる。
【００５３】 配列決定は、一般に以下の工程を含む： (a)その断片が相補的配列を有する固定化プローブとの第１複合体形成を可能 にするのに有効な条件下に、固定化オリゴヌクレオチドプローブのアレイ（arra
y）と核酸断片とを接触させ； (b)第１複合体が標識プローブにハイブリダイズし、それによって、その断片 が固定化プローブ及び標識プローブの両者によってハイブリダイズされる第２複
合体を形成することを可能にするのに有効な条件下の溶液中で、この第１複合体
を標識オリゴヌクレオチドプローブのセットとを接触させ； (c)第２複合体から、固定化プローブに隣接してハイブリダイズしない任意の 標識プローブを除去し； (d)隣接する標識及び非標識プローブの存在を、標識の存在を検出することに よって検出し；そして (e)固定化標識プローブの既知配列と連結することによって、その断片のヌク レオチド配列を決定する。
【００５４】 ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、実質的に完全対合（match）ハイブ リッド（例えば、断片及びプローブが7つの部位のうち6つでハイブリダイズする
ものなど）を検出するように選択されるか、完全対合及び1塩基対誤対合の相違 を許容するように選択されるか、又は完全対合ハイブリッドのみの検出を許容す
るように選択され得る。
【００５５】 好適なハイブリダイゼーション条件は、最適化手順又は試験的検討（studies ）によって日常的に決定され得る。そのような手順及び検討は、研究室で用いら
れるプロトコールを確立するために、当業者によって日常的に行われる。例えば
、参照によって本明細書中に組み入れられる、Ausubelら、Current Protocols i
n Molecular Biology, Vol. 1-2, John Wiley & Sons (1989)；Sambrookら、Mol
ecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版, Vols. 1-3, Cold Springs Harbo
r Press (1989)；及びManiatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring HarborLaboratory Corl Spring Harbor, New York (1982)を参照さ
れたい。例えば、温度、構成要素（components）の濃度、ハイブリダイゼーショ
ン及び洗浄時間、バッファー構成要素、並びにそれらのpH及びイオン強度などの
条件を、変化させることができる。
【００５６】 標識固定化プローブが物理的又は化学的に結合されない実施態様では、検出は
制御ストリンジェンシーの洗浄工程のみに依存し得る。そのような条件下では、
隣接プローブは、隣接プローブの間での積み重ね相互作用（stacking interacti
ons）のため、高い結合親和性を有する。条件は、上記のように工程を最適化す るために変化させ得る。
【００５７】 固定化標識プローブが連結されている実施態様では、連結は、化学連結試薬（
例えば、水溶性カルボジイミド又は臭化シアン）によって行うことができるか、
又はリガーゼ酵素、商業的に入手可能なT4 DNAリガーゼを利用することができる
。洗浄条件は、隣接プローブに対する非隣接プローブの安定性の差を利用して、
隣接標識固定化プローブに対して非隣接標識固定化プローブを識別するように選
択できる。
【００５８】 オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光染料、化学発光系、放射活性標識（例え
ば、35S、3H、32P又は33P）又は質量分析法によって検出し得る同位体によって 標識できる。
【００５９】 未知配列の核酸分子が約45又は50 bpより長い場合、その分子を断片化して、 その断片の配列を決定できる。断片化は、制限酵素消化、切断（shearing）又は
NaOHによって達成できる。断片は、サイズで分離され（例えば、ゲル電気泳動に
よって）、約10〜40 bpの長さの好ましい断片を得ることができる。
【００６０】 オリゴヌクレオチドは、当業者に公知の多数の方法（例えば、ヌクレオシドホ
スホロアミダイト（phosphoramidite）又はリン酸水素化ヌクレオシド（nucleos
ide hydrogen phosphorate）などの試薬を用いて、リン酸基を介してレーザー活
性化光脱保護アタッチメント（laser-activated photodeprotection attachment
））によって固定化できる。ガラス、ナイロン、珪素及びフッ素化炭素支持体を
使用できる。
【００６１】 オリゴヌクレオチドは、アレイ中に組み込まれ、これらのアレイは、全て若し
くは所与の長さの全プローブのサブセットか、又は選択された長さのプローブの
セットを含むことができる。疎水性分割（partitions）は、プローブ又はプロー
ブのサブアレイを分離するのに使用できる。アレイは、多様なアプチケーション
（例えば、マッピング、部分配列決定、診断目的の標的領域の配列決定、mRNA配
列決定及び大容量配列決定）のために設計できる。特異的チップは、基質上のプ
ローブの組み合わせ及び配列を選択することによって、特定のアプリケーション
専用に設計できる。
【００６２】 例えば、長さ5塩基対の全オリゴヌクレオチドプローブの1024個の固定化プロ ーブアレイ（各アレイは1024個の異なるプローブを含む）が構築できる。この例
のプローブは、情報提供センス中の5-mer（それらは実際にはより長いプローブ であり得る）である。1024個の5-merプローブの第２のセットは、標識され、各 標識プローブの１つは、配列決定されるべき断片を伴った固定化プローブのアレ
イに適用され得る。この例では、1024個のアレイが大きなスーパーアレイ、又は
「スーパーチップ」に結合されるだろう。標識プローブ及び標識プローブの１つ
が核酸断片に沿って末端−末端（end-to-end）でハイブリダイズするこれらの例
では、２つのプローブは、例えば、連結反応によって結合され、未結合標識を除
去後、サンプル断片に相補的な10-merが、既知配列の標識プローブが適用される
既知配列の固定化プローブを有するアレイ中のポイントでの標識の存在の相関関
係によって検出される。サンプル断片の配列は、単純に標識プローブの配列中に
連続する固定化プローブの配列である。このように、全ての100万個の可能な10-
merは、5-merのみを使用し、従ってオリゴヌクレオチド合成の労力量の1000分の
1を含む組み合わせ（combinatorial）工程によって試験できる。
【００６３】 好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを支持する基体
は、アレイ中の各プローブが、例えば、疎水性材料であり得る物理的バリアーに
よって隣接プローブから分離されるように、部分に仕切られる。好ましい実施態
様では、物理的バリアーは、100μm〜30μmの幅を有する。より好ましい実施態 様では、各プローブの中心から任意の隣接プローブの中心までの距離は325μmで
ある。これらのプローブアレイは、動かない（nonmoving）固定化基体又はイン クジェットデポジション（deposition）装置、例えば、微小滴液量ヘッド、及び
好適なロボットシステム、例えば、アノラドガントリー（anorad gantry）を有 する回転ドラム又はプレートに固定された基体を用いて「大量生産」できる。
【００６４】 別の好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、３次元アレイに
固定される。３次元アレイは、多数の層から構成され、各層は、他の層から離れ
て個別に分析できる。３次元アレイは、、多数の形態をとり得、例えば、次の形
態を含む：くぼみの中の異なる深さにプローブが位置している多数のくぼみを有
する基体上に配置され得る（各平面は、くぼみ内の同様の深さのプローブで構成
されている）を含むか；又は、アレイはくぼみの底、若しくはくぼみ又は幾つか
のピークの組み合わせを分割するピークにプローブが位置している異なる深さの
くぼみを有する基体上に配置され、くぼみを用いることができる（各平面は一定
の深さで全てのプローブから構成されている）か；又はアレイは、積層されて３
次元アレイを形成する多数のシートで構成される基体上に配置され得る。
【００６５】 これらのアレイ中のプローブは、基体表面とプローブの情報提供部分との間の
距離を増すスペーサーを含むことができる。スペーサーは、炭素、珪素、酸素、
硫黄、リンなどの少なくとも2価の結合を形成し得る原子から構成され得るか、 又は糖−リン酸基、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、炭
化水素、芳香環、炭化水素環、直鎖及び分岐炭化水素などの少なくとも2価の結 合を形成し得る分子から構成され得る。
【００６６】 配列決定される核酸サンプルは、断片化又はそれと異なる処理（例えば、recA
の使用によって）をされてサンプル中の第２構造によるハイブリダイゼーション
の妨害を避けることができる。サンプルは、例えば、Cviなどの制限酵素による 消化、物理的切断（例えば、超音波によって）、又はNaOH処理によって断片化で
きる。得られた断片は、ゲル電気泳動によって分離でき、約10 bp〜約40 bpの間
などの適切な長さの断片をゲルから抽出できる。好ましい実施態様では、核酸サ
ンプルの「断片」は、プール中の他の断片と連結できない。そのような断片のプ
ールは、断片化された核酸をホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸ホスファターゼ
）で処理することによって得られる。あるいは、サンプル核酸の非連結性断片は
、サンプル核酸によるSanger−デオキシシークエンシング反応において、ランダ
ムプライマー（例えば、N5-N9、ここでN=A、G、T、又はC）を用いることによっ て得られる。これは、標的核酸に相補的な配列を有し、他の断片に連結できない
ジデオキシ残基で停止しているDNA断片を製造するだろう。
【００６７】 再利用できるフォーマット3 SBHアレイは、固定化プローブと標識プローブの 間に開裂可能な結合を導入し、次いでフォーマット3分析のラウンドが終了した 後にこの結合を開裂することによって製造できる。標識プローブは、リボヌクレ
オチド類又はリボヌクレオチドであり、標識プローブ中の結合塩基として使用で
き、このプローブは、続いて例えば、RNAse又はウラシル−DNAグリコシル化処理
、又はNaOH処理によって除去され得る。さらに、化学連結反応によって製造され
る結合は、選択的に開裂され得る。
【００６８】 他のバリエーションは、特異性又は効率を増加させる修飾オリゴヌクレオチド
の使用、例えば、標識プローブの第１セットに最適に選択された条件（例えば、
温度）下にハイブリダイゼーションサイクルを行い、次いで標識プローブの第２
セットに最適に選択された条件下にハイブリダイゼーションすることによる、ハ
イブリダイゼーションシグナルを増加する循環（cycling）ハイブリダイゼーシ ョンを含む。リーディングフレームのシフトは、それぞれ4つのヌクレオチド塩 基A、T、C及びGで終わるプローブの混合物（好ましくは等モル量の混合物）を使
用することによって決定できる。
【００６９】 分岐点は、断片の規則正しい配列に関して曖昧さを生じさせる。配列情報はSB
Hによって決定されるけれども、そのような曖昧さ（「分岐点」）がある場合、 ハイブリダイゼーションデータを整理するために、(i)完全ゲル配列決定のコス ト（cost）画分（fraction）での長い読み出し長さの単一パスゲル配列決定；又
は(ii)関連配列との比較のいずれかを使用することができる。分岐点を介する単
一パスゲル配列決定のためのプライマーは、SBH配列情報から、又は既知ベクタ ー配列、例えば、ベクター挿入部位に隣接する配列から同定し、サンプル核酸に
関して、標準Sanger−シークエンシング反応を行う。この単一パスゲル配列決定
から得られた配列を、分岐点からの読み込み、読み出し（read into and out of
the branch points）、Sfsの順序を同定するSfsと比較する。あるいは、Sfsは 、Sfsの配列を関連配列と比較し、Sfsを整列して、関連配列に最も近い配列を製
造することによって整列することができる。
【００７０】 さらに、標的断片中の縦列反復核酸セグメントの数は、シングル−パスゲル配
列決定によって決定できる。縦列反復は、遺伝子のタンパク質コード部分中で稀
に起きるので、ゲル配列決定工程はこれらの非コード領域の１つが特別に興味あ
るものとして同定される場合（例えば、それが重要な制御領域である場合）にの
み行われるであろう。
【００７１】 たった約200個のオリゴヌクレオチドプローブのセットが示すハイブリダイゼ ーションの程度についての情報を得ることにより、各遺伝子の特有のサイン（si
gnature）を定義し、ライブラリーからのcDNAの分類に使用でき、ライブラリー が同じ遺伝子の多数のコピーを含んでいるか否かを決定できる。そのようなサイ
ンによって、同一、類似及び異なるcDNAが区別でき、目録を作成できる。
【００７２】 核酸及び核酸を単離し、クローニングし、配列決定する方法は、当業者に周知
である。例えば、参照によって本明細書中に組み込まれる、Ausubelら、Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-2, John Wiley & Sons (1989)；及 びSambrookら、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第2版、Vols. 1-3, C
old Springs Harbor Press (1989)を参照されたい。
【００７３】 SBHは、当業者に知られている多数の方法によって実施され得る非常に発達し た技術である。特に、以下の文献のハイブリダイゼーションによる配列決定に関
連する技術は、参照によって本明細書中に組み込まれる：Drmanacら、1993年4月
13日発行の米国特許第5,202,231号（これによって参照によって本明細書に組み 込まれる）；Drmanacら、Genomics, 4, 114-128 (1989),Drmanacら、Proceeding
s of the First Int'l. Conf. Electrophoresis Supercomputing Human Genome,
Cantorら編集、World Scientific Pub. Co., Singapore, 47-59 (1991)；Drman
acら、Science, 260, 1649-1652 (1993)；Lehrachら、Genome Analysis: Geneti
c and Physical Mapping, 1, 39-81 (1990), Cold Spring Harbor Laboratory P
ress；Drmanacら、Nucl. Acids Res., 4691 (1986)；Stevanovicら、Gene, 79 1
39 (1989)；Panuskuら、Mol. Biol. Evol., 1, 607 (1990)；Nizeticら、Nucl.
Acids Res., 19 182 (1991)；Drmanacら、J. Biomol. Struct. Dyn., 5, 1085 (
1991)；Hoheiselら、Mol. Gen., 4, 125-132 (1991)；Strezoskaら、Proc. Nat'
l. Acad. Sci. (USA), 88, 10089 (1991)；Drmanacら、Nucl. Acids Res., 19,
5839 (1991)；及びDrmanacら、Int. J. Genome Res., 1, 59-79 (1992)。
【００７４】 本発明を以下の実施例で説明する。本明細書の開示を考慮すれば、当業者であ
れば、本発明の範囲内で、多くの他の実施態様及びバリエーションを為すことが
できることを認識するであろう。従って、本発明のより広い側面は以下の実施例
の開示に限定されることは意図されていない。
【００７５】実施例１ プローブセットの調製 2タイプのプローブの普遍的セットが調製できる。第１は比較的短いプローブ の完全セット（又は少なくとも非相補的サブセット）、例えば、全4096個（又は
約2000個の非相補的）の6-mer、又は全16,384個（又は約8,000個の非相補的）の
7-merである。全非相補的8-merサブセット及びより長いプローブは、それらが32
,000個以上のプローブを含むためより便利ではない。
【００７６】 第２タイプのプローブセットは、少なくとも1個のプローブによる任意の配列 のいずれのbp（塩基対）をも読み出す（reading）のに依然十分なプローブの小 さなサブセットとして選択される。例えば、16個の２-merのうちの12個で十分で
ある。二本鎖DNAの配列決定のための7-mer、8-mer及び9-merの小さなサブセット
は、それぞれ約3,000個、10,000個及び30,000個のプローブであり得る。
【００７７】 プローブセットはまた、既知配列の標的核酸を同定、及び／又は既知配列によ
る標的核酸の対立遺伝子又は突然変異体を同定するために選択することもできる
。そのようなプローブセットは、標的核酸のいずれのヌクレオチド位置も少なく
とも１度読み出されるように、十分なプローブを含んでいる。対立遺伝子又は突
然変異体は、「プラス（positive）」プローブの１つの結合が失われることによ
って同定される。これらの対立遺伝子又は突然変異体の特定配列は、次いで標的
核酸と、これらのプローブ位置でのいずれかの可能なヌクレオチド交換及び交換
の組み合わせを含む、プローブセットとのインターロゲーション（interrogatin
g）によって決定される。
【００７８】 プローブセットはまた、50個のプローブからプローブの普遍的セット（特定長
の全プローブ）までで構成されることができ、より好ましくはセットは、100-50
0個のプローブから構成され、最も好ましい実施態様では、プローブセットは300
個のプローブを含む。好ましい実施態様では、プローブセットは6〜9個の長さの
ヌクレオチドであり、cDNAクローンを類似又は同一配列のグループに集める（cl
uster）のに使用され、単一の代表クローンは配列決定のための各グループから 選択できる。
【００７９】 プローブは、1〜3個の非特定の（混合されたA、T、C及びG）又は末端の普遍的
な（例えば、M塩基又はイノシン）塩基による標準化学法を用いて調製できる。 放射標識が用いられるならば、プローブは放射標識されたリン酸基による基質活
性化（kinasing）のために5'末端にOH基を有することができる。あるいは、任意
の互換性のあるシステム、例えば蛍光染料などによって標識されたプローブを用
いることができる。プローブの他のタイプ、例えばPNA（タンパク質核酸）、又 は二本鎖安定性を変化させる修飾塩基を含むプローブも使用できる。
【００８０】 プローブはバーコードの付された多数ウエルプレートに貯蔵できる。少数のプ
ローブには、96−ウエルプレートを使用でき、10,000個以上のプローブには、38
4-又は864−ウエルプレートでの貯蔵が好ましい。5〜50プレートの積み重ねで、
全プローブを貯蔵するのに十分である。およそ5 pgのプローブで、１つのDNAサ ンプルでのハイブリダイゼーションに十分であり得る。このように、プローブ当
たり約50 mgの小さな合成から、1,000万個のサンプルが分析できる。各プローブ
がいつも第３サンプルに使用され、各サンプルが長さ1000 bpであるなら、その ときは、300億個を越える塩基（10人のヒトのゲノム）が、5,000個のプローブセ
ットによって配列決定され得る。
【００８１】実施例2 修飾されたオリゴヌクレオチドを有するプローブ 修飾オリゴヌクレオチドは、それに適切な条件下にハイブリダイゼーションプ
ローブ中に導入され、使用され得る。例えば、C5−位にハロゲンを有するピリミ
ジン類は、塩基積み重ね（stack）に影響を及ぼすことにより二本鎖安定性を改 善するのに使用できる。2,6−ジアミノプリンは、チミンとの塩基の対合の第３ 水素結合を提供するのに使用でき、それによってDNA２本鎖を熱的に安定化させ ることができる。2,5−ジアミノプリンの使用は２本鎖安定性を増加させ、アニ ーリングのよりストリンジェントな条件を可能にし、それによって２本鎖形成の
特異性を改善し、バックグラウンドの問題を抑え、より短いオリゴマーの使用を
可能にする。
【００８２】 これらの修飾ヌクレオチド類の3リン酸化体の合成は、Hoheisel & Lehrach (1
990)によって開示されている。
【００８３】 Nicholsら(1994)によってデザインされた、非識別性（non-discriminatory） 塩基アナログ、又は普遍的塩基も使用できる。この新規なアナログ、1−（2−デ
オキシ−D−リボフラノシル）−3−ニトロピロール（Mと呼ぶ）は、遺伝子コー ドの縮重の結果として起きるか、又は断片化されたペプチド配列データのみしか
利用できない場合のデザインの問題を解消するためにオリゴヌクレオチドプロー
ブ及びプライマー中で用いるために作り出された。このアナログは、積み重ねを
最大化する一方、DNA２本鎖を立体的に（sterically）崩壊させることなく、水 素結合相互作用を最小化する。
【００８４】 Mヌクレオシドアナログは、ヘテロ芳香環に結合した中性極性置換基を用いて 積み重ね相互作用を最小化するようにデザインされ、鎖内及び鎖間の積み重ね相
互作用を高めて塩基の対合の水素結合の役割を小さくした。Nicholsら(1994)は 、その誘導体が２本鎖DNAの最小の既知挿入物の１つである、p−ニトロアニリン
との構造的及び電子的類似性故に3−ニトロピロール 2−デオキシリボヌクレオ
シドを奨励した。
【００８５】 ヌクレオシドMのジメトキシトリチル保護されたホスホロアミダイトはまた、 配列決定及びポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のためのプライマーとして用いられ るヌクレオチド中に組み入れるのにも利用できる。Nicholsら(1994)は、相当な 数のヌクレオチドが、プライマーの特異性を低下させることなく、Mによって置 換できることを示した。
【００８６】 Mのユニークな特性は、連続したヌクレオシドの長い糸（strings）を置換し、
また、機能的配列決定用プライマーを産出するその能力である。3、6及び9個のM
置換を有する配列は、全て読み出し可能な（readable）配列決定用ラダー（ladd
ers）を与えると報告されており、3個の異なるM−含有プライマーによるPCRは、
全て、正しい産物の増幅をもたらした（Nicholsら、1994）。
【００８７】 3−ニトロピロール含有オリゴヌクレオチドのプライマーとして機能する能力 は、２本鎖構造が、相補的な鎖によって形成されているに違いないことを強く示
唆する。オリゴヌクレオチド対d（5−C2−T5XT5G2−3）及びd（5−C2A5YA5G2−3
）（ここで、X及びYは、A、C、G、T又はMであり得る）に対して得られる視覚的 な（optical）熱プロフィールは、DNA２本鎖から1本鎖への転移に対して観察さ れる正常なS字パターンと一致することが報告された。XM塩基対（ここで、Xは、
A、C、G又はTであり、YはMである）を含むオリゴヌクレオチドのTm値は、全て、
3℃の範囲内に入ることが報告された（Nicholsら、1994）。
【００８８】実施例3 プローブの選択及び標識付け サブアレイのアレイが作製されると、各ハイブリダイゼーションサイクル中で
各サブアレイにハイブリダイズされるプローブセットが規定される。例えば、38
4個のプローブセットは、普遍的セットから選択でき、96のプロービングを各4サ
イクルで行うことができる。１つのサイクル中でハイブリダイズされるように選
択されたプローブは、好ましくは類似のG+C含量を有する。
【００８９】 各サイクルのために選択されたプローブを96ウエルプレートに移し、次いで貯
蔵される前にそれらが（例えば、安定な蛍光染料によって）標識されていないな
ら、キナージング（kinasing）によって標識するか、又は、他の標識手順によっ
て標識する。
【００９０】 ハイブリダイゼーションの第１ラウンドに基づいて、新たなプローブセットが
、さらなるサイクルのための各サブアレイに対して規定できる。一部のアレイは
、幾つかのサイクルで使用できない。例えば、64の患者サンプルのうちたった8 つしか突然変異を示さず、8個のプローブが各突然変異に対して最初に評価され るならば、そのときは、64全てのプローブが１つのサイクルで評価され、32のサ
ブアレイは使用しない。これらの未使用のサブアレイは、フィルターの乾燥を防
ぐためハイブリダイゼーションバッファーで処理してもよい。
【００９１】 プローブは、貯蔵プレートから任意の便利なアプローチ、例えば単一チャンネ
ルピペッティング装置、又はロボットステーション、例えばBeckman Biomek 100
0（Beckman Instruments, Fullerton, California）又はMega Twoロボット（Meg
amation, Lawrencevill, New Jersey）、などによって回収できる。ロボットス テーションは、データ分析プログラム及びプローブ管理プログラムによって統合
され得る。これらのプログラムのアウトプットは、１つ以上のロボットステーシ
ョンにインプットされ得る。
【００９２】 プローブは、１つずつ回収され、ハイブリダイゼーションバッファーによって
被覆されているサブアレイに添加することができる。好ましくは、回収プローブ
が新たなプレートに配置され、標識されるか又はハイブリダイゼーションバッフ
ァーと混合される。好ましい回収方法は、貯蔵プレート１つずつにアクセスして
、十分な量のそれぞれ各プレートから選択されたプローブを中継プレート中の特
定ウエルにピペッティングする（又は金属ピンによって移す）ことによる。個々
にアドレス指定可能なピペット又はピンからなるアレイは、回収工程をスピード
アップするのに使用できる。
【００９３】実施例4 標識プローブの製造 オリゴヌクレオチドプローブは、自動合成によって製造でき、そしてそれは当
業者にとって日常のことであり、例えば、Applied Biosystemsのシステムを使用
する。あるいは、プローブは、多孔性テフロン（Teflon）ウエーハの積層を用い
るGenosys Biotechnologies Inc.法を用いて製造できる。
【００９４】 オリゴヌクレオチドプローブは、例えば、100-200 μm又は100-400 μmスポッ
トを有するアレイに対して放射性標識（35S、32Pであり、好ましくは33P）；非 放射性同位体（Jacobsenら、1990）；又は発蛍光団（Brumbaughら、1988）によ って標識できる。全てのそのような標識方法は、Sambrookら（1989)中の適切な セクションによって及びSchubertら(1990)、Murakamiら(1991)及びCateら（1991
)などのさらなる文献によって例示されるように、当業界で日常的であり、そし てこれらの全ての文献は参照によって本明細書中に特定的に組み込まれる。
【００９５】 放射性標識付けに関して、普通の方法は、T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い
る末端標識化又はKlenow又はT7ポリメラーゼを用いる高比放射能標識化である。
これらを以下に説明する。
【００９６】 合成オリゴヌクレオチドは、それらの5'末端にリン酸基を含まないで合成され
、それ故、酵素バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いる[-32P]
ATP又は[-33P]ATPからの-32P又は-33Pの転移によって容易に標識される。反応が
効率的に行われるならば、そのようなプローブの比放射能は、その[-32P]ATP又 は[-33P]ATPそれ自身の比放射能と同じくらい高くなり得る。下記反応は、10 pm
oleのオリゴヌクレオチドを高い比放射能で標識するためにデザインされる。異 なる量のオリゴヌクレオチドの標識化は、反応サイズを増加又は減少して、全て
の構成要素の濃度を一定に維持することによって容易に達成できる。
【００９７】 反応混合物は、10μlのオリゴヌクレオチド（10 pmole/μl）；2.0μlの10× バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー；5.0μlの[-32P]AT
P又は[-33P]ATP（比放射能5000 Ci/mmole；水溶液中10 mCi/ml）（10 pmole）；
及び11.4μlの水を用いて作られるであろう。8単位(約1μl）のバクテリオファ ージT4ポリヌクレオチドキナーゼを、反応混合物に添加し、37℃で45分間インキ
ュベートする。反応物を68℃で10分間加熱し、バクテリオファージT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを不活性化する。
【００９８】 32P又は33Pのオリゴヌクレオチドへの転移効率及びその比放射能を次いで測定
する。プローブの比放射能が許容可能であれば、それを精製する。比放射能が低
すぎるなら、追加の8単位の酵素を添加し、酵素を不活性化するために反応物を6
8℃で10分間加熱する前に、さらに37℃で30分間インキュベートする。
【００９９】 放射標識オリゴヌクレオチドの精製は、例えば、エタノールによる沈殿；臭化
セチルピリジニウムによる沈殿；バイオ−ゲルP-60によるクロマトグラフィー；
若しくはSep-Pak C18カラムでのクロマトグラフィー、又はポリアクリルアミド ゲル電気泳動によって達成できる。
【０１００】 より高い比放射能を有するプローブは、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片
を用いて合成オリゴヌクレオチドに相補的なDNA鎖を合成することによって得ら れる。短いプライマーを、配列が所望の放射標識プローブの相補体（complement
）であるオリゴヌクレオチド鋳型にハイブリダイズさせる。そして、プライマー
を、大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を用いて鋳型指令法（template-direc
ted manner）で[-32P]dNTP又は[-33P]dNTPを導入することによって伸長する。反
応後、鋳型及び生成物を、変性し、変性条件下でのポリアクリルアミドゲルによ
る電気泳動によって分離する。この方法によれば、オリゴヌクレオチド分子当た
り幾つかの放射活性原子を含むオリゴヌクレオチドプローブを作製することが可
能である。
【０１０１】 この方法を利用するには、所望の比放射能を達成し、全ての鋳型鎖の合成を完
了させるのに十分な計算量の[a-32P]dNTP又は[a-33P]dNTPを、微小遠心管中で混
合する。次いで、この管に適当量のプライマー及び鋳型DNAを、プライマーを鋳 型よりも3〜10倍モル過剰にして添加する。
【０１０２】 次いで、0.1倍容量の10×Klenowバッファーを添加し、よく混合する。次に、2
-4単位の大腸菌DNAポリメラーゼIのKlenow断片を反応容量5μlごとに添加し、混
合し、4℃で2-3時間インキュベートする。所望ならば、反応の進行を、少量の（
0.1μl）アリコートを取り出し、10%トリクロロ酢酸（TCA）によって沈殿可能に
なる放射活性の割合を測定することによってモニターできる。
【０１０３】 反応物は、ゲルローディング（gel-loading）バッファーの等容量によって希 釈し、80℃へ3分間加熱し、次いで全サンプルを変性ポリアクリルアミドゲル上 にローディングする。電気泳動に続き、ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、
プローブを局在化し、ゲルから除去する。蛍光プローブ標識付けの多様な方法も
また利用でき、例えば、Brumbaughら(1988)は、蛍光的に標識されたプライマー の合成を記載している。C-5位に結合している12個の原子からなる第１アミンの 「リンカーアーム（linker arm）」を有するデオキシウリジン類似体を合成する
。類似体の合成は、有機金属中間体を介して2−デオキシウリジンを誘導して5- （メチルプロペニル）-2-デオキシウリジンを得ることからなる。塩化ジメトキ シトリチル生成物による反応は、対応する5-ジメトキシトリチル付加生成物を生
成する。このメチルエステルを加水分解し、活性化し、適切にモノアシル化され
たアルキルジアミンと反応させる。精製後、得られたリンカーアームヌクレオシ
ドを化学オリゴヌクレオチド合成に好適なヌクレオシド類似体に変換する。
【０１０４】 1又は2個のリンカーアーム塩基を含むオリゴヌクレオチドは、次いで修飾ホス
ホリダイト化学法を用いて作られる。500 mM炭酸ナトリウム（pH 9.4）25μl中 の50 nmolリンカーアームオリゴヌクレオチドの溶液に、ジメチルスルホキシド 中300 mM FITCの20μlを添加する。混合物を室温で6時間攪拌する。1×30 cmセ ファデックス（Sephadex）G-25カラムから20 mM酢酸アンモニウム（pH 6）で溶 出し、第１のUV吸収ピークの画分を合わせることによって、オリゴヌクレオチド
を遊離のFITCから分離する。
【０１０５】 一般に、その5'末端でのオリゴヌクレオチドの蛍光標識は、２つの工程を含む
。第１は、N−保護アミノアルキルホスホルアミダイト誘導体を、自動核酸合成 の間にオリゴヌクレオチドの5'末端に付加する。全ての保護基を除去した後、適
切な蛍光染料のNHSエステルを5'−アミノ基と一晩カップリングし、次いで逆相H
PLC又はPAGEを用いて過剰の染料から標識オリゴヌクレオチドを精製する。
【０１０６】 Schubertら（1990)は、フルオレセインによって標識されたオリゴヌクレオチ ドが自動DNA合成の間に製造されるのを可能にするホスホルアミダイトの合成を 報告した。
【０１０７】 Murakamiらも、フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの製造を報告した。 Cateら(1991)は、プローブ検出を可能にする直接化学発光基質（AMPPD）との 組み合わせでアルカリホスファターゼに直接コンジュゲートされるオリゴヌクレ
オチドプローブの使用を報告している。
【０１０８】 標識プローブは、合成するよりもむしろ、GENSETを含めて多様な商業的ソース
から容易に購入できるだろう。
【０１０９】 他の標識は、標識抗体に特異的に結合するメンバーとして働くことができるリ
ガンド、化学発光体、酵素、標識リガンドに対する特異的結合対メンバーとして
働くことができる抗体などを含む。広く多様な標識は、容易に利用できるイムノ
アッセイで用いられてきた。また、他の標識は、抗原、特異的な反応性を有する
基、及び電気化学的に検出可能な成分を含む。
【０１１０】 一般に、エレクトロフォア質量標識（electrophore mass labels: EML）によ る核酸の標識は、例えば、Xuら、J. Chromatography 764:95-102 (1997)に記載 されている。エレクトロフォアは、電子捕獲質量分光分析（EC-MS）によって高 い感度で検出できる化合物である。EMLは、ヌクレオチドを可逆的に修飾するた めに当業界で周知の化学（例えば、周知のヌクレオチド合成化学は、分子を保護
基としてのヌクレオチドに結合するための多様な方法を教示している）を用いて
プローブに結合できる。EMLは、多様な周知の電子捕獲質量分光分析装置（例え ば、Finnigan Corporationによって販売されている装置）を用いて検出される。
さらに、EMLの検出に使用できる技術は、例えば、高速原子ボンバードメント（f
ast atomic bombardment）質量分析（例えば、Kosterら、Biomedical Environ,
Mass Spec. 14:111-116 (1987)を参照）；プラズマ脱着質量分析；エレクトロス
プレー／イオンスプレー法（例えば、Fennら、J. Phys. Chem. 88:4451-59 (198
4)、国際出願第WO90/14148、Smithら、Anal. Chem. 62:882-89 (1990)を参照さ れたい）；及びマトリックス補助レーザー脱着／イオン化法（Hillenkampら、"M
atorix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass S
pectrometry of Large Biomolecules." Biological Mass Spectrometry (Burlin
game及びMacCloskey編集）、Elsevier Science Publishers, Amsterdam, pp. 49
-60, 1990）；Huth-Fehreら、"Matrix Assisted Laser Desorption Mass Spectr
ometry of Oligodeoxythymidylic Acids", Rapid Communications in Mass Spec
trometry, 6:209-13 (1992)）を含む。
【０１１１】 好ましい実施態様では、EMLは光感受性の共有結合によってプローブに結合さ れている。EMLは、標的核酸とのハイブリダイゼーション後、レーザー又は所望 の波長の光を発する他の光源によってプローブから放出される。EMLは、次いでG
C-MS（ガスクロマトグラフ−質量分析計）又は他の適切な装置に送り込まれ、そ
の質量によって同定される。
【０１１２】実施例5 配列決定用チップ及びアレイの作製 基本的な実施例では、20×20 cmのアレイを得るために組み合わせることがで きる3×3 mmの寸法のチップを得るために50ミクロン表面に結合された6-merを使
用する。もう１つの実施例では、5×5 mmの寸法の9-merチップ（そのようなチッ
プの4000単位が30×30 cmアレイを作るのに使用される）を作る10×10ミクロン 表面に結合された9-merオリゴヌクレオチドを使用する。4,000〜16,000個のオリ
ゴチップを含むアレイは、正方形のアレイに配列される。描写されるような、プ
レート、又は管の収集物は、配列決定用キットの一部としてアレイとともにパッ
ケージすることができる。
【０１１３】 アレイは、互いに物理的に又は疎水性表面によって分離できる。疎水性ストリ
ップ（strip）分離を利用するための１つの可能な方法は、QA Laboratories, Tr
onto, Canadaによって製造されたIso-Grid Microbiology Systemなどの技術を使
用することである。
【０１１４】 疎水性グリッド（grid）膜フィルター（HGMF）は、それらが拡張された数値範
囲及びコロニーの自動計数というユニークな魅力（attractions）を示す場合、 約10年間分析食品微生物学で用いられてきた。１つの商業的に入手可能なグリッ
ドは、その上に1600個（40×40）の正方形のセルからなる黒色の疎水性インクグ
リッドが印刷された、ポリスルホンポリマー（Gelman Tuffryn HT-450, 0.45μ ポアサイズ）の正方形（60×60 cm）からなるQA Laboratories Ltd. (Toronto,
Canada)のISO-GRID（登録商標）である。HGMFは、吸引濾過によって細菌懸濁液 と共に予め植え付けられ、選択された（of choice）、異なる又は選択的な培地 上でインキュベートされる。
【０１１５】 微生物生育は、膜上の既知の位置及びサイズを有するグリッドセルに制限され
るので、HGMF機能は従来のプレート又は膜フィルターよりもMPN装置に類似して いる。Peterkinら（1987）は、HGMFレプリケータと共に使用する場合、これらの
HGMFがゲノムライブラリーを増やして貯蔵するのに使用できることを報告した。
１つのそのような器具は、ISO-GRIDの1600個の各セルから増殖（growth）を複製
し、作られるマスターHGMFの多くのコピーを可能にする（Peterkinら、1987）。
【０１１６】 Sharpeら（1989）はまた、QA Laboratories からのISO-GRID HGMFおよび自動H
GMF計数器（MI-100インタプリタ）及びRP-100レプリケータを使用した。彼らは 、多くの微生物培養物を維持し、スクリーニングする技術を報告した。
【０１１７】 Peterkin及び同僚は、疎水性グリッド膜フィルター（Peterkinら、1989）を使
用したDNAプローブのスクリーニング方法を後に報告した。これらの著者は、HGM
F上での効率のよい直接コロニーハイブリダイゼーション方法を報告した。以前 は、HGMFが上にプリントされたエポキシスルホンポリマーの低いDNA結合能のた めに、貧弱な結果しか得られなかった。しかしながら、Peterkinら（1989）は、
膜表面へのDNAの結合が、DNAに接触する前に、複製されインキュベートされたHG
MFをポリエチレンイミン、ポリカチオンによって処理することによって改善され
ることを報告した。この初期の研究は、細胞性DNA結合を使用し、本発明とは異 なる目的を有しているが、記載された方法は、フォーマット3 SBHに容易に適用 できる。
【０１１８】 有用な配列を迅速に同定するために、Peterkinら（1989）は、種々のクローン
由来の放射標識プラスミドDNAを使用し、製造されたHGMF上のDNAに対するその特
異性を試験した。この方法では、組換えプラスミド由来のDNAは、容易にそして 再現性をもって製造できるHGMF上の100個の微生物に対するコロニーハイブリダ イゼーションによって迅速にスクリーニングされた。
【０１１９】 小さな（2-3 mm）チップを用いた操作、および数千の反応の平行実施。本発明
の解決策は、チップ及びプローブを対応するアレイ中に維持することである。１
つの実施例では、250,000個の9-merを含むチップを、中間に1 mMの溝を有する8 ×12フォーマット（96個のチップ）で整列された、8×8 mMプレート（15μM／オ
リゴヌクレオチド、Peaseら、1994）の形状のシリコンウエハー上に合成する。 プローブを、多チャンネルピペット又はピンアレイのいずれかによって、１つの
チップ上に１つのプローブを添加する。全ての4000個の6-merを評価するために は、異なるものを使用するか、又はチップアレイの１つのセットを何回も再使用
するかのいずれかによって、42のチップアレイを使用しなければならない。
【０１２０】 上記の場合には、本出願の当初の命名法を使用すると、F=9；P=6；及びF+P=15
である。チップは、式BxNn（ここで、xは特定塩基Bの数であり；nは非特定塩基 の数であり、その結果x=4〜10であり、n=1〜4である）で示されるプローブを有 することができる。より効率的なハイブリダイゼーションを達成し、かつ任意の
支持（support）オリゴヌクレオチドの潜在的な影響を避けるためには、特定塩 基を非特定塩基で囲むことができ、従って、(N)nBx(N)mなどの式で表すことがで
きる。
【０１２１】 チップのもう１つの実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブのアレイを支
持する基体は、セクションに区分されており、アレイ中の各プローブは、例えば
、疎水性材料であり得る物理的バリアーによって隣のプローブから分離されてい
る。好ましい実施態様では、物理的バリアーは、幅300μm〜30μmを有し、各物 理的バリアーの中心から隣の物理的バリアーの中心の間の距離は、少なくとも32
5μmである。
【０１２２】 好ましい実施態様では、疎水性材料は、基体上に配置され、適切なロボットシ
ステムに結合された、インクジェットヘッドを使用して所望の幅のバリアーを形
成する。例えば、所望の疎水性材料（例えば、溶媒が蒸発した後にバリアーを形
成する油系材料）の懸濁液又は溶液をアプライするのに適合する、微小滴液量ヘ
ッドは、アノラドガントリー（anorad gantry）システムと結合でき、適切なハ ウジング及び分配システムにはめ込むことができ、疎水性材料のグリッドは、基
体上に多数のウエルを形成する所望の基体上に適用できる。疎水性材料のグリッ
ドを形成した後、グリッド形成に使用されたが、プローブの溶液又は懸濁液をア
プライするのに適用したロボットシステムと類似のロボットシステムを使用して
、異なるプローブが各ウエル上にスポットされる（又はプローブの混合物を各ウ
エルにアプライする）。１つの実施態様では、同じロボットシステムが、疎水性
グリッド及びプローブに適用するために使用される。この実施態様では、分配シ
ステムは、疎水性グリッドがアプライされた後に水で洗い流され、次いでプロー
ブの送達のためにプライムされる（primed）。
【０１２３】実施例6 支持体結合オリゴヌクレオチドの製造 オリゴヌクレオチド、すなわち、小さな核酸セグメントは、例えば、自動オリ
ゴヌクレオチド合成装置を使用して普通に実施される、化学手段によってオリゴ
ヌクレオチドを直接合成することによって容易に製造できる。
【０１２４】 一般に、オリゴヌクレオチドは、適切な反応基によって支持体に結合できる。
そのような基は、当業界で周知であり、例えば、アミノ（−NH2）；ヒドロキシ ル（−OH）；又はカルボキシル（−CO2H）基を含む。支持体に結合されたオリゴ
ヌクレオチドは、ガラス、ポリスチレン又はテフロンなどの任意の好適な支持体
を使用した当業者に公知の任意の方法によって製造できる。１つの方法は、標準
合成装置によって合成されたオリゴヌクレオチドを正確にスポットすることであ
る。固定化は、例えば、受動吸着（passive adsorption）を使用して（Inouye &
Hondo, 1989）：UV光を使用して（Nagataら、1985；Dahlenら、1987；Morriey 及びCollins、1989）：若しくは塩基修飾DNAの共有結合による（Kellerら、1988
；1989）；又はプローブと支持体の間のアミド基の形成による（Wallら、1995；
Chebabら、1992；及びZhangら、1991）；（全ての文献は本明細書中に特定的に 組み入れられる）方法を含む多くの方法によって達成できる。
【０１２５】 利用できるもう１つの方法は、リンカーとしての強いビオチン−ストレプトア
ビジン相互作用の使用である。例えば、Broudeら（1994）は、それらは二本鎖プ
ローブであるが、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ上に固定されたビオチン化
プローブの使用を報告している。ストレプトアビジン被覆ビーズは、Dynal、Osl
oから購入することができるのはもちろん、この同じ結合化学方法は、ストレプ トアビジンによる任意の表面をコーティングするのに適用できる。ビオチン化プ
ローブは、例えば、Operon Technologies（Alameda, CA）などの種々の供給源か
ら購入できる。
【０１２６】 Nunc Laboratories (Naperville, IL)も、使用できる好適な材料を販売してい
る。Nunc Laboratoriesは、DNAがコバリンクNH（Covalink NH）と呼ばれるミク ロウエル表面に共有結合できる方法を開発した。コバリンクNHは、さらなる共有
結合のための架橋ヘッドとして働く２級アミノ基（＞NH）によってグラフト化さ
れたポリスチレン表面である。コバリンクモジュール（CovaLink Modules）は、
Nunc Laboratoriesから購入できる。DNA分子は、ホスホロアミデート結合によっ
て5'末端でコバリンクに独占的に結合でき、1 pmolを超えるDNAの固定化を可能 にする（Rasmussenら、1991）。
【０１２７】 5'末端でのDNA分子の共有結合のためのコバリンクNHストリップの使用が報告 されている（Rasmussenら、1991）。この技術では、ホスホルアミダイト結合が 利用される（Chuら、1983）。単共有結合のみを使用する固定化が好ましいので 、これは有益である。ホスホルアミダイト結合は、DNAを、2 nmの長さのスペー サーアームによってポリスチレン表面上に共有的にグラフト化されるスペーサー
アームの末端に位置するコバリンクNHの2級アミノ基に結合させる。オリゴヌク レオチドをホスホルアミデート結合を介してコバリンクNHに結合させるには、オ
リゴヌクレオチド末端は5'末端リン酸基を有していなければならない。恐らく、
ビオチンが、コバリンクに共有結合され、次いでストレプトアビジンがプローブ
を結合するのに使用されることでさえ可能であろう。
【０１２８】 より詳細には、結合方法は、DNAを水（7.5 ng/μl）中に溶解し、95℃で10分 間変性させ、氷の上で10分間冷却することを含む。次いで、氷冷された0.1 M 1 −メチルイミダゾール、pH 7.0（1-MeIm7）を添加して最終濃度10 mM 1-Melm7に
する。次いで、ss DNA溶液を氷上に置かれたコバリンクNHストリップ上に分注す
る。
【０１２９】 10 mM 1-Melm7中に溶解したカルボジイミド、0.2 M 1−エチル−3−（3−ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド（EDC）を新たに調製し、ウエル当たり2
5μl添加する。ストリップを50℃で5時間インキュベートする。インキュベーシ ョン後、ストリップを、例えば、ヌンク−イムノウオッシュ（Nunc-Immuno Wash
）を使用して洗浄する。すなわち、最初にウエルを3回洗浄し、次いで洗浄液で5
分間浸し、最後に3回洗浄する（ここで、洗浄液は、50℃に加熱された0.4 N NaO
H, 0.25% SDSを含む）。
【０１３０】 本発明による使用のためのさらに好適な方法は、参照によって本明細書中に組
み入れられる、PCT特許出願第WO90/03382号（Southern及びMaskos）に記載のも のであると考えられる。支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを製造する方法
は、共有ホスホジエステル結合によりリン酸基を介してヌクレオシド3'−試薬を
、支持体に担持されている脂肪族ヒドロキシル基に結合することを含む。次に、
オリゴヌクレオチドは、支持されたヌクレオシド上で合成され、支持体からオリ
ゴヌクレオチドが切断されない標準条件下に合成オリゴヌクレオチド鎖から保護
基を除去する。好適な試薬は、ヌクレオシドホスホルアミダイト及びヌクレオシ
ド水素ホスホレートを含む。
【０１３１】 DNAプローブアレイの製造用のDNAプローブの作製のためのオンチップ方法（on
-chip strategy）が利用できる。例えば、アドレス指定可能なレーザー活性化光
脱保護（photodeprotection）は、参照によって本明細書中に組み込まれる、Fod
orら（1991）によって報告された、ガラス表面上での直接的なオリゴヌクレオチ
ド化学合成において利用できる。プローブはまた、Van Nessら（1991）によって
報告されたようにナイロン支持体上に固定化するか；又はDuncan及びCavalier（
1988）の方法を使用してテフロンに結合することもでき、これら全ての文献は、
本明細書中に特定的に組み入れられる。
【０１３２】 Van Nessら（1991）によって報告された、ナイロン支持体へのオリゴヌクレオ
チドの結合は、アルキル化によるナイロン表面の活性化及び塩化シアヌルによる
オリゴヌクレオチドの5'−アミンの選択的活性化を必要とする。
【０１３３】 支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを製造するための１つの特別な方法は
、参照によって本明細書中に組み入れられる、Peaseら（1994）によって報告さ れた光発生（light-generated）合成を利用することである。これらの著者は、 現在の写真平版技術を使用して、固定化オリゴヌクレオチドプローブアレイ（DN
Aチップ）を作り出した。光を使用して高密度微小アレイ中のオリゴヌクレオチ ドプローブの合成を誘導するこれらの方法は、光不安定性5'−保護N−アシル-デ
オキシヌクレオシドホスホルアミダイト、表面リンカー化学及び多方面にわたる
組み合わせ合成方法を利用する。256個の空間的に規定されたオリゴヌクレオチ ドプローブのマトリックスは、この方法で作ることができ、そして本明細書記載
の有利なフォーマット3配列決定で使用できる。
【０１３４】 もちろん、上記の光活性化チップの１つなどのDNAチップを商業的供給源から 容易に購入できるだろう。この点については、Santa Clara, CA 95051のAffymet
riox及びBeckmanと連絡をとることができる。
【０１３５】 好ましい実施態様では、本発明のプローブは、情報提供部分（標的核酸にハイ
ブリダイズし、配列情報を与える部分）、基体（固体支持体）に結合される反応
基、及びランダム化された位置（すなわち、4つの塩基のうちの幾つかがこれら の位置で見出される）を含む。好ましいプローブは、配列5'−(T)6−(N)3−(B)5 （ここで、T=チミン（固相支持体に結合する）、N=A、C、G又はT（ランダム化さ
れた位置）、及びB=プローブの5個の情報提供位置（情報提供部分）である）を 有する。最も好ましい実施態様では、プローブは、支持体に結合し、スペーサー
部分がプローブの末端又はプローブの内部で(N)3の5'側に見出される。スペーサ
ーは、炭素、珪素、酸素、硫黄、リンなどの少なくとも2つの共有結合を形成で きる原子から構成できるか、又は糖−リン酸基、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオ
シド、ヌクレオチド、糖、炭水化物、芳香環、炭化水素環、線状及び分岐状炭化
水素などの少なくとも2つの共有結合を形成できる分子から構成できる。
【０１３６】実施例7 核酸断片の製造 配列決定されるべき核酸は、cDNA、ゲノムDNA、染色体DNA、微細切断された染
色体バンド、コスミド又はYACインサート、及びいかなる増幅工程もないmRNAを 含むRNAなどの、任意の適切な供給源から得られる。例えば、Sambrookら（1989 ）は、哺乳類細胞由来の高分子量DNAの単離のための3つのプロトコールを報告し
ている（p. 9.14-9.23）。
【０１３７】 標的核酸断片は、M13、プラスミド又はλベクター中のクローンとして製造で き、及び／又はPCR又は他の増幅方法によってゲノムDNA又はcDNAから直接に製造
できる。サンプルをマルチウエルプレート中で調製又は分注してもよい。約100-
1000 ngのDNAサンプルが最終容量2-500 mlで調製される。PCRによって製造され た標的核酸は、精製することなく、フォーマット1 SBHの基体に直接アプライで きる。標的核酸が一旦基体に固定されれば、基体を洗浄でき、又はプローブと直
接アニーリングさせることもできる。
【０１３８】 次に、核酸は、例えば、Sambrookら（1989）の9.24-9.28に記載の制限酵素の 使用、超音波及びNaOH処理による切断を含む当業者に公知の任意の方法で断片化
されるだろう。
【０１３９】 Schrieferら（1990）（参照によって本明細書中に組み入れられる）によって 報告された、低圧切断も適している。この方法では、DNAサンプルは、低圧から 中圧の様々な圧力の小さなフレンチ（French）圧力セルを通過する。レバー装置
によってセルにかける低圧から中圧の圧力の制御が可能である。これらの研究の
結果は、低圧切断が超音波及び酵素的DNA断片化方法の代わりとして有用である ことを示している。
【０１４０】 DNAの断片化に特に好適な１つの方法は、Fitzgeraldら（1992）によって報告 された、2塩基認識エンドヌクレアーゼ、CviJIを使用したものであると考えられ
る。これらの著者は、迅速な断片化及びショットガンクローニング及び配列決定
に好適であると考えられる特定サイズにDNAを断片化するためのアプローチを報 告した。本発明者は、これもまた、本配列決定技術での使用のための、ランダム
であるが比較的小さいDNA断片を作製するのに特に有用であろうと考えている。
【０１４１】 制限エンドヌクレアーゼCviJIは通常、GとCの間の認識配列PuGCPyを開裂して 平滑末端を残す。この酵素（CviJI**）の特異性を変化させる、典型的な反応条 件は、DNA断片の準ランダム分布を与え、小分子pUC19（2688塩基対）を形成する
。Fitzgeraldら（1992）は、高速ゲル濾過法によってサイズ分画されたpUC19のC
viJI**消化を使用して、この断片化方法のランダム性を定量的に評価し、末端修
復することなく、Lac ZマイナスM13クローニングベクターに直接連結した。76個
のクローンの配列分析は、CviJI**が、PuGCPy部位に加え、pyGCPy及びPuGCPuを 制限すること、及び新たな配列データがランダム断片化と一致する速度で蓄積さ
れることを示した。
【０１４２】 文献中に報告されているように、超音波処理及びアガロースゲル分画と比較し
たこのアプローチの利点は、より少量のDNAを必要とすること（2-5μgに対して0
.2-0.5μg）；及び工程数が少ないこと（前ライゲーション、末端修復、化学抽 出、又はアガロースゲル電気泳動及び溶出の必要がない）を含む。これらの利点
はまた、フォーマット3による配列決定のためにDNAを調製する時にも有用である
ことが提案されている。
【０１４３】 好ましい実施態様では、核酸サンプルの「断片」は、それらが互いに連結され
得ないように調製される。そのような断片のプールは、酵素消化又は物理的切断
によって得られた断片化核酸をホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸ホスファター
ゼ）で処理することによって得られる。あるいは、サンプル核酸の非連結断片は
、サンプル核酸によるSanger−ジデオキシシークエンシング反応中のその5'末端
にリン酸を有しない、ランダムプライマー（例えば、N5-N9、ここでN=A、G、T、
又はC）を使用して得られる。これは、標的核酸に相補的な配列を有し、ジデオ キシ残基で停止しており、他の断片に連結できない、DNA断片をもたらすだろう 。
【０１４４】 核酸断片を得る方法又は製造する方法にかかわりなく、DNAを変性させて、ハ イブリダイゼーションに利用できる１本鎖断片を与えることは重要である。これ
は、DNA溶液を89-90℃で2-5分間インキュベートすることによって達成される。 次いで、溶液を、2℃まで急速に冷却し、チップと接触する前のDNA断片の再生を
防ぐ。
【０１４５】実施例8 DNAアレイの製造 アレイは、ナイロン膜などの支持体上にDNAサンプルをスポットすることによ って製造できる。スポッティングは、金属ピンのアレイ（マイクロタイタープレ
ート中のウエルのアレイに対応する位置）を使用して、ナイロン膜に約20 nlのD
NA溶液を移すことを繰り返して行うことができる。オフセット印刷によって、ウ
エルの密度よりも高いドットの密度が達成される。1〜25個のドットは、使用さ れる標識のタイプによって、1 mm2中に収容できる。幾つかの予め選択された数 の縦列及び横列でのスポッティングを避けることによって、独立サブセット（サ
ブアレイ）を形成できる。１つのサブアレイ中のサンプルは、異なる個体由来の
同じゲノム（又は同じ遺伝子）のDNAセグメントであり得るか、又は異なる、オ ーバーラップしたゲノムクローンであり得る。１つの実施例では、選択された遺
伝子セグメントは、64人の患者から増幅され得る。各患者に対して、増幅遺伝子
セグメントは、１つの96ウエルプレート中にある（全ての96ウエルが同じサンプ
ルを含む）。64人の患者のそれぞれに対するプレートが製造される。96ピン装置
を使用することによって、全てのサンプルが１つの8×12 cm膜上にスポットでき
る。サブアレイは、各患者から１つで、64のサンプルを含むことができる。96サ
ブアレイが同一である場合は、ドット間隔（span）を1 mm2とし、サブアレイ間 を1 mmの間隔とすることができる。
【０１４６】 もう１つのアプローチは、例えば、膜を覆うように成形されたプラスチックグ
リッド（グリッドはマルチウエルプレートの底に適用される膜の種類に類似する
）、又は疎水性ストリップなどの物理的スペーサーによって分割できる膜又はプ
レート（NUNC, Naperville, Illinoisから入手可能）を使用することである。固
定された物理的スペーサーは、平らなホスホル-ストレージ-スクリーン(phospho
r-storage screen)又はX線フィルムに暴露することによるイメージングには好ま
しくない。
【０１４７】実施例９ ハイブリダイゼーションおよび評価過程 標識プローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、(好ましくは多チ ャネルピペットによって)サブアレイにピペットしてもよい。サブアレイ間のプ ローブの混合を防ぐため(疎水性の帯または物理的バリアーが膜に印されていな い場合)、プラスチック、金属またはセラミックからなる対応するグリッドを膜 に固定するように圧着してもよい。また、緩衝液の容量を１mm2あたり約１ml以 下に減らしてもよい。使用するプローブの濃度およびハイブリダイゼーション条
件は、既に記載されているようなものでよいが、洗浄用緩衝液は多数のサブアレ
イに素早く注いで、プローブの迅速な希釈を促して有意なクロスハイブリダイゼ
ーションを防ぐ。同様の理由のために、最小濃度のプローブを使用し、ハイブリ
ダイゼーション時間を実用レベルで最長の時間まで延長してもよい。DNA検出お よび配列決定のために、「通常」配列の知識により連続積み重なり相互作用現象を
使用してシグナルを増強することができる。標識プローブに加えて、標識プロー
ブと連続的にハイブリダイズする別の非標識プローブをハイブリダイゼーション
反応に加えてもよい。ハイブリッドの量は数倍に増加してもよい。プローブはラ
イゲーションにより連結してもよい。この方法は、「圧縮状態(compression)」を 形成するDNA領域を分解するのに重要となり得る。
【０１４８】 放射能標識されたプローブの場合、好ましくは蛍光ストレージ(phosphorstora
ge)技術により、フィルターの画像を得ることができる。CCDカメラ、共焦点顕微
鏡などで蛍光標識の評価ができる。異なるハイブリダイゼーション実験において
正確に評点し、データを正確にまとめるために、各ドットごとの標的量に基づい
て生シグナルを標準化する。ドットごとの標的DNAの量の差は、各プローブのシ グナルを、１つのドット上にある評価した全てのプローブの平均シグナルで割る
ことによって補正できる。標準化したシグナルを、評点（通常1〜100）して、異
なる実験のデータを比較する。また、各サブアレイにおいていくつかの対照DNA を使用して、完全に対合した標的を含まないサンプルの平均バックグラウンドシ
グナルを決定できる。二倍体(倍数体)評価により得られたサンプルには、ホモ接
合体対照を用いて、サンプル中のヘテロ接合体を認識できる。
【０１４９】実施例１０ オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーション オリゴヌクレオチドは、Genosys Inc., Houston, Texasより購入するか、また
はApplied Biosystems 381A DNA合成器により作製した。使用したプローブのほ とんどは、HPLCまたはゲル電気泳動によって精製しなかった。例えば、プローブ
は、インターフェロン中の921 bp EcoRI-BglIIヒトB1-インターフェロン断片を 含むM13クローン[OhnoおよびTaniguchi, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:4270-4274
(1981)]中の完全に相補的な単一の標的、ならびにM13ベクター自体において末端
塩基誤対合を有する少なくとも１つの標的の両方を有するように設計した。
【０１５０】 オリゴヌクレオチドの末端標識は、記載されているように[Maniatisら、Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Cold Sp
ring Harbor, New York (1982)]、T4-ポリヌクレオチドキナーゼ(５単位、Amers
ham)、γ32P-ATP(3.3pM、10mCi Amersham 3000 Ci/mM)、およびオリゴヌクレオ チド(4pM、10ng)を含む10ml中で行った。プローブの比活性は2.5-5×109 cpm/nM
であった。
【０１５１】 一本鎖DNA(0.5NaOH、1.5M NaCl溶液中に2〜4ml)を、同溶液で湿らせたGene Sc
reen膜にスポットした。フィルターは0.05 M Na2HPO4(pH 6.5)で中和し、80℃に
て60分間炉で焼成し、1分間紫外線照射した。次いで、フィルターをハイブリダ イゼーション溶液(0.5M Na2HPO4(pH 7.2)、７％ナトリウムラウロイルサルコシ ン(sodium lauroyl sarcosine))中で室温にて５分間インキュベートし、プラス チック製のペトリ皿の表面に置いた。４nMの濃度の32P末端標識オリゴマープロ ーブを含むハイブリダイゼーション溶液(10ml、0.5M Na2HPO4(pH 7.2)、７％ナ トリウムラウロイルサルコシン)を１滴ずつ、フィルターごとに１〜６ドット滴 下し、正方形のポリエチレン片(約１×１cm)を被せ、湿性チャンバ中で所定の温
度にて３時間インキュベートした。フィルターを6X SSC洗浄用溶液に０℃にて３
×５分間入れて、ハイブリダイズしていないプローブを除去して、ハイブリダイ
ゼーションを停止した。フィルターを乾燥させるか、または所定の時間および温
度にてさらに洗浄するかして、オートラジオグラフィーにかけた。識別測定のた
めに、オートラジオグラフィー[蛍光画像化装置 (Molecular Dynamics, Sunnyva
le, California)が使用できる]後の乾燥フィルターからドットを切り出し、液体
シンチレーションカクテルに入れ、数を数えた。IFドットおよびM13ドットの未 補正cpm比はＤとする。
【０１５２】 本明細書中で報告する条件は、非常に短いオリゴヌクレオチドでのハイブリダ
イゼーションが可能でかつ標的核酸に対して相補的であるために、結合する対合
オリゴヌクレオチドと誤対合オリゴヌクレオチドとの識別を確実にするようなも
のである。ハイブリッド中の完全に相補的な標的と、単一の誤対合を有する不完
全に相補的な標的との識別(Ｄ)の程度に基づく短い特異的配列のハイブリダイゼ
ーションの有効な検出に影響を及ぼす因子は定義されている。実験検査において
、膜フィルターに結合した２つのM13クローンまたはモデルオリゴヌクレオチド への、６〜８ヌクレオチドの長さの28のプローブのドットブロットハイブリダイ
ゼーションを達成した。実験過程の指針となる原理を以下に記載する。
【０１５３】 プローブ過剰条件下で、膜結合した標的核酸（プローブよりも数ヌクレオチド
長い）へのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、標的濃度に関する疑
似一次反応である。この反応は： Ｓt/Ｓ0＝ｅ-kh[OP]t によって定義される。式中、ＳtおよびＳoは、それぞれ時間ｔおよびｔ0におけ る標的配列濃度である。(OP)はプローブ濃度であり、ｔは温度である。ハイブリ
ッド形成の速度定数ｋhは、0℃〜30℃の範囲でわずかに増加する(Porschkeおよ びEigen、J.Mol.Biol. 62:361(1971); Craigら, J.Mol. Biol. 62:383 (1971)) 。ハイブリッド溶解は、以下の式で表わされるハイブリッド濃度に関する一次反
応である(膜結合状態のため質量に置き換わる)： Ｈt/Ｈ0＝ｅ-kmt
【０１５４】 式中、ＨtおよびＨ0は、それぞれ時間ｔおよびｔ0におけるハイブリッド濃度 であり、ｋmは、温度および塩濃度に依存する、ハイブリッド溶解の速度定数で ある[Ikutaら、Nucl. Acids Res. 15:797(1987)；PorsclikeおよびEigen、J.Mol
.Biol. 62:361(1971);Craigら、J.Mol.Biol.62:303(1971)]。鎖会合過程である ハイブリダイゼーションの間、逆反応、溶解反応、または鎖解離反応も生じる。
つまり、時間内に形成されるハイブリッドの量は、正反応および逆反応の結果と
して生じる。プローブ濃度を上げて、および/または温度を下げて、平衝をハイ ブリッド形成に向かわせることができる。しかし、大容量の緩衝液中での洗浄サ
イクルにおいては溶解反応が優性であり、プローブがないために逆反応ハイブリ
ダイゼーションは有意ではない。この分析は、作用可能な短オリゴヌクレオチド
ハイブリダイゼーション(SOH)条件要件が、プローブ濃度または温度について変 化できることを示す。
【０１５５】 Ｄあるいは識別は式４によって定義される： Ｄ＝Ｈp(ｔw)/Ｈi(ｔw) Ｈp(ｔw)およびＨi(ｔw)はそれぞれ、同量の完全相補的二重鎖および不完全相
補的二重鎖について、洗浄時間ｔwの後に残るハイブリッドの量である。識別Ｄ は、所定の温度において、10の長さの洗浄時間に応じて変化し、式５においてＨ i ＝Ｂの際に最大値に到達する。
【０１５６】 バックグラウンドＢは、系において検出可能な最も低いハイブリダイゼーショ
ンシグナルを表わす。それ以上低下したＨiは検査できない可能性があるため、 続けて洗浄するとＤは増加する。ｔwを超える洗浄は、Ｂに対するＨpを減少させ
るのみであり、Ｄの減少として現れる。不完全ハイブリッドの最適洗浄時間ｔw は、式３および式５から： ｔw＝-In(Ｂ/Ｈi(ｔ0))/Ｋm.i である。
【０１５７】 Ｈpも同じｔwだけ洗浄されるため、式を組み合わせると以下の最適な識別関数
が得られる： Ｄ＝ｅIn(B/Hi(t0))km,p/km,iＸＨp(ｔ0)/Ｂ Ｔの関数としてのＤの変化は、最適洗浄温度の選択のために重要である。これ
は、Arheniusの式： Ｋ-＝Ａｅ-Ea/RT を、先の式に代入して最終的な式： Ｄ＝Ｈp((ｔ0)/ＢＸ(Ｂ/Ｈi(ｔ0)))(Ap/Ai)e(Ea,i-Ea,p)/RT を得る。
【０１５８】 式中、ＢはＨi(ｔ0)よりも低い。
【０１５９】 完全ハイブリッドの活性エネルギーＥa,p、および不完全ハイブリッドの活性 エネルギーＥa,iは、同等またはＥa,i＜Ｅa,pのいずれかであり、従ってそれぞ れの場合においてＤは温度に無関係か、または温度の上昇と共に減少する。この
結果は、SOHにおける良好な識別のためのストリンジェントな温度条件を調べる ことが不当であることを示している。低温度で洗浄すれば、同等またはより良好
な識別が得られるが、温度低下に従って洗浄時間が指数関数的に長くなる。Ｈp(
ｔ0)に対してＨi(ｔ0)が増える場合、識別はＴと共により激しく減少する。
【０１６０】 低温度におけるＤは、Ｈp(ｔ0)/Ｈi(ｔ0)比よりもＨp(ｔ0)/Ｂ比の方により依
存する。この結果は、この工程において得られる識別とは無関係に、ハイブリダ
イゼーションにおいて十分な量のＨpを得る方がより良いことを示す。洗浄によ ってより良好な識別が得られる。なぜなら完全ハイブリッドの量が多ければ、差
異溶解が効果を示すための時間がより長くなるからである。同様に、より多くの
量の標的核酸は、Ｋm,pとＫm,iとの差が小さくても、必要な識別が得られる。
【０１６１】 この単純なモデルで扱っているものよりも複雑な状況を推定した場合、所与の
核酸標的において多くの末端誤対合を有するプローブのハイブリダイゼーション
の場合、識別を得るために低温度における洗浄がより重要となる。
【０１６２】 実験指針として記載した理論的原理を使用すると、信頼できるハイブリダイゼ
ーションは６〜８ヌクレオチドの長さのプローブで得られる。全ての実験は、フ
ィルター上にハイブリダイゼーション溶液のフィルムを張った浮遊プラスチック
シートで行った。この方法は、プローブの量を最大限に低くするため、ドットブ
ロットハイブリダイゼーションにおける標識のコストが低くなる。ホスフェート
ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムラウロイルサルフェートの代わり
に高濃度のナトリウムラウロイルサルコシンを用いると、反応を室温から12℃に
まで下げることができる。同様に、4-6×SSC、10％ナトリウムラウロイルサルコ
シン緩衝液により、２℃の低温度におけるハイブリダイゼーションが可能になる
。これらの緩衝液中の界面活性剤は、最高40nMまでの濃度の標識プローブで許容
できるバックグラウンドを得るためのものである。短オリゴヌクレオチドハイブ
リッドの熱安定性の初期特性を、50％のＧ＋Ｃ含量を有するプロトタイプ8-mer(
即ち、配列TGCTCATGのプローブ)で決定した。理論上の予想では、このプローブ はより不安定な８-merの１つである。このプローブの遷移エンタルピーは、より
安定な７-merのそれに近く、６ヌクレオチドの長さのプローブにさえも近い(Bre
sslauerら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 83:3746(1986))。パラメーターＴd(１
分の単位時間においてハイブリッドの50％が溶解する温度)は18℃である。結果 は、８bpのハイブリッドのＴdが、11bpの二重らせんのＴdよりも15℃低いことを
示す[Wallaceら、Nucleic Acids Res.6:3543(1979)]。
【０１６３】 モデルオリゴヌクレオチドでの実験に加えて、短オリゴヌクレオチドハイブリ
ダイゼーションの実施証明用の系としてM13ベクターを選択した。主な目的は、 本発明の方法の種々の応用において使用される標的に類似した標的を用いて有用
な末端誤対合識別を示すことであった。M13モデルのためのオリゴヌクレオチド プローブは、M13ベクター自体が末端誤対合塩基を含むように選択された。ベク ターIF(921bpのヒトインターフェロン遺伝子挿入体を含むM13組換体)は、単一の
完全対合標的を担持する。従って、IFは、M13ベクター自体と比べて同数または より多数の誤対合標的を有する。
【０１６４】 低温度条件およびドットブロットを使用すれば、完全対合標的および誤対合標
的を含むドットと、誤対合標的のみを含むドットとの間で、ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルの十分な差が得られる。これは、６-merオリゴヌクレオチド、なら
びに大きいIF-M13対の核酸にハイブリダイズした７-merおよび８-merオリゴヌク
レオチドについても当てはまった。
【０１６５】 ハイブリダイゼーションシグナルは、プローブと反応できる、フィルター上の
標的の量に依存する。対照は、２つのドットにおけるサイン強度の差が核酸の量
の差を反映するものでないことを示すために必要である。IFおよびM13の両方に おいて同じ数および種類の標的を有するプローブでのハイブリダイゼーションは
、ドット中に同量のDNAが存在することを示す。ハイブリッド形成の有効性はハ イブリッドの長さと共に向上するため、ヌクレオチドを６つ有する二重らせんの
シグナルは、フィルターに結合した高質量のオリゴヌクレオチド標的で最も良好
に検出できた。標的として機能する大きい分子の核酸と比べて分子量が低いオリ
ゴヌクレオチド標的分子の方がより多く所定の表面積に結合することができる。
【０１６６】 未精製DNAでの検出の感度を測定するため、様々な量のファージ上清をフィル ター上にスポットし、32P標識８-merとハイブリダイズした。たった0.5ngのDNA を含む最小5000万の未精製ファージから検出可能なシグナルが得られ、短オリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーション方法の感度が十分であることを示した。実
用面では、反応時間が短かいことを付け加える。
【０１６７】 上記理論の節で記載したように、ハイブリッドの平衡収率は、プローブ濃度お
よび/または反応温度に依存する。例えば、13℃での４nM８-merでの場合、標的 のシグナルレベルは、プローブ濃度が40nMの場合の同量の標的シグナルレベルよ
りも３倍低く、ハイブリダイゼーション温度を25℃まで上昇すると4.5倍低くな る。
【０１６８】 最大限の識別を得るために低温度で洗浄することは実証されている。現象を明
確に可視化するために、IFドットと比べて50倍のDNAをM13ドットに加えて、ベク
ター特異的プローブでのハイブリダイゼーションを用いた。このようにして、実
際のプローブでのハイブリダイゼーション工程後のシグナルは、対合の場合より
も誤対合の場合に強くした。Ｈp/Ｈi比は１：４であった。７℃で時間延長して 洗浄すると、完全なハイブリッドを大量に失うことなく、２：１の比でシグナル
強度の逆転を得た。逆に、25℃ではいかなる識別も得ることは不可能であった。
なぜなら、2分間の洗浄で対合標的シグナルは既にバックグラウンド値にまで下 がる一方、誤対合ハイブリッド由来のシグナルは検出可能なままであるからであ
る。13℃での識別の損失は７℃の場合と比べるとそれほど大きくはないが明らか
に目で見えるものである。７℃での90分の時点と13℃での15分の時点とを考慮す
ると、誤対合ハイブリッドシグナルが、それぞれの条件における最適洗浄時間を
表わすバックグラウンド値に近い場合、13℃よりも７℃において量が数倍多いこ
とは明白である。このことについてさらに例示するために、２つの温度における
同量の出発ハイブリッドの洗浄による時間経過に伴う識別の変化は、より低い温
度においてより高い最大Ｄを示す。これらの結果から、温度、および洗浄工程の
開始時点における２種のハイブリッドの量の比に応じたＤの変化の傾向を確認で
きる。
【０１６９】 短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション条件の一般的な利用性を示すた
めに、本発明者らの簡易M13系において、４つの７-mer、10の８-mer、および14 の最長12ヌクレオチドの長さのプローブのハイブリダイゼーションを観察した。
これらは、ＧＣ含量の２つの極値を表わす９-merGTTTTTTAAおよび８-merGGCAGGC
Gを含む。ＧＣ含量および配列は、短いハイブリッドの安定性に影響を及ぼすと 予想されるが[Bresslauerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:3746 (1986)]
、低温度の短オリゴヌクレオチド条件は検査した全てのプローブに対して、十分
な識別を得るために適用できた。13ヌクレオチドの長さのプローブで得られた最
良の識別値は20であり、配列変化による数倍の低下は容易に許容できる。
【０１７０】 M13系は、標的DNAの複雑性が識別レベルに及ぼす影響を示す利点を有する。誤
対合標的が０または５であり、１つのＧＣ対のみ異なる２つの８-merについては
、それぞれ観察された識別は18.3および1.7であった。
【０１７１】 本方法の有用性を示すために、８ヌクレオチドの長さのプローブを３本、Blue
scriptベクターのライブラリーから作製された51プラスミドDNAドットの集合上 で検査した。プローブの１つは、Bluescriptベクターに存在し、同ベクターに対
して特異的であったが、M13では不在であった。その他の２つのプローブは、既 知配列挿入体である標的を有していた。この系では、それぞれのプローブに対し
て陰性または陽性の対照DNAでのハイブリダイゼーションを行うことができる。 このプローブ配列(CTCCCTTT)は、インターフェロン挿入体中にも相補的標的を有
していた。M13ドットは陰性であり、M13またはBluescript中のインターフェロン
挿入体は陽性であるため、ハイブリダイゼーションは配列特異的であった。同様
に、プローブは、51の挿入体のうちたった１つにある標的配列を検出し、対照で
は検査挿入体において標的配列を全く検出せず、適切な標的がクローン中に存在
すればハイブリダイゼーションが生じたであろうことを確認した。
【０１７２】 ６〜８ヌクレオチドの長さの非常に短いオリゴヌクレオチドハイブリッドにつ
いての熱安定性曲線は、11〜12ヌクレオチドの長さのハイブリッドよりも少なく
とも15℃低い[図１およびWallaceら, Nucleic Acids Res. 6:3543-3557 (1979)]
。しかし、低温度にて、かつ非常に実用的な0.4〜40nMの濃度のオリゴヌクレオ チドプローブにおいてハイブリダイゼーション反応を行うことにより、既知また
は未知の核酸標的中の相補的な配列の検出が可能になる。未知の核酸配列を完全
に決定するために、65,535の８-merプローブを含む完全セットを使用することが
できる。この目的のために十分な量の核酸が、都合の良い生物学的サンプル（例
えば数マイクロリットルのM13培養物、10mlの細菌培養物から得たプラスミド調 製物または単一コロニーの細菌、１ml未満の標準PCR反応液など）中に存在する 。
【０１７３】 ６〜10ヌクレオチドの長さの短いオリゴヌクレオチドから、優れた識別が得ら
れる。単一末端誤対合によるハイブリッド安定性の相対的な減少は、長いプロー
ブよりも大きい。８-merTGCTCATGから得られる結果がこの結論を裏付ける。実験
において、Ｇ/Ｔ末端誤対合を有する標的、この種の誤対合を有する標的へのハ イブリダイゼーションは他の全ての種のオリゴヌクレオチドの中で最も安定して
いる。得られた識別は、19塩基対二重らせんにおける内部G/T誤対合と同一かま たは大きい[Ikutaら、Nucl. Acids res. 15:797(1987)]。短オリゴヌクレオチド
のための記載されているハイブリダイゼーション条件を用いてこれらの識別特性
を活用すれば、オリゴヌクレオチド標的の非常に正確な決定が可能である。完全
ハイブリッドと不完全ハイブリッドとの識別を検出の簡便性に対して、非常に短
いオリゴヌクレオチドを用いる上で存在する問題は十分な量のハイブリッドを調
製することである。実際には、ＨpとＨiとを識別する必要性は、ドット中のDNA 量および/またはプローブ濃度を上昇すること、またはハイブリダイゼーション 温度を下げることによって補助される。しかし、高いプローブ濃度は、通常バッ
クグラウンドを上げる。また、実用面での標的核酸の量には限度がある。この問
題は、４nMのプローブで有効なバックグラウンドをもたらす界面活性剤サルコシ
ルの濃度を高くすることによって解決された。プローブが非特異的にフィルター
に結合するのを防ぐための競合相手を使用すること、またはハイブリダイゼーシ
ョン支持体材料を変えることで更に改良できる。さらに、45Kcal/mol未満のＥa を有するプローブ(例えば、多くの７-merおよび主な６-mer)については、改変オ
リゴヌクレオチドの方が、改変されていない相当物よりも安定なハイブリッドが
得られる[Asselineら、Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3297 (1984)]。本発明に記 載されている、低温度を利用する短いオリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼー
ションのためのハイブリダイゼーション条件により、全ての配列および二重らせ
んハイブリッドインプットに対してより良好な識別が得られる。異なる配列に対
してハイブリダイゼーション条件の均一性を得るための唯一の代償は、洗浄時間
が配列によって数分から最長で24時間長くなることである。また、洗浄時間は、
塩濃度を下げることによってさらに短くすることができる。
【０１７４】 短オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、誤対合ハイブリッドに対し
て１つの対合ハイブリッドを識別する点で優れているが、誤対合ハイブリッド由
来のシグナルも存在する。この誤対合ハイブリッドの多くは末端誤対合によるも
のである。これにより、特定の長さのプローブで有効に検査されうる挿入体の大
きさが限定される可能性がある。
【０１７５】 配列の複雑性の識別に対する影響は無視できない。しかし、複雑性の影響は、
短オリゴヌクレオチドでのハイブリダイゼーションにより特異的かつ非ランダム
な配列について配列情報を定義する場合により有意であり、（適切なプローブの
長さ）対（標的の長さ）の比を用いることによって克服できる。長さ比は、統計
に基づいて、識別を消去するか、識別を間違って反転してしまうようないくつか
の末端誤対合を有する特異的配列が発生する可能性を無くすように選択する。結
果から、0.6、2.5、および10kb未満の標的核酸挿入体に対して、それぞれ６、７
、および８ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドの使用が示唆される。
【０１７６】実施例11 DNAの配列決定 複数のサブアレイからなるアレイにより、反復されたサブアレイの形で並べら
れたサンプルの小さなセットの効率的な配列決定が可能になる。例えば、64個の
サンプルを８×８mmのサブアレイ上に並べて、16×24個のサブアレイを15×23cm
の膜上に１mm幅間隔で反復させもよい。幾つかのレプリカ膜を作製してもよい。
たとえば、3072の７-merからなる１つのユニバーサルセットからのプローブを、
32個の96ウェルプレートに分け、キナーゼにより標識することができる。４つの
膜を１サイクルのハイブリダイゼーションの間に並行処理してもよい。各膜上で
、384のプローブを評点してもよい。全てのプローブを２サイクルのハイブリダ イゼーションで評点してもよい。ハイブリダイゼーション強度を評点し、配列を
以下のようにアセンブルすることができる。
【０１７７】 単一のまたは複数のサンプルのサブアレイが幾つかの未知物質を含む場合、特
に似たようなサンプルを使用する場合、先に評点したプローブの結果に基づいて
プローブを賢く選択すれば、より少ないプローブで十分である。例えば、プロー
ブAAAAAAAが陽性でない場合、８つのオーバーラッププローブのうちのいずれか が陽性である可能性は低い。AAAAAAAが陽性であれば、通常２つのプローブが陽 性である。この場合、アンカーの順番および各アンカー間のギャップのサイズお
よびタイプについて最も可能性の高い仮説のうちの１つを確認する配列決定プロ
セスは、まずオーバーラップが最小であるプローブからなるサブセットをハイブ
リダイズして陽性アンカーを定義したあと、プローブを選択することからなる。
この第２段階において、各プローブが、そのプールからの他のプローブに対して
陽性であると期待されるサンプルとは異なるたった１つのDNAサンプルにおいて のみ陽性であるように選択された場合、２〜10プローブからなるプールを使用す
ることができる。
【０１７８】 このサブアレイ方法により、分岐問題を解明するためのプローブの競合（オー
バーラッププローブ）またはプローブの協働（プローブの連続的なスタッキング
）の効率的な実施が可能となる。プローブのユニバーサルセットをハイブリダイ
ズしたあと、配列アセンブリプログラムにより候補配列のサブ断片（SF）を決定
する。SFのさらなるアセンブリのために、（DNA断片のオーバーラップ配列、類 似配列、単一パスゲル配列、また他のハイブリダイゼーションもしくは制限地図
データからの）追加情報を提供しなければならない。分岐点を通る単一パスゲル
配列決定のためのプライマーを、SBH配列情報または既知のベクター配列（例え ばベクター挿入部位のフランキング配列）から同定し、標準的なサンガーの配列
決定反応をサンプルDNAに対して行う。この単一パスゲル配列決定から得た配列 を、分岐点の中に読みこまれたもしくはそこから読み出されたSfと比較し、Sfの
順番を同定する。さらに、単一パスゲル配列決定をSBHと組み合わせて、核酸を 新たに配列決定するかまたは再配列決定することができる。
【０１７９】 また、競合ハイブリダイゼーションおよび連続的なスタッキング相互作用を使
用してSfをアセンブルすることもできる。これらの方法は、SBHでは均一なアレ イを使用する場合に標識されたプローブをアレイに固定されたサンプルに適用す
るため、大量のサンプルを配列決定するための商業的価値に限界がある。幸運に
も、レプリカサブアレイを用いた少量サンプルの分析により両方の方法の効率的
な実施が可能になる。各レプリカサブアレイ上で、プローブのプールを用いて、
同じサブアレイの中にスポットされた異なるサンプルの中の突然変異配列を解明
するときと同じように（上記参照）、１つの分岐点を１以上のDNAサンプルにつ いて検査することができる。
【０１８０】 この実施例に記載した64サンプルの各々には100の分岐点があり、８サンプル を各サブアレイで並行して分析する場合は、少なくとも800のサブアレイプロー ビングにより全ての分岐点を解明する。これは、3072の塩基プロービングのため
にはさらに800のプロービング（25％）が使用されることを意味する。より好ま しくは、２つのプロービングを１つの分岐点で使用する。サブアレイがより小さ
い場合、追加使用するプロービングはこれより少ない。例えば、サブアレイが16
個のサンプルからなる場合、200の追加プロービングが評点される（６％）。７-
merプローブ（N1-2B7N1-2）を用いることにより、および競合的もしくは共同的 な分岐点解明方法またはその両方を用いて、約1000bpの断片を約4000のプロービ
ングによりアセンブルすることができる。さらに、８-merプローブ（NB8N）を用
いて4kbもしくはこれより長い断片を12000のプロービングでアセンブルすること
ができる。途切れたプローブ（gapped probe）、例えばNB4NB3NもしくはNB4NB4N
を使用して分岐点の数を減少させることができる。
【０１８１】実施例１２ プローブの一時的なサブアレイへの結合によるDNA解析および標識プローブのラ イゲーション
【０１８２】 情報提供の長さを４から４０塩基有するオリゴヌクレオチドプローブを、標準的
な化学により合成し、試験管またはマルチウェルプレート中に保存する。１から
１０,０００プローブから成る特定のプローブセットを、別個の支持体またはよ り大きな支持体の異なる部分への沈降、またはin situ 合成により整列させる 。後者の場合、その部分またはサブアレイは、物理的または疎水性のバリアーに
よって分離してもよい。このプローブアレイは、in situ合成によって調整して もよい。適当なサイズのサンプルDNAを、一つかそれ以上の特定アレイでハイブ リダイズする。サンプルの多くは同じサブアレイにおけるプールとして、または
一つの支持体内に異なるサブアレイを有するものをそれぞれ個別に、コンピュー
タにかけてもよい。サンプルと同時に、またはそれに続いて、単一の標識プロー
ブ、または標識プローブのプールを一つ、各サブアレイに加える。結合および標
識したプローブを、サンプルDNA中の相補的な標的に背中合わせにハイブリダイ ズすると、それらは連結される。ライゲーションの発生は、プローブから標識を
検出することによって測定する。
【０１８３】 この手順は、DNAサンプルが支持体に永久的に結合されない、記載のDNA解析方法
とは異なる方法である。一時的な結合は、支持体に固定したプローブによっても
たらされる。この場合、標的DNAアレイの方法は必要ない。さらに、ライゲーシ ョンにより、短い固定プローブを伴う短い標識プローブを結合することによって
、より長いオリゴヌクレオチド配列の検出が可能になる。
【０１８４】 この方法はいくつかのユニークな特色をもつ。基本的に、標的の一時的結合によ
り、その再利用が可能になる。ライゲーションが起きた後、標的を放出してもよ
く、標識は支持体に共有結合したままとなる。この特色により、標的のサイクリ
ングおよび少量の標的で検出できる信号の産生が可能になる。最適条件下では、
標的を増幅する必要はない。例えば、DNAサンプルの天然源を、診断および配列 決定を目的として、直接使用してもよい。効率のよいハイブリダイゼーションと
効率のよい二重らせんの融解との間で温度をサイクリングすることによって、標
的を放出させてもよい。成分の温度と濃度は、遊離標的とハイブリッド中に入っ
た標的との間で均衡をもつように（およそ50:50％）定義してよい。この場合、 連結した産物が連続して産生される。目的が異なる場合は、最適均衡比が異なっ
てくる。
【０１８５】 電場を、標的の利用を高めるために使用してもよい。まず始めに、各サブアレイ
内の水平フィールドパルシング（horizontal field pulsing）を、より早く標的
を選別するために使用してよい。この段階で、均衡がハイブリッド形成に動き、
非標識プローブが使用できる。標的を選別する段階を経た後に、適当な洗浄（垂
直電場でサンプルの動きを制限することでやりやすくなる）を実施してよい。識
別するハイブリッド融解、ハイブリダイゼーションによる標的の収穫、未使用標
的のライゲーションおよび除去の、いくつかのサイクルを、特異性を増すために
導入してもよい。次の段階では、標識したプローブを加え、垂直電気パルスを用
いてもよい。温度を上昇させて、最適な遊離標的とハイブリダイズした標的との
比が得られる。垂直電場は選別した標的の拡散を防ぐ。
【０１８６】 固定プローブのサブアレイおよび標識プローブのセット（特に設計するかまたは
一般的なプローブセットから選択する）は、有効でフレキシブルな配列決定およ
び診断方法を可能にするべく、様々にアレンジしてよい。例えば、細菌ゲノムの
短いフラグメント（約1００−５００ｂｐ）を部分的にまたは完全に配列決定す る場合は、既知の配列の塩基上に設計したプローブの小さなアレイ（５−３０塩
基長）を使用してよい。サブアレイ毎、すなわちそれぞれ１０個のプローブを有
する１０のサブアレイ毎に、１０の標識プローブからなる別個のプールを調べる
と、ライゲーションで連結された2塩基を評価すると仮定して、２００塩基確認 できる。ハイブリッドを通じて誤対合を識別する条件下で、プローブは一つ以上
の塩基と置き換えて、同数のプローブをもつより長い標的をカバーしてもよい。
長いプローブを用いることにより、サンプル中の残りのDNAから増幅または単離 せずに、直接調べることができる。また、いくつかの標的を同時に一つのサンプ
ル中で分析（スクリーニング）してもよい。得られた結果が突然変異（または病
原体）の発生を示唆する場合、その突然変異のタイプまたは病原体のサブタイプ
を検出するために、プローブの追加プールを使用してもよい。これはこの方法の
特色であり、ほんの一部の患者のみが感染または突然変異を有すると考えられる
場合の予防的診断において費用対効果が優れている。
【０１８７】 実施例で述べた方法においては、いろいろな検出方法を使用してよい。例えば、
放射性標識、蛍光標識、酵素または抗体（化学発光）、光分散または光の干渉を
利用する方法で検出可能な大きな分子または粒子があげられる。
【０１８８】実施例13 ８-merおよび９-merを用いた標的の配列決定 ８-merおよび９-merのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションから得られ
るデータは、ハイブリダイゼーションによる配列決定が非常に精度が高いことを
示している。この実験では、隣接してオーバーラップする成分の８-merおよび９
-merのオリゴヌクレオチドを推定するために、既知の配列を使用した。
【０１８９】 完全に対合するオリゴヌクレオチドに加えて、誤対合のオリゴヌクレオチド、内
部または末端誤対合がオリゴヌクレオチドにより形成された二重らせん中に発生
する誤対合のオリゴヌクレオチド、ならびに標的を調べた。この分析では、ハイ
ブリダイゼーション形成を最大限にするために、最も低い実温度を用いた。誤対
合 対 対合オリゴヌクレオチド／標的ハイブリダイゼーションの最大解離率を
用いて、必ず最大限の識別ができるように、上記と同じ温度またはより低い温度
で洗浄を行った。絶対ハイブリダイゼーション収率は配列に依存して示してある
が、上記の条件は、全ての配列に適用できるように示してある。
【０１９０】 不安定さが最小であると仮定できる誤対合は、単一端の誤対合であるので、ハイ
ブリダイゼーションによる配列決定の試験とは、すなわち完全に対合するオリゴ
ヌクレオチド／標的二重らせんを、末端が誤対合したオリゴヌクレオチド／標的
二重らせんから識別する能力である。
【０１９１】 ドットブロットフォーマット（dot blot format）中１０２から１０５のハイブ リダイズするオリゴヌクレオチドについて、識別を示す値は、精度の高い配列生
成を可能とする、２より大きかった。このシステムはまたハイブリダイゼーショ
ン形成に及ぼす配列の効果ならびにハイブリダイゼーションの不安定性の分析も
可能にする。
【０１９２】 既知の配列の１０５のオリゴヌクレオチドプローブの標的核酸への、ハイブリダ
イゼーションにより得られたデータを用いて、例えば１００bｐの標的配列のPCR
で調製したヒトインターフェロン遺伝子の既知の部分の１００の塩基対を生成し
た。使用したオリゴヌクレオチドプローブは、その配列が完全に標的と相補的な
配列である、72の８-merと21の９-merのオリゴヌクレオチドを含んでいた。93の
プローブセットにより、一つか二つの塩基をずらした標的配列の連続してオーバ
ーラップするフレームが提供された。
【０１９３】 誤対合の影響を評価するために、１００ｂｐの試験標的配列へハイブリダイズし
た際に、少なくとも一端の誤対合を含む１２の追加プローブについて、ハイブリ
ダイゼーションを調べた。また、選んだその他４つの対照核酸配列と末端が誤対
合する標的をもつ１２のプローブのハイブリダイゼーションを試験したところ、
形成した１２のオリゴヌクレオチドは、四つの対照DNAをともなう二重らせんハ イブリッドと完全に対合した。こうして、オリゴヌクレオチドと標的の、内部の
誤対合、末端誤対合、完全に対合する二重らせん対のハイブリダイゼーションを
、試験で使用したオリゴヌクレオチドそれぞれについて評価した。絶対DNA標的 濃度が、試験の８-merと９-merのオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼー
ションに及ぼす影響を、共増幅したプラスミドDNA内の単一で発生する非標的部 位への異なるオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出し、
標的DNA濃度を定義することによって決定した。
【０１９４】 この試験の結果により、標的に完全に対合する相補的な配列を含むオリゴヌクレ
オチド全て、または対照DNAが、誤対合を有するオリゴヌクレオチドよりも強く ハイブリダイズしたことが示された。この結論にいたるため、各プローブについ
てHｐおよびD値を調べた。Hpは試験標的とオリゴヌクレオチドプローブとの間に
形成されたハイブリッド二重らせん量を定義する。０から１０の間の値を１０５
のプローブについて得られたハイブリダイゼーションに当てたところ、１０５の
プローブの６８．５％が２より大きいHpであることが明らかとなった。
【０１９５】 １）試験オリゴヌクレオチドと標的または対照核酸との間に形成された完全に対
合した二重らせんをひとつ含むドットと、２）同じオリゴヌクレオチドと標的ま
たは対照核酸内の異なる部位との間に形成された誤対合二重らせんをひとつふく
むドット、との間の信号強度の比として定義して、識別（D）値を得た。D値の変
動は、１）バックグラウンドから信号の視覚化を可能にする、ハイブリダイゼー
ションの有効性の摂動、または２）試験オリゴヌクレオチドと標的との間に見ら
れた誤対合のタイプ、のどちらかによりもたらされる。この試験で得られたD値 は、試験をした１０５のオリゴヌクレオチドプローブのうち１０２について、２
から４０の間であった。１０２のオリゴヌクレオチドを全体とした群について、
D値を計算したところ、平均１０．６であった。
【０１９６】 オリゴヌクレオチド／標的二重らせんが末端誤対合を示したのは２０例であった
。このうち５例では、Dは１０より大きかった。この場合の大きいD値は、最も安
定的な（G／TおよびG／A）末端の誤対合以外により引き起こされる、ハイブリダ
イゼーションの不安定性によるのではないかと考えられる。その他の可能性とし
ては、オリゴヌクレオチドまたは標的のどちらかの配列にエラーがあったことが
あげられる。
【０１９７】 低いHpのプローブの標的におけるエラーの可能性は、このようなエラーがその他
８つのオーバーラップするオリゴヌクレオチドそれぞれのハイブリダイゼーショ
ンに影響したと考えられるため、除外した。その他のオーバーラップするオリゴ
ヌクレオチドについて配列の誤対合による明らかな不安定性が見られなかったこ
とは、標的配列が正しかったことを示すものである。オリゴヌクレオチド配列中
のエラーの可能性は、７つの新しく生成したオリゴヌクレオチドを再度調べた後
に除外した。７つのオリゴヌクレオチドのうち一つのみが、よりよいD値をもた らした。低いハイブリッド形成値は、ハイブリッドの不安定性またはハイブリッ
ド二重らせんの形成の無能力からもたらされる可能性がある。ハイブリッド二重
らせんの形成の無能力、１）選んだプローブの自己相補性または２）標的／標的
自己ハイブリダイゼーションのどちらかより起こりえる。プローブが自己相補性
であった場合、オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド二重らせん形成のほう
が、オリゴヌクレオチド／標的ハイブリッド二重らせん形成よりも有利となる可
能性がある。同様に、標的が自己相補的であった場合には、標的／標的結合が有
利となるか、または内部パリンドロームを形成する可能性がある。これらの可能
性を評価したところ、問題のあるプローブが、自身とハイブリッドを形成しなか
ったことは、プローブ分析から明らかであった。さらに、標的／標的ハイブリダ
イゼーションの貢献度を検討したところ、問題のあるオリゴヌクレオチドプロー
ブの一つが、同じ標的を含む二つの異なるDNAで非効率的にハイブリダイズした ことが決定された。二つの異なるDNAが同じ標的配列について自己相補的な領域 をもつ可能性が低いということは、標的／標的ハイブリダイゼーションが低いハ
イブリダイゼーション形成には寄与しなかったという結論を導き出す。したがっ
て、こうした結果は、ハイブリッド形成の無能力ではなく、ハイブリッドの不安
定性が、特定のオリゴヌクレオチドに観察された低いハイブリッド形成の原因で
あったことを示唆している。またこうした結果は、低いハイブリッド形成が、一
定のオリゴヌクレオチドの特定の配列によるものであることをも示唆している。
さらにこうした結果は、８-merおよび９-merのオリゴヌクレオチドを使用すれば
、配列を生成するのに信頼できる結果が得られるだろうことを示唆している。
【０１９８】 これらの結果は、記載した方法を用いることで、どんな特定の標的核酸の長い配
列も、構成するオリゴヌクレオチドの最大限かつユニークなオーバーラップによ
り生成されるであろうことを示している。このような配列決定方法は、その頻度
や位置とは無関係で、個々の構成オリゴマーの内容に依存する。
【０１９９】 下記のアルゴリズムを使って生成する配列は、精度が高い。４つ低い信頼値が含
まれる、１０５のハイブリダイゼーション値から生成する配列が正しかったとい
う事実に示されるとおり、このアルゴリズムは、ハイブリダイゼーションドット
からの誤った正の信号を許容する。ハイブリダイゼーションによる配列決定にお
ける正確さは、短いオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの「一か八か（
all or none）」の動態、ならびに完全に対合した二重らせんと誤対合した二重 らせんとの間の二重らせんの安定性の違いによる。対合した二重らせんおよび末
端が誤対合した二重らせんの二重らせん安定性の比は、二重らせん長の減少につ
れて増す。さらに、結合エネルギーは、二重らせん長の減少につれ低下し、より
低いハイブリダイゼーション効率をもたらす。ただし、こうした結果は、オクタ
マーハイブリダイゼーションが、二重らせんの安定性に影響する因子の平均化、
ならびにハイブリダイゼーションにより配列決定する精度の高い方法を生み出す
ための識別を、可能にすることを示す。その他実施例における結果は、６，７、
または８つのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドは、０．５ｋｂ（ヘキサマ
ー）、２ｋｂ（セプタマー）、６ｋｂ（オクタマー）である標的に、信頼できる
配列を生成するのに、有効に利用できることが示された。長いフラグメントの配
列は、完全なゲノム配列を生成するため、オーバーラップしてもよい。
【０２００】実施例14 得られたデータの解析 イメージファイルを、DOTSプログラム(Drmanacら, 1993)のようなイメージ解 析プログラムで解析し、例えばSCORESプログラム(Drmanacら, 1994)中に含まれ る統計的機能でスケールして評価した。シグナルの分布から、シグナルを+/-ア ウトプットに変換するために最適閾値を決定する。検出された標識の位置から、
断片からのF+Pヌクレオチド配列が標識位置に対応する標識プローブと固定化プ ローブの既知配列を組み合わせることで決定されよう。その後、ヒト染色体など
の元の分子の完全な核酸配列または配列サブフラグメントはコンピュータ演繹法
により決定されたオーバーラップするF+P配列からアセンブルされるだろう。
【０２０１】 一つの選択肢は、配列アセンブリ過程でハイブリダイゼーションシグナル（例
えば、スコア）を+/-アウトプットに変換することである。この場合に、アセン ブリは非常に高いスコアをもつF+P配列、例えばF+P配列 AAAAAATTTTTT から出発
するだろう。４つ全ての可能なオーバーラップするプローブ AAAAATTTTTA、AAAA
ATTTTTT、AAAAATTTTTTCおよびAAAAATTTTTTG、および冒頭で異なる３つの追加の プローブ(TAAAAATTTTTT; CAAAAATTTTTT; GAAAAATTTTTT)のスコアを比較すると、
３つの結果が規定される。すなわち、(i) 出発プローブと４つのオーバーラップ
するプローブのうちの１つだけが他の６つのプローブに対して有意に正のスコア
を有する。この場合には、AAAAAATTTTTT配列が右側に１ヌクレオチドだけ伸長さ
れる；(ii)出発プローブを除いてどのプローブも有意に正のスコアをもたない。
アセンブリは停止し、例えばAAAAAATTTTT配列が配列決定されるDNA分子の最後に
くる；(iii) オーバーラップするプローブおよび／または他の３つのプローブの
中に有意に正のスコアが２以上存在する。エラーまたは枝分かれのためにアセン
ブリが停止される(Drmanacら, 1989)。
【０２０２】 コンピュータ演繹法では、既存のアルゴリズムを用いるコンピュータプログラ
ムが利用されるだろう（例えば、Pevzner, 1989; Drmanacら, 1991; Labat & Dr
manacら, 1993を参照のこと；それぞれを参考としてここに組み入れる）。
【０２０３】 F+Pのほかに、F(スペース1)P、F(スペース2)P、F(スペース3)PまたはF(スペー
ス4)Pが決定される場合は、アルゴリズムを用いて全てのデータセットをマッチ させることにより、起こりうるエラーを修正したり、枝分かれの問題が存在する
事例を解明できるだろう（例えば、Drmanacら, 1989; Bainsら, 1988；それぞれ
を参考としてここに組み入れる）。
【０２０４】実施例15 ツーステップハイブリダイゼーションにより配列決定を行う 本発明者により意図される配列決定法の実施を記載するいくつかの実施例に続
いて、最初に、全チップを１億bp（１本のヒト染色体）ほどに複雑なDNAの混合 物とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションを実施するためのガイドラ
インは、Drmanacら (1990); Khrapkoら (1991); Broudeら (1994) などの文献に
載っている。これらの文献は、フォーマット3 SBHの初期ステップで使用するの に適するハイブリダイゼーションの温度範囲、緩衝液および洗浄ステップを教示
している。
【０２０５】 本発明者は、特に、提供され得る標的DNAの濃度が比較的低いために、ハイブ リダイゼーションを高塩濃度にて低温（-2〜5℃）で最大数時間にわたり実施す ることを意図している。そのために、10℃で析出するリン酸ナトリウム緩衝液の
代わりにSSC緩衝液を使用する(Drmanacら, 1990)。洗浄は第２ステップのために
十分である必要はなく(2,3分)、高度に複雑なDNAサンプルの配列決定のためにハ
イブリダイゼーションサイクリングを使用する場合には完全に排除することがで
きる。ハイブリダイゼーションステップと洗浄ステップで同一の緩衝液を用いる
と、標識プローブを用いる第２ハイブリダイゼーションステップと続行させるこ
とができる。
【０２０６】 各アレイ（例えば、8 x 8mm アレイ）に対して単純なロボットデバイスを使用
する適切な洗浄を行った後に、１つの標識プローブ（例えば、6-mer）を添加す る。96-チップまたは96-ピンデバイスを用いて、これを42回実施する。この場合
も、科学文献に記載されるような、ある範囲の差別的条件が採用されるだろう。
【０２０７】 本発明者は、特に、次の条件を採用することを意図している。最初に、標識プ
ローブを添加して、低温(0〜5℃)で（添加オリゴヌクレオチドの高濃度のため）
数分間だけインキュベートした後、F+P長さに応じて温度を3〜10℃に上げ、洗浄
緩衝液を添加する。この時に用いる洗浄緩衝液はどのようなライゲーション反応
にも適合しうるもの（例えば、100 mMの塩濃度範囲）である。リガーゼを添加し
た後、迅速なライゲーションおよび完全対合と誤対合ハイブリッドのさらなる識
別を可能とするために温度を再度15〜37℃に上げる。
【０２０８】 Pontius & Berg (1991, 参考としてここに組み入れる）に記載されるように、
カチオン界面活性剤の使用が、フォーマット3 SBHでも意図される。これらの著 者は、２種の単純なカチオン界面活性剤、ドデシル- およびセチルトリメチルア
ンモニウムブロミド(DTABおよびCTAB)をDNA再結合において使用することを記述 している。
【０２０９】 DTAB およびCTABは、第四級アミンであるテトラメチルアンモニウムブロミド(
TMAB)の変異体で、メチル基の１つが12炭素アルキル基(DTAM)または16炭素アル キル基(CTAB)のいずれかで置換されている。TMABはテトラメチルアンモニウムイ
オンの臭化物塩であり、融解温度のG-C含量バイアスを低下させるための核酸再 結合実験で用いる試薬である。DTABおよびCTABは構造的にドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)に類似しており、SDSの負に荷電した硫酸基が正に荷電した第四級アミン
に置き換わっている。SDSは非特異的結合を減少させかつヌクレアーゼを阻害す るためにハイブリダイゼーション緩衝液中で普通に用いられるが、再結合速度に
は大きな影響を与えない。
【０２１０】 ライゲーション法を使用するとき、酵素は標識プローブと共に、またはバック
グラウンドを低下させる適切な洗浄ステップの後に添加されるだろう。SBH法で の使用についてこれまで提案されたことはないが、リガーゼ技法は分子生物学の
分野で十分に確立されている。例えば、Hoodと共同研究者はリガーゼ媒介遺伝子
検出法(Landegrenら, 1988)を記載しており、この方法はフォーマット3 SBHでの
使用のために容易に適合させることができる。Wu & Wallaceもまた、２つの隣接
した短い合成オリゴヌクレオチドを連結するためにバクテリオファージT4 DNAリ
ガーゼの使用を記載している。彼らのオリゴライゲーション反応は、50 mM Tris
HCl pH7.6, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTTおよび5% PEG中で実施された。 ライゲーション反応物を100℃に5〜10分加熱し、続いて0℃に冷却してからT4 DN
Aリガーゼ(1単位; Bethesda Research Laboratory)を添加した。大方のライゲー
ション反応は30℃で実施し、100℃で5分間加熱して終結させた。
【０２１１】 その後、ハイブリダイズした隣接する、またはライゲートされた、長さ(F+P) のオリゴヌクレオチドの識別検出に適する最終洗浄を行う。この洗浄ステップは
、ライゲートされていない全ての標識プローブと他の全ての化合物を洗い流して
バックグラウンドを最小に低減させるために、40〜60℃の水の中で数分間実施す
る。共有結合で結合された標識オリゴヌクレオチドのため、検出は単純化される
（時間および低温を強制されない）。
【０２１２】 用いた標識に応じて、チップのイメージングは異なる装置を用いて行う。放射
性標識の場合は、ホスホル・ストレージ・スクリーン技術とスキャナーとしての
PhosphorImagerを使用することができる(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)
。チップをカセットの中に置き、リンスクリーンでカバーする。1〜4時間の暴露
後、スクリーンをスキャンして、イメージファイルをコンピュータのハードディ
スクに記憶させる。蛍光標識の検出の場合は、CCDカメラとエピ蛍光または同焦 点顕微鏡を使用する。CCDカメラの画素上に直接作製されたチップについては、E
ggersら(1994, 参考としてここに組み入れる）が記載するとおりに検出を行うこ
とができる。
【０２１３】 電荷結合デバイス(charge-coupled device: CCD)検出器は、プローブに基づい
たアッセイで標識標的分子を定量的に検出して、その分布をイメージする活性固
相支持体として働く。これらのデバイスは、高度にパラレルなアッセイ、超高感
度検出、ハイスループット、統合データ獲得およびコンピュータ計算に適合する
マイクロエレクトロニクスの固有の特徴を使用している。Eggersら(1994)は、本
発明のフォーマット3 SBHなどのプローブに基づいたアッセイと共に使用するた めのCCDを記述しており、このCCDは採用した高感度および直接結合のために数秒
以内での定量的評価を可能にする。
【０２１４】 統合CCD検出法はチップ上での分子結合イベントの検出を可能にする。この検 出器はサンプルをユニークに特徴づける二次元パターンを速やかに作成する。CC
Dに基づく分子検出器の特定的な操作においては、個別の生物学的プローブがCCD
の画素上に直接固定されるか、またはCCD表面上に置かれた使い捨てカバースリ ップに結合させてもよい。サンプル分子は放射性同位体、化学発光物質または蛍
光タグで標識することができる。
【０２１５】 CCDに基づくプローブアレイにサンプルを暴露すると、フォーマット3の場合に
は、サンプルが2つの相補的なプローブに結合された画素位置で光子または放射 性同位体の崩壊産物が発生する。その後、荷電粒子または標識サンプルからの放
射線がCCDゲートに入射すると、電子−穴対が形成される。次に、電子が隣接す るCCDゲートの下に集められ、ディスプレイモジュールで順次読み取られる。そ れぞれの画素で生成された光電子の数は、このような接近している分子結合イベ
ントの数に直接比例している。その結果、分子結合を定量的に測定することがで
きる(Eggersら, 1994)。
【０２１６】 イメージングアレイをサンプルに接近して配置することにより、収集効率が従
来のCCDカメラに見られるようなレンズに基づく技術よりも少なくとも10倍向上 する。すなわち、サンプル（エミッタ）を検出器（イメージングアレイ）と近く
で接触しており、このことがレンズやミラーなどの従来のイメージングオプチッ
クスを排除する。
【０２１７】 放射性同位体がレポーター基として標的分子に結合される場合は、エネルギー
粒子が検出される。さまざまなエネルギーの粒子を発生する数種のレポーター基
が微細加工検出器と共に使用されて成功を収めており、32P、33P、35S、14Cおよ
び125Lなどがある。32P由来のような高エネルギー粒子は最高の分子検出感度を 提供するが、35S由来のような低エネルギー粒子はより良い解像度を提供する。 それゆえ、放射性同位体レポーターは要求に合わせて選択することができる。い
ったん特定の放射性同位体標識が選択されると、Eggersら(1994)が記載するよう
に、シグナル対ノイズ比(SNR)を計算することで検出性能を推定することができ る。
【０２１８】 別の発光検出法は、標的分子に結合された蛍光または化学発光レポーター基の
使用を含む。蛍光標識は共有結合でまたは相互作用を介して結合させることがで
きる。エチジウムブロミドなどの蛍光染料は、強力な吸収バンドがUV(300〜350
nm)域付近にあり、また、主な発光バンドが可視(500〜650 nm)域にあって、用い
るCCDデバイスに最も適している。なぜなら、量子効率が蛍光シグナル波長でよ りも励起波長で数桁分低いからである。
【０２１９】 ルミネッセンスを検出する視点からは、ポリシリコンCCDゲートはUV域の入射 光の寄与を濾過するためのビルトイン容量を有し、しかも蛍光レポーター基によ
って発生した可視ルミネッセンスに対して非常に感度がよい。UV励起に対するこ
のような大きい固有の識別は、Eggersら(1994)により提案されたCCDで大きなSNR
(100より大)を達成することを可能にする。
【０２２０】 検出器へのプローブの固定化のために、ハイブリダイゼーションマトリックス
を安価なSiO２ウェーハ上に作製することができ、次にこれがハイブリダイゼー ションおよび乾燥後にCCDの表面に配置される。このフォーマットは経済的に効 率がよい。というのは、DNAのハイブリダイゼーションが安価な使い捨てSiO２ウ
ェーハ上で実施され、したがって、比較的高価なCCD検出器の再利用を可能にす るからである。あるいはまた、CCD上に直接プローブを固定化してプローブマト リックスを作製してもよい。
【０２２１】 SiO2コーティング上にプローブを固定するために、エポキシ-シラン試薬と標 準的なSiO2修飾化学を用いて、フィルム表面に均一なエポキシド層を結合させる
。次に、アミン修飾オリゴヌクレオチドプローブを、エポキシド環との第二級ア
ミン形成によりSiO2表面に結合させる。得られる結合により、オリゴヌクレオチ
ドの3塩基とSiO2表面とを隔離する17の回転可能な結合が提供される。完全なア ミンの脱プロトン化を確実にし、かつ結合中の二次構造体の形成を最小限とする
ために、反応を0.1 M KOH 中で実施し、37℃で6時間インキュベートする。
【０２２２】 一般的にフォーマット3 SBHでは、シグナルが莫大な数の地点のそれぞれにつ き評価される。全てのアレイ、例えば4000の5x5 mmを一度にハイブリダイズさせ
る必要はなく、より少ない数のアレイの使用も可能である。
【０２２３】 サイクリングハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーションシグナルを増
強させうる１つの方法である。１サイクルにおいて、固定プローブの大部分が標
識プローブに非相補的なテイル配列をもつDNA断片とハイブリダイズするだろう 。温度を上げることにより、これらのハイブリッドが融解される。次のサイクル
では、それらの一部(約0.1%)が適切なDNA断片とハイブリダイズし、追加の標識 プローブがライゲートされる。この場合には、両方のプローブセットに対して同
時にミスマッチをもつDNAハイブリッドの示差的融解が起こる。
【０２２４】 サイクルハイブリダイゼーションにおいては、サイクリングを開始する前に、
全成分を、T4の場合には37℃で、耐熱性リガーゼの場合はより高い温度で添加す
る。その後温度を15〜37℃に低下させ、チップを最大10分間インキュベートし、
次に温度を37℃またはそれ以上に数分間上昇させ、その後再度低下させる。サイ
クルを10回まで繰り返すことができる。ある変法では、サイクリングを行わずに
より高い最適温度(10〜50℃)を使用して、より長いライゲーション反応(1〜3時 間)を行うことができる。
【０２２５】 ここに記載する方法は、標準的な合成および精確なオリゴヌクレオチドのスポ
ッティングを用いて複雑なチップの製造を可能とするが、それは、必要なオリゴ
ヌクレオチドが比較的少数であるからである。例えば、全て7-merのオリゴ(1638
4のプローブ)を合成する場合には、2億5600万個の14-merのリストを測定するこ とができる。
【０２２６】 本発明方法の１つの重要な変法は、ベースアレイにつき２以上の異なって標識
されたプローブを使用することである。これは２つの目的を意図して実施される
。すなわち、多重化することで、別個にハイブリダイズされるアレイの数を減少
させること、または3x6または3x7などのさらに長いオリゴ配列のリストを測定す
ることである。この場合に、２つの標識を用いるならば、３つの連続したオリゴ
ヌクレオチドの特異性は、陽性部位が両方の標識の十分なシグナルをもたねばな
らないので、ほぼ絶対的でありうる。
【０２２７】 さらなる追加の変法は、BxNyプローブ(yは1〜4)を含むチップを使用すること である。これらのチップは異なるフレームでの配列解読を可能とする。これは適
切なセットの標識プローブを用いても達成することができ、また、FプローブとP
プローブの両方がいくつかの非特定化末端位置（すなわち、末端縮重のいくつか
のエレメント）をもつことができる。また、特定配列のプローブを固相支持体に
結合させるためのリンカーの一部として普遍的（万能）な塩基を使用してもよい
。これにより、プローブはハイブリダイゼーションに一層利用可能となり、構築
物がより安定になる。プローブが５個の塩基をもつ場合、例えば、３個の普遍的
塩基をリンカーとして使用することができる。
【０２２８】実施例16 ハイブリダイゼーションデータからの配列の決定 所定のオーバーラップする(N-1)merが２回以上繰り返される場合には、配列ア
センブリが中断されうる。そのときには、最後のヌクレオチドが異なる２つのN-
merのいずれかを配列の伸長に用いることができる。この枝分かれ地点は配列の 明確なアセンブリを制限する。
【０２２９】 標的核酸にハイブリダイズして標的核酸の完全な配列を生成する既知オリゴヌ
クレオチドの配列の再アセンブリングは、いくつかの場合には達成され得ない。
というのは、ハイブリッド形成に使用するオリゴヌクレオチドのサイズに対して
適切なサイズの断片中に標的核酸が存在しない場合は、いくらかの情報が失われ
るからである。失われる情報の量は配列決定しようとする標的の長さに比例する
。しかし、十分に短い標的を用いるならば、その配列は明確に決定されるだろう
。
【０２３０】 ある長さのDNAに沿って分布している、配列アセンブリを妨害しうる重複配列 の予想される頻度は計算することが可能である。この誘導には、配列組織化を処
理しなければならないパラメーターの定義を導入する必要がある。すなわち、配
列サブフラグメント(SF)である。配列サブフラグメントは、標的核酸の配列の任
意の一部が標的配列内で２回以上反復されている(N-1)merから出発してそれで終
わるときに結果として生じる。かくして、サブフラグメントは本発明方法による
配列アセンブリの過程で２つの枝分かれ点の間に生じる配列である。全てのサブ
フラグメントを合計した長さは、オーバーラップする短い末端のため、実際の標
的核酸よりも長い。一般には、サブフラグメントは追加の情報がないと直鎖型に
アセンブリされ得ない。なぜならば、それらは末端部および開始部で(N-1)merを
共有するからである。反復(N-1)merの数に応じて各核酸標的について異なる数の
サブフラグメントが得られる。その数はN-1の値と標的の長さに依存する。
【０２３１】 確率の計算は２つのファクターの相互関係を推定することができる。陽性のN-
merの順序付けが長さN-1のまたはAoの平均距離のオーバーラップ配列を使用する
ことで達成される場合、N-1個のLf塩基長の断片は次の方程式により示される。 Nsf = 1 + Ao X K X P(K, Lf) ここで、Kは2より大きいか2に等しく、P(K, Lf)はLf塩基長の断片上にK回存在
するN-merの確率を表す。また、所定の配列についてN-merの含量からサブ断片を
形成することができるコンピュータプログラムは以下の実施例18において説明す
る。
【０２３２】 サブ断片の数は所定の長さのプローブの場合に断片の長さの増加とともに増加
する。得られた断片はそれら自体の中でユニークに順序付けられ得ない。完全で
はないものの、この情報は比較配列分析および機能的配列特徴の認識にとって非
常に有用である。このタイプの情報は部分配列と呼ばれる。部分配列を得るため
の別の方法は、所定の長さのオリゴヌクレオチドプローブのサブセットのみを使
用することである。
【０２３３】 理論により推定された配列とランダムDNA配列のコンピュータシュミレーショ ンとの間には比較的良好な一致が見られる。例えば、N-1=7 [8-merまたは5'(A,T
,C,G) B8 (A,T,C,G)3'のタイプの16の10-merの群を使用] の場合、200塩基の標 的核酸は平均３つのサブ断片をもつだろう。しかし、平均付近のばらつきのため
、標的核酸のライブラリーは、2000の標的のうち１未満が３より多いサブ断片を
もつように500 bpのインサートをもつべきである。かくして、ランダム配列の長
い核酸の配列決定の理想的なケースでは、標的核酸の十分に短いインサートを含
む代表的ライブラリーが使用される。このようなインサートの場合は、本発明の
方法により個々の標的を再構築することが可能である。その後、特定された個々
のインサート配列を重ね合わせることにより大きな核酸の全配列が得られる。
【０２３４】 非常に短い断片（例えば、8-merプローブについては50塩基）の必要性を減ず るためには、クローニングのようなランダムDNA断片化方法またはランダムPCRに
おいて存在するオーバーラップ断片中に含まれる情報が使用される。また、短い
物理的核酸断片のプールを使用することも可能である。１メガベースの配列決定
のために8-merまたは11-mer、例えば5'(A,T,C,G) N8 (A,T,C,G)3'を使用すると 、20,000の50 bp断片を必要とする代わりに、たった2,100のサンプルで十分であ
る。この数は700個の7 kbクローン（基本ライブラリー）、500 bpの20個のクロ ーンの1250のプール（サブ断片順序付けライブラリー）およびジャンピング（ま
たは類似の）ライブラリーからの150個のクローンから成る。開発されたアルゴ リズム（実施例18参照）により、これらの記載されたサンプルのハイブリダイゼ
ーションデータを用いて配列が再構成される。
【０２３５】実施例17 アルゴリズム この実施例は、開始核酸配列の最小数のランダムに決めた個々の断片において
構成成分であるｋ-タプルのワードから４文字のアルファベットで書かれる長い 配列を生じさせるアルゴリズムについて記載する（ここで、kはオリゴヌクレオ チドプローブの長さである）。このアルゴリズムは主としてハイブリダイゼーシ
ョン(SBH)プロセスによる配列決定での使用を意図したものである。このアルゴ リズムはサブ断片(SF)、情報提供断片(IF)および情報提供断片を定義するのに物
理的核酸配列のプールを使用できることに基づいている。
【０２３６】 記載のように、サブ断片は標的核酸k-1オリゴマー配列の反復によるものであ るアセンブリプロセスにおいて分岐点によって引き起こされうる。サブ断片は配
列中に生じる長さK-1の任意の2つの反復ワードの間に見られる配列断片である。
K-1ワードの多重発生は、配列形成プロセスにおけるK-ワードのオーバーラップ の整列の中断の原因である。中断により配列はサブ断片の形態のままとなる。こ
のように、その順序が独自に決定される分岐点間の明白なセグメントは配列サブ
断片と呼ばれる。
【０２３７】 情報提供断片はオーバーラップした物理的配列断片の最も近い末端によって決
定される配列の断片として定義される。
【０２３８】 ある数の物理的断片は、情報提供断片を定義できる可能性を失わずにプールさ
れうる。ランダムにプールされた断片の全長は配列決定プロセスで使用されるｋ
-タプルの長さに依存する。
【０２３９】 このアルゴリズムは2つのメインユニットからなる。第1の部分は、配列中に含
まれるｋ-タプルのセットからサブ断片を生じさせるのに使用される。サブ断片 はあるサイズの物理的核酸配列のコード領域内、または長い核酸配列内で定義さ
れる情報提供断片内で形成され得る。両種の断片は基本ライブラリーに属するも
のである。このアルゴリズムでは、この基本ライブラリーの情報提供断片のｋ- タプルの内容の決定、すなわち配列形成プロセスで使用される情報提供断片の製
造段階については記載しない。
【０２４０】 このアルゴリズムの第2の部分は基本ライブラリーの核酸断片の完全配列を再 形成する目的で得られたサブ断片の直線上の順序を決定する。この目的のため、
ランダムにプールされた開始配列の断片からなる第2の整列ライブラリーが使用 される。このアルゴリズムは、全メガベースプラス配列を再形成するための塩基
断片の配列を組み合わせるステップを含まない。これは情報提供断片形成の必要
条件である基本ライブラリーの断片の連結を用いて達成してもよい。あるいは、
通常の末端配列の存在に基づき、それらのオーバーラップに関する検索を使用し
、このアルゴリズムにより基本ライブラリーの断片の配列を形成した後これを達
成してもよい。
【０２４１】 このアルゴリズムは基本および整列ライブラリーの核酸配列における所定のｋ
-タプルの出現数を知る必要もないし、ｋ-タプルのワードの情報が断片の末端に
存在するという情報も必要としない。アルゴリズムは、種々の長さのｋ-タプル のワードの混合内容物を用いて実行される。このアルゴリズムのコンセプトによ
り、偽陽性および偽陰性のｋ-タプルを含むｋ-タプルセットを用いた演算が可能
となる。特殊な場合にのみ偽ｋ-タプルの内容は主として生じた配列の完全性お よび正確性に影響を及ぼす。このアルゴリズムはシミュレーション実験における
パラメーターの最適化、ならびに実際のSBH実験における配列形成、例えばゲノ ムＤＮＡ配列の形成にも使用してよい。パラメーターの最適化において、実際の
便宜な断片のためのオリゴヌクレオチドプローブ（ｋ-タプル）の選択、ならび に／または定義されたプローブのための最適な長さおよび断片数の選択は特に重
要である。
【０２４２】 このアルゴリズムの部分は、ｋ-タプルの内容から配列を形成するプロセスに 中心的な役割を持つ。これは、最大のオーバーラップによるｋ-タプルの固有の 整列に基づくものである。配列の形成における主な障害は、特異的な反復配列と
偽陽性および／または偽陰性のｋ-タプルである。このアルゴリズムの部分の目 的は、正しい配列を持つ最小の数のできるだけ最長のサブ断片を得ることである
。このアルゴリズムの部分は１つの基本ステップといくつかの制御ステップから
なる。ある情報はすべての一次サブ断片の形成後にのみ使用できるので、二段階
のプロセスが必要である。
【０２４３】 配列形成の主な問題は、定義によっては個々のｋ-タプルの発生数に関する情 報を持たないワード内容から反復配列を得ることである。アルゴリズム全体のコ
ンセプトはこの問題を解決するという基本によっている。原則として2つの相対 するアプローチがあり、それは1)反復配列がpSFの形成プロセスの最初に得られ るか、または2)反復配列がその後のサブ断片の最終整列プロセスで得られるかで
ある。第１の場合、pSFは過剰な配列を含み、第2の場合では、それらは配列の配
列の欠損を含む。第1のアプローチは形成された過剰な配列の削除が必要であり 、第２の場合では、配列の最終アセンブリのプロセスでいくつかのサブ断片の多
重的な使用を許容する必要がある。
【０２４４】 Ｋ-タプルの固有のオーバーラップの法則の厳格さの程度におけるこの２つの アプローチの違い。あまり厳格でない法則は、ｋ-タプルXは、ｋ-タプルXの最も
右側のk-1末端がｋ-タプルYの最も左側の末端にしか存在しない場合に、またそ の場合だけに、明確にｋ-タプルYと最大限にオーバーラップするということであ
る。この法則によって、反復配列の形成および余剰配列の形成が可能となる。
【０２４５】 第2のアプローチで使用されるより厳格な法則はさらなる警告を持ち、ｋ-タプ
ルXは、ｋ-タプルXの最も右側のk-1末端がｋ-タプルYの最も左側の末端にだけ存
在する場合、またその場合だけに、かつ、ｋ-タプルYの最も左側のk-1末端が他 のいすれかのｋ-タプルの最も右側には存在しない場合に明確に最大限にｋ-タプ
ルオーバーラップする。より厳格な法則に基づくアルゴリズムはより単純で、こ
れが本明細書に記載される。
【０２４６】 所定のサブ断片の伸長プロセスは、含まれる最後のｋ-タプルの右側のk-1末端
がいずれかのｋ-タプルの左側に存在しないか、または2個の以上のｋ-タプルに 存在する場合に停止する。もしそれがあるｋ-タプルに存在すれば、この法則の2
番目の部分が試験される。さらにこれまでに含まれたものとは異なるｋ-タプル があれば、所定のサブ断片の構築物は最初の最も左側の位置でしか終結しない。
もしこの付加的なｋ-タプルが存在しなければ、この条件は固有のk-1オーバーラ
ップに適合し、所定のサブ断片は右側で１つの構成要素だけ伸長する。
【０２４７】 この基本法則の他、種々の長さのｋ-タプルの使用を可能にするため、補足的 なものが使用される。最大のオーバーラップは、オーバーラップ対のより短いｋ
-タプルのk-1の長さでなる。PSFの形成は、ｋ-タプルが核酸配列におけるそれら
の順序からランダムかつ独立して表示されるファイルから得られる最初のｋ-タ プルから始まって遂行される。従って、ファイルのｋ-タプルは、配列の開始に も、特定のサブ断片の開始にも必ずしも必要ではない。サブ断片形成のプロセス
は、記載の法則によって定義された固有のオーバーラップによりｋ-タプルを整 列することによって行われる。使用された各々のｋ-タプルはそのファイルから 消去される。含まれる最後のものと明確にオーバーラップするｋ-タプルがそれ 以上ないという時点で、サブ断片の構築が終わり、別のpSFの構築が始まる。大 多数のサブ断片の形成はそれらの実際の開始から始まるわけではないので、形成
されたpSFはｋ-タプルのファイルに加えられ、より長いｋ-タプルと考えられる 。もう１つの可能性としては、開始時のｋ-タプルから両方向に進行するサブ断 片を形成することである。このプロセスは、さらなるオーバーラップ、すなわち
サブ断片のいずれもの伸長が可能でない場合に終了する。
【０２４８】 pSFは次の3つのグループに分けられる、1)正しいｋ-タプルセットの場合の最 長かつ正しい配列のサブ断片；2)不完全なセットおよび／または偽陽性のｋ-タ プルをいくつか有するセットに対する最大かつ明確なオーバーラップ法則の使用
によって形成された短いサブ断片；および3)不正確な配列のpSF。2)のセットの 不完全性はハイブリダイゼーション実験の偽陰性の結果、ならびに不正確なｋ- タプルのセットの使用によって生じる。これらは偽陽性および偽陰性のｋ-タプ ルによって形成され、a)誤って連結したサブ断片；b)誤った末端を有するサブ断
片；およびc)最小限の誤ったサブ断片として現れる偽陽性のｋ-タプルである可 能性がある。
【０２４９】 偽陽性のｋ-タプルを考慮すると、誤った塩基を1より多く含むか、または中央
部のどこかに１つの誤った塩基を含むｋ-タプルが存在する可能性、ならびに末 端に誤った塩基を有するｋ-タプルである可能性がある。短いか、誤りを有する か、または誤って連結したサブ断片は後者のｋ-タプルによって生じるものであ る。前者２種のｋ-タプルは、ｋ-タプルの長さに等しい長さを有する誤ったpSF を表す。
【０２５０】 ある偽陰性のｋ-タプルの場合では、最大のオーバーラップが不可能なためにp
SFが生じる。最も左側または最も右側の末端に誤った塩基を有する、１つの偽陽
性のｋ-タプルが存在する場合には、明確なオーバーラップが不可能なためpSFが
生じる。共通のk-1配列を有する偽陽性および偽陰性双方のk-タプルがファイル に存在する場合はpSFが生じ、これらのpSFの１つは関連した末端に偽ｋ-タプル を含む。
【０２５１】 配列に誤りを持つサブ断片を修正して明確に連結したpSFを連結するプロセス は、サブ断片の形成後およびサブ断片の整列プロセス中に行われる。誤って連結
したpSFを切除し、pSFの明確な連結により最終的なサブ断片を得ることからなる
第1のステップを下記に記載する。
【０２５２】 誤って結合されたサブ断片の形成のためには２つのアプローチがある。第１に
は、長さk-1の反復配列の構築点に偽ｋ-タプルが見られる場合に誤りが生じる。
第２には、反復配列はk-1より短い。これらの状況は各々２つの変異型に生じ得 る。第１の変異型では、反復配列の１つは断片の末端を表す。第２の変異型では
、反復配列は断片内のいずれの位置でも生じる。第１の可能性に関しては、誤っ
た結合を形成するには、ファイルにｋ-タプルが存在しないことが（偽陰性）要 求される。第２の可能性では、ファイルに偽陰性および偽陽性双方のｋ-タプル が存在する必要がある。K-1配列の反復を考慮すると、どちらかの末端が内部に 反復を持つ場合には１つのｋ-タプルを欠くだけで十分である。厳密には内部の 反復には２つ欠如することが必要である。この理由は、配列の末端が、情報科学
的には、偽陰性のｋ-タプルのエンドレスの直鎖状アレイとみなされるからであ る。「k-1の場合よりも小さい」ということから、2つまたは3つの特異的な偽ｋ-
タプルを要する、k-2の長さの反復配列だけが考慮されよう。これらは実際の実 験で検出される唯一のケースであって、その他のものはそれほど頻繁ではない可
能性が高い。
【０２５３】 誤って結合されたサブ断片の認識は、その断片の末端に反復配列が見られない
場合により厳密に定義される。この状況においては、さらに2つのサブ断片を検 出でき、そのうち1つは最も左側の末端に、もう一方は最も右側の末端にk-2配列
を含み、これは誤って結合されたサブ断片にも存在する。反復配列が断片の末端
にある場合、その最も左側または最も右側の端部でのサブ断片の形成に誤りが生
じるk-2配列を含む唯一のサブ断片が存在する。
【０２５４】 切除による誤って結合されたサブ断片の除去は一般的な法則に従って行われる
。すなわち、いずれかのサブ断片のk-2の長さの最も左側または最も右側の配列 が他のいずれかのサブ断片に存在すれば、そのサブ断片は切断されて、その各々
がk-2配列を含む2つのサブ断片となる。この法則は、反復k-1配列の点で1つより
多い偽陰性のｋ-タプルが存在するという、反復末端のまれな状況を包含しない 。この種の誤って結合されたサブ断片は、オーバーラップした断片、または基本
ライブラーおよび整列ライブラリーの双方の情報提供断片からの情報情報を用い
て認識できる。さらに、誤って結合されたサブ断片は、同一のk-1配列を含む両 方の位置で2以上の偽陰性のｋ-タプルが生じたときには、そのままである。それ
は特異的な偽ｋ-タプルを少なくとも4つ要するので、これは極めてまれな状況で
ある。もし、あるサブ断片の余端および他の断片の開始部分から得たk-2より短 い配列の組合せにより所定の配列が得られるならば、長さkの配列上でこれらの サブ断片を切除するためにさらなる法則を導入することができる。
【０２５５】 記載の法則の厳密な適用により、出力の精度を保証するには幾分完全性が失わ
れる。いくつかのサブ断片は、誤って結合されたサブ断片のパターンに適合する
ので、連結に誤りがないのに切除される。この種のものにはいくつかの状況があ
る。例えば、断片が少なくとの2つの同一のk-1配列の他にk-1由来のk-2配列のい
ずれかを含み、あるいは断片は少なくとも2回反復するk-2配列と、中央部に所定
のk-2配列を含む少なくとも1つの偽陰性ｋ-タプルとを含む、等。
【０２５６】 このアルゴリズム部分の目的は、pSFの数を減らして、正しい配列を有するよ り長いサブ断片を最小数にすることである。特異なより長いサブ断片または完全
な配列の形成は2つの状況下で可能となる。第1の状況は反復するk-1ワードの特 定順序に関するものである。最大限に伸長したpSF（第1のグループのpSF）のい くつかまたはすべてが固有の順序を持つ場合がある。例えば、断片S-R1-a-R2-b-
R1-c-R2-E（ここで、SよびEは断片の開始点および終結点であり、a、bおよびcは
個々のサブ断片に特異的な異なる配列であり、R1およびR2はタンデムに反復する
2つのk-1配列である）では、5つのサブ断片が形成される(S-R1、R1-a-R2、R2-B-
R1、R1-c-R2、およびR-E)。これらは、前記のオリジナル配列またはS-R1-c-R-b-
R1-a-R-Eの2通りで整列され得る。これに対し、順序は異なるが同じ数およびタ イプの反復配列を有する断片、すなわちS-R1-a-R1-b-R-c-R-Eでは、すべてサブ 断片を含むそれ以外の配列はない。このタイプの例はpSFの形成プロセスの後に しか認識できない。それらはpSF形成プロセスの2つのステップの必要性を表すも
のである。ファイルが偽陰性および／または偽陽性のｋ-タプルを含む場合、非 反復k-1配列の位置での誤った短いサブ断片の形成の第2の状況はより重要である
。
【０２５７】 PSFの両グループについては状況は2つの部分からなっている。まず、最小のサ
ブ断片の不在として現れる偽陽性のｋ-タプルが除去される。最大数の連結の形 成を可能にするには、いずれかの末端にオーバーラップを持たない長さkの、一 方の末端でk-aより長く、かつ他方のでk-bより長い長さのｋ-タプルのサブ断片 のすべては除去される。発明者らの実験では、aとbがそれぞれ2と3の値であれば
、十分な数の偽陽性のｋ-タプルが十分除去されると考えられた。
【０２５８】 固有に連結され得るサブ断片の組込み(merging)は第2のステップで達成される
。連結法則は、2つのサブ断片の適した終結点または開始点にあるオーバーラッ プ配列が他のいずれかのサブ断片の開始点および／または終結点に存在しなけれ
ば、またその場合にのみ2つのサブ断片が明確に連結するというものである。
【０２５９】 考慮される対に由来する１つのサブ断片が同一の開始点および終結点を有して
いる場合は除外される。この場合、同一の終結点を有する別のサブ断片がファイ
ルに存在していたとしても連結は可能である。ここでの主な問題は、オーバーラ
ップ配列の正確な定義である。もし、1対のサブ断片だけに特異的であるオーバ ーラップ配列がk-2より短いか、同じか、または長いが、k-4より長いいずれかの
長さのオーバーラップ配列とともにさらなるサブ断片が存在していれば連結は許
容されない。また、pSFの正しい両末端および1つの（または数個の）最後の塩基
を除いた後の末端も、オーバーラップ配列とみなされる。
【０２６０】 このステップの後、いくつかの偽陽性のｋ-タプル（最小のサブ断片として） および誤った末端を有するいくつかのサブ断片が残る。さらに、ある数の幾分か
特異的な偽ｋ-タプルが同時に存在するという極めてまれな場合では、誤った連 結が起こり得る。これらのケースはサブ断片整列プロセスで、また切除されなか
った「誤って結合された」サブ断片の取扱いを伴うさらなる制御ステップで検出
および解明される。
【０２６１】 得られた短いサブ断片には2種類がある。通常の場合、これらのサブ断片は、 反復するk-1配列が分布しているのでそれら自身の間で明確に連結され得る。 これはpSFの形成プロセス後に行われてもよく、pSFの形成プロセスに2つのステ ップが必要であることのよい例である。偽陽性および／または偽陰性のｋ-タプ ルを含むファイルを用いる場合、非反復k-1配列の部位に短いpSFが得られる。偽
陽性のｋ-タプルを考慮すると、ｋ-タプルは誤った塩基を1個より多く含み（あ るいは中央部のどかかに1個の誤った塩基を含む）、さらにその末端にｋ-タプル
を含みうる。短い、誤った（または誤って結合された）サブ断片の形成は、後者
のｋ-タプルによって引き起こされる。前者の種のｋ-タプルは、ｋ-タプルの長 さに等しい長さを有する誤ったpSFを表す。
【０２６２】 アルゴリズムのpSF部分を組み込む目的は、pSFの数を、正確な配列を有する長
いサブ断片の最小限の数まで減少させることである。最大限に連結できるよう、
一方の末端のk-aより長く、かつ他方のk-bより長い、いずれの末端上でもオーバ
ーラップしないｋ-タプルのサブ断片をすべて排除する。このように、偽陽性の ｋ-タプルの大部分は棄却される。連結の法則は、2個のサブ断片が明確に連結さ
れ得るか、さらに2個のサブ断片の関連する終結または開始点のオーバーラップ 配列がいずれの他のサブ断片の開始および／または終結部分に存在しないかどう
かだけである。例外は同一の開始および終結点を有するサブ断片である。その場
合、ファイルに存在する同じ末端を有するもう1個のサブ断片があるという条件 で連結がなされる。ここでの主要な問題は、オーバーラップ配列の正確な定義で
ある。偽陽性のおよび偽陰性のｋ-タプルの連結とともに、k-1またはk-2配列の 反復点の少なくとも2種の特異な偽陰性のｋ-タプルの存在が消失し、またいくつ
かのオーバーラップ配列が「マスク」され、pSFの誤りのない明確な連結が生じ 得る。これを防ぐために、k-2より短い末端配列上で、さらにk-4より長い特別な
オーバーラップ配列の存在下ではその連結はなされない。オーバーラップ配列は
pSFの末端から明らかにされており、すなわち１個、またはごく少数の最終の塩 基が除去されている。
【０２６３】 極めてまれな状況では、一定数のある種の偽陽性のおよび偽陰性のｋ-タプル の存在により、誤りのある末端を有するあるサブ断片が残存し、ある偽陽性のｋ
-タプル（最小限のサブ断片として）が残存し得る、すなわち誤った連結が起こ り得る。これらの問題はサブ断片整列プロセスで、および未切断の、誤って連結
したサブ断片の管理とともにある、さらなる制御ステップで認められ、解決され
る。
【０２６４】 サブ断片整列プロセスは、それらの形成プロセスに類似している。サブ断片を
長いｋ-タプルと考えるならば、末端のオーバーラップによるそれらの明確な連 結により整列がなされる。明確な連結のための情報提供基盤は、基本ライブラリ
ーの断片で発生するサブ断片の、それらの断片のセグメントに相当するグループ
への分割である。その方法は、関連連結配列を有する長いオリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションに基づくこの問題の生化学的解決法に類似している。
その連結配列は基本ライブラリー断片の、適当なｋ-タプルセットのセグメント を用いてサブ断片として形成される。関連するセグメントは基本ライブラリーの
各断片とオーバーラップする整列ライブラリーの断片により明確にされる。最も
短いセグメントが整列ライブラリーの情報提供断片である。最も長いものは、隣
接するいくつかの情報提供断片または整列および基本ライブラリーに対応する断
片の全オーバーラップ部分である。分離されるサンプル数を減らすために、整列
ライブラリーの断片をランダムにプールし、さらに特異なｋ-タプル内容を決定 する。
【０２６５】 整列ライブラリーの多数の断片を用いることにより、非常に短いセグメントが
形成され、よってサブ断片の形成の原因であるk-1配列の多くの出現の機会が減 少する。さらに、最も長いセグメントは基本ライブラリーの所定の断片の様々な
領域からなり、反復するk-1配列を全く含んでいない。あらゆるセグメントで、 連結配列（連結サブ断片）が所定の断片の一定のサブ断片対に形成される。整列
プロセスは3つのステップ：(1)各セグメントに含まれるｋ-タプルの形成；(2)各
セグメントのサブ断片の形成；および(3)セグメントのサブ断片との連結からな る。第1のセグメントは、基本ライブラリーの所定の断片のｋ-タプル内容と整列
ライブラリープールのｋ-タプル内容との重要な共通部分および相違部分と定義 される。第2の（短い）セグメントは第1のセグメントのｋ-タプル内容の共通部 分と相違部分と定義される。
【０２６６】 共通部分および相違部分両方に、偽陽性のおよび偽陰性のｋ-タプル両方を集 積する問題がある。偽陽性のｋ-タプルが関連オーバーラップ領域でない両方の 配列にランダムに発生するとともに、開始配列の偽陰性のｋ-タプルは共通部分 （オーバーラップ部分）に集積する。他方、開始配列のいずれかの大部分の偽陽
性のｋ-タプルは共通部分に取り上げられない。このことはそれらとオーバーラ ップする断片からの情報を用いて個々の断片からの実験誤差を小さくする例であ
る。偽ｋ-タプルは別の理由で相違部分に集積する。オリジナル配列の偽陰性の もののセットは、共通部分の偽陽性のものに、および誤って共通部分に含まれな
い、すなわち共通部分には偽陰性であるそれらのｋ-タプルに対して偽陽性のも ののセットに拡張される。開始配列が10%偽陰性のデータを含んでいるならば、 第1および第2の共通部分はそれぞれ19%および28%の偽陰性のｋ-タプルを含んで いるだろう。他方、基本断片およびプールがそれぞれ500bpおよび10,000bpの長 さを有するならば、期待値77の偽陽性のものが推測されよう。しかしながら、「
失った」ｋ-タプルの大部分を再生する可能性および偽陽性のｋ-タプルの大部分
を排除する可能性がある。
【０２６７】 まず、所定の対のｋ-タプル内容の共通部分として所定のセグメントのｋ-タプ
ル基本内容を決定する必要がある。これに次いで、一方の末端にk-1を、他方の 末端に基本セットの2種のｋ-タプルの末端に生ずるk-+配列を含んでいる共通部 分の開始ｋ-タプル内容の全ｋ-タプルを含んでいることを調べる。よってそのプ
ロセスで偽陽性のものの集積を妨げる相違部分が発生する前にこれがなされる。
その後、同一タイプのｋ-タプル拡張セットを、借りてきたものが共通部分のか らのものであるという相違を有する相違部分に当てはめる。借りてこられる全ｋ
-タプルは偽陽性のものとして共通部分ファイルから排除される。
【０２６８】 共通部分、すなわち共通なｋ-タプルのセットがそれぞれの対（基本断片）X（
整列ライブラリーのプール）に対して定義される。そのセットのｋ-タプル数が 有意であるならば、記載の法則に従い、偽陰性のものにより増大される。第1の 相違部分セットは、所定の基本断片セットから得られた共通セットを減ずること
で得られる。偽陰性のｋ-タプルは、記載の法則に従って共通セットから借りて きて、相違セットにあてはめ、同時に偽陽性のｋ-タプルとして共通セットから 取り除かれる。基本断片がプールされる断片より長い場合、この相違部分はさら
なるステップにおける有用性を幾分減ずる２つの異なるセグメントを意味するで
あろう。第1のセグメントはかなりの数のｋ-タプルを含む対（基本断片）X（整 列ライブラリーのプール）の共通部分および相違部分を生ずるすべてである。第
2のセグメントのｋ-タプルセットは、第1のセグメントのすべての起こりうる対 のｋ-タプルセットの比較により得られる。2つの相違部分はかなりの数のｋ-タ プルとの共通部分を生ずるそれぞれの対から定義される。オーバーラップされる
断片から入手できる情報の大部分が、共通部分および相違部分を形成する第3の ラウンドより得られるものがほとんどないようにこのステップで回収される。
【０２６９】 (2)セグメントのサブ断片の形成は基本ライブラリーの断片に関する記載と同 様に行われる。
【０２７０】 (3)サブ断片との連結法は、いくつかのオーバーラップされる末端を有する所 定の基本ライブラリー断片のサブ断片のうち、正確に連結するサブ断片対を連続
的に決定することをからなる。関連する4個の断片（そのうち2個が同一の開始部
分を含み、2個が同一終結部分を有する）の場合では、異なる4対の連結され得る
サブ断片がある。一般に、2個は正確であり、２個は誤りである。正確なものを 見つけるために、各対の連結配列の存在が、所定の基本断片のすべての第1およ び第2のセグメントから生ずるサブ断片で試験される。連結配列の長さおよび位 置は、偶然に起こる配列による妨害を避けるよう選択される。それらはk+2であ るか、またはより長く、さらに所定の対の両サブ断片のオーバーラップ配列のそ
ばに少なくとも1つのエレメント2を含んでいる。2つの連結配列が見い出され、 残りの2つが存在しない場合にのみ、連結がなされる。その2個の連結したサブ断
片はファイル中の先のサブ断片を戻し、さらにプロセスを周期的に繰り返す。
【０２７１】 反復配列はこのステップで形成される。これはいくつかのサブ断片が１度なら
ず連結されるサブ断片に含まれることを意味している。それらは2個の異なるサ ブ断片に関して1個のサブ断片と連結する関連連結配列を見い出すことで認識さ れよう。
【０２７２】 pSFを構築するプロセスおよびpSFを組み込むプロセスで生ずる誤って結合され
た認識は所定の基本ライブラリーのサブ断片の配列がその断片のセグメントで形
成されるサブ断片の配列に存在するかどうかの試験に基づいている。誤って連結
された位置の配列は誤って結合されたサブ断片を示すことではわからないであろ
う。
【０２７３】 より完全な配列を誤りなく形成するためには、サブ断片を整列する記載の3ス テップに加えて、さらなるいくつかの対照ステップまたは特定の配列に適用でき
るステップが必要であろう。
【０２７４】 セグメントおよびサブ断片中のｋ-タプル内容の比較により、どのサブ断片が どのセグメントに属しているのかの決定がなされる。ｋ-タプル内容中の誤差（ プール中の第1の誤差および頻繁なｋ-タプルの発生による統計的誤差による）の
ため、サブ断片の正確な分割が不可能である。よって、「全か無か」の分割の代
わりに、各サブ断片ついての所定のセグメントから生ずる機会が決定される。こ
の可能性はｋ-タプルの長さ、サブ断片の長さ、整列ライブラリーの断片の長さ 、プールのサイズ、およびファイル中の偽ｋ-タプルのパーセンテージの関数で ある： P(sf,s)=(Ck-F)/Lsf, （式中、Lsfはサブ断片の長さであり、Ckは所定のサブ断片／セグメント対の共 通ｋ-タプル数であり、Fはｋ-タプルの長さ、基本ライブラリーの断片、プール のサイズ、および誤差%間の関係を含むパラメーターである）。
【０２７５】 特定のセグメントのサブ断片は冗長な短いpSFとして処理され、明確な連結の プロセスを受ける。オーバーラップ末端をため、明確な連結の決定はこの場合、
わずかに異なる。なお、明確な連結の精度は他のセグメントのこれらのサブ断片
連結に従い制御される。異なるセグメントの連結後、得られたすべてのサブ断片
は一緒に組み込まれ、長いサブ断片に含まれる短いものは排除され、さらに残る
ものは通常の連結プロセスを受ける。明確な連結の後、その配列が完全に再生さ
れない場合、特定のセグメントに属する確率についての同一のまたは厳密さを欠
いた基準でサブ断片の分割および連結プロセスが繰り返される。
【０２７６】 明確なオーバーラップを定義するための厳密な基準を用いる場合、いくつかの
情報は用いられない。完全な配列の代わりに、所定の断片に対する多くの可能性
を定義するいくつかのサブ断片が得られる。厳密さを欠いた基準を用いる場合、
正確かつ完全な配列がもたらされる。一定の状況、例えば誤った連結では、完全
ではあるが不的確な配列を、またはそれらの間に連結のない「巨大な」サブ断片
をもたらし得る。従って、基本ライブラリーの各断片は、a)正確であるという点
で可能性あるいくつかの解式およびb)最も有望な正確な解式が得られる。また非
常に稀な場合、サブ断片形成プロセス中の誤りにより、または属する見込みにつ
いての一定比率により明確な解式が生まれ、または1つ、すなわち最も有望な解 式が生ずる。これらの場合は不完全配列としてあり、または明確な解式は基本ラ
イブラリーの他のオーバーラップされた断片をこれらのデータをものと比較する
ことで得られる。
【０２７７】 記載されたアルゴリズムを、ランダムに形成された、ヒトゲノムのＧＣ内容を
シミュレートした40%GCを含む50kb配列に対して試験した。この配列の中間部分 には、約4kbの全長を有する様々なすべての、およびいくつか他の反復配列が挿 入された。in vitro SBH試験をシミュレートするために、次の操作を行い適当な
データを用意した。
【０２７８】 -60個の5kbオーバーラップ「クローン」の位置をランダムに定義して、基本ライ
ブラリーの調製をシミュレーションした： -1000個の500bp「クローン」の位置をランダムに定義して、整列ライブラリーの
作製をシミュレーションした。これらの断片はその配列から得た。20の断片のラ
ンダムプールを作製し：プールのｋ-タプルセットを決定して、ハードディスク に入れた。これらのデータはサブ断片整列段階で使用した：同一密度のクローン
の代わりに、基本ライブラリーの400万クローンおよび整列ライブラリーの300万
クローンをヒト全ゲノムに使用する。全数700万のクローンは、ほとんどすべて のゲノムDNAのランダムクローニングおよびゲルに基づく方法による配列決定用 の数kbの長さのクローン数より数倍低い。
【０２７９】 5kb断片の開始部分および終結部分のデーターから、117個の「情報提供断片」
がその配列にあることが決定された。この後、シグナル「情報提供断片」を構成
するオーバーラップｋ-タプルのセットが決定された。予め決定されたリストに あるｋ-タプルのサブセットのみ使用した。そのリストには８-mer65%、9-mer30%
および10ないし12-mer5%が含まれていた。これらのデータに基づいて、サブ断片
の形成および整列プロセスを行った。
【０２８０】 アルゴリズムの試験はシミュレートした2つの試験のデータに基づいて行った 。100%正確なデータセット(20,000bpを超える)、および10%偽ｋ-タプル（5%陽性
および5%陰性のもの）を含む26個の情報提供断片(約10,000bp)を含む50個の情報
提供断片の配列を再生した。
【０２８１】 第1の試験では、すべてのサブ断片が正確であり、50個の情報提供断片のうち1
個だけ配列が完全には再生されず、5個のサブ断片のまま残った。整列ライブラ リーのオーバーラップ断片の位置の分析により、それらが5個のサブ断片の特異 な整列の情報を欠いていることが示された。サブ断片はオーバーラップ末端に基
づく2通り、1-2-3-4-5および1-4-3-2-5に連結され得る。唯一の相違点は、サブ 断片2および4の位置が取り換えられることである。サブ断片2、3、および4は比 較的短い（すべて約100bp）ため、この場合、すなわちサブ断片3領域で開始、ま
たは終結される整列ライブラリーの断片がない場合に比較的多くの機会が存在し
、起こった。
【０２８２】 実際の配列決定をシミュレートするために、多くの試験ではいくつかの誤った
（「ハイブリダイゼーション」）データがインプットとして含められた。オリゴ
マーハイブリダイゼーション試験では、目的の条件下で、信頼できないデータを
生み出す唯一の事態が誤対合対完全適合ハイブリダイゼーションである。それゆ
え、シミュレーションで、いずれかの末端の1つのエレメントが実際のものと異 なっているそれらのｋ-タプルだけが偽陽性のものと考えられた。これらの「誤 った」セットは次のように作製される。情報提供断片のｋ-タプルの原セットに 対し、5%偽陽性のｋ-タプルのサブセットを添加する。偽陽性のｋ-タプルはその
セットからｋ-タプルをランダムに選択し、それをコピーして、さらにその開始 または終結部分のヌクレオチドを部分的に変えることにより作製される。この後
、ランダムに選択された5% ｋ-タプルのサブセットを除く。このように、正確な
ｋ-タプルが末端に誤った塩基を有するｋ-タプルと置き換えられるという最も複
雑な事態が統計的推測数で生ずる。
【０２８３】 記載のｋ-タプルセットの形成により、10%の誤ったデータとなる。この値はコ
ピーされ、変えられ、消去されるｋ-タプルがランダムに選択されるため、あら ゆる場合に応じて変化する。それにもかかわらず、このパーセンテージは実際の
ハイブリダイゼーション試験での信頼できないデータ量を3ないし4倍超えている
。導かれた10%の誤りが結局、基本ライブラリーの断片（基本ライブラリー情報 提供断片）およびセグメントの両方におけるサブ断片数が2倍増加することにな る。最終サブ断片の約10%は、偽陽性のものを含むｋ-タプルセットで予測される
（第1のサブ断片の形成を参照）ように、末端に誤った塩基を有する。サブ断片 が誤った連結をする事例もサブ断片が誤った配列を有する事例も見られなかった
。整列プロセスで試験された26個のうち4個の情報提供断片で完全な配列が再生 されなかった。4つの事例すべてにおいて、配列は同一配列に含まれた数個の長 いサブ断片および数個の短いサブ断片として得られた。この結果が、アルゴリズ
ム原理がパーセンテージの高い誤ったデータを動かしていることを示している。
【０２８４】 ｋ-タプル含有物からの配列形成の成功は、完全性と正確さに関して記載され る。形成プロセスでは、2つの特別な状況：1)ある情報部分が生じた配列中では 落とされているが、不明確なものがどこにあり、それらがどのタイプに属するの
かは分かっている、および2)得られた再生配列が、そこからｋ-タプル含有物を 生じる配列に適合せず、その誤りが検出できない、が明確にされ得る。アルゴリ
ズムが理論上の限界まで展開されると仮定すれば、正確なｋ-タプルを使用する ように第1のシミュレーションだけ行われ得る。その点で、不完全さにより一定 数のサブ断片が明確に整列されなくなり、さらに単配列の正確な長さ、すなわち
完全な縦列反復数の決定の問題が起こる。
【０２８５】 偽ｋ-タプルにより、不正確な配列が生じると考えられる。誤りの原因はアル ゴリズム不足にではなく、所定のｋ-タプル含有物が最初のものとは異なる配列 を明確に表しているという事実にある。ファイル中に存在する偽ｋ-タプルの種 類に基づいて、誤りは3つに定義され得る。偽陰性のｋ-タプル（偽陽性のものを
伴わない）は「欠失」を引き起こす。偽陽性のｋ-タプルは「延長（不等交差） 」を引き起こしている。偽陰性のものを伴う偽陽性のものは、単独または「欠失
」を組み合わせての「挿入」が起こる原因である。欠失は、サブ断片の2つの可 能な開始部分間のすべてのｋ-タプル（またはそれらの大部分）が偽陰性のもの である場合に引き起こされる。配列のあらゆる位置がｋ-タプルにより明確にさ れるため、一般的な場合、欠失が起こる場合にはkの連続した偽陰性のものが必 要である。（偽陰性のもの10%およびk=8で、各108エレメントの後にこの状況が 起こる）この状況は非常に稀に、10ゲノム等量を含むランダムなライブラリーを
用いる哺乳類ゲノム配列決定にさえある。
【０２８６】 偽陽性のｋ-タプルにより引き起こされる配列の延長は、その配列の末端が偽 陰性のｋ-タプルの循環直線アレイと考えられ得るため、「挿入」の特殊な例で ある。1つのｋ-タプルより長いサブ断片を生ずる偽陽性のｋ-タプルの群と考え られる。整列ライブラリーのランダムな物理的断片のようなオーバーラップ断片
でサブ断片が形成されるならば、この種の状況が検出されよう。偽陽性および偽
陰性のｋ-タプルの特殊な組合わせの結果として、挿入または欠失の代わりの挿 入が起こり得る。第1の場合では連続した偽陰性のｋ-タプル数がkより低い。両 方の場合に、数個のオーバーラップ偽陽性のｋ-タプルが必要である。数および 偽ｋ-タプルの特異性における必要条件は、非常に単純であるため、挿入および 欠失は実際のかなり大きな影響もなく、概ね理論的に可能性がある。
【０２８７】 偽陽性のおよび／または偽陰性のものの種類が最小数であるという理論的な必
要条件に合わないその他すべての状況では、ｋ-タプル含有物の誤りが生じた配 列の完全性を低下させると思われる。
【０２８８】 SBH、核酸サンプルは、サンプルを既知の配列の支持体結合プローブ、および 標識プローブまたは溶解プローブに曝して配列決定される。プローブリガーゼが
プローブおよびサンプルの混合物に導入される場合、すなわち支持体がサンプル
に沿って背中合わせにハイブリダイズされた結合プローブおよび標識プローブを
有する場合、2つのプローブはリガーゼの作用で化学的に結合されよう。洗浄後 、化学的に結合した支持体結合および標識プローブだけを標識プローブの存在に
より検出する。アレイの特定の位置の支持体結合プローブの同一性および標識プ
ローブの同一性を知ることで、サンプルの配列の一部を3つの基体サンプルを有 するフォーマットにおけるアレイのポイントの標識の存在により決定できる。偶
然でもなく仕向けたわけでもないが(not chances not working)、結合プローブ 対のすべての配列が最大限にオーバーラップし、サンプルの配列が再構築されよ
う。配列決定されないサンプルは、核酸断片または10塩基対（"bp"）のオリゴヌ
クレオチドであろう。そのサンプルは、好ましくは4ないし1000塩基の長さであ る。
【０２８９】 プローブの長さは、10塩基未満の長さの断片であり、好ましくは4ないし9間の
塩基の長さである。このように、支持体結合プローブのアレイは所定の長さのす
べてのオリゴヌクレオチドを有するか、または特定の試験用に選択されるオリゴ
ヌクレオチドだけを有するであろう。所定の長さのすべてのオリゴヌクレオチド
を使用する場合、中央のオリゴヌクレオチド数は4N（Nはプローブの長さである ）により算出されるであろう。
【０２９０】実施例18 配列決定用チップの使用に関して 配列決定法においてライゲーションが採用される場合、通常のオリゴヌクレオ
チドチップを直ちに再使用するわけにはいかない。本発明者は、この問題をいろ
いろなやり方で克服できると考える。
【０２９１】 第２のプローブであるプローブPのためにリボヌクレオチドを使用することが でき、その結果としてこのプローブをその後のRNAse処理で除去することができ る。RNAse処理では、ピリミジン残基の3'側の一本鎖RNAを特異的に攻撃して隣接
ヌクレオチドへのリン酸エステル結合を切断するエンドリボヌクレアーゼ RNAse
Aを使用する。最終産物はピリミジン3リン酸と末端ピリミジン3リン酸をもつオ
リゴヌクレオチドである。RNAse A は補因子と二価カチオンの非存在下で働く。
【０２９２】 RNAseを使用するためには、一般的に、Sambrookら(1989;参考としてここに組 み入れる）に記載されるように、適切なRNAse含有緩衝液中でチップをインキュ ベートする。8x8 mmまたは9x9 mmアレイにつき30〜50μlのRNAse含有緩衝液を37
℃で10〜60分間使用することが好ましい。その後ハイブリダイゼーション緩衝液
で洗浄する。
【０２９３】 広範には適用可能でないが、Craigら(1989;参考としてここに組み入れる）に 記載されるように、特定の実施形態においてウラシル塩基を使用することができ
る。ライゲートされたプローブ組合せ物の破壊（再使用可能なチップをもたらす
）は、E. coli 修復酵素であるウラシル-DNAグリコシラーゼ（DNAからウラシル を除去する）で消化することにより達成される。
【０２９４】 また、プローブ間に特異的に開裂可能な結合を形成させて、検出後にその結合
を切断することもできる。例えば、これは、Shabarovaら(1991)およびDolinnaya
ら(1988)(両文献とも参考としてここに組み入れる）に記載されるような化学的 ライゲーションにより達成できる。
【０２９５】 Shabarovaら(1991)は、縮合剤として臭化シアンを用いてオリゴデオキシリボ ヌクレオチドを縮合させることを記載している。彼らのワンステップ化学ライゲ
ーション反応では、オリゴヌクレオチドを97℃に加熱し、0℃まで徐々に冷却し 、その後アセトニトリル中の10 mM BrCNを1 μl添加する。
【０２９６】 Dolinnayaら(1988)は、DNA二本鎖中にホスホルアミダイトおよびピロホスフェ
ートヌクレオチド間結合を如何に組み込むかを記載している。彼らはまた、カッ
プリング剤として水溶性カルボジイミド(CDI)を用いて、DNAの糖リン酸骨格を修
飾するための化学的ライゲーション法を使用している。ホスホルアミダイト結合
の選択的切断には、15% CH3COOHと95℃で5分接触させる必要がある。ピロホスフ
ェート結合の選択的切断には、ピリジン−水混合物(9:1)および新たに蒸留した(
CF3CO)2Oとの接触が必要がある。
【０２９７】実施例１９ 既知の突然変異の診断-スコアリングまたは完全遺伝子の再配列決定 簡単な場合には、選択された既知の突然変異がDNAセグメント中で起こるか否 かを発見することが目的であってもよい。この目的には12個未満のプローブで十
分であり、例えば、一方の対立遺伝子に陽性のプローブが5個、もう一方に陽性 のものが5個、そして両方に陰性のものが2個である。サンプルごとにスコアリン
グされるプローブの数が少ないため、多数のサンプルを平行して分析することが
可能である。例えば、12個のプローブを3回のハイブリダイゼーションサイクル に用いれば、64人の患者からの96個の異なるゲノム遺伝子座または遺伝子セグメ
ントを1枚の6×9インチ膜で分析することができる。この膜には12×24のサブア レイが含まれており、各サブアレイは、64人の患者由来の同一DNAセグメントを 示す64個のドットを有する。本実施例では、64枚の96ウェルプレートでサンプル
を調製してもよい。プレート１枚につき患者１人とし、ウェル１個につき分析す
べきDNAセグメント１つとすることができる。64枚のプレートからのサンプルを 、同じ膜の４分の１ごとにスポットして4つのレプリカとしてもよい。
【０２９８】 12個のプローブのセットは、96個のセグメントの各々に対して単一チャネルピ
ペッティングまたは単一ピン移送(transferring)装置(または個別に制御される ピペットもしくはピンのアレイ)によって選択することができ、選択したプロー ブを12枚の96ウェルプレート中に配列させることができる。プローブが予備標識
されていない場合には標識してもよく、次いで4枚のプレートから得たプローブ をハイブリダイゼーション緩衝液と混合し、96チャネルピペッティング装置によ
って優先的にサブアレイに添加すればよい。ハイブリダイゼーションを1サイク ル行った後、膜を37℃〜55℃にて好ましくは未希釈のハイブリダイゼーション緩
衝液もしくは洗浄緩衝液中でインキュベートすることにより、先に適用したプロ
ーブを除去することが可能である。
【０２９９】 一方の対立遺伝子に陽性のプローブが陽性であり、もう一方の対立遺伝子に陽
性のプローブが陰性である確率を利用して、２つの対立遺伝子のいずれが存在す
るのかを判定することができる。この重複スコアリングスキームでは、各プロー
ブのハイブリダイゼーションにおいて一定レベル(約10％)のエラーが許容可能で
ある。
【０３００】 特に、より少ない重複度で十分な場合 (例えば、1または2個のプローブによっ
て2つの対立遺伝子の一方がサンプルに含まれるか否かが証明される場合)には、
プローブの不完全なセットを使用して多くの対立遺伝子のスコアリングを行うこ
ともできる。例えば、4000個の8-merのセットを用いると、無作為に選択した遺 伝子座について2つの対立遺伝子の一方に対して陽性であるプローブを少なくと も1つ見出す確率は91％である。プローブの不完全なセットを、被験サンプルの Ｇ＋Ｃ含量および他の偏り(bias)を反映するように最適化してもよい。
【０３０１】 完全遺伝子を配列決定する場合には、遺伝子を適切な数のセグメントで増幅す
ればよい。各セグメントごとに、プローブのセット(2〜4塩基当たり約1個のプロ
ーブ)を選択してハイブリダイズさせればよい。これらのプローブによって、被 験セグメントの何処に突然変異が存在するのかが確認できる。1つ以上の突然変 異部位が検出されるセグメント(即ち、これらのセグメントを含有するサブアレ イ)は追加のプローブとハイブリダイズし、突然変異部位において正確な配列を 見出すことができる。DNAサンプルを第2の6-merの各々で試験した際に、陽性に ハイブリダイズしたプローブTGCAAAおよびTATTCCによって包囲され、かつ3個の 陰性プローブCAAAAC、AAACTAおよびACTATTによって覆われる位置に突然変異が局
在化していれば、突然変異ヌクレオチドは、正常な配列のその位置に存在するA および／またはCのはずである。この変化は、単一塩基突然変異によって、また は塩基AA、ACもしくはCT間において1つもしくは2つのヌクレオチドが欠失したり
挿入されたりすることによって生じる。
【０３０２】 一つのアプローチは、陽性にハイブリダイズしたプローブTGCAAAをヌクレオチ
ド1個分右側へ伸長させたプローブと、同じく陽性にハイブリダイズしたプロー ブTATTCCをヌクレオチド1個分左側へ伸長させたプローブを選択するというもの である。これらの8個のプローブ(GCAAAA、GCAAAT、GCAAAC、GCAAAGおよびATATTC
、TTATTC、CTATTC、GTATTC)を用いて、2つの問題のヌクレオチドを判定する。
【０３０３】 突然変異に関して最も可能性の高い推測を求めることができる。例えば、AがG
に突然変異することが判る。これらの結果を満たす解釈には２つある。一つは、
AをGで置換えることを唯一の変化とするものであり、もう一つは、この変化の他
にも、新たに判定されたGとそれに続くCの間に一定数の塩基が挿入されるという
ものである。架橋プローブを用いた結果が陰性の場合には、まず突然変異位置を
含む少なくとも1個の架橋プローブ(AAGCTA)によって、次いで追加の8個のプロー
ブCAAAGA、CAAAGT、CAAAGC、CAAAGGおよびACTATT、TCTATT、CCTATT、GCTATTを用
いてこれらの選択肢を確認すればよい。突然変異解明プローブを選択するには、
他にも多くの方法がある。
【０３０４】 二倍体の場合には、試験サンプルとホモ接合体対照についてスコアを個別に比
較することで、ヘテロ接合体を同定することができる(上記参照)。連続するプロ
ーブで覆われるセグメントが2本の染色体の一方で突然変異している場合には、 これらの連続プローブのいくつかは約2分の1のシグナルを有するものと予測され
る。
【０３０５】実施例２０ 遺伝障害および他の形質の原因となる遺伝子(突然変異)の同定 長鎖プローブ(8-merまたは9-mer)の普遍的なセットをサンプルの固定化アレイ
上で使用すれば、サブクローニングをしなくても5〜20kb程度のDNA断片を配列決
定することができる。さらに、配列決定の速度は容易に約10,000,000bp/日/ハイ
ブリダイゼーション装置になり得る。この性能により、科学的または医学的に興
味のある個人に由来する大規模画分のヒト遺伝子またはヒトゲノムを繰返し再配
列決定することが可能となる。ヒト遺伝子の50％を再配列決定するためには、約
100,000,000bpの塩基対がチェックされるが、比較的短い期間に妥当なコストで 実施することができる。
【０３０６】 この優れた再配列決定能力を複数の方法に利用して、突然変異および／または
障害もしくは任意の他の形質をコードする遺伝子を同定することができる。基本
的には、特定の障害を有する患者の特定の組織またはゲノムDNAに由来するmRNA(
cDNAに変換し得るもの)を出発材料として使用すればよい。両方のDNA供給源から
、クローニング手法またはin vitro増幅手法(例えば、PCR)によって、適切な長 さの異なる遺伝子またはゲノム断片を調製することができる。クローニングを利
用する場合に、分析すべきクローンの最小限のセットをライブラリーから選択し
、次いでクローニングを行えばよい。この操作は、特に、5kbよりも長い少数の クローンを選別しようとする場合には、少数のプローブをハイブリダイゼーショ
ンさせればよいので効率的である。クローニングを行うことでハイブリダイゼー
ションのデータ量を約2倍に増やすことができるが、何万ものPCRプライマーを必
要とするわけではない。
【０３０７】 改良を加えた手順の1つでは、DNAをGACGC(N5')/CTGCG(N10')のように切断する
HgaI等の酵素による制限切断によって遺伝子断片またはゲノム断片を調製するこ
とができる。5塩基からなる突出末端は断片ごとに異なる。1種類の酵素では、一
定数の遺伝子に対して決まった断片が生じる。cDNAまたはゲノムDNAを複数の酵 素で別々の反応にて切断することにより、目的の各遺伝子を適切に切り出すこと
ができる。1つのアプローチでは、切断されたDNAをサイズごとに分画する。この
ように調製したDNA断片(さらに、3'末端からヌクレオチドを1個ずつ除去し、か つ末端の長さと特異性を増加させるエキソヌクレアーゼIIIで任意に処理したも の)を、チューブまたはマルチウェルプレートに分配してもよい。共通部分と適 切な長さの可変突出末端とを有するDNAアダプターの比較的少数のセットから、 増幅させる必要のある遺伝子断片ごとにアダプター対を選択することができる。
これらのアダプターをライゲートし、次いで普遍的プライマーでPCRを行う。100
0個のアダプターから1,000,000対を生成させることができ、従って、アダプター
の共通末端に相補的な普遍的プライマー対によって、同一の条件下で1,000,000 通りの異なる断片を特異的に増幅させることが可能である。
【０３０８】 DNAの相違が複数の患者で繰り返し見出されるのであれば、このような配列変 化はナンセンスであるか、または対応するタンパク質の機能を変化させ得るもの
であり、従って、突然変異した遺伝子によって障害が引き起こされる可能性があ
る。特定の形質を有する有意数の個人を分析することにより、特定の遺伝子の機
能的対立遺伝子変異体を特定の形質と関連付けることができる。
【０３０９】 このアプローチを使用すれば、広範な家系に対して高コストの遺伝子マッピン
グを行う必要がなくなり、また、このような遺伝子データまたは遺伝子材料がな
くても特定の有用性が認められる。
【０３１０】実施例２１ 遺伝子マッピングにおける単一ヌクレオチド多型性のスコアリング この出願に開示される技術は、単一ヌクレオチド多型性(SNUP)を有するゲノム
断片の効率的な同定に適している。10人の個人において、クローニングまたはin
vitro増幅によって増幅可能な既知の配列の多数のゲノム断片に、記載の配列決
定法を適用することにより、SNUPを有する十分な数のDNAセグメントを同定する ことができる。多型性を有する断片をSNUPマーカーとしてさらに使用する。これ
らのマーカーは既にマッピングされているものでもよく(例えば、マッピングさ れたSTSに該当)、または下記のスクリーニング手法によってマッピングしてもよ
い。
【０３１１】 該当する家族または集団に属する個人ごとに、マーカーを増幅してサブアレイ
のアレイ形状に配列させることによってSNUPをスコアリングすることが可能であ
る。サブアレイには、被験個人から増幅された同一のマーカーが含まれる。各マ
ーカーごとに、既知の突然変異の診断の場合と同様、一方の対立遺伝子に陽性の
6個以下のプローブと、もう一方の対立遺伝子に陽性の6個以下のプローブとから
なるセットを選択してスコアリングすることができる。1個のマーカーまたはマ ーカー群と障害とを有意に関連付けることによって、原因遺伝子の染色体位置を
決定することができる。ハイスループットでかつ低コストのため、何千ものマー
カーを何千もの個人についてスコアリングすることができる。このようなデータ
量のため、1,000,000bp未満の分解能レベルで遺伝子の位置を決定することがで き、さらに多遺伝子性疾患に関与する遺伝子の位置を決定することができる。該
当する正常な個人および疾患状態の個人に由来する特定の領域を配列決定して突
然変異をスコアリングすることにより、局在する遺伝子を同定することができる
。
【０３１２】 ゲノムDNA由来のマーカーの増幅にはPCRが好ましい。各々のマーカーには、特
異的なプライマー対が必要である。既存のマーカーを転用するか、またはHgaIタ
イプの制限酵素でゲノムDNAを切断し、アダプター対とライゲートすることによ って調製し得る新しいマーカーを規定してもよい。
【０３１３】 SNUPマーカーを増幅したり、プールとしてスポットすることにより、独立した
増幅反応の数を減らすことができる。この場合、1サンプル当たりより多くのプ ローブがスコアリングされる。4個のマーカーを12個のレプリカ膜上にプールお よびスポットする場合には、48個のプローブ(マーカー当たり12個)を4サイクル でスコアリングできる。
【０３１４】実施例２２ ＤＮＡ断片の正体の検出および検証 制限切断、クローニングまたはインビトロにおける複数回の増幅（例えば、Ｐ
ＣＲ）によって作製したＤＮＡを実験で同定できる。同定は、ゲル電気泳動分析
の結果特定サイズのＤＮＡバンドが存在するかどうかを検証することによって実
施できる。または、特定のオリゴヌクレオチドを作製して、ハイブリダイゼーシ
ョンによって問題のＤＮＡ試料を検証するために使用できる。本明細書において
開発された手法により、各断片ごとに特定のオリゴヌクレオチドを作製すること
なく、大多数の試料をより効率的に同定することが可能になる。陽性プローブお
よび陰性プローブのセットは、既知の配列に基づいて、各断片の普遍的セットか
ら選択できる。陽性であると選択されるプローブは、通常、１つまたは数個のオ
ーバーラップ基を形成でき、陰性プローブは全挿入部位に拡散する。
【０３１５】 本発明の技術は、ＹＡＣクローンのマッピング過程の際にＳＴＳｓを同定する
ために使用できる。約１００個のＹＡＣクローンまたはＹＡＣクローンのプール
についてＳＴＳｓの各々を試験することができる。これら１００の反応によって
得られたＤＮＡを１つのサブアレイにスポットする。異なるＳＴＳｓは逐次的な
サブアレイであってもよい。数サイクルのハイブリダイゼーションにおいて、Ｄ
ＮＡ試料の各々について、所定のＹＡＣクローン中に特定のＳＴＳが存在するか
どうかをある程度の信頼性をもって証明する、または証明しない識別特性が形成
され得る。
【０３１６】 個々のＰＣＲ反応の数または個々のスポット試料の数を減らすために、それぞ
れ、数個のＳＴＳｓを１つの反応において同時に増幅してもよく、またはＰＣＲ
試料を混合してもよい。この場合には、１ドットあたりより多くのプローブがス
コアリングされなければならない。ＳＴＳｓ貯蔵は貯蔵中のＹＡＣｓとは独立し
ており、１つのＹＡＣｓまたはＹＡＣｓのプールに対して使用できる。異なる色
で標識したいくつかのプローブを一緒にハイブリダイゼーションする場合には、
この案は特に魅力的である。
【０３１７】 試料中にＤＮＡ断片が存在するかどうかを確認する以外に、いくつかの別個の
プローブまたはプローブの１つ以上のプールのハイブリダイゼーションの強度を
使用してＤＮＡの量を推定できる。得られた強度を既知量のＤＮＡを有する対照
試料の強度と比較することによって、スポットした全ての試料中のＤＮＡ量が同
時に求められる。ＤＮＡ断片の同定にはほんの数プローブしか必要なく、塩基の
長さがＮ塩基のＤＮＡに使用できるプローブをＮ個と思われるので、本発明の用
途では、任意のＤＮＡセグメントを同定するのに十分なプローブは多くのセット
を必要としない。１０００個の８-merから、平均で約３０個の全長の対合プロー
ブを１０００ｂｐ断片のために選択できる。
【０３１８】実施例２３ 感染性病原生物およびそれらの変種の同定 患者のウィルス、細菌、真菌および他の寄生性生物を検出するためのＤＮＡに
基づいた試験は、通常、他の方法より信頼性が高く、安価である。ＤＮＡ試験の
主要な利点は特定の菌株および変種を同定でき、最終的には、より効果的な治療
を適用できる。
【０３１９】 細菌感染症において１２種の既知の抗生物質耐性遺伝子が存在することはこれ
らの遺伝子を増幅することによって試験できる。１２８人の患者の増幅産物を２
つのサブアレイにスポットし、次いで、１２種の遺伝子の２４のサブアレイを８
×１２ｃｍの膜で４回反復することができる。各遺伝子について、陽性および陰
性スコアリングのために１２種のプローブを選択できる。ハイブリダイゼーショ
ンは３サイクルの条件で実施することができる。これらの試験では、かなり小規
模のセットのプローブが普遍的である可能性が最も高い。例えば、１０００個の
８-merから、平均で３０個のプローブが１０００ｂｐの断片では陽性であり、１
０個の陽性プローブは信頼性の高い同定のためには通常十分である。実施例９に
記載するように、いくつかの遺伝子を一緒に増幅および／またはスポットし、所
定のＤＮＡ量を求めることができる。増幅した遺伝子の量は感染レベルの指標と
して使用することができる。
【０３２０】 別の例は、ＨＩＶウィルスの１つの遺伝子またはゲノム全体の配列決定の可能
性に関係する。多様化の速さのために、このウィルスは最適な治療法の選択に多
大な困難を呈する。６４人までの患者から単離したウィルス由来のＤＮＡ断片を
増幅して、記載されている手法によって再度配列決定することができる。得られ
た配列に基づいて、最適な治療法を選択することができる。一方が（異型接合型
の場合と同様の）基本配列を有する２種のウィルス種の混合物が存在する場合に
は、そのハイブリダイゼーションスコアを他の試料、特に基本的なウィルス種だ
けを含有する対照試料のスコアと定量比較することによって同定することができ
る。試料中に存在する２種のウィルス種の一方の変異部位をカバーする３〜４つ
のプローブでは２倍程度のスコアが得られる（上記を参照）。
【０３２１】実施例２４ 法医学的同定および親子の同定 配列の多形性は個々のゲノムＤＮＡを独自なものにしている。これにより、犯
罪現場から採取した血液または他の体液または組織の分析および犯罪容疑者の試
料との比較が可能になる。多形部位が十分な数であれば試料の独自の識別特性を
形成するようにスコアリングされる。ＳＢＨは１つのヌクレオチド多形を容易に
スコアリングしてこのような識別特性を生ずる。
【０３２２】 試料および容疑者由来の１セットのＤＮＡ断片（１０〜１０００）を増幅する
ことができる。１つの断片を提示する試料および容疑者由来のＤＮＡｓを１つま
たはいくつかのサブアレイにスポットし、各サブアレイを４回複製することがで
きる。３サイクルで、１２個のプローブが各ＤＮＡ座について容疑者を含む試料
の各々に対立遺伝子ＡまたはＢが存在することを判定できる。試料および容疑者
のパターンを対合させることにより、その犯罪の容疑者を発見することができる
。
【０３２３】 同じ手法を子供の親の正体の証明に適用することができる。ＤＮＡを調製し、
子供と大人由来の多形性を示す遺伝子座を増幅し；各々についてハイブリダイゼ
ーションすることによって対立遺伝子ＡまたはＢのパターンを求めることができ
る。得られたパターン並びに陽性および陰性対照の比較は家族関係を決定する際
の助力となる。この場合には、同定には対立遺伝子の意義ある部分だけが一方の
親と対合する必要がある。遺伝子座のスコアリング数が多いと、この手法の統計
誤差またはデノボ変異の遮蔽効果の回避を可能にする。
【０３２４】実施例２５ 集団または種の遺伝的多様性および生態学的地位の生物的多様性の評価 かなりの数の遺伝子座（例えば、いくつかの遺伝子またはミトコンドリアＤＮ
Ａ全体）について対立遺伝子変異の頻度を測定することにより、１つの集団の遺
伝子型、歴史および進化または疾患もしくは絶滅の可能性等に対する環境の影響
に関する結果などの種々の種類の結果が得られる。特定の既知の対立遺伝子を試
験することによって、または小さな変異または環境における変異原の存在を明ら
かにすることができるデノボ変異を形成することができるようにいくつかの遺伝
子座の全長を再度配列決定することによってこれらの評価を実施することができ
る。
【０３２５】 または、リボソームＲＮＡｓの遺伝子または高度に保存されているタンパク質
の遺伝子などの進化的に保存されているＤＮＡ配列を再度配列決定することによ
って、微生物界における生物多様性を調査することができる。環境からＤＮＡを
調製し、保存配列に対応するプライマーを使用して特定の遺伝子を増幅すること
ができる。ＤＮＡ断片は、好ましくは、プラスミドベクターにクローニングされ
る（または、マルチウェルプレートの１ウェルあたり１分子の濃度まで希釈され
、次いで、インビトロで増幅される）。この方法で作製したクローンを上記のよ
うに再度配列決定することができる。２種類の情報が得られる。その最初として
、異なる種の一覧表を形成することができると同時に、各種の個体の密度を規定
することができる。別の情報を使用して、生態的因子または汚染が生態系に与え
る影響を測定することができる。いくつかの種が根絶するかどうか、または種の
発生量比が汚染によって変更されるかどうかが明らかになる。本発明の方法はま
た、化石のＤＮＡｓを配列決定するのに適用できる。
【０３２６】実施例２６ 核酸種の検出または定量 基体に固定した未標識プローブまたは溶液中の標識プローブを含むプローブ対
を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ種を検出および定量することができる。標識プ
ローブおよびリガーゼの存在下で未標識プローブに暴露することによって種を検
出および定量することができる。具体的には、標識および未標識プローブの連結
によって試料の核酸骨格に伸長プローブが形成されることは、検出対象の種が存
在することを示す。このように、未連結の標識プローブを除去後、基体上のアレ
イの特定の箇所に標識が存在することは試料の種の存在を示すと同時に、標識の
定量は種の発現量を示す。
【０３２７】 または、１つ以上の未標識プローブを、溶液で導入する予定の１つ以上の標識
プローブとの対の第１のメンバーとして基体上に配列することができる。一方法
によると、アレイ上の標識のマルチプレクシングは、識別可能な波長で蛍光を発
する染料を使用して実施することができる。この方法では、アレイに適用される
ｃＤＮＡと被同定種に特異的な標識および未標識プローブの対との混合物は、ｃ
ＤＮＡ種の存在および発現量について調査することができる。好ましい実施態様
によると、本発明の方法を実施して、被検出ｃＤＮＡの配列とオーバーラップす
る配列を含む未標識および標識プローブ対を選択することによって、ｃＤＮＡｓ
の一部を配列することができる。
【０３２８】 プローブを選択して、標的病原生物ゲノムにのみ組み合わせた状態で存在する
選択されたプローブ対を組成物中に含むことによって、特定の病原生物ゲノムの
存在を検出し、定量することができる。このように、１つのプローブ対は必ずし
も病原生物ゲノムに特異的でなくてもよいが、対の組み合わせは特異的である。
同様に、ｃＤＮＡｓを検出または配列決定する際には、特定のプローブがｃＤＮ
Ａｓまたは他の種類の種に特異的ではないことが生じるかもしれない。にもかか
わらず、特定の種の存在および定量は、別個のアレイ位置に選択されたプローブ
の組み合わせが配置されるということが特定の種の存在を示すという結果によっ
て判定される。
【０３２９】 約１０ｋｂ以上のＤＮＡを有する感染菌は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
または他の標的増幅手法を使用しないで、支持体結合検出チップを使用して検出
することができる。他の方法によると、細菌およびウィルスを含む感染菌のゲノ
ムは、ＰＣＲによって１つの標的ヌクレオチド配列を増幅し、標的配列に特異的
な標識プローブのハイブリダイゼーションによって標的の存在を検出することに
よってアッセイされる。このようなアッセイは１つの標的配列だけに特異的であ
るために、検出可能なシグナルとなる十分な標的を提供するために、ＰＣＲなど
の方法によって遺伝子を増幅することが必要である。
【０３３０】 この実施例によると、関心のある感染菌に特異的な多重の異なる固定されたオ
リゴヌクレオチドプローブのアレイを含む固相検出チップが調製される、フォー
マット３-型反応による感染菌に特徴的なヌクレオチド配列を検出する改善され た方法が提供される。標的核酸に相補的な多くの未標識プローブの混合物を含む
１つのドットは、１つの位置における種に特異的な標識を濃縮しており、それに
よって拡散またはシングルプローブ標識法よりも感度が改善される。このような
多重プローブは標的ヌクレオチド配列のオーバーラップ配列であってもよいが、
非オーバーラップ配列並びに非隣接配列であってもよい。このようなプローブは
、好ましくは、約５〜１２のヌクレオチド長を有する。
【０３３１】 試料中に存在するプローブアレイおよび標的配列に暴露された核酸試料は多重
固定プローブとハイブリダイゼーションする。ついで、固定プローブに隣接する
標的配列に特異的に結合するように選択された多重標識プローブのプールを試料
と共に未標識オリゴヌクレオチドプローブ混合物のアレイに適用する。次いで、
リガーゼ酵素をチップに適用して、隣接プローブを試料に連結する。次いで、検
出チップを洗浄して、プローブと試料核酸のハイブリダイゼーションしなかった
ものおよび連結しなかったものを除去して、標識の有無によって試料核酸の存在
を求めることができる。この方法は試料薬剤のモル濃度が約１０００倍低下した
信頼性の高い試料検出法を提供する。
【０３３２】 本発明のさらに別の態様として、それ自体発色多重標識、酵素多重標識または
放射性多重標識を含む、またはそれ自体、多重標識されているさらに別のプロー
ブ剤による特異的な結合を受けやすい遊離プローブと共通の末端を提供するなど
によって標識プローブシグナルを増幅することができる。この方法では、第２回
目のシグナル増幅を実施することができる。標識または未標識プローブを第２回
目の増幅に使用することができる。この第２回目の増幅では、多重標識を有する
ＤＮＡ試料が長いと増幅強度シグナルが１０〜１００倍増加し、総増幅シグナル
は１００，０００倍となる。この実施例の両態様を使用することにより、約１０
０，０００倍の強度シグナルによってプローブ-ＤＮＡ連結の陽性の結果を得る ことができる。
【０３３３】 本発明のさらに別の態様により、完全なセットのプローブ、例えば４０９６個
の６-merプローブからなるアレイまたはスーパーアレイを作製することができる
。この種類のアレイは、任意の核酸種の同定、または一部には任意の核酸種の配
列決定を完成することができるという意味において普遍的である。アレイ中の個
々のスポットは１つのプローブ種またはプローブの混合物、例えば、１つの反応
で合成されるＮ（１-３）Ｂ（４-６）Ｎ（１-３）種の混合物を含有してもよい （Ｎは４ヌクレオチド全てを示し、Ｂは１つの特異的なヌクレオチドを示し、関
連する数字は塩基の数の範囲である、すなわち、１-３は「１〜３個の塩基」を 意味する。）これらの混合物は、同じ長い核酸種分子の異なる部分からシグナル
を採取することにより、低濃度で存在する核酸種のより強い信号を提供する。普
遍的なセットのプローブは多数のサブセットに小分割され、ハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液の拡散を防止するバリアによって分離されたユニットアレイとして試
料および標識プローブとともにスポットされる。
【０３３４】 既知の配列を有する核酸種を同定するために、未標識固定プローブおよび標識
プローブ溶液の両者を含む１種以上のオリゴヌクレオチド配列を選択することが
できる。標識プローブを合成するか、または予め合成しておいた完全なセットの
例えば、７-merから選択する。リガーゼの添加の結果、プローブが共有結合され
るように、固定および標識プローブの対を標的配列に隣接してハイブリダイゼー
ションするように、標識プローブを対応するユニットアレイの固定プローブに添
加する。 ユニットアレイが、所定の核酸種において陽性である（分離されたスポットと
して、または同じスポット内で）２つ以上の固定プローブを含有する場合には、
全ての対応する標識プローブを同じユニットアレイに混合および添加することが
できる。核酸種の混合物を試験する場合には、標識プローブの混合物がさらによ
り重要である。核酸種の複雑な混合物の一例は１つの細胞または組織中のｍＲＮ
Ａｓである。
【０３３５】 本発明の一実施態様によると、固定プローブのユニットアレイにより、全ての
可能な固定プローブと比較的小数の標識プローブの溶液を使用することができる
。マルチプレックス標識法を実施する場合には、標識プローブのさらに複雑な溶
液を使用することができる。好ましいマルチプレクシング方法は異なる蛍光染料
または質量分析計で分離できる分子量標識を使用することができる。
【０３３６】 または、本発明の好ましい実施態様によると、多数の核酸配列に高頻度でハイ
ブリダイゼーションする比較的短い固定プローブを選択することができる。この
ような短いプローブを、少なくとも１つの標識プローブが固定プローブの各々に
対応するように作製することができる標識プローブの溶液と併用して使用する。
好ましい溶液は、標識プローブのどれも２つ以上の固定プローブに対応しないも
のである。
【０３３７】 実施例２７全ての可能な１０-merを用いたＨＩＶウィルスセグメントの審問 フォーマットＩＩＩ ＳＢＨのこの実施例では、全ての可能な結合５-mer（１
０２４個の可能なペンタマー）のアレイをナイロン膜（例えば、ジーンスクリー
ン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ））上に作製した。５‘-ＴＴＴＴＴＴ-ＮＮＮ-３ ’（Ｎ＝４種全ての塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔで、反応のこの段階では、等しいモル両
の４種全ての塩基を添加する）の５‘末端を有する結合５-merオリゴヌクレオチ
ドを合成する。これらのオリゴヌクレオチドをナイロン膜に正確にスポットし、
スポットを乾燥させ、ＵＶ光線で乾燥させたスポットを処理することによってオ
リゴヌクレオチドを固定した。
【０３３８】 アレイ中のサブアレイを、各サブアレイが隣接サブアレイによる交差汚染をう
けることなく、ハイブリダイゼーションすることを可能にする疎水性ストリップ
のような物理的バリアによって互いに分配される。好ましい実施態様において、
疎水性ストリップは適当な（このような溶媒は当技術上周知である）溶媒中でシ
リコーン溶液（例えば、家庭用シリコーンのりおよびシールのり）から作製され
る。シリコーングリースのこの溶液をサブアレイ間に適用して、溶媒留去後に細
胞を分離する疎水性ストリップとして作用するラインを形成する。
【０３３９】 このフォーマットＩＩＩの例では、遊離または溶液（未結合）５-めｃｒｓを ５‘-ＮＮ-３’（Ｎ＝は４種全ての塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の３‘末端を用いて合
成した。この実施態様において、遊離の５-merおよび結合５-merを組み合わせて
、２０ｋｂより少ない既知のＤＮＡ配列を配列決定するために可能な全ての１０
-merを作製する。２０ｋｂの２本鎖を４０ｋｂの１本さＤＮＡに変性する。この
４０ｋｂのｓｓ ＤＮＡは全ての可能な１０-merの約４％とハイブリダイゼーシ
ョンする。１０-mer結合配列および既知の標的配列の低い頻度により、配列情報
を損失することなく、各サブアレイを処理するための遊離または溶液（未結合）
５-merをプールすることが可能になる。好ましい実施態様において、１６のプロ
ーブを各アレイについてプールし、すべの可能な５-merを遊離の５-merの合計６
４のプールで表わす。従って、全ての可能な１０-merを、１０２４個のサブアレ
イを使用してＤＮＡ試料に対してプローブ化することができる（遊離の５-merの
各プールについて１６サブアレイ）。
【０３４０】 この実施態様における標的ＤＮＡはＨＩＶウィルスの２つの６００ｂｐセグメ
ントを示す。これらの６００ｂｐセグメントは６０のオーバーラップする３０-m
erのプールによって示される（３０-merが２０ヌクレオチドごとに各隣接３０-m
erとオーバーラップする）。３０-merのプールは、当技術上周知の技法を使用し
て処理して標的ＤＮＡを切断、消化および／またはランダムＰＣＲして、非常に
小さいの断片のランダムプールを作製した標的ＤＮＡに類似している。
【０３４１】 先のフォーマットＩＩＩの例に上記するように、遊離の５-merを放射性同位体
、ビオチン、蛍光染料等で標識する。標識した遊離５-merを結合５-merと共に標
的ＤＮＡにハイブリダイゼーションし、連結する。好ましい実施態様において、
３００〜１０００単位のリガーゼを反応液に添加する。ハイブリダイゼーション
条件は、先の実施例の技法に準じて実施した。標的ＤＮＡおよび過剰の遊離のプ
ローブを連結し、除去後、（上記の実施例に記載する技法を使用して）アレイを
アッセイして、標識プローブの位置を決定する。
【０３４２】 各サブアレイ中の標的の既知のＤＮＡ配列、並びに既知の遊離および結合５-m
erは、どの結合５-merが各サブアレイ中の標識遊離５-merに連結するかを予測す
る。これらの予測ドットの２０由来のシグナルは損失し、予測配列由来の標的Ｄ
ＮＡ中の各変化について２０の新たなシグナルが得られる。これらの１０の新た
なドットにおける結合５-merのオーバーラップ配列は、どの遊離の標識５-merが
各新たなドット中に結合するかを同定する。
【０３４３】 上記の方法を使用して、遊離の標識５-mer、試験ＨＩＶＤＮＡ配列のアレイお
よびプールに全ての可能な１０-merをプローブ処理する。このフォーマットＩＩ
Ｉ方法を使用して、本発明社らは、試験したセグメントの「野生型」配列並びに
これらの配列に導入されたいくつかの配列「変異体」を正しく同定した。
【０３４４】実施例２８ 反復ＤＮＡ配列の配列決定 位置実施態様において、標的ＤＮＡにおける反復ＤＮＡ配列を改良したフォー
マットＩＩＩ方法における「スペーサーオリゴヌクレオチド」を用いて配列決定
する。種々の長さの反復ＤＮＡ配列のスペーサーオリゴヌクレオチド（反復配列
は１回めのＳＢＨ操作で同定される）を、第１の既知の隣接するオリゴヌクレオ
チドおよび第２の既知のまたはスペーサーの他方の端に隣接する可能なオリゴヌ
クレオチドの群（１回めのＳＢＨ操作により周知）とともに標的ＤＮＡにハイブ
リダイゼーションする。反復ＤＮＡセグメントの長さに一致するスペーサーを標
的にハイブリダイゼーションする場合、２つの隣接するオリゴヌクレオチドをス
ペーサーに連結することができる。第１の既知のオリゴヌクレオチドを基体に固
定し、第２の既知の、または可能なオリゴヌクレオチドを標識する場合には、適
切な長さのスペーサーが標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションするときに、標識
した第２の既知のまたは可能なオリゴヌクレオチドを含む結合連結産物を形成す
る。
【０３４５】実施例２９ フォーマットＩＩＩＳＢＨを用いた分岐点による配列決定 一実施態様において、標的ＤＮＡ中の分岐点を、第３のセットのオリゴヌクレ
オチドと改良フォーマットＩＩＩ方法を使用して配列決定する。１回目のＳＢＨ
操作の後に、配列がコンパイルされるときに、いくつかの分岐点を同定すること
ができる。分岐点に至る既知の配列の１つと部分的にオーバーラップするオリゴ
ヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、次いで、標識され、分岐点を生ずる
配列の１つに相当する追加のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイゼーショ
ンすることによってこれは解決される。適切なオリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡ
にハイブリダイゼーションされると、標識オリゴヌクレオチドは他と連結するこ
とができる。好ましい実施態様において、１から数ヌクレオチドごとに分岐点か
らオフセットされる第１のオリゴヌクレオチドを選択し（分岐配列の１つに読み
込まれるように）、第１の配列から分岐点の配列に読み込まれる第２のオリゴヌ
クレオチドを選択し、１から数ヌクレオチドごとに分岐点の配列のオーバーラッ
プを有する全ての可能な分岐配列に対応する第３のオリゴヌクレオチドのセット
（第１のオリゴヌクレオチドに対応する）を選択する。これらのオリゴヌクレオ
チドを標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションし、適切な分岐配列を有する第３の
オリゴヌクレオチド（第１のオリゴヌクレオチドの分岐配列と一致する）だけが
第１および第２のオリゴヌクレオチドとの連結産物を産生する。
【０３４６】実施例３０ 標的核酸を分析するためのマルチプレクシングプローブ この実施例において、セットの各プローブがセット中の他のプローブから識別
されるように、プローブのセットを異なる標識で標識する。従って、プローブセ
ットを、任意のプローブ情報を損失することなく、１つのハイブリダイゼーショ
ン反応において標的核酸と接触させることができる。好ましい実施態様において
、異なる標識は異なる放射性同位体または異なる蛍光標識または異なるＥＭＬｓ
である。これらのプローブセットをフォーマットＩ、フォーマットＩＩまたはフ
ォーマットＩＩＩＳＢＨにおいて使用することができる。
【０３４７】 フォーマットＩＳＢＨにおいて、異なるように標識したプローブセットを完全
な対合と１塩基対の誤対合とを識別できる条件下で基体に固定した標的核酸にハ
イブリダイゼーションする。標的核酸に結合する特異的プローブは、異なる標識
によって同定され、完全な対合は、少なくとも一部には、この結合情報によって
判定される。
【０３４８】 フォーマットＩＩＳＢＨにおいて、標的核酸を異なるプローブで標識して、プ
ローブアレイにハイブリダイゼーションする。プローブに結合する特異的な標的
核酸は、これらの異なる標識によって同定され、完全な対合は、少なくとも一部
には、この結合情報によって判定される。
【０３４９】 フォーマットＩＩＩＳＢＨにおいて、異なるように標識したプローブセットお
よび固定プローブを完全な対合と１塩基対の誤対合とを識別できる条件下で標的
核酸にハイブリダイゼーションする。標識上で、固定プローブに隣接する標識プ
ローブを固定プローブに結合し、これらの産物を検出し、異なる標識によって識
別する。
【０３５０】 好ましい実施態様において、異なる標識は、電子捕獲型質量分析計（ＥＣ- ＭＳ）で検出することができるＥＭＬｓである。ＥＭＬｓは、ある種の芳香族骨
格が特に好ましい種々の骨格分子から作製される。例えば、Ｘｕら、Ｊ．Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇ．７６４：９５-１０２（１９９７）を参照。ＥＭＬは可逆的で安 定な方法で結合され、プローブが標的核酸にハイブリダイゼーションされると、
ＥＭＬはプローブから除去され、標準的なＥＣ-ＭＳ（例えば、ＥＣ-ＭＳはガス
クロマトグラフ-質量分析計によって実施される）によって同定される。
【０３５１】実施例３１ 低頻度標的核酸の検出 フォーマットＩＩＩ ＳＢＨは、サンプル中に類似の配列の９９対１の割合で
存在する、１個のヌクレオチドが異なる配列を同定する十分な識別力を有する。
したがって、フォーマットＩＩＩは核酸サンプル、例えば血液由来のサンプル中
に、非常に低濃度で存在する核酸を同定するために用いることができる。
【０３５２】 一つの態様において、２つの配列は嚢胞性線維症の配列であり、これらは互い
に３個のヌクレオチド欠失により異なっている。２つの配列のプローブは以下の
通りであった。野生型からの欠失を識別するプローブは基質に固定されており、
標識した近接プローブは両方に共通であった。これらの標的およびプローブを用
いて、欠失突然変異体が野生型の９９分の１で存在する場合に、これをフォーマ
ットＩＩＩ ＳＢＨにより検出することができた。
【０３５３】実施例３２ 標的核酸を分析するためのポラロイド器具および方法 核酸を分析するための器具を、２つの核酸アレイと、２つのアレイの核酸の混
合が望まれるまで混合しないようにする任意の物質とを用いて構成することがで
きる。器具のアレイは、ナイロンメンブレン、ニトロセルロースメンブレン、ま
たは前述の他の物質を含む様々な基質で支持することができるが、これらに制限
されることはない。好ましい態様において、基質の一つは疎水性ストリップによ
り複数のセクターに分けられた膜、またはゲルもしくはスポンジを含むウェルを
備える適当な支持物質である。この態様において、プローブは膜のセクター上、
またはウェル、ゲル、もしくはスポンジ中に位置し、溶液（標的核酸を含む、ま
たは含まない）を膜またはウェルに加えてプローブを可溶化する。次いで、可溶
化したプローブを含む溶液を第二の核酸アレイに接触させる。この核酸はオリゴ
ヌクレオチドプローブまたは標的核酸でもよいが、これらに制限されることはな
く、プローブまたは標的核酸は標識されていてもよい。核酸は、放射性同位体、
蛍光標識またはエレクトロフォアマス標識を含む当技術分野において通常用いら
れるいかなるラベルで標識されていてもよいが、これらに制限されることはない
。
【０３５４】 核酸の混合を妨げる物質は、物質を除去した時に２つのアレイの核酸が混合す
るような方法で、２アレイ間に配置することができる。この物質はシート、膜、
または他の障壁の形でもよく、また、この物質は拡散の混合を妨げるいかなる物
質からなっていてもよい。
【０３５５】 この器具は下記の通りフォーマットＩ ＳＢＨにおいて用いることができる。
すなわち、器具の第一のアレイは基質に固定された標的核酸を有し、器具の第二
のアレイは標識された核酸プローブを有していて、除去すると第一アレイの核酸
に応答指令信号を送ることができる。２つのアレイは、プローブが標的核酸と接
触するのを妨げる物質のシートにより任意に分離されており、シートを除去する
とプローブが標的に応答指令信号を送ることができる。適当なインキュベーショ
ンと、（任意の）洗浄段階の後、標的アレイを「読み取り」、どのプローブが標
的と完全な対を形成したかを調べることができる。この読み取りは自動化するこ
ともでき、または手動で（例えば、オートラジオグラムを用いた目による読み取
り）実施することもできる。フォーマットＩＩ ＳＢＨでは、以下の手順は標的
を標識し、プローブを固定する他は、前述の手順と同様であろう。
【０３５６】 または、器具は下記の通りフォーマットＩＩＩ ＳＢＨにおいて用いることが
できる。すなわち、核酸プローブの２アレイを形成し、いずれか、または両方の
アレイの核酸プローブを標識してもよく、アレイの一方をその基質に固定しても
よい。２アレイはプローブを混合しないようにする物質のシートで分離する。フ
ォーマットＩＩの反応を、標的核酸を加え、シートを除去してプローブをお互い
に、および標的と混合させることにより、開始する。標的の隣接する部位に結合
するプローブは相互に結合し（例えば、塩基積み重ね相互作用または骨格の共有
結合による連結により）、結果を読み取ってどのプローブが隣接部位の標的に結
合しているかを調べる。一組のプローブを基質に固定する場合、固定したアレイ
を読み取って、もう一方のアレイのどのプローブが固定したプローブと結合する
かを調べることができる。前述の方法と同様に、この読み取りは自動化（例えば
、ＥＬＩＳＡ読みとり機を用いて）してもよく、または手動で（例えば、オート
ラジオグラムを用いた目による読み取り）実施することもできる。
【０３５７】実施例３３ プローブの３次元アレイ 好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブを３次元アレイに固
定する。各層が他の層とは別個に、間隔をおいて分析され、または３次元アレイ
の層の全てが同時に分析されるように、３次元アレイは多数の層を含む。これら
の３次元アレイには、例えば、プローブがくぼみの異なる深さの位置に配置され
る多数のくぼみを有する基体に配置されたアレイ（各レベルはくぼみの同じ深さ
の位置のプローブから作られる）；または、プローブがくぼみの底部、くぼみを
分離するピーク部またはピークとくぼみをくみあわせたところに配置される異な
る深さのくぼみを有する基体に配置されたアレイ（各レベルはある種の深さの全
てのプローブから作られる）；または、層を形成して３次元アレイを形成する多
数のシートを含む基体に配置されたアレイを含む。
【０３５８】 これらの３次元アレイを合成するための方法は当技術上周知であり、プローブ
アレイの支持体と同じくらい適当であると本明細書において先に引用した材料を
含む。また、オリゴヌクレオチドプローブを支持することができ、好ましくは可
撓性である他の好適な材料を基体として使用することができる。
【０３５９】実施例３４ ｃＤＮＡクローンをクラスター化するための識別特性配列 標準的なｐｃｒ、ＳＧＨ配列識別特性分析およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の
配列決定法を使用して、ｃＤＮＡライブラリーから複数の別個の核酸配列を得た
。ライブラリーの挿入部は、挿入部に隣接するベクター配列に特異的なプライマ
ーを使用したｐｃｒを用いて増幅した。これらの試料をナイロン膜にスポットし
、好適な数のオリゴヌクレオチドプローブを用いて調査し、陽性結合プローブの
強度を配列の識別特性を与えることによって測定した。クローンを同様のまたは
同一の配列の識別特性にクラスター化し、ゲル配列決定のためにクローンを代表
するシグナルを各群から選択した。典型的なサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列決
定プロトコールにおいて逆Ｍ１３配列決定用プライマーを使用して増幅した挿入
物の５‘配列を推定する。ＰＣＲ産物を精製し、蛍光染料ターミネーターサイク
ル配列決定を実施した。３７７アプライド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）シークエンサーを使用してシングルパスゲル
配列決定を実施した。この方法によって選択され、配列決定されたクローンの大
半は、互いに他と異なる配列を有し、同じ配列を有したのはごく少数であった。
【０３６０】実施例３５ チップの高スループット生産 好適な実施の形態において、プローブのアレイを大量生産するための装置は、
インクジェット蒸着装置に結合した回転ドラムもしくはプレート（例えばミクロ
ドロップ注入ヘッドなど）と、好適なロボットシステム（例えばアノラド・ガン
トリー（anorad gantry））と、を含む。この装置の特に好適な実施形態は、図 １〜３を参照して記載される。
【０３６１】 該装置は、好適な基体が固定されたシリンダー（１）を含む。この基体は、プ
ローブのアレイに好適であるものとして先に記載した材料のいずれからできてい
てもよい。好適な実施の形態において、該基体はフレキシブルな物質であり、ア
レイは該基体上に直接作製される。他の実施形態においては、フレキシブルな基
体を該シリンダーに固定し、個々のチップを該基体上に固定させる。つぎに該ア
レイを個々の各チップ上に作製する。
【０３６２】 好適な実施形態において、物理的バリアーを基体またはチップ上に設け、ウェ
ルのアレイを画定する。この物理的バリアーは、該装置により基体またはチップ
に設けても良いし、あるいはこの物理的バリアーは、シリンダー（１）に固定す
る前にチップまたは基体上に設けてもよい。つぎに、オリゴヌクレオチドプロー
ブの１スポットを各ウェルに入れるが、このとき個々のウェルに配置したプロー
ブは全て同じ配列を有してもよいし、または個々のウェルにスポットされたプロ
ーブは異なる配列を有していてもよい。より好適な実施形態において、１つのア
レイの中の個々の各ウェルにスポットされた１以上のプローブは、そのアレイの
他のウェルにスポットされたプローブと異なる。つぎに、複数のアレイを含む配
列決定チップをこれらのアレイから組立てることができる。
【０３６３】 基体または基体とチップをシリンダー（１）に固定させたあと、モーター（図
示せず）により該シリンダーを回転させる。このシリンダーの回転速度は、当分
野で公知の任意の方法（例えば固定型光学センサーおよびシリンダーと共に回転
する光源を用いた方法など）により正確に測定される。分配装置（３）はアーム
（２）に沿って移動し、上記のように計算した正確な回転速度を使用して、分配
チップ（dispensing tip）（８）を介してプローブや他の試薬を当分野で公知の
方法により基体またはチップ上の正確な位置に送達することができる。該分配装
置は、リザーバー（６）から供給ライン（７）を介してプローブや試薬を受け取
る。リザーバー（６）は、アレイを作製するのに必要なプローブおよび他の試薬
全てを収容する。
【０３６４】 分配装置は図３に図示されている。該分配装置は、１つまたは複数の分配チッ
プ（14および８）を有することができる。各分配チップは、サンプルウェル（13
）を本体（12）の中に有し、該サンプルウェル（13）は、サンプルライン（10）
を介してプローブや他の試薬を受け取る。圧力ライン（11）は、分配チップ（14
および８）を介してプローブや試薬を移動させるのに十分なpsiまでチャンバー （９）を加圧する。サンプルライン（10）、ウェル（13）および分配チップ（14
および８）は、プローブまたは試薬の交換の度毎に各交換の間に洗浄しなければ
ならない。サンプルライン（10）または任意の専用洗浄ライン（図示せず）を介
して適切な洗浄用緩衝液をサンプルウェル（13）に供給する。あるいは、任意で
、チャンバー（９）の一部または全てを洗浄用緩衝液で充填してもよい。つぎに
必要であれば、洗浄用緩衝液を、排出ライン（図示せず）により、またはサンプ
ルライン（10）および分配チップ（14および８）を介して、サンプルウェル（13
）およびチャンバー（９）から除去する。
【０３６５】 分配手段がプローブを各アレイもしくはチップ中の全ての適切な位置に当てが
ったら、基体（チップ付きまたはチップなし）をシリンダーから取り出し、新し
い基体をシリンダーに固定させる。
【０３６６】実施例36 離散粒子と複合体化したプローブを用いた標的核酸の分析 この実施形態において、標的核酸を、複数の離散粒子と（共有結合または非共
有結合により）複合体形成するプローブ用いて調べる。該離散粒子は、物理的性
質（または複数の物理的性質の組合せ）に基づいてそれぞれを識別することがで
き、該物理的性質により区別した粒子を、異なるプローブと複合体形成させる。
好適な実施形態において、プローブは、既知の配列および長さを有するオリゴヌ
クレオチドである。従って、プローブは、離散粒子の物理的性質により同定する
ことが可能である。この実施形態に好適であるプローブには、先の節で記載した
全てのプローブ（全長プローブよりも情報提供部分が短いプローブを含む）が含
まれる。
【０３６７】 離散粒子の物理的性質は、粒子を幾つかのセットに分けることができる、当分
野で公知である任意の特性でよい。例えば、粒子は、そのサイズ、蛍光、吸光度
、電磁的電荷または重量に基づいて幾つかのセットに分けることができる。ある
いは、色素、放射性核種、またはＥＭＬにより粒子を標識することができる。他
の好適な標識としては、標識された抗体に特異的に結合するメンバーとして機能
することができるリガンド、化学発光物質、酵素、標識されたリガンドに特異的
に結合して対をなすメンバーとして機能することができる抗体等が挙げられる。
イムノアッセイにおいて、簡単に使用することができる多様な標識が使用されて
きた。更に他の標識として、抗原、特異的反応性を有する基、および電気化学的
に検出可能な成分が挙げられる。更に他の標識としては、先の節に記載した標識
のいずれもが挙げられる。これらの標識および特性を、当分野で公知の方法（例
えば先の節で記載したこれらの方法を含む）により定量的に測定し、およびシグ
ナル強度またはシグナルタイプに基づいて粒子を区別することができる（標識の
１つとして、例えば異なる色素強度、または異なるタイプの色素を粒子に適用し
てもよい）。好適な実施形態において、幾つかの物理的性質を組み合わせ、この
特性の様々な組合せにより粒子の区別を可能とする（例えば１０種類のサイズと
１０種類の色を組み合わせて１００の粒子グループに分けるなど）。
【０３６８】 粒子-プローブにより、例えば約2000の反応容器を用いて全ての可能な10-mer を合成することができるような、標準的な組合せ方法の活用が可能となる。1024
反応からなる最初の第１セットを行って、1024の異なるように標識した粒子上に
全ての可能な５-merを合成する。得られたプローブ-粒子を混合し、1024の反応 容器からなる他のセットに分ける。これらのサンプルを用いて反応の第２セット
を行い、粒子のプールの中のプローブ上に全ての可能な５-mer伸長物を合成する
。この物理的性質は、各プローブの最初の５ヌクレオチドを同定し、反応容器は
全てのプローブの第２の５ヌクレオチドを同定する。こうして、2048の反応容器
を使用して全ての可能な10-merプローブを合成する。この方法は、種々のプロー
ブ長のための全ての可能なn--merを作製するために簡単に修飾される。
【０３６９】 好適な実施形態において、粒子をその粒子の蛍光強度により幾つかのセットに
分ける。各セットの中の粒子は、蛍光標識の強度を変えて調製されるので、これ
らの粒子は異なる蛍光強度を有する。フルオレセインの蛍光強度は、１：300〜 １：300,000の範囲にかけて濃度に関連し（Lockhartら、1986）、１：3000〜１ ：300,000の間には一次関係がある（つまり、フルオレセイン強度は約１〜300の
範囲にかけて線形である）。検出の線形範囲において、256セットの粒子をフル オレセインで標識する（例えば３〜259）。256セットの粒子により、全ての可能
な４-merを異なるセットの粒子に結合させることができる。該粒子をプールする
ことにより、全ての可能な５-merを、全ての可能な４-merからなる４つのプール
を持たせ、つぎに各プールの中のプローブをA、G、CまたはTだけ伸長することに
より、作製することができる。同様に、全ての可能な６-merは、全ての可能な４
-merからなる１６個のプールを持たせ、この中で４-merの各プールを、A、G、C およびTからなる１６種類の可能な２塩基順列のうちの１つ分だけ伸長させるこ とにより、作製することができる（また、例えば７-merの場合は６４プール、８
-merの場合は256プールというように）。
【０３７０】 ５-merプローブ（４つのプール中）を使用して、標的核酸を調べる。標的核酸
を他の蛍光色素、または他の異なる標識（上記記載）で標識する。標識した標的
を４つのプールと混合し、各プールの中の相補的なプローブは、該標的核酸にハ
イブリダイズする。これらのハイブリダイゼーション複合体を、当分野で公知の
方法により検出したあと、ハイブリダイズした陽性プローブを、粒子の蛍光強度
を検出することにより同定する。多くの好適な実施形態において、プローブ-粒 子と標的核酸との混合物をフロー・サイトメーターまたは他の分離装置を介して
１回に１粒子ずつ供給し、粒子標識および標的を測定して、どのプローブが標的
核酸と相補的であるかを決定する。
【０３７１】 他の実施形態において、１セットの遊離プローブを他の蛍光色素または他の標
識（上記）で標識し、個々の遊離プローブを５-merプローブの各プール（４プー
ル）と混合して、この混合物を標的核酸とハイブリダイズさせる。薬剤を加えて
遊離プローブを５-merプローブに共有結合させると（上記の好適な薬剤の説明の
節を参照のこと）、遊離プローブが標的核酸上の、５-merプローブが結合する部
位に隣接する部位に結合する（遊離プローブ部位は、連結することができる５-m
erプローブの端部に隣接していなければならない）。次に、当分野で公知の方法
により粒子をアッセイし、どの粒子が遊離プローブに共有結合したか（すなわち
遊離プローブ標識を有する粒子）を決定し、５-merプローブを粒子の蛍光強度に
より同定する。最も好適な実施形態において、プローブ-粒子、遊離プローブお よび標的核酸の混合物をフロー・サイトメーターを介して１回に１粒子ずつ供給
し、粒子標識と遊離プローブ標識を測定してどのプローブが標的核酸に相補的で
あるかを決定する。
【０３７２】 好適な実施形態において、単一の装置が、プローブ-粒子複合体を用いた標的 核酸の分析操作の全てまたは大部分を備える。該装置は１以上の試薬チャンバー
を有し、該チャンバーには緩衝液と標識された標的核酸が完全に混合されている
（標的核酸は、手動で加えても自動的に加えてもよい）。該混合物を試薬チャン
バーから複数の反応チャンバーに等分し、各反応チャンバーはプローブ-粒子複 合体のプールを１つ有する。プローブ-粒子と標的核酸は、標的核酸に相補的な プローブを結合させるような条件下において反応する。過剰な標的核酸（すなわ
ち結合しなかった核酸）を、反応チャンバーから（例えば洗浄により）除去し、
標的核酸に結合した粒子を標的核酸標識と粒子との会合により同定し、該プロー
ブを、粒子の物理的性質により同定する。好適な実施形態において、過剰な標的
を除去したあと、該粒子は１列で反応チャンバーから検出装置までチャネルを通
って移動する。単一粒子が検出装置を通過するとき、これらの装置は標的標識お
よび粒子の物理的性質を測定する。他の好適な実施形態において、過剰な標的を
除去する前または除去した後に、粒子を例えばサイズ別に（例えば排除クロマト
グラフィー）、電荷により（例えばイオン交換クロマトグラフィー）、および／
または密度-重量別に、これらの物理的性質の１つまたはこれらの組み合わせを 用いてセットに分ける。これらの分画した粒子をつぎに検出装置によりアッセイ
する。
【０３７３】 この実施形態の代替として、主要な試薬チャンバーに、緩衝液、標的核酸、プ
ローブ-粒子複合体のプール、および化学的もしくは酵素的な連結試薬を供給す る。これらの成分を完全に混合し、次に試薬チャンバーから複数の反応チャンバ
ーに等分する。各反応チャンバーは１個の標識された遊離プローブを有する。或
いは、プローブ粒子複合体のプールを、試薬チャンバーに加える代わりに、遊離
プローブと共に反応チャンバーの中に入れてもよい。さらに、遊離プローブを試
薬チャンバーに加えてプローブ粒子のプールを該反応チャンバーに加えることも
できる。プローブ-粒子、標的核酸、および遊離プローブは、遊離プローブおよ び粒子-プローブが、標的核酸上の隣接部位で結合するような条件下で反応し、 これにより、遊離プローブはプローブ粒子に連結される。過剰な遊離プローブ（
すなわち連結していないプローブ）、および標的核酸を、反応チャンバーから（
洗浄により）除去し、連結されたプローブを、遊離プローブ標識と粒子との会合
により同定し、粒子と複合体形成したプローブをその粒子の物理的性質により同
定する。好適な実施形態において、過剰なプローブと標的を除去したあと、該粒
子は１列で反応チャンバーから検出装置までチャネルを通って移動する。単一粒
子が検出装置を通過するとき、該装置は粒子に共有結合した遊離プローブ標識、
および粒子の物理的性質を測定する。他の好適な実施形態において、過剰プロー
ブおよび標的を除去する前または除去した後に、粒子をその物理的性質を用いて
、例えばサイズ毎に（例えば排除クロマトグラフィー）、電荷により（例えばイ
オン交換クロマトグラフィー）、および／または密度・重量毎に、セットに分け
る。これらの分画した粒子を検出装置によりアッセイする。
【０３７４】 好適な実施形態において、該装置の中には第２の反応チャンバーのセットがあ
り、プローブ-粒子のプールを第２反応チャンバーの中に配置する。標的および 緩衝液を試薬チャンバーの中で混合し、これらを、標識された遊離プローブの入
った第１反応チャンバーの中に入れる。プローブと標的を混合し、任意でプロー
ブを標的にハイブリダイズさせることができる。つぎに、この標識されたプロー
ブと標的の混合物を、プローブ-粒子のプールが入った第２反応チャンバーに送 る。遊離プローブおよびプローブ-粒子は標的にハイブリダイズし、適当なプロ ーブを第２反応チャンバーの中で連結させる。連結剤は、試薬チャンバーで、ま
たはいずれかの反応チャンバーの中で加えても良く、好ましくは、連結剤は、第
２反応チャンバーの中で添加する。第２反応チャンバーの中のプローブ-粒子ハ イブリダイゼーション生成物を上記のように分析する。
【０３７５】 １つの実施の形態において、標的核酸は、分析前に（PCRにより、またはλラ イブラリーなどのベクターにより）増幅しない。好ましくは、この実施の形態に
おいてより長い遊離プローブおよび粒子プローブを使用する。というのは、サン
プルの配列がより複雑であるためである（即ちバックグラウンドに対して陽性で
あるものを区別するため）。
【０３７６】 この実施例に記載されたプローブ-粒子の実施形態は、先述の用途（上記診断 および配列決定用途を含むがこれらに限定されない）のいずれにも有用である。
さらに、これらのプローブ粒子の実施形態は、上記変更および改変により修飾す
ることができる。
【０３７７】実施例37 ポリヌクレオチド間の結合を修飾する薬剤の存在下における相補的なポリヌクレ オチドの相互作用 この実施形態において、相補的なポリヌクレオチドの結合における誤対合から
の完全な対合の識別は、１以上の薬剤の添加により調節される。好適な実施形態
において、相補的なポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドプローブである。誤対合からの完全な対合の識別は、薬剤の添加により
調節することができる。この薬剤は、トリアルキルアンモニウム塩（例えばTMAC
、Ricelliら、Nucl. Acids Res. 21: 3785-3788(1993)）、塩化ナトリウム、リ ン酸塩およびホウ酸塩などの塩、ホルムアミド、グリコール、ジメチルスルフォ
キシド、およびジメチルホルムアミドなどの有機溶媒、尿、グアニジニウム、ベ
タインなどのアミノ酸類似体（Henkeら、Nucl. Acids Res. 19: 3957-3958(1997
); Reesら、Biochemistry 32: 137-144(1993)）、スペルミジンおよびスペルミ ンなどのポリアミン（Thomasら、Nucl. Acids Res. 25: 2396-2402(1997)）、ま
たはホスフェート骨格の負電荷を中和する他の正に荷電した分子、ドデシル硫酸
ナトリウム、およびナトリウムラウリルサルコシネート等の界面活性剤、主溝／
小溝結合剤、正に荷電したポリペプチド、およびインターカレート剤（例えばア
クリジン、臭化エチジウム、およびアントラセンなど）である。好適な実施形態
において、薬剤の混合物をハイブリダイゼーション反応に加えて、誤対合からの
完全な対合の識別を調節する。これらの薬剤の幾つかは、２つの相補鎖の間の溶
解のエントロピーを低減することにより識別を行う。
【０３７８】 好適な実施形態において、誤対合からの完全な対合の識別を、１以上の薬剤に
より改善する。例えば、ホルムアミド（一般的に使用される変性剤）は、フォー
マットIIIの反応における（誤対合）：（完全な対合）を選択的に不安定化する ことが分かった。上記のように、フォーマットIIIの反応を開始し、次にホルム アミドを量を変えて添加した（０％、10％、20％、30％、40％および50％）。０
％では、完全な対合シグナルが検出され、バックグラウンド（誤対合）は高かっ
た。ホルムアミド10％では、良好な完全対合シグナルがあり、バックグラウンド
／誤対合シグナルは減少した。ホルムアミド20％では、完全対合シグナルは（検
出可能であったが）減少し、バックグラウンド／誤対合シグナルは無くなった。
ホルムアミド30％〜50％では、完全対合シグナルもバックグラウンド／誤対合シ
グナルも無かった。
【０３７９】 他の実施形態において、薬剤を使用して１対の相補的ポリヌクレオチドのTmを
上下させる。より好適な実施形態において、薬剤の混合物を使用して１対の相補
的ポリヌクレオチドのTmを上下させる。薬剤は、種々の方法でTmを変更させるこ
とができる。本発明を限定するわけではないが、２つの例として、（１）２つの
相補的ポリヌクレオチドの塩基間の水素結合を切断する薬剤（Goodman, Proc. N
at'l Acad. Sci. 94: 10493-10495 (1997); Moranら、Proc. Nat'l Acad. Sci.
94: 10506-10511(1997); Nguyenら、Nucl. Acids Res. 25: 3059-3065(1997)） 、および（２）ポリヌクレオチドの糖リン酸骨格の中のリン酸の負電荷を中和も
しくは遮蔽する薬剤（Thomasら、Nucl. Acids Res. 25: 2396-2402(1997)）が挙
げられる。（１）および／または（２）を強化したりまたは弱めたりすることに
より、１対の相補的なポリヌクレオチドのTmを調節することが可能である。
【０３８０】 最も好適な実施形態において、GC塩基対の結合エネルギーを弱めたり、AT塩基
対の結合エネルギーを強化したり、またはその両方を行うために１以上の薬剤を
加える。好適な実施形態において、１以上の薬剤を加えてAT塩基対からの結合エ
ネルギーをGC塩基対の結合エネルギーとほぼ同じにする。このように、これらの
相補的ポリヌクレオチド間の結合エネルギーは、長さに全く依存する。これらの
相補的ポリヌクレオチドの結合エネルギーは、ポリヌクレオチド骨格中のリン酸
基の負電荷を中和または遮蔽する薬剤を加えることにより、増大させることがで
きる。
【０３８１】 本発明は、例示した実施形態によりその範囲を制限するものではなく、これら
の実施の形態は本発明の態様を例示することを意図するものであって、機能的に
同等な組成物および方法は、本発明の範囲内とする。実際に、本明細書の好適な
実施形態を考慮すれば、当業者であれば、本発明の実施に際し、様々な改変およ
び変更が思いつくことが予想される。従って、本発明の範囲を限定するのは、請
求の範囲に記載されたもののみである。 本明細書中の本体に記載された全ての参考文献は、本明細書中に参考としてそ
の全体が組み込まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、大量生産プローブアレイ用の装置の平面図である。
【図２】 図２は、大量生産プローブアレイ用の装置の側面図である。
【図３】 図３は、大量生産プローブアレイ用の装置の給液ユニット（dispensing unit ）の断面側面図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ０８／９５９，３６５ (32)優先日 平成９年10月28日(1997．10．28) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＲ，Ｈ Ｕ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 バイドヤ，ナラヤン アメリカ合衆国 94086 カリフォルニア 州、サニーベール、ヘレン アベニュー ナンバー１ 966 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA09 CA11 HA11 HA14 HA19 4B063 QA01 QA13 QA17 QA18 QA19 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR31 QR41 QR48 QR49 QR50 QR51 QR56 QR62 QR66 QR84 QS02 QS25 QS34 QS39 QX01 QX02 QX07 4B064 AF27 CA21 DA13

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 多数のオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、 基体と、 物理的バリアーを形成している材料で、該基体の上に配置されていて多数のウ
    ェルを有するグリッドを形成している該材料、 を含み、多数のオリゴヌクレオチドプローブが多数のウェル中にアレイを形成す
    るように配列されており、各ウェルが該基体上に固定されたプローブの１スポッ
    トを含むものである、上記アレイ。
  2. 【請求項２】 個々の各スポットが前記アレイの他のスポット中の他のプロ
    ーブと異なる配列をもつプローブを有する、請求項１記載のアレイ。
  3. 【請求項３】 個々の各スポット中のプローブが同一の配列を有する、請求
    項２記載のアレイ。
  4. 【請求項４】 あるスポットの中心と隣接スポットの中心間の距離が少なく
    とも325μmである、請求項１記載のアレイ。
  5. 【請求項５】 多数の請求項１記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ
    。
  6. 【請求項６】 多数の請求項２記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ
    。
  7. 【請求項７】 多数の請求項３記載のアレイを含んでなる配列決定用チップ
    。
  8. 【請求項８】 オリゴヌクレオチドプローブが情報提供部分と反応性基を含
    み、該反応性基により該プローブが基体に結合されている、請求項１記載のアレ
    イ。
  9. 【請求項９】 オリゴヌクレオチドプローブがさらに少なくとも１つのラン
    ダム化された位置を含む、請求項８記載のアレイ。
  10. 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドプローブがさらにスペーサーを含む、
    請求項９記載のアレイ。
  11. 【請求項１１】 多数のオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、多
    数の平面を有する基体を含み、多数のプローブが該基体の多数の平面に固定され
    ている、上記アレイ。
  12. 【請求項１２】 各平面を個別に分析することができる、請求項１１記載の
    アレイ。
  13. 【請求項１３】 多数の平面を同時に分析することができる、請求項１１記
    載のアレイ。
  14. 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドプローブが情報提供部分と反応性基を
    含み、該反応性基により該プローブが基体に結合されている、請求項１１記載の
    アレイ。
  15. 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドプローブがさらに少なくとも１つのラ
    ンダム化された位置を含む、請求項１４記載のアレイ。
  16. 【請求項１６】 オリゴヌクレオチドプローブがさらにスペーサーを含む、
    請求項１５記載のアレイ。
  17. 【請求項１７】 標的核酸を分析する方法であって、 標的核酸を多数のオリゴヌクレオチドプローブに接触させ（ただし、該プロー
    ブは物理的性質に基づいて互いに識別できる多数の異なる離散粒子と複合体化さ
    れていて、異なるプローブがそれぞれのタイプの離散粒子に結合している）、 標的核酸に対して相補的であるプローブを検出し、そして 相補的プローブのセットから標的核酸を分析する、 各ステップを含む上記方法。
  18. 【請求項１８】 離散粒子を分離して画分を得るステップをさらに含み、そ
    の際、離散粒子を物理的性質に基づいて分離する、請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 相補的プローブのセットがオーバーラップする少なくとも
    ２つのプローブを有する、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて１つにまとめられ
    る、請求項１８記載の方法。
  21. 【請求項２１】 相補的プローブが離散粒子の物理的性質により同定される
    、請求項１８記載の方法。
  22. 【請求項２２】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項１８記載の方法。
  23. 【請求項２３】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群
    より選択される、請求項１８記載の方法。
  24. 【請求項２４】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項２
    ３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項２
    ３記載の方法。
  26. 【請求項２６】 プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項
    １８記載の方法。
  27. 【請求項２７】 標的核酸が標識を含み、相補的プローブが標的核酸上の標
    識により検出される、請求項１８記載の方法。
  28. 【請求項２８】 検出ステップが、個々の粒子を検出器に通すことにより、
    個々の離散粒子に対して行われる、請求項１７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 相補的プローブのセットがオーバーラップする少なくとも
    ２つのプローブを有する、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて１つにまとめられ
    る、請求項２８記載の方法。
  31. 【請求項３１】 相補的プローブが離散粒子の物理的性質により同定される
    、請求項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項２８記載の方法。
  33. 【請求項３３】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群
    より選択される、請求項２８記載の方法。
  34. 【請求項３４】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項３
    ３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項３
    ３記載の方法。
  36. 【請求項３６】 プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項
    ２８記載の方法。
  37. 【請求項３７】 標的核酸が標識を含み、相補的プローブが標的核酸上の標
    識により検出される、請求項２８記載の方法。
  38. 【請求項３８】 標的核酸を多数の遊離オリゴヌクレオチドと接触させ、そ
    して標的核酸上のある部位に結合した相補的な遊離プローブを、遊離プローブが
    結合した部位に隣接する標的核酸上の部位に結合している離散粒子の相補的プロ
    ーブに共有結合で結合させるステップをさらに含み、 検出ステップが離散粒子のプローブに共有結合で結合している遊離プローブを
    同定する、請求項２８記載の方法。
  39. 【請求項３９】 相補的な共有結合プローブのセットがオーバーラップする
    少なくとも２つの共有結合プローブを有する、請求項３８記載の方法。
  40. 【請求項４０】 標的核酸の配列が分析ステップにおいて１つにまとめられ
    る、請求項３８記載の方法。
  41. 【請求項４１】 離散粒子と複合体化されたプローブが離散粒子の物理的性
    質により同定される、請求項３８記載の方法。
  42. 【請求項４２】 離散粒子を分離して画分を得るステップをさらに含み、そ
    の際、離散粒子を物理的性質に基づいて分離する、請求項３８記載の方法。
  43. 【請求項４３】 フローサイトメーターで離散粒子を分離して画分を得る、
    請求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 物理的性質が色素、放射性ヌクレオチド、EMLおよび蛍光 分子からなる群より選択される分子と関連している、請求項３８記載の方法。
  45. 【請求項４５】 物理的性質がサイズ、電荷、吸光度および重量からなる群
    より選択される、請求項３８記載の方法。
  46. 【請求項４６】 物理的性質が物理的性質の強度と関連している、請求項４
    ５記載の方法。
  47. 【請求項４７】 物理的性質が多数の異なる分子と関連している、請求項４
    ５記載の方法。
  48. 【請求項４８】 遊離プローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請
    求項３８記載の方法。
  49. 【請求項４９】 離散粒子と複合体化されたプローブの情報提供部分が全長
    プローブより短い、請求項３８記載の方法。
  50. 【請求項５０】 遊離プローブの情報提供部分および離散粒子と複合体化さ
    れたプローブの情報提供部分が全長プローブより短い、請求項３８記載の方法。
  51. 【請求項５１】 標的核酸を分析する方法であって、 標的核酸とプローブとを、完全な対合と誤対合との識別を可能とする条件下（
    ここでは、完全な対合と誤対合との識別を向上させる薬剤を添加する）で接触さ
    せ、そして 該プローブが標的核酸に対して相補的であるかどうかを検出する、 各ステップを含む上記方法。
  52. 【請求項５２】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ
    酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の
    分子、界面活性剤、小溝／主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインタ
    ーカレート剤からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記塩がトリアルキルアンモニウム塩、塩化ナトリウム、
    リン酸塩およびホウ酸塩からなる群より選択される、請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記有機溶媒がホルムアミド、グリコール、ジメチルスル
    ホキシドおよびジメチルホルムアミドからなる群より選択される、請求項５２記
    載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記アミノ酸類似体がベタインである、請求項５２記載の
    方法。
  56. 【請求項５６】 前記ポリアミンがスペルミジンおよびスペルミンからなる
    群より選択される、請求項５２記載の方法。
  57. 【請求項５７】 前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムおよびナトリウ
    ムラウリルサルコシネートからなる群より選択される、請求項５２記載の方法。
  58. 【請求項５８】 前記インターカレート剤がアクリジン、エチジウムブロミ
    ドおよびアントラシンからなる群より選択される、請求項５２記載の方法。
  59. 【請求項５９】 複数の薬剤が添加される、請求項５１記載の方法。
  60. 【請求項６０】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ
    酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の
    分子、界面活性剤、小溝／主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインタ
    ーカレート剤からなる群より選択される、請求項５９記載の方法。
  61. 【請求項６１】 標的核酸を分析する方法であって、 多数の固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用意し、 多数の標識されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用意し、 標的核酸と固定プローブおよび標識プローブとを、標的核酸と完全な対合を形
    成するプローブと、標的核酸と１塩基誤対合で結合したプローブとの識別を可能
    とする条件下（ここでは、完全な対合と１塩基誤対合との識別を向上させる薬剤
    を添加する）で接触させ、 標的核酸のある部位に結合した固定プローブを、固定プローブが結合された部
    位に隣接する標的核酸の部位にハイブリダイズしている標識プローブに共有結合
    で結合させ、そして 共有結合で結合された固定プローブと標識プローブを同定する、 各ステップを含む上記方法。
  62. 【請求項６２】 前記薬剤が塩、有機溶媒、尿素、グアニジニウム、アミノ
    酸類似体、ポリアミン、ホスフェート骨格の負電荷を中和する正に荷電した他の
    分子、界面活性剤、小溝／主溝結合剤、正に荷電したポリペプチドおよびインタ
    ーカレート剤からなる群より選択される、請求項６１記載の方法。
  63. 【請求項６３】 前記薬剤がホルムアミドである、請求項６１記載の方法。
  64. 【請求項６４】 複数の薬剤が添加される、請求項６１記載の方法。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005537799A (ja) * 2002-09-09 2005-12-15 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 遺伝子解析および認証方法
JP2010117167A (ja) * 2008-11-11 2010-05-27 Sharp Corp 電気泳動装置およびその構成器具
JP2018533965A (ja) * 2015-11-16 2018-11-22 リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
WO2023238921A1 (ja) * 2022-06-10 2023-12-14 壽文 池田 ペプチド核酸（ｐｎａ）センサーチップ及びその製造方法

Families Citing this family (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0907889B1 (en) 1996-04-25 2007-07-04 BioArray Solutions Ltd. Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
DE60042775D1 (de) 1999-01-06 2009-10-01 Callida Genomics Inc Verbesserte sequenzierung mittels hybridisierung durch verwendung von sondengemischen
EP1192274A2 (en) 1999-03-25 2002-04-03 Hyseq, Inc. Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization
JP3911909B2 (ja) 1999-06-09 2007-05-09 株式会社日立製作所 Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置
AU5764500A (en) * 1999-06-25 2001-01-31 Motorola, Inc. Novel methods and products for arrayed microsphere analysis
EP2083015B1 (en) 2000-02-11 2016-04-06 The Texas A & M University System Biosensor compositions and methods of use
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
JP2002153271A (ja) 2000-11-17 2002-05-28 Jeol Ltd Ｄｎａあるいはｒｎａの塩基配列決定方法およびｄｎａシーケンサー
US7419833B2 (en) 2000-11-17 2008-09-02 Nagayama Ip Holdings Llc Method for nucleic acid sequencing
WO2003014398A2 (en) * 2001-01-03 2003-02-20 Transgenomic, Inc. Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography
CA2441006A1 (en) * 2001-03-08 2002-09-19 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to fibulin-like polypeptides and polynucleotides
US7138506B2 (en) 2001-05-09 2006-11-21 Genetic Id, Na, Inc. Universal microarray system
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP1463825B1 (en) 2001-10-15 2017-12-06 BioArray Solutions Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
US6916621B2 (en) 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0309391B1 (pt) 2002-04-19 2018-10-30 Dsm Food Specialties B V vetor compreendendo ácido nucléico que codifica polipeptídeo com atividade de fosfolipase, célula transformada, preparado de proteína, método de preparação e métodos relacionados
AU2003298655A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 Bioarray Solutions, Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
CN103289893B (zh) 2003-02-26 2015-11-18 凯利达基因组股份有限公司 通过杂交进行的随机阵列dna分析
JP2006519384A (ja) * 2003-03-04 2006-08-24 チョンドークァチャンイシュエゴォンイェユーシェンゴォンスー 極小の高さのリアクターを持つ高集積解析チップとその応用
CN1208622C (zh) * 2003-03-04 2005-06-29 成都夸常科技有限公司 一种反应器隔离结构高度最小化的生物芯片及制备方法
EP3023498B1 (en) 2003-03-06 2018-11-28 BASF Enzymes LLC Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP3299465A1 (en) 2003-03-07 2018-03-28 DSM IP Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ES2598037T3 (es) 2003-04-04 2017-01-24 Basf Enzymes Llc Pectato liasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para su preparación y uso
EP2404928A1 (en) 2003-07-02 2012-01-11 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP1668113B1 (en) 2003-08-11 2013-06-19 Verenium Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN1882699A (zh) 2003-09-22 2006-12-20 佰尔瑞溶液有限公司 带有多个能共价结合生物分子的官能基团的表面固定化多电解质
WO2005042763A2 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
CN1735807A (zh) * 2003-12-19 2006-02-15 成都夸常医学工业有限公司 芯片检测方法及相关装置
EP1696920B8 (en) 2003-12-19 2015-05-06 Plexxikon Inc. Compounds and methods for development of ret modulators
EP1742627A4 (en) 2004-05-06 2009-08-26 Plexxikon Inc PDE4B HEMMER AND ITS USE
EP1766061B1 (en) 2004-05-20 2013-07-17 Quest Diagnostics Investments Incorporated Single label comparative hybridization
AU2005264938B2 (en) 2004-06-16 2011-11-24 Verenium Corporation Compositions and methods for enzymatic decolorization of chlorophyll
US7498342B2 (en) 2004-06-17 2009-03-03 Plexxikon, Inc. Compounds modulating c-kit activity
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
JP2008512380A (ja) 2004-09-03 2008-04-24 プレキシコン，インコーポレーテッド Ｐｄｅ４ｂ阻害剤
DE602006018861D1 (de) 2005-01-27 2011-01-27 Quest Diagnostics Invest Inc Schnelle komparative genomhybridisierung
CA2614769A1 (en) 2005-03-10 2006-09-21 Verenium Corporation Lyase enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2861310A1 (en) 2005-03-15 2006-09-28 Bp Corporation North America Inc. Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP1885723A2 (en) 2005-05-17 2008-02-13 Plexxikon, Inc. Pyrrolo[2,3-b]pyridine derivatives as protein kinase inhibitors
GB0515323D0 (en) * 2005-07-26 2005-08-31 Electrophoretics Ltd Mass labels
US8076074B2 (en) 2005-11-29 2011-12-13 Quest Diagnostics Investments Incorporated Balanced translocation in comparative hybridization
EP2216403A3 (en) 2006-02-02 2010-11-24 Verenium Corporation Esterases and related nucleic acids and methods
NZ595497A (en) 2006-02-10 2013-09-27 Verenium Corp Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
PL1989302T3 (pl) 2006-02-14 2019-03-29 Bp Corp North America Inc Ksylanazy, kodujące je kwasy nukleinowe i sposoby ich wytwarzania i stosowania
CN105063072A (zh) 2006-03-07 2015-11-18 巴斯夫酶有限责任公司 醛缩酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
WO2007103389A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 Cargill, Incorporated Aldolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101528766A (zh) 2006-08-04 2009-09-09 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
PT2057274E (pt) 2006-09-21 2014-03-13 Dsm Ip Assets Bv Fosfolípases, ácidos nucleicos que as codificam e métodos de preparação e utilização das mesmas
CN101541822B (zh) 2006-09-21 2014-10-22 维莱尼姆公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
US8618248B2 (en) 2006-10-31 2013-12-31 President And Fellows Of Harvard College Phosphopeptide compositions and anti-phosphopeptide antibody compositions and methods of detecting phosphorylated peptides
WO2008063888A2 (en) 2006-11-22 2008-05-29 Plexxikon, Inc. Compounds modulating c-fms and/or c-kit activity and uses therefor
HUE027892T2 (en) 2006-12-21 2016-10-28 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them and processes for their preparation and their use \ t
JP2010516296A (ja) 2007-01-30 2010-05-20 ヴェレニウム コーポレイション リグノセルロース性物質を処理する酵素、前記をコードする核酸並びに前記を製造及び使用する方法
WO2008109176A2 (en) 2007-03-07 2008-09-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
CN101688201B (zh) 2007-04-27 2013-08-21 加利福尼亚大学董事会 植物co2传感器、编码它们的核酸以及制造和使用它们的方法
CN101808994B (zh) 2007-07-17 2013-05-15 普莱希科公司 用于激酶调节的化合物和方法以及其适应症
US7507539B2 (en) 2007-07-30 2009-03-24 Quest Diagnostics Investments Incorporated Substractive single label comparative hybridization
EP2708602B1 (en) 2007-10-03 2019-02-27 BP Corporation North America Inc. Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN101946010B (zh) 2007-12-21 2014-08-20 哈佛大学 用于核酸测序的系统和方法
AU2008347234B2 (en) 2008-01-03 2015-05-28 Basf Enzymes Llc Transferases and oxidoreductases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8198062B2 (en) 2008-08-29 2012-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
EP2329259B1 (en) 2008-08-29 2016-04-20 Janssen Biotech, Inc. Markers and methods for assessing and treating ulcerative colitis and related disorders using a 20 gene panel
WO2010033200A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US20120052066A1 (en) 2008-11-07 2012-03-01 Cesar Calderon Markers and methods for assessing and treating lupus patients susceptible to photoprovocation
US8748094B2 (en) 2008-12-19 2014-06-10 President And Fellows Of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
KR101838670B1 (ko) 2009-03-09 2018-03-14 바이오아트라, 엘엘씨 미락 단백질
CN105237530A (zh) 2009-04-03 2016-01-13 豪夫迈罗氏公司 丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯-苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺组合物及其用途
CN102459303B (zh) 2009-05-21 2016-06-29 巴斯夫酶有限责任公司 肌醇六磷酸酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
WO2011038360A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Signature Genomics Laboratories Llc Multiplex (+/-) stranded arrays and assays for detecting chromosomal abnormalities associated with cancer and other diseases
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
US9056289B2 (en) 2009-10-27 2015-06-16 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
NZ599866A (en) 2009-11-06 2014-09-26 Plexxikon Inc Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
JP5660910B2 (ja) * 2010-03-30 2015-01-28 富士フイルム株式会社 放射線画像撮影用グリッドの製造方法
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
AR083354A1 (es) 2010-10-06 2013-02-21 Bp Corp North America Inc Polipeptidos variantes cbh i (celobiohidrolasas i) con reducida inhibicion de producto
WO2012109075A1 (en) 2011-02-07 2012-08-16 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
TWI558702B (zh) 2011-02-21 2016-11-21 普雷辛肯公司 醫藥活性物質的固態形式
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
BR112013029163A2 (pt) 2011-05-17 2017-01-31 Plexxikon Inc modulação quinase e indicações dos mesmos
US9150570B2 (en) 2012-05-31 2015-10-06 Plexxikon Inc. Synthesis of heterocyclic compounds
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP4397767A3 (en) 2012-08-14 2024-07-31 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014060483A1 (en) 2012-10-17 2014-04-24 Spatial Transcriptomics Ab Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2014124338A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Technologies, Inc. Polynucleotide barcode generation
US9267171B2 (en) 2013-02-28 2016-02-23 New York University DNA photolithography with cinnamate crosslinkers
CN111500680B (zh) 2013-06-25 2024-04-16 普罗格诺西斯生物科学公司 检测样品中生物靶标的空间分布的方法和系统
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US20160279068A1 (en) 2013-11-08 2016-09-29 President And Fellows Of Harvard College Microparticles, methods for their preparation and use
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
DE202015009609U1 (de) 2014-04-10 2018-08-06 10X Genomics, Inc. Mikrofluidisches System zur Erzeugung von Emulsionen
WO2015175375A1 (en) 2014-05-13 2015-11-19 Short Jay M Conditionally active biological proteins
CN106575322B (zh) 2014-06-26 2019-06-18 10X基因组学有限公司 核酸序列装配的方法和系统
EP3889325A1 (en) 2014-06-26 2021-10-06 10X Genomics, Inc. Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations
KR102615681B1 (ko) 2014-08-28 2023-12-18 바이오아트라, 인코퍼레이티드 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
WO2016036916A1 (en) 2014-09-03 2016-03-10 Bioatla, Llc Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts
KR20170073667A (ko) 2014-10-29 2017-06-28 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화 핵산 서열 분석을 위한 방법 및 조성물
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
KR102321863B1 (ko) 2015-01-12 2021-11-08 10엑스 제노믹스, 인크. 핵산 시퀀싱 라이브러리의 제조 방법 및 시스템 및 이를 이용하여 제조한 라이브러리
US10650912B2 (en) 2015-01-13 2020-05-12 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
EP3256606B1 (en) 2015-02-09 2019-05-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation
AU2016222719B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
SG11201705988UA (en) 2015-02-24 2017-08-30 Bioatla Llc Conditionally active biological proteins
US10697000B2 (en) 2015-02-24 2020-06-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
WO2016164641A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
EP3530752B1 (en) 2015-04-10 2021-03-24 Spatial Transcriptomics AB Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
WO2017019804A2 (en) 2015-07-28 2017-02-02 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
EP3362032A4 (en) 2015-10-13 2019-05-01 President and Fellows of Harvard College SYSTEMS AND METHODS OF MAKING AND USING GEL MICROSPHERES
WO2017096158A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
AU2016367147B2 (en) 2015-12-07 2021-04-08 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation, and indications therefor
SG11201806757XA (en) 2016-02-11 2018-09-27 10X Genomics Inc Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
MX2018013306A (es) 2016-05-13 2019-01-30 Bioatla Llc Anticuerpos anti-ror2, fragmentos de anticuerpos, sus inmunoconjugados y usos de los mismos.
TW201815766A (zh) 2016-09-22 2018-05-01 美商普雷辛肯公司 用於ｉｄｏ及ｔｄｏ調節之化合物及方法以及其適應症
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
AU2017395023B2 (en) 2016-12-23 2022-04-07 Plexxikon Inc. Compounds and methods for CDK8 modulation and indications therefor
EP3545089B1 (en) 2017-01-30 2022-03-09 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
CN110870018A (zh) 2017-05-19 2020-03-06 10X基因组学有限公司 用于分析数据集的系统和方法
US20180340169A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10428067B2 (en) 2017-06-07 2019-10-01 Plexxikon Inc. Compounds and methods for kinase modulation
EP3625361A1 (en) 2017-11-15 2020-03-25 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
CN108728330A (zh) * 2018-06-19 2018-11-02 东台德缘生物科技有限公司 一种用于哺乳动物细胞基因编辑载体构建的试剂盒
WO2020123311A2 (en) 2018-12-10 2020-06-18 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays using deconvolution
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
US11590505B2 (en) * 2019-05-31 2023-02-28 Illumina, Inc. System and method for storage
CN110716040B (zh) * 2019-10-31 2022-06-14 福建师范大学 一种基于MXene纳米片光热放大的邻近杂交双模式免疫传感器的制备及应用
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
ES2946357T3 (es) 2019-12-23 2023-07-17 10X Genomics Inc Métodos para el análisis espacial usando ligación con molde de ARN
US20210190770A1 (en) 2019-12-23 2021-06-24 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for using fixed biological samples in partition-based assays
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US12076701B2 (en) 2020-01-31 2024-09-03 10X Genomics, Inc. Capturing oligonucleotides in spatial transcriptomics
US12110541B2 (en) 2020-02-03 2024-10-08 10X Genomics, Inc. Methods for preparing high-resolution spatial arrays
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US12129516B2 (en) 2020-02-07 2024-10-29 10X Genomics, Inc. Quantitative and automated permeabilization performance evaluation for spatial transcriptomics
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
EP4139485B1 (en) 2020-04-22 2023-09-06 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
AU2021275906A1 (en) 2020-05-22 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
EP4172362B1 (en) 2020-06-25 2024-09-18 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN113008595B (zh) * 2021-02-26 2023-07-07 中冶东方工程技术有限公司 一种冶金行业的机器人综合取制样系统及方法
EP4347879A1 (en) 2021-06-03 2024-04-10 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, kits, and systems for enhancing analyte capture for spatial analysis
EP4196605A1 (en) 2021-09-01 2023-06-21 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN116153411B (zh) * 2023-04-18 2023-06-30 北京携云启源科技有限公司 多病原体探针库组合的设计方法及应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5002867A (en) * 1988-04-25 1991-03-26 Macevicz Stephen C Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes
NO164622C (no) * 1988-05-11 1990-10-24 Tore Lindmo Binaer immunometrisk partikkelbasert metode for maaling av spesifikke serum-antigener ved hjelp av vaeskestroemsmikrofotometri og et ferdigpreparert maaloppsett derav.
AU4181089A (en) * 1988-08-01 1990-03-05 George D. Cimino Identification of allele specific nucleic acid sequences by hybridization with crosslinkable oligonucleotide probes
DK0834576T3 (da) * 1990-12-06 2002-04-22 Affymetrix Inc A Delaware Corp Påvisning af nukleinsyresekvenser
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5503980A (en) * 1992-11-06 1996-04-02 Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
AU694146B2 (en) * 1993-09-27 1998-07-16 Arch Development Corporation Methods and compositions for efficient nucleic acid sequencing
KR970702375A (ko) * 1994-03-24 1997-05-13 알렉미안 Dna 멜토메터 및 이것의 사용방법(a dna meltometer and methods of use thereof)
CA2186465A1 (en) * 1994-04-04 1995-10-12 Richard A. Martinelli Hybridization-ligation assays for the detection of specific nucleic acid sequences
US5545531A (en) * 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005537799A (ja) * 2002-09-09 2005-12-15 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 遺伝子解析および認証方法
JP4741233B2 (ja) * 2002-09-09 2011-08-03 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 遺伝子解析および認証方法
JP2010117167A (ja) * 2008-11-11 2010-05-27 Sharp Corp 電気泳動装置およびその構成器具
JP2018533965A (ja) * 2015-11-16 2018-11-22 リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
JP2022023083A (ja) * 2015-11-16 2022-02-07 リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
JP7315326B2 (ja) 2015-11-16 2023-07-26 リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
US11725233B2 (en) 2015-11-16 2023-08-15 Revere Biosensors, Llc Systems and methods for identifying and distinguishing genetic samples
JP7434243B2 (ja) 2015-11-16 2024-02-20 リヴィア バイオセンサーズ，エルエルシー 遺伝子サンプルを識別且つ区別するためのシステムと方法
WO2023238921A1 (ja) * 2022-06-10 2023-12-14 壽文 池田 ペプチド核酸（ｐｎａ）センサーチップ及びその製造方法

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