JP2001507227A - 小脳および胚に特異的なタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、心筋因子スーパーファミリーのメンバーである、新規な小脳および胚に特異的な(CESP)タンパク質に関する。特に、ヒトCESPタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。CESPポリペプチドもまた、同じものを産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法と同様に提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 小脳および胚に特異的なタンパク質 発明の背景 発明の分野 本発明は新規の内皮因子に関する。より詳細には、ヒト小脳および胚に特異的 なタンパク質をコードする、単離された核酸分子が提供される。小脳および胚に 特異的なポリペプチドもまた提供され、同様にベクター、宿主細胞、ならびにこ れらのタンパク質を産生するための組換え方法が提供される。小脳および胚に特 異的タンパク質関連疾患に関する診断方法および治療方法もまた、提供される。 関連技術 心筋壊死は血栓による冠動脈の閉塞から生じ、これはしばしばプラーク破裂の 後に不安定なアテローム性動脈硬化症プラークを形成する。破裂および血栓症を 最も導きやすいプラークは、最初は緩和な狭窄症であるのみであり得る（すなわ ち50％または60％狭窄）。しかし心筋の損傷は、傷害の「波面（wave front）」 として迅速に進行し、心内膜から心外膜に移動し、そして副行血液の供給によっ て梗塞の領域が適切に栄養補給されない限り、またはその動脈の再開通（すなわ ち再血管形成）が達成されない限り、３〜４時間以内に完了し、そして不可逆的 になり得る。Rogers．W.J.Am.J.Med.99:195-206（1995）を参照のこと。しかし 、代表的には、副行循環は重度の冠動脈狭窄が発症するまでは、発生しない（Sc haper、W.、European Heart J.16:66-68(1995)）。 冠状血管形成の１つのモデルにおいて、血管形成は以下を含む３つの主要な段 階を通じて生じる：１）血管拡張および内皮細胞活性化；２）新規血管チャネル の形成；ならびに３）新規血管の成熟および全血管細胞の最終的分化(Rakusan、 K.、Coronary Angiogenesis：From Morphometry to Molecular Biology and Bac k:Claycomb、W.C.およびDi Nardo、P.編、Ann.New York Acad.Sci.752:257-266 (1995)）。血管形成、および特に冠動脈血管形成を促進する薬剤は、血管疾患、 および特に心疾患で苦しむ患者に治療的に価値がある。このような薬剤は、副行 循環の形成を促進し、および冠動脈閉塞の病理学的な影響を緩解する。 経皮的冠動脈形成術（PTCA）は、冠動脈閉塞および心筋壊死に一般的に用いら れる再血管形成処置である。しかし、PTCAの後の冠動脈管腔狭窄（再狭窄）は不 運な合併症であり、これは多くの患者に生じる（Rensing、B.J．ら、Circulatio n 88:975-985（1993））。再狭窄を予防および治療するのに用いられ得る治療薬 剤に対する必要性が残存する。 発明の要旨 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または1996年９月23日の細菌 宿主中のATCC受託番号97728として寄託されたcDNAクローンによってコード化さ れるアミノ酸配列を有する小脳および胚に特異的なタンパク質（本明細書中以下「 CESP」）をコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。 本発明はまた、本発明で単離した核酸分子を含む組換えベクター、およびこの 組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞を 作製する方法、ならびに組換え技術によるCESPポリペプチドまたはペプチドを産 生するためにこのベクターを使用するための方法に関する。 本発明はさらに、本明細書中に記載されたポリヌクレオチドによってコードさ れるアミノ酸配列を有する単離されたCESPポリペプチドを提供する。 多くのCESP関連障害について、CESP関連障害を有さない個体からの組織および 体液中の「標準」CSEP遺伝子発現レベル、すなわちCESP発現レベルに比較して、 CESP遺伝子発現の有意により高いまたはより低いレベルが、そのような障害を有 する個体から得た特定の組織（例えば、心臓、腎尿細管、腎糸球体、血管内皮、 および大静脈上皮）または体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、滑液、または 髄液および羊水）において検出され得ることが考えられる。従って、本発明は、 CESP関連疾患の診断中に有用な診断方法を提供し、これは以下の工程を含む： （ａ）個体の細胞、または体液中のCESP遺伝子発現レベルをアッセイする工程； （ｂ）このCESP遺伝子発現レベルを標準的なCESP遺伝子発現レベルと比較する工 程、これにより標準発現レベルと比較されたアッセイしたCESP遺伝子発現レベル の増加または減少がCESP関連疾患の指標となる。 本発明のさらなる局面は、体内に増加したレベルのCESP活性を必要とする個体 を処置する方法に関し、これはこのような個体に治療有効量の単離された本発明 のCESPポリペプチドまたはそのアゴニストを含む組成物を投与する工程を包含す る。 図面の簡単な説明 図1A-1Cは、CESPのヌクレオチド配列（配列番号１）および推定アミノ酸配列 （配列番号２）を示す。タンパク質は、約21アミノ酸残基（下線部）のリーダー 配列を有し、これは推定分子量が約38kDaである。成熟CESPタンパク質の予想ア ミノ酸配列もまた示す。 図２は、CESPタンパク質のアミノ酸配列と機能が未知であるニワトリ遺伝子（ Genbank受託番号D26311;配列番号３）との間の類似性の領域を示す。 図３はCESPアミノ酸配列の分析を示す。α、β、ターンおよびコイル領域；親 水性および疎水性；両親媒性領域；可撓性領域；抗原性指数および表面確率を示 す。「抗原性指数−Jameson-Wolf」グラフにおいて、図１中のアミノ酸残基約20 〜約86、約92〜約126、約135〜約157、約169〜約190、約195〜約219、約234〜約 250、約255〜約274、および約288〜約336は、示されたCESPレセプタータンパク 質の高度に抗原性の領域に対応する。図１中のこれらの高度に抗原性のフラグメ ントは、配列番号２における以下のフラグメントにそれぞれ対応する：アミノ酸 残基約-1〜約65、約71〜約105、約114〜約136、約148〜約169、約174〜約198、 約213〜約229、約234〜約253、および約267〜約315。 詳細な説明 本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。本発明のCE SPタンパク質は、機能が未知であるニワトリ遺伝子（図２；配列番号３）（Genb ank受託番号D26311）と配列相同性を共有する。 配列番号２中のアミノ酸配列は、CESP cDNAクローンHHFHG78の配列から推測さ れた。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、HHFHG78クローンを配列決定 することによって得られた。これは、1996年９月23日に、アメリカンタイプカル チャーコレクション12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852に寄託 され、そして受託番号第97728号を与えられた。このクローンにおいて、CESP配 列は、pBluescript SK(-)プラスミド(Stratagene，LaJolla，CA)のポリリンカー 中のEco RI部位とXho I部位との間に含まれる。 核酸分子 他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定 されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機（例えば、Applied B iosystems，Inc.からのModel 373）を用いて決定され、そして本明細書中で決定 されるDNA分子によってコードされるポリペプチドの全てのアミノ酸配列は、上 記のように決定されるDNA配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化 アプローチによって決定された任意のDNA配列について当該分野において公知の ように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含 み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるDNA分 子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90％の同一、よ り代表的には少なくとも約95％から少なくとも約99.9％の同一である。実際の配 列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによ ってより正確に決定され得る。当該分野においてもまた公知のように、実際の配 列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、 ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定 されたヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、その ような挿入または欠失の点で始まる配列決定されるDNA分子によって実際にコー ドされるアミノ酸配列とは完全に異なる。 本明細書中で提供される情報（例えば、配列番号１中のヌクレオチド配列）を 用いて、CESPポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、標準的なクローニ ングおよびスクリーニング手順（例えば、開始物質としてmRNAを用いるクローニ ングcDNAのための手順）を用いて得られ得る。本発明の例示として、配列番号１ において記載される核酸分子は、ヒト胎児心臓由来のcDNAライブラリー中で発見 された。配列番号１のCESP cDNAの決定されたヌクレオチド配列は、350アミノ酸 残基で約38kDaの推定分子量のタンパク質をコードするオープンリーディングフ レームを含む。配列番号２中に示されるCESPタンパク質は未知のニワトリ遺伝子 （Genbank受託番号D26311）（図２；配列番号３）に約58％同一、および約74％ 類似であった。 本発明はまた、本発明のCESPタンパク質の成熟形態を提供する。シグナル仮説 によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、シグナルまたは分泌 リーダー配列を有し、これは粗面小胞体を介して成長するタンパク質鎖の輸送が 一旦開始されると、成熟タンパク質から切断される。ほとんどの哺乳動物細胞、 および昆虫細胞でさえ、同様の特異性を有して分泌されたタンパク質を切断する 。しかしある場合には、分泌されたタンパク質の切断は完全に均一ではなく、こ れはタンパク質において２つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌されたタンパ ク質の切断特異性が、最終的には完全なタンパク質の一次構造によって決定され ること、すなわち、ポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが長く公知で ある。それゆえ、本発明は、ATCC受託番号97728として同定され、配列番号２に 示される宿主中に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有 する成熟CESPポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。ATCC受託 番号97728のように同定された宿主中に含まれるcDNAクローンによってコードさ れるアミノ酸配列を有する成熟CESPタンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、以下 に記載するようなCOS細胞）中での、寄託した宿主中のベクターに含まれるクロ ーンのヒトDNA配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレーム の発現によって産生される、CESPタンパク質の成熟形態を意味する。以下に示す ように、ATCC受託番号97728中に含まれるcDNAクローンによってコードされるア ミノ酸配列を有する成熟CESPタンパク質は、配列番号２に示される推定「成熟」 CESPタンパク質（配列番号２の約１〜約329のアミノ酸）と異なっていても、ま たは異なっていなくてもよく、これはコンピューター分析に基づいた推定切断部 位の正確さに依存する。 タンパク質が分泌リーダー配列、ならびにリーダー配列の切断点を有するかど うかを推定する方法は有用である。例えば、McGeoch（Virsu Res.3:271-286(198 5)）およびVon Heinje(Nucleic Acids Res.14:4683-4690(1986))の方法が用いら れ得る。これらの方法のそれぞれの既知の哺乳動物分泌タンパク質の切断点の推 定の正確さは、75〜80％の範囲内である。Von Heinje、前出。しかし、２つの方 法は、必ずしも所定のタンパク質について同じ切断点を生じない。 本発明の場合において、本発明の完全CESPポリペプチドの推定アミノ酸配列は コンピュータープログラム(「PSORT」）（K.NakaiおよびM.Kanehisa、Genomics 14:897-911(1992)）（これはアミノ酸配列に基づくタンパク質の細胞内局在を推 定するための専門システムである）によって分析された。このコンピューターを 利用した局在の推定の一部として、McGeochおよびVon Heinjeの方法が援用され る。PSORTプログラムによる分析は、配列番号２中の−１および１の間のアミノ 酸に切断部位を推定した。その後、完全なアミノ酸配列は、さらにVon Heinjeの (-1、-3)原則の簡単な形態を適用して視覚的検査によって分析される。Von Hein je前出。従って、CESPタンパク質のためのリーダー配列は配列番号２中のアミノ 酸残基−21から−１からなると推定され、一方推定成熟CESPタンパク質は配列番 号２中の約１から約329の残基からなる。 当業者が理解するように、上記の配列決定誤差の可能性、ならびに異なる公知 のタンパク質におけるリーダーの切断部位の可変性に起因して、全長CESPポリペ プチドは、約350のアミノ酸を含むが、335〜365の範囲のアミノ酸で任意の場所 であり得る；そしてこのタンパク質の推定リーダー配列は、約21アミノ酸である が、約14〜約50アミノ酸の範囲の任意の場所であり得る。 示されるように、本発明の核酸分子は、RNA（例えば、mRNA）の形態、またはD NAの形態（例えば、cDNA、およびクローニングによって得られるか、または合成 的に生成されるゲノムDNAを含む）で存在し得る。DNAは、二本鎖または一本鎖で あり得る。一本鎖DNAまたはRNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であ り得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であ り得る。 「単離された」核酸分子によって、その天然の環境から取り出された核酸分子 、 DNA、またはRNAが意図される。例えば、ベクター中に含まれた組換えDNA分子は 、本発明の目的のために単離されたと見なされる。さらに単離されたDNA分子の 例には、異種宿主細胞中で維持された組換えDNA分子、または溶液中の（部分的 または実質的に）精製されたDNA分子が挙げられる。単離されたRNA分子にはイン ビボまたはインビトロでの本発明のDNA分子のRNA転写物がさらに含まれる。本発 明による、単離された核酸分子には、合成的に産生されたような分子が含まれる 。 本発明の単離された核酸分子は、配列番号１において示されるオープンリーデ ィングフレーム(ORF)を含むDNA分子；配列番号２（最後の329アミノ酸）におい て示される成熟CESPタンパク質のためのコード配列を含むDNA分子；そして上記 のDNA分子とは実質的に異なる配列を含むが、遺伝コードの縮重に起因してさら にCESPタンパク質をコードする。当然のことながら、遺伝コードは当該分野にお いて周知である。従って、このような縮重した変異体を生成することは、当業者 にとって日常的である。 別の局面において、本発明は、1996年９月23日にATCC受託番号97728として寄 託されたプラスミド中に含まれるcDNAクローンによってコードされるようなアミ ノ酸配列を有するCESPポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する 。さらなる実施態様において、この核酸分子は成熟ポリペプチドまたはＮ末端メ チオニンを欠損する全長ポリペプチドをコードする。本発明はさらに、配列番号 １に示されるヌクレオチド配列または上記の寄託されたクローン中に含まれるCE SP cDNAの核酸配列を有する単離された核酸分子、あるいは上記の配列の１つに 相補的な配列を有する核酸分子を提供する。このような単離された分子、特にDN A分子は染色体を用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる遺伝子マッ ピング用の、およびヒト組織中、例えばノーザンブロット分析によるCESP遺伝子 の発現を検出するためのプローブとして有用である。 本発明はさらに、本明細書中で記載される単離された核酸分子のフラグメント に関する。寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、または配列番号１に示されるヌ クレオチド配列を有する単離された核酸分子のフラグメントにより、少なくとも 約15nt、およびより好ましくは少なくとも約20nt、なお好ましくは少なくとも約 30nt、ならびにさらにより好ましくは、少なくとも約40nt長のフラグメントが意 図され、これらは本明細書中に記載される診断プローブおよびプライマーとして 有用である。当然のことながら、より長いDNAフラグメント50、100、150、200、 250、300、350、400、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、85 0、900、950、1000、1050、または1100nt長の配列もまた、寄託されたcDNA、ま たは配列番号１に示される、全てではないにしろ、ほとんどのヌクレオチド配列 に対応するフラグメントのように、本発明に従って有用である。例えば、少なく とも20ntの長さのフラグメントによって、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列、 または配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列由来の20以上の連続的な塩 基を含むフラグメントが意図される。 本発明の好ましい核酸フラグメントにはまた、CESPタンパク質のエピトープ保 有部分をコードする核酸分子が含まれる。特に、本発明のこのような核酸フラグ メントには、以下をコードする核酸分子が含まれる：配列番号２におけるアミノ 酸約-１〜約65のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約71〜 約105のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約114〜約136の アミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約148〜約169のアミノ酸 残基を含むポリペプチド；配列番号２における約174〜約198のアミノ酸残基を含 むポリペプチド；配列番号２における約213〜約229のアミノ酸残基を含むポリペ プチド；配列番号２における約234〜約253のアミノ酸残基を含むポリペプチド； 配列番号２における約267〜約315のアミノ酸残基を含むポリペプチド。 さらに、本発明者らは配列番号１のコード領域の広範な部分に関する：HHFBI5 5Ra（配列番号12）;HHFDB95R（配列番号13）;HUSFC71R（配列番号14）；およびH CE2S01R（配列番号15）。本発明者らは、配列番号１の非コード領域の広範な部 分に関する以下のcDNAクローンを同定した：HCEB157R（配列番号16）。 以下の公開のEST（配列番号１のコード領域の部分に関する）はすでに同定さ れている：GenBank受託番号W61032（配列番号17）;GenBank受託番号AA349552（ 配列番号18）；GenBank受託番号R52311（配列番号19）；GenBank受託番号AA3516 24（配列番号20）；GenBank受託番号C05172（配列番号21）；GenBank受託番号T3 3818（配列番号22）；GenBank受託番号AA324686（配列番号23）；GenBank受託番 号Z42237（配列番号24）；GenBank受託番号T30923（配列番号25）；GenBank受 託番号AA226979（配列番号26）；GenBank受託番号W45085（配列番号27）；GenBa nk受託番号T31076（配列番号28）；GenBank受託番号T08793（配列番号29）；Gen Bank受託番号R14945（配列番号30）；GenBank受託番号AA031480（配列番号31） ；GenBank受託番号AA424460（配列番号32）；GenBank受託番号C05296（配列番号 33）；GenBank受託番号R58671（配列番号34）；GenBank受託番号T18925（配列番 号35）；GenBank受託番号R57834（配列番号36）。 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条 件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ATCC受託番号第97728号に含まれるc DNAクローン）中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオ チドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼ ーション条件」によって、以下：50％ホルムアミド、５×SSC（150mMのNaCl、15 mMのクエン酸三ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、５×デンハー ト液、10％硫酸デキストラン、および20g/mlの変性剪断サケ精子DNA、を含む溶 液中で42℃にて一晩のインキュベーション、続く約65℃での0.1×SSC中において フィルターを洗浄することが意図される。 ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって 、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ま しくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさら により好ましくは30、40、50、60、または70ntにハイブリダイズするポリヌクレ オチド（DNAまたはRNAのいずれか）が意図される。これらは、以上、および以下 でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用であ る。 例えば、「少なくとも20nt長」のポリヌクレオチドの一部により、参照ポリヌ クレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたcDNA、または配列番号１に 示されるようなヌクレオチド配列）由来の20以上の連続したヌクレオチドが意図 される。当然のことながら、ポリＡ配列（例えば、配列番号１に示されるCESP c DNAの3'末端ポリ（A）トラクト）にのみ、あるいはT（またはU）残基の相補的伸 長にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダ イズさせるために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら 、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（A）伸長またはその相補体（例えば、 特 に任意の二本鎖cDNAクローン）を含む任意の核酸分子にハイブリダイズするから である。 示されるように、CESPポリペプチドをコードする本発明の核酸分子は、成熟ポ リペプチドそれ自体のアミノ酸配列をコードする核酸を含み得るが、これらに限 定されない；成熟ポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、プレ タンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレプロタンパク質配列のよう 約21アミノ酸リーダー配列あるいは分泌配列をコードする配列）；成熟ポリペプ チドのコード配列で、さらなる非コード配列とともに上記のさらなるコード配列 を含むかまたは含まず、この配列は、例えば、イントロンおよび非コード5'およ び3'配列（転写、mRNAプロセシング（スプライシングおよびポリアデニル化シグ ナル（例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性を含む）において役割を担う 転写された非翻訳配列））を含むがこれらに限定されない；さらなる機能性を提 供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、ポリ ペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチド の精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの 局面の特定の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサーヒ スチジンペプチド（例えば、pQEベクター(Qiagen，Inc.)において提供されるタ グ）であり、とりわけ、それらの多くは市販されている。例えば、Gentzら、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 86：821-824(1989)において記載されるように、ヘキ サヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、イン フルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有 用な別のペプチドであり、これは、Wilsonら、Cell 37:767(1984)によって記載 されている。以下で考察されるように、他のそのような融合タンパク質には、Ｎ 末端またはＣ末端にてFcに融合されたCESPタンパク質が含まれる。 本発明は、さらに、CESPタンパク質の一部、アナログ、または誘導体をコード する本発明の核酸分子の変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体の ように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所 定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代わりの形態の１つが意図される。Ge nes II，Lewin，B.編、John WileyおよびSons，New York(1985)。天然に存在し ない変異体は、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。 このような変異体には、１つ以上のヌクレオチドを含み得る、ヌクレオチド置 換、欠失、または付加により産生される変異体が含まれる。変異体は、コード領 域、非コード領域、または両方において改変され得る。コード領域における改変 は、保存または非保存アミノ酸置換体、欠失体、または付加体を産生し得る。こ れらの間で特に好ましいのは、サイレントな置換体、付加体、または欠失体であ り、これらは、CESPタンパク質、またはそれらの一部の特性および活性を変化さ せない。この点に関してまた特に好ましいのは、保存的置換体である。 本発明のさらなる実施態様は、以下のものに少なくとも95％同一、より好まし くは少なくとも96％、97％、98％、または99％同一であるヌクレオチド配列を有 するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む、（ａ）推定リーダー配 列を含む配列番号２中の完全なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列（-21〜329のアミノ酸残基）；（ｂ）配列番号２中の、Ｎ末端 メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオ チド配列（アミノ酸残基−20〜329）；（ｃ）配列番号２中の1〜329位のアミノ 酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ATCC受託番 号97728に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有 するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ATCC受託番号97728に 含まれるcDNAクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟CESPポリ ペプチドをコードするヌクレオチド配列；あるいは（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ ）、（ｄ）、または（ｅ）中のヌクレオチド配列のいずれか１つに相補的なヌク レオチド配列。 CESPポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、 95％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、ポリヌク レオチド配列が、CESPポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100 ヌクレオチドあたり５つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチ ドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれ ば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有す るポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５％までのヌクレオチドが 欠失され得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列に おいて全ヌクレオチドの５％までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入さ れ得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端 位置でか、または参照配列内のヌクレオチド間で個々に、または参照配列内の１ 以上の連続した群でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで 生じ得る。 実際には、任意の特定の核酸分子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列 または寄託されたcDNAクローンのヌクレオチド配列に少なくとも95％、96％、97 ％、98％、または99％同一であるかどうかは、例えば、Bestfitプログラム（Wis consin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711） のような公知のコンピュータープログラムを用いて従来通りに決定され得る。Be stfitは、SmithおよびWaterman，Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の相同性の最適のセ グメントを見出す。Bestfitまたは任意の他の配列整列プログラムを使用して、 特定の配列が、例えば本発明による参照配列に95％同一であるか否かを決定する 場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全 長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の５％まで の相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。 本願は、配列番号１に示される核酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列と 少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一である核酸分子に関する。 これは、特定の核酸分子がCESP活性を有するポリペプチドをコードしない場合で さえ、当業者は、核酸分子の使用法（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ 、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマーとして）をなお知るからであ る。CESP活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用とし ては、とりわけ(i)CESP遺伝子またはその対立遺伝子変異体をcDNAライブラリー から単離すること；(2)Vermaら，Human Chromosomes:A Manual of Basic Techni ques，Pergamon Press，New York(1988)に記載のように、CESP遺伝子の正確な染 色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブ リダイゼーション(例えば、「FISH」)；および、(3)特定の組織におけるCESP mR NA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。 しかし、核酸分子は、配列番号１に示される核酸配列、または実際CESP活性を 有するポリペプチドをコードする寄託されたcDNAの核酸配列に、少なくとも95％ 、96％、97％、98％または99％同一である配列を有することが好ましい。「CESP 活性を有するポリペプチド」とは、特定の生物学的アッセイにおいて活性を示す ポリペプチドを意図する。例えば、タンパク質活性は、Sueishiらにより記載さ れる（Japanese Circulation J.56:192-198(1992)）ように、血管形成について の形態計測学的定量的インビトロアッセイを使用して測定され得る。本アッセイ は、再構成された内皮下マトリックスとしてＩ型コラーゲンゲルを用いた培養系 中の血管形成モデルを利用する。毛細管様管状構造の長さは、画像分析機を使用 して形態計測的に測定される。手短には、このアッセイは、毛細管内皮細胞（例 えば、ウシ副腎皮質または別の適切な供給源由来）の単離および培養、候補タン パク質の細胞培養物への投与、ならびに位相差顕微鏡写真を用いた管状構造全長 の形態測定的測定を含む。 もちろん、遺伝コードの縮重に起因して、当業者は、配列番号１に示される核 酸配列、または寄託されたcDNAの核酸配列に少なくとも95％、96％、97％、98％ 、または99％同一である配列を有する多数の核酸分子が、CESPタンパク質活性を 有するポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際に、これらのヌク レオチド配列の縮重改変体は全て、同じポリペプチドをコードするので、これは 上記の比較アッセイを実施することなくとも当業者に明らかである。縮重改変体 でないそのような核酸分子について、合理的な数がまたCESPタンパク質活性を有 するポリペプチドをコードすることが、当該分野でさらに認識される。これは、 当業者が、タンパク質の機能により低い有意性で影響しそうであるか、または有 意には影響しそうにないかのいずれかのアミノ酸置換（例えば、１つの脂肪族ア ミノ酸の第二の脂肪族アミノ酸への置換）を充分に知っているからである。 例えば、どのように表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製するかに関す るガイダンスは、Bowie，J.U．ら”Deciphering the Message in Protein Seque nces:Tolerance to Amino Acid Substitutions”Science 247:1306-1310(1990) に提供される。その中で著者らはタンパク質がアミノ酸置換に驚異的に寛容であ ることを示している。 ベクターおよび宿主細胞 本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクター で遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術によるCESPポリペプチドまたは そのフラグメントの産生に関する。 ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクター に結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物の ような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクター がウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてイン ビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。 DNAインサートは、適切なプロモーター（例えば、少し名を挙げると、ファー ジλPLプロモーター、E.coli lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプ ロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウ イルスLTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプ ロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終 結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む 。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは翻訳される べきポリペプチドの始めに転写開始を含み、そして終わりに適切に配置される終 止コドン（UAA、UGA、またはUAG）を含む。 示されるように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカー を含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉 酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、ならびにE.coliおよび他の細菌におけ る培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が 挙げられる。適切な異種宿主の代表的な例としては、細菌細胞（例えば、E.coli 細胞、Streptomyces細胞、およびSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例 えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophlia S2細胞およびSpodoptera Sf9 細胞）；動物細胞（例えば、CHO細胞、COS細胞、およびBowes黒色腫細胞）；な らびに植物細胞が挙げられるが、それらに限定されない。上記の宿主細胞のため の適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。 細菌における使用に好ましいベクターの中には、pQE70、pQE60、およびpQE-9 （Qiagenから入手可能）;pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベク ター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）;ならびにpt rc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が含ま れる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNE0、pSV2CAT、p0G44、pXT1、お よびpSG（Stratageneから入手可能）;ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL （Pharmaciaから入手可能）がある。他の適切なベクターは、当業者に容易に明 らかである。 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクシ ョン、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって行われ 得る。このような方法は、Davisら，Basic Methodsin Molecular Biology(1986) のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。 ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変型において発現し得、そして分 泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能性領域も含み得る。例えば、さらなる アミノ酸領域、特に荷電されたアミノ酸は、精製の間またはその後の取り扱いお よび保存の間の宿主細胞中での安定性および持続性改善のために、ポリペプチド のN-末端に付加され得る。さらに、ペプチド部分は、精製を容易にするためにポ リペプチドに付加され得る。このような領域は、ポリペプチドの最終調製以前に 除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じさせるため、または安定性を改 善し精製を容易にするために、ペプチド部分をポリペプチドに付加することは、 当業者に公知であり、そして日常技術である。好ましい融合タンパク質は、タン パク質の溶解化に有用である、免疫グロブリンからの異種領域を含む。例えば、 EP-A-0464533(カナダ対応特許2,045,869)は、免疫グロブリン分子の様々の定常 領域部と、別のヒトタンパク質またはその部分とを共にを含む融合タンパク質を 開示する。多くの場合、融合タンパク質におけるFc部は、治療適用および診断適 用において大いに有利であり、従って例えば、薬物動態学的特性（EP-A 0232 26 2）の改良をもたらす。他方、いくつかの使用について、記載された有利な様式 で融合タンパク質が発現、検出および精製された後に、Fc部を除去し得ることが 、望ましい。これは、治療および診断での使用に対して、Fc部が障害になる場合 、例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用されることになる場 合がある。薬物の発見において、例えば、hIL-5のようなヒトタンパク質は、hIL -5アンタゴニスを同定するための高処理量スクリーニングアッセイを目的に、Fc 部分と融合された。D.Bennettら,Journal of Molecular Recognition,第8巻:52- 58(1995)およびK.JohansonらThe Journal of Biological Chemistry，第270巻， 第16号:9459-9471(1995)を参照のこと。 CESPタンパク質は、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは 陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水 性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテイークロマトグラフィー、ヒドロキ シアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周 知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好 ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）が精製のために用いられる 。本発明のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核 生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆 虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を 含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチ ドは、グリコシル化されていても、またはグリコシル化されていなくてもよい。 さらに、本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結 果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。 CESPポリペプチドおよびフラグメント 本発明は、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有する、単離 されたCESPポリペプチド、もしくは、配列番号２のアミノ酸配列、または上記の ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドをさらに提供する。 タンパク質の構造または機能に有意な差異を与えずに、CESPポリペプチドのい くつかのアミノ酸配列を変更し得ることが、当該分野において認識され得る。こ のような配列の差異が意図される場合、そのタンパク質上に、活性を決定する 重要な領域が存在することを留意するべきである。 従って、本発明は、CESPポリペプチドの改変体をさらに包含する。この改変体 は、実質的CESPポリペプチド活性を示すか、また下記で記載したタンパク質部分 のようなCESPタンパク質の領域を含む。このような変異体は、欠失、挿入、逆位 、重複および型置換を含む。上記に記載されるように、どのアミノ酸変化が表現 型的にサイレントであるようであるかに関するガイダンスは、Bowie J.U.らの"D eciphering the Message in Protein Sequences:Tolerance to Aminoacid Subst itutions"Science 247:1306-1310(1990)の中に見出し得る。 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、 あるいは寄託されたcDNAにコードされたものは、以下のものであり得る。(i)１ つ以上のアミノ酸残基が、保存的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基（好 ましくは、保存的アミノ酸残基）によって置換され、そしてこのような置換アミ ノ酸残基は遺伝コードでコードされたものでもされてないものでもあり得る、ま たは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または(iii)成熟ポリペ プチドが、ポリペプチドの半減期をを増加させるような別の化合物（例えば、ポ リエチレングリコール）と融合されたもの、または(iv)さらなるアミノ酸が成熟 ポリペプチドと融合されたもの（例えば、IgG Fc融合領域ペプチド、またはリー ダーもしくは分泌配列、または成熟ポリペプチドの精製に利用される配列、また はプロタンパク質配列）。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、 本明細書の教示から、当業者の範囲に含まれるとみなされる。 荷電アミノ酸を、別の荷電アミノ酸および中性または陰性荷電アミノ酸と置換 することは特に興味深い。後者は、タンパク質の陽電荷の低下をもたらし、CESP タンパク質の特性が改善される。凝集の防止は非常に望ましい。タンパク質の凝 集は活性の消失をもたらすだけでなく、薬学的処方物を調製する場合、免疫原性 になり得るために問題ともなり得る(PinckardらClin.Exp.Immunol.2:331-340(19 67);RobbinsらDiabates 36:838-845(1987);ClelandらCrit．Rev．Therapeutic D rug Carrier Systems 10:307-377(1993))。 アミノ酸の置き換えはまた、細胞表面レセプターへの結合選択性を変化し得る 。Ostadeら（Nature 361:266-268(1993)）は、特定の変異が、TNFレセプターの 既 知の型の２つのうちの１つのみに対するTNF-αの選択的結合をもたらしたと記載 している。従って、本発明のCESPタンパク質は、自然変異あるいは人為的操作の いずれかに由来する、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る 。 記載したように、タンパク質の折り畳みまたは活性に有意な影響を与えない保 存的アミノ酸の置換のような、性質の軽微な変化が好ましい（表１参照のこと） 。 本発明のCESPタンパク質における、機能に必須のアミノ酸は、例えば、部位特 異的変異誘発、またはアラニンスキャニング変異誘発（CunninghamおよびWells, Science 244:1081-1085(1989)）のような、当該分野において公知の方法によっ て同定し得る。後者の手順は、分子内の全ての残基に１つずつアラニン変異を導 入する。次いで、得られた変異分子は、レセプター結合性もしくはインビトロ、 またはインビトロ増殖活性のような生物学的活性について試験される。リガンド −レセプター結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標 識（SmithらJ.Mol.Biol.224:899-904(1992)）およびde VosらScience 255:306-3 12(1992))のような構造分析によって同定され得る。 表１ 保存的アミノ酸置換 当然ながら、当業者が行うアミノ酸置換の数は、上記のものを含めた多くの要 因に依存する。一般的に、任意の所与のCESPポリペプチドについてのアミノ酸置 換の数は、50、40、30、20、10、５、または３を超えない。 本発明のCESPタンパク質における、機能に必須のアミノ酸は、例えば、部位特 異的変異誘発、またはアラニンスキャニング変異誘発（Cunningham and Wells,S cience 244:1081-1085(1989)）のような、当該分野において公知の方法によって 同定し得る。後者の手順は、分子内の全ての残基に一つずつアラニン変異を導入 する。次いで、得られた変異分子は、インビトロでの増殖活性のような生物学的 活性について試験される。 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供される。「単離 されたポリペプチド」は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドを意図 する。従って、組み換え宿主細胞において産生、または含有されるポリペプチド は、本発明の目的のために「単離された」ものとみなされる。さらに、組み換え 宿主、あるいは天然の供給源から、部分的または実質的に精製されたポリペプチ ドも「単離された」ものと意図される。例えば、組み換え的に産生されたCESPポ リペプチドのバージョンは、SmithおよびJohnso、Gene 67:31-40(1988)に記載の 一段階方法によって実質的に精製され得る。 本発明のポリペプチドは、寄託されたcDNAによってコードされる完全なポリペ プチド；寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポリペプチド；配列番号２の −21から329のアミノ酸残基；配列番号２の−20から329のアミノ酸残基；および 配列番号２の１から329のアミノ酸残基；ならびに、寄託されたcDNAによってコ ードされるポリペプチド、および配列番号２のポリペプチドに対して少なくとも 95％同一、そして、より好ましくは、少なくとも96％、97％、98％または99％同 一であるものを含み、そしてまた、少なくとも30アミノ酸、および、より好まし くは少なくとも50のアミノ酸を有する、そのようなポリペプチドの部分を含む。 ポリペプチドが、CESPポリペプチドの参照アミノ酸配列と、少なくとも、例え ば、95％「同一」のアミノ酸配列を有することによって、そのポリペプチドのア ミノ酸配列は、参照配列と同一であることが意図される。ただし、このポリペプ チド配列は、CESPポリペプチドの参照アミノ酸の各100アミノ酸あたり、５つま でのアミノ酸の変更を含み得る。言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも 95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列にお ける５％までのアミノ酸残基が欠失、または別のアミノ酸と置換され得るか、あ るいは参照配列におけるアミノ酸残基全体の５％までの多数のアミノ酸が、参照 配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ 末端位置またはカルボキシ末端位置で、またはそれらの末端の位置の間のどこで でも起こり得、参照配列内の残基間で個々に、または、参照配列内の１以上の連 続した基のいずれかで散在し得る。 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列番号２に示されるアミ ノ酸配列、または寄託されたcDNAクローンによりコードされるアミノ酸配列に対 して、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一であるかどうかは、 Bestfitプログラム（Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Un ix、Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive ，Madison，WI 53711）のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣 習的に決定され得る。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列に対して95％同 一であるかどうかを決定するために、Bestfitまたは任意の他の配列アラインメ ントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百分率が参照アミノ酸配列の全 長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の５％までの相 同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される。 本発明のポリペプチドは、当業者に周知な方法を用いて、SDS-PAGEゲルまたは 、分子量ふるいゲル濾過カラムに用いる分子量マーカーとして使用され得る。 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を 含む、ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピト ープは、本明細暑中に記載のポリペプチドの免疫原性または抗原性のエピトープ である。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体 応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。一方では、抗体が結合し得 るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質 の免疫原性エピトープの数は、一般的には、抗原性エピトープの数未満である。 例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002(1983)を参照のこと 。 抗原性エピトープを有するペプチドまたはポリペプチド（すなわち、抗体が結 合し得るタンパク質分子の領域を含むエピトープ）の選択に関して、タンパク質 配列の一部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク 質と反応する抗血清を日常的に誘発し得ることが当該分野で周知である。例えば 、 Sutcliffe,J.G.、Shinnick,T.M.、Green，N.およびLearner,R.A.、Antibodies t hat react with predeternmined sites on proteins，Science 219:660-666(198 3)を参照のこと。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、しばしばタン パク質の一次配列で示され、一連の単純な化学的法則により特徴づけられ得、そ してインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトープ） にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、どちらにも制限されない。 それゆえ、本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本 発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起す るのに有用である。例えば、Wilsonら、Cell 37:767-778（1984）777を参照のこ と。 本発明の抗原性エピトープ保有のペプチドおよびポリペプチドは、好ましくは 本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも７、より好ましく は少なくとも９、そして最も好ましくは、少なくとも約15〜約30のアミノ酸配列 を含む。 CESP特異的抗体を産生するために使用され得る抗原性ポリペプチドおよびペプ チドの非限定的な例には：配列番号２におけるアミノ酸約−１〜約65のアミノ酸 残基を含むポリペプチド；配列番号２における約71〜約105のアミノ酸残基を含 むポリペプチド；配列番号２における約114〜約136のアミノ酸残基を含むポリペ プチド；配列番号２における約148〜約169のアミノ酸残基を含むポリペプチド； 配列番号２における約174〜約198のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ２における約213〜約229のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけ る約234〜約253のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における 約267〜約315のアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段（ Houghten,R.A.、General method for the rapid solid-phase synthesis of lar ge numbers of peptides:Specificity of antigen-antibody interaction at th e level of individual amino acids,Proc．Natl．Acad．Sci.USA 82:5131-5135 (1985)）によって産生され得る。この「Simultaneous Multiple Peptlde Synthe sis(SMPS)」プロセスは、さらに、Houghtenら（1986）の米国特許第4,631,2 11号に記載される。 当業者が理解するように、上記の本発明のCESPポリペプチドおよびそのエピト ープ保有フラグメントは、免疫グロブリン(IgG)の定常ドメインの一部として結 合し得、キメラポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易に し、そしてインビボにおける半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトのCD4- ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖また は軽鎖の定常領域の種々のドメインから構成されるキメラタンパク質について示 されている（EPA394,827；Trauneckerら、Nature 331:84-86（1988））。IgG部 分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、他の分 子の結合および中和において、モノマーCESPタンパク質またはタンパク質フラグ メント単独よりも効率的であり得る（Fountoulakisら、J．Biochem．270:3958-3 964（1995））。 CESPの診断適用のおよび予後の適用 CESP関連障害をもつ哺乳類中の特定の組織は、対応する「標準」哺乳動物（） すなわち、障害を有さない同じ種の哺乳動物）と比較した場合、顕著に増加また は減少したレベルのCESPタンパク質およびCESPタンパク質をコードするmRNAを発 現すると考えられている。さらに、CESPタンパク質の増加または減少したレベル は、障害を有さない同じ種類の哺乳類由来の血清と比較した場合、障害を有する 哺乳類由来の特定の体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、および髄液）中で検 出され得ると考えられている。従って、本発明は、診断の間に有用な診断方法を 提供する。哺乳動物細胞または体液中のCESPタンパク質をコードする遺伝子の発 現レベルをアッセイし、そして遺伝子発現レベルを標準CESP遺伝子発現レベルと 比較し、それにより、標準を超える遺伝子発現レベルにおける増加は、特定の障 害の指標となる。 CESP関連障害には、以下の冠状動脈性血管再生、冠状動脈血栓または閉塞後の 再狭窄、心筋梗塞、心房および／または心室性不整脈、ハートブロック、小さな 冠状動脈および肺動脈の遺伝的中間の「壊死」、小さな冠状動脈の病巣線維筋性 異形成症、心筋症、不整脈発症的右心室異系性および突然死を含むが、これらに 限定されない。 診断は従来の方法によってすでに実施されており、本発明は予後指標として有 用であり、それによって、増加したまたは減少したCESP遺伝子発現を示す患者は 、低レベルで遺伝子を発現する患者と比較して、より悪い臨床症状を経験する。 さらに、CESPは羊膜細胞中で検出される。CESPは胎児遺伝子欠失についての標識 として役立ち得ると考えられている。このような胎児遺伝的欠失は、発達性の心 臓病を含む。 「CESPタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルをアッセイすること」によ り、第一の生物学的サンプルにおいて直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベ ルまたはmRNAレベルを測定または評価することにより）または相対的（例えば、 第二の生物学的サンプルにおけるCESPタンパク質レベルまたはmRNAレベルと比較 することにより）のいずれかで、CESPタンパク質のレベルまたはCESPタンパク質 をコードするmRNAレベルの定性的測定もしくは定量的測定または評価が意図され る。 好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるCESPタンパク質レベルまたはmR NAレベルが測定または評価され、そして標準CESPタンパク質レベルまたはmRNAレ ベルと比較される。標準は障害を有さない固体から得られた第２の生物学的サン プルから得られる。当該分野において評価されるように、一旦標準CESPタンパク 質レベルまたはmRNAレベルが公知になると、それは比較のための標準として繰り 返して使用され得る。 「生物学的サンプル」によって、個体、細胞株、組織培養物、またはCESPタン パク質もしくはmRNAを含む他の供給源から得られる任意の生物学的サンプルが意 図される。生物学的サンプルは、分泌された成熟CESPタンパク質を含む哺乳動物 の体液（例えば、血液、血清、血漿、尿、滑液、および髄液ならびに羊膜細胞を 含む羊水）心臓、腎糸球体、および腎尿細管を含む。 本発明は、哺乳動物中のCESP関連障害を検出することについて有用である。好 ましい哺乳動物は、サル、尾なしザル、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ 、およびヒトを含む。ヒトが特に好ましい哺乳類である。 全細胞RNAが、ChomczynskiおよびSacchi，Anal．Biochem．162:156-159(198 7)に記載されている一工程のグアニジニウム-チオシアネート-フェノール-クロ ロホルム法）を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、CESPタン パク質をコードするmRNAのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる 。これらは、ノーザンブロット分析(Haradaら、Cell 63:303-312(1990))、Slヌ クレアーゼマッピング(Fujitaら、Cell 49:357-367(1987))、ポリメラーゼ連鎖 反応（PCR）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写(RT-PCR)(Makinoら、 Technique2:295-301(1990))、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（R T-LCR）を含む。 生物学的サンプル中のCESPタンパク質レベルのアッセイは、抗体に基づく技術 を使用して行われ得る。例えば、組織中でのCESPの発現は、伝統的な免疫組織学 的方法で研究され得る（Jalkanen，Mら、J．Cell．Biol．101:976-985(1985)Jal kanen，Mら、J．Cell．Biol．105:3087-3096(1987)）。 CESPタンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、 イムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイ ムノアッセイ（RIA））を含む。適切な標識は、当該分野で公知であり、そして グルコースオキシダーゼのような酵素標識、およびヨード(¹²⁵I、¹²¹I)、炭素(^{1 4} C)、硫黄(³⁵S)、トリチウム(³H)、インジウム(¹¹²In)、およびテクネチウム(^{99 m} Tc)のようなラジオアイソトープ、ならびにフルオレセインおよびローダミンお よびビオチンのような蛍光標識を含む。 CESPタンパク質治療 HSFは多種多様の生理学的および病理学的プロセスにおいて役割を果たすと考 えられている。従って、CESPタンパク質は、CESP系の異常な活性が関係し、そし て病理学的および物理学的結果を有する任意の生理学的または病理学的疾患状態 への適用を有する。 CESPが関与されることが考えられる生理学的過程は、血管再生過程後の冠状動 脈再狭窄の側副枝の循環（特に、心臓で）制御の調節、筋細胞中のアポトーシス の制御、発育する心臓の筋細胞発達の調節、循環する血液量の制御、血管緊張の 制御、血圧および心拍出量の制御、利尿、ナトリウム排泄増加、間質に対する血 漿水の漏出の促進、およびアルドステロン、アンギオテンシンII、エンドセリン 、レニン、およびバソプレッシンのようなホルモンの放出または作用の阻害を含 む。 CESPは発育心臓における成長モジュレーターとしての役割を果たすとも考えら れている。さらに、CESPは心筋虚血の間の損傷から成人心筋細胞を保護すると考 えられている。さらに、CESPは血管再生治療（例えば、冠状動脈バイパス術；経 皮経管冠動脈拡張；またはヘパリン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ストレプトキナ ーゼ、または組織プラスミノーゲンアクチベーター）後の心筋の血管再生を増強 し、そして血管再生治療後の冠状動脈の再狭窄を防御または阻害すると考えられ ている。従って、CESPが血管再生治療を受けている患者に投与される場合、CESP は心筋の血管再生を増強し、そして冠動脈の再狭窄を防御または抑制する。 CESPは血管新生（すなわち、新しい血管組織の形成）を促進するとも考えられ ている。従って、循環系統の病気に悩まされる患者へのCESPの投与は、血管新生 を促進する。CESP処方が有益である循環系統の病気は、アテローム硬化型心臓病 、冠状動脈狭窄、冠状動脈鼻閉（部分的または全てのどちらか）、心筋梗塞、静 脈血栓症、およびReynaud症候群を含む。 本発明は、哺乳動物中のCESP関連障害を処方することまたは抑制することにつ いて有用である。好ましい哺乳動物はサル、尾なしザル、ネコ、イヌ、ウシ、ブ タ、ウマ、ウサギおよびヒトを含む。ヒトが特に好ましい哺乳類である。 投与様式 個体におけるCESP活性の標準レベルまたは正常レベルにおける減少により引き 起こされる状態が、CESPタンパク質の投与により処置され得ることが理解される 。従って、本発明はさらに、CESPの活性の増加したレベルを必要とする個体を処 置する方法を提供する。この方法は、このような個体におけるCESPの活性レベル を増大するのに効果的な、有効量の本発明の単離されたCESPのポリペプチド（特 に、成熟形態のCESP）を含む薬学的組成物をそのような個体に投与する工程を含 む。 一般的提案として、１用量あたりで非経口投与されるCESPのポリペプチドの総 薬学的有効量は、患者の体重の約１μg/kg/日〜10mg/kg/日の範囲であるが、上 記のように、これは治療的自由裁量に供される。より好ましくは、この用量は、 少なくとも0.01mg/kg/日、そして最も好ましくはヒトについてホルモンで、約0. 01と1mg/kg/日との間である。連続的に与えられる場合、CESPのポリペプチドは 、代表的には、約１μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の用量速度で、１日あたり１ 〜４回の注射、または例えば、ミニポンプを用いる連続的皮下注入のいずれかに より投与される。静脈内バック溶液もまた用いられ得る。 本発明のCESPタンパク質を含む薬学的組成物は、経口、直腸、非経口、槽内（ intracistemally）、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、点眼薬、または経皮パ ッチによるような）、頬に、または経口もしくは鼻腔内スプレーとして投与され 得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体、または液 体の賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、または任意の型の処方助剤を意味する。 本明細書中で用いられる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下、 皮下、および関節内の注射および注入を含む投与態様をいう。 染色体アッセイ 本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染 色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズす る。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と、疾患に関連 する遺伝子との相関付けにおいて重要な第１工程である。 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中に開示されるcD NAは、CESPタンパク質遺伝子のゲノムDNAをクローニングするために使用される 。これは、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用し て達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、この目的のための周知の技術を使用し てインサイチュ染色体マッピングのために使用される。 さらに、いくつかの場合において、配列は、cDNAからPCRプライマー（好まし くは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。遺伝子の3'非翻 訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがら ず、従って増幅プロセスを複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用 される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブ リッドのPCRスクリーニングに使用される。 cDNAクローンの、中期染色体スプレッド（spread）への蛍光インサイチュハイ ブリダイゼーション（「FISH」）は、１工程で正確な染色体位置を提供するため に使用され得る。この技術は、50bpまたは60bpほどの短いcDNA由来のプローブを 用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら，Human Chromosomes :A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)を参照のこ と。 一旦配列が正確な染色体位置にマップされると、配列の染色体上での物理的な 位置を遺伝地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V．McK usick，Mendeilan Inheritance in Man(Johns Hopkins University，Welch Medi cal Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、同 じ染色体領域にマップされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に 隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。 次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列における相違 を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、 いずれの正常な個体にも観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるよ うである。 一般に記載される本発明により、同じ様なことが、以下の実施例を参照にする ことにより容易に理解され、これらは例示の目的で提供されるが、限定を意図し ない。 実施例 実施例1：E.coliにおけるCESPの発現および精製 細菌性発現ベクターpQE60をこの実施例中で細菌発現について使用する(QIAGEN ，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60はアンピシリン抗 生物質抵抗性(「Amp^r」)をコードしそして細菌の複製起点(「ori」)、IPTG誘導性 プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、QIAGEN Inc.(前出)より販売される ニッケルニトロトリ酢酸(「Ni-NTA」)親和性樹脂を使用して、親和性精製を可能 にするヒスチジン残基をコードする６つのコドン、および適切な１つの制限酵素 切断部位を含む。これらの要素は、そのポリペプチドのカルボキシル末端に共有 結 合する、6つのHis残基（すなわち、「6×His tag」）を含むポリペプチドを発現 するポリペプチドをコードする挿入されるDNAフラグメントのように配置される 。 疎水性リーダー配列を欠失するCESPタンパク質の所望される部位をコードする DNA配列を、CESPタンパク質の所望される部位のアミノ末端配列、およびcDNAコ ーディング配列に対して３’に配置された構築物における配列にアニールするPC Rオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、配置されたcDNAクローンから増幅 する。pQE60ベクター中のクローニングを促進するための制限部位を含むさらな るオリゴヌクレオチドを、５’および３’配列へ、それぞれ加える。 成熟タンパク質のクローニングについて、５’プライマーは、配列5'-GGGAGGA TCC GCGCCCGCTCCGACGGCG-3'（配列番号４）を有し、これは下線を付したBamHI制 限部位、続いて配列番号１に示されるCESP cDNA配列のヌクレオチド134〜153に 対応する20ヌクレオチドを含む。もちろん、当業者は、５’プライマーが始まる タンパク質コード配列中のポイントは、成熟型よりも短いかまたは長い完全なタ ンパク質の所望される任意の部位をコードするDNAセグメントを増幅するように 改変され得る。３’プライマーは、配列5'-GCCTCTAGATTAAATCTCTTCCCCTCCCAGCAG T-3’（配列番号５）を有し、これは、pQE60ベクター中の6つのHisコドンを有す るそれとそのリーディングフレームを維持するような制限部位と整列されるコー ド配列を有する、下線を付したXba I制限部位、続いて配列番号１に示されるCES P DNA配列の1101〜1124のヌクレオチドに相補的な24ヌクレオチドを含む。 増幅したCESP DNAフラグメントおよびベクターpQE60を、BamHIおよびXbaI制限 酵素により消化され次いで消化されたDNAを互いに連結する。制限化pQE60ベクタ ーへのCESP DNAの挿入は、IPTG誘発プロモーターから下流のCESPタンパク質コー ド領域、ならびに開始AUGおよび6つのヒスチジンコドンを有するインフレームを 配置する。 この連結混合物を、Sambrookら、Molecular Cloning:a Laboratory Manual,第 2版;Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)中 に記載されるような標準的手段を使用して、コンピテントE.coli細胞へ形質転換 導入する。lacリプレッサーを発現しそしてカナマイシン抵抗性(「Kan^r」)を付 与するプラスミドpREP4の複数コピーを含むE．coli株MI5/rep4を、本明細書 中に記載される例示的な実施例を行うにあたって使用する。CESPタンパク質の発 現に適した多くの株のうちの唯一のこの株は、QUIGEN，Inc.(前出)から市販され ている。形質転換体を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でLBプレート 上で増殖するそれらの能力により同定する。プラスミドDNAを耐性コロニーから 単離し、そしてクローン化DNAの同定を制限分析、PCRおよびDNA配列決定により 確認する。 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（100μg/ml）とカナマイシン （25μg/ml）の両方を補充したLB培地における液体培地中で一晩（「O/N」）増 殖させる。O/N培養物を用いて約1:25〜1:250の希釈で大規模培養物に接種した。 細胞を、0.4と0.6との間の600nmでの吸光度（「OD600」）にまで増殖させる。次 いで、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（「IPTG」）を加えて１mMの 最終濃度にし、IacIリプレッサーを不活性化することにより、1acリプレッサー 感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３〜４時間引き続きイ ンキュベートする。次いで、細胞を遠心分離により採集する。 次いでこの細胞を、pH8の6Mグアニジン−HCl中で４℃にて３〜４時間撹拌する 。細胞破片を遠心分離により除去し、そしてCESPタンパク質を含む上清を、ニッ ケルニトロトリ酢酸(「NiNTA」)親和性樹脂カラム（QIAGEN，Inc.前出から入手 可能）へロードする。6×Hisタグを有するタンパク質は、高い親和性を有するNI -NTA樹脂に結合し、そして簡単な１工程手順で精製され得る（詳細については、 The QIAexpressionist，1995，QIAGEN，Inc.、前出を参照のこと）。手短に言う と、この上清を6Mグアニジン−HCl、pH8のカラムへロードし、このカラムを最初 に、10容量の6Mグアニジン-HCl、pH8で洗浄し、次いで10容量の6Mグアニジン-HC l、pH6で洗浄し、そして最終的にCESPタンパク質を6Mグアニジン-HCl、pH5で溶 出する。 次いで、精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（「PBS」）、また は50mMの酢酸ナトリウム、pH6の緩衝液および200mM NaClに対して透析すること によって再生する。あるいは、このタンパク質は、Ni-NTAカラムに固定する間、 首尾良く再折り畳みし得る。奨励される条件は以下のようである：プロテアーゼ インヒビターを含む、500mM NaCl-20%グリセロール、20mM Tris/HCl、pH7.4中で 、 6M〜1M尿素の直線勾配を使用して再生する。この再生を、1.5時間以上の期間に 渡り実施するべきである。再生後、タンパク質を、250mMのイミダゾールの添加 により溶出し得る。イミダゾールを、PBSまたは50mM酢酸ナトリウム、pH6緩衝液 および200mM NaClに対する最終的な透析工程により除去する。この精製したタン パク質は４℃で保存するか、または−80℃で凍結する。 実施例２：バキュロウイルス発現系におけるCESPのタンパク質のクローニングお よび発現 寄託されたクローンにおける完全長CESPのタンパク質をコードするcDNA配列を 、この遺伝子の５'配列および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライ マーを用いて増幅した： ５'プライマーは、配列5'-TGCCGCGGATCCGCCATCATGCAGCGGCTTGGGGCCAC-3'（配 列番号６）を有する、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いて配列番号１に示 されるCESPタンパク質コード配列のヌクレオチド73-92に対応する20ヌクレオチ ドを含む。以下に示されるように、発現ベクターに挿入した場合、CESPをコード する増幅されたフラグメントの５’末端は、効果的なシグナルペプチドを提供し た。真核生物細胞中の効果的な翻訳開始シグナルを、Kozak，M.，J．Mol．Biol ．196:947-950(1987)により記載されるように、構築物のベクター部位中に、適 切に配置した。 ３’プライマーは、配列5'-GCACAGGTACCCACAGCCTGGTCCAGATCTAAATCTCTTCCCCTC CCAG-3'（配列番号７）を有した下線を付したAsp718制限部位、続いて、配列番 号１で示されるCESPcDNA配列のヌクレオチド1105-1145に相補的な42ヌクレオチ ドを含んだ。 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Geneclean」，BIO 101 Inc.，L a Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、このフラ グメントをBamHIおよびAsp718で消化し、そして１％アガロースゲルで再び精製 した。このフラグメントを、本明細書中でF2と命名する。 ベクターpA2を用いて、Summersら、A Manual of Methods for Baculovirus Ve ctors and Insect Cell Culture Procedures，Texas Agricultural Experimenta l Station Bulletin No．1555（1987）に記載の標準的な方法を用いて、CESPの タンパク質をバキュロウイルス発現系において発現する。この発現ベクターは、 Autographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプ ロモーター、それに続く都合のいい制限部位を含む。シミアンウイルス40（「SV 40」）のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換 えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポ リヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、そしてポリヘドリン遺伝子のポリア デニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスDNAとの細胞媒 介性相同組換えのためにウイルス配列によって両側に隣接させ、クローン化ポリ ヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。 pA2発現ベクターは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の 強力なポリヘドリンプロモーター、続いて従来の制限部位を含む。シミアンウイ ルス40(「SV40」)のポリアデニル化部位は、効果的なポリアデニル化のために使 用される。組換えウイルスの簡単な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダ ーゼ遺伝子が、ポリヘドリンプロモーターと同じ方向で挿入され、そしてポリヘ ドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列は、クローン 化されたポリヌクレオチドを発現する生ウイルスを生成するために、野生型ウイ ルスDNAを有する細胞媒介性同種組換えのためのウイルス配列によって両側に隣 接される。 当業者が容易に理解するように、構築が転写、翻訳、輸送などのために適切に 位置したシグナル（例えば、必要ならばインフレームでのAUGおよびシグナルペ プチド）を提供する、多くの他のバキュロウイルスベクター（例えば、pA2-GP(A cMNPV gp67シグナルペプチドを含む)、pAc373、pVL941、およびpAcIM1）が、pA2 の代わりに用いられ得る。このようなベクターは、とりわけ、Luckowら、Virolo gy，170:31-39に記載される。 pA2プラスミドを、制限酵素BamHIおよびAsp718で消化した。次いでDNAを、市 販のキット（「Geneclean」BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca）を用いて１％アガロ ースゲルから単離した。このベクターDNAを、本明細書中で「V」と命名する。 フラグメントF2および脱リン酸化プラスミドV2を、T4DNAリガーゼでともに連 結した。E.coli HB101細胞を連結混合物で形質転換し、そして培養プレート上に 播種した。BamHIおよびAsp718を用いて個々のコロニーからDNAを消化し、次いで ゲル電気泳動によって消化産物を分析することによって、ヒトCESP遺伝子を有す るプラスミドを含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配 列決定により確認した。このプラスミドを、本明細書中でpBacCESPと命名する。 ５μgのプラスミドpBacCESPを、Felgnerら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84: 7413-7417(1987)によって記載されるリポフェクション法を用いて、1μgの市販 の線状化バキュロウイルスDNA（「BaculoGold^TMbaculovirus DNA」，Pharmingen ，San Diego，CA.）とともに同時トランスフェクトした。1μgのBaculoGold^TMウ イルスDNAおよび５μgのプラスミドpBacCESPを、50μlの無血清グレース培地（L ife Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレート の無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのグレ ース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで 、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１mlを有する35mm組 織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 1711）に滴下する。この プレートを新しく加えた溶液と混合するために前後側に振動した。次いでプレー トを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液 をプレートから除去し、そして10％ウシ胎仔血清を補充した１mlのグレース昆虫 培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養 を続けた。 ４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（上記で引用）に記載され るようにプラークアッセイを行った。青く染色されたプラークを産生するgal発 現クローンの容易な同定および単離を可能にするために、「Blue GaU（Life Tec hnologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを使用した。（このタ イプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、Life Technologies Inc.、Ga ithersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイ ド（9〜10頁）においても見い出され得る）。 連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に添加した。適切なインキュベーションの 後、青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次い で、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのグレース培地を含むエッペンドルフ チューブ中に再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換 えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞を感染 させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を回収し、次いで それらを４℃で保存した。適切に挿入されたhESSB I．II、およびIIIを含むクロ ーンを、制限マッピングおよび配列決定を含むDNA分析によって同定した。これ を、本明細書中でV-CESPと命名する。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したグレース培地中で増殖する。約２（約 １〜約３）の感染多重度（「MOI」）で組換えバキュロウイルスV-CESPを感染さ せた。６時間後、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除い たSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburgから入手可能）に置き 換えた。42時間後、５μCiの³⁵Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓ−システイン （Amershamから入手可能）を添加した。細胞をさらに16時間インキュベートし、 次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をSD S-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。 実施例３：哺乳動物細胞におけるクローニングおよび発現 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（これは、mRNAの 転写の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転 写物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、 エンハンサー、ドナーに隣接するKozak配列および介在配列、ならびにRNAスプラ イシングのためのアクセプター部位が挙げられる。非常に効率的な転写を、SV40 由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、RSV、HTLVl、HI VI）由来の長末端反復（LTRS）ならびにサイトメガロウイルス（CMV）の初期プ ロモーターで達成し得る。しかし、細胞シグナルもまた使用され得る（例えば、 ヒトアクチンプロモーター）。本発明の実施における使用に適切な発現ベクター としては、例えば、PSVLおよびPMSG（Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat（ ATCC 37152）、pSV2dhfr（ATCC 37146）、ならびにpBC12MI（ATCC 67109）のよ うなベクターが挙げられる。使用し得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトHela 293、H9およびJurkat細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos1、Cos7およびCV1 、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞が挙げられる。 あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれるその遺伝子を含む安定な細胞株に おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、dhfr、gpt、ネオマイシン、また はハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクト細胞 の同定および単離を可能にする。 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅されて、大量のコードされるタン パク質を発現し得る。DHFR（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の遺 伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。別 の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（GS）である（Murphyら、 Biochem J．227:277-279(1991)；Bebbingtonら、Bio/Technology 10:169-175(19 92)）。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において増殖さ せ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組 み込まれる増幅遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞およびN SO細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。 発現ベクターpC1およびpC4は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（LT R）（Cullenら、Molecular and Cellular Biolugy，438-447（1985年３月））お よびCMV-エンハンサーのフラグメント（Boshartら、Cell 41:521-530（1985）） を含む。複数のクローニング部位（例えば、制限酵素切断部位BamHI、XbaI、お よびAsp718に関する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクター はさらに、ラットプレプロインスリン遺伝子の3'イントロン、ポリアデニル化、 および終結シグナルを含む。 実施例３(a)：COS細胞におけるクローニングおよび発現 発現プラスミドpCESP HAを、CESPをコードするcDNAを発現ベクターpcDNAI/Amp またはpcDNA3(Invitrogen，Inc.から入手し得る)にクローングすることによって 作製する。 発現ベクターpcDNA3は以下を含む：（１）E.coliおよび他の原核生物細胞にお ける増殖に有効なE.coli複製起点；（２）プラスミド含有原核生物細胞の選択の ためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細胞における増殖のためのSV40 複製起点；（４）CMVプロモーター、ポリリンカー、SV40イントロン；（５）赤 血球凝集素フラグメント（すなわち、精製を容易にするための「HA」タグ）、引 き続き、cDNAが、都合良くCMVプロモーターの発現制御下におかれ、そしてポリ リンカーにおける制限部位によってSV40イントロンおよびポリアデニル化シグナ ルに作動可能に連結され得るように配置された終結コドンおよびポリアデニル化 シグナルをコードするいくつかのコドン。HAタグは、Wilsonら、Cell 37:767(19 84)に記載されているインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピト ープに対応する。HAタグの標的タンパク質への融合は、HAエピトープを認識する 抗体による組換えタンパク質の容易な同定および回収を可能にする。pcDNA3は、 さらに選択ネオマイシンマーカーを含む。 CESPをコードするDNAフラグメントは、組換えタンパク質の発現をCMVプロモー ターにより指向するようにベクターのポリリンカー領域にクローン化する。プラ スミド構築ストラテジーは以下の通りである。E.ColiでCESPを発現するためのベ クターの構築のために、上記のように、寄託されたクローンのCESPcDNAを、簡便 な制限部位を含むプライマーを使用して増幅する。適切なプライマーは以下を含 み、これらは本実施例で使用される。５’プライマーは、５’-TGC CGC GGA TCC GCC ATC ATG CAG CGG CTT GGG GCC AC-３’（配列番号６）の配列を有し、下線 部のBamHI制限酵素部位、コザック配列、およびAUG開始コドン、引き続き配列番 号１のCESPタンパク質のコード配列の20ヌクレオチド(ヌクレオチド73〜92)を含 む。HAタグを使用しない場合、３’プライマーは５’-GTC TCT AGA CAG ATC TAA ATC TCT TCC CCT CCC AG-３’（配列番号８）の配列を有し、下線部のXbaI部位 および配列番号１に示されるCESP cDNA配列のヌクレオチド1105〜1130に相補的 な23ヌクレオチドを含む。HAタグを使用する場合は、３’プライマーは５’-GTC TCT AGA CAG ATC TAA GCG TAG TCT GGG ACG TCG TAT GGG TAA ATC TCT TCC CCT CCC AGC AG-３’（配列番号９）の配列を有し、下線部のXbaI部位および配列番 号１に示されるCESP cDNA配列のヌクレオチド1102〜1124に相補的な23ヌクレオ チドを含む。 PCR増幅DNAフラグメントおよびベクターpcDNA3を、XbaI制限酵素で消化し、次 いで連結する。連結混合物を、E.coli株SURE(Stratagene Cloning Systems，110 99 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能)へ形質転換し 、そして形質転換培養物を、次いでインキュベートしてアンピシリン耐性コロニ ーの増殖を可能にするアンピシリン培地プレートへプレーティングする。プラス ミドDNAを耐性コロニーから単離し、そしてCESPをコードするフラグメントの存 在について制限分析または他の手段によって試験する。 組換えCESPの発現のために、COS細胞を、例えば、Sambrookら，Molecular Clo ning:A Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，Cold Spring Harb or，New York(1989)に記載のようにDEAE-DEXTRANを用いて、上記のように発現ベ クターでトランスフェクトする。細胞をベクターによるCESPの発現のための条件 下でインキュベートする。 CESP-HA融合タンパク質の発現を、例えば、Harlowら，Anitibodies:A Laborat ory Mnual,第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbo r，New York(1988)に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって 検出する。この目的を達するため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、³⁵ Ｓ-システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識す る。細胞および培地を回収し、そして細胞を洗浄し、そしてWilsonら（上記に引 用される）に記載されるように界面活性剤含有RIPA緩衝液：150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、0.5％ DOC、50mM TRIS、pH7.5で溶解する。タンパク質を、H A特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。 次いで、沈降したタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって 分析する。期待されるサイズの発現産物が、細胞溶解物において観察され、これ はネガティブコントロールにおいては観察されない。 実施例3(b)：CHO細胞におけるクローニングおよび発現 ベクターpC4を、CESPタンパク質の発現のために使用した。プラスミドpC4は、 プラスミドpSV2-dhfr[ATCC受託番号37146]の誘導体である。このプラスミドは、 SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミ ドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスタ ー卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地 （αマイナスMEM、Life Technologies）中で細胞を増殖させることによって選択 され得る。メトトレキサート（MTX）に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の増 幅は、よく考証されている（例えば、Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R .およびSchimke，R.T.，1978，J．Biol．Chem．253:1357-1370、Hamlin，J.L.お よひMa，C.1990，Biochem．et Biophys．Acta，1097:107-143、Page，M.J.およ びSydenham，M.A.，Biotechnology 9:64-68(1991)を参照のこと）。漸増濃度のM TXにおいて増殖した細胞は、DHFR遺伝子の増幅の結果として、標的酵素DHFRを過 剰産生することによって薬物への耐性を発現する。第二の遺伝子がDHFR遺伝子に 連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。このアプローチ は、増幅した遺伝子の1,000を越えるコピーを有する細胞株を開発するために使 用され得ることは当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取 り除かれる場合、宿主細胞の1つ以上の染色体（単数または複数）に取り込まれ た増幅遺伝子を含む細胞株が得られる。 プラスミドpC4は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Culle nら、Molecular and Cellular Biology，1985年３月：438-447）の長末端反復（ LTR）の強力なプロモーターの遺伝子、およびヒトサイトメガロウイルス（CMV） （Boshartら、Cell 41:521-530,1985）の前初期遺伝子のエンハンサーから単離 されたフラグメントを含む。プロモーターの下流は、遺伝子の組込みを可能にす る、BamHI、XbaIおよびAsp718制限酵素切断部位である。これらのクローニング 部位の後ろに、プラスミドは、ラットのプレプロインスリン遺伝子の3'イントロ ンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた、発現のた めに使用され得る（例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後 期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、HIVおよびHTLVI）由来の 長末端反復）。ClontechのTet-OffおよびTet-On遺伝子発現系および類似の系が 、哺乳動物細胞中の調節方法でのCESPタンパク質の発現に使用され得る(Gosson, M & Bujard H.1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:5547-5551)。mRNAのポリアデニ ル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺 伝子由来）も同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を有する 安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、gpt、G418、またはハイグロマイ シン）での同時トランスフェクトに基づいて選択され得る。最初に１つより多い 選択マーカー（例えば、G418およびメトトレキサート）を使用することが有益で ある。 プラスミドpC4を制限酵素BamHIで消化し、次いでウシ腸ホスファターゼを用い て、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化した。次いで、ベクターを、１％ アガロースゲルから単離した。 完全なCESPタンパク質をコードするDNA配列（リーダー配列を含む）を、遺伝 子の５’および３’の配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを使用 して増幅した。５’プライマーは、５’-GCT GCC GCG GAT CCG CCA CCA TGC AGC GGC TTG GGG CCA CC-３’の配列を有し（配列番号１０）、下線部にBamHI制限 酵素部位、真核生物での翻訳の開始に効率的なシグナル（Kozak.M.,J.Mol.Biol. 196:947-950(1987)によって記載される）、そして続いてCESPタンパク質コード 配列（配列番号１に示される）のヌクレオチド73〜93に対応する21ヌクレオチド を含む。 ３’プライマーは、５’-CAC ACG CGG ATC CAG ATC TAA ATC TCT TCC CCT C- ３’の配列を有し（配列番号１１）、下線部にBamHI制限酵素部位、続いてスト ップコドンを含むCESPタンパク質コード配列（配列番号１に示される）に相補的 な24ヌクレオチド（ヌクレオチド1109〜1132）を含む。 増幅したフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、次いで１％のアガロースゲ ルで再精製した。次いで、単離したフラグメントおよび脱リン酸化ベクターを、 T4 DNAリガーゼで連結した。次いで、E.coli HB101細胞またはXL-1 Blue細胞を 形質転換し、そして制限酵素分析を用いてプラスミドpC4に挿入されたフラグメ ントを含む細菌を同定した。 活性なDHFR遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフ ェクションのために使用した。５μgの発現プラスミドpC4を、リポフェクチン（ Felgnerら、前出）を用いて、0.5μgのプラスミドpSV2neoとともに同時トランス フェクトした。プラスミドpSV2-neoは、優性選択マーカー（G418を含む一群の 抗生物質への耐性を与える酵素をコードするTn5由来のneo遺伝子）を含む。細胞 を、１mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種した。２日後、細胞をトリプ シン処理し、10、25、または50ng/mlのメトトレキサートおよび１mg/ml G418を 補充したαマイナスMEM中で、ハイブリドーマクローニングプレート（Greiner， Germany)に播種した。約10〜14日後、単一のクローンをトリプシン処理し、次い で異なる濃度のメトトレキサート（50nm、100nM、200nM、400nM、800nM）を用い て、６ウェルペトリ皿または10mlフラスコに播種した。次いで、最高濃度のメト トレキサートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μM 、２μM、５μM、10μM、20mM）を含む新たな６ウェルプレートに移した。同じ 手順を、100〜200μMの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所望 の遺伝子産物の発現を、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットによって、または逆 相HPLC分析によって分析した。 実施例４：CESPタンパク質発現の組織分布 ノーザンブロット分析を行って、Sambrookら（上記に引用される）によって記 載される方法を用いて、ヒト組織におけるCESP遺伝子発現を調べた。CESPタンパ ク質の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を含むcDNAプローブを、rediprime^TMD NA標識システム(Amersham Life Science)を製造者の説明書に従って用いて³²Pで 標識した。標識後、プローブを、CHROMA SPIN-100^TMカラム（Clontech Laborato ries，Inc.）を製造者のプロトコル番号PT1200-1に従って用いて精製した。次い で、精製した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をCESP mRNAについて調べ た。 ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺 、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血白血球からのMultiple Tissue Northe rn（MTN）ブロットを、Clontechから入手し、そしてExpressHyb^TMハイブリダイ ゼーション溶液（Clontech）を製造者のプロトコル番号PT1190-1に従って用いて 、標識プローブを用いて調べた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロ ットをマウントし、そして−70℃にて一晩フィルムに曝し、そしてフィルムを標 準的な手順に従って現像した。大量の2.6キロベース転写物を心臓および脳につ いて 検出した。弱い2.6キロベースのシグナルを内皮細胞、羊水細胞、平滑筋、HSC17 2細胞、および骨芽細胞腫細胞について検出した。 本発明が、前述の説明および実施例に詳細に記載される以外に実施され得るこ とは明白である。 本発明の多数の改変および変異が、上記の教示に照らして可能であり、それゆ え添付の請求の範囲の範囲内である。 本明細書において引用される全ての刊行物（特許、特許出願、学術誌、研究室 マニュアル、書籍、または他の文書を含む）の開示の全体が、本明細書によって 参考として援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｐ 9/00 45/00 43/00 １１１ Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ルーベン，スティーブン エム. アメリカ合衆国 メリーランド 20832, オルニー，ヘリテイジ ヒルズ ドライブ 18528

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のヌクレオチド配 列を有するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子： (a)配列番号２における約-21位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列； (b)配列番号２における約-20位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列； (c)配列番号２における約１位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列； (d)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 なアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列； (e)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミ ノ酸配列を有する成熟CESPポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；およ び (f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるヌクレオチドのいずれかに相補的 なヌクレオチド配列。 ２．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１における完全なヌクレオチド配列を有 する、請求項１に記載の核酸分子。 ３．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２における完全なアミノ酸配列を有する CESPポリペプチドをコードする、配列番号１におけるヌクレオチド配列を有する 、請求項１に記載の核酸分子。 ４．前記ポリヌクレオチドが、配列番号２におけるアミノ酸配列を有する成熟CE SPポリペプチドをコードする配列番号１におけるヌクレオチド配列を有する、請 求項１に記載の核酸分子。 ５．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローン の完全なヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。 ６．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローン によってコードされる完全なアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドをコードす るヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。 ７．前記ポリヌクレオチドが、ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローン によってコードされるアミノ酸配列を有する成熟CESPポリペプチドをコードする ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。 ８．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるヌクレオチド配 列に同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、ストリンジェントな ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単 離された核酸分子であって、ここで該ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、 Ａのみの残基またはＴのみの残基からなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレ オチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ しない、核酸分子。 ９．請求項１に記載の(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるアミノ酸配列を 有するCESPポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。 １０．以下からなる群から選択されるCESPポリペプチドのエピトープ保有部分を コードする、請求項９に記載の単離された核酸分子：配列番号２におけるアミノ 酸約-1〜約65由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約71 〜約105由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約114〜約 136由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約148〜約169 由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約174〜約198由来 のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約213〜約229由来のア ミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約234〜約253由来のアミノ 酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約267〜約315由来のアミ ノ酸残基を含むポリペプチド。 １１．以下からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、単 離された核酸分子： (a)フラグメントのヌクレオチド配列であって、ここで該フラグメントは、配 列番号１において示される配列のコード領域の少なくとも50の連続するヌクレオ チドを含み、ただし該単離された核酸分子は、配列番号12、配列番号13、配列番 号14、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番 号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番 号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番 号33、配列番号34、配列番号35、もしくは配列番号36、またはそれらの任意のサ ブフラグメントではない；および (b)(a)におけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。 １２．請求項１に記載の単離された核酸分子を、ベクターに挿入する工程を包含 する、組換えベクターを作製するための方法。 １３．請求項１２に記載の方法によって生成される組換えベクター。 １４．請求項１３に記載の組換えベクターを、宿主細胞中に導入する工程を包含 する、組換え宿主細胞を作製する方法。 １５．請求項１４に記載の方法によって生成される組換え宿主細胞。 １６．CESPポリペプチドを生成するための組換え方法であって、該ポリペプチド が発現されるような条件下で請求項１５に記載の組換え宿主細胞を培養する工程 、 および該ポリペプチドを回収する工程を包含する、方法。 １７．以下からなる群から選択される配列に少なくとも95％同一のアミノ酸配列 を有する、単離されたCESPポリペプチド： (a)配列番号２における約-21位〜約329位のアミノ酸； (b)配列番号２における約-20位〜約329位のアミノ酸； (c)配列番号２における約１位〜約329位のアミノ酸； (d)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 なアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドのアミノ酸配列；および (e)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミ ノ酸配列を有する成熟CESPポリペプチドのアミノ酸配列；および (f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるポリヌクレオチドのいずれか１つ のエピトープ保有部分のアミノ酸配列。 １８．CESPタンパク質のエピトープ保有部分を含む、単離されたポリペプチドで あって、ここで該部分が以下からなる群から選択される、ポリペプチド：配列番 号２におけるアミノ酸約-1〜約65由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列 番号２における約71〜約105由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号 ２における約114〜約136由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２に おける約148〜約169由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２におけ る約174〜約198由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約 213〜約229由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；配列番号２における約234 〜約253由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド；および配列番号２における約2 67〜約315由来のアミノ酸残基を含むポリペプチド。 １９．CESPポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸 分子であって、ここで1〜50の保存的アミノ酸置換を除いて、該ポリペプチドが 以下からなる群から選択される配列を有する、核酸分子： (a)配列番号２における約-21位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列； (b)配列番号２における約-20位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレ オチド配列； (c)配列番号２における約１位〜約329位のアミノ酸配列をコードするヌクレオ チド配列； (d)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 なアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列； (e)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミ ノ酸配列を有する成熟CESPポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；およ び (f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるヌクレオチドのいずれかに相補的 なヌクレオチド配列。 ２０．単離されたCESPポリペプチドであって、ここで1〜50の保存的アミノ酸置 換を除いて、該ポリペプチドが以下からなる群から選択される配列を有する、ポ リペプチド： (a)配列番号２における約-21位〜約329位のアミノ酸； (b)配列番号２における約-20位〜約329位のアミノ酸； (c)配列番号２における約１位〜約329位のアミノ酸； (d)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされる完全 なアミノ酸配列を有するCESPポリペプチドのアミノ酸配列；および (e)ATCC受託番号第97728号に含まれるcDNAクローンによってコードされるアミ ノ酸配列を有する成熟CESPポリペプチドのアミノ酸配列；および (f)(a)、(b)、(c)、(d)、または(e)におけるポリヌクレオチドのいずれか１つ のエピトープ保有部分のアミノ酸配列。