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JP2001213799A - Antineoplastic - Google Patents

Antineoplastic

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Publication number
JP2001213799A
JP2001213799A JP2000019528A JP2000019528A JP2001213799A JP 2001213799 A JP2001213799 A JP 2001213799A JP 2000019528 A JP2000019528 A JP 2000019528A JP 2000019528 A JP2000019528 A JP 2000019528A JP 2001213799 A JP2001213799 A JP 2001213799A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gad
dihydroxyphenylalanine
cells
alanyl
melanoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000019528A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Shunji Natori
俊二 名取
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Original Assignee
RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by RIKEN Institute of Physical and Chemical Research filed Critical RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority to JP2000019528A priority Critical patent/JP2001213799A/en
Publication of JP2001213799A publication Critical patent/JP2001213799A/en
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antineoplastic selective for a kind of mastocarcinoma or melanoma by proving that 5-S-GAD shows selective antineoplastic effect on that kind of mastocarcinoma and melanoma in vitro and in vivo. SOLUTION: This antineoplastic for melanoma or mastocarcinoma contains as an effective component at least one kind selected from the group consisting of N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD), β-alanyl-3,4- dihydroxyphenylalanine (β-AD), 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD) and pharmaceutically permissible salts thereof.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、黒色腫または乳癌
の治療に用いる抗腫瘍剤、より詳細には、Sarcophaga p
eregrina(ニクバエ)成虫から分離することができる、
グルタチオンとβ−アラニル−ジヒドロキシフェニルア
ラニン(dopa)との複合体である化合物またはその構成
成分である化合物を有効成分として含む上記癌に選択的
な抗腫瘍剤に関する。
TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antitumor agent for treating melanoma or breast cancer, and more particularly, to Sarcophaga p
eregrina can be isolated from adults
The present invention relates to an antitumor agent selective for the above-mentioned cancer, which comprises, as an active ingredient, a compound that is a complex of glutathione and β-alanyl-dihydroxyphenylalanine (dopa) or a compound that is a component thereof.

【0002】[0002]

【従来の技術】Sarcophaga peregrina(ニクバエ)を用
いた昆虫免疫の研究中に、本発明者らは免疫した成虫の
溶解物中に新規な抗菌性物質を発見した(Leem JY, et
al. JBiol Chem 1996, 271, 13573-13577; Natori S. M
olecular Mechanisms of Immune Responses in Insect
s. London, Chapman & Hall, 1998, 245-260;及び特開
平8−337594号公報)。5-S-GADと命名されたこ
の化合物は、グルタチオンとβ−アラニル−ジヒドロキ
シフェニルアラニン(dopa)との複合体である。昆虫が
細菌に感染すると、チロシナーゼが活性化し、グルタチ
オンとβ−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルア
ラニン(β-AD)からの5-S-GAD合成を触媒した。5-S-GA
D中の3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの水酸基
は不安定であり、過酸化水素を産生するオルトキノンに
容易に変換される。5-S-GADの抗菌活性は、オルトキノ
ン由来の過酸化水素によるものであることが判明した
(LeemJY, et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-1357
7)。
BACKGROUND OF THE INVENTION During research on insect immunity using Sarcophaga peregrina, the present inventors have discovered a novel antibacterial substance in the lysate of immunized adults (Leem JY, et. Al.).
al. JBiol Chem 1996, 271, 13573-13577; Natori S. M
olecular Mechanisms of Immune Responses in Insect
s. London, Chapman & Hall, 1998, 245-260; and JP-A-8-337594). This compound, named 5-S-GAD, is a complex of glutathione and β-alanyl-dihydroxyphenylalanine (dopa). When insects infected bacteria, tyrosinase was activated and catalyzed the synthesis of 5-S-GAD from glutathione and β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD). 5-S-GA
The hydroxyl group of 3,4-dihydroxyphenylalanine in D is unstable and is easily converted to orthoquinone, which produces hydrogen peroxide. The antibacterial activity of 5-S-GAD was found to be due to orthoquinone-derived hydrogen peroxide (LeemJY, et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-1357).
7).

【0003】5-S-GADは、Sarcophagaの防御機構におけ
る鍵分子の候補であることが判明した。すなわち、5-S-
GADは、細菌感染の初期段階で抗菌物質として作用する
のみならず、過酸化水素を産生することによってRelフ
ァミリー転写因子の活性化物質として作用することが示
唆された(Natori S. Molecular Mechanisms of Immune
Responses in Insects. London, Chapman & Hall, 199
8, 245-260)。Relファミリー転写因子は、細菌感染の
抑制に不可欠な一連の抗菌タンパク質の遺伝子を活性化
することが知られている(Engsrom Y. Molecular Mecha
nisms of Immune Responses in Insects. London, Chap
man & Hall, 1998, 211-244)。
5-S-GAD has been found to be a candidate for a key molecule in the defense mechanism of Sarcophaga. That is, 5-S-
It has been suggested that GAD not only acts as an antibacterial at the initial stage of bacterial infection, but also acts as an activator of the Rel family transcription factor by producing hydrogen peroxide (Natori S. Molecular Mechanisms of Immune).
Responses in Insects. London, Chapman & Hall, 199
8, 245-260). Rel family transcription factors are known to activate a series of antimicrobial protein genes essential for the control of bacterial infection (Engsrom Y. Molecular Mecha).
nisms of Immune Responses in Insects. London, Chap
man & Hall, 1998, 211-244).

【0004】興味深いことに、5-S-GADは、v-srcを含む
哺乳類タンパク質チロシンキナーゼ類の強力な阻害物質
であることが示された(Hijikata M, et al. Biochem B
iophys Res Com 1997, 237, 423-426; Leem JY, et al.
Biol Pharm Bull 1998, 21,784-785; Zheng Z, et al.
Chem Pharm Bull 1998, 46, 1950-1951; Zheng Z,et a
l. Chem Pharm Bull 1999, 47, 136-137)。5-S-GADの
効力は、周知のタンパク質チロシンキナーゼ類の阻害物
質であるヘルビマイシン(herbimycin)Aとほぼ同等であ
った(Uehara Y, et al. Biochem Biophys Res Com 198
9, 163, 803-809; Fukazawa H, et al. Biochem Phamac
ol 1991, 42, 1661-1671; Fukazawa H, et al. FEBS Le
tters 1994, 340, 155-158)。受容体関連タンパク質チ
ロシンキナーゼ類は、膜通過シグナル伝達機構の初期段
階に関係すると考えられる。従って、これらのチロシン
キナーゼ類の変異によって、正常細胞から腫瘍細胞への
形質転換が生じる場合がある。かくして、5-S-GADがあ
る種の腫瘍細胞中の変異したタンパク質チロシンキナー
ゼを阻害することによって、インビトロで腫瘍細胞の生
長が抑制される可能性がある。
[0004] Interestingly, 5-S-GAD has been shown to be a potent inhibitor of mammalian protein tyrosine kinases, including v-src (Hijikata M, et al. Biochem B).
iophys Res Com 1997, 237, 423-426; Leem JY, et al.
Biol Pharm Bull 1998, 21,784-785; Zheng Z, et al.
Chem Pharm Bull 1998, 46, 1950-1951; Zheng Z, et a
l. Chem Pharm Bull 1999, 47, 136-137). The potency of 5-S-GAD was almost equivalent to that of herbimycin A, a known inhibitor of protein tyrosine kinases (Uehara Y, et al. Biochem Biophys Res Com 198).
9, 163, 803-809; Fukazawa H, et al. Biochem Phamac
ol 1991, 42, 1661-1671; Fukazawa H, et al. FEBS Le
tters 1994, 340, 155-158). Receptor-related protein tyrosine kinases are thought to be involved in the early steps of the transmembrane signaling mechanism. Thus, mutations of these tyrosine kinases may result in transformation from normal cells to tumor cells. Thus, by inhibiting 5-S-GAD from mutating protein tyrosine kinases in certain tumor cells, tumor cell growth may be inhibited in vitro.

【0005】本発明者らは上記仮定に基づいて、様々な
ヒト腫瘍細胞の生長に対する5-S-GADの効果を検討する
ことにした。癌研究日本財団(Japanese Foundation for
Cancer Research)のスクリーニングプログラムにおい
て、38種のヒト癌細胞系統を用い、インビトロで5-S-
GADが腫瘍細胞の生長を阻害するかどうかを検討した結
果、一定の癌細胞系統の生長は、5-S-GADの存在下で阻
害されることが示唆された(Yamori T. Jpn J Cancer C
hemother(癌と化学療法),1998, 25(Supple. II), 22
6)。しかし、これらの研究は、癌研究日本財団のスク
リーニングプログラムで得られた非常に予備的な結果で
あり、5-S-GADがある種の乳癌および黒色腫に対して選
択的な抗腫瘍効果を奏するかどうかは明らかではなかっ
た。
[0005] Based on the above assumptions, the present inventors have studied the effect of 5-S-GAD on the growth of various human tumor cells. Japanese Foundation for Cancer Research
Cancer Research) screening program using 38 human cancer cell lines in vitro with 5-S-
Examination of whether GAD inhibits the growth of tumor cells suggests that the growth of certain cancer cell lines is inhibited in the presence of 5-S-GAD (Yamori T. Jpn J Cancer C
hemother (cancer and chemotherapy), 1998, 25 (Supple. II), 22
6). However, these studies are very preliminary results from the Cancer Research Nippon Foundation screening program, and 5-S-GAD has shown selective antitumor effects against certain types of breast cancer and melanoma. It was not clear if they would play.

【0006】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、5-S-GADが
ある種の乳癌および黒色腫に対して選択的な抗腫瘍効果
をインビトロ及びインビボで発揮することを実証し、こ
れらの癌又は腫瘍に対して選択的な抗腫瘍剤を提供する
ことを解決すべき課題とした。
The present invention demonstrates that 5-S-GAD exerts a selective antitumor effect on certain breast cancers and melanomas in vitro and in vivo, Another object of the present invention is to provide a selective antitumor agent for a tumor.

【0007】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、インビト
ロおよびインビボにおいて乳癌の細胞系統および黒色腫
の細胞系統の生長に対する5-S-GADの効果を厳密に検討
した結果、5-S-GADがこれら細胞系統に対して選択的な
生長阻害効果を奏することを実証し、本発明を完成する
に至った。
The present inventors strictly studied the effects of 5-S-GAD on the growth of breast cancer cell lines and melanoma cell lines in vitro and in vivo, and It has been demonstrated that GAD exerts a selective growth inhibitory effect on these cell lines, and the present invention has been completed.

【0008】即ち、本発明によれば、N−β−アラニル
−5−S−グルタチオニル−3,4−ジヒドロキシフェ
ニルアラニン(5-S-GAD)、β−アラニル−3,4−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン(β-AD)、5−S−シス
テイニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-
S-CD)、及び薬学的に許容されるそれらの塩から成る群
から選択される少なくとも1種を有効成分として含む、
黒色腫の治療に用いる抗腫瘍剤が提供される。本発明の
別の側面によれば、N−β−アラニル−5−S−グルタ
チオニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-
S-GAD)、β−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン(β-AD)、5−S−システイニル−3,4
−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-CD)、及び薬学
的に許容されるそれらの塩から成る群から選択される少
なくとも1種を有効成分として含む、乳癌の治療に用い
る抗腫瘍剤が提供される。
That is, according to the present invention, N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β- AD), 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-
S-CD), and at least one selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient,
An antitumor agent for use in treating melanoma is provided. According to another aspect of the present invention, N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-
S-GAD), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD), 5-S-cysteinyl-3,4
An antitumor agent for treating breast cancer, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of -dihydroxyphenylalanine (5-S-CD) and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

【0009】本発明の別の観点からは、黒色腫または乳
癌を治療する方法であって、上記化合物の有効量をヒト
を含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法;並びに、
黒色腫または乳癌の治療に用いる抗腫瘍剤の製造のため
の上記化合物の使用が提供される。
[0009] In another aspect of the present invention, there is provided a method of treating melanoma or breast cancer, which comprises the step of administering an effective amount of the compound to a mammal, including a human.
There is provided the use of a compound as described above for the manufacture of an anti-tumor agent for use in the treatment of melanoma or breast cancer.

【0010】[0010]

【発明の実施の形態】本発明の抗腫瘍剤の有効成分は、
N−β−アラニル−5−S−グルタチオニル−3,4−
ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GAD)、β−アラ
ニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(β-A
D)、5−S−システイニル−3,4−ジヒドロキシフ
ェニルアラニン(5-S-CD)、または薬学的に許容される
それらの塩からなる群から選ばれる化合物である。5-S-
GAD、β-AD、並びに5-S-CDの化学構造を図1に示す。
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The active ingredient of the antitumor agent of the present invention comprises
N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-
Dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-A
D), 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD), or a pharmaceutically acceptable salt thereof. 5-S-
FIG. 1 shows the chemical structures of GAD, β-AD, and 5-S-CD.

【0011】5-S-GAD、β-AD、または5-S-CDには不斉炭
素が存在するが、それらの不斉炭素の立体配置は特に限
定されず、S-又はR-配置(α位又はβ位と呼ぶ場合もあ
る)のいずれであってもよい。上記化合物が、1若しく
は2個以上の不斉炭素に基づく異性体として存在可能な
場合には、立体化学的に純粋な形態の任意の異性体(光
学異性体、ジアステレオ異性体など)や、任意の異性体
の混合物又はラセミ体などを用いることができる。
Asymmetric carbon exists in 5-S-GAD, β-AD, or 5-S-CD, but the configuration of the asymmetric carbon is not particularly limited, and the S- or R-configuration ( (sometimes referred to as α-position or β-position). When the compound can exist as an isomer based on one or more asymmetric carbons, any stereoisomerically pure isomer (optical isomer, diastereoisomer, etc.), A mixture of arbitrary isomers or a racemate can be used.

【0012】また、本発明で用いる抗腫瘍化合物が塩の
形態で存在可能な場合には、薬学的に許容される塩の形
態で本発明の抗腫瘍剤に配合してもよい。さらに、遊離
形態又は塩の形態の抗腫瘍化合物の水和物又は溶媒和物
を本発明の抗腫瘍剤に有効成分として配合して用いても
よい。薬学的に許容される塩には酸付加塩、塩基付加
塩、及びアミノ酸付加塩などが包含される。酸付加塩と
しては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン
酸塩等の無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、安息
香酸塩、メタンスルホン酸塩、p−トルエンスルホン酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸
塩、コハク酸塩、乳酸塩等の有機酸塩を挙げることがで
きる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カ
リウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの金属
塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、トリエチルアミ
ン塩などのアミン塩を用いることができる。アミノ酸付
加塩としては、例えば、グリシン、フェニルアラニン、
アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩を用いること
ができる。
When the antitumor compound used in the present invention can exist in the form of a salt, it may be mixed with the antitumor agent of the present invention in the form of a pharmaceutically acceptable salt. Further, a hydrate or solvate of the antitumor compound in a free form or a salt form may be used as an active ingredient in the antitumor agent of the present invention. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts, base addition salts, amino acid addition salts and the like. Examples of the acid addition salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate and phosphate, formate, acetate, oxalate, benzoate, methanesulfonate, p- Organic acid salts such as toluenesulfonate, maleate, fumarate, tartrate, citrate, succinate and lactate can be mentioned. As the base addition salt, for example, metal salts such as sodium salt, potassium salt, magnesium salt and calcium salt, and amine salts such as ammonium salt, methylamine salt and triethylamine salt can be used. As amino acid addition salts, for example, glycine, phenylalanine,
Addition salts such as aspartic acid and glutamic acid can be used.

【0013】本発明の抗腫瘍剤は好ましくは、黒色腫ま
たは乳癌に対して選択的な抗腫瘍作用を発揮する。本発
明は以下の理論に拘束されることはないが、本発明の抗
腫瘍剤は、一般的には、脳腫瘍、大腸癌、肺癌、胃癌、
卵巣癌および腎臓癌に対する抗腫瘍活性を有さない。黒
色腫または乳癌は、原発癌のみならず、転移癌又は再発
癌に対しても適用可能である。
The antitumor agent of the present invention preferably exerts a selective antitumor effect on melanoma or breast cancer. Although the present invention is not limited by the following theory, the antitumor agent of the present invention is generally a brain tumor, colon cancer, lung cancer, gastric cancer,
No antitumor activity against ovarian and kidney cancer. Melanoma or breast cancer is applicable not only to primary cancer but also to metastatic or recurrent cancer.

【0014】黒色腫は好ましくは転移性黒色腫である。
但し、本明細書で用いる黒色腫という用語は最も広い意
味で解釈すべきであり、若年性黒色腫、悪性黒色腫(黒
色肉腫)の全てを包含する。乳癌の種類は特に限定され
ない。本発明の抗腫瘍剤が抗腫瘍作用を発揮する乳癌細
胞の具体例としては、MDA-MB-231およびMDA-MB-435Sな
どが挙げられる。
[0014] The melanoma is preferably a metastatic melanoma.
However, the term melanoma as used herein should be interpreted in the broadest sense and encompasses all juvenile melanomas, malignant melanomas (melanomas). The type of breast cancer is not particularly limited. Specific examples of the breast cancer cells on which the antitumor agent of the present invention exerts an antitumor effect include MDA-MB-231 and MDA-MB-435S.

【0015】N−β−アラニル−5−S−グルタチオニ
ル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GA
D)、β−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルア
ラニン(β-AD)、5−S−システイニル−3,4−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン(5-S-CD)は、特開平8−
337594号公報、Leem JY, et al. J Biol Chem 19
96, 271, 13573-13577、並びにIto S, et al. J Med Ch
em 1981, 124, 673-677等の公知の製造方法に準じて、
当業者ならば容易に製造することができる。具体的に
は、5-S-GADは、センチニクバエの成虫に傷を与えて飼
育した後に体液を採取するか、ホモジネート化して原料
となし、これをイオンカラムクロマトグラフィー及び逆
相HPLCにより分離・分画処理して抗菌活性を有する
画分を採取する方法により得ることができる。
N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GA
D), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD) and 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD) are disclosed in
337594, Leem JY, et al. J Biol Chem 19
96, 271, 13573-13577, and Ito S, et al. J Med Ch
em 1981, 124, 673-677.
A person skilled in the art can easily produce. Specifically, 5-S-GAD is used as a raw material by collecting or homogenizing a body fluid after breeding the adult adult of the fly, wounded on the fly, and separating it by ion column chromatography and reverse phase HPLC. It can be obtained by a method of collecting fractions having antibacterial activity by fractionation treatment.

【0016】あるいは、5-S-GADはアミノ酸の縮合合成
法及び酵素処理法の両方を利用して合成することもでき
る。具体的には、t−ブトキシカルボニル−β−アラニ
ル−N−ヒドロキシスクシンイミドとL−β−3,4−
ジヒドロキシフェニルアラニン(dopa)とをジクロ
ロメタン、トリエタノールアミン、シアン化メチル及び
ジメチルフルオリドの存在下に反応させ、反応混合物に
1N塩酸を添加して酸性条件下で酢酸エチルを用いて抽
出処理を行う。酢酸エチル層について減圧下で濃縮して
析出する結晶を回収し、溶解後、HPLCにより精製し
てβ−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニ
ン(β−アラニル−dopa)を得る。なお、β−アラ
ニル−dopaは、液相ペプチド合成法により調製する
こともできる。次いで、β−アラニル−dopaをグル
タチオンと共にリン酸緩衝液に溶解し、チロシナーゼに
て処理し、塩酸などで反応液のpHを1とした後、HP
LCにより分離・精製することで5-S-GADを得ることが
できる。
Alternatively, 5-S-GAD can be synthesized using both the condensation synthesis method of amino acids and the enzyme treatment method. Specifically, t-butoxycarbonyl-β-alanyl-N-hydroxysuccinimide and L-β-3,4-
Dihydroxyphenylalanine (dopa) is reacted in the presence of dichloromethane, triethanolamine, methyl cyanide and dimethyl fluoride, 1N hydrochloric acid is added to the reaction mixture, and extraction is performed using ethyl acetate under acidic conditions. The ethyl acetate layer is concentrated under reduced pressure to collect the precipitated crystals, which are then dissolved and purified by HPLC to obtain β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-alanyl-dopa). Β-alanyl-dopa can also be prepared by a liquid phase peptide synthesis method. Next, β-alanyl-dopa was dissolved in phosphate buffer together with glutathione, treated with tyrosinase, and the pH of the reaction solution was adjusted to 1 with hydrochloric acid or the like.
5-S-GAD can be obtained by separation and purification by LC.

【0017】本発明の抗腫瘍剤としては、N−β−アラ
ニル−5−S−グルタチオニル−3,4−ジヒドロキシ
フェニルアラニン(5-S-GAD)、β−アラニル−3,4
−ジヒドロキシフェニルアラニン(β-AD)、5−S−
システイニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン
(5-S-CD)、及び薬学的に許容されるそれらの塩から成
る群から選択される少なくとも1種をそのまま単独で用
いてもよいが、通常は製剤学的に許容される製剤用添加
物を用いて医薬組成物の形態で供給することが好まし
い。本発明の抗腫瘍剤は経口的又は非経口的に投与する
ことができる。経口投与に適する医薬組成物としては、
例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸
濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与
に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴
剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本
発明の抗腫瘍剤の形態はこれらに限定されることはな
い。
The antitumor agents of the present invention include N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD), β-alanyl-3,4
-Dihydroxyphenylalanine (β-AD), 5-S-
At least one selected from the group consisting of cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD) and pharmaceutically acceptable salts thereof may be used alone as it is, but it is usually used in pharmaceuticals. It is preferable to supply the composition in the form of a pharmaceutical composition using an excipient which is chemically acceptable. The antitumor agent of the present invention can be administered orally or parenterally. Pharmaceutical compositions suitable for oral administration include:
For example, tablets, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, syrups and the like can be mentioned. Examples of the pharmaceutical composition suitable for parenteral administration include injections, drops, suppositories, Examples include transdermal absorbents, but the form of the antitumor agent of the present invention is not limited thereto.

【0018】本発明の抗腫瘍剤はヒトを含む哺乳動物に
投与することができる。本発明の抗腫瘍剤の投与量は患
者の年齢、性別、体重、症状、及び投与経路などの条件
に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成
人一日あたり1mg/kgから1,000mg/kg程度の
範囲であり、好ましくは10mg/kgから500mg/
kg程度の範囲であり、特に好ましくは50mg/kg
〜100mg/kg程度の範囲である。上記投与量の抗
腫瘍剤は、毎日投与してもよいしあるいは数日間隔で投
与してもよく、例えば1〜4日毎に投与される。なお、
本発明の抗腫瘍剤を他の抗腫瘍剤と併用することもで
き、その場合の投与量も上記と同様である。
The antitumor agent of the present invention can be administered to mammals including humans. The dose of the antitumor agent of the present invention should be appropriately adjusted according to the conditions such as the age, sex, body weight, symptoms, and administration route of the patient. In general, the dose per adult per day is 1 mg / kg. To 1,000 mg / kg, preferably 10 mg / kg to 500 mg / kg.
kg, particularly preferably 50 mg / kg.
The range is about 100 mg / kg. The above dose of the antitumor agent may be administered daily or may be administered at intervals of several days, for example, every 1 to 4 days. In addition,
The antitumor agent of the present invention can be used in combination with other antitumor agents, and the dosage in that case is also the same as described above.

【0019】本発明の抗腫瘍剤の製造に用いられる製剤
用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可
能である。例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、分散剤、
懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化
剤、pH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることがで
き、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業
者に周知されている。以下の実施例により本発明をさら
に具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって
限定されることはない。
The type of the pharmaceutical additive used for producing the antitumor agent of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, excipients, binders, lubricants, dispersants,
Suspending agents, emulsifying agents, buffers, antioxidants, preservatives, tonicity agents, pH regulators, solubilizers, stabilizers, and the like can be used, and individual specific components used for these purposes can be used. Are well known to those skilled in the art. The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the scope of the present invention is not limited by the examples.

【0020】[0020]

【実施例】材料と方法 化合物:N−β−アラニル−5−S−グルタチオニル−
3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GAD)、
β−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン
(β-AD)、および5−S−システイニル−3,4−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン(5-S-CD)は、既報の通
り、化学的および/または酵素的に合成した(LeemJY,
et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-13577; Ito S,
et al. J Med Chem1981, 124, 673-677)。
EXAMPLES Materials and Methods Compound: N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-
3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GAD),
β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD) and 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD) are chemically and / or enzymatically, as previously reported. Synthesized (LeemJY,
et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-13577; Ito S,
et al. J Med Chem 1981, 124, 673-677).

【0021】細胞:ヒト黒色腫(LOX-IMV1)および乳癌
2種(MDA-MB-231およびMCF-7)は癌研究日本財団から
提供された。ヒト乳癌3種(MDA-MB-435S、MDA-MB-468
およびT47D)は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(American Type CultureCollection)より購
入した。これらの細胞は、FCS10%、ストレプトマイシン
100μg/mlおよびペニシリン100U/mlを補充したRPMI 164
0培地中37℃で、空気95%/二酸化炭素5%の下で培養し
た。これらの細胞生長に対する5-S-GADの効果を検討す
るために、細胞をFCS 0.5%を含む培地中で培養した。
Cells: Human melanoma (LOX-IMV1) and two breast cancers (MDA-MB-231 and MCF-7) were provided by The Cancer Research Nippon Foundation. 3 types of human breast cancer (MDA-MB-435S, MDA-MB-468
And T47D) were purchased from the American Type Culture Collection. These cells contain 10% FCS, streptomycin
RPMI 164 supplemented with 100 μg / ml and 100 U / ml penicillin
The cells were cultured in 0 medium at 37 ° C under 95% air / 5% carbon dioxide. To study the effect of 5-S-GAD on these cell growths, cells were cultured in a medium containing 0.5% FCS.

【0022】実施例1:腫瘍細胞の生長に対する5-S-GA
Dのインビトロの効果のアッセイ: (方法)ゼラチン2%を含むPBS(-)で処理した96穴マイク
ロタイタープレートを使用した。細胞は初めにFCS 0.5%
を含む培地で1週間予備培養した。次に、約5,000個(M
DA-MB-231およびMDA-MB-435S)〜10,000個(LOX-IMV1、
MDA-MB-468、T47DおよびMCF-7)の細胞を、同様の培地1
00μlを含むウエルに接種した。37℃で24時間インキュ
ベートした後、連続的に希釈した5-S-GADを含む温めた
培地100μlを加え、2日間インキュベーションを続け
た。その後、細胞増殖を、alamarBlue(商品名)キット
(BIOSOURCE INTERNATIONAL製)を使用し、製造元の取
扱説明書に従って定量した。簡単に説明すると、細胞を
試験薬と共にインキュベートした後、alamarBlue10%お
よびFCS 0.5%を含む新しい培地中で4時間処理し、続い
て570nmおよび600nmの吸収を測定して、細胞増殖を定量
した。結果を図2に記載する。
Example 1: 5-S-GA on tumor cell growth
Assay of in vitro effect of D: (Method) A 96-well microtiter plate treated with PBS (-) containing 2% gelatin was used. Cells are initially FCS 0.5%
Was pre-cultured for 1 week in a medium containing Next, about 5,000 pieces (M
DA-MB-231 and MDA-MB-435S) to 10,000 (LOX-IMV1,
MDA-MB-468, T47D and MCF-7) cells were transferred to a similar medium 1
Wells containing 00 μl were inoculated. After incubation at 37 ° C. for 24 hours, 100 μl of warmed medium containing serially diluted 5-S-GAD was added and the incubation continued for 2 days. Thereafter, cell proliferation was quantified using alamarBlue (trade name) kit (manufactured by BIOSOURCE INTERNATIONAL) according to the manufacturer's instructions. Briefly, after the cells were incubated with the test agent, they were treated in fresh medium containing 10% alamarBlue and 0.5% FCS for 4 hours, followed by measuring the absorbance at 570 nm and 600 nm to quantify cell proliferation. The results are shown in FIG.

【0023】(結果)5-S-GADは免疫したSarcophaga
(ニクバエ)の成虫から単離した抗菌性化合物である
(Leem JY, et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-135
77; Natori S. Molecular Mechanisms of Immune Respo
nses in Insects. London, Chapman & Hall, 1998, 245
-260)。実施例1では、各種の細胞系統の生長に対する
5-S-GADおよびその誘導体(図1に記載)の効果を厳密
に検討し、IC50値を他の薬物と比較した。
(Results) 5-S-GAD was immunized with Sarcophaga
(Leem JY, et al. J Biol Chem 1996, 271, 13573-135).
77; Natori S. Molecular Mechanisms of Immune Respo
nses in Insects. London, Chapman & Hall, 1998, 245
-260). In Example 1, the growth of various cell lines was
The effects of 5-S-GAD and its derivatives (described in FIG. 1) were strictly examined, and the IC 50 values were compared with those of other drugs.

【0024】上述の通り、先ずヒト黒色腫(LOX-IMV1)
および乳癌(MDA-MB-231、MDA-MB-435S、MDA-MB-468、T
47DおよびMCF-7)細胞を、FCS 0.5%を含むRPMI 1640培
地中、ゼラチンでコートしたプレート上で24時間培養し
た。次に、5-S-GAD、ヘルビマイシンAおよびマイトマ
イシンCの量を変えて培地に加え、2日間培養を継続し
た。almarBlue(商品名)キットを使用して、細胞増殖
を定量した。対照(薬物なし)に対する細胞生長を、薬
物投与量(logM)に対してプロットした(図2)。測定
は三回ずつ行い、3回の別々の実験の平均をSDと共に
示す。図2において、黒丸は5-S-GAD、黒三角はマイト
マイシンC、そして黒四角はヘルビマイシンAを示す。
As described above, first, human melanoma (LOX-IMV1)
And breast cancer (MDA-MB-231, MDA-MB-435S, MDA-MB-468, T
47D and MCF-7) cells were cultured in RPMI 1640 medium with 0.5% FCS on gelatin-coated plates for 24 hours. Next, varying amounts of 5-S-GAD, herbimycin A and mitomycin C were added to the medium, and the culture was continued for 2 days. Cell proliferation was quantified using almarBlue (trade name) kit. Cell growth versus control (no drug) was plotted against drug dose (logM) (FIG. 2). Measurements were performed in triplicate and the average of three separate experiments is shown with SD. In FIG. 2, a closed circle indicates 5-S-GAD, a closed triangle indicates mitomycin C, and a closed square indicates herbimycin A.

【0025】図2に示すように、5-S-GAD感受性細胞系
統(LOX-IMV1、MDA-MB-231およびMDA-MB-435S)の生長
は5-S-GADの投与量に依存して阻害されたが、非感受性
細胞系統(MDA-MB-468、T47DおよびMCF-7)は影響を受
けなかった。5-S-GAD非存在下における培養条件下で、
それらの非感受性細胞系統の平均倍加時間は約24時間で
あり、生長速度と5-S-GADの有効性との間に認知できる
関係は認められなかった。感受性細胞を5-S-GADで処理
した際には、細胞が浮かび上がり、細胞の形態が著しく
変化することから、5-S-GADの効果は静細胞性よりはむ
しろ細胞傷害性であった。5-S-GADとは逆に、タンパク
質チロシンキナーゼ類の強力な阻害物質であるヘルビマ
イシンAは、試験した全ての細胞系統の生長を阻害し、
ヘルビマイシンAが非特異的な生長阻害物質であること
が実証された。マイトマイシンCも試験した全ての細胞
系統の生長を阻害した。
As shown in FIG. 2, the growth of 5-S-GAD-sensitive cell lines (LOX-IMV1, MDA-MB-231 and MDA-MB-435S) depends on the dose of 5-S-GAD. Inhibited, but insensitive cell lines (MDA-MB-468, T47D and MCF-7) were not affected. Under culture conditions in the absence of 5-S-GAD,
The average doubling time of these insensitive cell lines was about 24 hours, and there was no perceptible relationship between growth rate and the effectiveness of 5-S-GAD. When susceptible cells were treated with 5-S-GAD, the effect of 5-S-GAD was cytotoxic rather than cytostatic, as the cells emerged and markedly altered cell morphology . Contrary to 5-S-GAD, herbimycin A, a potent inhibitor of protein tyrosine kinases, inhibits the growth of all tested cell lines,
Herbimycin A was demonstrated to be a non-specific growth inhibitor. Mitomycin C also inhibited the growth of all cell lines tested.

【0026】LOX-IMV1、MDA-MB-231およびMDA-MB-435S
に対する5-S-GADのIC50値は、それぞれ0.5、2および15
μMであったが、これらの値はヘルビマイシンAおよび
マイトマイシンCのIC50値とほぼ同等であった。これら
の結果から、5-S-GADのみがLOX-IMV1、MDA-MB-231およ
びMDA-MB-435Sに対して選択的な毒性を示すことが実証
された。
LOX-IMV1, MDA-MB-231 and MDA-MB-435S
The IC 50 values of 5-S-GAD for each 0.5, 2 and 15
was μM, these values were almost equivalent to an IC 50 value of herbimycin A and mitomycin C. These results demonstrated that only 5-S-GAD exhibited selective toxicity to LOX-IMV1, MDA-MB-231 and MDA-MB-435S.

【0027】さらに、これらの癌細胞系統の生長に対す
るβ-ADおよび5-S-CDの効果を検討した(Fujita K, et
al. Cancer Res 1980, 40, 2543-2546; Ito S, et al.
Biochem Pharmacol 1983, 32, 2079-2081)。こららの
2種類の化合物は5-S-GADの構成成分である(図1)。
以下の表1に要約したように、β-ADおよび5-S-CDは共
に、5-S-GAD感受性細胞系統の生長を有意に阻害した
が、非感受性の細胞系統の生長は阻害しなかった。β-A
DのIC50値は、5-S-GADとほぼ同等であったが、5-S-CDの
IC50値は5-S-GADより高かった。
Furthermore, the effect of β-AD and 5-S-CD on the growth of these cancer cell lines was examined (Fujita K, et al.
al. Cancer Res 1980, 40, 2543-2546; Ito S, et al.
Biochem Pharmacol 1983, 32, 2079-2081). These two compounds are components of 5-S-GAD (FIG. 1).
As summarized in Table 1 below, both β-AD and 5-S-CD significantly inhibited the growth of 5-S-GAD sensitive cell lines but did not inhibit the growth of insensitive cell lines. Was. β-A
The IC 50 value of D was almost equivalent to that of 5-S-GAD, but that of 5-S-CD.
IC 50 values were higher than 5-S-GAD.

【0028】[0028]

【表1】 [Table 1]

【0029】実施例2:腫瘍細胞の生長に対する5-S-GA
Dのインビボ効果のアッセイ: (方法)このアッセイでは、LOX-IMV1(黒色腫)および
MDA-MB-435S(乳癌)を使用した。黒色腫細胞の生長に
対する化合物の効果は、既報の方法(Yamori T et al.,
Jpn J Cancer Res 1997, 88, 1205-1210)に準じて評価
した。初めに、黒色腫細胞(1×106個)を、SLC(日
本)より購入した6週令の雌のヌードマウス(BALB/c n
u/nu)の皮下に接種した。14日後、腫瘍結節を切除し、
断片化した。2×2×2mm3の断片を各ヌードマウスの皮下
に移植した。移植の4日後に、5-S-GADによる腹腔内
(i.p.)処置を開始した。乳癌細胞の生長に対する効果
は、既報の方法(Singh Y, et al. Breast Cancer Trea
t Res 1997, 45, 15-17; Price JE, et al. Cancer Res
1990, 50, 717-721)に準じて検討した。それぞれ約1
×107個の乳癌細胞を、雌のヌードマウスの右胸乳房の
脂肪パッドの2箇所に同所的に移植した。移植の7日後
に、5-S-GADによる処置を開始した。薬物の投与量およ
び化学療法のスケジュールは、Fujitaらによって報告さ
れた5-S-CDの投与量および化学療法スケジュールを参考
に選択した(Fujita K, et al. Cancer Res 1980,40, 2
543-2546)。5-S-GAD試料溶液の調製には、初めに5-S-G
ADを1N水酸化ナトリウムに溶解して320mg/ml(pH=7.0)
とし、注射直前に0.9%塩化ナトリウム溶液で希釈した。
化学療法スケジュールに従って、薬物溶液はマウス1匹
当たり1日0.1mlの容量を腹腔内に注射した。対照動物
には0.9%塩化ナトリウム溶液を同容量投与した。陽性対
照として、化学療法スケジュールの初日に5mg/kgのマイ
トマイシンCを投与した。それぞれの腫瘍塊の長さおよ
び幅を測定し、腫瘍容量をYamoriらの記載の通り計算し
た(Yamori T, et al. Jpn J Cancer Res 1997, 88,120
5-1210;Ito et al, J.Med.Chem 1981, 124, 673-67
7)。統計的評価はStudentのt-検定を用いて行った。得
られた結果を図3に示す。
Example 2: 5-S-GA on tumor cell growth
Assay for in vivo effects of D: (Method) In this assay, LOX-IMV1 (melanoma) and
MDA-MB-435S (breast cancer) was used. The effect of compounds on melanoma cell growth was determined by previously reported methods (Yamori T et al.,
Jpn J Cancer Res 1997, 88, 1205-1210). First, 6-week-old female nude mice (BALB / cn) purchased from SLC (Japan) were melanoma cells (1 × 10 6 ).
u / nu). 14 days later, the tumor nodule was excised,
Fragmented. 2 × 2 × 2 mm 3 fragments were implanted subcutaneously in each nude mouse. Four days after implantation, intraperitoneal (ip) treatment with 5-S-GAD was started. The effect on breast cancer cell growth was determined by previously reported methods (Singh Y, et al. Breast Cancer Trea
t Res 1997, 45, 15-17; Price JE, et al. Cancer Res
1990, 50, 717-721). About 1 each
The × 10 7 cells of the breast cancer cells were orthotopically transplanted in two places fat pad of the right breast breast female nude mice. Seven days after transplantation, treatment with 5-S-GAD was started. The drug dose and chemotherapy schedule were selected with reference to the 5-S-CD dose and chemotherapy schedule reported by Fujita et al. (Fujita K, et al. Cancer Res 1980, 40, 2).
543-2546). To prepare the 5-S-GAD sample solution, first add 5-SG
Dissolve AD in 1N sodium hydroxide to 320mg / ml (pH = 7.0)
And diluted with 0.9% sodium chloride solution immediately before injection.
According to the chemotherapeutic schedule, the drug solution was injected intraperitoneally in a volume of 0.1 ml per mouse per day. Control animals received the same volume of 0.9% sodium chloride solution. As a positive control, 5 mg / kg mitomycin C was administered on the first day of the chemotherapy schedule. The length and width of each tumor mass was measured and tumor volume was calculated as described by Yamori et al. (Yamori T, et al. Jpn J Cancer Res 1997, 88,120).
5-1210; Ito et al, J. Med. Chem 1981, 124, 673-67.
7). Statistical evaluation was performed using Student's t-test. The results obtained are shown in FIG.

【0030】(結果)図3において、aおよびbは、黒
色腫に対する結果を表し、cは乳癌に対する結果であ
る。矢印は、5-S-GAD(0.1ml/マウス/日)を腹腔内投与
した日を示す。陽性対照として、初日に、マウス一匹に
5mg/kgのマイトマイシンCを一回注射した。図3のaは
腫瘍を移植したマウスを移植の4、8、11および14日後に
5-S-GADで処置した結果を示す。処置は;黒四角は対照
(n=4)を示し、黒丸は5-S-GAD(100mg/kg)(n=4)を
示し、黒菱形は5-S-GAD(500mg/kg)(n=4)を示し、白
四角はマイトマイシンC(5mg/kg)(n=2)を各々示
す。
(Results) In FIG. 3, a and b show the results for melanoma, and c shows the results for breast cancer. The arrow indicates the day when 5-S-GAD (0.1 ml / mouse / day) was administered intraperitoneally. As a positive control, on the first day,
A single injection of 5 mg / kg mitomycin C was made. FIG. 3 a shows tumor-implanted mice 4, 8, 11 and 14 days after implantation.
The results of treatment with 5-S-GAD are shown. Treatments; solid squares indicate control (n = 4), solid circles indicate 5-S-GAD (100 mg / kg) (n = 4), solid diamonds indicate 5-S-GAD (500 mg / kg) (n = 4), and open squares indicate mitomycin C (5 mg / kg) (n = 2), respectively.

【0031】図3のbは、腫瘍を移植したマウスを腫瘍
移植の4〜8日後に毎日5-S-GADで処置した結果を示
す。処置は、黒四角は対照(n=4)を示し、白丸は5-S-G
AD(50mg/kg)(n=4)を示し、黒丸は5-S-GAD(100mg/k
g)(n=4)を示し、白四角はマイトマイシンC(5mg/k
g)(n=2)を示す。図3のcは、腫瘍を移植したマウス
を、移植の7日後から1日おきに20回、5-S-GADで処
置した結果を示す。陽性対照として、5mg/kgのマイトマ
イシンCを用いた(n=5)。処置は、黒四角は対照(n=
5)を示し、黒丸は5-S-GAD(100mg/kg)(n=5)を示
し、白菱形は5-S-GAD(200mg/kg)(n=5)を示し、白四
角はマイトマイシンC(5mg/kg)(n=5)を示す。
FIG. 3b shows the results of daily treatment of tumor-implanted mice with 5-S-GAD 4 to 8 days after tumor implantation. In the treatment, a closed square indicates a control (n = 4), and an open circle indicates 5-SG
AD (50 mg / kg) (n = 4), black circles indicate 5-S-GAD (100 mg / k
g) (n = 4), and open squares represent mitomycin C (5 mg / k).
g) (n = 2). FIG. 3c shows the results of treating the mouse with the transplanted tumor with 5-S-GAD 20 times every other day from 7 days after the transplantation. As a positive control, 5 mg / kg mitomycin C was used (n = 5). The treatments were as follows:
5), a black circle indicates 5-S-GAD (100 mg / kg) (n = 5), a white diamond indicates 5-S-GAD (200 mg / kg) (n = 5), and a white square indicates mitomycin. C (5 mg / kg) (n = 5) is shown.

【0032】この実験においては、腫瘍切片2片は、各
マウスの右胸乳房の脂肪パッドの2箇所に離して移植し
た。従って、1群当たり10個の腫瘍結節の容量を測定し
た。データは平均値であり、SEと共に示す。処置群お
よび対照群間の差の統計的有意性は、Studentのt-検定
によって計算した(*P<0.05、**P<0.01)。
In this experiment, two tumor sections were implanted separately at two locations on the fat pad of the right breast breast of each mouse. Therefore, the volume of 10 tumor nodules per group was measured. Data are mean values and are shown with SE. Statistical significance of differences between treatment and control groups was calculated by Student's t-test (* P <0.05, ** P <0.01).

【0033】実施例1において5-S-GADはインビトロで
ヒトのある種の癌細胞の生長を阻害することが示された
ので、5-S-GADがインビボでもそれらの生長を抑制する
かどうかを検討した。先ず、LOX-IMV1細胞を皮下に移植
し、次に5-S-GADを腹腔内に注射することによってLOX-I
MV1細胞を5-S-GADで処置した。黒色腫細胞(LOX-IMV1)
は、ヌードマウスにおいて急速に増殖することが判明
し、皮下に腫瘍結節を形成した。黒色腫については、2
つの治療スケジュールを検討した。100mg/kgおよび500m
g/kgの5-S-GADをそれぞれ移植の4、8、11および14日後
に腹腔内に4回注射した場合、腫瘍の生長は、図3のa
に示すように、投与量に依存して抑制される傾向を示し
た。動物を腫瘍移植の4〜8日後に毎日50mg/kgおよび1
00mg/kgの5-S-GADで処置した場合、同様の治療効果が観
察された(図3のb)。これらの結果から、最適な治療
スケジュールを採用すれば、5-S-GADがインビボで黒色
腫細胞の生長を抑制する有効な薬剤になりうることが判
明した。
Since in Example 1 5-S-GAD was shown to inhibit the growth of certain human cancer cells in vitro, it was determined whether 5-S-GAD suppressed their growth even in vivo. It was investigated. First, LOX-IMV1 cells are implanted subcutaneously, and then LOX-I is injected by intraperitoneal injection of 5-S-GAD.
MV1 cells were treated with 5-S-GAD. Melanoma cells (LOX-IMV1)
Was found to grow rapidly in nude mice and formed tumor nodules subcutaneously. For melanoma, 2
Two treatment schedules were considered. 100mg / kg and 500m
When g / kg of 5-S-GAD was injected intraperitoneally four times on days 4, 8, 11 and 14, respectively, of tumors, tumor growth was shown in FIG.
As shown in the figure, there was a tendency to be suppressed depending on the dose. Animals were dosed daily at 50 mg / kg and 1 to 4 days after tumor implantation.
A similar therapeutic effect was observed when treated with 00 mg / kg 5-S-GAD (FIG. 3b). These results indicated that 5-S-GAD could be an effective drug to suppress melanoma cell growth in vivo if the optimal treatment schedule was adopted.

【0034】また、乳癌細胞(即ち、MDA-MB-435S)の
生長に対する5-S-GADの効果を検討した。この実験にお
いては、各ヌードマウスの右胸乳房の2箇所の脂肪パッ
ドに、腫瘍細胞を同所的に注入した。MDA-MB-435Sの生
長は、黒色腫LOX-IMV1よりもかなり遅かった。MDA-MB-4
35Sとは異なり、MDA-MB-231は、ヌードマウスにおいて
生長が認められなかった。腫瘍を移植したマウスに、移
植の7日後から1日おきに20回、100mg/kg又は200mg/
kgの5-S-GADを腹腔内に投与した。図3のcに示すよう
に、腫瘍結節の生長は有意に抑制された。これらの条件
下で、2つの投与量の間で実質的な差は見られなかっ
た。
The effect of 5-S-GAD on the growth of breast cancer cells (ie, MDA-MB-435S) was examined. In this experiment, tumor cells were orthotopically injected into two fat pads on the right breast of each nude mouse. MDA-MB-435S grew significantly slower than melanoma LOX-IMV1. MDA-MB-4
Unlike 35S, MDA-MB-231 showed no growth in nude mice. The mice transplanted with the tumor were administered 20 times every other day from 7 days after the transplantation at 100 mg / kg or 200 mg / kg.
kg of 5-S-GAD was administered intraperitoneally. As shown in FIG. 3c, the growth of tumor nodules was significantly suppressed. Under these conditions, no substantial difference was seen between the two doses.

【0035】対照のマウスと比較して、5-S-GAD処置マ
ウスの体重の有意な減少は認められなかった。5-S-GAD
の腹腔内の単回投与では、8g/kgまで毒性死亡は起こら
なかった。これらの実験において、陽性コントロールと
して5mg/kgのマイトマイシンCの単回腹腔内注射を行っ
た。5-S-GADの化学療法的効果はマイトマイシンCより
も明らかに弱かったが、5-S-GADはある種の癌細胞に選
択的な毒性を有することが示された。
There was no significant decrease in body weight of 5-S-GAD-treated mice as compared to control mice. 5-S-GAD
A single intraperitoneal dose of did not cause toxic mortality up to 8 g / kg. In these experiments, a single intraperitoneal injection of 5 mg / kg mitomycin C was performed as a positive control. Although the chemotherapeutic effect of 5-S-GAD was clearly weaker than mitomycin C, 5-S-GAD was shown to be selectively toxic to certain cancer cells.

【0036】(実施例の考察)実施例1の結果から分か
るように、5-S-GADを培地に加えると、ヒトの2種の乳
癌細胞系統および1種の黒色腫細胞系統の生長が阻害さ
れた。これらの細胞に対する5-S-GADのIC50値は、0.5〜
15mMの範囲であり、ヘルビマイシンAおよびマイトマ
イシンCと同等であった。非常に興味深いことに、5-S-
GADは、転移性黒色腫およびエストロゲン受容体陰性悪
性乳癌(Thompson EW, et al. J Cell Physiol 1992, 1
50, 534-544)を選択的に阻害した。5-S-GADはタンパク
質チロシンキナーゼ類の強力な阻害物質であることか
ら、これらの感受性細胞は、5-S-GADに対する感受性を
著しく高める突然変異を起こすチロシンプロテインキナ
ーゼを含有することが示唆される。また、5-S-GADが感
受性細胞に対してのみ透過性を有し、非感受性細胞には
透過性を有さないという可能性もある。現時点では、5-
S-GADがこれらの細胞に対して選択的毒性を示す理由は
明らかではない。しかし、5-S-GADは、検討した他の細
胞系統の生長には影響を及ぼさなかったことから、5-S-
GADの正常細胞に対する毒性は無視できる。
(Consideration of Examples) As can be seen from the results of Example 1, when 5-S-GAD was added to the medium, the growth of two human breast cancer cell lines and one melanoma cell line was inhibited. Was done. The IC 50 value of 5-S-GAD for these cells is between 0.5 and
The range was 15 mM, which was equivalent to herbimycin A and mitomycin C. Interestingly, 5-S-
GAD is a metastatic melanoma and estrogen receptor-negative malignant breast cancer (Thompson EW, et al. J Cell Physiol 1992, 1
50, 534-544). 5-S-GAD is a potent inhibitor of protein tyrosine kinases, suggesting that these sensitive cells contain a mutating tyrosine protein kinase that significantly enhances sensitivity to 5-S-GAD. You. It is also possible that 5-S-GAD is permeable only to sensitive cells and not permeable to non-sensitive cells. At present, 5-
It is not clear why S-GAD is selectively toxic to these cells. However, 5-S-GAD did not affect the growth of the other cell lines examined,
The toxicity of GAD to normal cells is negligible.

【0037】実施例2で示したように、腫瘍を移植した
ヌードマウスを用いて、5-S-GADがインビボで化学療法
的活性を示すかどうかを検討した結果、インビトロで5-
S-GADに対して感受性を有するLOX-IMV1およびMDA-MB-43
5Sに対する有効な抗腫瘍活性が得られた。この結果か
ら、5-S-GADはインビボでこれら一定の癌細胞の生長を
抑制する潜在能力を有することが示された。
As shown in Example 2, it was examined whether 5-S-GAD exhibits chemotherapeutic activity in vivo using tumor-transplanted nude mice.
LOX-IMV1 and MDA-MB-43 sensitive to S-GAD
Effective antitumor activity against 5S was obtained. The results indicated that 5-S-GAD has the potential to suppress the growth of these certain cancer cells in vivo.

【0038】これらの細胞の生長を阻害するインビトロ
で得られた5-S-GADのIC50値は、マイトマイシンCおよ
びヘルビマイシンAとほぼ同等であったが、5-S-GADの
インビボの力価は、マイトマイシンCより低かった。こ
れは多分、腹腔内処置によって、5-S-GADのバイオアベ
イラビリティが低下したためである。即ち、5-S-GADは
インビボでタンパク質および他の成分に非特異的に吸着
されてしまうことにより見かけの力価が著しく低下して
いる可能性がある。別の可能性としては、5-S-GADがイ
ンビボで容易に代謝されて、その活性を急速に失うのか
もしれない。
The IC 50 value of 5-S-GAD obtained in vitro, which inhibits the growth of these cells, was almost equivalent to mitomycin C and herbimycin A, but the in vivo titer of 5-S-GAD was Was lower than mitomycin C. This is probably due to reduced bioavailability of 5-S-GAD due to intraperitoneal treatment. That is, 5-S-GAD may be adsorbed nonspecifically to proteins and other components in vivo, and the apparent titer may be significantly reduced. Another possibility may be that 5-S-GAD is readily metabolized in vivo and rapidly loses its activity.

【0039】本発明により、5-S-GADがヒトのある種の
癌細胞を治療するのに有用であることが示された。ま
た、β-ADはインビトロで5-S-GAD感受性癌細胞の生長を
有意に抑制するので、β-ADはインビボでもある種の癌
細胞を治療するのに有用であることが示唆される。
The present invention has shown that 5-S-GAD is useful for treating certain human cancer cells. Also, β-AD significantly suppresses the growth of 5-S-GAD-sensitive cancer cells in vitro, suggesting that β-AD is useful for treating certain cancer cells in vivo.

【0040】[0040]

【発明の効果】本発明により、黒色腫または乳癌の治療
に用いることができる抗腫瘍剤が提供されることになっ
た。本発明の抗腫瘍剤は毒性が低いので、上記した癌の
治療に有用である。
According to the present invention, an antitumor agent which can be used for treating melanoma or breast cancer has been provided. Since the antitumor agent of the present invention has low toxicity, it is useful for treating the above-mentioned cancer.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】図1は、5-S-GAD、β-ADおよび5-S-CDの構造を
示す。
FIG. 1 shows the structures of 5-S-GAD, β-AD and 5-S-CD.

【図2】図2は、5-S-GADによるインビトロのヒト癌細
胞の生長の阻害を示すグラフである。
FIG. 2 is a graph showing the inhibition of human cancer cell growth in vitro by 5-S-GAD.

【図3】図3は、5-S-GADによるインビボのLOX-IMV1お
よびMDA-MB-435Sの生長の阻害を示すグラフである。
FIG. 3 is a graph showing the inhibition of LOX-IMV1 and MDA-MB-435S growth in vivo by 5-S-GAD.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 N−β−アラニル−5−S−グルタチオ
ニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GA
D)、β−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルア
ラニン(β-AD)、5−S−システイニル−3,4−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン(5-S-CD)、及び薬学的に
許容されるそれらの塩から成る群から選択される少なく
とも1種を有効成分として含む、黒色腫の治療に用いる
抗腫瘍剤。
(1) N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GA
D), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD), 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD), and pharmaceutically acceptable salts thereof. An antitumor agent for treating melanoma, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of:
【請求項2】 N−β−アラニル−5−S−グルタチオ
ニル−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン(5-S-GA
D)、β−アラニル−3,4−ジヒドロキシフェニルア
ラニン(β-AD)、5−S−システイニル−3,4−ジ
ヒドロキシフェニルアラニン(5-S-CD)、及び薬学的に
許容されるそれらの塩から成る群から選択される少なく
とも1種を有効成分として含む、乳癌の治療に用いる抗
腫瘍剤。
2. N-β-alanyl-5-S-glutathionyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-GA
D), β-alanyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (β-AD), 5-S-cysteinyl-3,4-dihydroxyphenylalanine (5-S-CD), and pharmaceutically acceptable salts thereof. An antitumor agent for treating breast cancer, comprising as an active ingredient at least one selected from the group consisting of:
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005213159A (en) * 2004-01-27 2005-08-11 Inbiotex:Kk Neovascularization inhibitor and vascular retraction agent
WO2007013147A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-01 Inbiotex Inc. Angiogenesis inhibitor and vascular regressive agent
US8304452B2 (en) 2005-06-07 2012-11-06 Inbiotex Inc. Radical scavenger and active oxygen eliminating agent

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