JP2001199997A - 細胞透過性キャリアペプチド - Google Patents
細胞透過性キャリアペプチドInfo
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- JP2001199997A JP2001199997A JP2000013504A JP2000013504A JP2001199997A JP 2001199997 A JP2001199997 A JP 2001199997A JP 2000013504 A JP2000013504 A JP 2000013504A JP 2000013504 A JP2000013504 A JP 2000013504A JP 2001199997 A JP2001199997 A JP 2001199997A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】細胞透過性キャリアペプチド及びペプチドコン
ジュゲートを提供する。 【解決手段】特別な配列のポリペプチドを含む細胞透過
性キャリアペプチド。及び上記ポリペプチドを含む細胞
透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ及
び糖からなる群から選ばれるいずれかを、必要に応じて
架橋剤を介して連結してなるキャリアペプチドコンジュ
ゲート。
ジュゲートを提供する。 【解決手段】特別な配列のポリペプチドを含む細胞透過
性キャリアペプチド。及び上記ポリペプチドを含む細胞
透過性キャリアペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ及
び糖からなる群から選ばれるいずれかを、必要に応じて
架橋剤を介して連結してなるキャリアペプチドコンジュ
ゲート。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞透過性キャリ
アペプチド及び該キャリアペプチドと異種ポリペプチ
ド、ＤＮＡ及び糖からなる群から選ばれるいずれかを連
結してなるキャリアペプチドコンジュゲートに関する。
また、本発明は、ポリペプチドないしタンパク質、さら
にはＤＮＡや糖を細胞内に導入するための細胞透過性キ
ャリアペプチドの使用に関する。
アペプチド及び該キャリアペプチドと異種ポリペプチ
ド、ＤＮＡ及び糖からなる群から選ばれるいずれかを連
結してなるキャリアペプチドコンジュゲートに関する。
また、本発明は、ポリペプチドないしタンパク質、さら
にはＤＮＡや糖を細胞内に導入するための細胞透過性キ
ャリアペプチドの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、合成ペプチドやタンパク質、さら
にはＤＮＡや糖を細胞内に導入し、細胞内でのタンパク
質相互作用を調節することにより細胞内情報伝達や転写
などに関する情報を得ようとする試みがなされている。
このアプローチにより、標的タンパクをコードした遺伝
子を導入する方法によっては困難なペプチド導入量の調
節や、非天然アミノ酸骨格を分子内に有するポリペプチ
ドの細胞内導入が期待できる。
にはＤＮＡや糖を細胞内に導入し、細胞内でのタンパク
質相互作用を調節することにより細胞内情報伝達や転写
などに関する情報を得ようとする試みがなされている。
このアプローチにより、標的タンパクをコードした遺伝
子を導入する方法によっては困難なペプチド導入量の調
節や、非天然アミノ酸骨格を分子内に有するポリペプチ
ドの細胞内導入が期待できる。
【０００３】一般にポリペプチド、核酸、糖は親水性が
高く、細胞膜を通過することは困難であり、ポリペプチ
ド、核酸、糖の細胞内導入には、マイクロインジェクシ
ョンの他、脂肪酸などの脂溶性分子とのハイブリッド化
による方法やリポソームを用いる方法が従来採られてき
た。
高く、細胞膜を通過することは困難であり、ポリペプチ
ド、核酸、糖の細胞内導入には、マイクロインジェクシ
ョンの他、脂肪酸などの脂溶性分子とのハイブリッド化
による方法やリポソームを用いる方法が従来採られてき
た。
【０００４】これらの方法とは別に、近年、疎水性のシ
グナルペプチド（Lin Y.Z., et al.(1995) J. Biol. Ch
em., 270, 14255-14258; Rojas M., et al. (1998) Na
t. Biotechnol., 16, 370-375)、或いはHIV-1 Tat タン
パク質やショウジョウバエAntennapediaタンパク質由来
の塩基性ペプチドを用いてペプチド・タンパク質を導入
する試みが知られている（特開平１０−３３１８６号公
報、Derossi D. et al. (1998) Trends. Cell Biol.,
8, 84-87; Fawell S., et al. (1994) Proc. Acad. Nat
l. Sci., USA, 91, 664-668; Nagahara H. et al. (19
98) Nat. Med.,4, 1449-1452)。
グナルペプチド（Lin Y.Z., et al.(1995) J. Biol. Ch
em., 270, 14255-14258; Rojas M., et al. (1998) Na
t. Biotechnol., 16, 370-375)、或いはHIV-1 Tat タン
パク質やショウジョウバエAntennapediaタンパク質由来
の塩基性ペプチドを用いてペプチド・タンパク質を導入
する試みが知られている（特開平１０−３３１８６号公
報、Derossi D. et al. (1998) Trends. Cell Biol.,
8, 84-87; Fawell S., et al. (1994) Proc. Acad. Nat
l. Sci., USA, 91, 664-668; Nagahara H. et al. (19
98) Nat. Med.,4, 1449-1452)。
【０００５】しかしながら、これら従来技術の試みで
は、ペプチドないしタンパク質、さらにはＤＮＡや糖を
十分に細胞内へ導入することができなかった。
は、ペプチドないしタンパク質、さらにはＤＮＡや糖を
十分に細胞内へ導入することができなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、効率
よく細胞内にポリペプチドないしタンパク質、ＤＮＡ、
糖を導入できる細胞透過性キャリアペプチド、該キャリ
アペプチドとポリペプチド、さらにはＤＮＡや糖を結合
したキャリアペプチドコンジュゲートを提供することに
ある。
よく細胞内にポリペプチドないしタンパク質、ＤＮＡ、
糖を導入できる細胞透過性キャリアペプチド、該キャリ
アペプチドとポリペプチド、さらにはＤＮＡや糖を結合
したキャリアペプチドコンジュゲートを提供することに
ある。
【０００７】また、本発明の目的は、ポリペプチド、さ
らにはＤＮＡや糖を細胞内に導入するための細胞透過性
キャリアペプチドの使用を提供することである。
らにはＤＮＡや糖を細胞内に導入するための細胞透過性
キャリアペプチドの使用を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（ａ）
または（ｂ）のポリペプチドを含む細胞透過性キャリア
ペプチド。 （ａ）配列番号２〜１４のいずれかで表されるポリペプ
チド； （ｂ）ポリペプチド(ａ)において１又は数個のアミノ酸
が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含み、細胞透
過性キャリアペプチド活性を有するポリペプチドに関す
る。
または（ｂ）のポリペプチドを含む細胞透過性キャリア
ペプチド。 （ａ）配列番号２〜１４のいずれかで表されるポリペプ
チド； （ｂ）ポリペプチド(ａ)において１又は数個のアミノ酸
が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含み、細胞透
過性キャリアペプチド活性を有するポリペプチドに関す
る。
【０００９】また、本発明は、前記（ａ）または（ｂ）
のポリペプチドを含む細胞透過性キャリアペプチドと異
種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からなる群から選ばれる
いずれかを、必要に応じて架橋剤を介して連結してなる
キャリアペプチドコンジュゲートに関する。
のポリペプチドを含む細胞透過性キャリアペプチドと異
種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からなる群から選ばれる
いずれかを、必要に応じて架橋剤を介して連結してなる
キャリアペプチドコンジュゲートに関する。
【００１０】さらに、本発明は、前記細胞透過性キャリ
アペプチドの、異種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からな
る群から選ばれるいずれかを細胞内に導入するための使
用に関する。
アペプチドの、異種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からな
る群から選ばれるいずれかを細胞内に導入するための使
用に関する。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の細胞透過性キャリアペプ
チドとしては、配列番号２〜１４のいずれかで表される
ポリペプチドが挙げられ、該配列は、細胞透過性キャリ
アペプチド活性を保持する限りにおいて１又は数個のア
ミノ酸が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含む。
チドとしては、配列番号２〜１４のいずれかで表される
ポリペプチドが挙げられ、該配列は、細胞透過性キャリ
アペプチド活性を保持する限りにおいて１又は数個のア
ミノ酸が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含む。
【００１２】「アミノ酸の欠失、置換又は付加」の程度
及びそれらの位置などは、改変されたポリペプチドが、
細胞透過性キャリアペプチド活性を有する限り特に制限
されない。本発明において「細胞透過性キャリアペプチ
ド活性」とは、配列番号２〜１４のポリペプチドと結合
したタンパク質ないしポリペプチドが、細胞膜を透過
し、細胞内に導入されることを意味する。
及びそれらの位置などは、改変されたポリペプチドが、
細胞透過性キャリアペプチド活性を有する限り特に制限
されない。本発明において「細胞透過性キャリアペプチ
ド活性」とは、配列番号２〜１４のポリペプチドと結合
したタンパク質ないしポリペプチドが、細胞膜を透過
し、細胞内に導入されることを意味する。
【００１３】置換・付加・欠失の具体的手段としては、
該キャリヤペプチドをコードするＤＮＡを経由して行う
場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネ
シス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (19
87)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9
441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、
日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手
法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの
化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；
同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetr
ahedron Lett.,22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕
及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的
には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはト
リエステル法による化学合成によることもでき、市販さ
れている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこと
もできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件
下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプ
ライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を
付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得
ることもできる。さらに、本発明の細胞透過性キャリア
ペプチドは、ペプチド合成機を用いて固相合成法により
合成することもでき、置換・付加・欠失は、ペプチド合
成機を用いる場合には保護アミノ酸の種類を変えること
により容易に行うことができる。又、Ｄ−アミノ酸やサ
ルコシン（N-メチルグリシン）等の特殊なアミノ酸を導
入することもできる。
該キャリヤペプチドをコードするＤＮＡを経由して行う
場合には、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネ
シス〔Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (19
87)；同 100, 468 (1983)；Nucleic Acids Res., 12, 9
441 (1984)；続生化学実験講座１「遺伝子研究法II」、
日本生化学会編, p105 (1986)〕などの遺伝子工学的手
法、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの
化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, 4801(1967)；
同 91, 3350 (1969)；Science, 150, 178 (1968)；Tetr
ahedron Lett.,22, 1859 (1981)；同 24, 245 (1983)〕
及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的
には、ＤＮＡの合成は、ホスホルアミダイト法またはト
リエステル法による化学合成によることもでき、市販さ
れている自動オリゴヌクレオチド合成装置上で行うこと
もできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件
下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプ
ライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を
付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得
ることもできる。さらに、本発明の細胞透過性キャリア
ペプチドは、ペプチド合成機を用いて固相合成法により
合成することもでき、置換・付加・欠失は、ペプチド合
成機を用いる場合には保護アミノ酸の種類を変えること
により容易に行うことができる。又、Ｄ−アミノ酸やサ
ルコシン（N-メチルグリシン）等の特殊なアミノ酸を導
入することもできる。
【００１４】本発明の細胞透過性キャリアペプチドに連
結されて細胞内に導入されるポリペプチドは特に限定さ
れず、任意のポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチ
ドの分子量は５００程度から１００万程度、好ましくは
１０００〜５０万程度が例示され、分泌タンパク、膜結
合タンパク、ペプチドホルモンなどの種類も問わない。
結されて細胞内に導入されるポリペプチドは特に限定さ
れず、任意のポリペプチドが挙げられる。該ポリペプチ
ドの分子量は５００程度から１００万程度、好ましくは
１０００〜５０万程度が例示され、分泌タンパク、膜結
合タンパク、ペプチドホルモンなどの種類も問わない。
【００１５】細胞内に導入されるポリペプチドの具体例
としては、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロビ
ン、西洋わさびパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ロイシンジッパーや亜鉛フィンガーモチーフを有す
る転写因子、Fas p53などのアポトーシス誘導タンパク
質、欠損により代謝異常の疾病を誘発するアデノシンデ
アミナーゼなどのタンパク質及び酵素阻害剤（例えばカ
ルパインインヒビター）、遺伝情報発現調節因子（例え
ばＩκＢ）、ペプチドホルモン（インスリン、カルシト
ニン等）などが例示される。
としては、カルボニックアンヒドラーゼ、ミオグロビ
ン、西洋わさびパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ロイシンジッパーや亜鉛フィンガーモチーフを有す
る転写因子、Fas p53などのアポトーシス誘導タンパク
質、欠損により代謝異常の疾病を誘発するアデノシンデ
アミナーゼなどのタンパク質及び酵素阻害剤（例えばカ
ルパインインヒビター）、遺伝情報発現調節因子（例え
ばＩκＢ）、ペプチドホルモン（インスリン、カルシト
ニン等）などが例示される。
【００１６】細胞内に導入されるポリペプチドと本発明
の細胞透過性キャリアペプチドは、細胞透過性キャリア
ペプチドがシステイン残基を有する場合には、ポリペプ
チドのシステイン残基と−ＳＳ−結合を介して連結して
もよく、適当な架橋剤を介して連結してもよい。また、
本発明の細胞透過性キャリアペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドと導入されるポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド（遺伝子）を、好ましくは直接に結合
し、ベクターに導入し、大腸菌等の宿主細胞内で発現さ
せるなどの常法により、本発明の細胞透過性キャリアペ
プチドのＣ末端側に導入されるタンパク質ないしポリペ
プチドが直接連結されたペプチドコンジュゲートを得る
ことができる。同様に、ＤＮＡや糖についても、適当な
架橋剤を介して連結することができる。
の細胞透過性キャリアペプチドは、細胞透過性キャリア
ペプチドがシステイン残基を有する場合には、ポリペプ
チドのシステイン残基と−ＳＳ−結合を介して連結して
もよく、適当な架橋剤を介して連結してもよい。また、
本発明の細胞透過性キャリアペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドと導入されるポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチド（遺伝子）を、好ましくは直接に結合
し、ベクターに導入し、大腸菌等の宿主細胞内で発現さ
せるなどの常法により、本発明の細胞透過性キャリアペ
プチドのＣ末端側に導入されるタンパク質ないしポリペ
プチドが直接連結されたペプチドコンジュゲートを得る
ことができる。同様に、ＤＮＡや糖についても、適当な
架橋剤を介して連結することができる。
【００１７】架橋剤としては、本発明の細胞透過性キャ
リアペプチドと導入されるタンパク質ないしポリペプチ
ド、ＤＮＡまたは糖を結合できる少なくとも２価の架橋
剤であれば特に限定されないが、例えばN-(6-マレイミ
ドカプロイルオキシ)コハク酸イミドエステル(EMCS)な
どが挙げられる。
リアペプチドと導入されるタンパク質ないしポリペプチ
ド、ＤＮＡまたは糖を結合できる少なくとも２価の架橋
剤であれば特に限定されないが、例えばN-(6-マレイミ
ドカプロイルオキシ)コハク酸イミドエステル(EMCS)な
どが挙げられる。
【００１８】本発明の細胞透過性キャリアペプチドのＣ
末端側には、例えばCys、Gly-Cysなどの様式でCys残基
をさらに結合するのが好ましい。該Cys残基のＳＨ基
は、EMCSのマレイミド基に付加反応させたり、導入され
るタンパク質ないしポリペプチドがフリーのＳＨ基を有
する場合には−ＳＳ−結合により導入されるタンパク質
ないしポリペプチドに、連結することができる。−ＳＳ
−結合を介して連結した場合には、細胞内で該−ＳＳ−
結合が還元され、非修飾のタンパク質ないしポリペプチ
ドが遊離されるので好ましい。
末端側には、例えばCys、Gly-Cysなどの様式でCys残基
をさらに結合するのが好ましい。該Cys残基のＳＨ基
は、EMCSのマレイミド基に付加反応させたり、導入され
るタンパク質ないしポリペプチドがフリーのＳＨ基を有
する場合には−ＳＳ−結合により導入されるタンパク質
ないしポリペプチドに、連結することができる。−ＳＳ
−結合を介して連結した場合には、細胞内で該−ＳＳ−
結合が還元され、非修飾のタンパク質ないしポリペプチ
ドが遊離されるので好ましい。
【００１９】
【発明の効果】本発明によれば、単独で投与した場合に
細胞内に移行し難いポリペプチド、ＤＮＡ、糖を高効率
で細胞内に導入することができる。
細胞内に移行し難いポリペプチド、ＤＮＡ、糖を高効率
で細胞内に導入することができる。
【００２０】細胞内に導入されて生物活性を示すポリペ
プチド、ＤＮＡ、糖などの生理活性物質を細胞内に導入
することにより、各種の疾患の治療が期待できる。
プチド、ＤＮＡ、糖などの生理活性物質を細胞内に導入
することにより、各種の疾患の治療が期待できる。
【００２１】
【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。 実施例１〜１３ 配列番号２〜１４で表されるポリペプチドのＣ末端にGl
y-Cys-アミドが付加されたポリペプチドを、島津PSSM-8
型ペプチド合成機、Rinkアミド樹脂を用いてFmoc固相合
成法で合成した。得られたポリペプチドは、各々トリフ
ルオロ酢酸−エタンジチオール（９５：５）で室温１．
５時間処理し、脱保護と樹脂からの切り出しを行い、Wa
ters社Symmetry 300 C18（5μm、4.6×150mm)を用い、
0.1%TFAを含有するアセトニトリル−水グラジエント
（アセトニトリル濃度５％〜５０％）で溶出する逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製した。さらに、該ポリペプチドのCys
残基を1.5当量の5-マレイミドフルオレセインジアセテ
ートで蛍光標識して得られたポリペプチドについて質量
分析（MALDI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))を行った。結
果を表１に示す。 実施例１４、１５ 配列番号２，３で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-
Cys-アミドが付加されたポリペプチドを、実施例１〜１
３と同様にして固相合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
得られたポリペプチドの質量分析結果を表１に示す。な
お、実施例１４で得られたポリペプチドは、フルオレセ
インで蛍光標識されていない点を除いて、実施例１で得
られたポリペプチドと同一である。同様に、実施例１５
で得られたポリペプチドは、フルオレセインで蛍光標識
されていない点を除いて、実施例２で得られたポリペプ
チドと同一である。 比較例１ 配列番号１で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-Cys-
アミドが付加されたポリペプチドを実施例１〜１３と同
様にして合成した。得られた蛍光ラベルされたポリペプ
チドの質量分析結果を表１に示す。 比較例２ 配列番号１５で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-Cy
s-アミドが付加されたポリペプチドを実施例１〜１３と
同様にして合成した。得られた蛍光ラベルされたポリペ
プチドの質量分析結果を表１に示す。
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。 実施例１〜１３ 配列番号２〜１４で表されるポリペプチドのＣ末端にGl
y-Cys-アミドが付加されたポリペプチドを、島津PSSM-8
型ペプチド合成機、Rinkアミド樹脂を用いてFmoc固相合
成法で合成した。得られたポリペプチドは、各々トリフ
ルオロ酢酸−エタンジチオール（９５：５）で室温１．
５時間処理し、脱保護と樹脂からの切り出しを行い、Wa
ters社Symmetry 300 C18（5μm、4.6×150mm)を用い、
0.1%TFAを含有するアセトニトリル−水グラジエント
（アセトニトリル濃度５％〜５０％）で溶出する逆相Ｈ
ＰＬＣにより精製した。さらに、該ポリペプチドのCys
残基を1.5当量の5-マレイミドフルオレセインジアセテ
ートで蛍光標識して得られたポリペプチドについて質量
分析（MALDI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))を行った。結
果を表１に示す。 実施例１４、１５ 配列番号２，３で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-
Cys-アミドが付加されたポリペプチドを、実施例１〜１
３と同様にして固相合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。
得られたポリペプチドの質量分析結果を表１に示す。な
お、実施例１４で得られたポリペプチドは、フルオレセ
インで蛍光標識されていない点を除いて、実施例１で得
られたポリペプチドと同一である。同様に、実施例１５
で得られたポリペプチドは、フルオレセインで蛍光標識
されていない点を除いて、実施例２で得られたポリペプ
チドと同一である。 比較例１ 配列番号１で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-Cys-
アミドが付加されたポリペプチドを実施例１〜１３と同
様にして合成した。得られた蛍光ラベルされたポリペプ
チドの質量分析結果を表１に示す。 比較例２ 配列番号１５で表されるポリペプチドのＣ末端にGly-Cy
s-アミドが付加されたポリペプチドを実施例１〜１３と
同様にして合成した。得られた蛍光ラベルされたポリペ
プチドの質量分析結果を表１に示す。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１において、Human cFos-(139-164)の配
列を一部改変したのでanalogとした。また、(Fl)はフル
オレセインを示す。 実施例１６ 図１で示されるように、配列番号２で表されるHIV-1 Re
v-(34-50)のＣ末端と配列番号１６で表されるカルパイ
ン阻害剤のＮ末端をGlyを介して結合し、さらに、カル
パイン阻害剤のＣ末端にGly-Cys-amideを結合した合成
ポリペプチドを島津PSSM-8型ペプチド合成機、Rinkアミ
ド樹脂を用いてFmoc固相合成法で合成した。得られたポ
リペプチドは、各々トリフルオロ酢酸−エタンジチオー
ル（９５：５）で室温１．５時間処理し、脱保護と樹脂
からの切り出しを行い、Waters社Symmetry 300 C18（5
μm、4.6×150mm)を用い、0.1%TFAを含有するアセトニ
トリル−水グラジエント（アセトニトリル濃度５％〜５
０％）で溶出する逆相ＨＰＬＣで精製した。さらに、該
ポリペプチドを１．５当量のフルオレセイン-5(6)-カル
ボキサミドカプロン酸N-ヒドロキシコハク酸イミドエス
テルと反応させて、蛍光標識したHIV-1 Rev-(34-50)−G
ly−カルパイン阻害剤−GlyCys(フルオレセイン)-amide
を得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MALDI-TOF-MS
(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。 実施例１７ 配列番号１６で表されるカルパイン阻害剤の配列に代え
て、配列番号１７で表されるIκＢ(15-41)の配列を利用
した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識体HIV-1 Re
v-(34-50)−Gly−IκＢ(15-41)−GlyCys(フルオレセイ
ン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MAL
DI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。 実施例１８ HIV-1 Rev-(34-50)の配列に代えてFHV coat-(35-49)の
配列を利用した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識
体FHV coat-(35-49)−Gly−カルパイン阻害剤−GlyCys
(フルオレセイン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の
質量分析（MALDI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表
２に示す。 実施例１９ 配列番号１６で表されるカルパイン阻害剤の配列に代え
て、配列番号１７で表されるIκＢ(15-41)の配列を利用
した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識体FHV coat
-(35-49)−Gly−IκＢ(15-41)−GlyCys(フルオレセイ
ン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MAL
DI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。
列を一部改変したのでanalogとした。また、(Fl)はフル
オレセインを示す。 実施例１６ 図１で示されるように、配列番号２で表されるHIV-1 Re
v-(34-50)のＣ末端と配列番号１６で表されるカルパイ
ン阻害剤のＮ末端をGlyを介して結合し、さらに、カル
パイン阻害剤のＣ末端にGly-Cys-amideを結合した合成
ポリペプチドを島津PSSM-8型ペプチド合成機、Rinkアミ
ド樹脂を用いてFmoc固相合成法で合成した。得られたポ
リペプチドは、各々トリフルオロ酢酸−エタンジチオー
ル（９５：５）で室温１．５時間処理し、脱保護と樹脂
からの切り出しを行い、Waters社Symmetry 300 C18（5
μm、4.6×150mm)を用い、0.1%TFAを含有するアセトニ
トリル−水グラジエント（アセトニトリル濃度５％〜５
０％）で溶出する逆相ＨＰＬＣで精製した。さらに、該
ポリペプチドを１．５当量のフルオレセイン-5(6)-カル
ボキサミドカプロン酸N-ヒドロキシコハク酸イミドエス
テルと反応させて、蛍光標識したHIV-1 Rev-(34-50)−G
ly−カルパイン阻害剤−GlyCys(フルオレセイン)-amide
を得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MALDI-TOF-MS
(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。 実施例１７ 配列番号１６で表されるカルパイン阻害剤の配列に代え
て、配列番号１７で表されるIκＢ(15-41)の配列を利用
した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識体HIV-1 Re
v-(34-50)−Gly−IκＢ(15-41)−GlyCys(フルオレセイ
ン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MAL
DI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。 実施例１８ HIV-1 Rev-(34-50)の配列に代えてFHV coat-(35-49)の
配列を利用した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識
体FHV coat-(35-49)−Gly−カルパイン阻害剤−GlyCys
(フルオレセイン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の
質量分析（MALDI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表
２に示す。 実施例１９ 配列番号１６で表されるカルパイン阻害剤の配列に代え
て、配列番号１７で表されるIκＢ(15-41)の配列を利用
した他は実施例１６と同様にして、蛍光標識体FHV coat
-(35-49)−Gly−IκＢ(15-41)−GlyCys(フルオレセイ
ン)-amideを得た。得られた蛍光標識体の質量分析（MAL
DI-TOF-MS(Shimadzu MALDI-2))結果を表２に示す。
【００２４】
【表２】
【００２５】実施例２０ 図２で示されるように、カルボニックアンヒドラーゼ(C
A、分子量29000)をＰＢＳ中で１５当量のN-(6-マレイミ
ドカプロイルオキシ)コハク酸イミドエステル(EMCS)及
び１５当量のフルオレセイン-5(6)-カルボキサミドカプ
ロン酸N-ヒドロキシコハク酸イミドエステルを室温で２
時間反応させて、マレイミド基及びFITC基を平均で１〜
２個ずつ結合した蛍光標識カルボニックアンヒドラーゼ
誘導体を得た。
A、分子量29000)をＰＢＳ中で１５当量のN-(6-マレイミ
ドカプロイルオキシ)コハク酸イミドエステル(EMCS)及
び１５当量のフルオレセイン-5(6)-カルボキサミドカプ
ロン酸N-ヒドロキシコハク酸イミドエステルを室温で２
時間反応させて、マレイミド基及びFITC基を平均で１〜
２個ずつ結合した蛍光標識カルボニックアンヒドラーゼ
誘導体を得た。
【００２６】得られた蛍光標識カルボニックアンヒドラ
ーゼ誘導体と実施例１４で得られたフルオレセインで標
識されていないポリペプチド（HIV-1 Rev-(34-50)-GlyC
ys-amide）をＰＢＳ中室温で２０時間反応させることに
より、該ポリペプチド（HIV-1 Rev-(34-50)-GlyCys-ami
de）のＣ末端のCysのＳＨ基がFITC標識カルボニックア
ンヒドラーゼ誘導体のマレイミド基に付加した本発明の
細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペプチド・コン
ジュゲートを得た。なお、得られたペプチドコンジュゲ
ートの精製は、PBS緩衝液及びSephadex G25を用いたゲ
ル濾過により行った。
ーゼ誘導体と実施例１４で得られたフルオレセインで標
識されていないポリペプチド（HIV-1 Rev-(34-50)-GlyC
ys-amide）をＰＢＳ中室温で２０時間反応させることに
より、該ポリペプチド（HIV-1 Rev-(34-50)-GlyCys-ami
de）のＣ末端のCysのＳＨ基がFITC標識カルボニックア
ンヒドラーゼ誘導体のマレイミド基に付加した本発明の
細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペプチド・コン
ジュゲートを得た。なお、得られたペプチドコンジュゲ
ートの精製は、PBS緩衝液及びSephadex G25を用いたゲ
ル濾過により行った。
【００２７】マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２１ 実施例１４で得られた非蛍光標識ポリペプチド（HIV-1
Rev-(34-50)-GlyCys-amide）に代えて実施例１５で得ら
れた非蛍光標識ポリペプチド（FHV coat-(35-49)-GlyCy
s-amide)を用いた他は実施例２０と同様にして本発明の
細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペプチド・コン
ジュゲートを得た。
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２１ 実施例１４で得られた非蛍光標識ポリペプチド（HIV-1
Rev-(34-50)-GlyCys-amide）に代えて実施例１５で得ら
れた非蛍光標識ポリペプチド（FHV coat-(35-49)-GlyCy
s-amide)を用いた他は実施例２０と同様にして本発明の
細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペプチド・コン
ジュゲートを得た。
【００２８】マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２２ カルボニックアンヒドラーゼに代えてミオグロビン（分
子量：１７０００）を用いた他は実施例２０と同様にし
て、本発明の細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペ
プチド・コンジュゲートを得た。
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２２ カルボニックアンヒドラーゼに代えてミオグロビン（分
子量：１７０００）を用いた他は実施例２０と同様にし
て、本発明の細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペ
プチド・コンジュゲートを得た。
【００２９】マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２３ カルボニックアンヒドラーゼに代えてミオグロビン（分
子量：１７０００）を用いた他は実施例２１と同様にし
て、本発明の細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペ
プチド・コンジュゲートを得た。
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２３ カルボニックアンヒドラーゼに代えてミオグロビン（分
子量：１７０００）を用いた他は実施例２１と同様にし
て、本発明の細胞透過性キャリアペプチド−異種ポリペ
プチド・コンジュゲートを得た。
【００３０】マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２４〜３４ マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞と、RPMI 1
640培地中チェンバースライド上で１６時間培養し、RPM
I 1640培地を交換し、実施例３〜１３で得られたＣ末端
にGly-Cys(フルオレセイン)-amide構造を有する各標識
ポリペプチドを１０μＭの濃度になるように加え、３７
℃で３時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄
し、アセトン：メタノール（１：１）で固定した。固定
化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光顕微鏡で観察し
た。その結果、蛍光標識ポリペプチドは全ての細胞内に
入ったことが確認された。 実施例３５〜３８ 実施例３〜１３で得られたＣ末端にGly-Cys(フルオレセ
イン)-amide構造を有する各標識ポリペプチドに代え
て、実施例１６〜１９で得られたカルパイン阻害剤また
はIκＢ(15-41)を有する各標識ポリペプチドを用いて実
施例２４〜３４と同様に試験を行ったところ、実施例１
６〜１９の蛍光標識ポリペプチドは全ての細胞内に入っ
たことが確認された。 比較例３ 比較例２で得られた細胞透過性キャリアペプチド活性を
有するポリペプチドと、１．５当量の５−マレイミドフ
ルオレセインジアセテートをジメチルホルムアミド中室
温で１時間反応させて、フルオレセインがCys残基に結
合した蛍光標識ポリペプチド誘導体を得た。
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られた蛍
光標識ペプチドコンジュゲートを１０μＭの濃度になる
ように加え、３７℃で３時間インキュベーションした
後、ＰＢＳで洗浄し、アセトン：メタノール（１：１）
で固定した。固定化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光
顕微鏡で観察した。その結果、蛍光標識ペプチドコンジ
ュゲートは全ての細胞内に入ったことが確認された。 実施例２４〜３４ マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細胞と、RPMI 1
640培地中チェンバースライド上で１６時間培養し、RPM
I 1640培地を交換し、実施例３〜１３で得られたＣ末端
にGly-Cys(フルオレセイン)-amide構造を有する各標識
ポリペプチドを１０μＭの濃度になるように加え、３７
℃で３時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄
し、アセトン：メタノール（１：１）で固定した。固定
化されたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光顕微鏡で観察し
た。その結果、蛍光標識ポリペプチドは全ての細胞内に
入ったことが確認された。 実施例３５〜３８ 実施例３〜１３で得られたＣ末端にGly-Cys(フルオレセ
イン)-amide構造を有する各標識ポリペプチドに代え
て、実施例１６〜１９で得られたカルパイン阻害剤また
はIκＢ(15-41)を有する各標識ポリペプチドを用いて実
施例２４〜３４と同様に試験を行ったところ、実施例１
６〜１９の蛍光標識ポリペプチドは全ての細胞内に入っ
たことが確認された。 比較例３ 比較例２で得られた細胞透過性キャリアペプチド活性を
有するポリペプチドと、１．５当量の５−マレイミドフ
ルオレセインジアセテートをジメチルホルムアミド中室
温で１時間反応させて、フルオレセインがCys残基に結
合した蛍光標識ポリペプチド誘導体を得た。
【００３１】マクロファージ由来のＲＡＷ２６４．７細
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られたＣ
末端にGly-Cys(フルオレセイン)構造を有する各標識ポ
リペプチドを１０μＭの濃度になるように加え、３７℃
で３時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、
アセトン：メタノール（１：１）で固定した。固定化さ
れたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光顕微鏡で観察した。そ
の結果、比較例３の蛍光標識ポリペプチドは細胞内にほ
とんど入らないことが確認された。
胞と、RPMI 1640培地中チェンバースライド上で１６時
間培養し、RPMI 1640培地を交換し、上記で得られたＣ
末端にGly-Cys(フルオレセイン)構造を有する各標識ポ
リペプチドを１０μＭの濃度になるように加え、３７℃
で３時間インキュベーションした後、ＰＢＳで洗浄し、
アセトン：メタノール（１：１）で固定した。固定化さ
れたＲＡＷ２６４．７細胞を蛍光顕微鏡で観察した。そ
の結果、比較例３の蛍光標識ポリペプチドは細胞内にほ
とんど入らないことが確認された。
【００３２】
SEQUENCE LISTING <110> KANSAI TLO Co., ltd. <120> Cell Permeable Carrier Peptide <130> 3419JP <160> 17 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> HIV-1 Tat-(48-60) <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 13 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> HIV-1 Rev-(34-50) <400> 2 Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg Gln 1 5 10 15 Arg 17 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> FHV Coat-(35-49) <400> 3 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> BMV Gag-(7-25) <400> 4 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg 19 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> HTLV-II Rex-(4-16) <400> 5 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 13 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> CCMV Gag-(7-25) <400> 6 Lys Leu Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Lys Asn Lys Arg 1 5 10 15 Asn Thr Arg 19 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> P22 N-(14-30) <400> 7 Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu 1 5 10 15 Arg 17 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> λN-(1-22) <400> 8 Met Asp Ala Gln Thr Arg Arg Arg Glu Arg Arg Ala Glu Lys Gln Ala 1 5 10 15 Gln Trp Lys Ala Ala Asn 20 22 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> φ21N-(12-29) <400> 9 Thr Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Ala Arg Arg Ala Glu Leu Ile Ala Glu 1 5 10 15 16 Arg Arg 18 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Yeast PRP6-(129-144) <400> 10 Thr Arg Arg Asn Lys Arg Asn Arg Ile Gln Glu Gln Leu Asn Arg Lys 1 5 10 15 16 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> (Arg)8 <400> 11 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 8 <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213> Human cJun-(252-279) <400> 12 Arg Ile Lys Ala Glu Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser 1 5 10 15 Lys Ser Arg Lys Arg Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg 20 25 28 <210> 13 <211> 29 <212> PRT <213> Human cFos-(139-164)analog <400> 13 Arg Arg Arg Ile Arg Arg Ile Arg Arg Glu Arg Asn Lys Met Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ser Arg Asn Arg Arg Arg Glu Leu Thr Asp Thr 20 25 29 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Yeast GCN4-(231-252) <400> 14 Lys Arg Ala Arg Asn Thr Glu Ala Ala Arg Arg Ser Arg Ala Arg Lys 1 5 10 15 Leu Gln Arg Met Lys Gln 20 22 <210> 15 <211> 12 <212> PRT <213> Human U2AF-(142-153) <400> 15 Ser Gln Met Thr Arg Gln Ala Arg Arg Leu Tyr Val 1 5 10 12 <210> 16 <211> 27 <212> PRT <213> Calpain inhibitor <400> 16 Asp Pro Met Ser Ser Thr Tyr Ile Glu Glu Leu Gly Lys Arg Glu Val 1 5 10 15 Thr Ile Pro Pro Lys Tyr Arg Glu Leu Leu Ala 20 25 27 <210> 17 <211> 27 <212> PRT <213> IκＢ(15-41) <400> 17 Gly Pro Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Val Asp Asp Arg His 1 5 10 15 Asp Ser Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu 20 25 27
【図１】細胞透過性キャリアペプチドとカルパインイン
ヒビター又はＩκＢ(15-41)を連結した蛍光標識ペプチ
ドコンジュゲートを示す。
ヒビター又はＩκＢ(15-41)を連結した蛍光標識ペプチ
ドコンジュゲートを示す。
【図２】カルボニックアンヒドラーゼを細胞透過性キャ
リアペプチドと連結した蛍光標識ペプチドコンジュゲー
トの製造スキームを示す。
リアペプチドと連結した蛍光標識ペプチドコンジュゲー
トの製造スキームを示す。
Claims (4)
- 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチド
を含む細胞透過性キャリアペプチド （ａ）配列番号２〜１４のいずれかで表されるポリペプ
チド； （ｂ）ポリペプチド(ａ)において１又は数個のアミノ酸
が置換、欠失又は付加したポリペプチドを含み、細胞透
過性キャリアペプチド活性を有するポリペプチド。 - 【請求項２】少なくとも１つのCys残基をさらに付加し
てなる請求項１に記載の細胞透過性キャリアペプチド。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の細胞透過性キャリ
アペプチドと異種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からなる
群から選ばれるいずれかを、必要に応じて架橋剤を介し
て連結してなるキャリアペプチドコンジュゲート。 - 【請求項４】請求項１又は２に記載の細胞透過性キャリ
アペプチドの、異種ポリペプチド、ＤＮＡ及び糖からな
る群から選ばれるいずれかを細胞内に導入するための使
用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000013504A JP3854995B2 (ja) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | 細胞透過性キャリアペプチド |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000013504A JP3854995B2 (ja) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | 細胞透過性キャリアペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3854995B2 JP3854995B2 (ja) | 2006-12-06 |
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ID=18541088
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000013504A Expired - Fee Related JP3854995B2 (ja) | 2000-01-21 | 2000-01-21 | 細胞透過性キャリアペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3854995B2 (ja) |
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