JP2001017166A

JP2001017166A - Ｄｎａチップ、ｄｎａチップの検定キットおよびｄｎａチップの検定法

Info

Publication number: JP2001017166A
Application number: JP11189360A
Authority: JP
Inventors: Satoru Kuhara; 哲久原; Kosuke Tashiro; 康介田代; Shigeru Muta; 滋牟田; Masashi Hakamata; 正志袴田; Takafumi Hora; 尚文洞
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2001-01-23
Also published as: EP1065280A2; EP1065280A3

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子分野の研究で特に有用なＤＮＡチップ
を、ＤＮＡチップを製造する側および使用する側の何れ
もが検定できるような、ＤＮＡチップ、ＤＮＡチップの
検定キット及びＤＮＡチップの検定法を提供すること。【解決手段】基板表面に区画された複数の領域のそれ
ぞれに、ＤＮＡ断片群が各ＤＮＡ断片の一端で固定され
ているＤＮＡチップであって、それぞれの領域に固定さ
れているＤＮＡ断片群が、共通した塩基配列を有する共
通オリゴヌクレオチド部位と、領域ごとに互いに異なる
塩基配列を有する非共通ポリヌクレオチド部位とからな
ることを特徴とするＤＮＡチップ、当該ＤＮＡチップと
標識オリゴヌクレオチドとからなるＤＮＡチップの検定
キット、及び当該ＤＮＡチップに標識オリゴヌクレオチ
ドを接触させ、各領域の相対感度を求めることを特徴と
するＤＮＡチップの検定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子の発現、遺
伝子の変異、遺伝子の多型等の解析に特に有用なＤＮＡ
チップに関する。

【０００２】

【従来の技術】細胞や組織における遺伝子発現の様態の
解析は、これまで種々の細胞や組織からＲＮＡを調製
し、そのＲＮＡをメンブレン上に固定し、解析対象の遺
伝子の特異的プローブを用いてハイブリダイゼーション
を行うノーザンブロット（もしくは、ドットブロット）
法や、解析対象の遺伝子に特異的なプライマを用いたＲ
Ｔ−ＰＣＲ法などによって行われてきた。一方、遺伝子
の研究の進展により解析に供する遺伝子の数が急速に増
加し、さらに、ゲノムプロジェクトの進行に伴って各生
物が保持する全遺伝子が明らかになるにつれて、多数の
遺伝子を一度に解析する必要性が高まっている。

【０００３】この必要性に答える技術として、最近、マ
イクロアレイ法もしくはＤＮＡチップ法が開発されつつ
ある。これらの技術の特徴は、１ｃｍ²の基板上に、互
いに異なる数千種類のＤＮＡ断片を固定し（このもの
を、ＤＮＡチップもしくはマイクロアレイという。）、
この固定ＤＮＡ断片と極少量の標識されたターゲットＤ
ＮＡ断片とのハイブリダイゼーションを行い、高感度で
該ターゲットＤＮＡ断片を検出することにある。上記の
方法を用いることによって、ヒト等のほ乳類や数千個の
遺伝子を有する微生物の全遺伝子を数枚のＤＮＡチップ
等を用いて解析することができ、標識ＲＮＡによる全遺
伝子を対象とした発現量の解析を行うこともできる。ま
た、ゲノムＤＮＡを標識することによって遺伝子欠損等
の変異の解析、ＤＮＡチップ等の表面上に適当なオリゴ
ヌクレオチドを固定することによって点突然変異の検出
も可能である。

【０００４】ＤＮＡチップ等の作製において、「オン・
チップ」法（基板表面上に固定するＤＮＡ断片を、直
接、基板表面上で合成する方法）によらない場合には、
ＤＮＡ断片は、予め調製したものを基板表面に点着し、
次いで静電的相互作用あるいは共有結合によって基板表
面に固定する。

【０００５】しかし、一般的に、ＤＮＡ断片の点着量と
実際に固定される量とは同一ではない。例えば、ＤＮＡ
チップの作製においては、通常、スポッター装置を用い
てＤＮＡ断片溶液を基板表面に点着するが、その点着液
量は極微量であるため、スポッター装置の不具合等によ
って液量が異なることがある。また、同一の液量のＤＮ
Ａ断片溶液が点着されたとしても、基板表面との相互作
用の差異によって、同一の数のＤＮＡ断片が固定される
とは限らない。さらに、固定されているＤＮＡ断片の中
には、その一端で基板表面に固定されていないものも存
在する場合があり、一旦固定されたＤＮＡ断片が基板よ
り外れることもあり得る。従って、点着するＤＮＡ断片
量（通常、重さ）から、ＤＮＡチップに固定されている
ＤＮＡ断片の量を判断するには問題がある。実際に、固
定されているＤＮＡ断片量を厳密に測定する方法は確立
されていない。

【０００６】一般的なハイブリダイゼーションの系で
は、標識されたターゲットＤＮＡ断片に対して、大過剰
量のＤＮＡ断片を点着して作製されたＤＮＡチップを使
用するが、そのようなＤＮＡチップでは、実際に固定さ
れているＤＮＡ断片量も大過剰量になると考えられるた
め、実際の固定量が明らかでなくても、該ターゲットＤ
ＮＡ断片の検出にはほとんど影響がない。

【０００７】しかし、ＤＮＡチップに固定されているＤ
ＮＡ断片量がほぼ同数であることを示す情報が必要とさ
れる場合もある。実際に固定されているＤＮＡ断片量の
厳密な測定法が未だ確立されていないため、ＤＮＡチッ
プの品質を保証する指標の一つとして、上記の情報を与
える方法の開発は、ＤＮＡチップの製造者側にとっては
もちろんのこと、使用者側にとっても重要なことであ
る。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子分野
の研究で特に有用なＤＮＡチップを、ＤＮＡチップを製
造する製造者側および使用者側の何れもが検定できるよ
うな、ＤＮＡチップ、ＤＮＡチップの検定キットおよび
ＤＮＡチップの検定法を提供することを、その課題とす
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、基板表面に区
画された複数の領域のそれぞれに、ＤＮＡ断片群が各Ｄ
ＮＡ断片の一端で固定されているＤＮＡチップであっ
て、それぞれの領域に固定されているＤＮＡ断片群が、
共通した塩基配列を有する共通オリゴヌクレオチド部位
と、領域ごとに互いに異なる塩基配列を有する非共通ポ
リヌクレオチド部位とからなることを特徴とするＤＮＡ
チップにある。

【００１０】本発明のＤＮＡチップは、好ましくは、各
領域のＤＮＡ断片群のそれぞれが、非共通ポリヌクレオ
チド部位の両端のそれぞれに共通オリゴヌクレオチド部
位を有することを特徴とするＤＮＡチップである。

【００１１】本発明は、また、上記のＤＮＡチップ、お
よび共通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有する標識
オリゴヌクレオチドからなることを特徴とするＤＮＡチ
ップの検定キットにもある。

【００１２】本発明のＤＮＡチップの検定キットは、好
ましくは、標識オリゴヌクレオチドが、蛍光物質によっ
て標識されたオリゴヌクレオチドであることを特徴とす
るＤＮＡチップの検定キットである。

【００１３】本発明は、さらに、本発明のＤＮＡチップ
上の区画された領域のそれぞれに、各ＤＮＡ断片群の共
通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有する標識オリゴ
ヌクレオチドを含む水性液を接触させることにより、標
識オリゴヌクレオチドを各ＤＮＡ断片群の共通オリゴヌ
クレオチド部位に結合させ、各領域における標識強度を
測定することによって、各領域の相対感度を求めること
を特徴とするＤＮＡチップの検定法にもある。

【００１４】

【発明の実施の形態】図１の（１）は、本発明のＤＮＡ
チップの一例を示す模式図である。本発明のＤＮＡチッ
プは、基板（３１）表面に区画された複数の領域（４
１）のそれぞれに、ＤＮＡ断片群が各ＤＮＡ断片（２
１、２２および２３）の一端で固定されているＤＮＡチ
ップである。それぞれの領域（４１）に固定されている
ＤＮＡ断片群は、共通した塩基配列を有するオリゴヌク
レオチド部位（２１ａ、２１ｃ）と、領域ごとに互いに
異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド部位（２１
ｂ、２２ｂおよび２３ｂ）とからなる。

【００１５】以下、共通した塩基配列を有するオリゴヌ
クレオチド部位を「共通オリゴヌクレオチド部位」、互
いに異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド部位を
「非共通ポリヌクレオチド部位」という。

【００１６】各領域に固定されているＤＮＡ断片群のそ
れぞれは、非共通ポリヌクレオチド部位の両端のそれぞ
れに共通オリゴヌクレオチド部位を有するＤＮＡ断片群
であることが好ましい。それぞれの共通オリゴヌクレオ
チド部位は、互いに異なっていることが好ましいが、塩
基配列が既知である必要はない。共通オリゴヌクレオチ
ド部位は、さらに二つ以上のサブ共通オリゴヌクレオチ
ド部位からなるものであってもよい。共通オリゴヌクレ
オチド部位は、その塩基数が１０〜１００の範囲にある
ことが好ましい。非共通ポリヌクレオチド部位は、領域
ごとに互いに異なる。

【００１７】ＤＮＡ断片としては、ヒト、マウス等の哺
乳類、酵母、乳酸菌、大腸菌、放線菌等の外来ＤＮＡを
使用して複数の種類の組み換えＤＮＡプラスミドを作製
し、それぞれインサートＤＮＡに導き、次いで、各イン
サートＤＮＡをそれぞれサブクローニングして得られた
ものであることが好ましい。このＤＮＡ断片は、酵母等
の外来ＤＮＡのポリヌクレオチド部位（非共通ポリヌク
レオチド部位に相当）の両端に、それぞれ、ベクター
（サブクローニングで使用したベクター）由来の、互い
に異なる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド部位（何
れも共通オリゴヌクレオチド部位に相当）を有する。Ｄ
ＮＡ断片は、その断片が共通オリゴヌクレオチド部位と
非共通ポリヌクレオチドとからなるものであれば、合成
等の他の方法によって得られたものであってもよい。

【００１８】基板としては、疎水性、あるいは親水性の
低い基板であることが好ましい。また、その表面が凹凸
を有する平面性の低いものであっても好ましく用いるこ
とができる。基板の材質としては、ガラス、セメント、
陶磁器等のセラミックスもしくはニューセラミックス、
ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフ
ェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメ
チルメタクリレート等のポリマー、シリコン、活性炭、
多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、
多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブ
レンフィルター等の多孔質物質などを挙げることができ
る。多孔質物質の細孔の大きさは、２〜１０００ｎｍの
範囲にあることが好ましく、２〜５００ｎｍの範囲にあ
ることが特に好ましい。基板の材質は、ガラスもしくは
シリコンであることが特に好ましい。これは、表面処理
の容易さや電気化学的方法による解析の容易さによるも
のである。基板の厚さは、１００〜２０００μｍの範囲
にあることが好ましい。

【００１９】基板は、その表面がポリ−Ｌ−リシン、ポ
リエチレンイミン、ポリアルキルアミン等で処理されて
いることが好ましく、ポリ−Ｌ−リシンで処理されてい
ることが特に好ましい。また、基板は、アミノ基、アル
デヒド基、エポキシ基等を有する各種カップリング剤に
よってその表面が処理されていてもよく、ポリ−Ｌ−リ
シン等を用いる処理に、シランカップリング剤による処
理を組み合わせて行ってもよい。表面処理を行うことに
よって、疎水性、あるいは親水性の低い基板とＤＮＡ断
片との静電気的な相互作用を促進することができる。

【００２０】表面処理がされた基板表面上に、さらに、
電荷を有する親水性の高分子物質等からなる層や架橋剤
からなる層を設けてもよい。このような層を設けること
によって表面処理がされた基板の凹凸を軽減することが
できる。基板の種類によっては、その基板中に該高分子
物質等を含有させることも可能であり、このような処理
を施した基板も好ましく用いることができる。

【００２１】ＤＮＡ断片の点着は、ＤＮＡ断片と親水性
ポリマーとを水性媒体に溶解あるいは分散した水性液
を、９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分
注し、分注した水性液をスポッター装置等を用いて基板
表面上に滴下して行うことが好ましい。

【００２２】ＤＮＡ断片の固定は、親水性ポリマーの添
加処理によって安定に行うことができるが、さらに安定
に行うために、該処理に加えて、下記に記載する二種類
の処理の何れか一方あるいは両方を組み合わせて行うこ
とが好ましい。

【００２３】その処理の一つとして、ＤＮＡ断片の末端
に、予め静電的な相互作用に関与しうる官能基を導入す
る。そのような官能基としては、アミノ基、アルデヒド
基、チオール基、ビオチン基等を挙げることができる
が、アミノ基であることが好ましい。

【００２４】もう一つの処理として、ＤＮＡ断片と親水
性ポリマーとの混合溶液を基板表面に点着した後、加
熱、紫外線（ＵＶ）、水素化ホウ素ナトリウムあるいは
シッフ試薬による後処理を施す。また、これらの後処理
は、複数種類を組み合わせて行ってもよく、加熱処理と
紫外線処理を組み合わせて行うことが特に好ましい。こ
れらの後処理によって、ＤＮＡ断片の末端に導入した官
能基と基板表面との間に架橋が形成され、その結果、Ｄ
ＮＡ断片がさらに安定に結合すると考えられる。

【００２５】親水性ポリマーとしては、カチオン性、ア
ニオン性もしくは両性のイオン性の親水性ポリマーを用
いることが好ましい。ノニオン性ポリマーも好ましく用
いることができる。親水性ポリマーは、ＤＮＡ断片との
静電的な相互作用が強いこと、かつ後述するハイブリダ
イゼーションに対する阻害作用が少ないことが好まし
い。

【００２６】親水性ポリマーの具体例としては、ポリ
（１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタン
−１，４−ジイルメチレン−１，４−フェニレンメチレ
ンクロリド）、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリ
コール、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸
ナトリウム、ポリビニルベンゼンスルホン酸ナトリウ
ム、アルブミン等を挙げることができる。

【００２７】一般的に、親水性ポリマーのＤＮＡ断片の
結合に対する効果は、カチオン性、ノニオン性、アニオ
ン性（ＣＯＯ^-）、両性、アニオン性（ＳＯ₃ ^-）の順に
大きい。ポリマーの分子量は、１０³〜１０⁶の範囲にあ
ることが好ましい。分子量がこの範囲を超えると、粘性
が大きくなりすぎるため、ＤＮＡ断片の溶解性や固相担
体への結合に影響を及ぼす。親水性ポリマーの濃度は、
ＤＮＡ断片と親水性ポリマーとの水性液中、０．１〜２
容量％の範囲にあることが好ましい。０．５〜１容量％
の範囲にあることが特に好ましい。

【００２８】点着するＤＮＡ断片は、各領域当たり数ｎ
ｇ以下であることが好ましい。各領域間の距離は、０〜
１．５ｍｍの範囲にあることが好ましく、１００〜３０
０μｍの範囲にあることが特に好ましい。１つの領域の
大きさは、直径が５０〜３００μｍの範囲にあることが
好ましい。点着する液量は、１００ｐＬ〜１μＬの範囲
にあることが好ましく、１〜１００ｎＬの範囲にあるこ
とが特に好ましい。

【００２９】点着後は、必要に応じてインキュベーショ
ンを行うことが好ましい。インキュベート後、全く固定
されていないＤＮＡ断片や一端で固定されていないＤＮ
Ａ断片を洗浄して除去することが好ましい。このように
して作製されたＤＮＡチップの寿命は、数週間〜数ヶ月
の範囲にある。

【００３０】本発明のＤＮＡチップの利用法の一つとし
て、ＤＮＡチップの検定が挙げられる。実際に各領域に
固定されているＤＮＡ断片のモル量を厳密に測定する方
法が未だないことから、例えば、以下のような問題が生
じる場合がある。市販のＤＮＡチップを標識されたター
ゲットＤＮＡ断片を含むサンプル水性液とのハイブリダ
イゼーションに供し、ほとんど標識強度が検出されなか
った場合に、該ターゲットＤＮＡ断片がサンプル中に存
在していなかったのか、あるいは該ターゲットＤＮＡ断
片との二本鎖形成に必要とされる充分な量のＤＮＡ断片
が固定されていなかったのかを判別することが難しい場
合である。また、ＤＮＡチップを製造する製造者側にお
いては、製造したＤＮＡチップの品質を簡便に、かつ効
率良く検査するための指標がないという問題もある。本
発明のＤＮＡチップを利用することによって、かかる問
題を解決することができる。本発明のＤＮＡチップの検
定法は、基板上の各領域のＤＮＡ断片群を構成するＤＮ
Ａ断片が、各領域においてほぼ同数であることを相対的
に確認する方法である。本発明のＤＮＡチップの検定法
として、以下に説明する二例を挙げることができる。

【００３１】図２に、本発明のＤＮＡチップの検定法の
一例（特に、ハイブリダイゼーションまでの工程）を模
式的に示す。本発明のＤＮＡチップの検定法の一例は、
まず、上記で作製されたＤＮＡチップ（図１）上の区画
された領域（４１）のそれぞれに、共通オリゴヌクレオ
チド部位（２１ａ）に相補性を有する標識（６２）され
たオリゴヌクレオチド（７１）を含む水性液を、共通オ
リゴヌクレオチド部位群に対して、該オリゴヌクレオチ
ド（７１）が過剰モル量となるように接触させる。過剰
モル量を接触させることによって、該オリゴヌクレオチ
ド（７１）は、何れの領域においても、ＤＮＡ断片群の
すべてのＤＮＡ断片と二本鎖を形成する。次いで、各領
域における標識強度を測定することによって、各領域に
おける相対感度を求める。図３は、３つの領域における
標識強度の比が１：１：１であることを示している。こ
の方法は、主に、ＤＮＡチップを製造する製造者側が行
う、いわゆる抜き取り検査のための検定法である。

【００３２】共通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有
する標識されたオリゴヌクレオチド（以下、「標識オリ
ゴヌクレオチド」という。）としては、真核生物等の細
胞や組織からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応により標識
ｄＮＴＰを取り込ませて、標識ｃＤＮＡ断片としたも
の、合成によって作製されたオリゴヌクレオチドに標識
を付したもの等を用いることが好ましい。標識オリゴヌ
クレオチドの塩基数は、１０〜１００個の範囲にあるこ
とが好ましい。

【００３３】標識オリゴヌクレオチドを含む水性液の接
触は、その接触がすべての領域のＤＮＡ断片に均一に行
われるように、標識オリゴヌクレオチドを含む水性液中
にＤＮＡチップを浸積する方法、あるいは該水性液をＤ
ＮＡチップの全面に静かに重層する方法によって実施す
ることが好ましい。ハイブリダイゼーションは、該オリ
ゴヌクレオチドの接触によって開始する。接触は、室温
〜７０℃の温度範囲で、そして６〜２０時間の範囲で実
施することが好ましい。接触後、界面活性剤と緩衝液と
の混合溶液を用いて洗浄を行い、未反応の該オリゴヌク
レオチドを除去することが好ましい。界面活性剤として
は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いることが
好ましい。緩衝液としては、クエン酸緩衝液、リン酸緩
衝液、ホウ酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を
用いることができるが、クエン酸緩衝液を用いることが
好ましい。

【００３４】上記記載の本発明のＤＮＡチップの検定法
では、非共通ポリヌクレオチド部位に対する相対感度の
測定を行う工程を組み合わせて行ってもよい。

【００３５】図３に、本発明のＤＮＡチップの検定法の
別の一例（特に、ハイブリダイゼーションまでの工程）
を模式的に示す。本発明のＤＮＡチップの検定法の別の
一例は、本発明のＤＮＡチップを用いて、各領域に固定
されているＤＮＡ断片群の相対感度を検定する方法であ
って、下記の工程を含む。この方法は、ＤＮＡチップを
使用する使用者側が主に行う方法である。工程（Ａ）
は、本発明のＤＮＡチップ（図１）上の区画された領域
（４１）のそれぞれに、同一の標識（６１）方法によっ
て標識された複数の種類（図３においては、３種類）の
核酸断片（５１、５２、５３）が溶解あるいは分散して
なるサンプル水性液を接触させ、各領域における標識強
度を測定することによって、各領域に固定されているＤ
ＮＡ断片の相対感度を検定する工程である。工程（Ｂ）
は、（Ａ）で使用したＤＮＡチップ（（２））を用い
て、該ＤＮＡチップ上の区画された領域（４１）のそれ
ぞれに、共通オリゴヌクレオチド部位（２１ａ）に相補
性を有し、かつ上記（Ａ）の標識方法とは異なる標識
（６２）方法によって標識されているオリゴヌクレオチ
ド（７１）を含む水性液を、共通オリゴヌクレオチド部
位群に対して、該オリゴヌクレオチド（７１）が過剰モ
ル量となるように接触させ、各領域における標識強度を
測定することによって、各領域における相対感度を求め
る工程である。

【００３６】工程（Ａ）および工程（Ｂ）を含む本発明
のＤＮＡチップの検定法の具体例を示す。図３の（２）
に示すように、標識核酸断片５１、５２および５３のサ
ンプル中の含有比が既知でその値が４：２：１とする場
合に、該サンプルを各領域に接触させ、各領域における
標識強度を測定し、その比が３：２：１であったという
検出結果を得たとする。次に、各領域に、標識オリゴヌ
クレオチド（７１）を接触させると、図３の（３）に示
すように、各領域における標識強度が同一であることが
分かるので、上記の検出結果が、少なくとも使用したＤ
ＮＡチップの品質に依存するものではないことを確認す
ることができる。

【００３７】上記記載の検定法は、工程（Ｂ）が工程
（Ａ）に先行して行われてもよく、また工程（Ａ）と工
程（Ｂ）とが実質的に同時に行われてもよい。工程
（Ａ）および工程（Ｂ）の順に関わらず、工程（Ａ）と
工程（Ｂ）とは、同一の領域のそれぞれに対して行われ
る。

【００３８】非共通ポリヌクレオチド部位に相補性を示
す、同一の標識方法によって標識された核酸断片（以
下、「標識核酸断片」という。）としては、非共通ポリ
ヌクレオチド部位が由来する真核生物と同一属の真核生
物をサンプルとし、その細胞や組織からｍＲＮＡを抽出
し、次いで逆転写反応により標識ｄＮＴＰを取り込ませ
て、標識ｃＤＮＡ断片としたものを用いることが好まし
い。例えば、ＤＮＡチップに固定されているＤＮＡ断片
が由来する真核生物が酵母である場合には、野生型酵母
やＴＵＰＩ欠損型酵母から抽出したｍＲＮＡを鋳型とし
て合成した標識ｃＤＮＡ断片を用いることができる。ま
た、標識核酸断片として、サンプルが原核生物の細胞や
組織の場合には、ｍＲＮＡの選択的な抽出が困難である
ため、全ｍＲＮＡを標識したもの、標識プライマや標識
ｄＮＴＰを含む反応系でターゲット領域のＰＣＲを行っ
て得たものなどを用いることもできる。

【００３９】標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソト
ープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げる
ことができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリ
ゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合に
は、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって
標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上で
あることが好ましい。

【００４０】蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合
できるものであれば何れも用いることができるが、シア
ニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅ^TMシリーズのＣｙ３、
Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ
²−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ
（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好まし
い。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物
質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との
組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、
ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等
を挙げることができる。

【００４１】上記の二例の検定法では、共通オリゴヌク
レオチド部位がＤＮＡ断片に二つ以上存在する場合に
は、さらに検定の信頼性を上げるため、二つ以上の標識
オリゴヌクレオチド（標識方法が互いに異なり、かつオ
リゴヌクレオチドの塩基配列も互いに異なる標識オリゴ
ヌクレオチド）を用いて二回以上のハイブリダイゼーシ
ョンを行ってもよい。

【００４２】本発明のＤＮＡチップの検定キットは、本
発明のＤＮＡチップ（図１）および標識オリゴヌクレオ
チド（図２の７１）からなる。標識オリゴヌクレオチド
は、何れの標識方法によって標識されているオリゴヌク
レオチドであってもよいが、蛍光物質で標識されたもの
であることが好ましい。蛍光物質としては、前記記載の
蛍光物質を挙げることができる。本発明のＤＮＡチップ
の検定キットは、遺伝子分野の研究に携わる使用者によ
って、特に有効に使用される。

【００４３】

【実施例】［実施例１］ＤＮＡチップの作製（１）スライドガラスの処理スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）を、水酸化ナト
リウム５０ｇを蒸留水１５０ｍＬおよびエタノール２０
０ｍＬに溶解した溶液に１時間浸し、洗浄後、１０容量
％のポリ−Ｌ−リシン（シグマ社製）水溶液に１時間浸
水した。このものをプレート用遠心機で遠心し、室温に
て乾燥した。下記に記載するスライドガラスは、既にこ
の前処理が行われたスライドガラスを意味する。

【００４４】（２）スライドガラス表面上に固定される
ＤＮＡ断片の調製酵母由来の複数種の遺伝子からそれぞれ得られた組み換
えＤＮＡプラスミドを、Ｍ１３ファージにサブクローニ
ングし、それぞれＰＣＲ産物を得た。これらのＰＣＲ産
物は、それぞれ、酵母由来の特定の塩基配列部位、Ｍ１
３ファージ由来の特定の塩基配列部位（すべてのＰＣＲ
産物において共通であって、酵母由来の特定の塩基配列
部位の端の一方に位置する）およびＭ１３ファージ由来
の別の特定の塩基配列部位（すべてのＰＣＲ産物におい
て共通であって、酵母由来の特定の塩基配列部位の端の
別の一方に位置する）からなる。

【００４５】（３）ＤＮＡ断片の固定（２）で調製した各種のＤＮＡ断片の内、８種類のＤＮ
Ａ断片を使用した。その内の１種類のＤＮＡ断片（０．
５ｍｇ／ｍＬ）の３×ＳＳＣ（標準食塩−クエン酸緩衝
液の原液を３倍に希釈したもの）水溶液（１ｍＬ）を原
液とし、これを３×ＳＳＣにて２倍、４倍、８倍、１６
倍および３２倍にそれぞれ希釈したものを調製した。次
いで、それぞれのＤＮＡ断片の水溶液に、ＣＭＣ（カル
ボキシメチルセルロース）をその最終濃度が１容量％と
なるように添加し、ＣＭＣを含むＤＮＡ断片の各水溶液
６点（各水溶液の濃度は、０．５０、０．２５、０．１
３、０．０６３、０．０３１、０．０１６ｎｇ／ｎＬ）
を得た。次いで、（１）のスライドガラスの表面の領域
Ａ₁、Ａ₂、Ａ₃、Ａ₄、Ａ₅およびＡ₆に、上記の各水溶液
１ｎＬを順次、スポッター装置を用いて点着した（下記
第１表）。他の７種類のＤＮＡ断片についても同様にし
てＣＭＣを含む各水溶液を調製して、それぞれ、領域Ｂ
₁〜Ｂ₆、Ｃ₁〜Ｃ₆、Ｄ₁〜Ｄ₆、Ｅ₁〜Ｅ₆、Ｆ₁〜Ｆ₆、Ｇ
₁〜Ｇ₆およびＨ₁〜Ｈ₆に点着した。次に、７０℃で１時
間加熱処理した後、このスライドガラスの表面を、スラ
イドガラス表面当たり１２０ＫＪの強度で紫外線照射を
行った。このスライドガラスを、７０ｍＭ無水コハク酸
を含む０．１Ｍホウ酸ナトリウム水溶液に１０分間浸
し、時々振盪した後、沸騰したＭｉｌｌｉＱ水中に３分
間浸し、エタノールに浸した後、室温で乾燥した。

【００４６】

【表１】

【００４７】［実施例２］ＤＮＡチップの検定（１）標識オリゴヌクレオチドの調製５’末端に蛍光標識試薬（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＣｙ
３−ｄＣＴＰ、アマシャム・ファルマシア・バイオテッ
ク社製、ＰＡ５３０２２）を結合させた２４量体の標識
オリゴヌクレオチドを調製した。

【００４８】（２）ハイブリダイゼーションおよび蛍光
強度の測定（１）の標識オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼー
ション用溶液（４×ＳＳＣおよび１０重量％のＳＤＳの
混合溶液）２０μＬに、２ピコモル／μＬとなるように
分散させたものを、実施例１で作製したＤＮＡチップに
静かに重層し、モイスチャーチャンバー内にて、６０℃
で２０時間インキュベートした。次いで、このものを
０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合溶液に浸積し
た。そして、０．１重量％ＳＤＳと２×ＳＳＣとの混合
溶液、０．１重量％ＳＤＳと０．２×ＳＳＣとの混合溶
液、および０．２×ＳＳＣ水溶液で順次洗浄した後、６
００ｒｐｍで２０秒間遠心し、室温で乾燥した。次い
で、ハイブリダイゼーション後のＤＮＡチップの各領域
の蛍光強度を蛍光スキャニング装置で測定し、その相対
感度を求めた。第２表には、ＤＮＡチップの領域１〜８
の相対感度を示す。

【００４９】

【表２】第２表 ──────────────── 領域相対感度 ──────────────── Ａ₁ １．２４Ｂ₁ １．２６Ｃ₁ １．２８Ｄ₁ １．００Ｅ₁ １．２６Ｆ₁ １．３３Ｇ₁ １．０２Ｈ₁ １．１５ ────────────────

【００５０】第２表より、領域Ａ₁〜Ｈ₁の相対感度
は、本来同一となるはずであるが、実際に蛍光強度を測
定してみると同一とはならないことが分かる。また、上
記の差異が、本発明のＤＮＡチップの検定法を利用して
確認できることも分かる。

【００５１】また、第３表には、領域Ａ₁〜Ａ₆の相対感
度を示す。第３表より、点着ＤＮＡ断片の量（重量）と
相対感度とはほぼ良好な直線関係を示すことが分かる。

【表３】第３表 ──────────────── 領域相対感度 ──────────────── Ａ₁ ３．０１Ａ₂ ２．５９Ａ₃ ２．０１Ａ₄ １．５３Ａ₅ １．３７Ａ₆ １．００ ────────────────

【００５２】

【発明の効果】本発明のＤＮＡチップは、共通オリゴヌ
クレオチド部位と非共通ポリヌクレオチド部位とからな
るＤＮＡ断片群を固定させてなる新規なＤＮＡチップで
ある。また、本発明のＤＮＡチップを用いる本発明のＤ
ＮＡチップの検定法によって、ＤＮＡチップを製造する
製造者側は、一定の品質を備えたＤＮＡチップを提供す
ることが可能となり、使用者側も、市販のＤＮＡチップ
の品質を使用者自身で確認することができる。さらに、
本発明のＤＮＡチップの検定キットは、上記の検定法に
有効に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡチップの代表的な模式図であ
る。

【図２】本発明のＤＮＡチップの検定法の一例を示す模
式図（特に、ハイブリダイゼーションまでの工程）であ
る。

【図３】本発明のＤＮＡチップの検定法の別の一例を示
す模式図（特に、ハイブリダイゼーションまでの工程）
である。

【符号の説明】

１１ＤＮＡチップの全体図２１、２２、２３ＤＮＡ断片２１ａ共通オリゴヌクレオチド部位２１ｂ、２２ｂ、２３ｂ非共通ポリヌクレオチド部位２１ｃ２１ａとは異なる共通オリゴヌクレオチド部位３１基板４１領域５１、５２、５３標識された核酸断片６１、６２互いに異なる方法による標識７１共通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有する標
識オリゴヌクレオチド

フロントページの続き (72)発明者袴田正志神奈川県足柄上郡開成町宮台798番地富士写真フイルム株式会社内 (72)発明者洞尚文東京都港区西麻布２丁目26番30号富士写真フイルム株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA80 HA14 4B063 QA01 QA17 QA18 QQ42 QQ53 QR55 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】基板表面に区画された複数の領域のそれ
ぞれに、ＤＮＡ断片群が各ＤＮＡ断片の一端で固定され
ているＤＮＡチップであって、それぞれの領域に固定さ
れているＤＮＡ断片群が、共通した塩基配列を有する共
通オリゴヌクレオチド部位と、領域ごとに互いに異なる
塩基配列を有する非共通ポリヌクレオチド部位とからな
ることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項２】各領域のＤＮＡ断片群のそれぞれが、非
共通ポリヌクレオチド部位の両端のそれぞれに共通オリ
ゴヌクレオチド部位を有することを特徴とする請求項１
に記載のＤＮＡチップ。
【請求項３】請求項１もしくは２に記載のＤＮＡチッ
プ、および共通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有す
る標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とするＤ
ＮＡチップの検定キット。
【請求項４】標識オリゴヌクレオチドが、蛍光物質に
よって標識されたオリゴヌクレオチドであることを特徴
とする請求項３に記載のＤＮＡチップの検定キット。
【請求項５】請求項１もしくは２に記載のＤＮＡチッ
プ上の区画された領域のそれぞれに、各ＤＮＡ断片群の
共通オリゴヌクレオチド部位に相補性を有する標識オリ
ゴヌクレオチドを含む水性液を接触させることにより、
標識オリゴヌクレオチドを各ＤＮＡ断片群の共通オリゴ
ヌクレオチド部位に結合させ、各領域における標識強度
を測定することによって、各領域の相対感度を求めるこ
とを特徴とするＤＮＡチップの検定法。