JP2001097994A - ２’−ｏ−置換ピリミジンおよびそのオリゴマー化合物の合成の改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】２−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドおよびこ
れらのヌクレオシドを持つオリゴマー化合物を合成する
ための改良方法の提供。 【解決手段】式（１） ［式中Ｒ^２およびＲ^３は、独立して水素またはヒドロキ
シル保護基、Ｘ′は酸素または硫黄、Ｒ^５およびＲ^６は
独立して水素、置換されててもよいヒドロカルビルを、
それぞれ表す］で表される２，２′−アンヒドロピリミ
ジンヌクレオシドまたは２Ｓ、２′−アンヒドロピリミ
ジンヌクレオシドをルイス酸触媒の存在下で、弱い求核
試薬、例えばアルコール等と反応させアルキル化する工
程を含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の技術分野】本発明は２’−Ｏ−置換ピリミジン
ヌクレオチドおよびこれらのヌクレオチドを含むオリゴ
マー化合物の合成のための改良法に関する。本発明は
２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドまたは２
Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドを弱い求
核試薬およびルイス酸で処理することを特徴としてい
る。本方法は現在使用されている方法と比較して経済的
な利点を持ち、大規模合成に応用できる。本発明はま
た、糖の２’−Ｏ−位およびピリミジンの５位が修飾さ
れた少なくとも一つの修飾ピリミジン単量体サブユニッ
トを持つオリゴマー化合物を特徴としている。本発明の
オリゴマー化合物は核酸に対する増加した結合親和性お
よび増加したヌクレアーゼ耐性を示す。

【０００２】

【背景技術】２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドは
それ自体オリゴヌクレオチドおよび関連する化合物の製
造に有用である。２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシ
ドは例えば、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌ
ｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａのような会社から市販品とし
て購入可能であり、商業的商品と考えられる。本発明は
２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの製造のための
新規かつ有用な方法に関している。

【０００３】オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体
は、分子生物学においてプローブ、プライマー、リンカ
ー、アダプターおよび遺伝子フラグメントとしての使用
を含む種々の使用のために開発されてきた。これらの方
法で使用されるオリゴヌクレオチドへの修飾には、フル
オレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリ性ホ
スファターゼまたは他のレポーター分子のような非放射
性標識による標識化が含まれる。生じる類似体のヌクレ
アーゼ安定性を増加させるためにリボースリン酸主鎖へ
も修飾がなされた。これらの修飾にはメチルホスホネー
ト、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート結合お
よび２’−Ｏ−メチルリボース糖ユニットの使用が含ま
れる。他の修飾はオリゴヌクレオチドの取り込みおよび
細胞分布に関している。診断および治療の両方の使用に
おけるこれらのオリゴヌクレオチドの成功は改良された
オリゴヌクレオチド類似体に対するさらなる要望を創り
出した。

【０００４】多細胞系生物体の身体状態のほとんどは
（ほとんどの疾患状態を含む）蛋白質により影響され
る。直接的に働くにしても、またはその酵素的またはそ
の他の機能を通して働くにせよ、そのような蛋白質は動
物またはヒトにおける多くの疾患および制御的機能に主
な比率で寄与している。疾患状態に対して、古典的治療
では一般的にそのような蛋白質の疾患を引き起こすまた
は疾患を悪くする機能を和らげようとしてそのような蛋
白質との相互作用に焦点が合わされてきた。より新しい
治療方法においては、そのような蛋白質の実際の産生を
調節することが望まれている。蛋白質の産生を妨害する
ことにより、最小の副作用で最大の治療効果が得られる
であろう。そのような治療法の一般的な目的は、望まれ
ない蛋白質形成を導くであろう遺伝子発現を妨害、さも
なくば調節することである。

【０００５】特定の遺伝子発現を阻害する一つの方法は
オリゴヌクレオチド、特に特定の標的メッセンジャーＲ
ＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的であるオリゴヌクレオチ
ドの使用である。そのような使用のため、いくつかのオ
リゴヌクレオチドが現在臨床試験されている。ホスホロ
チオエートオリゴヌクレオチドは現在種々の疾患状態の
ためのヒト臨床試験におけるアンチセンス剤（抗ウイル
ス剤としての使用を含む）として使用されている。転写
因子は転写の制御において二本鎖ＤＮＡと相互作用す
る。オリゴヌクレオチドは転写因子の競合阻害剤として
働き、転写因子の作用を調節することができる。いくつ
かの最近の報告はそのような相互作用を記載している
（Ｂｉｅｌｉｎｓｋａ，Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９
９０，２５０，９９７〜１０００；およびＷｕ，Ｈ．
ら、Ｇｅｎｅ，１９９０，８９，２０３〜２０９を参照
されたい）。

【０００６】蛋白質の間接的および直接的両方の制御に
加え、オリゴヌクレオチドには例えば、体液、組織、無
傷の細胞または単離された細胞成分を含む材料の診断試
験における使用もまた見いだされている。遺伝子発現阻
害のように、診断応用は核酸の相補鎖とハイブリダイズ
するオリゴヌクレオチドの能力を利用している。ハイブ
リダイゼーションとはＲＮＡまたはＤＮＡへのワトソン
−クリックおよび／またはフーグスティーン塩基対によ
るオリゴヌクレオチドの配列特異的水素結合である。そ
のような塩基対の塩基はお互いに相補的であると言われ
ている。

【０００７】オリゴヌクレオチドはまた研究用試薬とし
て広く使用されている。それらは生物学的分子の機能を
調べる研究、ならびに生物学的分子の調製において特に
有用である。例えば、ＰＣＲ反応におけるプライマーと
しての天然および合成の両オリゴヌクレオチドの使用は
商業的製造工業の拡大をもたらした。ＰＣＲは商業的お
よび研究的実験室の大黒柱となっており、ＰＣＲの応用
は増加してきた。例えば、現在ＰＣＲ技術は法廷、古生
物学、進化的研究および遺伝学的相談の分野での使用が
みられる。商業化は、ＰＣＲの応用において分子生物学
の訓練を受けていない人を助けるキットの開発を導い
た。

【０００８】オリゴヌクレオチドはまた他の実験室操作
でも使用される。これらの使用のいくつかはＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＭａｎｕａｌ，第二版、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；およびＣｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３のような
一般の実験室マニュアルに記載されている。そのような
使用の代表的なものは、合成オリゴヌクレオチドプロー
ブ、抗体およびオリゴヌクレオチドによるスクリーニン
グ発現ライブラリー、ＤＮＡシークエンシング、ポリメ
ラーゼ連鎖反応によるＤＮＡのインビトロ増幅およびク
ローン化ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発（上記Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ ＭａｎｕａｌのＢｏｏｋ２参照）およびＤＮＡ−
蛋白質相互作用およびポリメラーゼ連鎖反応（上記Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの第２巻参照）である。

【０００９】オリゴヌクレオチドは所望の使用に適合す
るように調整されたあつらえた特性を持つように合成で
きる。従って、診断において、研究試薬としておよび治
療物質としてのそれらの有用性を増加させるために多数
の化学修飾が導入された。それらの修飾には、標的鎖へ
の結合性を高くするため（すなわち、それらの融解温
度、Ｔ_m を高くする）、オリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド−標的複合体の同定を助けるため、細胞
侵入を増加させるため、オリゴヌクレオチドの構造また
は活性を分解または妨害するヌクレアーゼおよびその他
の酵素に対して安定化させるため、標的へ配列特異的結
合した後の破壊（終了事象）の様式を提供するため、お
よびオリゴヌクレオチドの薬動力学的特性を改良するた
めに設計された修飾が含まれる。

【００１０】Ｇｉｂｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．、およびＢｅｎｋ
ｏｖｉｃ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，６４５５〜６４６７
はオリゴヌクレオチド内へ取り込まれたフタルイミド保
護５−（３−アミノプロピル）−２’−デオキシウリジ
ン ヌクレオシドプローブを報告している。Ｈａｒａｌ
ａｍｂｉｄｉｓ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，１５，４８５７〜４８
７６はオリゴヌクレオチド内へ取り込まれたＣ−５置換
デオキシウリジンを報告している。置換基はマスクされ
た一級脂肪族アミノ基を有しており、これをさらに種々
の基で置換することができる。

【００１１】１９９３年１月２２日に出願され、１９９
４年８月４日に公開されたＰＣＴ出願第ＷＯ９４／１７
０９４号は５−置換ピリミジン（シトシンまたはウラシ
ル）塩基（ここで、５−置換基はＣ_3-14ｎ−アルキル、
Ｃ_2-8 （Ｅ）−ｎ−１−アルケニル、エチニルまたはＣ
_4-12 ｎ−１−アルキル基である）、および一つまたは
それ以上の修飾５−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌ
クレオチドの合成を報告している。１９９２年１１月２
４日に出願され、１９９３年６月１０日に公開されたＰ
ＣＴ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は５−（１−プロピ
ニル）ウラシルおよび５−（１−プロピニル）シトシン
または関連類似体、および一つまたはそれ以上の修飾５
−置換ピリミジン塩基を持つオリゴヌクレオチドの合成
を報告している。１９９２年１１月２４日出願されたＰ
ＣＴ出願第ＷＯ９３／１０８２０号は塩基の５’位へ結
合された炭素原子のパイ結合連結を持つオリゴヌクレオ
チド内へ取り込まれた２’−および５−置換ピリミジン
ヌクレオチドを報告している。

【００１２】

【発明の要旨】本発明は核酸に対する改良された親和性
を持ちおよび構造Ｉの単量体ユニットを少なくとも一つ
持つオリゴマー化合物を提供する：

【００１３】

【化６】

【００１４】［式中：Ｘはヒドロキシルまたはアミノで
あり；ＲはハロまたはＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルまたは置換Ｃ
₁ 〜Ｃ₆ アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒド
ロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ
る）であり；Ｌは酸素または硫黄であり；Ｚはフルオロ
またはＯ−Ｒ₁ Ｘ₁ （式中、Ｒ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキ
ル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₀アリール、またはＣ₇ 〜Ｃ₁₈アルカリー
ルであり、およびＸ₁ はＨ、ＮＨ₂またはイミダゾール
である）であり；およびＱ₁ およびＱ₂ の一つは共有結
合でヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド
またはオリゴヌクレオシドに結合されており、および該
Ｑ₁ およびＱ₂の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキシ
ル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−ヌ
クレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホス
フェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトであ
る］。

【００１５】本発明の一つの好適な態様において、Ｌは
酸素である。別の態様において、ＺはＦである。本発明
のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は約５か
ら２００サブユニットの長さである。本発明のより好適
な態様において、オリゴマー化合物は約５から５０サブ
ユニットの長さである。さらにより好適な態様におい
て、オリゴマー化合物は約１０から２０サブユニットの
長さである。別の態様においては、オリゴマー化合物に
おける本発明の単量体サブユニットとヌクレオチド、オ
リゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオ
シド間の共有結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエ
ステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホスホ
ネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホ
ノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエ
ートまたはホスホロアミデートから選択される。

【００１６】本発明のさらに別の態様において、オリゴ
マー化合物は構造Ｉの複数の単量体サブユニットを持つ
ように製造される。好適な態様において、構造Ｉの複数
の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は、前も
って選択された場所に位置する単量体サブユニットを持
つように製造される。本発明の特別な態様に含まれてい
るのは構造IIの単量体サブユニットを少なくとも一つ持
つオリゴマー化合物である：

【００１７】

【化７】

【００１８】［式中：Ｘはヒドロキシルまたはアミノで
あり；ＲはハロまたはＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルまたは置換Ｃ
₁ 〜Ｃ₆ アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒド
ロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ
る）であり；Ｌは酸素または硫黄であり；およびＱ₁ お
よびＱ₂ の一つは連結残基を通してヌクレオチド、オリ
ゴヌクレオチド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシ
ドに結合されており、および該Ｑ₁ およびＱ₂ の他方は
ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、活性化固相支持体、
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、オ
リゴヌクレオシド、オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシ
ド、活性化ホスフェート、ホスフェート、活性化ホスフ
ァイトまたはホスファイトである］。

【００１９】本発明の好適な態様において、ＬはＯであ
る。さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合
物は約５から５０サブユニットの長さである。別の態様
において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サ
ブユニットとヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌク
レオシドまたはオリゴヌクレオシド間の共有結合は、ホ
スホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェン
ホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホ
ノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミ
デートから選択される。

【００２０】本発明のさらに別の態様において、オリゴ
マー化合物は構造IIの複数の単量体サブユニットを持つ
ように製造される。好適な態様において、構造IIの複数
の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前もっ
て選択された場所に位置する単量体サブユニットを持つ
ように製造される。本発明の特別な態様に含まれている
のは構造III の単量体サブユニットを少なくとも一つ持
つオリゴマー化合物である：

【００２１】

【化８】

【００２２】［式中：Ｘはヒドロキシルまたはアミノで
あり；ＲはハロまたはＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルまたは置換Ｃ
₁ 〜Ｃ₆ アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒド
ロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ
る）であり；Ｌは酸素または硫黄であり；Ｒ₁ はＣ₁ 〜
Ｃ₆ アルキル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₀アリール、Ｃ₇ 〜Ｃ₁₈アルカ
リールであり、およびＸ₁ はＨ、ＮＨ₂ またはイミダゾ
ールであり；およびＱ₁ およびＱ₂ の一つは連結残基を
通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシ
ドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、および
該Ｑ₁ およびＱ₂ の他方はヒドロキシル、保護ヒドロキ
シル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌクレ
オチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ−
ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、ホ
スフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイトで
ある］。

【００２３】本発明の好適な態様において、ＬはＯであ
る。さらに別の態様において、本発明のオリゴマー化合
物は約５から５０サブユニットの長さである。別の態様
において、オリゴマー化合物における本発明の単量体サ
ブユニットとヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌク
レオシドまたはオリゴヌクレオシド間の共有結合は、ホ
スホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェン
ホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホ
ノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホロアミ
デートから選択される。

【００２４】本発明のさらに別の態様において、オリゴ
マー化合物は構造III の複数の単量体サブユニットを持
つように製造される。好適な態様において、構造III の
複数の単量体サブユニットを持つオリゴマー化合物は前
もって選択された場所に位置する単量体サブユニットを
持つように製造される。本発明に従うと、式：

【００２５】

【化９】

【００２６】［式中：Ｑはピリミジン塩基または２−Ｓ
ピリミジン塩基であり；Ｒ¹ は置換または非置換Ｃ₁ 〜
Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルケニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アル
キニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇ 〜Ｃ₃₀アラルキ
ルであり、ここで該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシ
ル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであり；お
よびＲ² およびＲ³ は独立して水素またはヒドロキシル
保護基である］の２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシ
ド合成のための改良法も提供され、該方法は以下の工程
を含む：

【００２７】２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオ
シドを提供し；式Ｒ¹ −ＯＨのアルコールを選択し；お
よび該２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドお
よび該アルコールを該２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレ
オシドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件
下、ルイス酸で処理する。本発明に従うと、式：

【００２８】

【化１０】

【００２９】〔式中：Ｘ’はＯまたはＳであり；Ｒ₁ は
置換または非置換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アル
ケニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリールま
たはＣ₇ 〜Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置換はハ
ロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたは
チオエーテルである；Ｒ² およびＲ³ は独立して水素ま
たはヒドロキシル保護基であり；Ｒ⁵ およびＲ⁶ は独立
してＨ、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁ 〜Ｃ
₃₀ヒドロカルビルである〕の２’−Ｏ−置換シチジンヌ
クレオシド合成のための改良法も提供され、該方法は以
下の工程を含む：式：

【００３０】

【化１１】

【００３１】の２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオ
シドを提供し；式Ｒ¹ −ＯＨのアルコールを選択し；お
よび該２−２’−アンヒドロウリジンヌクレオシドおよ
び該アルコールを該２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシ
ドを得るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ル
イス酸で処理し；および該２’−Ｏ−置換ウリジンヌク
レオシドを該２’−Ｏ−置換シチジンヌクレオシドへア
ミノ化する。本発明の好適な態様において２−２’−ア
ンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび式Ｒ¹ −ＯＨの
アルコールは、反応容器として例えば、高圧容器のよう
な圧力封入容器中で処理される。好適には反応容器は約
１２０℃から約２００℃で加熱される。

【００３２】本発明のより好適な態様において、ルイス
酸はホウ酸エステル（ｂｏｒａｔｅ）、特にホウ酸トリ
アルキルである。好適には、ホウ酸トリアルキルのアル
キル基はアルコールのＲ基と同一のものであり、従っ
て、ホウ酸エステルの式はＢ（ＯＲ¹ ）₃ である。ホウ
酸トリアルキルは好適には水素化ホウ素（ｂｏｒａｎ
ｅ）をアルコールで処理することにより製造される。好
適には、２−２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシド
の処理に使用されるアルコールはまたホウ酸トリアルキ
ルの製造にも使用され、好ましくは式ＨＯ−Ｒ¹ のアル
コールである。本発明のいくつかの好適な態様におい
て、Ｒ¹ はＣ₁ 〜Ｃ₃₀アルキルであり、より好ましくは
Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである。別の好適な態様において、
Ｒ¹ はＣ ₆ 〜Ｃ₁₄アリールである。

【００３３】本発明の一つの好適な態様において、本方
法により製造されるピリミジンヌクレオシドはウリジン
または５−メチルウリジンである。本発明の別の好適な
態様において、本方法により製造される２’−Ｏ−置換
シチジンヌクレオシドはウリジンまたは２’−Ｏ−メチ
ル−５−メチルシチジンである。本発明に従うと、少な
くとも一つの構造IVの単量体サブユニットを含むオリゴ
マー化合物が提供される：

【００３４】

【化１２】

【００３５】［式中：Ａはヒドロキシルまたはアミノで
あり；ＲはハロまたはＣ₁ 〜Ｃ₆ アルキルまたは置換Ｃ
₁ 〜Ｃ₆ アルキル（ここで該置換はハロ、アミノ、ヒド
ロキシル、チオール、エーテルまたはチオエーテルであ
る）であり；Ｌは酸素または硫黄であり；Ｚ’は置換ま
たは非置換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルケニ
ル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリールまたは
Ｃ₇ 〜Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置換はハロ、ア
ミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエ
ーテルであり；およびＱ₁ およびＱ₂ の一つは結合残基
を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオ
シドまたはオリゴヌクレオシドに結合されており、およ
び該Ｑ₁ およびＱ₂ の他方はヒドロキシル、保護ヒドロ
キシル、活性化固相支持体、ヌクレオチド、オリゴヌク
レオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオシド、オリゴ
−ヌクレオチド／ヌクレオシド、活性化ホスフェート、
ホスフェート、活性化ホスファイトまたはホスファイト
である］。

【００３６】本発明の好適な態様において、ＬがＯであ
る単量体サブユニットを少なくとも一つ持つオリゴマー
化合物が提供される。本発明のさらに好適な態様におい
て、Ｚ’が置換アルキルである単量体サブユニットを少
なくとも一つ持つオリゴマー化合物が提供される。より
好適な態様において、Ｚ’はメトキシエチル（ＣＨ₃Ｏ
ＣＨ₂ ＣＨ₂ −）である。一つの態様において、本発明
のオリゴマー化合物は５から２００の単量体サブユニッ
トを含んでいる。より好適な態様において、本発明のオ
リゴマー化合物は５から５０の単量体サブユニットを含
んでいる。さらにより好適な態様において、本発明のオ
リゴマー化合物は１０から２０のサブユニットを含んで
いる。

【００３７】別の態様において、Ｑ₁ およびＱ₂ の一つ
は連結残基を通してヌクレオチド、オリゴヌクレオチ
ド、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドに結合され
ており、ここで連結残基はホスホジエステル、ホスホト
リエステル、ハイドロジェンホスホネート、アルキルホ
スホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホ
スホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチ
オエートまたはホスホロアミデートを含んでいる。本発
明のさらに別の態様において、オリゴマー化合物は上記
の式の複数の単量体サブユニットを持つように提供され
る。より好適な態様では、オリゴマー化合物は前もって
選択された場所に単量体サブユニットが位置するように
提供される。

【００３８】

【好適な態様の説明】本発明の好適なオリゴマー化合物
は少なくとも一つの構造Ｉの単量体サブユニットを持っ
ている。構造Ｉは２’位が置換され、１’がグリコシル
結合を通して５−置換ピリミジンの１へ結合されたβ−
Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル糖である。単量体サブ
ユニットの５’および３’末端は、ヌクレオチド、ヌク
レオシド、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドま
たは混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドへ結合で
き、またはオリゴマー化合物の３’または５’終結末端
でありうる。

【００３９】本発明の化合物の製造に使用される単量体
サブユニットはヌクレオチドおよびヌクレオシドを含ん
でいる。ヌクレオチドはリン結合残基を含んでおり、一
方、ヌクレオシドはリン結合残基を含んでいないが、各
々ともグリコシル結合を通して核酸塩基へ結合されたリ
ボフラノシル残基を有する。本発明の単量体サブユニッ
トは連結残基を用いて結合されている。連結残基には、
ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロジェ
ンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホス
ホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデ
ート、ケトン、スルホン、カーボネートおよびチオアミ
デートが含まれる。アルキルホスホノチオエート結合は
ＷＯ９４／０２４９９号に開示されている。他のそのよ
うな残基もまた使用することができる。

【００４０】本発明の一つの態様において、２’−Ｆ−
５−アルキル−ウリジン（および５−ハロ類似体）単量
体サブユニットは、最初にヌクレオシドの５−位に適当
なアルキル基を置換することにより製造される。５−ハ
ロ基の場合、５−Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩウラシルがＡ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから
入手可能である。ウラシルのＣ−５でのアルキル、アル
ケニルおよびアルキニルの置換は１９９２年１１月２４
日に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１
５号に開示されており、アルキル置換の例はさらにＭａ
ｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏ
ｏｋｅおよびＬｅｂｌｅｕ編，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂ
ｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３に記載されている。

【００４１】５−アルキル化ウリジンはＤＭＦ中で炭酸
ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウムで処理し、続いて
精製することにより、２，２’−アンヒドロ［１−（β
−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］
へ変換される。２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−
アラビノフラノシル）−５−アルキルウリジン］は適当
な溶媒中（例えばジオキサン）、ＨＦ／ピリジンでさら
に処理されて１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−
ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンを与える。
この化合物は標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／
アミダイトへ変換され、１−（５−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
アミノ−２−シアノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリ
スロ−ペントフラノシル）−５−アルキルウリジンを与
える。１−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオ
ロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シア
ノエチルホスファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル）−５−アルキルウリジンはオリゴマー化合物合
成において単量体サブユニット前駆体として使用され
る。

【００４２】５−アルキル化−２’−Ｆ−ウリジンの５
−アルキル化−２’−Ｆ−４−Ｎ−保護（例えばベンゾ
イル）シチジンへの変換は１，２，４−トリアゾールを
用いる既知の方法および技術により達成される。５−Ｏ
−アルキル化ウリジンは最初、３’および５’位が保護
される。この保護は無水酢酸により達成できる。塩基存
在下（例えば、トリエチルアミン）、適当な溶媒（例え
ばアセトニトリル）中で１，２，４−トリアゾールを低
温にてＰＯＣｌ₃ で処理する。保護された５−Ｏ−アル
キル化−２’−Ｆ−ウリジンを適当な溶媒に溶解し、ト
リアゾール／ＰＯＣｌ₃ を含む溶液に加える。十分な時
間が経過した後、続いて後処理および精製を行うとトリ
アジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フ
ルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−
アルキルウリジンが得られる。この化合物はアンモニア
処理することにより５−アルキル−１−（２−フルオロ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシンへ
変換される。環外アミノ基は例えば、適当な溶媒（例え
ば、ピリジン）中で無水安息香酸で処理することにより
保護される。

【００４３】この化合物は標準的な方法および技術に従
ってＤＭＴ／アミダイトへ変換され、４−Ｎ−保護−５
−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−
５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペン
トフラノシル）−シトシンが得られる。４−Ｎ−保護−
５−アルキル−１−（２−フルオロ−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−
ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト
−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ
ントフラノシル）−シトシンはオリゴマー化合物合成に
おいて単量体サブユニット前駆体として使用される。

【００４４】５位の置換基に対しアルキルより複雑な基
（例えば、ハロまたは置換Ｃ₁ 〜Ｃ ₆ アルキル、ここで
該置換はハロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エー
テルまたはチオエーテルである）を用いる５−置換−
２’−Ｆ−ピリミジンの製造では、適当な保護基を用い
て、アンヒドロ化合物の製造に先立ってその基が保護さ
れることが必要である。５位に保護基を持つ化合物の全
合成は飽和アルキル基の代わりにこれらの置換アルキル
基の一つの取り込みに対して前に記載したものと同一で
ある。

【００４５】本発明の別の態様において、２’−Ｏ−置
換−５−置換ウリジン単量体サブユニットは、アンヒド
ロ体の開裂にアルコール（例えば、フェニル置換基に対
してフェノール、またはＯ−プロピル置換基に対してプ
ロパノール）が使用されることを除いては上記の２，
２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシ
ル）−５−アルキルウリジン］の方法を用いて製造され
る。生じる化合物は標準的な方法および技術に従ってＤ
ＭＴ／アミダイトへ変換され、１−（２−Ｏ−置換−３
−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチ
ルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ
−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンが
得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成
において単量体サブユニット前駆体として使用される。

【００４６】１−（２−Ｏ−置換−５−ジメトキシトリ
チル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−置
換ウリジンは１，２，４−トリアゾールを用いる既知の
方法および技術によりシチジン類似体に変換される。５
−置換−２’−Ｏ−置換ウリジンはまず、適当な保護基
（例えば、無水酢酸）を用いて３’位が保護される。本
物質は後処理後に精製される。塩基存在下（例えば、ト
リエチルアミン）、適当な溶媒（例えばアセトニトリ
ル）中で１，２，４−トリアゾールを低温にてＰＯＣｌ
₃ で処理する。保護された５−置換−２’−Ｏ−置換−
３’−Ｏ−保護ウリジンを適当な溶媒に溶解し、トリア
ゾール／ＰＯＣｌ₃ を含む溶液に加える。十分な時間が
経過した後、続いて後処理および精製を行うと１−（２
−Ｏ−置換−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシト
リチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−
トリアゾロ−５−置換ピリミジンが得られ、これはアン
モニアで処理することによりシチジン類似体へ変換され
る。環外アミノ基（Ｎ−４）は例えば、ピリジンまたは
ＤＭＦのような適した溶媒中で無水安息香酸で処理する
ことにより保護され、前に例示したようにＤＭＴ／アミ
ダイトへさらに変換される。得られる１−（２−Ｏ−置
換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シア
ノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−
β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベン
ゾイル−５−置換シチジンはオリゴマー化合物合成にお
いて単量体サブユニット前駆体として使用される。

【００４７】本発明の別の態様において、２’−置換−
５−置換ピリミジンの２−Ｓ類似体が製造される。２’
−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンは２，３，５
−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖から出発し、グリコ
シル化工程を経て２−チオ−５−置換ピリミジンと結合
させる１つの方法により製造される。種々の２−チオ−
５−置換ピリミジンの合成はＶｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，
Ｐ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，１９
６９，８，９７６〜９７７およびＶｏｒｂｒｕｇｇｅ
ｎ，Ｐ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１９７３，１０６，
３０３９〜３０６１に記載されている。２，３，５−ト
リ−Ｏ−ベンゾイルリボース糖および５−置換−２−チ
オウラシルは適当な溶媒に溶解し、Ｎ−Ｏ−ビス（トリ
メチルシリル）アセトアミドおよびトリメチルシリル
トリフレートで処理される。生じた２，３，５−トリ−
Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−置換ウリジンを適当な
溶媒中でナトリウムメトキシドを用いて脱保護すると２
−チオ−５−置換ウリジンが得られる。２−チオ−５−
置換ウリジンを適当な溶媒に溶解し、酸化ジブチルスズ
およびヨウ化テトラブチルアンモニウム、続いてハロゲ
ン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）で処理すると、
２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリジンが得られ
る。

【００４８】２’−Ｏ−置換−２−チオ−５−置換ウリ
ジンは標準的な方法および技術に従ってＤＭＴ／アミダ
イトへ変換され、１−（２−Ｏ−置換−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホスファイ
ト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−
ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジンが得
られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物合成に
おいて単量体サブユニット前駆体として使用される。

【００４９】本発明のさらに別の態様において、２’−
Ｆ−５−置換ピリミジンの２−Ｓ類似体が製造される。
２’−Ｆ−２−チオ−５−置換ピリミジンを製造する一
つの方法は２’−Ｆ−２−置換−５−置換ピリミジンの
製造に使用される方法と類似した方法を使用するもので
ある。この方法では官能基を選択的に保護し、上記のＯ
−２および２’間で形成されるアンヒドロ結合と同様
に、Ｓ−２および２’間にアンヒドロ結合を形成させ
る。

【００５０】２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−
チオ−５−メチル−ウリジンは２，３，５−トリ−Ｏ−
ベンゾイルリボースおよび５−置換−２−チオウリジン
間のグリコシル化により形成される。適当な溶媒中、ナ
トリウムメトキシドで脱保護して精製した後、得られた
５−メチル−２−チオウリジンは標準的方法および技術
を用いて５’位がＤＭＴで保護される。次に、適当な溶
媒中、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドで処理して
２’位がｔ−ブチルジメチルシリル基で保護される。

【００５１】得られた５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−
３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−５−置換−２−チ
オウリジンは適当な溶媒に溶解し、メタンスルホニルク
ロリドで処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−
３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２’−メタンスル
ホニル−５−置換−２−チオウリジンが得られる。５’
−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチル−ジメチ
ルシリル−２’−メタンスルホニル−５−置換−２−チ
オウリジンを適当な溶媒中、ナトリウムメトキシドでさ
らに処理すると５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−
ｔ−ブチル−ジメチルシリル−２−２’−チオアンヒド
ロ−５−置換−２−チオウリジンが得られる。この化合
物をジオキサン中、ＨＦ／ピリジンでさらに処理すると
２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメチルシリル−
５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換−２−チオウ
リジンが得られる。

【００５２】２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメ
チルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換
−２−チオウリジンは標準的な方法および技術を用いて
アミダイトへ変換され１−（２−フルオロ−３−Ｏ−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホス
ファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリ
スロ−ペントフラノシル）−２−チオ−５−置換ウリジ
ンが得られる。ＤＭＴ／アミダイトはオリゴマー化合物
合成において単量体サブユニット前駆体として使用され
る。

【００５３】２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチル−ジメ
チルシリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−置換
−２−チオウリジンのシチジン類似体への変換は１，
２，４−トリアゾールを用いる１−（２−Ｏ−置換−５
−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル）−５−置換ウリジンのそのシチジン類似体への
変換のための上記の方法を用いて達成される。２−Ｓ化
合物の変換のためにはこの基はまた適当な保護基（例え
ば、トルオイル）を用いて保護されなければならない。

【００５４】”プロテインキナーゼＣのオリゴヌクレオ
チド調節”と題し、１９９５年７月９日に出願された米
国特許出願第０８／０８９，９９６号（代理人書類番号
ＩＳＩＳ−１１５４、本出願と共通して譲渡されてお
り、その開示は本明細書に援用される）において、ギャ
ップを持つオリゴヌクレオチド（Ｄｅａｎら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，２３，１６４１６を参照
されたい）が合成され、その効力を決定するためプロテ
インキナーゼＣで試験されている。良好な効力を持つオ
リゴヌクレオチドの一つの例は配列ＩＤ番号：２７であ
り、それは２０ｍｅｒデオキシホスホロチオエートであ
る。このオリゴヌクレオチドは上記のアッセイにおい
て、小さい方の転写体の約８０％の減少、および大きい
方の転写体の９０％以上の減少を与えた。

【００５５】本発明の一つの態様において、少なくとも
一つの構造Ｉの単量体ユニットを持つオリゴマー化合物
が合成され、ＰＫＣ−α蛋白質合成の阻害に使用され
た。配列ＩＤ番号：２７と類似の配列を持つ二つのオリ
ゴヌクレオチドが合成された：オリゴヌクレオチド配列
ＩＤ番号：２８、この配列は完全に修飾されたホスホロ
チオエートであり、１−６および１５−２０位に２’−
フルオロ、および２、３、５および１６−１８位のチミ
ンの代わりにウラシルを持つ；オリゴヌクレオチド配列
ＩＤ番号：２９、この配列は完全に修飾されたホスホロ
チオエートであり、２、３、５および１６−１８位のチ
ミンの代わりに２’−フルオロ−５−メチルウリジンを
持ち、さらに１、４、６、１５、１９および２０位に
２’−フルオロを持っている。これらの二つのオリゴヌ
クレオチド（配列ＩＤ番号：２８、配列ＩＤ番号：２
９）は上記のアッセイで評価され、その結果は配列ＩＤ
番号：２７の結果と比較された。

【００５６】配列ＩＤ番号：２８および配列ＩＤ番号：
２９は配列ＩＤ番号：２７と比較して約１０倍の効力の
増加を示した。配列ＩＤ番号：２９はまた配列ＩＤ番
号：２８と比較して測定できるほどの効力の増加を示し
た。上記の結果から期待されるようにこれら三つのオリ
ゴヌクレオチドのＴ_m は配列ＩＤ番号：２９＞配列ＩＤ
番号：２８＞配列ＩＤ番号：２７の順であった。

【００５７】

【表１】 配列ＩＤ番号： 配列 Tm ISIS# 27 GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA 52.1 ℃ 3521 28 GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA 64.9 ℃ 8469-2 29 GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA 69.0 ℃ 8469-3 本発明の一つの態様において、本発明のオリゴマー化合
物は式IVの複数の単量体サブユニットを有する。

【００５８】

【化１３】

【００５９】〔式中、置換基Ａ、Ｒ、Ｌ、Ｑ₁ 、Ｑ₂ お
よびＺ' は前に定義した通りである〕本発明の別の態様
において、構造Ｉ−IVの複数の単量体サブユニットを持
つ本発明のオリゴマー化合物は前もって決められた配列
を持っている。オリゴマー化合物の活性を増加させるた
め、本発明の単量体サブユニットは前もって決められた
配列のオリゴマー化合物中の前もって決められた場所に
位置することができる。

【００６０】本発明の一つの態様において、ヌクレオシ
ドダイマーが本発明の化合物内へ取り込まれる。本発明
の化合物内へ混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシド
を取り込むための一つの方法は、標準オリゴヌクレオチ
ド合成プロトコールを用い、オリゴマー化合物内へ前も
って決められた順番でヌクレオチド、ヌクレオシドダイ
マーおよび構造Ｉ〜IVの単量体サブユニットを取り込ま
せることである。本発明の一つの態様において、ヌクレ
オシド、オリゴヌクレオシドおよびヌクレオシドダイマ
ーは”ヒドラジンに基づいた、およびヒドロキシルアミ
ンに基づいたオリゴヌクレオシド結合およびその二方向
性合成法”と題して１９９３年１２月２８日に出願され
た米国特許出願第０８／１７４，３７９号（代理人書類
番号ＩＳＩＳ−０７１６としても同定される）；”主鎖
修飾オリゴヌクレオチド類似体および基結合によるその
製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国
特許出願第０８／０４０，９３３号（代理人書類番号Ｉ
ＳＩＳ−０７１７としても同定される）；および”主鎖
修飾オリゴヌクレオチド類似体および基結合によるその
製造”と題して１９９３年３月３１日に出願された米国
特許出願第０８／０４０，９０３号（代理人書類番号Ｉ
ＳＩＳ−０７１８としても同定される）（本出願と共通
して譲渡されており、その開示は本明細書において援用
される）の開示に従って製造される。

【００６１】本発明の目的のためのオリゴ−ヌクレオチ
ド／ヌクレオシドは、非リン酸結合により共有結合で結
合された少なくとも二つのヌクレオシドを持ち、前に定
義したような単量体サブユニットとのリン含有共有結合
を形成する混合主鎖オリゴマーである。オリゴ−ヌクレ
オチド／ヌクレオシドはリン含有およびリンを含まない
結合を通して結合された複数のヌクレオチドおよびヌク
レオシドを持つことができる。

【００６２】本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジン
ヌクレオシドの合成に有用である。２’−Ｏ−置換ピリ
ミジンヌクレオシドはオリゴヌクレオチドおよび関連化
合物の合成に日常的に使用される重要な化合物である。
市販品として入手可能な代表的な２’−Ｏ−置換ピリミ
ジンヌクレオシドには２’−Ｏ−メチルウリジンおよび
２’−Ｏ−メチルシチジンが挙げられる。本発明の目的
には、ピリミジンヌクレオシドはウリジンおよびシチジ
ンのような天然に存在するピリミジン塩基、ならびに２
Ｓ類似体および５−および６−置換ウリジンおよびシチ
ジンのような天然に存在しないピリミジンを含んでい
る。Ｎ３置換ピリミジン、および例えば４および／また
は５位に結合されたヘテロ環構造を持つピリミジンも含
まれる。本発明に利用できる多くの修飾ピリミジンが本
分野で知られている（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏ
ｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １ ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓ
ｓ， Ｎ．Ｙ．１９８８を参照されたい）。本明細書で
定義されるように、２Ｓピリミジン塩基とはその２位に
結合された硫黄を持つピリミジン塩基である。

【００６３】本発明に従う核酸塩基には、アデニン、グ
アニン、シトシン、ウリジンおよびチミンのようなプリ
ンおよびピリミジン、ならびにキサンチン、ヒポキサン
チン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの
６−メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンお
よびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘
導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラ
シル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシ
ル）、４−チオウラシル，８−ハロ、アミノ、チオー
ル、チオアルキル、ヒドロキシおよびその他の８−置換
アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよ
びその他の５−置換ウラシルおよびシトシン，７−メチ
ルグアニンのような他の合成および天然の核酸塩基が含
まれる。さらに別のプリンおよびピリミジンには米国特
許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｃｏ
ｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ，８５８〜８５９ページ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔ
ｚ，Ｊ．Ｉ．編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ，１９９０に記載されているもの、およびＥｎｇｌｉ
ｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ １９９１，
３０，６１３に記載されているものが含まれる。

【００６４】本明細書に定義されるように、２Ｓ，２’
−アンヒドロピリミジンヌクレオシドはピリミジン環の
２位とヌクレオシドの糖の２’−酸素を連結する単結合
を持つピリミジンヌクレオシドである。２Ｓ，２’−ア
ンヒドロピリミジンヌクレオシドは、本明細書で定義さ
れるようにピリミジン環の２位とヌクレオシドの糖の
２’位が間に入る硫黄原子により結合されているピリミ
ジンヌクレオシドである。いくつかの好適な態様におい
て、２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドま
たは２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは
一般式：

【００６５】

【化１４】

【００６６】［式中：Ｘ' はＯまたはＳであり；Ｒ² お
よびＲ³ は独立して水素またはヒドロキシル保護基であ
り；およびＲ⁵ およびＲ⁶ は独立してＨ、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒ
ドロカルビルまたは置換Ｃ₁ 〜Ｃ ₃₀ヒドロカルビルであ
る］を持っている。

【００６７】本発明の方法における使用に適した２Ｓ，
２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび２Ｓ，
２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドには無置換の
ものならびにピリミジン環に置換基を持つものが含まれ
る。種々のそのように置換されたピリミジン置換が本分
野で知られている（例えば、５位でのアルキル化）。例
えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， Ｖｏｌｕｍ
ｅ １、上記文献、を参照されたい。そのような置換
２，２’および２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌク
レオシドは天然に存在するヌクレオシドから製造でき、
２，２’または２Ｓ，２’結合形成の前または後に修飾
できる。従って、本発明の一つの態様では、２，２’ま
たは２Ｓ，２’結合形成の後で２，２’または２Ｓ，
２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドへ置換基が結
合され、本発明の別の態様では２，２’または２Ｓ，
２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシド形成に先立っ
てピリミジンヌクレオシドのピリミジン環へ置換基が結
合される。

【００６８】本発明の方法は２’−Ｏ−置換ピリミジン
の製造において著しい経済的利点を提供する。例えば、
修飾オリゴヌクレオチドおよび関連化合物の合成の重要
な中間体である化合物２’−Ｏ−メチルウリジンは、本
発明の方法を用いると市販品として入手可能なものの約
１０分の１の経費で製造できる。修飾オリゴヌクレオチ
ドおよび関連化合物の合成に有用な別の有用な中間体、
２’−Ｏ−メチルシチジンは、本発明の方法を用いると
市販品として入手可能なものの約５分の１の経費で製造
できる。これらの経費は大規模合成で以前に得られた収
率、出発材料の価格および必要とされる労働時間に基づ
いている。

【００６９】２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオ
シドはピリミジンヌクレオシドをＤＭＦまたは他の伝統
的な溶媒中で、炭酸ジフェニルおよび炭酸水素ナトリウ
ムで処理し、続いて精製することにより製造することが
できる。例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌｅｒｏｙ
Ｂ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８を参照さ
れたい。得られた２，２’−アンヒドロピリミジンヌク
レオシドは加熱しながら弱い求核試薬（例えば、アルコ
ール）およびルイス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）
で処理すると、対応する２’−Ｏ−置換ピリミジンヌク
レオシドが得られる。本発明の好適な態様において、２
Ｓ，２’または２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレ
オシドは弱い求核試薬の存在下、式Ｒ¹ −ＯＨのアルコ
ールで処理され、各々２’−Ｏ−Ｒ¹ −ピリミジンヌク
レオシドまたは２Ｓ類似体が得られる。本方法は２’−
Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドの小規模および大規模
合成の両方に使用できる。

【００７０】２Ｓ，２’−アンヒドロピリミジンヌクレ
オシドは例えば、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌｅｒｏｙ Ｂ．
（上記文献）の方法に従ってピリミジンヌクレオシドか
ら製造できる。Ｕｅｄａ，Ｔ．，Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，
Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｙｋｙｏ），
１９７０，１８，１４９もまた参照されたい。２Ｓ，
２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは次に本発明
の方法に従って弱い求核試薬（例えば、アルコール）お
よびルイス酸（例えば、ホウ酸トリアルキル）で処理で
き、対応する２’−Ｏ−置換 ２Ｓ−ピリミジンヌクレ
オシドが得られる。

【００７１】２’−Ｏ−置換ピリミジンおよび２’−Ｏ
−置換２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドは標準的方法およ
び技術に従って各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき、１
−［５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３
−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチ
ルホスファイト）］ピリミジンヌクレオシドまたは１−
［５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−Ｏ−置換−（３−
Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチル
ホスファイト）］−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドが得
られ、その各々はオリゴマー化合物合成において単量体
サブユニット前駆体として使用できる。

【００７２】特定の理論に縛られるのは望まないが、ア
ンヒドロピリミジンヌクレオシド環の開裂機構には弱い
求核試薬による２’−炭素への求核的攻撃が含まれてい
ると考えられる。求核攻撃は架橋酸素へのルイス酸の複
合体形成により容易になっていると考えられる。得られ
る複合体は２’−炭素を弱い求核試薬による求核的攻撃
に対して活性化していると考えられる。適用できるであ
ろう別の理論は、ルイス酸が５’および３’ヒドロキシ
ル基へ複合し、分子のコンホメーション変化を起こして
弱い求核試薬による攻撃を可能にして生成物を与えるこ
とである。本発明の一つの態様では、使用されるルイス
酸はホウ酸トリアルキルである。ホウ酸トリアルキルは
購入でき、またはホウ酸のアルキル基が求核試薬のアル
キル基と同一となるように製造できる。例えば、２’−
Ｏ−メチルウリジンが製造される場合、ホウ酸トリメチ
ルが好適なルイス酸であろうし、メタノールが好適な求
核試薬であろう。ホウ酸トリメチル、トリエチルおよび
トリプロピルはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎから市販品として入手可能である。

【００７３】もしくは、ホウ酸トリアルキルは前に示し
たように水素化ホウ素および２’位の所望の置換基に対
応するアルコールから製造できる。典型的には、水素化
ホウ素（ＴＨＦ中、１．０Ｍ溶液として利用可能であ
る）を各々のアルコールの３当量と反応させる。水素の
発生が完了したら、溶液を濃縮してＴＨＦを除去する。
得られた溶液は所望のアルコールに所望のホウ酸トリア
ルキルを含んでおり、前に説明したように本方法におい
てアンヒドロ環の開裂を達成するために使用できる。

【００７４】本発明の一つの態様において、ピリミジン
がウリジンまたは置換ウリジンである２’−Ｏ−置換ピ
リミジンヌクレオシドは、既知の方法および技術によ
り、例えば、１，２，４−トリアゾールを用いて対応す
るシチジン類似体へ変換（アミノ化）できる。典型的に
は、２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドは最初に例え
ば無水酢酸のような伝統的な保護基で３’−Ｏおよび
５’−Ｏ位が保護される。１，２，４−トリアゾールは
伝統的な溶媒（例えば、アセトニトリル）中、塩基（例
えば、トリエチルアミン）存在下でＰＯＣｌ₃ にて低温
で処理する。保護２’−Ｏ−置換ウリジンヌクレオシド
を伝統的な溶媒に溶解し、トリアゾール／ＰＯＣｌ₃ 含
有溶液へ加える。十分な時間が経過後、後処理し精製す
ると、トリアジン−１−（３，５−ジ−Ｏ−保護−２−
置換）ピリミジンヌクレオシドが得られる。この化合物
はアンモニアで処理することによりシチジン類似体へ変
換できる。環外アミノ基は、例えば、伝統的な溶媒（例
えば、ピリジン）中で無水安息香酸で処理することによ
り保護できる。

【００７５】本発明のさらに別の態様において、ピリミ
ジンがウリジンまたは置換ウリジンである２’−Ｏ−置
換−２Ｓ−ピリミジンヌクレオシドは既知の方法および
技術により、例えば、１，２，４−トリアゾールを用い
て対応するシチジン類似体へ変換できる。トリアゾール
での処理に先立って２Ｓ基が適当な保護基（例えば、ト
ルオイル）で保護されることを除いて前に示した方法に
従う。得られた２’−Ｏ−置換ウリジンおよび２’−Ｏ
−置換２Ｓ−ウリジンは標準的方法および技術に従って
各々ＤＭＴ／アミダイトへ変換でき４−Ｎ−保護−１−
（２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルア
ミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−ジメチ
キシトリチル）シチジンまたはその２Ｓ類似体が得られ
る。４−Ｎ−保護−１−（２−Ｏ−置換−（３−Ｏ−
Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノエチルホス
ファイト−５−Ｏ−ジメチキシトリチル）シチジンまた
はその２Ｓ類似体はオリゴマー化合物合成において単量
体サブユニット前駆体として使用できる。

【００７６】本発明の一つの態様において２’−Ｏ−置
換−５−置換ウリジン単量体サブユニットは、上記のよ
うに合成された５−置換ウリジンから出発して製造され
る。この化合物は適当な溶媒（例えば、メタノール）中
で酸化ジブチルスズで処理して、精製する。得られた１
−（２’，３’−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリス
ロ−ペントフラノシル）−５−置換ウリジンは適当な溶
媒中でハロアルキル、保護ハロアルキルアミノまたはハ
ロアルキルイミダゾ化合物（例えば、ヨードプロパン）
で処理すると各々２’−Ｏ−置換体が得られる。アラル
キルおよびアリール基もまたアルキル基の代わりに使用
できる。

【００７７】種々の置換を持つピリミジン（即ち、置換
基を持つピリミジン）が本分野で知られている。本発明
の方法で使用できるそのような置換基の代表的なものに
は、アルキルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置
換アルケニル、アルキニルまたは置換アルキニル、炭素
環式アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラルキ
ル、アリール、アラルキルまたは置換アラルキルのよう
なヒドロカルビル基が含まれる。好適には、アルキル、
アルケニルおよびアルキニル置換基は１から３０の炭素
を持っており、１から約１０の炭素が特に好適である。
好適には、アリール基は６から約１４の炭素を持ち、ア
ラルキル基は７から約３０の炭素を持っている。上に掲
げた置換基はそれら自身アルコキシ、アルコール、ベン
ジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、
ハロゲン、またはアルキル、アリール、アルケニルまた
はアルキニル基およびエーテルのような置換基を持つこ
とができる。

【００７８】ウラシルのＣ−５でのアルキル、アルケニ
ルおよびアルキニル基の置換は１９９２年１１月２４日
に出願されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／１０１１５
に報告されており、アルキル置換の例はさらにＭａｎｏ
ｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋ
ｅ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３に記載されてい
る。さらに別の置換はＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｌ．Ｂ，（同
上）により報告されている。

【００７９】本発明の方法において、２Ｓ，２’または
２，２’−アンヒドロピリミジンヌクレオシドは式Ｒ¹
−ＯＨのアルコールで処理される。代表的なＲ¹ 基には
アルキルまたは置換アルキル、アルケニルまたは置換ア
ルケニル、アルキニルまたは置換アルキニル、炭素環式
アルキル、炭素環式アルケニル、炭素環式アラルキル、
アリール、アラルキルまたは置換アラルキルが含まれ
る。好適には、アルキル、アルケニルおよびアルキニル
Ｒ基は１から３０の炭素を持っており、１から約１０の
炭素が特に好適である。好適には、アリール基は６から
約１４の炭素を持ち、アラルキル基は７から約３０の炭
素を持っている。上に掲げたＲ¹ 基はそれら自身アルコ
キシ、アルコール、アミノ、ベンジル、フェニル、ニト
ロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、ヒドロキ
シ、エーテル、またはさらにアルキル、アリール、アル
ケニルまたはアルキニル基のような置換基を持つことが
できる。

【００８０】本発明の方法に従って製造された２’−Ｏ
−置換ピリミジンヌクレオシドおよび２’−Ｏ−置換２
Ｓ−ピリミジンヌクレオシド（置換ピリミジンヌクレオ
シド）は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、
混合オリゴ−ヌクレオチド／ヌクレオシドおよび本分野
で知られている関連化合物を含む種々の化合物の製造に
使用できる。本発明の文脈において、用語”オリゴヌク
レオチド”とは二つまたはそれ以上のヌクレオチドサブ
ユニットを含むオリゴマーまたはポリマーを含む。本明
細書において使用される場合、ヌクレオチドとは天然に
存在する糖、核酸および糖間（主鎖）結合ならびに同様
に機能する天然には存在しない部分を含んでいてもよ
い。例えば、促進された細胞取り込みおよびヌクレアー
ゼ存在下での増加した安定性のような特性のため、その
ような化学的に修飾されたまたは置換されたオリゴヌク
レオチドは天然の形よりもしばしば好適である。

【００８１】本発明のために意図されるいくつかの好適
なオリゴヌクレオチドの特定の例には、ホスホジエステ
ル糖間結合（主鎖）に加えて、ホスホロチオエート、ホ
スホトリエステル、メチルホスホネート、鎖アルキルま
たはシクロアルキル糖間結合または短鎖ヘテロ原子また
はヘテロ環式糖間結合のような修飾糖間結合が含まれ
る。

【００８２】本明細書で使用される場合、用語オリゴヌ
クレオシドは非リン結合残基を持つ二つまたはそれ以上
のヌクレオシドサブユニットを含むオリゴマーまたはポ
リマーを含む。本発明に従ったオリゴヌクレオシドはグ
リコシル結合を通して核酸塩基に結合されたリボフラノ
ース残基を持っている。本発明の目的のためのオリゴ−
ヌクレオチド／ヌクレオシドは、非リン酸結合により共
有結合で結合された少なくとも二つのヌクレオシドおよ
びヌクレオチドとの少なくとも一つのリン含有共有結合
を持ち、ここで単量体ヌクレオチドまたはヌクレオシド
ユニットの少なくとも一つは本発明の方法を用いて製造
された２’−Ｏ−置換化合物である。オリゴ−ヌクレオ
チド／ヌクレオシドはさらにリン含有および／または非
リン含有結合を通して結合された複数のヌクレオチドお
よびヌクレオシドを持つことができる。

【００８３】本発明の方法を用いて製造される２’−Ｏ
−置換化合物を結合する方法には、ホスホロアミダイト
への変換、続いての液相または固相化学が含まれる。代
表的な液相技術は１９９３年５月１１日に公開され、本
発明と共通して譲渡されている米国特許第５，２１０，
２６４号に記載されている。代表的な固相合成は標準ホ
スホロアミダイト化学を利用するＤＮＡおよびＲＮＡ合
成に典型的に用いられている技術である。（例えば、Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ，
Ｓ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ
Ｊ，１９９３を参照されたい。）好適な合成的固相合成
は活性化リン酸としてホスホロアミダイトを利用する。
ホスホロアミダイトはＰ^III 化学を利用する。中間体ホ
スファイト化合物は続いて既知の方法を用いてＰ^V 状態
へ酸化される。これは、選択された酸化条件に依存して
ホスホジエステルまたはホスホロチオエートリン酸結合
を含む結合の合成を可能とする。他のリン酸結合もまた
発生させることができる。適した結合の代表的な例に
は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ハイドロ
ジェンホスホネート、アルキルホスホネート、アルキル
ホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホ
スホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロア
ミデート、ケトン、スルフォン、カルボネート、チオア
ミデートおよび本分野で知られているその他のそのよう
な残基が含まれる。アルキルホスホノチオエート結合は
ＷＯ ９４／０２４９９に開示されている。

【００８４】オリゴヌクレオチド合成の結合効率を増加
させるために使用される標準的方法および技術には３’
および／または５’官能基の活性化が含まれる。いくつ
かの一般的に活性化される基はリン酸および亜リン酸基
であり、それらは対応する活性化リン酸および活性化亜
リン酸基を与える（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｇａｉｔ Ｍ．
Ｊ．，Ｅｄｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ；ＩＬ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９０，第３章，ｐ．
９８を参照されたい）。多くの他の基が知られており、
本発明で使用できる。

【００８５】本明細書の目的のためには、アルキル基に
は置換および無置換直鎖、分岐鎖および脂環式炭化水
素、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン
チル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシ
ル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシ
ル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オク
タデシル、ノナデシル、エイコシルおよびその他のより
高級な炭素アルキル基が含まれるが、それらに制限され
るわけではない。さらなる例としては２−メチルプロピ
ル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチル
プロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシ
ル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブ
チルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチ
ル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシルおよびそ
の他の分岐鎖基が含まれる。

【００８６】本発明に有用なアルケニル基には、ビニ
ル、アリルおよびクロチルのような、一つまたはそれ以
上の炭素−炭素二重結合を含む上記のアルキル基から誘
導される残基が含まれるが、それらに制限されるわけで
はない。本発明に有用なアルキニル基には、プロパルギ
ルのような、一つまたはそれ以上の炭素−炭素三重結合
を含む上記のアルキル基から誘導される残基が含まれる
が、それらに制限されるわけではない。用語アリールと
は例えば、フェニル、ナフチル、キシリル、ピロールお
よびフリル基を含む単環式および多環式芳香族基を示す
ことを企図している。アリール基は少ない場合は３つの
炭素原子を含むことができるが（例えば、イミダゾ
基）、好適なアリール基は６から約１４の炭素原子、よ
り好適には６から約１０炭素原子を持っている。

【００８７】用語アラルキルはアルキルおよびアリール
部分の両方を含む基を示すことを企図しており、ここで
そのような基の結合点はそのアルキル部分を通してい
る。ベンジル基はアラルキル基の一つの例である。多く
の置換基が本発明の化合物内へ保護された（ブロックさ
れた）形で導入でき、続いて脱保護されて最終的な所望
の化合物が形成される。置換基にはピリミジン環および
上記のアルコールＲ¹ −ＯＨのＲ¹ 基へ共有結合で結合
された基が含まれる。一般に、保護基は特定の反応条件
に対して化学官能性を不活性にし、実質的に分子の残り
の部分に障害を与えることなく分子のそのような官能性
に付加し、およびそれから除去することができる。例え
ば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖ
ｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈ
ｅｓｉｓ，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい。例え
ば、アミノ基はフタルイミド基または９−フルオレニル
メトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として保護でき、カ
ルボキシル基はフルオレニルメチル基として保護でき
る。代表的なヒドロキシル保護基はＢｅａｕｃａｇｅ
ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２，４８，２２２
３により記載されている。好適なヒドロキシル保護基は
トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル
およびトリメチルトリチルのように酸に不安定である。

【００８８】本発明に従った固相支持体には、調節細孔
ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル調節細孔ガラス（例え
ば、Ａｌｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ １９９１，１９，１５２７を参照された
い）、ＴｅｎｔａＧｅｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ−アミノポリ
エチレングリコール誘導化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈ
ｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９
９３，３４，３３７３を参照されたい）またはＰｏｒｏ
ｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体が含ま
れる。多くの他の固相支持体が市販品として入手可能で
あり、本発明に使用できる。

【００８９】本発明の文脈における活性化固相支持体と
は、得られる活性化固相支持体が本発明の単量体サブユ
ニットまたはヌクレオシドダイマーとの反応に対して化
学的に活性であるように、官能基で誘導化されているか
または反応性残基で処理されている固相支持体である。
いくつかの好適な態様において、本発明の方法は２’−
Ｏ−置換−５−ハロピリミジンヌクレオシドの製造に使
用される。２’−Ｏ−置換−５−ハロウリジンはＡｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから入手
可能な５−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉウラシルから
製造することができる。２’−Ｏ−置換−５−ハロウリ
ジンは以下のようにシチジン類似体へ変換できる。

【００９０】本発明の方法において、アルコール、ルイ
ス酸およびアンヒドロピリミジンヌクレオシドは反応容
器中で処理される。反応容器は反応に適している本分野
で既知の任意の容器であり、その中で反応物は加熱され
る。好適には、反応容器は圧力密封容器であり、より好
適には高圧容器である。好適な態様において、アルコー
ル、ルイス酸およびアンヒドロピリミジンヌクレオシド
はジオキサンのような適した溶媒中で約１２０℃から約
２００℃で加熱することにより処理される。特に好適な
態様において、アルコール、ルイス酸およびアンヒドロ
ピリミジンヌクレオシドおよび溶媒は圧力密封容器中で
加熱される。高圧容器が特に好適である。

【００９１】本明細書で使用される場合、用語ルイス酸
とは分子またはイオンとしてのその通常の意味を持って
おり、それは第二の分子またはイオンからの二つの電子
と共有結合を形成することにより別の分子またはイオン
と結合できる。本発明の方法での使用において、ルイス
酸は一対の電子を受け取ることができる電子欠乏種であ
ると考えられる。特に好適なものは二価および三価の硬
酸である。より好適なものはマグネシウム、カルシウ
ム、アルミニウム、亜鉛、クロム、銅、ホウ素、スズ、
水銀、鉄、マンガン、カドミウム、ガリウムおよびバリ
ウムを含む二価および三価の金属の二価および三価陽イ
オンおよびその錯体である。それらの錯体にはヒドロキ
シド、アルキル、アルコキシド、ジおよびトリハライド
（特にトリクロリドおよびトリフルオリド）およびアセ
テートのような有機酸リガンドが含まれるであろうが、
それらに制限されるわけではない。本方法で有用な特に
好適であるルイス酸の例はホウ酸エステル、特にホウ酸
アルキルである。２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオ
チドを含むオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を阻害す
るその能力、ならびに相補的ＲＮＡへのそのハイブリダ
イゼーション親和性を算定するための研究で評価され
た。２’−デオキシギャップを含む２’−修飾オリゴヌ
クレオチドおよび均一に修飾された２’−修飾オリゴヌ
クレオチドを用いたそのような研究の一つ（Ｍｏｎｉ
ａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９
３，２６８，１４５１４〜１４５２２参照）は、２’−
修飾オリゴヌクレオチドは対応する非修飾２’−デオキ
シオリゴヌクレオチドよりも相補的ＲＮＡに対する高い
親和性を持つことを示している。２’−デオキシギャッ
プを含む２’−修飾オリゴヌクレオチドもまた細胞中の
Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子の発現に対する活性を示した。

【００９２】均一に修飾された２’−Ｏ−置換オリゴリ
ボヌクレオチドを含む別の研究において、ヌクレアーゼ
安定性および融解温度（Ｔ_m ）が２’−フルオロ、２’
−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペ
ンチルヌクレオチドを含む完全修飾オリゴリボヌクレオ
チド配列について比較された。２’−Ｏ−ペンチルを除
いて修飾は相補的ＲＮＡと形成されたデュープレックス
のＴ_m を増加させることが観察された。修飾ホモデュー
プレックスは以下のＴ_m 順で著しく高いＴ_m を示した：
２’−フルオロ：２’−フルオロ＞ ２’−Ｏ−プロピ
ル：２’−Ｏ−プロピル＞２’−Ｏ−メチル：２’−Ｏ
−メチル＞ＲＮＡ：ＲＮＡ＞ＤＮＡ：ＤＮＡ。２’−修
飾オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性は蛇毒
ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）およびヌクレアーゼ
Ｓ１を用いて試験された。２’−修飾により与えられる
安定性が修飾の大きさに相関して観察された。二次構造
を形成する能力を持つオリゴリボヌクレオチドにおいて
はヌクレアーゼ安定性のレベルが追加されたが、それは
２’修飾オリゴリボヌクレオチドのみであり、２’−デ
オキシオリゴリボヌクレオチドでは観察されなかった。
本発明の他の目的、利点および新規な特色は以下に提供
される実施例を調べることにより当業者には明らかにな
るであろう。

【００９３】

【実施例】実施例１ ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノ
シル）−５−メチルウリジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ，
Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎを通して市販品として入手可
能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェニルカー
ボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸
水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をジメ
チルホルムアミド（３００ｍＬ）に加えた。混合物は攪
拌しながら加熱還流し、二酸化炭素ガスの発生が制御さ
れた様式で行った。一時間後、わずかに色が濃くなった
溶液は減圧下で濃縮した。得られたシロップは攪拌した
ジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。エーテルはデ
カントし、残渣は最少量のメタノール（約４００ｍＬ）
に溶解した。この溶液を上記のように新しいエーテル
（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得られた。エーテ
ルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で乾燥すると
（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固形物が得られ、そ
れを粉砕するとうすい黄褐色の粉末（５７ｇ，８５％の
粗収率）が得られた。ＮＭＲは構造と、フェノールおよ
びそのナトリウム塩の混入（約５％）に一致した。この
物質は環開裂にそのまま使用された。この物質は酢酸エ
チル中、メタノールの濃度勾配（１０〜２５％）を用い
るカラムクロマトグラフィーによりさらに精製でき、白
色固形物が得られた、ｍｐ２２２〜４℃。

【００９４】実施例２ １−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラ
ノシル）−５−メチルウリジン ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノ
シル）−５−メチルウリジン］（７１ｇ，０．３２ｍｍ
ｏｌ）およびジオキサン（７００ｍＬ）を２リットルの
ステンレス鋼高圧容器に入れ、ＨＦ／ピリジン（１００
ｇ，７０％）を加えた。混合物を１２時間、１２０〜１
２５℃で加熱し、その後氷浴で冷却した。高圧容器を開
け、混合物を３リットルの氷に注いだ。この混合物に注
意深く炭酸水素ナトリウム（３００ｇ）および飽和炭酸
水素ナトリウム溶液（４００ｍＬ）を加えた。混合物を
濾過し、フィルターケーキを水（２ｘ１００ｍＬ）およ
びメタノール（２ｘ５００ｍＬ）で洗浄した。水および
メタノール洗液は真空下濃縮して乾固させた。メタノー
ル（２００ｍＬ）および粗シリカゲル（８０ｇ）を残渣
に加え、混合物を真空下蒸発乾固させた。得られた物質
はシリカゲル上に濃縮し、酢酸エチルおよびメタノール
の濃度勾配（１００：０から８５：１５）を用いるシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成
物分画をプールし濃縮すると３６．９ｇ（５１％，２工
程収率）の表記化合物を得た。

【００９５】またこの反応から１−（２−フェニル−β
−Ｄ−エリスロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウ
リジン（１０．３ｇ）も単離された。この物質は高圧容
器反応が不純な物質を用いて実施された場合、フェノー
ルおよび上記無水反応からのナトリウム塩から形成され
る。無水物が精製されている場合この生成物は形成され
ない。形成された１−（２−フェニル−β−Ｄ−エリス
ロ−ペントロフラノシル）−５−メチルウリジンは２’
−フルオロ体と同じ反応条件を用いてそのＤＭＴ／ホス
ホロアミダイトへ変換された。

【００９６】実施例３ １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリ
ジン １−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントロフラ
ノシル）−５−メチルウリジン（３１．１５ｇ，０．１
２ｍｏｌ）をピリジン（１５０ｍＬ）に懸濁し、ジメト
キシトリチルクロリド（４４．６２ｇ，０．１２ｍｏ
ｌ）を加えた。この混合物は密閉されたフラスコ内で２
時間攪拌し、メタノール（３０ｍＬ）を加えた。混合物
は真空下濃縮し、生じた残渣は飽和炭酸水素ナトリウム
溶液（５００ｍＬ）と酢酸エチル（３ｘ５００ｍＬ）に
分配した。酢酸エチル分画をプールし、硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、濾過して真空下で濃縮すると粘張な油状物
が得られた。油状物はジクロロメタン（１００ｍＬ）に
溶解し、シリカゲルカラムにのせ酢酸エチル：ヘキサ
ン：トリエチルアミン（６０／３９／１から７５／２４
／１２まで増加する）で溶出する。生成物分画をプール
し真空下で濃縮すると５９．９ｇ（８９％）の表記化合
物があわ状物として得られた。

【００９７】実施例４ １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−３
−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソピルアミノ−２−シアノエチルホ
スファイト−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−
５−メチルウリジン １−（５−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−フルオロ−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリ
ジン（５９．８ｇ， ０．１０６ ｍｏｌ）をジクロロ
メタンに溶解し２−シアノエチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（４６．９
ｍＬ，０．１４８ｍｏｌ）およびジイソプロピルアミン
テトラゾリド（５．４６ｇ，０．３当量）を加えた。混
合物は１６時間攪拌した。混合物を飽和炭酸水素ナトリ
ウム溶液（１Ｌ）で洗浄し、炭酸水素溶液はジクロロメ
タン（５００ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層は食
塩水（１Ｌ）で洗浄し、食塩水はジクロロメタン（１０
０ｍＬ）で逆抽出した。合併した有機層を硫酸ナトリウ
ムで乾燥し濾過後、約２００ｍＬの容量まで濃縮した。
得られた物質はヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミ
ン（６０／４０／１）を用いた。シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。生成物分画を真空下濃
縮し、アセトニトリル（５００ｍＬ）に溶解し、濾過後
真空下で濃縮して乾燥するとあわ状物が得られた。あわ
状物を砕き２４時時間乾燥させると一定の重さになり６
８．２ｇ（８４％）の表記化合物が得られた。¹ Ｈ Ｎ
ＭＲ：（ＣＤＣｌ₃ ）δ ０．９〜１．４（ｍ，１４
Ｈ，４ｘＣＨ₃ ，２ｘＣＨ），２．３〜２．４（ｔ，１
Ｈ，ＣＨ₂ ＣＮ），２．６〜２．７（ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂
ＣＮ），３．３〜３．８（ｍ，１３Ｈ，２ｘＣＨ₃ ＯＡ
ｒ，５’ＣＨ₂ ，ＣＨ₂ ＯＰ，Ｃ−５ ＣＨ₃ ），４．
２〜４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３５〜５．０
（ｍ，１Ｈ，３’），４．９〜５．２（ｍ，１Ｈ，
２’），６．０〜６．１（ｄｄ，１Ｈ，１’），６．８
〜７．４（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ），７．５〜７．６
（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．８（ｂｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）；１５１．４６８，１５
１．６０９，１５１．７９０，１５１．９０４。

【００９８】実施例５ １−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−
β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウ
リジン 実施例２の方法に従って製造された１−（２−フルオロ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
ウリジン（２２．４ｇ，９２ ｍｍｏｌ，８５％純度）
をピリジン（２ｘ１５０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン
（２５０ｍＬ）に溶解した。無水酢酸（５５ｍＬ，．５
８ｍｏｌ）を加え混合物は１６時間攪拌した。メタノー
ル（５０ｍＬ）を加え攪拌を３０分間継続した。混合物
を蒸発させるとシロップ状物が得られた。シロップ状物
を最少量のメタノールに溶解し、シリカゲルカラムに加
えた。生成物分画を溶出するためにヘキサン／酢酸エチ
ル（１：１）が用いられた。精製により１９．０ｇ（７
４％）の表記化合物が得られた。

【００９９】実施例６ ４−トリアジン−１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル
−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシ
ル）−５−メチルウリジン １，２，４−トリアゾール（１０６ｇ，１．５３ｍｏ
ｌ）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）に溶解し続いてト
リエチルアミン（２５７ｍＬ，１．８４ｍｏｌ）を加え
た。混合物は氷浴を用いて０から１０℃の間に冷却し
た。ＰＯＣｌ₃ （３４．５ｍＬ，．３７５ｍｏｌ）を滴
加ロートを通してゆっくりと加え、混合物はさらに４５
分間攪拌した。別のフラスコには１−（３’，５’−ジ
−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペ
ントフラノシル）−５−メチルウリジン（５６．９ｇ，
．１４４ ｍｏｌ）をアセトニトリル（１５０ｍＬ）
に溶解した。１−（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２
−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−
５−メチルウリジンを含む溶液をカニューレを通してト
リアゾール溶液にゆっくりと加えた。氷浴を除き、反応
混合物を１時間放置して室温まで暖めた。アセトニトリ
ルを真空下除去し、残渣を飽和炭酸水素ナトリウム溶液
（４００ｍＬ）およびジクロロメタン（４ｘ４００ｍ
Ｌ）に分配した。有機層を合併し真空下濃縮した。得ら
れた残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）に溶解すると固形
物の沈殿が始まった。ヘキサン（３００ｍＬ）を加える
と更に固形物が沈殿した。固形物を濾過して集め、ヘキ
サン（２ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させる
と６３．５ｇの生成物が得られ、それは更に精製するこ
となくそのまま使用された。

【０１００】実施例７ ５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−
ペントフラノシル）−シトシン ステンレス鋼高圧容器中、４−トリアジン−１−
（３’，５’−ジ−Ｏ−アセチル−２−フルオロ−β−
Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−チミン（７５．５
ｇ，．１９８ｍｏｌ）をアンモニア（４００ｍＬ）に溶
解し、一夜密封した。高圧容器を冷却し、開放してアン
モニアを蒸発させた。フラスコへ物質を移すためにメタ
ノールを加え、約１０容量のエチルエーテルを加えた。
混合物は１０間攪拌した後濾過した。固形物をエチルエ
ーテルで洗浄し、乾燥すると５１．７ｇ（８６％）の表
記化合物を得た。

【０１０１】実施例８ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン ５−メチル−１−（２−フルオロ−β−Ｄ−エリスロ−
ペントフラノシル）−シトシン（５４．６ｇ，０．２１
ｍｏｌ）をピリジン（７００ｍＬ）に懸濁し、無水安息
香酸（７０ｇ，．３０９ｍｏｌ）を加えた。混合物は４
８時間室温で攪拌した。ピリジンを蒸発させて除去し、
メタノール（８００ｍＬ）を加え混合物を攪拌した。形
成された沈殿を濾過し、メタノール（４ｘ５０ｍＬ）お
よびエーテル（３ｘ１００ｍＬ）で洗浄し、真空オーブ
ン中４５℃で乾燥させると４０．５ｇの表記化合物が得
られた。濾液は真空下で濃縮し、高圧容器中室温で一夜
飽和メタノール性アンモニアで処理した。混合物を真空
下で濃縮し、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより精製した。回収された出発物質は上
記のように再び処理するとさらに４．９ｇの表記化合物
が得られ、合計で４５．４ｇ（６１％）の表記化合物が
得られた。

【０１０２】実施例９ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ
−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ
ントフラノシル）−シトシン ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン
（４５．３ｇ，．１２４ｍｏｌ）を２５０ｍＬの乾燥ピ
リジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド（４６．
４ｇ，．１３７ｍｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で
９０分間攪拌し、メタノール（２０ｍＬ）を加えた。混
合物は真空下で濃縮し、酢酸エチル（２ｘ１Ｌ）および
飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）に分配した。酢酸
エチル層を合併し、硫酸マグネシウムで乾燥して真空下
蒸発させた。得られた油状物はジクロロメタン（２００
ｍＬ）に溶解し、酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルア
ミン（５０：５０：１）を用いるシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製した。生成物分画をプール
し、真空濃縮して乾燥させると６３．６ｇ（７６．６
％）の表記化合物が得られた。

【０１０３】実施例１０ ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ
−３−Ｏ−Ｎ, Ｎ−ジイソプロピルアミノ−２−シアノ
エチルホスファイト−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−シトシン ４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−１−（２−フルオロ
−５−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペ
ントフラノシル）−シトシン（６１．８ｇ，９２．８ｍ
ｍｏｌ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）、２−シアノ
エチル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホス
ホロジアミダイト（４０．９ｍＬ，．１３０ｍｏｌ）お
よびジイソプロピルアミン テトラゾリド（４．７６
ｇ，０．３当量）と室温で１７時間攪拌した。混合物を
飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１Ｌ）で洗浄し、炭酸水
素ナトリウム溶液はジクロロメタン（５００ｍＬ）で逆
抽出した。合併した有機層は食塩水（１Ｌ）で洗浄し、
食塩水はジクロロメタン（１００ｍＬ）で逆抽出した。
合併した有機層は硫酸ナトリウムで乾燥し濾過後約２０
０ｍＬの容量まで濃縮した。得られた物質はヘキサン／
酢酸エチル／トリエチルアミン（６０／４０／１）を用
いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し
た。生成物分画を真空下で濃縮し、アセトニトリル（５
００ｍＬ）に溶解し濾過して真空下で濃縮して乾燥させ
るとあわ状物が得られた。あわ状物を砕き一定の重量と
なるまで２４時間乾燥させると７２．４ｇ（９０％）の
表記化合物が得られた。¹ Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ₃ ）
δ １．１７〜１．３（ｍ，１２Ｈ，４ｘＣＨ₃ ），
１．５〜１．６（ｍ，２Ｈ，２ｘＣＨ），２．３〜２．
４（ｔ，１Ｈ，ＣＨ₂ ＣＮ），２．６〜２．７（ｔ，１
Ｈ，ＣＨ₂ ＣＮ），３．３〜３．９（ｍ，１３Ｈ，２ｘ
ＣＨ₃ ＯＡｒ，５’ＣＨ₂ ，ＣＨ₂ ＯＰ，Ｃ−５ ＣＨ
₃ ），４．２〜４．３（ｍ，１Ｈ，４’），４．３〜
４．７（ｍ，１Ｈ，３’），５．０〜５．２（ｍ，１
Ｈ，２’），６．０〜６．２（ｄｄ，１Ｈ，１’），
６．８〜６．９（ｍ，４Ｈ，ＤＭＴ），７．２〜７．６
（ｍ，１３Ｈ，ＤＭＴ，Ｂｚ），７．８２〜７．８６
（ｄ，１Ｈ，Ｃ−６），８．２〜８．３（ｄ，２Ｈ，Ｂ
ｚ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃ ）；ｂｓ，１５１．７
０６；ｂｓ，１５１．９４１。

【０１０４】実施例１１ １−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン ５−メチルウリジン（７．８ｇ，３０．２ｍｍｏｌ）お
よび酸化ジブチルスズ（７．７ｇ，３０．９ｍｍｏｌ）
をメタノール（１５０ｍＬ）に懸濁し、１６時間加熱還
流した。反応混合物を室温まで冷却して濾過し、固形物
をメタノール（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄した。得られた
固形物を乾燥させると１２．２ｇ（８０．３％）の表記
化合物が得られた。この物質は続いての反応に更に精製
することなく使用された。ＮＭＲは構造と一致した。

【０１０５】実施例１２ １−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフ
ラノシル）−５−メチルウリジン １−（２，３−ジ−Ｏ−ブチルスズ−β−Ｄ−エリスロ
−ペントフラノシル）−５−メチルウリジン（５．０
ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）およびヨードプロパン（１４．
７ｇ，７２．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中、１００℃で２日
攪拌した。反応混合物を室温まで冷却し、濾過後濃縮し
た。残っているＤＭＦはアセトニトリルと共蒸留した。
残渣を乾燥させると２．４０ｇ（７８％）の表記化合物
および３’−Ｏ−プロピル異性体が粗混合物として得ら
れた。この物質は更に精製することなく続いての反応に
使用された。

【０１０６】実施例１３ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
ウリジン 粗混合物としての１−（２−Ｏ−プロピル−β−Ｄ−エ
リスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリジンおよ
び３’−Ｏ−プロピル異性体（２．４ｇ，８．４ｍｍｏ
ｌ）をピリジン（２ｘ４０ｍＬ）と共蒸留し、ピリジン
（６０ｍＬ）に溶解した。溶液はアルゴン下、１５分間
室温で攪拌し、ジメトキシトリチルクロリロ（４．２７
ｇ，１２．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を周期的にｔ
ｌｃで検査し、３時間で反応が完了した。メタノール
（１０ｍＬ）を加え、混合物を１０分間攪拌した。反応
混合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は１％トリエチ
ルアミンを含むヘキサン／酢酸エチル（６０：４０）を
用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製
した。適切な分画を集めて濃縮すると１．３２ｇ（２６
％）の表記化合物が得られた。

【０１０７】実施例１４ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ, Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−
ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ
シル）−５−メチルウリジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
ウリジン（５０．０ｇ，８６ｍｍｏｌ）、２−シアノエ
チル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホ
ロジアミダイト（３８ｍＬ，８６ｍｍｏｌ）およびジイ
ソプロピルアミンテトラゾリド（４．４５ｇ，２５．８
ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５００ｍＬ）に溶解し、
室温で４０時間攪拌した。反応混合物を飽和炭酸水素ナ
トリウム溶液（２ｘ４００ｍＬ）および食塩水（１ｘ４
００ｍＬ）で洗浄した。水溶液層はジクロロメタンで逆
抽出した。ジクロロメタン層を合併し、硫酸ナトリウム
で乾燥し濾過後、真空下濃縮した。得られた残渣は酢酸
エチル／ヘキサン（４０：６０）および１％トリエチル
アミンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
より精製した。適切な分画を集めて濃縮し、高真空下で
乾燥すると４３ｇ（６７％）の生成物が得られた。

【０１０８】実施例１５ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−
ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ
シル）−５−メチルウリジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−ジメトキシトリチル−β
−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチルウリ
ジン（１０．０ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）をピリジン（５
０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（４．７ ｍｌ，５２．７
ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は１８時間攪拌し、過
剰の無水酢酸はメタノール（１０ｍＬ）で中和した。混
合物は真空下で濃縮し、得られた残渣は酢酸エチル（１
５０ｍＬ）に溶解した。酢酸エチルは飽和ＮａＨＣＯ₃
（１５０ｍＬ）で洗浄し、飽和ＮａＨＣＯ₃ は酢酸エチ
ル（５０ｍＬ）で逆抽出した。酢酸エチル層を合併し、
真空下で濃縮すると１１．３ｇの白色あわ状物が得られ
た。粗収率は１００％以上であり、ＮＭＲは表記化合物
の構造から予期されるものと一致した。この物質は更に
精製されることなく続いての反応に使用された。

【０１０９】実施例１６ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−
ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ
シル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン トリアゾール（１０．５ｇ，１５２ｍｍｏｌ）をアセト
ニトリル（１２０ｍｌ）およびトリエチルアミン（２３
ｍＬ）に溶解し、無水条件下で攪拌した。得られた溶液
をドライアイスアセトン浴で冷却し、５分以上かけてオ
キシ塩化リン（３．９ｍＬ，４１ｍｍｏｌ）を徐々に加
えた。混合物を更に１０分攪拌すると、生成物形成の指
標となる薄いスラリー状となった。１−（２−Ｏ−プロ
ピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
ウリジン（１１．２ｇ，１６５ｍｍｏｌ）をアセトニト
リル１５０ｍＬに溶解し、ドライアイスアセトン浴の温
度を保ちながら上記スラリーへ加えた。反応混合物を３
０分攪拌し次に放置して室温まで温め、更に２時間攪拌
した。混合物はフリーザー中、０℃で１８時間放置した
後取り出し室温まで温めた。混合物の酢酸エチル／ヘキ
サン（１：１）でのｔｌｃは出発物質の完全な変換を示
した。反応混合物は真空下で濃縮し酢酸エチル（３００
ｍＬ）に再溶解しし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２
ｘ４００ｍＬ）および食塩水（４００ｍＬ）で抽出し
た。水溶液層は酢酸エチル（２００ｍＬ）で逆抽出し
た。酢酸エチル層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥し真
空下で濃縮した。粗収率は１１．３ｇ（９５％）であっ
た。ＮＭＲは表記化合物の構造から予期されるものと一
致した。この物質は更に精製されることなく続いての反
応に使用された。

【０１１０】実施例１７ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
シチジン １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−アセチル−５−Ｏ−
ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ
シル）−４−トリアゾロ−５−メチルピリミジン（１
１．２ｇ，１６．１ｍｍｏｌ）をドライアイスアセトン
温度で１００ｍＬの高圧容器中で液体アンモニア（５０
ｍＬ）に溶解した。高圧容器は放置して室温まで温め、
１８時間後ドライアイスアセトン温度まで再冷却した。
高圧容器内容物をビーカーに移し、メタノール（５０ｍ
Ｌ）を加えた。混合物は放置してほとんど乾固するまで
蒸発させた。酢酸エチル（３００ｍＬ）を加え、飽和炭
酸水素ナトリウム溶液（２ｘ２５０ｍＬ）での洗浄に先
立ち固形物を濾過して除いた。酢酸エチル層は硫酸ナト
リウムで乾燥させ、濾過して先ほど濾過して除いた固形
物と合わせ、真空下濃縮すると１０．１ｇの物質が得ら
れた。粗収率は１００％以上であり、ＮＭＲは表記化合
物の構造から予期されるものと一致した。この物質は更
に精製されることなく続いての反応に使用された。

【０１１１】実施例１８ １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベ
ンゾイル−５−メチルシチジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチル
シチジン（７．２８ｇ，１０．１ｍｍｏｌ）および無水
安息香酸（４．５ｇ，２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６０ｍ
Ｌ）に溶解し室温で１８時間攪拌した。反応混合物は真
空下で濃縮し、酢酸エチル（３００ｍＬ）に再溶解し
た。酢酸エチル溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２
ｘ４００ｍＬ）で洗浄し硫酸ナトリウムで乾燥して濾過
し、真空下濃縮した。残渣は酢酸エチル／ヘキサン
（１：２）および１％トリエチルアミンを用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適切な
分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥させると５．１ｇ
（１−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−５−メチ
ルウリジンから出発する４工程に対して５９％）の生成
物を得た。

【０１１２】実施例１９ １−（２−Ｏ−プロピル−３−Ｏ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノ−２−シアノエチルホスファイト−５−Ｏ−
ジメトキシトリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノ
シル）−４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシチジン １−（２−Ｏ−プロピル−５−Ｏ−ジメトキシトリチル
−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−４−Ｎ−ベ
ンゾイル−５−メチルシチジン（５．０ｇ，７ｍｍｏ
ｌ）、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
−イソプロピルホスホロジアミダイト（３．６ｍＬ，１
１．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルアミノテトラゾ
リド（０．４２ｇ，２．４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン
（８０ｍＬ）に溶解し、室温で４０時間攪拌した。反応
混合物は飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２ｘ４０ｍＬ）
および食塩水（１ｘ４０ｍＬ）で洗浄した。ジクロロメ
タン層を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥して濾過し、真
空下で濃縮した。得られた残渣は酢酸エチル／ヘキサン
（４０：６０）および１％トリエチルアミンを用いるシ
リカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。適
切な分画を集めて濃縮し、高真空下で乾燥させると７．
３ｇ（９８％）の生成物を得た。

【０１１３】実施例２０ ２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン 方法１ ：ステンレス鋼製高圧容器（１００ｍＬ容量）内
で粗２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１
０．０ｇ，０．０４１６ｍｏｌ）をメタノール（８０ｍ
Ｌ）に溶解した。ホウ酸トリメチル（５．６ ｍＬ，
０．０４９ｍｏｌ）を加えた（注１）。高圧容器を密封
し１５０℃の油浴に浸すと約５気圧の圧力を発生した。
４０時間後、高圧容器を氷で冷やして開いた後、内容物
を減圧下で濃縮すると黄褐色のあわ状物が１２ｇ得られ
た。粗生成物のＮＭＲは出発物質中の不純物が混入した
生成物および痕跡量のチミンおよび出発物質と一致した
（注２）。生成物はそのまま次の工程で使用された。ホ
ウ酸トリアルキルは水素化ホウ素の溶液（例えば１Ｍ
ＴＨＦ溶液）に所望のアルコールを加え水素ガスを発生
させることにより都合よく生じさせることができること
に注目されたい。また、ヌクレオシドはこの時点で酢酸
エチル中のメタノールノ濃度勾配（０〜１０％）を用い
たカラムクロマトグラフィーおよび無水エタノールから
の生成物の再結晶により精製でき、白色針状晶、ｍｐ１
９２〜１９３℃（ｍｐ１９７〜１９８℃）が得られるこ
とに注目されたい。この化合物の融点に関する参考文献
はＯｏｔｓｕｋａ，Ｈ．Ｉｎｏｕｅ，日本特許第８９−
８５４５６号（１９８９年４月４日）に含まれている。

【０１１４】方法２：ステンレス鋼製高圧容器（１００
ｍＬ容量）内で、純粋な２，２’−アンヒドロ−５−メ
チルウリジン（１．０ｇ，４．１６ｍｍｏｌ）およびホ
ウ酸トリメチル（０．５６ｍＬ，４．９ｍｍｏｌ）をメ
タノール（２０ｍＬ）に溶解した。高圧容器は１５０℃
の油浴に浸した。８０時間後、ＴＬＣは反応がほとんど
完全であることを示している。溶媒を除去すると白色の
あわ状物が得られた．ＮＭＲは生成物と出発物質の比が
９３：７であり、他の不純物が含まれていないことを示
した。残渣は酢酸エチル中メタノールの濃度勾配（０−
１０％）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィー
により精製され、８５０ｍｇ（７５％）の純粋な生成物
および２５０ｍｇの未だに不純な生成物が得られた。分
析的に純粋な試料がＮＭＲのために調製された。¹ Ｈ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆ ）：δ １．７９（ｓ，３Ｈ，
５−ＣＨ₃ ），３．３５（ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ₃ ），３．
５〜３．７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５’），３．７〜３．９
（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３’，４’），４．１５（ｍ，１Ｈ，
Ｈ−２’），５．１７（ｍ，２Ｈ，３’，５’−Ｏ
Ｈ），５．８７（ｄ, Ｊ＝５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），
７．８０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−６），１１．３７（ｂｒ
ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）。元素分析：Ｃ₁₁Ｈ₁₆Ｎ₂ Ｏ₆ （２
７２．２６）として計算値：Ｃ，４８．５２；Ｈ，５．
９２；Ｎ，１０．２９。実測値：Ｃ，４８．５６；Ｈ，
５．８８；Ｎ，１０．２２。

【０１１５】方法３：純粋な２，２’−アンヒドロ−５
−メチルウリジン（１０．０ｇ，４１．６ｍｍｏｌ）、
ホウ酸トリメチル（１０．０ｍＬ，８５ｍｍｏｌ）、Ｎ
ａＨＣＯ₃ （３０ｍｇ）およびＭｅＯＨ（７０ｍＬ）を
高圧容器中、約１７５℃で６０時間加熱した。高圧容器
を室温まで冷却し、内容物を真空下で蒸発させると白色
あわ状物が得られた。得られたあわ状物はエーテル（１
００ｍＬ）で磨砕し、生じる白色固形物を濾過により集
め, ５０℃で４時間真空下で乾燥させると表記化合物１
０７ｇ（１００％）が得られた。ＮＭＲ分析は約３％の
不純物が出発物質チミンおよびアラ−５−メチルウリジ
ンとして同定されることを示している。

【０１１６】実施例２１ ５’−Ｏ−ジメトキシトリフェニルメチル−２’−Ｏ−
メチル−５−メチルウリジン 粗２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン（１２ｇ）を
ピリジン（２ｘ５０ｍＬ）と共沸させ、乾燥ピリジン
（５０ｍＬ）に溶解した。ジメトキシトリフェニルメチ
ルクロリド（１８．１ｇ，０．０５４ｍｏｌ）を加え
た。フラスコに栓をし４５分間室温で放置した。反応停
止させるためにメタノール（１０ｍＬ）を加え溶液は減
圧下で油状物となるまで濃縮した。残渣を酢酸エチル
（２ｘ４００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウム溶液
（５００ｍＬ）に分配した。有機層を合併し乾燥後（硫
酸ナトリウム）濾過して黄色泡状物となるまで濃縮し
た。泡状物はメチレンクロリド（６０ｍＬ）に溶解し、
シリカゲルカラム（３００ｇ）上にのせ、酢酸エチル−
ヘキサン−トリエチルアミン（６０：４０：１）で溶出
した。生成物含有分画を合併し、濃縮して乾燥アセトニ
トリル（２ｘ５０ｍＬ）と共沸した。得られた残渣は１
ｍｍＨｇで２４時間乾燥させると堅くてもろい白色泡状
物を得た、１７．０ｇ（５−メチルウリジンからの三工
程で６０．４％）。

【０１１７】実施例２２ ２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−メ
チルウリジン ２５０ｍｌの３頸丸底フラスコ中で１−Ｏ−アセチル−
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイルリボース（０．５０
０ｇ，１ｍｍｏｌ）および５−メチル−２−チオ−ウラ
シル（０．１５６ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を真空下一夜乾
燥させた。これらの成分を１０ｍＬの乾燥アセトニトリ
ルに溶解し８０℃まで加熱した。この温かい溶液にＮ−
Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（０．５０
９ｇ，２．５ｍｍｏｌ）を加え、反応液は８０℃で１時
間攪拌した。反応混合物の加熱を止め放置して室温まで
冷却し、トリメチルシリルトリフレート（０．３３４
ｇ，１．５ｍｍｏｌ）を滴加した。反応混合物は次に５
０℃まで加熱し、４時間攪拌した。反応混合物は酢酸エ
チル／ヘキサン（１：１）を用いるＴＬＣにより検査さ
れ、反応が完了していることが示された。溶液を室温ま
で冷却し、５０ｍＬジクロロメタンのおよび５０ｍＬの
飽和炭酸水素ナトリウム溶液に分配した。水溶液層はジ
クロロメタンで２回以上抽出し、有機層を合併し、硫酸
マグネシウムで乾燥させ、濃縮すると淡黄色の泡状物が
得られた。この泡状物は更に精製することなく使用され
た。

【０１１８】実施例２３ ２−チオ−５−メチルウリジン 粗２，３，５−トリ−Ｏ−ベンゾイル−２−チオ−５−
メチルウリジン（２０ｇ，３７ｍｍｏｌ）を５００ｍＬ
のメタノールに溶解した。この溶液にナトリウムメトキ
シド（２．０ｇ，３７ｍｍｏｌ）を加え、反応液は２時
間攪拌した。反応液を酢酸エチル／ヘキサン（１：１）
および酢酸エチル／メタノール（９：１）を用いるＴＬ
Ｃにより検査すると、反応が完了していることが示され
た。溶液がｐＨ試験紙により溶液が中性になるまでＤｏ
ｗｅｘ ５０ Ｈ⁺ 樹脂を加え、樹脂は濾過した。樹脂
は次に１００ｍｌの別のメタノールで洗浄し、合併した
濾液を濃縮すると表記化合物８．５ｇ（８４％）を淡黄
色泡状物として得た。

【０１１９】実施例２４ ２’−Ｏ−メチル−５−メチル−２−チオウリジン ５−メチル−２−チオウリジン（０．５００ｇ，１．８
ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液を攪拌し、酸化ジ
ブチルスズ（０．５００ｇ，２．０ｍｍｏｌ）、ヨウ化
テトラブチルアンモニウム（０．７３８ｇ，２ｍｍｏ
ｌ）およびヨウ化メチル（１．０２２ｇ，７．２ｍｍｏ
ｌ）を加えた。反応フラスコを封じ５０℃で１６時間加
熱した。混合物を冷却し更にヨウ化メチルを加え（１．
０２２ｇ，７．２ｍｍｏｌ）反応液は更に１６時間加熱
した。この時間が終了すると反応混合物を室温まで冷却
し、メチレンクロリドで希釈し、メチレンクロリド／メ
タノール濃度勾配を用いてクロマトグラフィーを行っ
た。適切な分画を集めて濃縮すると２’−Ｏ−メチル−
５−メチル−２−チオウリジンが得られた。

【０１２０】実施例２５ ２’−Ｏ−プロピル−５−メチル−２−チオウリジン 表記化合物はヨウ化メチルをヨウ化プロピル（１．２２
ｇ，７．２ ｍｍｏｌ）に置換することにより実施例２
４の方法に従って製造される。

【０１２１】実施例２６ ２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チ
オウリジン 表記化合物はヨウ化メチルをブロモ−プロピルフタルイ
ミド（０．６７ｇ，２．５ｍｍｏｌ）に置換し、２日目
に追加（０．３００ｇ）を加える実施例２４の方法従っ
て製造される。

【０１２２】実施例２７ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルア
ミン−５−メチル−２−チオウリジン ２’−Ｏ−フタルイミドプロピル−５−メチル−２−チ
オウリジン（２．６ｇ，３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジ
ンに溶解し２回共沸させた。得られた泡状物は２５ｍＬ
の乾燥ピリジンに溶解し、ジメトキシトリチルクロリド
（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）および続いて４，４−ジ
メチルアミノピリジン（０．０５０ｇ，０．４ｍｍｏ
ｌ）を加えた。反応液は室温で一夜攪拌させた。反応混
合物へ１ｍＬのメタノールを加えた。この溶液は７５ｍ
Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液および５０ｍＬのクロ
ロホルムに分配した。水溶液層を２回新しいクロロホル
ムで抽出し、有機層を併せて硫酸マグネシウムで乾燥し
た。濾過して乾燥剤を除去した後、濾液を濃縮するとオ
レンジ色の油状物となり、シリカゲルを中和するために
加えられた０．５％のピリジンを含むメタノール／クロ
ロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムクロマトグ
ラフィーにより精製された。

【０１２３】実施例２８ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルア
ミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジ
ン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルア
ミン−５−メチル−２−チオウリジン（１ｇ，１．６ｍ
ｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し０℃まで冷却した。この溶液
にトリエチルアミン（０．３００ｇ，３ｍｍｏｌ）を加
え、続いてトルオイルクロリド（０．３００ｇ，１．９
２ｍｍｏｌ）を５分以上かけて滴加する。反応液は次に
放置して室温まで温め、一夜攪拌する。反応が完了した
らメタノールで反応を停止させ、油状物になるまで濃縮
する。この油状物は次に２５０ｍＬの飽和炭酸水素ナト
リウム／クロロホルム（１：１）の溶液に分配する。水
溶液層を更に７５ｍＬのクロロホルムで２回抽出し、有
機層を乾燥して油状物を得るまで乾燥する。保護ヌクレ
オシドはヘキサン／酢酸エチル濃度勾配を用いるシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製する。所望の
生成物はＮ−３トルオイルおよびＳ−２トルオイル化合
物の混合物として集められる。この混合物はホスフィチ
ル化工程に使用される。

【０１２４】実施例２９ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルア
ミン−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）
−２−シアノエトキシホスファイト］−５−メチル−２
−Ｓ−トルオイル−２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−プロピルア
ミン−５−メチル−２Ｓ−トルオイル−２−チオウリジ
ン（１６．０１ｇ，２２ｍｍｏｌ）およびジイソプロピ
ルエチルアミン（１０ｍｌ）のＴＨＦ（２００ｍｌ）溶
液に、０℃でクロロ−β−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピルアミノホスフィン（５．６ｍｌ，２５ｍｍ
ｏｌ）を加えた。反応混合物は室温で２４時間攪拌す
る。反応液を濃縮し、残渣はシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより精製される。酢酸エチル／ヘキサン濃
度勾配により溶出し（その間１％トリエチルアミンを維
持する）、適切な分画を集めて蒸発させると、表記化合
物が得られるであろう。

【０１２５】実施例３０ ２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリ
ジン ５００ｍＬのフラスコ中で、２’−Ｏ−フタルイミドプ
ロピル−５−メチル−２−チオウリジン（５．０ｇ，１
５．８ｍｍｏｌ）を１００ｍｌノメタノールに溶解し
た。ヒドラジン（２．０２ｇ，６３．２ｍｍｏｌ）を加
え、混合物は攪拌しながら１４時間加熱還流（６０〜６
５℃）する。溶媒を真空下蒸発させ、残渣をジクロロメ
タン（１５０ｍＬ）に溶解し、等量のＮＨ₄ ＯＨで２回
抽出する。有機層を蒸発させると粗生成物が得られる。
ＮＭＲが生成物純度の検定に使用される。本生成物は更
に精製することなく続いての反応に使用される。

【０１２６】実施例３１ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−
メチル−２−チオウリジン ２’−Ｏ−アミノプロピル−５−メチル−２−チオウリ
ジンをＭｅＯＨに溶解し５当量のトリエチルアミン、続
いて１０当量のエチルトリフルオロ酢酸を加える。表記
化合物が精製後に単離される。

【０１２７】実施例３２ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５’
−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−２−チオウリ
ジン ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−５−
メチル−２−チオウリジン（２．５ｇ，３．６ｍｍｏ
ｌ）を乾燥ピリジンに溶解して２回共沸させる。得られ
た黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解しジメト
キシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）お
よび続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５
０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜
攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加え
た。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液
および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を
２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸
マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した
後、濾液を濃縮すると油状物となり、シリカゲルを中和
するために加えられた０．５％のピリジンを含むメタノ
ール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラム
クロマトグラフィーにより精製され、表記化合物が得ら
れる。

【０１２８】実施例３３ ２’−Ｏ−トリフルオロアセチルアミノプロピル−３’
−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−２−シア
ノエトキシホスファイト］−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチル−２−チオウリジン 表記化合物は実施例３２の表記化合物を用いて実施例２
９の方法に従って製造される。

【０１２９】実施例３４ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチル
ウリジン ２−チオ−５−メチルウリジン（１ｇ，３．６ｍｍｏ
ｌ）を乾燥ピリジンに溶解して２回共沸させた。得られ
た黄色泡状物を２５ｍＬの乾燥ピリジンに溶解しジメト
キシトリチルクロリド（１．８ｇ，５．５ｍｍｏｌ）お
よび続いて４，４−ジメチルアミノピリジン（０．０５
０ｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応液は室温で一夜
攪拌させた。反応混合物へ１ｍＬのメタノールを加え
た。この溶液は７５ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウム溶液
および５０ｍＬのクロロホルムに分配した。水溶液層を
２回新しいクロロホルムで抽出し、有機層を併せて硫酸
マグネシウムで乾燥した。濾過して乾燥剤を除去した
後、濾液を濃縮するとオレンジ色の油状物となり、シリ
カゲルを中和するために加えられた０．５％のピリジン
を含むメタノール／クロロホルム濃度勾配を用いるシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより精製される。

【０１３０】実施例３５ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメ
チルシリル−５−メチル−２−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２−チオ−５−メチル
ウリジン（１ｇ，１．７３ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦと２
回共沸し、乾燥ＤＭＦに溶解してイミダゾール（０．１
４１ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）続いてｔ−ブチルジメチル
シリルクロリド（０．３１３ｇ，２．０８ｍｍｏｌ）を
加えた。反応混合物は一夜攪拌した。反応液は酢酸エチ
ル／ヘキサン１：１を用いるＴＬＣで検査すると、反応
がすでに完了していることを示した。反応混合物を５％
炭酸水素ナトリウム内へ注ぎクロロホルムで３回抽出し
た。合併した有機溶液は硫酸マグネシウムで乾燥し、濃
縮すると油状物が得られた。得られた油状物はメタノー
ル／クロロホルム濃度勾配を用いるシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーにより精製され、２’および３’シリ
ル保護ヌクレオシドが別々に単離された。

【０１３１】実施例３６ ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメ
チルシリル−２’−メタンスルホニル−５−メチル−２
−チオウリジン ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−ｔ−ブチルジメ
チルシリル−５−メチル−２−チオウリジン（１．０
ｇ，１．４５ｍｍｏｌ）をピリジンに溶解し０℃まで冷
却した。この溶液にメタンスルホニルクロリド（０．１
８３ｇ，１．６ｍｍｏｌ）を滴加した。反応液はＴＬＣ
により反応の完了が示されるまで攪拌した。反応混合物
はメタノールで中和し、濃縮して油状物とした。表記化
合物は続いての反応にそのまま使用された。

【０１３２】実施例３７ ５’−ＤＭＴ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−２，
２’チオアンヒドロ−５−メチル−２−チオウリジン 実施例３６で観察されたメチル化ヌクレオシドを５当量
のナトリウムムメトキシドを用いて室温で処理し、チオ
アンヒドロ化合物の形成が完了するまで攪拌した。溶液
は次にＤｏｗｅｘ ５０Ｗ（Ｈ⁺ 型）で中和し、樹脂は
濾過して除き、得られた溶液を濃縮すると表記化合物が
得られる。

【０１３３】実施例３８ ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−
５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジン 実施例３７のチオアンヒドロヌクレオシドを無水ジオキ
サンに溶解した。この溶液に６当量のＨＦ／ピリジン複
合体を加え、反応液はＴＬＣにより反応が完了するまで
攪拌した。反応混合物は次に等量の氷に注ぎ、中性にな
るまで炭酸カルシウムを加えた。固形物を濾過して除
き、炉液を濃縮した。残渣はシリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより精製され、表記化合物が得られる。

【０１３４】実施例３９ ２’−フルオロ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピ
ルアミノ）−２−シアノエトキシホスファイト］−５’
−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジン ２’−フルオロ−３’−ｔ−ブチルジメチルシリル−
５’−ＤＭＴ−５−メチル−２−チオウリジンを実施例
２９の方法に従って処理すると表記化合物が得られる。

【０１３５】実施例４０ ２，２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラロ
シル）−５−メチルウリジン］ ５−メチルウリジン（リボシルチミン Ｙａｍａｓａ，
Ｃｈｏｓｈｉ，Ｊａｐａｎを通して市販品として入手可
能）（７２．０ｇ，０．２７９ｍｏｌ）ジフェニルカー
ボネート（９０．０ｇ，０．４２０ｍｏｌ）および炭酸
水素ナトリウム（２．０ｇ，０．０２４ｍｏｌ）をＤＭ
Ｆ（３００ｍＬ）に加えた。混合物は攪拌しながら加熱
還流し、攪拌することにより放出されるべき二酸化炭素
ガスの発生を制御された様式に抑えた。一時間後、わず
かに色が濃くなった溶液は減圧下で濃縮した。得られた
シロップは攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）
に注いだ。エーテルはデカントし、残渣は最少量のメタ
ノール（約４００ｍＬ）に溶解した。この溶液を新しい
エーテル（２．５Ｌ）に注ぐと堅いゴム状物が得られ
た。エーテルをデカントしゴム状物を真空オーブン中で
乾燥すると（６０℃、１ｍｍＨｇで２４時間）固形物が
得られ、それを粉砕するとうすい黄褐色の粉末（５７
ｇ，８５％の粗収率）が得られた。この物質は続いての
反応にそのまま使用された。

【０１３６】実施例４１ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン ２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５
ｇ，０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレ
ート（２３１ｇ，０．９８Ｍ）および２−メトキシエタ
ノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレス鋼製圧力容器に
加え、１６０℃の前もって加熱されている油浴に浸し
た。１５５〜１６０℃で４８時間加熱した後、容器を開
け、溶液を蒸発乾固させてＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で摩
砕した。残渣は熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性
塩を濾過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄した後、濾
液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ₃ ＣＮ（６０
０ｍＬ）に溶解し、蒸発させた。０．５％のＥｔ₃ ＮＨ
を含むＣＨ₂ Ｃｌ₂ ／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：
３）でシリカゲルカラム（３ｋｇ）を充填した。カラム
に加える前に残渣をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （２５０ｍＬ）に溶解
してシリカ（１５０ｇ）に吸着させた。生成物を充填溶
媒で溶出すると１６０ｇ（６３％）の生成物が得られ
た。

【０１３７】実施例４２ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６
０ｇ，０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸
留し、乾燥残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。最
初のジメトキシトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２
７８Ｍ）を加え室温で１時間撹拌した。第二のジメトキ
シトリチルクロリド（９４．３ｇ，０．２７８Ｍ）を加
え、さらに室温で１時間撹拌した。次に反応を停止させ
るためにメタノール（１７０ｍＬ）を加えた。ＨＰＬＣ
は約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を留去し、Ｃ
Ｈ₃ ＣＮ（２００ｍＬ）と摩砕した。残渣はＣＨＣｌ₃
（１．５Ｌ）に溶解して２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣ
Ｏ₃ および２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。
有機相はＮａ₂ ＳＯ₄ で乾燥し、濾過後蒸発させた。２
７５ｇの残渣が得られた。残渣は０．５％のＥｔ₃ ＮＨ
を含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）
で充填および溶出するシリカゲルカラム（３．５ｋｇ）
で精製した。純粋な分画を蒸発させると１６４ｇの生成
物が得られた。約２０ｇの追加の生成物が不純な分画か
ら得られ、全収量は１８３ｇ（５７％）であった。

【０１３８】実施例４３ ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’
−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルウリジン（１０６ｇ，０．１６７
Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦおよび１
８８ｍＬのピリジンから作製された７５０ｍＬの３：１
混合物）および無水酢酸（２４．３８ｍＬ，０．２５８
Ｍ）を混ぜ、室温で２４時間撹拌した。ｔｌｃ試料を最
初にＭｅＯＨで反応停止させることによりｔｌｃで反応
をモニターした。反応完了後（ｔｌｃで判断された）、
ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、３５℃で混合物を蒸発さ
せた。残渣をＣＨＣｌ₃ （８００ｍＬ）に溶解し、２ｘ
２００ｍＬの飽和炭酸水素ナトリウムおよび２ｘ２００
ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層は２００ｍＬのＣ
ＨＣｌ₃ で逆抽出した。合併した有機層は硫酸ナトリウ
ムで乾燥し、蒸発させると１２２ｇの残渣（約９０％の
生成物）を与えた。残渣は３．５ｋｇのシリカゲルカラ
ムで精製され、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）で溶出
した。純粋な分画を蒸発させると９６ｇ（８４％）が得
られた。

【０１３９】実施例４４ ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’
−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾ
ールウリジン 第一の溶液として３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メト
キシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチ
ルウリジン（９６ｇ，０．１４４Ｍ）をＣＨ₃ＣＮ（７
００ｍＬ）に溶解して取っておく。トリエチルアミン
（１８９ｍＬ，１．４４Ｍ）をトリアゾール（９０ｇ，
１．３Ｍ）のＣＨ₃ ＣＮ（１Ｌ）溶液に加え、−５℃に
冷却してオーバーヘッド撹拌機を用いて０．５時間撹拌
した。０〜１０℃に維持されている撹拌溶液に３０分以
上かけてＰＯＣｌ₃ を滴加し、得られた混合物はさらに
２時間撹拌した。この溶液に４５分以上かけて第一の溶
液を滴加した。得られた反応混合物は低温室に一夜貯蔵
した。反応混合物から塩を濾去し、溶液は蒸発させた。
残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固形物は濾
過して除いた。濾液は１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ₃ お
よび２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナト
リウムで乾燥して蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃと摩砕
すると表記化合物が得られた。

【０１４０】実施例４５ ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルシチジン ３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’
−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾ
ールウリジン（１０３ｇ，０．１４１Ｍ）のジオキサン
（５００ｍＬ）およびＮＨ₄ ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を室
温で２時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣
はＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸させた。残渣はＭ
ｅＯＨ（３００ｍＬ）に溶解し２リットルのステンレス
鋼圧力容器に移した。ＮＨ₃ ガスで飽和させたＭｅＯＨ
（４００ｍＬ）を加え、容器は１００℃で２時間加熱し
た（ｔｌｃは完全な変換を示した）。容器内容物を蒸発
乾固させ、残渣はＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）に溶解し、
飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一度洗浄した。有機層は
硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させると８５ｇ
（９５％）の表記化合物が得られた。

【０１４１】実施例４６ Ｎ⁴ −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン ２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリ
チル−５−メチルシチジン（８５ｇ，０．１３４Ｍ）を
ＤＭＦ（８００ｍＬ）に溶解し、無水安息香酸（３７．
２ｇ，０．１６５Ｍ）を撹拌しながら加えた。３時間撹
拌後、ｔｌｃは反応が約９５％完了していることを示し
た。溶媒を蒸発させ、残渣はＭｅＯＨ（２００ ｍＬ）
と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ₃ （７００ｍＬ）に溶解
し、飽和ＮａＨＣＯ₃ （２ｘ３００ｍＬ）および飽和Ｎ
ａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ₄ で乾燥
してて蒸発させると残渣（９６ｇ）が得られた。残渣に
は０．５％のＥｔ₃ ＮＨを含むＥｔＯＡｃ／ヘキサン
（１：１）を用いる１．５ｋｇのシリカカラムでクロマ
トグラフィーを行った。純粋な生成物分画を蒸発させる
と９０ｇ（９０％）の表記化合物が得られた。

【０１４２】実施例４７ Ｎ⁴ −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−
アミダイト Ｎ⁴ −ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−
Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４
ｇ，０．１０Ｍ）をＣＨ₂ Ｃｌ₂ （１Ｌ）に溶解した。
テトラゾール ジイソプロピルアミン（７．１ｇ）およ
び２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスフ
ァイト（４０．５ｍＬ，０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下
で撹拌しながら加えた。得られた混合物は室温で２０時
間撹拌した（ｔｌｃは反応が約９５％完了していること
を示した）。反応混合物は飽和ＮａＨＣＯ₃ （１ｘ３０
０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ（１ｘ３００ｍＬ）で抽出
した。水性洗浄液はＣＨ₂ Ｃｌ₂ （３００ｍＬ）で逆抽
出し、抽出物を合併してＭｇＳＯ₄ で乾燥して濃縮し
た。得られた残渣はＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を
溶出溶媒として用いる１．５ｋｇのシリカカラムでクロ
マトグラフィーを行った。純粋な分画を蒸発させると９
０．６ｇ（８７％）の表記化合物が得られた。

【０１４３】評価 方法１ ２’−Ｏ−置換オリゴリボヌクレオチド ヌクレアーゼ安定性 ２’−Ｏ−メチルホスホロアミダイトはＧｌｅｎ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから購入され
た。２’−Ｏ−プロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルホス
ホロアミダイトはＬｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，７８３２〜７８３
８；Ｇｕｉｎｏｓｓｏら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａ
ｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９１，１０，２５
９〜２６２に記載されているように製造した。２’−Ｏ
−置換ヌクレオシドで誘導体化されたＣＰＧはＤａｍｈ
ａ，Ｍ．Ｊ．，Ｇｉａｎｎａｒｉｓ，Ｐ．Ａ．およびＺ
ａｂａｒｙｌｏ，Ｓ．Ｖ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１９９０，１８，３８１３〜３８２１により記
載されているように製造した。固相ＤＮＡ合成のための
その他の試薬は市販品が購入された。オリゴマーはＡＢ
Ｉモデル３８０Ｂ ＤＮＡ合成機により固相化学を用い
て合成された。オリゴマーはポリアクリルアミドゲル電
気泳動により精製され、続いてＰｏｌｙ−ｐａｋカート
リッジ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎ
ｇ，ＶＡ）で脱塩された。オリゴリボヌクレオチドは
［ｇ−³²Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチド キナ
ーゼを用いて５’末端標識された。標識反応後、Ｔ４ポ
リヌクレオチド キナーゼは３分間９５℃で熱不活性化
され、オリゴマーはさらに精製することなく使用され
た。ヌクレアーゼ耐性研究のために合成されたオリゴリ
ボヌクレオチド配列は表１に示されている。１２−ｍｅ
ｒ系列内への異なった２’−Ｏ−アルキル残基の取り込
みはエレクトロスプレー質量分析法により確認され、計
算された質量と測定された質量は０．０１％以内で一致
した。

【０１４４】蛇毒ホスホジエステラーゼ（μｇＳＢ，Ｃ
ｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）アッセイは１μＭオリゴマー
を用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、７２ｍ
ＭＮａＣｌおよび１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ の緩衝液中、３
７℃にて酵素濃度５ｘ１０ ^-2μｇ／ｍｌまたは５ｘ１０
^-3μｇ／ｍｌで実施された。本酵素はこれらの条件下、
少なくとも２４時間その活性を維持することが示され
た。ヌクレアーゼＳ１（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）アッセイは、１μＭのオリゴ
マーを用い、３７℃にて３０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ
４．５、５０ｍＭ

【０１４５】ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＺｎＣｌ₂ 中で実
施された。ヌクレアーゼＳ１は１．９μｇ／ｍｌまたは
１．９ｘ１０⁶ μｇ／ｍｌで使用された。ヌクレアーゼ
安定性試験反応液の一部を指定された時間に採り、探知
色素を含む等量の８０％ホルムアミドゲル負荷緩衝液の
添加により反応を停止させ、９５℃で２分間加熱し、変
性ポリアクリルアミド電気泳動による分析まで−２０℃
で保存した。定量はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）
で実施した。

【０１４６】

【表２】 表１ ヌクレアーゼ研究に使用された修飾オリゴリボヌクレオチド2'-O- 置換 主鎖 17-mer 12-mer 2'- デオキシ P=O 配列ＩＤ番号：1 配列ＩＤ番号：6 メチル P=O 配列ＩＤ番号：2 配列ＩＤ番号：7 プロピル P=O 配列ＩＤ番号：3 配列ＩＤ番号：8 ペンチル P=O 配列ＩＤ番号：4 配列ＩＤ番号：9 2'- デオキシ P=S 配列ＩＤ番号：5 配列ＩＤ番号：10 17-mer: 2'- デオキシ (P=O) 5' GGA CCG GAA GGTACGA 3' メチル 5' GGA CCG GAA GGU ACG AG 3' プロピル 5' GGA CCG GAA GGU ACG AG 3' ペンチル 5' GGA CCG GAA GGU ACG AG 3' 2'- デオキシ (P=S) 5' GGA CCG GAA GGT ACG AG 3' 12-mer: 全て 5' CUA AGC AUG UCA 3' 下線 = 2'- 修飾残基

【０１４７】１７−ｍｅｒ系列のヌクレアーゼ安定性が
蛇毒ホスホジエステラーゼを用いて試験された。完全長
物質の量をその最初の値の５０％へ減少させるのに必要
な時間（ｔ_1/2 ）が表４に示されている。相対的ヌクレ
アーゼ安定性は観察されたｔ _1/2 値を非修飾化合物のｔ
_1/2 時間で割ることにより計算された。１７−ｍｅｒ系
列の２’−Ｏ−メチルおよび２’−Ｏ−プロピル類似体
の両方とも５ｘ１０^-3μｇ／ｍｌの酵素濃度で非修飾対
照物よりも７４倍安定であった。この系列の２’−Ｏ−
メチルと２’−Ｏ−プロピル類似体とのヌクレアーゼ安
定性の相違を区別するため酵素濃度を増加させた。５ｘ
１０^-2μｇ／ｍｌの酵素濃度でＳＶＰＤアッセイを実施
すると、約２．５分で完全長２’−デオキシホスホジエ
ステルオリゴマーの５０％の分解が起こった。同一の反
応条件下、２’−Ｏ−メチルホスホジエステル、２’−
Ｏ−プロピルホスホジエステルおよび２’デオキシホス
ホロチオエート類似体は２’−デオキシホスホジエステ
ル対照物より１２０、１６０および３５０倍安定であっ
た（表２）。これらの類似体の変性ポリアクリルアミド
ゲル分析は、完全に修飾されたオリゴリボヌクレオチド
は最初のいくつかの３’−ヌクレオチドを著しく超えて
は分解が進行しないことを示し、一方、非修飾オリゴマ
ーは分解生成物のラダーを示した。定性的には、本分析
は２’−Ｏ−ペンチル類似体が２’−Ｏ−メチルまたは
２’−Ｏ−プロピルオリゴマーよりもエキソヌクレアー
ゼ分解に対してより耐性があることを示唆している（デ
ータは示されていない）。２’−Ｏ−ペンチル類似体の
定量的分析は二つの理由により困難であった。第一に、
２’−Ｏ−ペンチルオリゴマーはポリヌクレオチドキナ
ーゼには適さない基質であるため、有効な標識ができな
い。第二に、非常にたびたび標識２’−Ｏ−ペンチルオ
リゴマーの大部分はゲルの頂上で捕捉される。１７−ｍ
ｅｒのこの系列については、安定性の順序は以下のよう
に思われる：２’−デオキシホスホロチオエート＞２’
−Ｏ−ペンチルホスホジエステル＞２’−Ｏ−プロピル
ホスホジエステル＞２’−Ｏ−メチルホスホジエステル
＞２’−デオキシホスホジエステル。

【０１４８】１２−ｍｅｒ系列の相対的ヌクレアーゼ安
定性もまた蛇毒ホスホジエステラーゼを用いて決定され
た。この１２−ｍｅｒ系列は３’末端残基を含む全ての
位置に２’−Ｏ−アルキル糖修飾を含む。２’−Ｏ−メ
チルホスホジエステル、２’−Ｏ−プロピルホスホジエ
ステルおよび２’デオキシホスホロチオエート類似体は
非修飾対照体より７、１０および８９倍安定であった
（表２）。完全修飾２’−Ｏ−ペンチル１２−ｍｅｒオ
リゴリボヌクレオチドについて観察された安定性は定性
的には１７−ｍｅｒ ２’−Ｏ−ペンチル類似体と同程
度である。安定性の順序は１７−ｍｅｒ系列と同じであ
った。しかしながら１７−ｍｅｒ ２’−Ｏ−アルキル
類似体の単純な分解パターンとは対照的に、１２−ｍｅ
ｒ系列は分解生成物のラダーを示した（データは示され
ていない）。１２−ｍｅｒの安定性の整列順は１７−ｍ
ｅｒと同一であるが、定量的な相対安定性は二つの系列
で異なっていた。１２−ｍｅｒ系列の２’−Ｏ−メチル
および２’−Ｏ−プロピル類似体は非修飾対照より３か
ら１０倍以上蛇毒ホスホジエステラーゼに耐性であり、
１７−ｍｅｒ系列ではこれらの類似体は非修飾対照と比
較して７０から１６０倍の安定性の増加を示した。

【０１４９】２’−Ｏ−修飾オリゴマーの１２−ｍｅｒ
系列の安定性もまたＳ１ヌクレアーゼ（一本鎖エンドヌ
クレアーゼ）を用いて調べられた。１．９μｇ／ｍｌの
酵素濃度では２’−Ｏ−メチルホスホジエステルまたは
２’−Ｏ−プロピルホスホジエステルの１２−ｍｅｒで
は分解は観察されなかった。同一条件下、２’デオキシ
ホスホジエステルおよび２’デオキシホスホロチオエー
トは各々２および１３分のｔ_1/2 を持っていた（表
２）。２’−Ｏ−メチル対２’−Ｏ−プロピル修飾の安
定性における相違は１０⁵ 倍高いＳ１ヌクレアーゼ濃度
で観察された。１．９ｘ１０⁵ μｇ／ｍｌの酵素濃度で
は、２’−Ｏ−メチル類似体のｔ_1/2 は９０分であった
が、２’−Ｏ−プロピルオリゴマーの分解は観察されな
かった。

【０１５０】

【表３】表２ Ｓ１ヌクレアーゼおよび蛇毒ホスホジエステラーゼによる２’−Ｏ−修飾オリゴ リボヌクレオチドの半減期蛇毒ホスホジエステラーゼ（１２−ｍｅｒ系列） ｔ_1/2 （分） 相対 ｔ_1/2 （分） 相対 オリゴマー （５ｘ１０^-3 ｔ_1/2 （５ｘ１０^-2 ｔ_1/2 配列ＩＤ番号： μｇ／ｍｌ） μｇ／ｍｌ） ６ １２．０ １．０ １．５ １．０ ７ ３８．０ ３．２ １１．０ ７．３ ８ ６８．０ ５．７ １５．０ １０．０ １１² ＞６８．０ ＞５．７ ＮＤ³ −−− １０ ９７５ ８１．３ １３３ ８８．７

【０１５１】

【表４】蛇毒ホスホジエステラーゼ（１７−ｍｅｒ系列） ｔ_1/2 （分） 相対 ｔ_1/2 （分） 相対 オリゴマー （５ｘ１０^-3 ｔ_1/2 （５ｘ１０^-2 ｔ_1/2 配列ＩＤ番号： μｇ／ｍｌ） μｇ／ｍｌ） １ ２７．０ １．０ ２．５ １．０ ２ ２０００ ７４ ３００ １２０ ３ ２０００ ７４ ４００ １６０ ５ 分解なし −−− ８７５ ３５０

【０１５２】

【表５】Ｓ１ヌクレアーゼ（１２−ｍｅｒ系列） ｔ_1/2 （分） 相対 ｔ_1/2 （分） 相対 オリゴマー （５ｘ１０^-3 ｔ_1/2 （５ｘ１０^-2 ｔ_1/2 配列ＩＤ番号： μｇ／ｍｌ） μｇ／ｍｌ） ６ ２．０ １．０ ＜１．０ １．０ ７ 分解なし −−− ９０ ＞９０ ８ 分解なし −−− 分解なし １０ １３．０ ６．５ ＜１．０ −−¹ 配列および修飾は表１に与えられている。² このオリゴマーは５’残基が２’−デオキシＣである
ことを除いて完全に修飾された２’−Ｏ−ペンチル １
２−ｍｅｒである。ＮＤ³ ＝決定されていない。

【０１５３】方法２ ハイブリダイゼーション安定性の決定 Ｍｏｎｉａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
１９９２，２６７，１９９５４〜１９９６２に記載され
ているように、デュープレックスの吸光度対温度の曲線
が１００ｍＭ Ｎａ⁺ 、１０ ｍＭリン酸、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ７中４ｍＭの鎖濃度（デュープレッ
クス）または６ｍＭ鎖濃度（一本鎖の研究）で測定され
た。融解温度（Ｔ_m ）およびデュープレックス形成の自
由エネルギーが直線勾配ベースラインを用いた二状態モ
デルへデータを適合させて得られた（Ｆｒｅｉｅｒ，
Ｓ．Ｍ．，Ａｌｂｅｒｇｏ，Ｄ．Ｄ．，ａｎｄ Ｔｕｒ
ｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１９８
３，２２，１１０７〜１１３１）。デュープレックス形
成の自由エネルギーは、Ｆｒｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍ．ら、Ｇ
ｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ，Ｃ．
Ｆ．Ｆｏｘ編者，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１，１９９２，ｐｐ．９５〜１０７により示さ
れているように、Ｔ_m より熱力学的安定性のより正当な
測定である。しかしながら、実験誤差はＴ _m よりＤＧ°
₃₇における方がより大きい。従って、表３にはＴ_m 値が
報告されている。

【０１５４】

【表６】表３ 均一な２’−置換¹ を含むオリゴリボヌクレオチドのＴ_m 修飾 Ｐ＝Ｏ¹ Ｐ＝Ｏ¹ 一本鎖³ Ｐ＝Ｓ¹ Ｔ_m Ｔ_m Ｔ_m Ｔ_m 15-mer 17-mer 17-mer 18-mer 2'- デオキシ ４５．１ ５６．５ ６７．９(PO), ５５．３ ５７．６(PS) 2'-O- メチル ６２．８ ７９．６ ７３．４(PO) ８０．９ 2'-O- プロピル ５８．５ ７４．８ ７７．８(PO) ７８．３ 2'-O- ペンチル ４５．９ ６１．８ ＮＤ² ５４．２ ＲＮＡ ５９．２ ７４．５ ６８．６(PO) ＮＤ^{2 1} Ｔｍは℃で示され、１００ｍＭ Ｎａ⁺ 、１０ｍＭ
リン酸、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中、４ｍＭ
の鎖濃度でＲＮＡ相補体に対して測定された。（Ｐ＝
Ｏ、ホスホジエステル、Ｐ＝Ｓ、ホスホロチオエート）² ＮＤ ＝決定されていない³ Ｔｍは相補鎖なしで１００ｍＭ Ｎａ⁺ 、１０ｍＭ
リン酸、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０中、４ｍＭ
の鎖濃度で測定された。

【０１５５】

【表７】 研究された配列: 配列ＩＤ番号： 15-mer 配列 12 2'- デオキシ CoGoAoCoToAoToGoCoAoAoGoToAoC 13 メチル CoGoAoCoToAoToGoCoAoAoGoToAoC 14 プロピル CoGoAoCoToAoToGoCoAoAoGoToAoC 15 ペンチル CoGoAoCoToAoToGoCoAoAoGoToAoC 16 RNA CoGoAoCoToAoToGoCoAoAoGoToAoC 17-mer 17 2'- デオキシ GoGoAoCoCoGoGoAoAoGoGoToAoCoGoAoG 18 メチル GoGoAoCoCoGoGoAoAoGoGoUoAoCoGoAoG 19 プロピル GoGoAoCoCoGoGoAoAoGoGoUoAoCoGoAoG 20 ペンチル GoGoAoCoCoGoGoAoAoGoGoUoAoCoGoAoG 21 RNA GoGoAoCoCoGoGoAoAoGoGoToAoCoGoAoG 18-mer 22 2'- デオキシ TsGsGsGsAsGsCsCsAsTsAsGsCsGsAsGsGsC 23 メチル TsGsGsGsAsGsCsCsAsTsAsGsCsGsAsGsGsC 24 プロピル TsGsGsGsAsGsCsCsAsTsAsGsCsGsAsGsGsC 25 ペンチル TsGsGsGsAsGsCsCsAsTsAsGsCsGsAsGsGsC 26 RNA TsGsGsGsAsGsCsCsAsTsAsGsCsGsAsGsGsC 下線＝２’修飾残基；ｏ＝ホスホジエステル結合；ｓ＝
ホスホロチオエート結合

【０１５６】方法３ ｒａｓ ＲＮＡによるＲＮａｓｅ ＯＮＥフットプリン
ティング アッセイ ｒａｓ ４７−ｍｅｒステム／ループＲＮＡを３〜３０
ｐＭの濃度で標的上の好適なハイブリダイゼーション部
位に相補的であるオリゴヌクレオチドとインキュベート
した。これらのオリゴヌクレオチドは市販品として入手
可能な（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２’−Ｏ−メチ
ルアミダイトを５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂ を含む１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ ８）中、
１０μＭの濃度で用いて合成した。ハイブリダイゼーシ
ョンは３７℃にて少なくとも１６時間実施した。ＲＮａ
ｓｅ ＯＮＥ（１０μｇ／μＬ，Ｐｒｏｍｅｇａ）は
１：２０００から１：１００，０００の希釈で加え、２
５℃で５分間インキュベートし、急速冷凍により反応を
停止させた。ＲＮａｓｅ Ｔ１を用いる”Ｇ”マップお
よび５０ｍＭ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 緩衝液（ｐＨ ９）を用い
る塩基ラダーを調製した。分解生成物は、１０μＭでの
ＲＮａｓｅ ＯＮＥフットプリントを示す少なくとも一
つのオリゴヌクレオチドを同定するためシークエンシン
グＰＡＧＥにより分離された。次に問題とするオリゴヌ
クレオチドのＫ_d が、そのオリゴヌクレオチド（１００
ｐＭから１０μＭの範囲の濃度で）をＲＮａｓｅ ＯＮ
Ｅで滴定することにより決定された。分解生成物はシー
クエンシングＰＡＧＥにより分離され、オリゴヌクレオ
チドにより与えられた保護のパーセントがオリゴヌクレ
オチド濃度の関数としてプロットされた。５０％保護が
観察されるオリゴヌクレオチド濃度が問題とするオリゴ
ヌクレオチドのＫ_d である。この方法を用い、標的ｒａ
ｓ ＲＮＡに対して増強された親和性および特異性を持
つオリゴヌクレオチドが同定された。

【０１５７】方法４ ｒａｓ−ルシフェラーゼ レポーター遺伝子組立て この研究で記載されるｒａｓ−ルシフェラーゼ レポー
ター遺伝子はＰＣＲ技術を用いて組み立てられた。突然
変異体（コドン１２）および非突然変異体（野生型）ヒ
トＨ−ｒａｓ遺伝子両方のエキソン１の５’領域のＰＣ
Ｒクローニングのプライマーとして使用するため、オリ
ゴヌクレオチドプライマーが合成された。ｃ−Ｈ−ｒａ
ｓ１活性化癌遺伝子（コドン１２、ＧＧＣ→ＧＴＣ）を
含むｐＴ２４−Ｃ３、およびｃ−Ｈ−ｒａｓ原癌遺伝子
を含むｐｂｃ−Ｎ１はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄ
ａ，ＭＤ）から得られた。１．９ｋｂホタルルシフェラ
ーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＴ３／Ｔ７ ｌｕｃはＣ
ｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）から得られた。オリゴヌクレオチド
ＰＣＲプライマーは、鋳型として突然変異体および非突
然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子を用いる標準ＰＣＲ反応で使
用された。これらのプライマーはＮｈｅＩおよびＨｉｎ
ｄIII 制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接する、正常お
よび突然変異体Ｈ−ｒａｓの配列−５３から＋６５（翻
訳開始部位に関して）に対応する１４５塩基対のＤＮＡ
生成物を生成する。ＰＣＲ生成物は標準法を用いてゲル
で精製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。

【０１５８】Ｐ．ピラリス（ｐｙｒａｌｉｓ）（ホタ
ル）ルシフェラーゼ遺伝子のクローニングのためのＰＣ
Ｒプライマーは、ＰＣＲ生成物がアミノ末端メチオニン
残基を除いて（それは二つのアミノ酸で置き換えられる
であろう、アミノ末端リジンおよび続いてロイシン残
基）完全長ルシフェラーゼ蛋白質をコードするように設
計された。このルシフェラーゼ遺伝子のクローニングの
ために用いられたオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマー
は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む市販品とし
て入手可能なプラスミド（ｐＴ３／Ｔ７−Ｌｕｃ）（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる標準ＰＣＲ反応において鋳型
として使用された。これらのプライマーは独特のＨｉｎ
ｄIII およびＢｓｓＨII制限エンドヌクレアーゼ部位が
隣接し、ルシフェラーゼ遺伝子に対応する約１．９ｋｂ
の生成物を与える。この断片は標準法を用いてゲルで精
製し、沈澱させ、洗浄して水に再懸濁した。

【０１５９】ｒａｓ−ルシフェラーゼ融合レポーター遺
伝子の組立を完成させるため、ｒａｓおよびルシフェラ
ーゼＰＣＲ生成物は適当な制限エンドヌクレアーゼで消
化し、制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＨｉｎｄIII
およびＢｓｓＨIIを用いてステロイド−誘導可能マウス
乳癌ウイルスプロモーターＭＭＴＶを含む発現ベクター
内への三部分連結によりクローン化した。得られたクロ
ーンではホタルルシフェラーゼ遺伝子の読み枠内へ融合
されたＨ−ｒａｓ５’配列（−５３から＋６５）の挿入
がもたらされる。得られた発現ベクターはステロイド−
誘導可能ＭＭＴＶプロモーターの制御下で発現されるｒ
ａｓ−ルシフェラーゼ融合生成物をコードしている。こ
れらのプラスミド構築物はホタルルシフェラーゼをコー
ドする配列の読み枠内へ融合された活性化（ＲＡ２）ま
たは正常（ＲＡ４）Ｈ−ｒａｓ蛋白質のアミノ酸１〜２
２をコードしている配列を含む。ｒａｓ−ルシフェラー
ゼ融合ｍＲＮＡの翻訳開始は天然のＨ−ｒａｓ ＡＵＧ
コドンに依存する。突然変異体および正常Ｈ−ｒａｓル
シフェラーゼ融合構築物の両方が標準法を用いるＤＮＡ
配列分析により確認された。

【０１６０】方法５ プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション トランスフェクションは以下の修正を加えＧｒｅｅｎｂ
ｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．
Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍ
ｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈ
ｌ，編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，
ＮＹに記載されているように実施した。ヒーラー細胞を
６０ｍｍの培養皿に５ｘ１０⁵ 細胞／皿で播種した。各
々の皿に全部で１０μｇまたは１２μｇのＤＮＡを加
え、その１μｇは構成性ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）
プロモーターの制御下のグルココルチコイドレセプター
を発現するベクターであり、残りはｒａｓ−ルシフェラ
ーゼレポータープラスミド（実施例４３）であった。リ
ン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈澱物は、３ｍＭ ＥＧＴＡ
を含むトリス緩衝食塩水［５０ｍＭ トリス−Ｃｌ（ｐ
Ｈ ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で洗浄すること
により１６〜２０時間後に除去した。次に１０％ウシ胎
児血清を補給した新鮮な培地を細胞に加えた。この時点
で、デキサメタゾンによるレポーター遺伝子発現の活性
化に先だって細胞はオリゴヌクレオチドで前もって処理
された。

【０１６１】方法６ 細胞のオリゴヌクレオチド処理 プラスミドトランスフェクション（実施例４４）に続い
て、細胞は前もって３７℃に温めたリン酸緩衝食塩水で
洗浄し、５μｇ／ｍＬのＮ−［１−（２，３−ジオレイ
ルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアン
モニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を含むＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍを各々のプレートに添加した（ウェル当たり１．０
ｍｌ）。５０μＭ貯蔵液からオリゴヌクレオチドを各々
のプレートに加え、３７℃で４時間インキュベートし
た。培地を除き、１０％ウシ胎児血清および指定された
濃度の適当なオリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで置換
し、細胞は３７℃で２時間さらにインキュベートしたの
ち、０．２μＭの最終濃度のデキサメタゾンで細胞を処
理することによりレポーター遺伝子発現を活性化した。
デキサメタゾン刺激１５時間後に細胞を採取し、ルシフ
ェラーゼ活性をアッセイした。

【０１６２】方法７ ルシフェラーゼアッセイ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，
Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．
Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓ
ｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ，ＮＹに記載されているように、界面活性剤トリトン
Ｘ−１００で溶解させることにより細胞からルシフェラ
ーゼを抽出した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＬ１０００ルミ
ノメーターを使用して６２５μＭのルシフェリン（Ｓｉ
ｇｍａ）の添加によるピークルミネセンスを測定した。
各々の抽出物について、データがアッセイの直線的範囲
に集まることを確かにするため異なった量の抽出物を使
用して多数回ルシフェラーゼアッセイを実施した。

【０１６３】方法８ 融解曲線 ＩＢＭ ＰＣコンピューターと接続したＧｉｌｆｏｒｄ
２６０分光光度計およびＧｉｌｆｏｒｄ Ｒｅｓｐｏ
ｎｓｅ ＩＩ分光光度計を用いて２６０ｎｍで吸光度対
温度の曲線を測定した。緩衝液は１００ｍＭＮａ⁺ 、１
０ｍＭリン酸および０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７を
有した。オリゴヌクレオチド濃度は各々の鎖で４μＭで
あり、８５℃での吸光度および、Ｐｕｇｌｉｓｉおよび
Ｔｉｎｏｃｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．１９８９，１８０，３０４〜３２５に従って計算さ
れた吸光係数から決定された。Ｔ_m 値、デュープレック
ス形成の自由エネルギーおよび付随する定数は直線状ス
ロープ基線の二状態モデルへのデータの適合から得られ
た。Ｐｅｔｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍ．およびＴｕｒｎｅｒ，
Ｄ．Ｈ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８３，２
２，２５６〜２６３。報告されているパラメーターは少
なくとも３回の実験の平均である。いくつかのオリゴヌ
クレオチドに対し、Ｔ_m -1対ｌｏｇ₁₀（濃度）のプロッ
トからデュープレックス形成の自由エネルギーも得られ
た。Ｂｏｒｅｒ，Ｐ．Ｎ．，Ｄｅｎｇｌｅｒ，Ｂ．，Ｔ
ｉｎｏｃｏ，Ｉ．，Ｊｒ．およびＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，
Ｏ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７４，８６，
８４３〜８５３。

【０１６４】方法９ ２’−Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを持つオリゴヌ
クレオチドの活性 方法５〜８を用いて、オリゴマー化合物の相補的ＲＮＡ
へのハイブリダイゼーション親和性および細胞内でのＨ
ａ−ｒａｓ癌遺伝子に対する活性が試験された。均一に
２’−Ｏ−修飾されたオリゴマーおよび２’−Ｏ−修飾
領域および２’−デオキシ領域の両方を持つキメラオリ
ゴマーが試験された。２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−プ
ロピルおよび２’−Ｏ−ペンチルを含む均一に２’−Ｏ
−修飾されたオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴ
ヌクレオチドよりもＲＮＡへの高い親和性を示した。
２’−Ｏ−修飾領域および２’−デオキシ領域の両方を
持つキメラオリゴマーは非修飾２’−デオキシオリゴヌ
クレオチドよりもＲＮＡに対する高い親和性を示し、ま
た非修飾均一デオキシホスホロチオエートと比較して著
しいＨａ−ｒａｓ遺伝子発現の阻害も示した（Ｍｏｎｉ
ａ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９
３，２６８，１４５１４〜１４５２２を参照された
い）。

【０１６５】実施例４８ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡ発現のオリゴヌクレオチド阻害ア
ッセイ Ａ５４９細胞をＴ−７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ Ｌａ
ｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）に播種
し、２４〜４８時間後（この時８０〜９０％コンフルエ
ント）以下の組成を持つ３つのオリゴヌクレオチドで処
理した。

【０１６６】

【表８】配列ＩＤ番号： 配列 27 GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA 28 GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA 29 GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA

【０１６７】配列ＩＤ番号：２７は完全に修飾されたデ
オキシホスホロチオエートであり、配列ＩＤ番号：２８
は１−６および１５−２０位に２’−フルオロを持つ完
全に修飾されたデオキシホスホロチオエートであり、お
よび配列ＩＤ番号：２９は２、３、５および１６−１８
位に２’−フルオロ−５−メチルウリジンおよび１、
４、６、１５、１９および２０位に２’−フルオロを持
つ完全に修飾されたデオキシホスホロチオエートであ
る。

【０１６８】細胞は１０ｍｌのＤＭＥＭで２回洗浄し、
２０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液（リポフェ
クチン）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む５ｍｌのＤＭＥＭを加え
た。次に１０μＭの貯蔵溶液から必要とされる濃度まで
オリゴマー化合物を加え、皿を渦まかせることにより溶
液を混合させた。細胞は３７℃で４時間インキュベート
し、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ溶液を除くために１回ＤＭＥ
Ｍ＋１０％ＦＣＳで洗浄し、続いて追加の２０ｍｌのＤ
ＭＥＭ＋１０％ ＦＣＳを加え、細胞はさらに２０時間
放置して回復させた。

【０１６９】Ａ５４９細胞を２５、５０、１００、２０
０および４００ｎＭ濃度のオリゴマー化合物で処理し、
全細胞ＲＮＡを４Ｍグアニジウムイソチオシアネート中
での溶解、続いての塩化セシウム濃度勾配により単離し
た。全ＲＮＡ（１５〜３０μｇ）を１．１％ホルムアル
デヒド含有１．２％アガロースゲルで分離し、ナイロン
膜へ移した。ブロットは次にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｓｄ
ａ，ＭＤ）から得られたウシＰＫＣ−α ｃＤＮＡとハ
イブリダイズさせた（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、１９８
６）。ｃＤＮＡプローブは市販品として入手可能なキッ
ト（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、その使用説明書に従うラ
ンダムプライマー標識により［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで³²
Ｐ放射標識された。フィルターはＱｕｉｋｈｙｂ溶液
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中、６８℃で６０分ハイブリ
ダイズされた。続いて室温で弱いストリンジェンシー洗
浄が２回（２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ）、および６０
℃で強いストリンジェンシー洗浄が２回（０．１ｘＳＳ
Ｃ／０．１％ＳＤＳ）行われた。ハイブリダイズしたバ
ンドはＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒを用いて可視化お
よび定量された。ブロットは次に沸騰させることにより
放射活性を取り除き、等量のＲＮＡが負荷されたことを
確認するため³²Ｐ標識グリセロール−３−リン酸デヒド
ロゲナーゼプローブ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で再探査され
た。２’−フルオロ−５−メチルウリジン含有オリゴマ
ー化合物である配列ＩＤ番号：２９は、同一の場所にチ
ミジンを含むオリゴマー化合物である配列ＩＤ番号：２
７と比較すると１０倍の効力の増加を示した。配列ＩＤ
番号：２９はまた配列ＩＤ番号：２８と比較すると測定
できるほどの効力の増加を示した。

【０１７０】実施例４９ インビトロＨＩＶ阻害アッセイ ＨＩＶ ｒｅｖ蛋白質の発現を阻害するオリゴヌクレオ
チドを同定するためにインビトロトランスフェクション
アッセイが使用された。このアッセイの時間は４日間で
ある。マウス胎児線維芽細胞株（３Ｔ３）を１０％ウシ
胎児血清、グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥ
Ｍ（高グルコース）中で対数増殖期に維持した。

【０１７１】プラスミド構築：ｐＨＩＶ ｅｎｖ−ｌｕ
ｃは以下のように構築された。ヒト免疫不全ウイルス
タイプ１エンベロープ遺伝子を含むｐＢＨ１０（２０）
の３．１Ｋｂ Ｓａｌｌ／Ｘｈｏｌ断片（単離物ＢＨ１
０）（ヌクレオチド５１２０〜８２６０）をｐＭＡＭＢ
ａｍプラスミドのＸｈｏｌ部位へ結合させてｐＭＡＭＨ
ＩＶｅｎｖを得た。ｐＭＡＭＢａｍベクターは８．３Ｋ
ｂ ｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の
ＢａｍＨＩ消化物をゲル精製することにより得られた。
ＢａｍＨＩ部位は４つのｄＮＴＰ全ての存在下でクレノ
ーポリメラーゼで末端を充填し、続いて結合させること
により破壊された。ｐＭＡＭＨＩＶ−ｅｎｖは独特のＢ
ａｍＨＩ部位で切断され、４つのｄＮＴＰ全ての存在下
でクレノーポリメラーゼで末端が充填され、再結合され
た。この過程はｅｎｖ遺伝子のＲｅｖコード部分を不活
性化するフレームシフト突然変異を導入する。最後に、
ＳａｌＩ／ＳａｌＩルシフェラーゼコード化レポーター
遺伝子がＨＩＶ配列の上流の独特なＳａｌＩ部位へクロ
ーン化され、突然変異したｒｅｖ遺伝子を有する最終構
築物ｐＨＩＶ ｅｎｖ−ｌｕｃが得られた。

【０１７２】Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼで哺乳類細胞お
よびインビトロの両方でｒｅｖ蛋白質を発現するｐＳＧ
５−ｒｅｖプラスミドの構築のため、ｐＣＶ１からのＰ
ＣＲによりＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ ｒｅｖ ｃＤＮＡ
が調製された。ＰＣＲ断片はＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩ
Ｉで切断され、ベクターｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ部位へサブクローン化さ
れた。ＰＣＲプライマーは下記のものであった：

【０１７３】

【表９】 5'-GCT CGG GAA TTC ATG GCA GGA AGA AGC GGA 5'-CTG GGA GAT CTC TAT TCT TTA GCT CCT GAC TC

【０１７４】Ｒｅｐ６は、構成性ＲＳＶ ＬＴＲの制御
下で完全長グルココルチコイド レセプターを発現する
プラスミドであり、Ｍｉｅｓｆｅｌｄ，Ｒ．ら、Ｃｅｌ
ｌ，１９８６，４６，３８９〜３９９にしたがって調製
された。１日目 ：３Ｔ３細胞を洗浄し、トリパンブルー排除によ
り計数し、６−ウェルマイクロタイタープレートの各々
のウェルにウェル当たり８．５Ｘ１０⁴ 細胞で播種し
た。２日目 ：三つの組換え体プラスミド、ｐＳＧ５、ｐＨＩ
Ｖ ｅｎｖ−ｌｕｃおよびＲｅｐ０６を標準ＣａＰＯ₄
沈澱プロトコール（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．およびｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９７
３，５２，４５６〜４６７）を用いて沈澱させた。Ｃａ
ＰＯ₄ 沈澱ＤＮＡはマウス胎児線維芽細胞へ加え、細胞
は３７℃で７時間インキュベートした。細胞をリン酸緩
衝食塩水で洗浄し、１０％ウシ胎児血清、グルタミンお
よび抗生物質を補充したＤＭＥＭ、および決められた濃
度のオリゴヌクレオチドおよび一連の半対数希釈で３７
℃にて一夜インキュベートした。

【０１７５】３日目：細胞をＯＰＴｉｍｅｎ培地で２回
洗浄し、ウェル当たりＯＰｔｉｍｅｍ培地中２．５ｍｇ
／ｍｌのリポフェクチンおよびオリゴヌクレオチドで３
７℃にて４時間処理した。リポフェクチン／オリゴヌク
レオチド溶液を完全培地に置き換え、細胞は３７℃にて
２時間回復させた。オリゴヌクレオチド処理細胞は次に
デキサメタゾンで処理された。４日目 ：デキサメタゾン処理して２４時間後、細胞を溶
解させルシフェラーゼアッセイが実施される（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）。溶解試
料の蛋白質濃度はブラッドフォード蛋白質アッセイ（Ｂ
ｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
９７６，７２，２４８）を用いて決定される。

【０１７６】実施例５０ オリゴヌクレオチド８４６９のインビボ活性 皮下（ｓ．ｃ．）移植ヒト肺腺癌Ａ５４９を持つメスＢ
ａｌｂ／ｃヌードマウスがオリゴヌクレオチド８４６９
−３、配列ＩＤ番号：３およびベヒクル（食塩水）で処
理された。処理は９日で始め、一日一回３３日間続けら
れた。二つの用量投与計画で研究された：一つは６．０
ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｖ．およびもう一つは０．６ｍｇ／ｋ
ｇ ｉ．ｖ．である。連続的に経過した（３＋回）皮下
腫瘍の生存能力のある断片（２５〜５０ｍｇ）を套管針
により一つのわき腹に皮下で研究動物内へ再移植する。
断片が約１００ｍｇに達したら（５〜１５日後）処理を
始める。対照腫瘍が１グラムの大きさに達するまで（す
なわち、２〜４週間）動物を週当たり３から７回静脈内
（ｉ．ｖ．）で処理する。腫瘍の大きさは週に１または
２回、カリパスで測定する。結果は二つの用量投与計画
で腫瘍増殖の著しい減少を示しており、６．０ｍｇ／ｋ
ｇは０．６ｍｇ／ｋｇよりも遅い増殖速度を与える。

【０１７７】実施例５１ ＰＫＣ−α ｍＲＮＡレベルに対するオリゴマー化合物
の影響 Ａ５４９細胞を上記のようにオリゴマー配列ＩＤ番号：
１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３を用い、
陽イオン性脂質ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ存在下、１００か
ら４００Ｎｍの用量で４時間処理し、洗浄してさらに２
０時間回復させる。全ＲＮＡを抽出し、各々の２０μｇ
を１．２％ゲルで分離し、ナイロン膜へ移した。これら
のブロットは³²Ｐ放射性標識ＰＫＣ−α ｃＤＮＡプロ
ーブで探査し、次に取り除き、等量のＲＮＡ負荷を確認
するため放射性標識Ｇ３ＰＤＨプローブで再探査した。
ＰＫＣ−α転写体はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａ
ｌｅ ＣＡ）で試験し定量した。ＰＫＣ−αに対して活
性であることが知られているホスホロチオエートオリゴ
ヌクレオチド標品はこのアッセイにおいて約１７５ｎＭ
のＩＣ₅₀を持っている。改良された活性を示す化合物は
試験標品よりも高い活性、例えば１７５ｎＭより低いＩ
Ｃ₅₀を持つであろう。ＰＫＣ−α配列への試験化合物の
高い特異的結合はまた、ベータ、ガンマおよびデルタア
イソザイムのような他のＰＫＣアイソザイムのｍＲＮＡ
からＰＫＣ−α ｍＲＮＡを区別するのに使用できる。

【０１７８】実施例５２ インビボでのｒａｓ発現のノーザンブロット分析 上記のように２．５μＬのＤＯＴＭＡを含むＯｐｔｉ−
ＭＥＭ減少血清培地中で、細胞をオリゴマー配列ＩＤ番
号：１、配列ＩＤ番号：２および配列ＩＤ番号：３で処
理する。オリゴマーは所望の濃度まで加えられる。処理
して４時間後、培地をオリゴヌクレオチドを含まない培
地に置き換える。オリゴマー処理して４８時間後に細胞
を採取し、標準ＣｓＣｌ精製法を用いてＲＮＡを単離す
る。Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎ
ｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，
Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎおよび
Ｋ．Ｓｔｒａｈｌ編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ
Ｓｏｎｓ，ＮＹ。

【０１７９】ＲＮＡは各々のＲＮＡの１０μｇを用いる
ノーザンハイブリダイゼーション分析により分析する。
ＲＮＡは１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで
電気泳動され、標準法を用いて一夜ＧｅｎｅＢｉｎｄ
４５ナイロン膜（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）へ移される。Ｋｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｆ．
Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎ
ｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔ
ｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒａｈｌ
編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎ
Ｙ。ＲＮＡは膜へＵＶ−架橋された。二本鎖³²Ｐ標識プ
ローブがＰｒｉｍｅａ Ｇｅｎｅ標識キット（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて合成される。
ｒａｓプローブは活性化（突然変異体）Ｈ−ｒａｓ ｍ
ＲＮＡのｃＤＮＡクローンのＳａｉＩ−ＮｈｅＩ断片で
あり、コドン１２でのＧＧＣ−から−ＧＴＣの突然変異
を持っている。対照プローブはＧ３ＰＤＨである。ブロ
ットは６８℃にて１５分、ＱｕｉｃｋＨｙｂハイブリダ
イゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ，ＣＡ）で前ハイブリダイゼーションさせた。１
００μＬの１０ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡと混合した熱
変性放射活性プローブ（２．５ｘ１０⁶ カウント／２ｍ
ｌハイブリダイゼーション溶液）を加え、膜は６８℃に
て１時間ハイブリダイズさせた。ブロットは２回室温で
１５分２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで、および１回６０
℃で３０分０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄し
た。ブロットのオートラジオグラフィーを行い、Ｉｍａ
ｇｅＱｕａｎｔ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌ
ｅ，ＣＡ）を用いて信号の強度を定量した。ノーザンブ
ロットはｒａｓプローブと最初にハイブリダイズされ、
０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分煮沸するこ
とにより取り除いた後、正確な試料負荷を検査するため
に対照Ｇ３ＰＤＨプローブで再ハイブリダイズされた。

【０１８０】本明細書で述べられている公表された文献
は、本明細書においてその全文が援用される。当業者は
本発明の好適な態様に対して多くの変更および修正がで
きること、およびそのような変更および修正が本発明の
精神から離れることなくなされることを理解するであろ
う。従って、付随する特許請求の範囲はすべての均等な
変形を本発明の真の精神および範囲にあるとして包摂す
ることが意図されている。

【配列表】 配列番号1: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:1: GGACCGGAAG GTACGAG 17 配列番号2: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:2: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号3: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:3: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号4: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:4: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号5: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:5: GGACCGGAAG GTACGAG 17 配列番号6: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:6: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号7: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:7: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号8: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:8: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号9: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:9: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号10: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:10: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号11: (i)配列の特性: (A) 長さ: 12塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:11: CUAAGCAUGU CA 12 配列番号12: (i)配列の特性: (A) 長さ: 15塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:12: CGACTATGCA AGTAC 15 配列番号13: (i)配列の特性: (A) 長さ: 15塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:13: CGACTATGCA AGTAC 15 配列番号14: (i)配列の特性: (A) 長さ: 15塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:14: CGACTATGCA AGTAC 15 配列番号15: (i)配列の特性: (A) 長さ: 15塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:15: CGACTATGCA AGTAC 15 配列番号16: (i)配列の特性: (A) 長さ: 15塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:16: CGACTATGCA AGTAC 15 配列番号17: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:17: GGACCGGAAG GTACGAG 17 配列番号18: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:18: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号19: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:19: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号20: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:20: GGACCGGAAG GUACGAG 17 配列番号21: (i)配列の特性: (A) 長さ: 17塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:21: GGACCGGAAG GTACGAG 17 配列番号22: (i)配列の特性: (A) 長さ: 18塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:22: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 配列番号23: (i)配列の特性: (A) 長さ: 18塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:23: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 配列番号24: (i)配列の特性: (A) 長さ: 18塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:24: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 配列番号25: (i)配列の特性: (A) 長さ: 18塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:25: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 配列番号26: (i)配列の特性: (A) 長さ: 18塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (xi)配列: SEQ ID NO:26: TGGGAGCCAT AGCGAGGC 18 配列番号27: (i)配列の特性: (A) 長さ: 20塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)配列の種類: 核酸類似体 (xi)配列: SEQ ID NO:1: GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA 20 配列番号28: (i)配列の特性: (A) 長さ: 20塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)配列の種類: 核酸類似体 (xi)配列: SEQ ID NO:2: GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA 20 配列番号29: (i)配列の特性: (A) 長さ: 20塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii)配列の種類: 核酸類似体 (xi)配列: SEQ ID NO:3: GUU CUC GCT GGT GAG UUU CA 20

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18 35/00 35/00 (72)発明者 サングーヴィ，ヨゲシュ・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, エンシニタス，ワンダーリング・ロード 2169 (72)発明者 スプランクル，ケリー・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州92083, ヴィスタ，シカモア・アベニュー 920, アパートメント ナンバー61 (72)発明者 ロス，ブルース・エス アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ラス・ミエンテス・レー ン 7942 (72)発明者 グリフィー，リッチ・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州92084, ヴィスタ，バースビー・ストリート 360 (72)発明者 スプリンガー，ロバート・エイチ アメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，サウザンプトン 2719

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中：Ｑは、その１位で糖部分と結合しているピリミ
   ジン塩基または２−Ｓピリミジン塩基であり；Ｒ¹ は、
   置換または非置換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アル
   ケニル、Ｃ₁〜Ｃ₃₀アルキニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリールま
   たはＣ₇ 〜Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置換基はハ
   ロ、アミノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたは
   チオエーテルである；およびＲ² およびＲ³ は、独立し
   て水素またはヒドロキシル保護基である］の２' −Ｏ−
   置換ピリミジンヌクレオシドの合成法であって、 ２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドを提供
   し；式Ｒ¹ −ＯＨのアルコールを選択し；そして該２−
   ２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドおよび該アル
   コールを該２' −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシドを得
   るのに有効な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸
   で処理する；の各工程を含む方法。
2. 【請求項２】 該２' −Ｏ−置換ピリミジンヌクレオシ
   ドが式： 【化２】 ［式中：Ｒ¹ 、Ｒ² およびＲ³ は、請求項１に定義した
   通りであり；Ｘ' は、ＯまたはＳであり；Ｒ⁵ およびＲ
   ⁶ は、独立してＨ、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置
   換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒドロカルビルである］の化合物であり；
   そして、 該２−２' −アンヒドロピリミジンヌクレオシドが式： 【化３】 ［式中：Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｘ' 、Ｒ⁵ およびＲ⁶ は、先に定
   義した通りである］の化合物である、請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 該２−２' −アンヒドロピリミジンヌク
   レオシドおよび該アルコールが圧力封入容器内で処理さ
   れる請求項第１項に記載の方法。
4. 【請求項４】 該ルイス酸がホウ酸エステルである請求
   項第１項に記載の方法。
5. 【請求項５】 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキル
   である請求項第４項に記載の方法。
6. 【請求項６】 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ( ＯＲ¹)
   ₃ である請求項第５項に記載の方法。
7. 【請求項７】 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を
   アルコールで処理して製造される請求項第６項に記載の
   方法。
8. 【請求項８】 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素を
   式ＨＯ−Ｒ¹ のアルコールで処理して製造される請求項
   第７項に記載の方法。
9. 【請求項９】 Ｒ¹ がＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである請求項
   第１項に記載の方法。
10. 【請求項１０】 Ｒ¹ がＣ₆ 〜Ｃ₁₄アリールである請求
    項第１項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 該処理が約１２０℃から約２００℃で
    の加熱を含む請求項第１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】 該ピリミジンヌクレオシドがウリジン
    または５−メチルウリジンである請求項第１項に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 式： 【化４】 ［式中：Ｘ' は、ＯまたはＳであり；Ｒ¹ は、置換また
    は非置換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀アルケニル、
    Ｃ₁〜Ｃ₃₀アルキニル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₄アリールまたはＣ₇
    〜Ｃ₃₀アラルキルであり、ここで該置換基はハロ、アミ
    ノ、ヒドロキシル、チオール、エーテルまたはチオエー
    テルである；Ｒ² およびＲ³ は、独立して水素またはヒ
    ドロキシル保護基であり；Ｒ⁵ およびＲ⁶ は、独立して
    Ｈ、Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒドロカルビルまたは置換Ｃ₁ 〜Ｃ₃₀ヒ
    ドロカルビルである］の２' −Ｏ−置換シチジンヌクレ
    オシドの合成法であって、式： 【化５】 の２−２' −アンヒドロウリジンヌクレオシドを提供
    し；式Ｒ¹ −ＯＨのアルコールを選択し；該２−２' −
    アンヒドロウリジンヌクレオシドおよび該アルコールを
    該２' −Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを得るのに有効
    な時間、温度および圧力の条件下、ルイス酸で処理し；
    そして該２' −Ｏ−置換ウリジンヌクレオシドを該２'
    −Ｏ−置換シチジンヌクレオシドへアミノ化する；の各
    工程を含む方法。
14. 【請求項１４】 該２−２' −アンヒドロウリジンヌク
    レオシドおよび該アルコールが圧力封入容器内で処理さ
    れる請求項第１３項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該ルイス酸がホウ酸エステルである請
    求項第１３項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 該ホウ酸エステルがホウ酸トリアルキ
    ルである請求項第１５項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 該ホウ酸トリアルキルの式がＢ( ＯＲ
    ¹)₃ である請求項第１６項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素
    をアルコールで処理して製造される請求項第１６項に記
    載の方法。
19. 【請求項１９】 該ホウ酸トリアルキルが水素化ホウ素
    を式ＨＯ−Ｒ¹ のアルコールで処理して製造される請求
    項第１８項に記載の方法。
20. 【請求項２０】 Ｒ¹ がＣ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルである請求
    項第１３項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 Ｒ¹ がＣ₆ 〜Ｃ₁₄アリールである請求
    項第１３項に記載の方法。
22. 【請求項２２】 該処理が約１２０℃から約２００℃で
    の加熱を含む請求項第１３項に記載の方法。
23. 【請求項２３】 該２' −Ｏ−置換シチジンヌクレオシ
    ドが２' −Ｏ−メチル−５−メチルシチジンである請求
    項第１３項に記載の方法。