JP2000513578A - ニンジン抗凍結ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規な抗凍結ポリペプチドをニンジンから単離することができる。これらのペプチドは、商品、例えば菓子製品に好ましい影響を与えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ニンジン抗凍結ポリペプチド発明の属する技術分野 本発明は、抗凍結ポリペプチド（ＡＦＰ）およびＡＦＰを含有する食品に関す る。発明の背景 抗凍結ポリペプチド（ＡＦＰ）は、食料品の凍結寛容性を改良するために示唆 されてきた。 本発明の目的のためには、ＡＦＰという用語は、当業界で周知のとおりの意味 、すなわち氷晶（氷結晶）の成長を阻害するタンパクという意味を有する。例え ば、米国特許第５，１１８，７９２号を参照されたい。 ＷＯ９０／１３５７１は、化学的に、または植物から組換えＤＮＡ技術により 生産された抗凍結ペプチドを開示する。これらのＡＦＰは、アイスクリームのよ うな食品において好適に用いることができる。例３Ｂは、ウォーターアイス混合 物を０.０１重量％のＡＦＰと組み合わせてフィルム状に凍結させた場合に改変 された氷晶形を示す。 ＷＯ９２／２２５８１は、アイスクリームにおいて氷晶形を制御するために用 いることができる植物由来のＡＦＰを開示する。この出願は、植物細胞を破裂さ せることなく抽出媒体を用いて葉を浸透させることによる、植物の細胞外腔から のポリペプチド組成物の抽出方法をも記載する。 ＷＯ９４／０３６１７は、酵母からのＡＦＰの生産およびそのアイスクリーム における可能性のある用途を開示する。ＷＯ９６／１１５８６は、微生物により 生産される魚ＡＦＰを開示する。 しかし、現在まで、ＡＦＰの用途は、市販されている消費者製品に適用されて いない。これについての１つの理由は、ＡＦＰを得るためのコストの高さおよび 方法の複雑さである。別の問題は、ＡＦＰの供給源が、充分な量で入手すること が困難であるか（例えばＡＦＰを含有する魚）、または食品における用途に直接 的に好適ではないことである。 本発明は、豊富な天然供給源から容易に得ることができ、それが用いられる製 品に良好な特性を提供するという利点を有する新規な抗凍結ポリペプチドを提供 することを目的とする。 良好な再結晶阻害特性を有する抗凍結ポリペプチドを、ニンジンから得ること ができることが見出された。特に、ニンジンから得られた抗凍結ポリペプチドは 、他の根菜類から単離されたポリペプチドと比較して顕著によい特性を示すこと が見出された。特に、本発明の抗凍結ポリペプチドは、氷晶の結晶形を有意に変 化させずに良好な再結晶阻害特性を提供することができ、それによって、例えば ソフトアイスクリームの、より好ましい特性をもたらし得る。 本出願人は、ニンジン由来の有効な抗凍結ポリペプチドが、一般にＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥで３６ｋＤａの見かけの分子量を有することを特徴とすることを見出した 。したがって、第一の側面においては、本発明は、ニンジンから得ることができ 、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで３６ｋＤａの見かけの分子量を有する抗凍結ポリペプチド に関する。 これに関連して、当業者には、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける変動のため、 見かけの分子量は結果においていくらかの変動を伴って決定され得るにすぎない ことは明らかであろう。本発明の目的のためには、これらの変動、例えば３０〜 ４０ｋＤａまたは３４〜３８ｋＤａの変動もまた、「３６ｋＤａの見かけの分子 量」という文言の範囲内に包含される。 本出願人は、本発明にしたがった有効な抗凍結ポリペプチドが、例において示 したようなアミノ酸配列を有するフラグメントを含むことも見出した。 したがって、第二の側面においては、本発明は、以下のアミノ酸配列を有する １またはそれ以上のフラグメント（Ａ〜Ｅ）を含むポリペプチドに関する： 好ましくは、本発明のＡＦＰは、部分配列（Ａ〜Ｅ）の全部を含む。 本発明の好ましいＡＦＰの完全アミノ酸配列を、以下に示す。したがって、第 三の側面においては、本発明は、配列表Ｉに示すアミノ酸配列を有する抗凍結タ ンパクに関する： 本発明の範囲に同様に包含されるのは、抗凍結特性をなお有する上述のポリペ プチドのアイソフォームおよび誘導体である。好ましくは、誘導体は、配列表１ のポリペプチドまたは部分配列(Ａ〜Ｅ)を含むポリペプチドと少なくとも７５％ の相同性を有し、より好ましくは８５％を超える相同性を有し、最も好ましくは ９５％を超える相同性を有する。本発明の目的のためには、誘導体という用語は 、抗凍結特性をなお有する改変されたポリペプチド、例えば上述のポリペプチド のグリコシル化形態をも包含する。 本発明の範囲に同様に包含されるのは、上述のアミノ酸をコードするヌクレオ チド配列である。特に、本発明は、配列表１のヌクレオチド配列およびそれらの アリル（allele；対立遺伝子）に関する。 本発明の範囲に同様に包含されるのは、抗凍結ペプチドをコードする関連遺伝 子にハイブリダイズすることができるコード領域に由来するヌクレオチドフラグ メントである。 本発明のタンパクは、ニンジンから容易に直接単離することができるが、本発 明において記載したタンパクを生産するために遺伝子操作技術も用いることがで きる。 適切な宿主細胞または生物を、望ましいポリペプチドをコードする遺伝子構築 物で形質転換し得る。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写およ び翻訳に必要な要素を含む好適な発現ベクターに、それらが適切な条件下で発現 されるようにして（例えば正しい方向および正しいリーディングフレームで、お よび適切な標的化（ターゲティング）および発現配列とともに）、挿入すること ができる。これらの発現ベクターを構築するために必要な方法は、当業者には周 知である。 ポリペプチドコード配列を発現させるために多数の発現系を用いることができ る。これらとしては、適切な発現ベクターで形質転換された、細菌、酵母、昆虫 細胞系、植物細胞培養系および植物が挙げられるが、それらに限られない。この ような関係においては、酵母、植物および植物培養系が好ましい。 非常に種々の植物および植物細胞系を、ポリペプチドの核酸構築物で形質転換 することができる。好ましい態様としては、トウモロコシ、トマト、タバコ、ニ ンジン、イチゴ、ナタネおよびサトウダイコンが挙げられるが、それらに限られ ない。 本発明の１つの好ましい態様は、植物の霜耐性を増強するための本発明のＡＦ Ｐの用途に関する。これは、例えば上述の方法により行うことができ、それによ って、植物は形質転換されて本発明のＡＦＰの（増大された）産生を確実に行い 、それによりその植物の霜耐性が増強される。 本発明は、本発明のポリペプチド（のエピトープ）に特異的に結合する抗体に も関する。同様に包含されるのは、上述のポリペプチドに対する抗体との交差反 応性により決定されるこれらのポリペプチドに免疫学的に関連するポリペプチド である。 上記の情報に基づいて、他の天然供給源を、本明細書において上で同定したよ うな有利なＡＦＰを生産するように遺伝的に改変することも可能である。 好ましくは、有意な氷再結晶阻害特性を有するＡＦＰが、選択される。再結晶 阻害特性を決定するための好適な試験を、例Ｉに示す。同様に、本発明にしたが った好ましいＡＦＰは、再結晶に際し、５０μｍ未満、より好ましくは５〜４０ μｍの凍結晶における氷粒子サイズ（平均結晶長）を提供する。 ＡＦＰは、いくつかの品、好ましくは凍結された、または凍結されることを意 図された食品において、好都合に用いることができる。天然に存在するレベルで ＡＦＰを含有するニンジンは、本発明の範囲に包含されない。しかし、ニンジン （の部分）を含む食品は、この本発明に包含される。同様に包含されるのは、本 発明のＡＦＰを過剰発現するように形質転換されているニンジン、すなわち形質 転換されていないニンジンより有意に高いレベルでＡＦＰを含有するニンジンで ある。 このような食晶の例としては、以下のものが挙げられる：野菜のような冷凍食 品、ソース、スープ、スナック、アイスクリームまたはウォーターアイスのよう な冷凍菓子製品、乳製品等。 ＡＦＰが用いられる好ましい品は、冷凍野菜、またはアイスクリームまたはウ ォーターアイスのような冷凍菓子製品である。好ましくは、ＡＦＰのレベルは、 最終製晶に基づいて０.００００１〜０.５重量％である。 乾燥ミックスまたは濃縮物を用いる場合、濃度は、最終製品におけるレベルが 上述の範囲内であることを確実にするために、これより高くてもよい。驚くべき ことに、本発明の組成物は非常に低い量のＡＦＰを含有し、なおかつ良好な品質 であることができることが見出された。 ＡＦＰの好ましいレベルは、０.００００１〜０.５重量％、より好ましくは０ .００００５〜０.３重量％、最も好ましくは０.０００１〜０.２重量％である。 本発明の目的のためには、精製形態のＡＦＰを食品に添加することは必要では ない。ＡＦＰを含有する組成物、例えばＡＦＰを産生する天然物質の抽出物を添 加することも可能である。食品を、例えば食晶中でＡＦＰを産生することができ る遺伝的に改変された微生物を添加することにより、インサイチュでＡＦＰが産 生されるように改変することも可能である。さらに、食品（例えば野菜）を、（ 野菜）それ自身においてそれがインサイチュでＡＦＰを産生し得るように遺伝的 に改変することさえ可能である。 本発明の目的のためには、「冷凍菓子製品」という用語には、ミルク含有冷凍 菓子、例えばアイスクリーム、フローズンヨーグルト、シャーベット、ソルベ、 アイスミルクおよびフローズンカスタード、ウォーターアイス、グラニタおよび フローズンフルーツピューレが含まれる。 好ましくは、冷凍菓子製品中の固形物（例えば糖、脂肪、香料等）のレベルは 、３重量％を超え、より好ましくは１０〜７０重量％、例えば４０〜７０重量％ である。 本発明の冷凍菓子製品は、冷凍菓子の製造に適する任意の方法によって生産す ることができる。しかし、特に好ましくは、処方のすべての成分を、冷凍プロセ スを開始する前に充分に混合する。 例例Ｉ ニンジン（Daucus carota cv Autumn King）を、個別のポット中で生育させた 。植物がおよそ１２週齢になった時、植物を低温室に移し、寒冷気候順化のため に定常光下で４週間、４℃に維持した。植物には、週３回、水やりをした。 ニンジンの新鮮組織を、氷中に保った等量の緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２０ｍＭアスコルビン酸、トリスでｐＨ７．４に緩衝化したもの）中で、ペッス ルおよびモルタル（４℃に冷却したもの）を用いてすりつぶした。このホモジネ ートを、１層のモスリンを通してろ過し、さらに使用するまで氷中に維持した。 比較として、いくつかの他の根菜を生育させ、上述のように根からホモジネー トを調製した。 抗凍結活性を、「スプラットアッセイ（splat assay）」（Knight et al.,198 8）の変法を用いて測定した。３０％（Ｗ／Ｗ）スクロース中の２.５μｌの試験 対象溶液を、適切にラベルした清浄な１６ｍｍ円形カバースリップ上に移した。 第二のカバースリップを溶液の液滴の上に置き、このサンドイッチを指の間で圧 迫した。このサンドイッチをドライアイスの箱の中で−８０℃に保ったヘキサン 浴中に入れた。すべてのサンドイッチの調製が完了したとき、サンドイッチを、 ドライアイスで予め冷却したピンセットを用いて−８０℃のヘキサン浴から−６ ℃に保ったヘキサン含有観察室（viewing chamber）に移した。−６℃に移した 際、サンドイッチは、透明から濁った外観に変化するのが見られた。画像をビデ オカメラで記録し、２０倍の対物レンズを用いて画像解析システム(ＬＵＣＩＡ 、Nikon)にかけた。各スプラットの画像を、時間（ｔ）＝０に、および再び３０ 〜６０分後に記録した。両アッセイにおける氷晶のサイズを比較した。ｔ＝０で のサイズと比較して、３０〜６０分でのサイズが同様であるか、または中程度に しか増大していない（例えば２０％未満の増大、より好ましくは１０％未満の増 大、最も好ましくは５％未満の増大）場合、これは、良好な氷晶再結晶阻害特性 の表示である。 結果： サンドイッチスプラットアッセイ試験から、ニンジン根、ニンジン茎およびニ ンジン葉からの試料が有意な氷再結晶阻害特性を有し、根および葉がもっとも活 性が高いと思われた。比較として、気候順化しなかったニンジン根の試料を試験 したが、これは有意に劣った活性を示した。以下の例については、ニンジンに関 してさらに試験するために根組織を用いた。 比較としていくつかの他の野菜の根を３０％スクロース中でのサンドイッチス プラットアッセイ試験の手段により調べた。これらの野菜としては、カブ、ケー ル、芽キャベツ、ウィンターグリーン・キャベツ、ナタネ、パク・チョイ（体菜 ）、パースニップおよびイチゴが含まれていた。これらの供給源のいずれもが、 有意な氷再結晶阻害活性を与えなかった。例II ニンジン根組織を、３倍容量（ｗ／ｖ）の緩衝液（２０ｍＭ アスコルビン酸 、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリス／ＨＣ１、ｐＨ７．２）中で、予め冷 却したペッスルおよびモルタルでホモジナイズし、１層のモスリンを通してろ過 した。ろ液を、６，０００×ｇで、４℃で１０分間、遠心分離した。上清を集め 、１００,０００×ｇで４℃で１時間遠心分離した。この工程から得たこの１０ ０，０００ｇ上清を可溶性画分、ペレットをミクロゾーム画分と呼ぶ。 上清を、グラディフラック（Gradifrac）低圧クロマトグラフィシステム（Pha rmacia）により制御されたハイロード（HiLoad）ポンプＰ−５０により５ｍｌ／ 分の流速で供給した５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で予め平衡化させた ３０ｍｌのファスト・フローＱ（fast flow Ｑ）セフアロース（Sepharose）カ ラム（Pharmacia）に４℃で適用し、溶出液をＵＶモニター（モニタ−ＵＶ１、P harmacia）によりＯＤ２８０で監視してチャートレコーダー（ＲＥＣ１０２、Ph armacia）で記録した。５ｍｌ画分を集めた。カラムを、同じ流速の５０ｍＭト リス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、ＯＤ２８０が０に戻るまで洗浄した。次に、トリ ス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４中の０〜０.４Ｍ ＮａＣｌグラジエント（１５０ｍｌ ）を適用し、続いて２Ｍ ＮａＣｌでカラムを洗浄した。溶出液画分を、例１に おけるようにスプラットアッセイに供した。 再結晶阻害により明らかにされた抗凍結活性を含有する画分をプールし、以下 のようにしてポリエチレングリコールを用いて濃縮した。すなわち、画分を、水 道水で洗浄しておいた１０ｋＤａカットオフの透析チューブ（Sigma）に移し、 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で１０分間煮沸して、ミリＱ水ですすいだ。 濃縮すべき試料を含有する透析チューブを、分子量１５,０００〜２０,０００の 固体のポリエチレングリコール化合物（Sigma）でカバーし、４時間まで、また は透析チューブ内の試料容量が１０倍まで減少するまで、４℃でインキュベート した。 Ｑセファロースカラムからのプールした濃縮物を、フェニルセファロースカラ ム、ＳＭＡＲＴ スーパーデックス（superdex）７５ゲル透過カラム、またはＦ ＰＬＣ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル透過カラムのいずれかに適用した。 ニンジン根の抗凍結タンパクを、以下のようにしてゲル透過クロマトグラフィ により精製した。 試料の２０μｌアリコートを、流速４０μｌ／分で０.１５Ｍ ＮａＣｌを含 有する５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．４（緩衝液Ｅ）中で予め平衡化させた ＳＭＡＲＴ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル透過カラム（Pharmacia）に適用し、 平衡化緩衝液中で同じ流速のゲル透過により成分を分離した。溶出液を、ＯＤ２ ８０およびＯＤ２１５で監視した。０.８５および０.８９ｍｌの間で８０μｌ画 分、０.８９および１.２４ｍｌの間で４０μｌ画分、１.２４および３.０ｍｌの 間で１００μｌ画分を集めた。カラムのボイド容（Ｖｏ）は、ブルーデキストラ ン溶液の保持容量により決定したところ、０.９１ｍｌであった。スーパーデツ クスカラムは、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ〔分子量６６ｋＤａ、保持（Ｖｅ）＝１. ０２ｍｌ）、３ｍｇ／ｍｌカルボニックアンヒドラーゼ（分子量２９ｋＤａ、Ｖ ｅ＝１.２２ｍｌ）、２ｍｇ／ｍｌチトクロームＣ（分子量１２.４ｋＤａ、Ｖｅ ＝１.４１ｍｌ）、および２ｍｇ／ｍｌアプロチニン（分子量６.５ｋＤａ、Ｖｅ ＝１.５９ｍｌ）を含有する１０μｌの溶液を適用することにより較正し、分子 量の対数に対するＶｅ／Ｖｏの標準曲線をプロットした。抗凍結活性を含有する 画分を、例Ｉに記載したスプラットアッセイにより同定し、１.１６ｍｌの保持 容量および４０ｋＤａの見かけの分子量を示した活性ピークが存在した。これら の測定により、寒冷気候順化ニンジン由来の３６ｋＤａのバンドが抗凍結ペプチ ドであることが確認された。 Ｂｉｏｒａｄ ｍｉｎｉシステムを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）にし たがってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すべき試料を、Ｓ ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（Laemmli 1970）中に溶解し、ドライヒートブロック （Techne）上で１００℃で５分間加熱し、室温で１０,０００×ｇで３分間遠心 分離した。試料（１０〜５０μｌ）を、ミニゲル〔Biorad、０.７５、１.０また は１.５ｍｍ厚、１０、１２、１５％アクリルアミドまたは１０〜２０％グラジ エントアクリルアミド（Bioradのプレポアド）〕に適用し、電気泳動により分離 した。分離されたポリペプチドを、ゲル中で、クマシーブルー〔０.１％（Ｗ／ Ｖ）クマシーブリリアントブルー、酢酸／メタノール／ミリＱ水（５：４：３１ 、容量比）中〕で固定および染色し、またはＢｉｏｒａｄ銀染色キットを用いて 製造者の指示書にしたがって銀染色した。ゲルを、Ｂｉｏｒａｄ ゲライア（Ge lair）ドライヤー中で２枚のＧｅｌａｉｒセロハンのシートの間で、製造者の指 示書にしたがって乾燥した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での見かけの分子量の決定のた めには、Ｓｉｇｍａの高分子量および低分子量範囲の分子量マーカーキットを製 造者の指示書にしたがって使用した。 寒冷気候順化させたニンジン根および寒冷気候順化させていないニンジン根を 用いて、イオン交換クロマトグラフィを行った。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル は、寒冷気候順化試料中の３６ｋＤａバンドの存在を示した。このバンドは、寒 冷気候順化されていない根においてははるかに微量であった。したがって、この ３６ｋＤａバンドに抗凍結活性の原因が帰属された。例III タンパク配列決定のために、約３６ｋＤａのニンジン根タンパクを前記の例に 記載したように精製し、次いで、更なる精製を確実にするために、配列決定すべ き試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出して、ポリアクリルアミドゲルのスラ イス中でインサイチュでタンパク分解的に消化した。 約３６ｋＤａのほとんど純粋なタンパクの調製物（いくらかの少量の夾雑タン パクをなお含んでいた）を、１２％ポリアクリルアミドゲルに付した。各々２μ ｇのタンパクを３つのレーンに入れ、色素のフロントがゲルの底部に達するまで 、ゲル中を電気泳動させた。次いで、ゲルを０.２％クマシー・ブリリアント・ ブルー（Ｗ／Ｖ）、３０％メタノール（Ｖ／Ｖ）、１％酢酸（Ｖ／Ｖ）中で２０ 分間染色し、次いでタンパクのバンドが見えるようになるまで３０％メタノール で脱色した。３６ｋＤａのバンドは、隣接するレーンに入れた分子量マーカーと 比較することにより同定し、混在するバンドを排除するように注意しながら各レ ーンからのバンドを外科用メスの刃で切り出した。 ゲルのスライスを、清浄なエッペンドルフチューブに移し、０.５ｍｌの５０ ％ アセトニトリル（Ｖ／Ｖ）、１００ｍＭトリス−Ｃｌ、Ｈ８.５を用いて２回洗 浄した。洗浄により、クマシー染色のいくらかが除去され、ゲルスライスが部分 的に脱水された。次いで、ゲルスライスを、チューブから取り出して、有意に縮 んで巻き上がりはじめるまで実験台上で空気中で乾燥した。次に、これらをエッ ペンドルフチューブに戻し、まず、１０μｌの、１μｇのエンドプロテイナーゼ Ｌｙｓ Ｃ（Boehringer Mannheim）を含有する１００Ｍｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ ８.５で再水和した。これは、リジン残基のカルボキシ末端側でポリペプチド鎖 を特異的に切断するプロテイナーゼである。さらに、トリス緩衝液を、ゲルスラ イスが充分に再水和されるまで添加し、次いでゲルスライスを３７℃で１６時間 インキュベートした。 インキュベーション後、１μｌのトリフルオロ酢酸をチューブに添加して反応 を停止させ、次いでゲルスライスを０.３ｍｌの６０％アセトニトリル（Ｖ／Ｖ ）、０.１％ＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）で、３０℃で３０分間、２回洗浄した。これは、 再びケルスライスを部分的に脱水し、それらを縮ませて、生成されたペプチドを 溶出させるためであった。上清を別の清浄なエッペンドルフチューブに移し、次 いで遠心エバポレーター中で２時間、試料がほぼ乾燥するまで乾燥し、０.１％ ＴＦＡで０.１ｍｌの容量に再懸濁した。 次に、ＳＭＡＲＴ微量精製システム（Pharmacia）上で逆相ＨＰＬＣによりペ プチドを分離した。ペプチド消化物を、０.１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）で平衡化した Ｃ１８カラム（２.１×１００ｍｍ）上に流速０.１ｍｌ／分で付した。次いで、 カラムを、０〜７０％の溶媒Ｂ〔９０％アセトニトリル（Ｖ／Ｖ）、０.０８５ ％ＴＦＡ（Ｖ／Ｖ）〕のグラジエントで、同じ流速で７０分間にわたって溶出し た。光学密度（ＯＤ）を２１４ｎｍで監視し、個々のペプチドピークを、手動で 進行させながらフラクションコレクターで集めた。製造者の推奨にしたがって液 相化学サイクルを用いて、モデル４９２ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒタンパクシ ークエンサーにかけることにより、ポリペプチドを配列決定した。 ３６ｋＤａバンド中のいくつかのポリペプチドフラグメント（Ａ〜Ｅ）を解析 した。これらは、以下の配列と実質的に相同な配列を有していた： 例IV−ａ：ニンジン細胞培養 ニンジン細胞懸濁培養株（ＮＯＲ）を、Department of Biochemistry and Mol ecular Biology,University of Leedsから入手した。培養物は、１０ｍｌの培養 物を、２５ｇ／ｌスクロースおよび１ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄを含有する９０ｍｌ の新鮮Murashige and Skoog培地（Sigma）に７日ごとにサブ培養することにより 維持した。培養物は、暗黒下で、２５℃で、旋回振とうインキュベーター中で１ ５０ｒｐｍでインキュベートした。 ＮＯＲ培養物を、以下のようにして寒冷処理した。 ＮＯＲ培養物を、２５℃で４日および７日生育させた後、４℃に移した。培養 物を、ｔ＝０、ｔ＝７日およびｔ＝１４日に収穫した。収穫することに加えて、 パック細胞体積（ＰＣＶ）を各時点で各培養物について決定した。 ＮＯＲ懸濁培養の培地試料を、以下のようにして解析した。馴化した懸濁培養 培地の凍結アリコートの約１／１０容量を、解凍した。解凍した（凍結濃縮され た）部分をとり、例Ｉに記載したようなサンドイッチスプラットアッセイにより 活性について試験した。寒冷気候順化させた培養物からの培地は、寒冷気候順化 されていない培養物からの培地よりも有意に高い活性を含むことが見出された。 寒冷気候順化させたＮＯＲニンジン培地を、１００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ 、ｐＨ７.４を添加することにより緩衝化した。次に、活性の精製を、例IIの方 法に基づく方法を用いてイオン交換およびゲル透過クロマトグラフィにより行っ た。緩衝化した培地を、１ｍｌのＱセファロースカラム（Pharmacia）に１ｍｌ ／分の流速で適用し、結合した分子を、０.１Ｍから始まり０.５Ｍまで０.１Ｍ の段階 で増加する濃度のＮａＣｌを含有する５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４の ３ｍｌアリコートで溶出した。１ｍｌの画分を集め、例Ｉに記載したように活性 について試験した。 活性イオン交換画分の抗凍結活性を、以下のようにしてゲル透過クロマトグラ フィにより精製した。上述の画分を、アセトン沈殿に付し、ペレットを５０μｌ の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２中に再懸濁した。 次に、これを、１０,０００×ｇで１０分間遠心し、２０μｌをＰｈａｒｍａｃ ｉａ ＳＭＡＲＴシステムでスーパーデックス７５ゲル透過カラム上に適用した 。流速は、４０μｌ／分であり、移動（mobile）相は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ＋ ０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.２であった。８０μｌの画分を集め、スプラット した。活性は、１.１６ｍｌの保持に相当する画分中に検出された。 活性タンパクのさらなる単離は、例IIのようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により行 うことができる。例IV−ｂ：ニンジン根培養 ニンジン根培養は、以下のようにして開始した。 各々の個別の培養について、１０個の表面滅菌Daucus carote cv Autumn King 種子を、２５０ｍｌの滅菌三角フラスコ中の２５ｇ／ｌスクロースおよび０.５ ｇ／ｌ ＭＥＳを含有する１００ｍｌのＭＳ培地中に置いた。暗黒下で２５℃で ３週間、１５０ｒｐｍで振とうすることにより、種子を発芽させた。次に、葉お よび根を無菌的に採取した。根を、１００ｍｌの新鮮培地中に置き換え、振とう しながら、さらに２週間インキュベートした。 寒冷処理および寒冷処理なしの根培養物から、以下のようにしてホモジネート を調製した。急速冷凍した根を、冷却したモルタルおよびペッスル中で３倍の液 体窒素中ですりつぶし、別の冷却モルタルおよびペッスルに移して、３０％（Ｗ ／Ｗ）スクロースを含有する０.５倍容量の氷冷した５０ｍＭトリス／ＨＣｌ＋ １０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４を用いてすりつぶした。ホモジネートを１０,０ ００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、上清を例Ｉにおけるようにして活性に ついて試験した。寒冷処理根培養物において、寒冷処理なしの根培養物よりも有 意に高い活性が検出された。例Ｖ：アイスクリームの調製 寒冷気候順化ニンジン根からの根抽出物を、冷水中で新しく抜いた（例Ｉのよ うに）寒冷気候順化ニンジンをこすり洗いすることにより調製した。頂部を除去 し、家庭用ジュース抽出器（Russel Hobbs、モデル番号９９１５）を用いてジュ ースを抽出した。ジュースを１リットルのブロックで凍結させて、アイスクリー ム試作における使用のために回収する前に−２０℃で貯蔵した。ニンジンＡＦＰ ジュースを、以下のアイスクリーム処方に添加した。 上記の処方を凍結させ、１０６％超過量までエアレーションすることによりア イスクリームを調製した。 新鮮試料および−１０℃で１０日間の貯蔵により酷使した試料について、測定 を行った。比較として、ニンジン抽出物なしの試料を同様に測定した。測定は、 以下のように行った。 試料を、Ｐｒｏｌａｎ環境キャビネット中で約１２時間、−１８℃で平衡化し た。アイスクリームの各バッチから代表的に３つの試料を選び、各ブロックの中 央からアイスクリームの薄層を顕微鏡スライド上にスメアすることにより、Ｃｒ ｙｏｓｔａｔ温度制御キャビネット中で各々からスライドを調製した。ホワイト スピリットの１滴をスライドに適用し、次いでカバースライドを適用した。各ス ライドを、次に、温度制御した顕微鏡ステージに移した（Leit LaborLux S，Lei ca 10×対物レンズ、温度−１８℃）。氷晶の像（約４００個の氷晶）を集め、 ビデオカメラ（Sanyo ＣＣＤ）を通じて画像保存および解析システム（ＬＥＩＣ Ａ Ｑ520ＭＣ）にリレーした。 保存した氷晶像は、境界線に沿って線を引くことにより手動でハイライトし、 次いでこれが結晶全体をハイライトした。次いで、ハイライトされた結晶の像を 、最も長い直線（長さ）、最も短い直線（幅）、アスペクト比（長さ／幅）を完 成するのに必要な画素の数をカウントする画像解析ソフトウェアを用いて測定し た。アイスクリームの１バッチの各氷晶についてのデータをスプレッドシートに 取り入れて、ここでデータのセットの解析を行って平均および標準偏差を見出し た。 アイスクリーム硬度の測定は、Ｈｏｕｎｓｆｉｅｌｄ Ｈ１０ＫＭユニバーサ ルテスター、Ｈｏｕｎｓｆｉｅｌｄ １００Ｎロードセルおよび１０ｃｍシリン ダー状ステンレススチールプローブを用いて行った。アイスクリーム試料は、− １８℃に設定したＰｒｏｌａｎ温度制御キャビネット中で４８６ｍｌのアイスク リームブロックを１６時間インキュベートすることにより調製した。 アイスクリームブロックをＰｒｏｌａｎ温度制御キャビネットから取り出し、 Ｈｏｕｎｓｆｉｅ１ｄ Ｈ１０ＫＭユニバーサルテスターに置いた。１０ｃｍシ リンダー状プローブをアイスクリームブロックに４００ｍｍ／分の一定速度で２ ０ｍｍの深さまで押し込んだ。加圧の間に記録された最大力を用い、アイスクリ ーム硬度として表現した。試料の亀裂または破砕が観察された場合、これは、右 側の欄に示した。 以下の結果が得られた。 これは、ニンジンＡＦＰが良好な氷再結晶阻害特性を有することを証明する。例VI 例IIIに示したペプチド配列を、縮重オリゴヌクレオチドプライマー設計のた めの適性について解析した。ペプチドＤの部分（ＧＬＹ-ＰＲＯ-ＶＡＬ-ＰＲＯ- ＬＥＵ-ＰＨＥ-ＰＨＥ-ＰＲＯ）を選択し、プライマーｃｐ３（ＧＧＩ ＣＣＩ ＧＴＩ ＣＣＩ ＹＴＩ ＴＴＹ ＴＴＹ ＣＣ、ここでＩ＝イノシンであり、Ｙ＝Ｃ またはＴである）を合成した（Genosys）。 第一鎖ｃＤＮＡを、５μｇの寒冷気候順化（例Ｉのように１ヵ月）させたニン ジン根ＲＮＡから、スーパースクリプト（Superscript）リバーストランスクリ プターゼ（Stratagene）およびオリゴヌクレオチドプライマーＯＧ１〔ＧＡＧＡ ＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧ(Ｔ)¹⁵〕を用いて製造者の指示にしたがって調製し た。続くＰＣＲにおいて、第一鎖ｃＤＮＡ反応物の１％を鋳型として、ｃｐ３お よびＯＧ１プライマーとともに用いた。反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ Gibco ＢＲＬ）を用いて、製造者の指示にしたがって３０サイクル（９４℃で１ 分、５０℃で１分、および７２℃で１分）、サーマルサイクラー中で行った。す べてのプライマーは、１μＭの濃度で用いた。得られた〜８００ｂｐのＰＣＲ生 成物をゲルで精製し、製造者の指示にしたがってｐＴＡｇベクター（Ｒ＆Ｄ Sys tems）中にクローニングした。クローニングされたｃｐ３ ＰＣＲ生成物を、シ ークエナーゼ（Sequenase）キット（ＵＳＢ）を用いるジデオキシ配列決定法を 用いて配列決定した。ｃｐ３ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は、以下 の配列と実質的に同じであった： ニンジンＡＦＰについてのコード領域の全長を得るために、ｃＤＮＡライブラ リーを構築した。ポリ（Ａ）⁺クイックカラム（Stratagene）を用いて、製造者 の指示にしたがって、５００μｇの寒冷気候順化（１ヵ月）ニンジン全ＲＮＡか らｍＲＮＡを精製した。得られたすべてのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成 およびラムダＺＡＰベクターキット（Stratagene）を用いるその後のライブラリ ー構築のために使用した。ｃｐ３ ＰＣＲ生成物を³²Ｐ標識プローブとして用い て、ハイブリダイゼーションにより１×１０⁵個の組換えファージクローンをス クリーニングした。 陽性のプラークをスクリーニングして純化し、ＤＮＡ配列解析によりインサー トを特徴づけする前にファージミドを切り出した。２つのｃＤＮＡクローンを完 全に配列決定した。その５’および３’非翻訳領域にはいくらかの配列変異が含 まれていたが、コード領域は同一であった。２つのｃＤＮＡクローンのコード領 域は、以下の配列と実質的に同じであった： ４つの他のクローンの部分配列解析により、それらが完全に配列決定されたク ローンと同じコード領域を含み、したがってライブラリースクリ−ニングからの すべての陽性クローンが同じ遺伝子の転写物を表す可能性が高いことも示された 。ニンジンゲノム中のＡＦＰ遺伝子が１コピーしか存在しないことは、制限酵素 消化したニンジンゲノムＤＮＡのサザン解析がプローブにハイブリダイズする唯 一のフラグメントを示唆したという事実によってさらに実証された。例VII 例VIに示したニンジンｃＤＮＡが５ＡＦＰを表ことを証明するために、以下の ようにしてコード領域の発現を行った。以下に記載するように、ｃＤＮＡの１つ を、まず、ダブルＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Guerineau,J.F.,Woolsten,S. ,Brooks,L.,and Mollineaux,P.1988）発現カセットを含む中間体ｐＵＣプラスミ ドベクター（Messing，1983）中にクローニングし、次にバイナリーベクター中 にクローニングした。用いたすべての酵素はＧｉｂｃｏ ＢＲＬから供給された ものであり、製造者の指示書にしたがって用いた。 ｃＤＮＡクローンを含有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミド（Stratage ne）をＸｈｏＩで消化し、その３’凹み末端を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ ウフラグメントを用いて充填した。次に、このｃＤＮＡフラグメントを、Ｅｃｏ ＲＩで消化することによりベクターから解放した。このＥｃｏＲＩ／平滑末端ｃ ＤＮＡフラグメントを、次にＥｃｏＲＩ／平滑末端消化中間体ｐＵＣプラスミド ベクター中にクローニングした。次に、ＣａＭＶ ３５Ｓ−ｃＤＮＡ発現カセッ トを、部分ＨｉｎｄIIIフラグメントとしてＨｉｎｄIIIで消化したｐＢｉｎ１９ バイナリーベクター（Bevan 1984）中にサブクローニングした。このバイナリー ベクター構築物を、次に、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換 （Draper,J.,Scott,R.,Armatage,P.,and Walden,R.,1988に記載されたもの）を 用いてタバコに導入した。 充分なカナマイシン耐性材料が再生するとすぐに、トランスジェニックタバコ カルスを、再結晶阻害活性の発現について解析した。小規模のタンパク抽出物を 、いくつかの独立したカナマイシン耐性カルスといくつかの野生型タバコカルス から作製した。約２ｇの組織を、１〜２ｍｌのスクロース緩衝液（３０％スク ロース、５０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭアスコルベート、ｐＨ ７.２）中で、モルタルおよびペッスルを用いてすりつぶした。この溶液を１０, ０００×ｇで２分間遠心分離し、上清を新たなチューブに採取した。タンパク抽 出物の３μｌアリコートを、例Ｉのスクロースサンドイッチスプラットアッセイ 法を用いて再結晶活性について試験した。試験したすべてのカナマイシン耐性カ ルス抽出物は、再結晶阻害活性を明らかにした。 ニンジンＡＦＰを発現する安定なトランスジェニックタバコ植物もまた作製し た。野生型およびトランスジェニックタバコ植物からの葉抽出物を、ＡＦＰ ｃ ＤＮＡをプローブとして用いるノーザン解析に供した。ＡＦＰメッセージ（転写 物）は、トランスジェニックタバコ植物中にのみ検出可能であった。これは、Ａ ＦＰメッセージが温室で生育させたトランスジェニックタバコ植物において安定 であることを示唆する。天然のニンジン転写物と比較すると、タバコＡＦＰ転写 物は、わずかに大きいようであった。この違いは、ＡＦＰ発現カセットの構築の 方法により説明することができる。ＣａＭＶ ３５Ｓポリアデニル化シグナルは 、構築物の最も３’側にあるので、このシグナルがトランスジェニックＡＦＰメ ッセージにおいて使用されて、より長い転写物が生じた可能性が高い。また、野 生型およびトランスジェニックタバコ植物からの葉抽出物を、ニンジンＡＦＰ抗 体を用いてウェスタンブロットにより解析した。交差反応性タンパクは、トラン スジェニックタバコ植物においてのみ検出された。転写物のサイズの違いにもか かわらず、タバコにおいて産生されたタンパクは、天然のニンジンＡＦＰと同じ サイズのようであった。 上述のデータは、ニンジンから精製されたタンパクおよび相当するｃＤＮＡが 、活性なＡＦＰを表すことの証明を提供する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月２９日（１９９８．１２．２９） 【補正内容】 請求の範囲 １．ニンジンから得ることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３６ｋＤａの見かけの 分子量を有する、抗凍結活性を有するポリペプチド、および抗凍結活性をな お有するそれらのアイソフォームまたは誘導体。 ２．以下のアミノ酸配列の１またはそれ以上のフラグメント（Ａ〜Ｅ）を含む、 抗凍結活性を有するポリペプチド、および抗凍結活性をなお有するそれらの アイソフォームまたは誘導体： ３．フラグメント（Ａ〜Ｅ）を含む請求項２に記載の抗凍結活性を有するポリペ プチド。 ４．配列表Ｉに表すアミノ酸配列を有する、抗凍結活性を有するポリペプチド、 および抗凍結活性をなお有するそのアイソフォームおよび誘導体。 ５．請求項１〜４の１またはそれ以上に記載の抗凍結ポリペプチドをコードする 単離された核酸配列、および抗凍結活性をなお有するポリペプチドをコード するそれらのアリル。 ６．配列表Ｉの遺伝子配列に相当する単離された核酸配列、および抗凍結活性を なお有するポリペプチドをコードするそれらのアリル。 ７．そのポリペプチドを寒冷気候順化ニンジンから単離することによって、請求 項１〜４の１またはそれ以上に記載のポリペプチドを得る方法。 ８．そのポリペプチドを遺伝的に改変された生物により発現させることによって 、請求項１〜４の１またはそれ以上に記載のポリペプチドを得る方法。 ９．前記生物が、微生物、植物または細胞培養物である、請求項８に記載の方法 。 10．請求項１、２、３または４に記載のポリペプチドと特異的に結合することが できる抗体。 11．請求項１０記載の抗体との交差反応性により決定される、請求項１、２、３ または４に記載のポリペプチドと免疫学的に関連する、抗凍結活性を有する ポリペプチド。 12．その食品が、ニンジンではないことを条件として、請求項１、２、３、４ま たは１１に記載のポリペプチドを含む食品。 13．冷凍菓子製品または冷凍野菜である、請求項１２に記載の食品。 14．請求項１、２、３または４の１または２以上に記載の抗凍結ポリペプチドを 含む食品を製造する方法であって、 （a）食品に、前記抗凍結ポリペプチドを含む組成物を添加する工程；または （b）前記抗凍結ポリペプチドのインサイチュ産生 の工程を含むことを特徴とする方法。 15．植物の霜耐性を増強するための、請求項１、２、３または４に記載のポリペ プチドの用途。 16．植物が、改変されていないニンジン植物ではないことを条件として、請求項 １、２、３または４に記載のポリペプチドを発現することができる微生物、 細胞株または植物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/415 Ｃ０７Ｋ 14/415 16/16 16/16 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ドゥース、シャルロット・ジュリエット 英国、ワイオー１・５ワイダブリュ、ヨー ク、ヘスリントン、ザ・ユニバーシティ・ オブ・ヨーク、デパートメント・オブ・バ イオロジー、ザ・プラント・ラボラトリー （番地なし) (72)発明者 フェン、リチャード・アンソニー 英国、エムケイ44・１エルキュー、シャー ンブルック、コルワース・ハウス、ユニリ ーバー・リサーチ・コルワース・ラボラト リー（番地なし) (72)発明者 マッカーサー、アンドリュー・ジョン 英国、エムケイ44・１エルキュー、シャー ンブルック、コルワース・ハウス、ユニリ ーバー・リサーチ・コルワース・ラボラト リー（番地なし) (72)発明者 サイドボトム、クリストファー・マイケル 英国、エムケイ44・１エルキュー、シャー ンブルック、コルワース・ハウス、ユニリ ーバー・リサーチ・コルワース・ラボラト リー（番地なし) (72)発明者 スモールウッド、マーガレット・フェリシ ア 英国、ワイオー１・５ワイダブリュ、ヨー ク、ヘスリントン、ザ・ユニバーシティ・ オブ・ヨーク、デパートメント・オブ・バ イオロジー、ザ・プラント・ラボラトリー （番地なし) (72)発明者 ウオーラル、ダウン 英国、ワイオー１・５ワイダブリュ、ヨー ク、ヘスリントン、ザ・ユニバーシティ・ オブ・ヨーク、デパートメント・オブ・バ イオロジー、ザ・プラント・ラボラトリー （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ニンジンから得ることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３６ｋＤａの見かけの 分子量を有する抗凍結ポリペプチド、およびそれらのアイソフォームまたは 誘導体。 ２．以下のアミノ酸配列の１またはそれ以上のフラグメント（Ａ〜Ｅ）を含む抗 凍結ポリペプチド、およびそれらのアイソフォームまたは誘導体： ３．フラグメント（Ａ〜Ｅ）を含む請求項２に記載の抗凍結ポリペプチド。 ４．配列表Ｉに表すアミノ酸配列を有する抗凍結ポリペプチド、およびそのアイ ソフォームおよび誘導体。 ５．請求項１〜４の１またはそれ以上に記載の抗凍結ポリペプチドをコードする 単離された核酸配列、およびそれらのアリル。 ６．配列表Ｉの遺伝子配列に実質的に相当する単離された核酸配列、およびそれ らのアリル。 ７．そのポリペプチドを寒冷気候順化ニンジンから単離することによって、請求 項１〜４の１またはそれ以上に記載のポリペプチドを得る方法。 ８．そのポリペプチドを遺伝的に改変された生物により発現させることによって 、請求項１〜４の１またはそれ以上に記載のポリペプチドを得る方法。 ９．前記生物が、微生物、植物または細胞培養物である、請求項８に記載の方法 。 10．請求項１、２、３または４に記載のポリペプチドと特異的に結合することが できる抗体。 11．請求項１０記載の抗体との交差反応性により決定される、請求項１、２、３ または４に記載のポリペプチドと免疫学的に関連するポリペプチド。 12．その食品が、前記ポリペプチドを天然に生じるレベルで含有するニンジンで はないことを条件として、請求項１、２、３、４または１１に記載のポリペ プチドを含む食品。 13．冷凍菓子製品または冷凍野菜である、請求項１２に記載の食品。 14．請求項１、２、３または４の１またはそれ以上に記載の抗凍結ポリペプチド を含む食品を製造する方法であって、 （a）食品に、前記抗凍結ポリペプチドを含む組成物を添加する工程；または （b）前記抗凍結ポリペプチドのインサイチュ産生 の工程を含むことを特徴とする方法。 15．植物の霜耐性を増強するための、請求項１、２、３または４に記載のポリペ プチドの用途。 16．植物が、改変されていないニンジン植物ではないことを条件として、請求項 １、２、３または４に記載のポリペプチドを発現することができる微生物、 細胞株または植物。