JP2000510000A - 哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、哺乳動物の膵細胞の発生状態を試験するための新規な方法に関する。本発明はさらに、本発明の方法から直接導かれる医療分野における応用例に関する。さらに、本発明は、１以上の不活性化Pax4対立遺伝子と場合により１以上の不活性化Pax6対立遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法 発明の利用分野 本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この方法は、例 えば膵細胞（または前膵細胞）におけるPax4 mRNAおよび／またはタンパク質の レベルまたは状態を確かめて、そのレベルまたは状態を、正常な膵細胞（または 前膵細胞）の対応するレベルまたは状態と比較することによる。この方法はある 種の膵細胞に起因する疾病の診断または検出手段を提供し、特に例えば若年性糖 尿病のような糖尿病の診断または検出手段を提供する。前記方法は、膵細胞（ま たは前膵細胞）におけるPax6 mRNAおよび／またはタンパク質のレベルまたは状 態を確かめて、そのレベルまたは状態を、正常な膵細胞（または前膵細胞）の対 応するレベルまたは状態と比較することと組みわせて行うことができる。 以下に提示したデータは、Pax4発現の不足がβ細胞発生の欠損または不全、そ れ故にインスリン産生の欠乏または低下（故に、若年性糖尿病のような糖尿病） の指標となることを示す。したがって、本発明は、グルカゴン遺伝子の不適切な 発現から生じる若年性糖尿病のような糖尿病などの膵臓の疾患を治療し、予防し または遅延させるためにPax4発現を回復させることに関し、それ故に発現可能な 機能性Pax4タンパク質をコードする配列を有する第１の核酸分子少なくとも１つ 、および場合により発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする第２の核酸配 列、を含むように改変することでPax4発現を回復させたトランスジェニック哺乳 動物に関する。これとは別に、またはこれに加えて、本発明は、若年性糖尿病の ような糖尿病などの膵臓の疾患を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax4 を単独でまたはPax6と一緒に、および／またはPax4の発現またはPax4とPax6の両 発現を促進(stimulate)する物質を投与することに関する。 以下に提示したデータは、Pax4発現の不足がβ細胞発生の欠損または不全、そ れ故にインスリン産生の欠乏または低下（故に、若年性糖尿病のような糖尿病） の指標となることを示すから、本発明はまた、少なくとも１つの不活性化された Pax4対立遺伝子を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物に関する。 この哺乳動物には若年性糖尿病のような膵臓の疾患の研究用モデル動物をはじめ として多くの有用性があり、それ故、膵細胞の欠損または不全に起因する疾患の 治療法などを開発するうえで有用な新規動物を提供する。したがって、この場合 の哺乳動物はヒト以外の動物、例えばマウスやラットといった実験動物であるこ とが好ましい。 さらに、Pax4の不適切な発現は腫瘍などの疾病を引き起こすこともあるので、 本発明はまた、腫瘍などのPax4の不適切な発現に起因する膵臓疾患を治療し、予 防しまたは遅延させるために、少なくとも１つの不活性化されたPax4対立遺伝子 を含むように改変されたトランスジェニック哺乳動物に関する。この場合の哺乳 動物はヒトであってもよい。というのは、少なくとも１つの不活性化されたPax4 対立遺伝子の哺乳動物への導入が治療のためだからである。これとは別に、また はこれに加えて、本発明は、腫瘍などのPax4の不適切な発現に起因する膵臓疾患 を治療し、予防しまたは遅延させるために、Pax4を阻害する物質またはPax4とPa x6とを阻害する物質を投与することに関する。 いくつかの文献が本明細書全体にわたって引用されている。ここに引用された 文献（製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、それぞれを参照することによ り本明細書中に含めるものとする。発明の背景 膵臓は、消化管への酵素の供給に係わる外分泌機能と、各種ホルモンを血流中 に分泌する内分泌機能の両方を併せもつ重要な臓器である。外分泌機能は、種々 の消化酵素（アミラーゼ、プロテアーゼ、ヌ クレアーゼなど）を産生する腺房細胞および房心細胞と、アルカリ性溶液中のこ れら酵素を十二指腸に輸送する介在導管細胞が担当している。 内分泌膵臓の機能性単位は、膵臓の外分泌部全体に分散していて、４種類の細 胞型（すなわち、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞）から構成されるランゲルハ ンス島であり、これについてはSlack，Development 121(1995)，1569-1580に概 説されている。β細胞はインスリンを産生するもので、内分泌細胞の大部分に該 当し、ランゲルハンス島のコアを形成している。一方、α細胞はグルカゴンを分 泌し、周辺に局在している。δ細胞とPP細胞はあまり多くはないが、それぞれソ マトスタチンおよび膵性ポリペプチドを分泌する。インスリンとグルカゴンは血 中グルコース濃度を調節するための重要な物質である。インスリンは細胞による グルコースの取込みおよびグルコースのグリコーゲンへの変換を高めることで血 中グルコース濃度を低下させる。グルカゴンは肝臓グリコーゲンの分解により介 在して血中グルコース濃度を上昇させる。内分泌機能が損なわれる通常の膵臓疾 患としては真性糖尿病、ホルモン分泌性腫瘍などがある。 ４種類全ての内分泌細胞は内胚葉由来の共通の多能性前駆細胞から生ずると考 えられる。膵臓発生の初期に、これらの前駆細胞はインスリンやグルカゴンなど の数種のホルモンを同時発現する。マウスでは、α細胞が受胎後(p.c.)9.5日目 に分化する最初の内分泌細胞であり、続いて受胎後14.5日目にβ細胞とδ細胞へ の分化、そして生後１日目にPP細胞への分化が起こる。異なる内分泌細胞の系列 を規定することに係わっている分子および遺伝子要素については殆ど知られてい ない。これまでに記載された数個の遺伝子の一つはホメオボックス遺伝子Pdx1で あり、この遺伝子は膵臓発生の初期段階で発現されて、成体ランゲルハンス島の β細胞に制限されるようになる(Guzら，Development 121(1995)，11-18)。ホモ 接合性マウスPdx1の突然変異体は膵臓を発生させることができず、生後数日で死 亡する(Jo nssonら，Nature371(1994)，606-609)。Pax遺伝子ファミリーの２つのメンバー であるPax4およびPax6もまた膵臓の発生中に内分泌細胞において発現される。し かし、特にPax4およびPax6遺伝子が膵臓の発生にどのような影響を及ぼすのか、 今日まで知られていなかった。 膵臓における種々の分化パラメーターを試験する方法は、これまで利用できな かったとは言え、非常に望ましいものである。かかる方法により得られる結果は 、例えば膵臓関連疾患の診断および治療に、大きな影響を及ぼす。発明の概要 本発明は、哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する新規な方法に関する。本発 明はさらに、本発明の方法から直接もたらされる医療分野での応用（用途）に関 する。加えて、本発明は、少なくとも１つの不活性化Pax4遺伝子を含み、場合に より少なくとも１つの不活性化Pax6遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物に 関する。発明の詳細な説明 したがって、本発明の根底にある技術的課題は、膵細胞の分化状態をモニター する方法を提供することである。この技術的課題の解決は請求の範囲において特 徴づけられた実施形態により達成される。 かくして、本発明は哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法に関し、この 方法は、 （a）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ ／または （b）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認し 、そして （c）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、正 常膵細胞中の対応するレベルと比較する、 ことを含んでなる。 本発明に関連して、「レベル」とは産生されたmRNAまたはタンパク質の量のこ とである。「状態」という用語には、この遺伝子、mRNA、タンパク質または転写 制御エレメント（例えば、プロモーター／エンハンサー配列）が、野生型の正常 遺伝子産物と比較したとき、この遺伝子の全体的な活性に影響を与えるような突 然変異、欠失または他の改変をもつ可能性があるという選択肢が含まれる。この 用語にはタンパク質の翻訳後修飾が含まれる。 本発明の方法により、膵臓組織における異なる細胞型（すなわち、α細胞、β 細胞、δ細胞、PP細胞）の発生についての詳細な研究が初めて可能となる。以後 の実施例に示したように、Pax4遺伝子は、場合によりPax6遺伝子と共同して、膵 臓の発生の初期段階に係わっている。この驚くべき結果により、細胞の運命を追 跡することが可能となり、また膵臓に含まれる特定の細胞型に起因する疾患の発 症についての研究が可能となる。さらに、本発明が提示した結果により、Pax4お よび／またはPax6は特定の膵細胞のマスター調節剤であると結論づけることがで きる。つまり、Pax4はβ細胞のマスター調節剤であるようだ。Pax4は膵細胞以外 の細胞においても発現される。Pax4の発現は発生中の脊髄に存在する細胞のサブ セットにおいて検出される。それゆえ、Pax4は同様にこうした細胞の分化状態に おいても、ある役割を担っている可能性がある。 したがって、本発明の方法は、特定の膵細胞に起因する疾患の診断または検出 手段を提供し、特に早期検出または診断手段、例えば若年性糖尿病のような糖尿 病の検出または診断手段を提供し、そのような検出または診断は出生前であって もよいし出生後であってもよい。 好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、 （d）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、かつ ／または （e）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認し 、そして （f）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、正 常膵細胞中の対応するレベルと比較する、 ことを含んでなる。 本発明のこの実施形態により、Pax4およびPax6遺伝子産物の相乗作用の研究が 可能となる。この相乗作用の分析は膵臓における細胞特異的発生の調節に対する より深い洞察を提供すると期待される。膵臓特異的疾患に関係した診断用または 医薬用組成物の開発は、こうした深い洞察から大いに恩恵を受けるだろう。 本発明方法のさらなる好ましい実施形態では、前記哺乳動物は、 （i）胚体期、 （ii）新生児期、または （iii）成体期、 にあるものである。 本発明により示されたように、Pax4遺伝子は、好ましくはPax6遺伝子と共に、 異なるレベルで、かつ哺乳動物の膵臓の異なる発生段階において発現される。胚 体期、新生児期または成体期の膵細胞の発生段階の詳細な分析により、例えば各 時期と関連した特定の疾病状態に関して、さらなる洞察が得られるだろう。例え ば、本発明の方法を応用し、かつ本発明のトランスジェニック哺乳動物（ヒト以 外）を用いることにより、例えば若年性糖尿病の病因を解明することが期待され る(以下で述べる；実施例も参照のこと)。この知識に基づいて、新しい医薬（例 えば、若年性糖尿病の新薬）が開発されて、試験されるだろう。 本発明の方法は、研究の目的に応じて、さまざまな哺乳動物に適用することが できる。したがって、好ましい実施形態においては、哺乳動物はマウスである。 この実施形態は、膵臓の発生を調節している各種タンパク質の機能的相互関係を より明確に理解するための基礎研究に特に有用である。別の実施形態においては 、哺乳動物はヒトである。この実施形態では、好ましくは診断および治療上の適 用例が考え られる。 本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（a）と場合に より（d）、および／またはステップ（b）と場合により（e）はin vivoでおこな われる。 本発明のこの実施形態は特に基礎研究または治療上の適用例において有用であ ると予想される。 本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（a）と場合に より（d）、および／またはステップ（b）と場合により（e）はin vitroでおこ なわれる。 この実施形態の利点は主に診断上の適用例にあり、また基礎研究にも有利であ ると予想される。 本発明方法のさらなる好ましい実施形態においては、ステップ（a）と場合に よりステップ（d）での前記確認を、 （i） Pax4遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax4タンパク質の 少なくとも一部をコードする核酸配列、および場合によりPax6遺伝子の少なくと も一部に一致し、好ましくはPax6タンパク質の少なくとも一部をコードする第２ 核酸配列、 （ii）（i）の核酸配列に相補的な核酸配列、または （iii）（i）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーもし くはプライマー対、 を用いて行う。 本発明のこの実施形態によると、分化状態を試験する方法は、例えばサザンも しくはノーザンブロットまたはin situ分析の形で、Pax4遺伝子および／またはP ax6遺伝子またはその一部をコードする核酸分子を用いておこなうことができる 。前記核酸配列は上記遺伝子のいずれかのコード領域または非コード領域にハイ ブリダイズしうる。本発明の方法において（ii）の相補配列を用いる場合には、 前記核酸分子はノーザンブロットにおいて再使用することができる。さらに、前 記試験は実際上のブロック、例えば遺伝子転写のブロックと共におこ なってもよく、かくして治療との関連性を有することが予期される。さらに、プ ライマーまたはオリゴヌクレオチドは、上記のPax遺伝子または対応mRNAの１つ にハイブリダイズさせるためにも使用できる。ハイブリダイゼーション用の核酸 は、当然、放射性マーカーや他のマーカーを組み込んだり結合させることで便利 に標識される。このようなマーカーは当技術分野で周知である。上記核酸分子の 標識付けも慣用方法でおこなうことができる。 さらに、Pax4および場合によりPax6の存在または発現は、対応する核酸配列の いずれかに特異的にハイブリダイズするプライマー対を用いて、標準方法に従っ てPCR反応をおこなうことでモニターすることができる。 上記プローブまたはプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはストリンジ ェントなハイブリダイゼーション条件でおこなうことが好ましい。「ストリンジ ェントなハイブリダイゼーション条件」は当技術分野で周知であり、例えば、Sa mbrookら，“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”第２版，CSH Press，C old Spring Harbor，1989；“Nucleic Acid Hybridisation，A Practical Appro ach”，Hames and Higgins編，IRL Press，Oxford，1985を参照されたい。 当業者であれば、この開示内容から、過度な実験を行わずとも本発明の上記実 施形態のさらなる変更が容易に考えつくことである。 本発明のもう１つの実施形態は、ステップ（b）と場合によりステップ（e）で の前記確認を、Pax4タンパク質と特異的に結合する抗体またはそのフラグメント を用いて、場合により、Pax6タンパク質と特異的に結合する第２の抗体またはそ のフラグメントを用いて行う方法に関する。 前記タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントは、例えばHarlowおよび Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor， 1988に記載される慣用方法を用いて取得することができる。これらの抗体はモノ クローナル抗体であっても、ポ リクローナル抗血清中に含まれるものであっても、またはそのフラグメントであ ってもよい。本発明の方法で用いる抗体は、ヒスチジンフラッグやビオチン分子 などの検出可能なタグにより標識することができる。 本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、前記膵細胞がβ細胞またはδ細 胞である。 本発明によると、Pax4はβ細胞において発現されることがわかった。したがっ て、Pax4遺伝子機能の破壊は、膵臓における前記細胞の発生の精密な追跡を可能 にする。α細胞とβ細胞の両方ではPax6も発現されるので、Pax6発現は、Pax4が 作用しうる環境を整えるために必要とされるのかもしれない。 Pax4とPax6は両方とも内分泌細胞の適正な分化にとって必要な調節タンパク質 であるので、この実施形態は膵臓腫瘍のような疾病の発生に関してさまざまな結 論を可能しうる。 したがって、さらに好ましい実施形態は、前記分化状態が膵細胞の悪性度また は悪性力の指標となる方法に関する。機能性Pax4産物および場合によりPax6産物 の過剰発現または欠損は、正常な内分泌細胞を癌化するように誘導する可能性が ある。この記載に一致して、Pax4遺伝子の近くの染色体7qにおける対立遺伝子欠 損が多くの膵臓癌に観察されている(Albertoら，Cancer Res．56(1996)，3808-3 818)。Pax4は、場合によりPax6も、他の発癌因子と相互作用しているのかもしれ ない。 悪性度または悪性力は、本発明によれば、好ましくは、しかし排他的ではなく 、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ソマトスタチノーマ、管細胞腺癌などの膵 臓腫瘍との関連において用いられる。 本発明は、さらに好ましい実施形態において、 （a'）前記試験に先立って、前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること、 および （b'）前記試験後、Pax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過 剰発現している場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも 部分的に排除すること、またはPax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過少発 現しているか発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしく は発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を 前記細胞に導入すること、および （b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物に再導入す ること、 をさらに含む方法に関する。 これに関連して、本明細書全体を通して用いられる「機能性」Pax4(Pax6)とは 、β細胞（α細胞およびランゲルハンス細胞）への内分泌細胞の発生に寄与する という生物学的性質をもつPax4(Pax6)タンパク質の一次構造コンホメーションの 一部または全部を有するタンパク質を意味し、前記タンパク質はPax4(Pax6)をコ ードするDNA配列の原核または真核生物発現の産物であって、配列番号２もしく は１８（配列番号４）のアミノ酸配列、または配列番号２もしくは18（配列番号 ４）に示したアミノ酸配列のアミノ酸欠失、置換、挿入および／もしくは付加を 有するそのフラグメントもしくは誘導体を含んでなるアミノ酸配列を有する。ま た、「機能性」Pax4(Pax6)タンパク質という用語には、抗体応答のような特異的 免疫応答を生じさせる前記タンパク質またはその一部の能力も含まれる。 本発明のこの実施形態は、腫瘍（特にヒトの腫瘍）を治療するのに適している 。したがって、膵臓腫瘍細胞のPax4タンパク質および場合によりPax6タンパク質 の発現レベルをモニターすることが考えられる。前記タンパク質の過剰発現の検 出は、かかる過剰発現が腫瘍の発生または維持に相互関係していると結論づける ことができよう。したがって、その発現レベルを正常レベルにまで下げるステッ プが追加されよう。例えば、これは、生物学的手段により、例えばリボザイム、 アンチセンス核酸分子、またはPax4タンパク質かPax6タンパク質に 対する細胞内抗体を用いることで、Pax4遺伝子の発現を少なくとも部分的に排除 することにより行うことができる。さらに、Pax4の発現レベルを下げるための薬 剤が開発される可能性がある。目下のところPax4および場合によりPax6が膵臓組 織においてどのように調節されるのかは不明であるが、さまざまな発生因子とホ ルモン因子がこれらの遺伝子の活性レベルを決定していると考えられる。例えば 、特定の遺伝子の発現を抑制する小分子が知られている。TGFβスーパーファミ リーの一員であるアクチビンＡは、発生しつつある脊髄におけるPax6の発現をダ ウンレギュレートすることが実証されている(Pituelloら，Proc．Natl．Acad．S cl．USA 92(1995)，6952-6956)。同様の分子が膵臓でのPax4の発現と、場合によ りPax6の発現、をダウンレギュレートする可能性がある。一方、発現の不足つま り過少発現は腫瘍細胞で発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合によりPax6遺伝 子により回復され得る。また、発現の促進または誘導が小分子やその他の手段（ この場合はPax4遺伝子発現を活性化するもの）を用いることで得られる。これに 関して、本発明は、前記悪性状態では前記Pax遺伝子の一方が過剰発現されるが 他方のPax遺伝子は過少発現されるという可能性を意図している点に留意するこ とが重要である。最後に、ヒトの膵臓腫瘍の外科的切除または化学療法による治 療により、しばしば、患者はグルカゴン産生細胞の相当数が存在しない状態にな ってしまう。Pax4および場合によりPax6は、欠損しているかまたは損傷を受けた β細胞の機能性代替物を開発するための組織遺伝子工学的操作(LangerおよびVac anti，Science 260(1993)，920-924)において使用することができる。in vitro で正常レベルのPax4発現および場合によりPax6発現に復帰した膵臓腫瘍細胞を患 者に再導入すると、患者自身の遺伝的背景にある正常なインスリン産生細胞が患 者に供給される結果、細胞の免疫学的拒絶反応の危険性が低減する。 本発明のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験すること は、実施例に示すように、若年性糖尿病の指標となるβ細 胞の発生状態を試験することである。若年性糖尿病はβ細胞発生の欠損または不 全の結果として発症することが多い。実施例により、Pax4発現の不足がβ細胞発 生の欠損または不全の指標となり、したがってインスリン産生の欠乏または低下 （それ故に若年性糖尿病のような糖尿病）の指標となることが示される。 若年性糖尿病の早期診断は特に有利であり、かなり医学的に重要なことである 。したがって、糖尿病の診断または検出のために本発明の方法を用いることが好 ましい実施形態となる。この好ましい実施形態は、コロナ絨毛(coronar villi) において、すなわち胚の着床前に、若年性糖尿病を診断するのに用いることがで きる。さらに、本発明の方法を用いて、羊水穿刺により若年性糖尿病を診断する ことも可能である。本発明の方法のあらゆる適用例に従う若年性糖尿病の早期診 断は、誕生後で臨床的徴候の発現前に直接治療することを可能にする。 本発明方法の特に好ましい実施形態では、前記β細胞の分化状態を試験するこ とが胚体または新生児哺乳動物において行われる。 先に示したように、個々の薬剤治療および遺伝子治療のアプローチに特有の、 少なくとも１つの追加のステップを本発明の方法に含めることが特に好適である 。上述したように、Pax4発現、および場合によってはPax6発現を活性化し、それ ゆえ、インスリン産生β細胞の分化および生産とランゲルハンス島の発生を誘導 するために、医薬として有効な種々の小分子を用いることができよう。同様に、 活性のPax4および／または場合によってはPax6の細胞内ターゲティングは同様の 成果を前進させるだろう。この記載に合致して、膵管上皮細胞は内分泌細胞型の 潜在的な幹細胞を含むことが提唱された。前記細胞に限らないが、前記細胞にお けるPax4活性の誘導は、インスリン産生細胞への分化を促進し得る(Parsaら，19 85，Cancer Res．45:1285-1290)。 本発明方法のさらに好ましい実施形態においては、膵細胞の前記分化状態が薬 剤活性のまたは遺伝子治療法の結果である。例えば、前記 分化状態は、機能性Pax4および場合によりPax6遺伝子を、レトロウイルスベクタ ー(Naldiniら，Science 272(1996)，263-267;Mulligan，Science 260(1993)，92 6-932)または他の適切なベクターを用いて、in vivoで細胞に導入する遺伝子治 療アプローチにより影響を受ける。同様に、本発明によると、患者由来の細胞を 分離し、それらの細胞を標準的な組織培養技術を用いてβ細胞へと分化するよう にin vitroで改変し、そして患者に再導入することができる。 特に好ましい実施形態では、前記薬剤または遺伝子治療法が、Pax4遺伝子と場 合によりPax6遺伝子の発現レベルにmRNAレベルまたはタンパク質レベルで影響を 与える。 本発明の上記実施形態は、とりわけ、上記Pax遺伝子の発現に及ぼす薬剤の影 響について薬剤を試験することを可能にする。さらに上で述べたように、Pax4と 場合によりPax6の異常な発現レベルは、例えば膵臓の固形腫瘍の発症の原因とな ると予想される。したがって、本発明の方法は、薬剤の適用により細胞が正常な 発現レベルに戻れるような、そういった薬剤の試験を可能にする。前記正常な発 現レベルは、例えば細胞の悪性度に直接影響を与えることが期待されよう。例え ば、疾病または腫瘍がPax4の過少発現の直接的または間接的結果であるとすると 、個々の患者を治療している医師は、Pax4の発現を促進する薬剤を投与するだろ う。 本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、膵細胞の分化状態を試験す ることはPax4（場合により、同時にPax6）のノックアウトマウスにおける発生状 態を試験することである。 本発明方法のさらに好ましい実施形態において、前記方法は、β細胞と比べた とき、類似しているが異なる分化経路を有する膵臓α細胞または管上皮細胞に、 発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入し、場合によりさらに発現可能な機能性Pax6 遺伝子を導入することをさらに含む。本発明のこの実施形態を用いると、当業者 はα細胞または管上皮細胞の運命をβ細胞へと再度方向づけすることができる。 こうして、 α細胞は、Pax4遺伝子、および場合によりPax6遺伝子によるトランスフェクショ ン後に、β細胞へと分化することが期待される。患者がβ細胞の不足、それ故イ ンスリンの欠損に苦しんでいる場合は、相応の薬剤投与が考えられる。この方法 はin vitroでもin vivoでも行うことができると考えられる。 本発明はさらに、少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を含むトランスジ ェニック哺乳動物に関する。特にこのトランスジェニック哺乳動物の研究上の使 用に関しては、哺乳動物はヒト以外のものであることが好ましい。 本発明のトランスジェニック動物は、例えば膵臓における、種々の細胞の発生 をモニターするのに有利に使用することができる。しかし、このトランスジェニ ック哺乳動物の使用は膵臓発生の研究に制限されない。本発明によると、Pax4は 今やβ細胞のマスター調節剤であると考えられるので、その影響は生体の他の細 胞型でも研究することが可能である。 本発明のトランスジェニック動物（好ましくは、ホモ接合状態のトランスジェ ニックマウス）は重症の膵臓障害（トランスジェニックマウスの場合には、生後 三日以内に死に至る）を有するので、前記トランスジェニック動物は、特に膵臓 の発生障害と関連した疾患の研究にさらに使用することができる。トランスジェ ニックマウスはインスリン産生細胞に欠陥があり、若年性糖尿病のヒト患者によ く似た臨床的徴候を呈するので、前記マウスは若年性糖尿病に対する治療および 薬剤研究用のモデル動物として有用である。 好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物は少なくとも１つの不活性 化Pax6対立遺伝子をさらに含有する。 この実施形態は、哺乳動物またはその特定の組織（特に膵臓の組織）の発生に 関するPax4とPax6の相互作用の研究を可能にする。Pax4トランスジェニック哺乳 動物に関して本明細書中で先に述べた応用例はすべて、２個のトランスジーンを 保有する哺乳動物にも当てはま る。また、トランスジェニック動物の発生および／または生涯の特定の時期にPa x4遺伝子発現と場合によりPax6遺伝子発現を不活性化することが望ましいかもし れない。これは例えば、Pax4タンパク質をコードするRNA転写産物および場合に よりPax6コード化RNAに対するアンチセンスまたはリボザイムの発現を駆動する 、例えば組織特異的な、発生および／または細胞調節型のおよび／または誘導可 能なプロモーターを使うことで達成できる。適当な誘導系は、例えばGossenおよ びBujard(Proc．Natl．Acad．Sci．89 USA(1992)，5547-5551)およびGossenら(T rends Biotech．12(1994)，58-62)に記載されるテトラサイクリン調節遺伝子発 現である。本発明の別の好ましい実施形態においては、前記トランスジェニック 哺乳動物はヒト、マウスまたはラットである。上述したように、治療のために少 なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を哺乳動物に導入し得るから、トランス ジェニック動物はヒトであってよい。 本発明によれば、トランスジェニック動物は不活性化Pax4または不活性化Pax6 のいずれかまたは両方の不活性化遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ接合性 であり得る。 さらに、本発明は、哺乳動物の糖尿病を治療し、予防し、および／または遅延 させるための医薬組成物を調製するための、発現可能な機能性Pax4タンパク質を コードする少なくとも１つの第１核酸配列および場合により発現可能な機能性Pa x6タンパク質をコードする第２核酸配列の使用に関する。本発明によると、前記 核酸配列を含むベクターは、前記核酸配列の発現および／または前記核酸配列の 膵細胞へのターゲティングを可能にする調節エレメントに機能しうる形で連結さ せることができる。 さらに、本発明は、哺乳動物の糖尿病を治療し、予防しおよび／または遅延さ せるための医薬組成物を調製するための、機能性Pax4タンパク質および場合によ り機能性Pax6タンパク質の使用に関する。「機能性」という用語は本明細書中で 先に説明した意味を有する。 好ましくは、上記実施形態で言及された哺乳動物はヒト、マウスまたはラット である。かくして、本発明はさらに、発現可能な機能性Pax4タンパク質をコード する配列からなる少なくとも１つの第１核酸分子および場合により発現可能な機 能性Pax6タンパク質をコードする配列からなる第２核酸分子を含むように改変さ れたトランスジェニック哺乳動物（ただし、前記核酸分子は前記哺乳動物におい て発現される）を包含する。この哺乳動物は、出生前または出生後に、例えば本 発明の方法により低い、欠損したまたは皆無のPax4タンパク質またはmRNAが示さ れた後に、糖尿病を治療し、予防しおよび／または遅延させるために改変され得 る。この改変は、本明細書中で述べた技法によりまたは当業者の技量の範囲内で 、本明細書の開示から過度の実験をおこなうことなしに可能である。 本発明では、上記核酸およびタンパク質を単独でまたは任意の組合せで、場合 により製薬上許容される担体または賦形剤と共に、投与することが意図される。 前記核酸配列は哺乳動物のゲノムに安定に組み込むことができる。一方、ある種 の細胞や組織、好ましくは膵臓および／または脳に特異的で、前記細胞内にとど まって前記細胞内でのPax遺伝子の発現を賦与するウイルスベクターを使用する こともできる。適当な製薬上の担体および賦形剤は当技術分野で周知である。核 酸分子および／またはタンパク質を特定の細胞にターゲティングすることができ るエレメントは先行技術、例えばSomiaら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92(199 5)，7570-7574に記載されている。医薬組成物は哺乳動物に適切な用量で投与さ れるが、その用量は、当業者であれば、本明細書の開示および当技術分野の知識 から過度の実験をおこなうことなしに、とりわけ哺乳動物の種、年齢、性別、体 重、健康状態、投与経路、Pax4タンパク質を投与するのかPax4タンパク質とPax6 タンパク質を投与するのか、Pax4またはPax4とPax6を抑制する薬剤または促進す る薬剤のいずれかを投与するのか、単一の核酸を投与するのか、または複数の核 酸を投与するのか、その核酸がPax ４もしくはPax4とPax6を発現させるためのものなのか、またはPax４もしくはPax 4とPax6の発現を抑制するためのものなのか、といった典型的な要因を考慮に入 れて決定することができる。典型的な用量は例えば0.001〜1000μｇの範囲内（ またはこの範囲内の発現用または発現抑制用の核酸の用量）であってよい。しか し、この代表的範囲より少ないまたは多い用量も、特に上記要因を考慮して、考 えられる。 適切な組成物の投与はいろいろな方法でおこなうことができ、例えば静脈内、 腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によるものである。本発明に従って 調製された医薬組成物は、さまざまな種類の疾患、例えば膵臓関連疾患、すなわ ち糖尿病、またはさまざまな種類の後天性もしくは先天性神経障害、神経変性お よび関連障害を治療し、予防しまたは遅延させるために使用することができる。 前記疾患および障害は好ましくは内分泌または神経組織、例えば膵臓や脳に起因 するものである。 さらに、Pax4タンパク質をコードする核酸配列および場合によりPax6タンパク 質をコードする核酸配列を含む医薬組成物を遺伝子治療のために使用することが 可能である。当然、両配列が同じベクター中に含まれていてもよい。上述したよ うに、細胞がPax遺伝子の両方の機能性コピーを失うときに病気が発生すること が多い。こうした場合に、対応する遺伝子の機能性コピーを導入してやると、そ の状況を改善させることができる。例えば、生殖細胞系の細胞への遺伝子導入に 関する研究は生殖生物学において最も急速に進展している分野の一つである。遺 伝子治療は、ex-vivoまたはin-vivo技術による治療用遺伝子の細胞への導入に基 づくもので、遺伝子導入の最も重要な応用例の一つである。適当なベクターおよ びin-vitroまたはin-vivo遺伝子治療法は文献に記載されており、当業者には公 知である。例えば、Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539;Schaper，Ci rc．Res．79(1996)，911-919;Anderson，Science 256(1992)，808-812;Isner，L ancet 348(1996)，370-374;Muhlhauser，Circ．Re s．77(1995)，1077−1086;Wang，Nature Medicine2(1996)，714-716;WO94/29469 またはWO97/00957およびそこに引用された文献を参照のこと。Pax4および場合に よりPax6をコードする遺伝子は細胞への直接導入のために、またはリポソームも しくはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して の導入のために設計され得る。例えば、ヒトPax4をコードする配列および場合に よりPax6遺伝子を調節配列に機能しうる形で連結させて、標的細胞および組織内 での発現を可能にすることができる。遺伝病において、突然変異を起こしている 核遺伝子の正常なまたは機能的に十分な対立遺伝子を導入することが遺伝子置換 療法に相当し（例えば、Mouellic，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87(1990)，47 12-4716;Joyner,Gene Targeting，A Practical Approach，Oxford University P ressを参照のこと）、これは主に糖尿病や低血糖症などの単一遺伝子劣性疾患に 応用される。 したがって、さらなる実施形態において、本発明は糖尿病の治療方法に関し、 この方法は、 （a）哺乳動物から細胞を取り出し、 （b）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺 伝子を前記細胞に導入し、そして （c）ステップ（b）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の 哺乳動物に再導入する、 ことを含んでなる。 また、さらなる実施形態において、本発明は神経障害の治療方法に関し、この 方法は、 （a）哺乳動物から細胞を取り出し、 （b）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺 伝子を前記細胞に導入し、そして （c）ステップ（b）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種の 哺乳動物に再導入する、 ことを含んでなる。 導入された遺伝子は、前記細胞への導入後に機能性で、かつ発現可能であり、 好ましくは前記細胞の寿命の間その状態のままであり続けることを理解すべきで ある。 好ましくは、前記哺乳動物はヒト、ラットまたはマウスである。 本発明方法の好ましい実施形態において、前記細胞は生殖細胞系の細胞もしく は胚性細胞またはそれ由来の細胞である。胚性細胞は、例えばNagy，Proc．Natl ．Acad．Sci．90(1993)8424-8428に記載されるような、胚性幹細胞であってよい 。さらに好ましい実施形態では、前記細胞が卵細胞またはそれ由来の細胞である 。 適当なベクターおよびin-vitroまたはin-vivo遺伝子治療法は文献に記載され ており、当業者には公知である。本発明による医薬組成物は、Pax4遺伝子および ／またはPax6遺伝子の発現および／または無発現に関係することがこれまで知ら れていない種類の疾患の治療に使用することができる。 これらおよび他の実施形態は、本発明の説明および実施例により開示されて、 それらを包含するものである。例えば、本発明に従って用いられる化合物、使用 および方法のいずれかに関する更なる文献は、例えば電子機器を使って、図書館 から検索することができる。例えば、公共のデータベースである「Medline」を 利用することができ、これは例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medli ne.htmlのアドレスのもとにインターネットで入手可能である。更なるデータベ ースおよびアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/，http://www.infob iogen.fr/，http://www.fmi.ch/biology/research tools.html，http://www.tig r.org/が当業者に公知であり、また、例えばhttp://www.lycos.comを使って得る こともできる。バイオテクノロジーの特許情報の総覧および従来技術のサーチや 現在の事情に有用な特許情報の関連ソースの概論は、Berks，TIBTECH 12(1994) ，352-364に載っている。図面の簡単な説明 本明細書の開示内容は、参照することにより本明細書中に組み入れられる添付 図面と関連させることで最もよく理解されよう。 図１(図1a，1b，1c，1d)：ターゲティングされたPax4の破壊およびPax4(-/-) マウスの作製。 ａ．野生型およびターゲティングされたPax4遺伝子座の構造。β-ガラクトシ ダーゼ−ネオマイシン耐性カセットをインフレームで融合することにより、Pax4 のペアードボックス(paired box)ドメイン全体（黒塗り枠；エクソン２、３およ び４）のほぼ全部のターゲティングされた欠失を作製した（転写方向は矢尻２つ で示す）。制限酵素：Ａ、ApaI；Ｋ、KpnI；Nh、NheI；Ｎ、NotI；Ｓ、SpeI；St 、StuI；Ｘ、XhoI. ｂ．ES細胞クローンから単離したDNAをSpeIで消化し、0.7kb外部ゲノムフラグ メント（プローブ１、左側）と0.5kb cDNAフラグメント（プローブ２、右側）の 両方を用いたサザンブロットハイブリダーゼーションにより分析した。サイズは キロベースで示す。両方において、26kbフラグメントが野生型対立遺伝子の指標 であり、20kbおよび7.8kbのフラグメントはそれぞれターゲティングされた対立 遺伝子に由来するものである。星印は相同組換えに対して陽性な２つのクローン を表わす。 ｃ．野生型（上段）およびPax4欠損（下段）の１組の２日齢の同腹子であり、 ヌル突然変異体マウスの体長が小さくなることを示している。 ｄ．野生型のペアードドメインおよび／またはneo遺伝子を増幅させるために 、卵黄嚢または尾部からのゲノムDNAおよび２組のプライマー（ａにおいて矢印 で示すように位置する）を用いたPCR分析により胚の遺伝子型を決定した。 図２(図2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h)。Pax4(+/-)およびPa x4(-/-)E16.5胚および新生児マウスの膵臓におけるLacZ活性、インスリンおよび グルカゴン発現の分析。 E16.5(+/)の膵臓では、インスリン細胞（ａ中の矢印）およびグルカゴン細胞 （ｂ中の矢印）は、LacZ活性が検出される領域（ａおよびｂ中の矢尻）と関連す る。これに対して、E16.5（-/-）胚の膵臓では、LacZの発現（ｅ中の矢尻）は減 少し、インスリンは存在しない(ａとｅとを比較せよ)。E16.5(-/-)膵臓では、多 数のグルカゴン細胞が見出され(ｆ中の矢印)、LacZ活性の領域(ｆ中の矢尻)と関 連する。(+/-)新生児膵臓では、LacZ発現はインスリン細胞(ｃ中の矢印)に制限 され、グルカゴン細胞(ｄ中の矢印)によって囲まれているように見える。(-/-) 新生児膵臓では、LacZ活性またはインスリンの発現が全く検出されない(ｃ、ｄ およびｇを比較せよ)。一方、(-/-)新生児膵臓では、多数のグルカゴン細胞が存 在し(ｈ中の矢印)、異常に密集して分布している(ｄとｈとを比較せよ)。倍率は 400×である。 図３(図3a、3b、3c、3d、3e、3f)。Pax4(+/+)および(-/-)新生児膵臓における Pdx1およびソマトスタチンの発現。 (+/+)および(-/-)E10.5胚の両方の背側膵において、Pdx1の初期の発現は類似 しているように見える(ａとｂとを比較せよ)。 新生児(+/+)膵臓では、Pdx1は成熟インスリン産生β細胞に制限される(ｃ中の 矢印)。Pax4(-/-)新生児マウスの膵臓では、Pdx1の発現は全く検出されない(ｃ とｄとを比較せよ)。(+/+)新生児膵臓では、ソマトスタチン産生δ細胞は主にラ ンゲルハンス島周辺の細胞内（ｅ中の矢印）に分布する。しかし、(-/-)新生児 膵臓では、ソマトスタチンは検出されない(ｅとｆとを比較せよ)。ａおよびｂは ビブラトーム(vibratome)切片である。ｃおよびｄは低温槽切片である。ｅおよ びｆはパラフィン切片である。（ｃ〜ｆ）の倍率は（200×）であり、ａおよび ｂでは（400×）である。 図４(図4a、4b、4c、4d)。新生児マウスから得たPax4(+/+)および(-/-)膵臓の 組織学的分析およびα-アミラーゼの発現。 外分泌腺房を（a）に示す。これは、ピラミッド型の細胞群（矢尻）を含み、 その核は基底状態(base)にある。外分泌細胞（矢尻）はまた新生児(-/-)膵臓で 存在する。しかし、広い細胞質領域が見られ、その核の無秩序な分布も見られる (ａとｂとを比較せよ)。(+/+)新生児膵臓では、外分泌細胞は異なる量のα-アミ ラーゼを含み(ａ、ｃの矢印および矢尻)、これは通常は哺乳の後で起こる消化酵 素の欠乏を反映している。しかし、新生児(-/-)膵臓の外分泌組織のほぼ全部に おいて大量のα-アミラーゼが存在し(ｅ中の矢印)、このことは、α-アミラーゼ の分泌が影響を受けているかもしれないことを示すものである。ａおよびｂの倍 率は(400×)であり、ｃおよびｄの倍率は(200×)である。 図５。マウス膵臓での内分泌分化におけるPax4の役割のためのモデル。 最も初期の内分泌前駆細胞は、そのPdx1発現によって特徴付けられ、マウス発 生のE8.5付近である［Guzら，Development 121(1995)，11-18]。おそらくPdx1が もやは存在しない前駆細胞では、α細胞の分化は発生の非常に初期に起こる。最 も初期のβ細胞前駆細胞では、Pdx1およびインスリンのような遺伝子は選択的に 発現され、その発現を維持することが分化の進行にとって重要であると思われる 。成熟内分泌細胞では、Pdx1、インスリンおよびPax4は発現がβ系譜に制限され ている。Pax4は、インスリン産生β細胞に固有の遺伝子の発現を促進および／ま たは維持することができる。 図６。野生型、ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax4突然変異体新生児マウスの 膵臓におけるホルモン濃度。、 野生型動物とヘテロ接合性動物との間には、インスリンまたはグルカゴン濃度 の差はほとんど、または全く見られなかった。ホモ接合性動物ではインスリン濃 度はほぼ全部失われ、グルカゴンレベルは３倍増大した。 図７。膵腫瘍細胞系のノーザンブロット分析。 細胞系AR42Jは２種のPax4 RNA転写物を含んでいた。一方は野生型の転写物と 同様のサイズであり(矢尻)、他方はそれよりもサイズが大きいものであった(星 印)。細胞系β TC-1およびα TC 1-9では弱いPax4発現が検出される。 本発明およびその多くの利点は、例示としての以下の実施例からさらに理解さ れるだろう。 実施例 インスリン、グルカゴンおよびアミラーゼに対する抗体は数社から販売されて いる。本出願人の実験で用いた抗体はBoehringer Mannheim社から購入した。Pdx 1抗体はUmea大学(S-901 87 Umea，Sweden)微生物学部のThomas Edlund教授から 親切にも贈られたものである。同じ特異性を有する抗体、すなわちPdx1タンパク 質を特異的に認識する抗体は、通常の手順に従って、抗原としてPdx1タンパク質 を用いることで調製することができる。 実施例１：相同的組換え用の構築物の作製およびPax4欠損マウスの 作出 β-ガラクトシダーゼ−ネオマイシン耐性カセットをイン・フレームで融合す ることにより、Pax4のペアード(paired)ボックスドメイン（黒塗りの枠：エクソ ン２、３および４）全体のほぼ全部のターゲティングされた欠失を作製した。La cZpA-pGKNeopA配列を含む5.1kbのXba-Xholフラグメントの末端を平滑にし、NheI で消化し末端を平滑にしたPax4構築物と連結した。pGKneoプラスミド（Soriano ら，1991，Cell 64:693-702）と幾つかの供給元から入手可能なβ-ガラクトシダ ーゼ遺伝子（例えば、Pharmacia製のpCH110ベクター）とを組合せることにより 、LacZpA-pGKNeopA構築物を作製した。５’側Nhel部位を保持し、３’末端に新 たなSpel部位を作製した。陰性の選択として、F9ポリオーマ初期プロモーター由 来のHSV TK遺伝子を ５’側相同領域の上流に付加した。Rl ES細胞をエレクトポレーション処理し、 標準的手順に従って選択した。陽性クローンを用いて、桑実胚集合によりキメラ を作製した。尾部および卵黄嚢DNAの単離ならびにゲノムDNAのPCR増幅を標準的 手法を用いて行った。表現型の分析はNMR1およびC57BL/6マウスで行った。両方 の遺伝的バックグラウンド間に差異は全く見られなかった。 実施例２：発生過程でのPax4の発現についての検討 ゲノムスクリーニングにより、Pax4がPax遺伝子のマウスファミリーのメンバ ーであることが先に確認されている(Waltherら，Genomics 11(1991)，424-434) 。本出願人らは、対応するcDNA配列をRT-PCRにより単離した。 Pax4 cDNAのペアードドメインおよびホメオボックスドメインをコードするフ ラグメント（615nt）のPCR増幅は、E13.5マウス胚から単離した１μｇの全RNAを 用いて行った。逆転写はPharmacia製のキットおよびランダムプライマーを用い て行った。用いたプライマーは、ペアードドメイン［５’側、センスプライマー ：5’AGC AAT AAG AGG GAT GCG ACC 3'(配列番号５)」およびホメオボックスド メイン［３’側、アンチセンス:5’AGC TGT GCT TCC CAT TTC AGC 3'(配列番号 ６)］をそれぞれコードする対応するゲノム領域のシークエンシングを行った後 で得た。実施した全てのPCR反応（５'および３’RACEを含む）において、最初の 変性工程（95℃、３分間）の後、そして次のサイクルに入る前にTaqポリメラー ゼを添加した。２ユニットのTaqポリメラーゼを１ユニットの「パーフェクトマ ッチ(Perfect Match)」（Stratagene社製）と共に添加した。95℃で1.5分；60℃ で1.5分；72℃で2.5分を35サイクル行った。最後の工程は、60℃で1.5分および7 2℃で10分で行った。２％低融点アガロースでゲル電気泳動を行った後、予想し たサイズの薄いバンドが見えた。これを切り出し、同じプログラムで再増幅した (５μｌの溶融アガロース)。 ２％分離用ゲルからDNAを電気溶出し、標準的手法に従ってフィルインし、末端 を平滑化して、SmaIで消化したBluescriptにクローニングした。単離したクロー ンのシークエンシングは、Pharmacia社製のシークエンシングキットを用いて行 った。5'-RACE増幅は、GIBCO-BRL社製のキットを用いて製造業者の説明書に従っ て行った。簡単に説明すると、E10.5マウス胚の後方領域から単離した全RNA［後 肢芽(hindlimb)の後部:「テイルRNA」］５μｇを第１鎖のcDNA合成用の鋳型として 用いた。２組のネスティド(nested)プライマーをそれぞれAPプライマー［プライ マーBS4l：5'GCG AAT TCC CTG AAG TGC CCG AAG TAC TCG ATT 3'(配列番号7)］ およびUAPプライマー［プライマーBS57：5'GGC TCC GTG AAA TGT CAC AG 3'(配 列番号８)］と組合せて用いた。第１のPCR反応では、Pax4の既知配列の５’領域 の近傍に位置するPax4に特異的な１つのプライマーを、市販のキット（GIBCO-BR L社製の5'RACEシステム）の「AP」プライマー：5'CGT AGT ACT GTC GAC TAG CAG GGI IGG GII GGG IIG 3'(配列番号９)と共に用いた。この「AP」プライマーは 、dC-テイルを付けたcDNAとアニーリングするdG-テイルに連結したアダプターを 含んでいる。第２の反応では、「ネスティド」Pax4プライマー（「ネスティド」と は、第１の反応で用いたPax4プライマーの５’側寄りまたは「上流」に位置する ことを意味する）を、市販の「UAP」プライマー［APプライマーのアダプター配 列のみを含むプライマー：5'CGT AGT ACT GTC GAC TAG CA 3'(配列番号10)］と 共に用いた。第１のPCR（AP／BS41プライマー）はdC-テイルを付けたcDNA５μｌ を用いて行った(９４℃で1.5分；55℃で1.5分；72℃で３分、を35サイクル)。こ の得られたPCR反応物（20倍希釈物）２μｌを、プライマーUAP／BS57を用い、94 ℃で１分；60℃で１分；72℃で2.5分を40サイクル行うことにより再増幅した。 ゲル電気泳動を行った後、およそ500ntの単一のバンドが見えた。これを電気溶 出し、TA-pGEMベクター（PROMEGA社製）にクローニングした。この方法によって 、180ntの５’側の新 らしい配列情報が得られた。３’RACE増幅を、2.5μｇの「テイル」E10.5 RNAを 鋳型として用いて行った。第１鎖cDNAの合成は、第１鎖cDNA合成キット（Pharma cia社製）に添付のNotI-オリゴdTプライマーを用いて行った。第１のPCRはNotI プライマー［5'AAC TGG AAG AAT TCG CGG CCG CAG GAA 3'(配列番号11)］および BS36プライマー［5’CAG GAA GAC CAG AGC TTG CAC TGG 3'(配列番号12)］を用 いて行った。35サイクル（94℃、1.5分；55℃、1.5分；72℃、３分）行った。こ のPCR反応物（20倍希釈物）２μｌをネスティドプライマー［BS42:5’GCG GAT C CC ACA GGA ATC GGG CTA TCT TC 3'(配列番号13)］およびNotlプライマーを用い て再増幅した。ゲル電気泳動した後、２％低融点アガロースゲルから約550ntの 顕著なバンドを切り出した。２μｌの溶融アガロースを、別のネスティドプライ マー［BS59：5’GCG CAG GCA AGA GAA GCT GA 3'(配列番号14)］およびNotIプラ イマーを用いて再増幅した。最後の２回のPCRは、60℃、1.5分；72℃、３分；94 ℃、1.5分を40サイクルとした。420ntの顕著なバンドを電気溶出し、TA-pGEMベ クターにサブクローニングした。増幅した5'および3’PCRフラグメントの忠実度 は、２種類の方法で評価した。すなわち、第１として、「テイル」E10.5 RNAか ら、最も5'側および3'側にある新規な配列から設計されたプライマー［センスプ ライマー：5’CTT CCA GAA GGA GCT CTC 3'(配列番号15)、およびそのアンチセ ンスプライマー：5’TGG GAT GAT GGC ACT TGT C 3'(配列番号16)］を用いて、1 .1kbのフラグメントを増幅した。そのサイズおよび配列は予想したとおりであっ た。また、PCRで単離した３つのフラグメント（5'-、6l5ntおよび3'-）の配列を ゲノムクローン中の対応するコード領域と比較した。 Pax4の発現を分析したところ、その転写物が前脊髄および早期発生段階にある 膵臓では数個の細胞に限られることが判明した。発生過程でのこの遺伝子の機能 を調べるために、本出願人らは、Pax4-欠損マウスを作出した（実施例１を参照 ）。ペアードボックスドメインの ほぼ全体を欠失させ、β-ガラクトシダーゼ遺伝子をPax4のアミノ末端とインフ レームで融合させた後、ES細胞における相同組換え後のＰax4の不活性化を行っ た(図1a)。このアプローチにより、本出願人は、LacZ活性の検出によって、発生 全体を通してのPax4の発現をより詳細に分析できる。 ヘテロ接合性マウスは明らかな異常は示さず、それらは生存可能であり繁殖能 力がある。発生10.5日目の(+/-)胚（E10.5）を染色することにより、背側膵内の 細胞におけるLacZ活性が明らかになった。LacZ活性を検出するために、マウス胚 および単離した新生児膵臓のX-gal染色を標準的手順に従って行った。４％パラ ホルムアルデヒド中で４℃にて一夜にわたって後固定を行った。免疫組織化学の ために、X-gal染色した胚および組織をパラフィンに包埋し、ミクロトームで薄 切した(10μＭ)。Pax4(+/-)胚の膵臓におけるLacZの発現は、出生時まで続いた 。ヘテロ接合性新生児の膵臓では、lacZ活性は、LacZとインスリンとの同時発現 によって判定した場合に、ランゲルハンス島内のβ細胞に相当する不連続な領域 に制限されていることが判った(図1Cおよびd)。 Pax4欠損の子孫が予想どおりのメンデル分布で生まれた。このことは、Pax4の 不存在が子宮(utero)では致命的ではないことを示している。出生時、Pax4(-/-) マウスは正常に見え、その同腹子と区別できなかった。しかし、48時間後、それ らには成長の遅れが現われ、脱水症状を示した(図1c)。Pax4欠損マウスは生後３ 日間以内に全て死亡した。このことは、突然変異型表現型の完全な浸透度を実証 している。新生児Pax4(-/-)マウスの膵臓は肉眼で見たところ正常な外観を示し た。Pax4(-/-)突然変異体マウスの膵臓におけるLacZの発現についても調べた。E 10.5(-/-)胚では、ヘテロ接合性胚と同じように、LacZ活性は背側膵の細胞内で 検出された。Pax4(+/-)および(-/-)胚の発生途中の膵臓では、ほぼE16.5まではL acZ活性の発現に差異は全く見られなかった。しかしながら、この後、Pax4欠損 マウスの膵 臓では、LacZの発現は低下し始め(図2a、ｂと2e，ｆとを比較せよ)、出生後は検 出不可能になった(図2dと2gとを比較せよ)。 実施例３：Pax4ターゲティング化マウスにおけるインスリンおよび グルカゴンの発現 膵臓において、全ての内分泌細胞は共通の多能性前駆細胞から発生する(Alper t，Cell 53(1988)，295-308)。インスリンおよびグルカゴンを含む最初の前駆細 胞はE9.5付近に現れる[Gittesら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89(1992)，1128 -1132;Teitelmanら，Development 118(1993)，1031-1039]。マウスの膵臓におい て、外分泌細胞および大部分の内分泌細胞の分化は、発生のE16.5付近で始まる[ Githens，The Pancreas:biology，pathobiology，and disease．第２版，（編集 ：Vay Llang W．Goら）Raven，New York，(1993)，21-73]。出生時、インスリン の産生は、主に完全に分化したβ細胞（ランゲルハンス島の中心に位置する）に 限られる。これらは、グルカゴン産生α細胞によって囲まれている。β細胞は、 大部分が内分泌集団であるが、α細胞ではほんの一部がそれに該当するにすぎな い(Slack，Development 121(1995)，1569-1580)。本出願人らは、Pax4ヘテロ接 合性およびPax4ヌル突然変異体マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴ ンの発現について、文献に記載［Oliverら，EMBO J．7(1988)，3199-3209］のよ うにして行なわれるパラフィン切片についての免疫化学によって試験した。 E10.5では、インスリン産生細胞は、Pax4(+/-)および(-/-)胚の膵臓において 検出された。E16.5ヘテロ接合性胚では、全てのインスリン細胞は、LacZ活性の 領域内に含まれていることがわかった(図2a)。先に述べたように、ヘテロ接合性 新生児マウスでは、LacZおよびインスリンは同じ細胞内で検出され(図2c)、この ことは、発生の後期のPax4発現がインスリン産生β細胞に限られることを示して いる。これに対して、Pax4(-/-)E16.5胚および新生児マウスの膵臓では、 インスリン産生細胞は、検出されたとしてもほんの少ししか検出されなかった( 図2e，g)。このことは、Pax4の不存在下で膵β細胞の成熟が影響を受けたことを 示している。E10.5(+/-)および(-/-)胚の膵臓では、グルカゴンを含む細胞が存 在している。ヘテロ接合性E16.5胚では、細胞中にグルカゴンが検出され、その 大部分はLacZ活性領域内に含まれていた(図2b)。新生児ヘテロ接合性膵臓では、 グルカゴンはLacZが発現される領域周辺の細胞中に存在していたが、該領域の内 部には含まれていなかった(図2d)。Pax4(-/-)E16.5胚および新生児マウスの膵臓 では、かなり多数のグルカゴン産生細胞が見出された。これらの細胞もまた、異 常に密集した分布を示した(図2fおよびh)。 実施例４：Pax4ターゲティング化マウスにおけるPdx1の発現 Pax4欠損新生児マウスの膵臓にはβ細胞が存在しないことをさらに確認するた めに、特異的なβ細胞マーカーであるPdx1の発現を試験した。この遺伝子は、膵 臓発生の非常に初期に（おそらくは最も初期の膵前駆細胞中に）見られるが、後 期では完全に分化したβ細胞に限られる(Guzら，Development 121，11−18(1995 );Millerら，EMBO J．13(1994)，1145-1156)(図3c)。その初期の発現は、E10.5 マウス胚のホールマウント免疫染色法(whole-mount immunostaining)により確立 されたプロトコール（Ohlssonら，EMBO J．13(1994),1145−1158）を用いてアッ セイした。但し、脱色は24時間とした。染色後、E10.5胚を後固定し、ゼラチン- BSAマトリックスに包埋し、ビブラトーム(vibratome)で薄切した。クリオスタッ ト切片上での免疫染色による新生児膵臓でのPdx1発現は、先に記載のようにして 、次にような改変を加えて行った。すなわち、新生児膵臓は４％パラホルムアル デヒドで３時間固定し、次に30％ショ糖（PBS中）で一夜凍害防御した。二次抗 体を洗い出した後、切片を0.6％H₂O₂で20分インキュベートした。E10.5では、Pa x4(+/+)および(-/-)胚の両方の膵 臓において、Pdx1は同様に発現した(図3a、b)。しかしながら、Pa・x4欠損新生児 マウスの膵臓では、Pdx1発現は検出されなかった。このことは、Pax4ヌル突然変 異体マウスの膵臓には成熟β細胞が存在しない、という最初の結論を確証するも のである。また、Pax4は最も初期の内分泌前駆細胞の生産には必要ではないかも しれないが、β細胞の分化には非常に重要であることも示唆される。 実施例５：Pax4ターゲティング化マウスにおけるソマトスタチンの 発現 マウス胚形成中に、ソマトスタチン産生細胞はα細胞やβ細胞よりも遅れて分 化を始める(Teitelmanら，Development 118(1993),1031-1039)。Pax4(+/+)新生 児マウスの膵臓では、ソマトスタチン産生δ細胞は主に島の周辺部に分布し、α 細胞と入り混じっていた(図3e)。このことは、Pax4の不活性化もまたδ系譜の成 熟に影響を及ぼしたことを示唆している。しかし、消化管におけるソマトスタチ ンの発現は影響を受けていないように思えた。 実施例６：Pax4ターゲティング化マウス由来の新生児膵臓の組織学 的分析 外分泌膵臓は、小葉に分かれた分枝状の細葉状腺であり、ピラミッド型の分泌 細胞と基底核(basal nuclei)とを有する(Pictet，Devl．Biol．29(1972)，436-4 36)(図4a)。新生児Pax4(-/-)膵臓の組織学的分析から、この腺には外分泌組織が 存在することが示された。しかし、外分泌細胞の細胞質は拡大していると思われ 、それらの核は均一な基底状態の分布(basal distribution)は示さなかった(図4 b)。３日齢の野生型マウスの膵臓を特定の外分泌酵素（α-アミラーゼ）の存在 について分析したところ、大部分の外分泌組織がそのようなマーカーの発現を殆 ど、または全く示さなかった(図4c)。このことが、通常は哺乳の後で生じる外分 泌消化酵素の欠乏を最も反映している ようである(Githens，The Pancreas:biology，pathobiology，and disease．第 ２版（Vay Liang W．Goら編）Raven，New York，(1993)，21-73)。出生時、Pax4 欠損マウスは、胃がミルクで満たされているので、乳を吸うことができる(図1c) 。しかし、３日齢のPax4(-/-)膵臓は、全ての外分泌細胞においてα-アミラーゼ の強い発現を示し、このことは、それらが酵素を消化管に分泌することができな かったであろうことを示すものである(図4d)。 上記の実施例の結果から導かれる、膵細胞の発生に及ぼすPax4およびPdx1遺伝 子の影響についての結論を図５に示す。 実施例７：ヘテロ接合性およびホモ接合性Pax4突然変異体新生児 マウスの膵臓におけるインスリンおよびグルカゴン濃度 ヘテロ接合性またはホモ接合性新生児Pax4-LacZマウスから得た完全な膵臓に おけるインスリンおよびグルカゴン産生をラジオイムノアッセイ(RIA)で定量し た。野生型動物とヘテロ接合性動物とのインスリンまたはグルカゴン濃度には有 意な差は見られなかった(図6)。ところが、ホモ接合性動物ではインスリン濃度 は著しく、かつほぼ完全に失われたが、グルカゴンレベルは３倍に増大している ことが認められた。これらの結果は免疫化学により得られた結果(実施例3)と合 致しており、Pax4が欠損している突然変異型動物の膵臓にはβ細胞がほぼ完全に 存在せず、正常値より多いα細胞集団が存在することを実証している。これらの 観察結果から、Pax4が膵臓の発生過程でのβ細胞の形成に必要とされることが実 証される。 インスリンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット（カ タログ番号RI-13K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。野生型お よび突然変異型マウスから妊娠e19で帝王切開により生まれる直前に膵臓を摘出 した。個々の膵臓を酸抽出緩衝液(80mlエタノール，17.9ml蒸留水，2.1ml濃HCl) 40μｌ中に入れ、氷上で音波処理してそれらのタンパク質内容物を抽出した。４ ℃で一 夜インキュベーション後、サンプルを13000rpmで15分遠心した。次に上清を新し い試験管に移し、1:1000から1:10,000に希釈した各タンパク質抽出物についてRI Aを実施した。簡単に述べると、各希釈抽出物100μｌをラット・インスリン抗体 100μｌおよび¹²⁵I-インスリン標識100μｌと共に４℃で18時間インキユベート した。次に、サンプルを１mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15 分遠心した。上清をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数 した。グルカゴンについてのRIAは、Linco Researchから販売されているキット （カタログ番号GL-32K）を使って製造業者の説明書にしたがって実施した。新生 児野生型および突然変異型膵臓から上記のようにタンパク質を分離し、各希釈サ ンプル100μｌをラット・グルカゴン抗体100μｌと共に４℃で18時間、続いて^{12 5} I-グルカゴン標識100μｌと共に４℃で24時間インキュベートした。次に、サン プルを１mlの沈殿用試薬中４℃で20分沈殿させ、2000rpmで15分遠心した。上清 をデカントし、ペレットをシンチレーションカウンターで計数した。 実施例８：膵臓腫瘍細胞系におけるPax4の発現 各種のインスリノーマ(RIN 5F，β TCl)、グルカゴノーマ（αTC 1-9)、ソマ トスタチノーマ(RIN 14β)、島腫瘍(HC 13，HC 13T，RINm)、腺管癌(mPAC)およ び腫瘍AR42J細胞系におけるPax4発現レベルを分析した(図7)。βTClおよびαTC 1-9細胞系では低レベルのPax4発現が検出され、これは正常マウスのβ細胞にお ける内分泌の低レベル発現を反映するものであった。RINm、RIN 5F、RIN 14β、 HC 13TおよびmPac細胞系では発現は全く認められなかった。 興味深いことに、膵臓の外分泌組織中の腫瘍に由来するAR42J細胞［Christoph e J，Am．J．Physiol．266(1994)，G963-G971に概説されている］では高レベル のPax4発現が検出された。さらに、この細胞系では第二の大きなRNAメッセンジ ャー転写物が検出され、このことは、Pax4の対 立遺伝子の１つにおいてゲノム修飾されている可能性を示唆している。Pax遺伝 子が関与する染色体再編成は、肺胞性（alveolar）横紋筋肉腫のような特定の腫 瘍の発生と関連がある[Galiliら，Nature Genetics5(1993)，230-205;Davlsら， Cancer Res．54(1994)，2869-2872]。AR42J細胞で得られた結果から、そうした 染色体再編成がPax4遺伝子座内で起こって、該タンパク質の特性を改変し得るこ と、そして腫瘍表現型に関連し得ることが示唆される。 各種細胞系における発現レベルは、例えばSambrookら"Molecular Cloning:A L aboratory Manual"，CSH Press，Cold Spring Harbor，1989に記載のような慣用 のノーザンブロット分析法によって評価した。簡単に説明すると、細胞をトリプ シン処理し、１mlのホモジナイズ用緩衝液（3MLiCl、6M尿素、0.1％SDS）を含む 試験管に移し、氷上で20秒間３〜４回音波処理した。４℃で一夜インキュベーシ ョンした後、溶解物を18600rpmで30分間遠心分離した。RNAペレットを1mlの3M L iCl中で２回洗浄し、500μｌの可溶化緩衝液（10mM Tris-Cl pH 7.5，0.5％SDS ）に溶解し、フェノール−クロロホルム抽出により精製し、続いてエタノール沈 殿を行った。20μｇのRNAがアガロースゲル上で移動し、標準ノーザンブロット プロトコールに従ってナイロン膜に転写した。次に、膜をマウスPax4 cDNAプロ ーブ(EMBL受託番号Y09584)、マウス・グルカゴンcDNAプローブ（EMBL受託番号Z4 6845）またはラット・インスリンcDNAプローブ（EMBL受託番号J04807）のいずれ かを用いてハイブリダイズさせた。細胞系RINm(カタログ番号CRL-2057)、RIM 5F （カタログ番号CRL-2058）およびRIN 14β(カタログ番号CRL-2059)はアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞系βTCl、αTC 1-9、H C 13、HC 13TおよびmPacはRiplTaq2トランスジェニックマウス［Hanahan，D.，N ature 315(1985)，115-122］から慣用の組織培養法を用いて単離できる。細胞系 AR42Jは、ラット膵臓由来のアザセリン誘導悪性小節から誘導できる[Longnecker ら，Cancer lett．7(1979)，197-202]。 実施例９：別のPax4cDNA配列のクローニング β細胞cDNAライブラリーから別のPax4 cDNA配列を単離した。この配列（配列 番号17）は、1131位の後ろにヌクレオチドＧが付加されていること以外は配列番 号１に示すヌクレオチド配列と同一であり、その付加の結果、1214位で別の転写 終結コドンを利用することになった。したがって、こうして得られた配列番号17 により生じるタンパク質のＣ末端中の11個のアミノ酸は修飾され、配列番号１に よって生じるタンパク質と比較した場合にアミノ酸17個分だけ長くなっている。 β細胞cDNAライブラリーは、βTC1細胞系から、Stratagene社製のZAP-cDNA合 成キット（カタログ番号200400）を用い、製造業者の説明書に従って作製できる 。このライブラリーの約１×10⁶個のクローンをプレートし、ナイロン膜に写し 取り、高ストリンジェンシー下で³²Ｐ標識Pax4プローブ（EMBL受託番号Y09584） を用いてハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは６×SSPE、５×Denh ardts、0.5％ SDS、0.1mg/ml変性サケ精子DNA中で65℃で一夜行い、続いて、２ ×SSC／0.5％SDS中で65℃にて30分間の洗浄を２回、そして0.1×SSC／0.5％SDS 中で65℃にて30分間の洗浄を１回行った。陽性のクローンをプラーク精製し、得 られたcDNA配列をStratagene社製の迅速切出キット（rapid excision kit）(カ タログ番号211204)を用いて単離した。ヌクレオチド配列は、標準シークエンス 法を用いて、例えばSambrookら，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual” ，CSH Press，Cold Spring Harbor，1989に記載のようにして得た。 以上、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明してきたが、添付の請求の範囲 により規定される本発明は、上記説明において示した特定の細部により限定され るものでなく、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多くの明らかな変更 が可能であることを理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物の膵細胞の分化状態を試験する方法であって、 （a）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4 mRNAのレベルまたは状態を確認し、か つ／または （b）前記哺乳動物の膵細胞中のPax4タンパク質のレベルまたは状態を確認 し、そして （c）Pax4 mRNAおよび／またはPax4タンパク質の前記レベルまたは状態を、 正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、 ことを含んでなる方法。 ２.（d）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6 mRNAのレベルまたは状態を確認し、か つ／または （e）前記哺乳動物の膵細胞中のPax6タンパク質のレベルまたは状態を確認 し、そして （f）Pax6 mRNAおよび／またはPax6タンパク質の前記レベルまたは状態を、 正常膵細胞中の対応するレベルと比較する、 ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記哺乳動物が、 （i） 胚体期、 （ii）新生児期、または （iii）成体期、 にある、請求項１または２に記載の方法。 ４．前記哺乳動物がマウスである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ６．ステップ（a）および／または（b）と場合により（d）および／または（e） をin vivoで実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ７．ステップ（a）および／または（b）と場合により（d）および／または（e） をin vitroで実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 ８．ステップ（a）と場合によりステップ（d）での前記確認を、 （i） Pax4遺伝子の少なくとも一部に一致し、好ましくはPax4タンパク質 の少なくとも一部をコードする核酸配列、および場合によりPax6遺伝子の少なく とも一部に一致し、好ましくはPax6タンパク質の少なくとも一部をコードする第 ２核酸配列、 （ii） （i）の核酸配列に相補的な核酸配列、または （iii）（i）もしくは（ii）の核酸配列とハイブリダイズするプライマーま たはプライマー対、 を用いて行う、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 ９．ステップ（b）と場合によりステップ（e）での前記確認を、Pax4タンパク質 と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを使用し、場合により、Pax6タ ンパク質と特異的に結合する第２の抗体またはそのフラグメントを使用して行う 、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。 10．前記膵細胞がβ細胞またはδ細胞である、請求項１〜９のいずれか１項に記 載の方法。 11．前記発生状態が膵細胞の悪性度または悪性力の指標となる、請求項１〜10の いずれか１項に記載の方法。 12．（a'）前記試験に先立って、前記哺乳動物から固形膵臓腫瘍を摘出すること 、および （b'）前記試験後、Pax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過剰発現して いる場合は、前記腫瘍の細胞における前記遺伝子の発現を少なくとも部分的に排 除すること、またはPax4遺伝子および場合によりPax6遺伝子が過少発現している か発現していない場合は、前記遺伝子の発現を促進すること、もしくは発現可能 な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を前記 細胞に導入すること、および （b''）ステップ（b'）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物に再導入 すること、 をさらに含む、請求項11に記載の方法。 13.前記β細胞の発生状態が若年性糖尿病の指標となる、請求項１〜１０のいず れか１項に記載の方法。 14.前記β細胞の発生状態を胚体または新生児の状態で行う、請求項13に記載の 方法。 15．前記新生児を、前記若年性糖尿病を好転または軽減する薬剤で治療すること をさらに含む、請求項14に記載の方法。 16．前記発生状態が薬剤の活性または遺伝子治療法の結果である、請求項１〜10 のいずれか１項に記載の方法。 17．前記薬剤がmRNAまたはタンパク質のレベルでPax4遺伝子の発現レベルと場合 によりPax6遺伝子の発現レベルとに影響を与える、求項16に記載の方法。 18．場合によっては同時にPax6ノックアウトマウスであり得るPax4ノックアウト マウスで前記発生状態を試験する、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。 19．膵臓α細胞または膵管上皮細胞に発現可能な機能性Pax4遺伝子を導入し、場 合により発現可能な機能性Pax6遺伝子を導入することをさらに含む、請求項１〜 10のいずれか１項に記載の方法。 20．少なくとも１つの不活性化Pax4対立遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動 物。 21．少なくとも１つの不活性化Pax6対立遺伝子をさらに含む、請求項20に記載の トランスジェニック哺乳動物。 22．ヒト、マウスまたはラットである、請求項20または21に記載のトランスジェ ニック哺乳動物。 23．哺乳動物の糖尿病および／または神経障害を治療し、予防し、および／また は遅延させるための医薬組成物を調製するための、有効 な用量の、発現可能な機能性Pax4タンパク質をコードする核酸配列および場合に より発現可能な機能性Pax6タンパク質をコードする第２核酸配列の使用。 24．前記核酸配列がPax4タンパク質および場合によりPax6タンパク質の発現およ び／または前記タンパク質の特定細胞へのターゲティングを可能にする調節エレ メントに機能しうる形で連結されている、請求項23に記載の使用。 25．哺乳動物の糖尿病および／または神経障害を治療し、予防しおよび／または 遅延させるための医薬組成物を調製するための、有効な用量の機能性Pax4タンパ ク質および場合により機能性Pax6タンパク質の使用。 26．前記哺乳動物がヒト、マウスまたはラットである、請求項23〜25のいずれか １項に記載の使用。 27．糖尿病の治療方法であって、 （a）哺乳動物から細胞を取り出し、 （b）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6 遺伝子を前記細胞に導入し、そして （c）ステップ（b）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種 の哺乳動物に再導入する、 ことを含んでなる方法。 28．神経障害の治療方法であって、 （a）唾乳動物から細胞を取り出し、 （b）発現可能な機能性Pax4遺伝子および場合により発現可能な機能性Pax6 遺伝子を前記細胞に導入し、そして （c）ステップ（b）の産物として得られた細胞を前記哺乳動物にまたは同種 の哺乳動物に再導入する、 ことを含んでなる方法。 29．前記哺乳動物がヒト、マウスまたはラットである、請求項27または28に記載 の方法。 30．前記細胞が生殖細胞もしくは胚性細胞またはそれらに由来する細胞である、 請求項27〜29のいずれか１項に記載の方法。 31．前記細胞が卵細胞またはそれに由来する細胞である、請求項27〜29のいずれ か１項に記載の方法。