JP2000508539A - Ｓｔｒ座位の多重増幅 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、ＰＣＲ又はその他の増幅系を使用して、多重反応において、含まれる各座位の対立遺伝子を１回の反応で測定する、複数の異なる座位の同時増幅に関する。測定する座位には、ＨＵＭｖＷＦＡ３１、ＨＵＭＬＩＰＯＬ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＦ１３Ａ１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＴＨＯ１、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ３Ｓ１５３９が含まれる。
Description
【発明の詳細な説明】
ＳＴＲ座位の多重増幅
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、米国特許出願第０８／３１６，５４４号（出願日１９９４年９月30
日）の一部係属出願である。親出願の全ての開示は参照することにより本明細書
に組み込まれる。
連邦政府後援研究又は開発に関する記載
適用せず。
発明の背景
本発明は、一般的に、ゲノム系における遺伝子マーカーの検出に向けられる。
より詳細には、本発明は、多重系（multiplex system）内に含まれる各座位の対
立遺伝子を１回の反応で測定するための、ポリメラーゼ連鎖反応又はその他の増
幅系を使用した、多数の別個の多型性座位の同時増幅に向けられる。
近年、遺伝子マーカーとしての多型性ＳＴＲ（polymorphic short tandem rep
eats）の発見及び開発が、連鎖地図の開発、不健全な遺伝子(diseased gene)の
同定及び特徴付け並びにＤＮＡタイピング（DNA typing）の単純化及び精密化に
おける進歩を刺激してきた。
少なくともヒトゲノムにおける多数の座位は、多型性ＳＴＲ領域を含んでいる
(Adamson,D.,et al.(1995)"A collection of ordered tetranucleotide-repeat
markers from the human genome,"Am.J.Hum.Genet.57:619-628;Murray,J.C.,et
al.(1994)"A comprehensive human linkage map with centimorgan density,"Sc
ience 265:2049-2054;Hudson,T.J.,Engelstein,M.,Lee,M.K.,Ho,E.C.,Rubenfiel
d,M.J.,Adams,C.P.,Housman,D.E.,and Dracopoli,N.C.(1992)"Isolation and ch
romosomal assignment of 100 highly informative human simple sequence rep
eat polymorphisms,"Genomics 13:622-629)。ＳＴＲ座位
は、長さ３〜７塩基の短い反復配列要素から構成される。ヒトゲノムには、２，
０００，０００の予想される三量体又は四量体ＳＴＲが、１５ｋｂ毎に１つの頻
度で存在していると推測されている(Edwards et al.(1991)"DNA typing and gen
etic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats."Am.J.Hum.Genet
.49:746-756;Beckman,J.S.,and Weber,J.L.(1992)"Survey of human and rat mi
crosatellites,"Genomics 12:627-631)。Edwardsら（1991）により研究されたＳ
ＴＲ座位のほぼ半数が多型性であり、遺伝子マーカーの豊富な供給源を提供して
いる。
特定の座位におけるＳＴＲ単位の数の変動は、対立遺伝子間及び個体間におけ
るその部位のＤＮＡの長さの変化を引き起こす。そのような長さの多型性は、Ｖ
ＮＴＲ(variable number tandem repeat)座位(Nakamura,Y.,et al.(1987)"Varia
ble number of tandem repeat（VNTR）markers for human gene mapping,"Scien
ce 235:1616-1622)及びミニサテライト座位(Jeffreys,A.J.,et al.(1985)"Hyper
variable’minisatellite’regions in human DNA,"Nature 314:67-73)（両者と
もにＳＴＲ座位よりもかなり長い反復単位を含んでいる）を暗示している。長さ
の多型性は、ミニサテライト座位のジヌクレオチド反復形態(Litt,M.and Luty,J
.A.（1989）"A hypervariable microsatellite revealed by in-vitro amplific
ation of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene,”Am
.J.Hum.Genet.44:397-401,Tautz,D.,et al.(1986)"Cryptic simplicity in DNA
is a major source of genetic variation,"Nature 322:652-656,Weber,J.L.and
May,P.E.(1989)"Abundant class of human DNA polymorphisms which can be t
yped using the polymerase chain reaction,"Am.J.Hum.Genet.44:388-396;Beck
mann and Weber,(1992))、ＳＴＲ座位よりも短い反復単位を有するマイクロサテ
ライト座位形態を暗示している。
多型性ＳＴＲ座位は、ヒト同定用、父性検査用及び遺伝子マッピング用マーカ
ーとして極めて有用である。ＳＴＲ座位は、直列型反復配列（tandem repeat）
に隣接する領域おいて同定された特異的プライマー配列を用いたポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）により増幅されるだろう。
これらの座位の対立遺伝子は、増幅した領域内に含まれる反復配列のコピー数
により差別化され、放射能、蛍光、銀染色及び呈色を含むあらゆる適切な検出方
法による電気泳動的分離にしたがい互いに区別される。
労力、材料及び分析時間を最小化するために、多数の座位及び／又はより多く
のサンプルを同時に分析することが望ましい。この目的に対する１つのアプロー
チは、単一反応における多数の座位の同時増幅を含んでいる。「多重」増幅と呼
ばれる方法が、広く文献に記載されている。多重増幅セットは、ヒトの遺伝子疾
患、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー(Chamberlain,J.S.,et al.(1988)"D
eletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex
DNA amplification,"Nucleic Acid Res.16:11141-11156;Chamberlain,J.S.,et
al.(1989),"Multiple PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy
,"In PCR Protocols,A Guide to Methods and Application(ed.Gelfand,D.H.,et
al.)pp.272-281.Academic Press,San Diego,CA;Beggs,A.H.,et al.(1990)"Dete
ction of 98% DMD/BMD gene deletions by PCR,"Hum.Genet.86:45-48;Clemens,P
.R.,et al.(1991)．"Carrier detection and prenatal diagnosis in Duchenne
and Becker muscular dystrophy families,using dinucleotide repeat polymor
phisms,"Am J.Hum.Genet.49:951-960;Schwartz,J.S.,e tal.（1992）"Fluoresce
nt multiple linkage analysis and carrier detection for Duchenne/Becker's
muscular dystrophy,"Am J.Hum.Genet.51:721-729;Covone,A.E.,et al.（1992
） "Screening Duchenne and Becker muscular dystrophy patients for delet
ions in 30 exons of the dystrophin gene by three-multiplex PCR,"Am.J.Hum
.Genet.51:675-677)、レッシュ・ナイハン症候群(Gibbs,R.A.,et al.(1990)"Mul
tiple DNA deletion detection and exon sequencing of the hypoxanthine pho
sphoribosyltransferase gene in Lesch-Nyhan families,"Genomics 7:235-244)
、嚢胞性線維症(Estivill,x.,et al.（1991）"Prenatal diagnosis of cystic f
ibrosis by multiplex PCR of mutation and microsatellite alleles,"Lancet
338:458;Fortina,P.,et al.(1992)"Non-radioactive detection of the most co
mmon mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulato
r gene by multiplex polymerase chain reaction,"Hum.Genet.90:375-378;Ferr
ie,R.M.,et al.(1992)
"Development,multiplexing,and application of ARMS tests for common mutat
ions in the CFTR gene,"Am.J.Hum.Genet.51:251-262;Morral,N.and Estivill,X
.(1992)"Multiplex PCR amplification of three microsatellites within the
CFTR gene,"Genomics 51:1362-1364)及び網膜芽細胞腫（Lohmann,D.,et al.(199
2)"Detection of small RB1 gene deletions in retinoblastoma by multiplex
PCR and high-resolution gel electrophoresis,"Hum.Genet.89:49-53）などに
関連する遺伝子の解析用に広く開発されてきた。多型性マイクロサテライトマー
カーの多重増幅(Clemens et al.(1991);Schwartz et al.(1992);Huang,T.H.-M.,
et al.(1992)"Genetic mapping of four dinucleotide repeat loci DXS435,DXS
45,DXS454,DXS424,on the Xchromosome using the multiplex polymerase chain
reaction,"Genomics 13:375-380)及びＳＴＲマーカーの多重増幅(Edwards,A.,e
t al.(1992)"Genetic variation at five trimeric and tetrameric tandem rep
eat loci in four human population groups,"Genomics 12:241-253;Kimpton,C.
P.,et al.(1993)"Automated DNA profiling employing multiplex amplificatio
n of short tandem repeat loci,"PCR Methods and Applications 3:13-22;Namm
ond,H.A.,et al.(1994)"Evaluation of 13 STR loci for use in personal iden
tification applications,"Am.J.Hum.Genet.55:175-189;Schumm,J.W.et al.（19
94）"Development of nonisotopic multiplex amplification sets for analysi
s of polymorphic STR loci,"in"The Fourth International Symposium on Huma
n Identification 1993,"pp.177-187;Oldroyd,N.J.,et al.(1995)"A highly dis
criminating octoplex short tandem repeat polymerase chain reaction syste
m suitable for human individual identification,"Electrophoresis 16：334-
337)が記載されている。
これらの増幅産物は、通常、当業者に既知の幾つかの電気泳動法の１つにより
分離する。増幅産物の周知の検出方法の幾つかが記載されている。幾つかのケー
スにおいては、増幅した断片の臭化エチジウム染色又は銀染色が使用されている
が、他方では、増幅した物質の２本鎖の１つのみを標識する方法を使用すること
が好ましい。この例としては、ある座位を増幅する前に、２つのプライマーの１
つを放射性標識又は蛍光標識することが含まれる。検出に対するより洗練された
アプローチの１つは、異なる蛍光標識を使用して、異なる座位を示す増幅物質を
検出することであるが、電気泳動にしたがう同一の空間が存在する。異なる座位
の産物は、フィルター又は一度に１つの蛍光標識を可視化することができるその
他の識別力のある検出器を用いて差別化される。
国際公開第９３／１８１７７号及び第９３／１８１７８号パンフレット（Fort
inaら）について言及すると、対立遺伝子特異的多重ポリメラーゼ連鎖反応系を
使用した、嚢胞性線維症及びβ−サラセミアなどの疾患の診断方法及び診断キッ
トに向けられている。Fortinaらにしたがうと、多重ＰＣＲを多数の標的配列の
同時増幅に使用し、アガロースゲルの２つのレーンを使用して変異対立遺伝子を
スキャンする。
Ballabio,A.らは、("PCR Tests for Cystic Fibrosis Deletion,"Nature,343:
220(1991))で、Ｆ５０８嚢胞性線維症変異検出用の２つの異なる色素で標識した
蛍光プライマーを使用しての、単一の管での、多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ試験
を開示している。
特定の座位についての多重増幅手順が存在するが、その他の型の座位、例えば
特定のＳＴＲ座位における対立遺伝子検出についての多重増幅手順の使用が強く
望まれている。そのような座位の多重増幅を可能にするプライマーを同定するこ
とも望まれている。
発明の要約
本発明の目的は、多重系内に含まれる各座位の対立遺伝子を１回の反応で測定
するための、ＰＣＲ又はその他の増幅系を使用した、多数の別個の多型性ＳＴＲ
座位の同時増幅のための方法及び材料を提供することである。本明細書に開示す
る特定のＳＴＲ座位のセットの多重分析については、従来技術において開示され
ていない。ＳＴＲ座位の多重増幅に有用であることが示されている、以下に示す
本明細書に開示された多数のプライマーの配列についても過去においてまったく
開示されていない。
特定の座位を含む多重増幅に特異的な方法、キット及びプライマーを提供する
ことも本発明の目的である。
これら及びその他の目的は、各多重系の個々の座位に存在する対立遺伝子を同
時分析又は測定するための方法及び材料に向けられている本発明により扱われる
(address)。一般的に、本発明の方法は、(ａ)分析する少なくとも１つのＤＮＡ
サンプルを得る工程であって、ＤＮＡサンプルが一緒に増幅することができる少
なくとも２つの座位を有している工程、(ｂ)ＤＮＡサンプル中のＳＴＲ配列を増
幅する工程、及び(ｃ)使用した系の多型性を明らかにする方法で、増幅した物質
を検出する工程からなる。
より詳細には、本発明の方法は、１以上のＤＮＡサンプルに由来する少なくと
も３つの直列型反復座位に存在する対立遺伝子を同時測定する方法であって、以
下に示す工程：
（ａ）分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡ
サンプルが増幅することができる少なくとも３つの座位のセットを有しており、
座位のセットが本明細書に開示された特定の群又はセットから選ばれる工程、
（ｂ）多重増幅反応において座位のセットを同時増幅する工程であって、反応
産物がセット中の同時増幅した各座位に由来する増幅した対立遺伝子の混合物で
ある工程、
（ｃ）混合物中の増幅した対立遺伝子を評価して、ＤＮＡサンプル内のセット
における分析した各座位に存在する対立遺伝子を測定する工程からなる。
本発明の１つ態様においては、３つのＳＴＲ座位を一緒に増幅する。３つの同
時増幅する座位のセットは、
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７；及び、
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１３Ｓ３１７からなる群より選ばれる。
本発明の方法のより好ましい態様においては、ＤＮＡサンプルは、一緒に増幅
することができる少なくとも４つのＳＴＲ座位を有し、同時増幅する座位のセッ
トは、
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ９Ｓ９３０
、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ１
４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ１７Ｓ１２
９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ２２Ｓ６８３、
ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、
ＨＵＭＦ１３Ａ０１、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ、ＨＵＭｖＷＦＡ
３１からなる群より選ばれる。
より好ましくは、一緒に増幅する少なくとも４つのＳＴＲ座位のセットは、以
下に示す４つの座位：
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；及び、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、ＨＵＭｖＷＦＡ３１からなる
セットより選ばれる。
より好ましくは、一緒に増幅するＳＴＲ座位のセットは、６つの座位のセット
であり、以下に示す座位のセット：
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ；及び、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳから選ばれる。
更に、より好ましくは、一緒に増幅するＳＴＲ座位のセットは、７つの座位の
セットであり、以下に示す座位のセット：
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１；及び、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩから選ばれる。
更に、より好ましくは、一緒に増幅するＳＴＲ座位のセットは、８つの座位の
セットであり、以下に示す座位のセット：
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１；及び、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬから選ば
れる。
本発明の方法の多重増幅反応工程は、好ましくは、反応において同時増幅する
座位のセットにおける各座位に隣接（フランキング）するプライマー対を使用し
て行われる。より好ましくは、対立遺伝子をゲル電気泳動により分離するとき、
反応において同時増幅したセット内のその他の座位の対立遺伝子とは重複しない
各座位由来の対立遺伝子を生成する多重増幅反応用に、プライマー対を選択する
。更に、より好ましくは、多重増幅反応において使用するプライマーの各対の１
つの配列は、以下に示すプライマー配列：
セット内の座位の１つがＤ７Ｓ８２０であるとき、配列番号１、配列番号２；
セット内の座位の１つがＤ１３Ｓ３１７であるとき、配列番号３、配列番号４
；
セット内の座位の１つがＤ５Ｓ８１８であるとき、配列番号５、配列番号６；
セット内の座位の１つがＤ３Ｓ１５３９であるとき、配列番号７、配列番号８
、配列番号４９；
セット内の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９８であるとき、配列番号９、配列番号
１０；
セット内の座位の１つがＤ２０Ｓ４８１であるとき、配列番号１１、配列番号
１２、配列番号５２、配列番号５３；
セット内の座位の１つがＤ９Ｓ９３０であるとき、配列番号１３、配列番号１
４、配列番号５５、配列番号６１；
セット内の座位の１つがＤ１０Ｓ１２３９であるとき、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号５４；
セット内の座位の１つがＤ１４Ｓ１１８であるとき、配列番号１７、配列番号
１８；
セット内の座位の１つがＤ１４Ｓ５６２であるとき、配列番号１９、配列番号
２０；
セット内の座位の１つがＤ１４Ｓ５４８であるとき、配列番号２１、配列番号
２２；
セット内の座位の１つがＤ１６Ｓ４９０であるとき、配列番号２３、配列番号
２４；
セット内の座位の１つがＤ１６Ｓ７５３であるとき、配列番号２５、配列番号
２６；
セット内の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９９であるとき、配列番号２７、配列番
号２８；
セット内の座位の１つがＤ１６Ｓ５３９であるとき、配列番号２９、配列番号
３０、配列番号５８；
セット内の座位の１つがＤ２２Ｓ６８３であるとき、配列番号３１、配列番号
３２、
セット内の座位の１つがＨＵＭＣＳＦ１ＰＯであるとき、配列番号３３、配列
番号３４、
セット内の座位の１つがＨＵＭＴＰＯＸであるとき、配列番号３５、配列番号
３６、
セット内の座位の１つがＨＵＭＴＨ０１であるとき、配列番号３７、配列番号
３８、
セット内の座位の１つがＨＵＭｖＷＦＡ３１であるとき、配列番号３９、配列
番号４０、配列番号５９、配列番号６０、
セット内の座位の１つがＨＵＭＦ１３Ａ０１であるとき、配列番号４１、配列
番号４２、
セット内の座位の１つがＨＵＭＦＥＳＦＰＳであるとき、配列番号４３、配列
番号４４、
セット内の座位の１つがＨＵＭＢＦＸＩＩＩであるとき、配列番号４５、配列
番号４６、
セット内の座位の１つがＨＵＭＬＩＰＯＬであるとき、配列番号４７、配列番
号４８、
セット内の座位の１つがＤ１９Ｓ２５３であるとき、配列番号５０、配列番号
５１、
セット内の座位の１つがＤ４Ｓ２３６８であるとき、配列番号５６、配列番号
５７からなる群より選ばれる。
本発明の方法において、増幅した対立遺伝子は、好ましくは増幅した対立遺伝
子をサイズ標準（size standard）と比較することにより評価する。サイズ標準
は、ＤＮＡマーカー及び座位特異的アレリックラダー（allelic ladder）アレリ
ックラダー）からなるサイズ標準の群から選ばれる。対立遺伝子の評価は、好ま
しくは対立遺伝子を分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して行われ
、これにより分離した対立遺伝子を含むポリアクリルアミドゲルを形成する。ポ
リアクリルアミドゲル中の分離した対立遺伝子は、好ましくは適切な技術、例え
ば銀染色などを用いて可視化することにより測定する。より好ましくは蛍光分析
により測定する。
蛍光分析は、好ましくは、多重増幅反応に使用する各プライマー対の１つのプ
ライマーを、反応に使用する前に蛍光標識で標識することにより行う。各プライ
マーを標識するために使用する蛍光標識は、好ましくはフルオレセイン標識又は
テトラメチルローダミン標識である。最も好ましくは、少なくとも２つの異なる
標識を使用して、多重増幅反応に使用する異なるプライマーを標識する。
本発明の方法を使用して分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルは、好まし
くはヒト組織から分離したものであり、好ましくは血液、精液、膣細胞、毛髪、
唾液、尿、骨、口腔サンプル、胎盤細胞又は胎児細胞を含む羊水及び前記組織の
あらゆる混合物からなる群より選ばれる組織である。
代替の態様においては、本発明は、少なくとも３つの座位中のＳＴＲ配列を同
時分析するためのキットであって、これは少なくとも３つのＳＴＲ座位のセット
を同時増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー対を有する容器を含んでい
る。ここで座位のセットは、以下に示す座位のセット：
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１３Ｓ３１７；
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８；
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、ＨＵＭｖＷＦＡ３１；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ；
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ
１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１；および、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３
Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬから選ば
れる。
キットに含まれる各プライマー対の少なくとも１つのプライマーは、好ましく
は前記本発明の方法の記載に列挙した配列の群の１つから選ばれる配列を有して
いる。
第三の態様においては、本発明は、ヒトＤＮＡの特定のＳＴＲ座位を増幅する
ためのプライマー配列及びプライマー対である。ヒトＤＮＡの多重分析のための
本発明のプライマー及びプライマー対の使用は、以下に示される。本発明のプラ
イマーは、本発明の方法の使用に適しており、本発明の方法の評価工程において
、増幅した対立遺伝子をどのように測定するかどうかに依存して、標識化又は標
識化されていない形態で使用することができる。
前記において簡潔に記載した種々の態様全てにおいて、本発明は、座位の特定
の組合せと特定の条件を使用した、多型性遺伝子マーカーの検出及び分析用の高
処理方法及び材料を提供する。評価工程に対して適切な検出技術を選択すること
により、本発明の材料及び方法は、電源及びポリアクリルアミドゲル電気泳動用
の標準装置又は蛍光ゲルスキャニング用の最新設備を有する装置、例えばフルオ
ロイメージャー５７５（登録商標）FluorlmagerTM575（モレキュラー・ダイナミ
ックス(Molecular Dynamics)、サニーヴェール、カリフォルニア）若しくはヒタ
チＦＭＢＩＯ(登録商標)(Hitachi FMBIOTM)(サンブルーノ、カリフォルニア)蛍
光スキャナー又はＡＢＩ３７３及びＡＢＩプリズム３７７（登録商標）（ABI Pr
ismTM377）ＤＮＡシークエンサー（応用バイオシステム部門、パーキンエルマー
(Perkin Elmer)、フォスターシティ、カリフォルニア）のみを有する実験室にお
いて使用することができる。したがって、本発明の方法は、種々の用途及び実験
室に適応する。
本発明において特定されるアプローチは、多重系（multiplex）に含まれる座
位の分析において時間、労力及び材料を節約する。本発明の方法は、３以上、更
には８以上の座位を、別々の管内で各座位を独立して増幅させる代わりに、１回
の増幅反応を使用して、１つの管内で一緒に増幅させることを可能にする。
本発明は、法医学分析、父子鑑別、骨髄移植のモニター、連鎖地図作成並びに
遺伝子疾患及びガンの検出の分野において特定の用途を有する。３以上の座位を
同時に増幅及び分析することが可能になることにより、本発明の材料及び方法は
、２つの異なる個体の血液又はその他の組織から分離したＤＮＡの適合性の確実
性を有意に増加させる。異なる個体の少量の組織を正確に区別することの必要性
は、多数の有罪判決（及び無罪判決）がＳＴＲ座位の分析を含むＤＮＡタイピン
グ分析に依存している法医学用途において特に重要である。
科学者、特に法医学者は、２つの組織サンプルの適合性が統計学的に有意であ
ることを保証するための、ＤＮＡの多数の多型性座位の分析の必要性を長い間認
めてきた(Presley,L.A.et al.(1993)"The implementation of the polymerase c
hain reaction(PCR)HLA DQ alpha typing by the FBI laboratory,"in"The Thir
d International Symposium on Human Identification 1992,"pp.245-269;Bever
,R.A.,et al.(1992)"Characterization of five VNTR loci by Hae III RFLP an
alysis:application to paternity testing,"in"The Second International Sym
posium on Human Identification 1991,"pp.103-128.)。しかしながら、本発明
までに、１回の反応で３以上のＳＴＲ座位を同時に分析する方法はほとんど存在
しなかった。多重増幅（Multiplexing）能力の重要性を明確に理解するため
には、ＤＮＡタイピング分析の背後にあるいくつかの数学を理解することが役立
つ。
説明目的のために、あらゆるＳＴＲ座位が、１０に１の頻度で１つ遺伝子型（
すなわち２つの対立遺伝子のパターン）を有すると仮定する。換言すれば、ラン
ダムに選択した２つの個体が１つのＳＴＲについて適合した型を有している可能
性は１／１０であると仮定するいうことである。しかしながら、２つの異なるＳ
ＴＲ座位を分析する場合、両方の系が任意に適合する（random match）可能性は
１／１００となる。３つのＳＴＲ座位を分析する場合、３つの系それぞれが任意
に適合する可能性は１／１０００となる。結果として、３をこえる座位について
分析すべきＳＴＲ座位の数の著しい増加が、一般集団内の任意適合の可能性を有
意に減少させ、これにより容疑者のタイプと犯行現場の証拠とを比較することに
より容疑者を正確に同定（又は推定）する機会が増加することを理解することは
容易である。同様の論法を使用することにより、本発明の方法は、父子鑑定にお
ける疑わしい父親の同定の正確性、骨髄組織の正確な適合、連鎖地図の研究から
得られる有意な結果の発見並びに遺伝子疾患及びガンの検出の可能性を増加させ
るだろう。
本発明の更なる目的、特徴及び利点は、以下に示す発明の詳細な説明及び図面
より明らかになるだろう。
図面の簡単な説明
図１は、実施例１において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８
１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図２は、実施例２において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ
８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図３は、実施例３において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｓ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ
８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図４は、実施例４において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８
１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図５は、実施例５において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８
１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図６は、実施例６において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１
８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図７は、実施例７において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ
８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図８は、実施例８において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ
８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図９は、実施例９において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキャナ
ー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を用い
て検出した、座位Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８
１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１０は、実施例１0において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１１は、実施例１１において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１２は、実施例１２において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ
８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１３は、実施例１３において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１４は、実施例１４において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ
５Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１５は、実施例１５において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１６は、実施例１６において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５
Ｓ８１８の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図１７は、実施例１７において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング(Hitachi Software Engine
ering)、サンブルーノ、カリフォルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６
Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ
（「ＣＳＦ１ＰＯ」）及びＨＵＭＴＰＯＸ（「ＴＰＯＸ」）の同時増幅産物の蛍光検
出結果を示すレーザープリンター像である。
図１８は、実施例１８において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１ＰＯ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ(「Ｔ
ＰＯＸ」)及びＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）の同時増幅産物の蛍光検出結果を示
すレーザープリンター像である。
図１９は、実施例１９において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１ＰＯ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ(「Ｔ
ＰＯＸ」)、ＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）及びＨＵＭｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）
の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図２０は、実施例２０において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１（「Ｆ１３Ａ０１」）及びＨＵＭＦＥＳＦ
ＰＳ（「ＦＥＳＦＰＳ」）の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンタ
ー像である。
図２１は、実施例２１において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標)（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１（「Ｆ１３Ａ０１」）、ＨＵＭＦＥＳＦＰ
Ｓ（「ＦＥＳＦＰＳ」）及びＨＵＭＢＦＸＩＩＩ（「Ｆ１３Ｂ」）の同時増幅産物の
蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図２２は、実施例２２において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１（「Ｆ１３Ａ０１」）、ＨＵＭＦＥＳＦＰ
Ｓ（「ＦＥＳＦＰＳ」）、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ（「Ｆ１３Ｂ」）及びＨＵＭＬＩＰＯ
Ｌ（「ＬＰＬ」）の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像であ
る。
図２３は、実施例２３において、ＦＭＢＩＯ（登録商標）蛍光スキャナー（登
録商標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォ
ルニア）を用いて検出した、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１
７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１ＰＯ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ(「Ｔ
ＰＯＸ」)、ＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）及びＨＵＭｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）
の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である。
図２４は、実施例２４において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ
２０Ｓ４８１の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である
。
図２５は、実施例２５において、フルオロイメージャー（登録商標）蛍光スキ
ャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）を
用いて検出した、座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ
２０Ｓ４８１の同時増幅産物の蛍光検出結果を示すレーザープリンター像である
。
図２６は、実施例２６において、３つの座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０及
びＤ１３Ｓ３１７の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
図２７は、実施例２７において、４つの座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、
Ｄ１３Ｓ３１７及びＨＵＭｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）の同時増幅産物の銀染色検
出結果を示す写真である。
図２８は、実施例２８において、３つの座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０
及びＤ１３Ｓ３１７の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
図２９は、実施例２９において、３つの座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０
及びＤ４Ｓ２３６８の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
図３０は、実施例３０において、４つの座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０
、
Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真
である。
図３１は、実施例３１において、３つの座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３
及びＤ１３Ｓ３１７の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
図３２は、実施例３２において、４つの座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３
、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写
真である。
図３３は、実施例３３において、４つの座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３
、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写
真である。
図３４は、実施例３４において、３つの座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０
及びＤ２０Ｓ４８１の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
図３５は、実施例３５において、３つの座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６
８及びＤ２０Ｓ４８１の同時増幅産物の銀染色検出結果を示す写真である。
発明の詳細な説明
Ａ．定義
以下に示す定義は、用語の範囲及び詳細の明確かつ矛盾のない理解を提供する
ことを援助することを意図している。
アレリックラダー：座位に由来する増幅した対立遺伝子から構成される標準的
な大きさのマーカー。
対立遺伝子：ＤＮＡのセグメントと関連する遺伝的変異。すなわち、同一の座
位を占めるＤＮＡ配列の２以上の代替形態(alternate form)。
生化学命名法：本明細書においては、標準的な生化学命名法を使用して、アデ
ニンをＡ、チミンをＴ、グアニンをＧ、シトシンをＣと表す。例えば、対応する
ヌクレオチドはデオキシグアノシン−５’−３リン酸（ｄＧＴＰ）である。
ＤＮＡ多型性：ＤＮＡ配列中の２以上の異なるヌクレオチド配列が、同一種群
（same interbreeding population）に共存している状態。
座位：染色体上の特定の部位。座位の対立遺伝子は、相同染色体の同一部位に
位置している。
座位特異的プライマー：増幅方法を使用する条件下、座位の少なくとも１つの
対立遺伝子について規定された座位又はその相補鎖の部分と特異的にハイブリダ
イズするが、その他のＤＮＡ配列とは効率的にハイブリダイズしないプライマー
。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：変性、プライマーを用いたアニーリング及
びＤＮＡポリメラーゼを用いた伸張のサイクルを使用して、標的ＤＮＡ配列のコ
ピー数を約１０6倍又はそれ以上に増幅する技術。核酸増幅用ポリメラーゼ連鎖
反応は、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号明細書に
よりカバーされている。これらの方法の記載については参照することにより本明
細書に組み込まれる。
多型性ＳＴＲ座位：ゲノムＤＮＡの特定の領域における反復配列要素の数（及
び配列の正味の長さ）が、対立遺伝子間及び個体間で変化しているＳＴＲ座位。
多型情報量（polymorphism information content）(ＰＩＣ)：ある座位に存在
する多型性の量の尺度(Botstein et al.，1980)。ＰＩＣ値は０〜１．０の範囲
にあり、高い値は多型性の程度が高いことを示している。通常、この尺度は、一
般に使用される尺度、例えばヘテロ接合性よりも小さい値を示す。有益性の高い
（約７０％をこえるヘテロ接合性）マーカーについては、ヘテロ接合性とＰＩＣ
との間の差異はわずかである。
一次反応：精製ヒトゲノムＤＮＡをＰＣＲ用の鋳型として使用した初期反応。
プライマー：プライマーの３’末端が最近接状態（closest proximity）にあ
るように、座位の対立鎖とハイブリダイズする、２つの１本鎖オリゴヌクレオチ
ド又はＤＮＡ断片。
プライマー対：プライマー１及びプライマー２を含む２つのプライマーであっ
て、プライマー１は、増幅するＤＮＡ配列の一方の１本鎖と一方の末端でハイブ
リダイズし、プライマー２は、増幅するＤＮＡ配列の相補鎖上の他方の末端とハ
イブリダイズする。
プライマー部位：プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの領域。
二次反応：一次反応の希釈を使用して、ＰＣＲ用鋳型として同一又は異なるプ
ライマー対を用いての再増幅。
ＳＴＲ座位：長さ３〜７塩基対の、短い、反復配列要素を含むヒトケノム領域
。
Ｂ．多重反応成分の選択
本発明の方法は、適切な座位のセット、プライマー及びを選択して、大きさに
おいて重複しない多数の同時増幅した座位に由来する増幅した対立遺伝子、又は
大きさにおいて重複している増幅した対立遺伝子を互いに区別できるようにする
方法で標識した同時増幅した座位に由来する増幅した対立遺伝子を生成すること
を企図している。更に、本発明の方法は、１回の増幅プロトコルを用いての使用
に適合するＳＴＲ座位の選択を企図している。本明細書に記載する座位の特定の
組み合わせは、本出願に特有である。座位の組み合わせは、前記２つの理由によ
り又は、適切な産物収量を生成しない１以上の座位若しくは本発明の反応におい
て生成する真正の対立遺伝子を表さない断片との組合せで拒絶されるだろう。
本明細書に開示した組み合わせに加えて、成功する組み合わせを、座位の組み
合わせの試行錯誤、プライマー対配列の選択、及び全ての含まれる座位が増幅す
る平衡（equilibrium）を同定するためのプライマー濃度の調節により生成する
ことができる。本発明の方法及び材料を開示した後において、本発明の方法及び
キットにおける使用のための、座位、プライマー対及び増幅技術の種々の選択方
法は、当業者に容易に示唆されるだろう。そのような方法の全ては、請求の範囲
内にあることが意図される。
本発明の方法の実施において特に重要なのは、多重増幅反応工程において一緒
に増幅する個々の座位から生成する、増幅した対立遺伝子の大きさの範囲である
。現在の技術を使用しての分析を容易にするために、５００塩基よりも小さい断
片の増幅により検出することができる系が最も好ましい。最も好ましい座位の組
み合わせ、プライマー及び増幅技術は、前記の発明の概要に記載されている。
プライマーの不適切な選択により、幾つかの好ましくない影響、例えば増幅の
不足、多数の部位における増幅、プライマーの二量体形成、異なる座位に由来す
るプライマー配列の好ましくない相互作用、別の座位由来の対立遺伝子と重複す
るある座位由来の対立遺伝子の生成又は、多重系と適合しない異なる座位用の増
幅条件及びプロトコルの必要性が生じる。本発明の方法に使用するプライマーの
合成は、当業者に既知のオリゴヌクレオチド合成用の標準的手順を使用して行う
ことができる。
Ｃ．３より多い座位を使用した多重系を開発するための、３つの対立遺伝子の多
重系の使用
多数の異なる技術のいずれかひとつを使用して、本発明の方法を使用して分析
するＳＴＲ座位のセットを選択することができる。本発明の分析方法における使
用に有用な座位のセットを開発するための１つの好ましい技術を以下に記載する
。３つの座位を含む多重系を開発した後、それをコアとして使用して、３より多
い座位を含む多重系を作成してもよい。第一の３つ座位を含む新しい組み合わせ
を作成した。例えば、座位Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８を含
むコアの多重系を使用して、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及
びＤ５Ｓ８１８からなる多重系誘導体；ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、
Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８からなる多重
系誘導体；ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、Ｄ１６Ｓ５
３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８からなる多重系誘導体及
びＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１
、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８からなる多
重系誘導体を生成した。
座位のコアのセットを使用して、本発明の方法を使用した多重分析用のＳＴＲ
座位の適切な誘導体のその他のセットを生成することができることが企図される
。本発明の方法を使用して分析する座位を選択するために使用する方法にかかわ
らず、多重分析用に選択する全ての座位は以下に示す特徴を有していなければな
らない。（１）最小の滑り(minimal slippage)（例えば、増幅工程中の繰り返し
配列の読み違いに由来するもの）を生成すること;（２）多重増幅工程中の増幅
した対立遺伝子への塩基の付加または削除に由来する人工産物（artifact）がた
とえ存在するとしても少数であること;（３）ポリメラーゼによる増幅反応の早
すぎる終了に由来する人工産物がたとえ存在するとしても少数であること及び（
４）連続的単一塩基の削除に由来する、与ある真性の増幅した対立遺伝子よ
りも低分子量の「トレーリング(trailing)」バンドが存在しないこと。Schumm e
t al.,"Development of Nonisotopic Multiplex Amplification Sets for Analy
sis of Polymorphic STR Loci,"Fourth International Symposium on Human Ide
ntification 1993,pp.177-187(pub.by Promega Corp.,1993)を参照のこと。
Ｄ．ＤＮＡサンプルの調製
単一の座位の増幅に適合するあらゆるＤＮＡ調製方法を使用して、本発明の方
法に使用するためのヒトゲノムＤＮＡサンプルを調製することができる。以下に
示す文献に記載される方法を含む多数の方法が、本発明の方法に使用するための
ゲノムＤＮＡサンプル調製に適しているが、これに限定されるものではない。
Patel,P.I.,et al．(1984)”Organization of the HPRT gene and related sequ
ences in the human genome,"Somat Cell Mol Genet 10:483-493,and Gill,P.,e
t al.(1985)"Forensic application of DNA'fingerprints',"Nature 318:577-57
9。
本発明の方法に使用する前に、ＤＮＡ濃度を、あらゆる標準的なＤＮＡ検出方
法を使用して測定することができる。しかしながら、ＤＮＡ濃度は、好ましくは
、Brunk C.F.,et al.4(1979)"Assay for nanogram quantities of DNA in cellu
lar homogenates,"Anal Biochem 92:497-500に記載されるような測定技術を使
用して蛍光定量的に測定する。より好ましくは、ＤＮＡ濃度は、Waye et al.(19
79)Waye,J.S.,et al.(1991)"Sensitive and specific quantification of human
genomic deoxyribonucleic acid(DNA)in forensic science specimens:casewor
k examples,"J．Forensic Sci.,36:1198-1203に記載されるような、ＤＮＡ標準
とヒト特異的プローブとのハイブリダイゼーション量と比較することにより測定
する。増幅反応に多数の鋳型ＤＮＡを使用すると、真の対立遺伝子を示さない余
計なバンドとして現れる人工産物が生じる。
Ｅ．ＤＮＡの増幅
ヒトゲノムＤＮＡサンプルを単離し、その濃度の前記の様にして測定した後、
標的の座位を、本発明の方法の多重増幅工程で同時増幅することができる。ポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）(Saiki,R.K.,et al.（1985）"Enzymatic amplifica
tion of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia,"Science 230:1350-1354)、転写を基本とし
た増幅（Kwoh,D.Y.,and Kwoh,T.J.（1990）"Target amplification systems in
mucleic acid-based diagnostic approaches,"American Biotechnology Laborat
ory,October,1990）及び鎖置換増幅（ＳＤＡ）（Walker,G.T.,et al.（1992）"I
sothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme-DNA Poly
merase system,"Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:392-396）を含む多数の異なる
増幅方法のいずれかひとつを使用して座位を増幅することができるが、これらに
限定されるものではない。好ましくは、ＤＮＡサンプルを、プライマー対及びセ
ット中の各座位に特有の熱サイクル条件を使用したＰＣＲ増幅に付する。以下に
示す実施例に使用したプライマー配列を詳述している、本明細書の最後の配列表
について言及すると、幾つかの配列は、本発明の代替の態様である。
本発明の方法に使用する座位の最も好ましい組合せに対する最も好ましい増幅
プロトコルの詳細を、以下に示す実施例に記載する。各多重系に関連する特定の
手順の更なる詳細を、実施例で言及する。実施例において使用した座位特異的プ
ライマーの配列は、ハイブリダイゼーションで使用する条件下において、増幅す
る座位の対立遺伝子とハイブリダイズするのに十分であり、その他の座位の対立
遺伝子の増幅を本質的に免れている多数のヌクレオチドを含んでいる。米国特許
第５，１９２，６５９号明細書（Simons）について言及すると、遺伝子特異的プ
ライマーのより詳細な記載について参照することにより、その教示は本明細書に
組み込まれる。
Ｆ．ＤＮＡ断片の分離及び検出
増幅した対立遺伝子のセットを、本発明の多重増幅工程から生成した後、増幅
した対立遺伝子を評価する。本発明の方法の評価工程は、多数の異なる手段のい
ずれかひとつにより達成することができる。最も好ましい方法を以下に記載する
。
好ましくは、電気泳動を使用して、多重増幅反応産物を分離する。より好まし
くは変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動である(Sambrook,J.et al.(1989)In M
olecular Cloning−A Laboratory Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Lab
oratory Press,pp.13.45-13.57を参照のこと)。最も好ましいゲル調製及び電気
泳動手順並びに本発明の方法の評価工程に使用する条件を実施例１に記載する。
変性ポリアクリルアミドゲル中におけるＤＮＡ断片の分離は、断片の大きさを基
礎にして起こる。
増幅した対立遺伝子をポリアクリルアミドゲル中で分離した後、ゲル中の対立
遺伝子及びその他のあらゆるＤＮＡ（例えば、ＤＮＡマーカー又はアレリックラ
ダー）を可視化し、分析することができる。ゲル中のＤＮＡの可視化は、銀染色
、又は放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質及び検出することができる基質と
組合せた酵素などの報知物質（reporter）を含む多数の従来技術のいずれかひと
つを使用して達成することができる。銀染色は、ゲル中の対立遺伝子を可視化す
る好ましい方法である(Bassam,B.J.,et al.(1991)"Fast and sensitive silver
staining of DNA in polyacrylamide gels,"Anal.Biochem.196:80-83を参照のこ
と)。より好ましい方法は、多重反応における各座位用に放射性標識（Hammond e
t al.,(1994)を参照のこと）又は蛍光標識（Schumm et al.,(1994)を参照のこと
）したプライマーを使用し、それぞれオートラジオグラム又は蛍光定量的検出器
を使用して標識した生成物を検出することである。対立遺伝子を可視化する先行
技術の方法について記載している前記３つの文献は、参照することにより本明細
書に組み込まれる。
ＤＮＡサンプル中に存在する対立遺伝子は、好ましくは、サンプル中の各座位
に存在する対立遺伝子を測定するためのサイズ標準、例えばＤＮＡマーカー又は
座位特異的アレリックラダーと比較することにより測定する。２以上の多型性Ｓ
ＴＲ座位を含む多重増幅評価用の最も好ましいサイズ標準は、評価する各座位に
ついてのアレリックラダーの組合せから構成される。例えば、Schummら(supra,p
.178)のアレリックラダー及びラダー構築方法の記載を参照のこと。
各座位用の蛍光標識したプライマーを使用して生成した、２以上の多型性ＳＴ
Ｒ座位を含む多重増幅評価用の好ましいサイズ標準は、評価する座位についての
蛍光標識したアレリックラダーの組合せから構成される。
個々の座位用のアレリックラダーの構築に続いて、アレリックラダーを混合し
、増幅したサンプルのローディングと同時に、ロードしてもよい。各アレリック
ラダーは、対応の座位に由来するサンプル中の対立遺伝子と同等に移動（co-
migrate）する。
データの永久記録は、オートマチック・プロセッサー・コンパチブル(Automatic
Processor Compatible)（ＡＰＣ）フィルム（ＳＴＲシステムズマニュアル＃Ｔ
ＭＤ００４、プロメガ・コーポレーション(Promega Corporation)、マデイソン、
ウィスコンシンから入手可能）又は蛍光検出装置（ＳＴＲシステムズマニュアル
＃ＴＭＤ００６、プロメガ・コーポレーション、マディソン、ウィスコンシンか
ら入手可能）を使用して生成することができる。
Ｇ．好ましい検出技術：蛍光検出
本発明の方法の最も好ましい態様のひとつにおいては、蛍光検出を使用して、
多重増幅反応により生成した混合物中の増幅した対立遺伝子を評価する。以下に
記載するのは、検出方法が好ましくはどのように行われるかを要約したものであ
る。
自動蛍光イメージングの出現により、多重増幅産物の迅速な検出及び分析を達
成することが可能になった。蛍光分析については、１つのフルオレセイン標識化
プライマーを、各座位の増幅に含ませることができる。蛍光標識プライマーの２
つの好ましい種類、すなわちフルオレセイン標識化（ＦＬ−）プライマー及びテ
トラメチルローダミン標識化（ＴＭＲ−）プライマーの使用についての記載は、
以下に示す実施例に含まれる。標識プライマーを使用しての、生成した増幅した
断片の分離は、銀染色検出方法とまったく同様の様式で達成する。ゲルをスキャ
ンし、非常に短時間、例えば３〜２０分間でデータをデジタル化する、フルオロ
イメージャー分析器（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフ
ォルニアより入手可能）又はＦＭＢＩＯ（登録商標）（ヒタチ・コーポレーショ
ン(Hitachi Corporation)、サンブルーノ、カリフォルニアより入手可能）を使
用して、得られたゲルを分析することができる。
要約すれば、本発明の方法は、評価工程において蛍光検出を使用することによ
り最も好ましく実施される。好ましい検出方法においては、多重増幅反応に使用
するプライマーの各対の１つが、プライマーに結合する蛍光標識を有している。
その結果、増幅反応より生成した増幅した対立遺伝子は、蛍光標識されている。
本発明の最も好ましい態様においては、増幅した対立遺伝子を、ポリアクリルア
ミドゲル中で分離し、次いで分離した対立遺伝子を可視化し、蛍光イメージ分析
器を使用して分析する。
蛍光検出は、放射性標識法及び検出法よりも好ましい。なぜなら、放射性物質
の使用及びそれに伴う規制面及び安全面の問題が要求されないからである。
蛍光検出は、非放射性検出方法、例えば銀染色よりも好ましい。なぜなら、蛍
光検出方法は、染色よりも少数のゲル人工産物（gel artifact）を示すからであ
る。少数のゲル人工産物の原因は、おそらく、結合した標識を有する増幅したＤ
ＮＡ断片のみが蛍光検出において検出されるが、一方、銀染色検出方法では、多
重増幅反応より生成した増幅したあらゆるＤＮＡ断片が染色され、検出されると
いう事実にその大部分が帰する。銀染色を用いて染色したポリアクリルアミドゲ
ルは、銀染色のゲル自身への非特異的結合により、一般的にかなり高いバックグ
ラウンドを有し、その結果、ゲル内で検出することができる個々のＤＮＡバンド
に対する感度が低下する。銀染色及び蛍光検出法を、以下に示す２つの実施例に
おいて比較する。
Ｈ．キット
本発明は、前記の方法を利用するキットにも向けられる。基本的なキットは、
各座位用の１以上の座位特異的プライマーを有する容器を含んでいる。使用説明
書を含んでいてもよい。
その他の任意のキット成分は、特定の座位のそれぞれに向けられたアレリック
ラダー、十分量の増幅用酵素、増幅を促進するための増幅緩衝液、ゲル電気泳動
用の増幅物質調製用ローディング溶液(loading solution)、鋳型コントロール（
template control）としてのヒトゲノムＤＮＡ、物質のゲル中での予想される移
動を保証するサイズ標準並びに使用者を教育し、使用中の誤りを制限するため
のプロトコル及びマニュアルを含んでいてもよい。キット中の種々の試薬の量は
、多数の因子、例えば方法の最適の感度等に依存して変化させることができる。
手動適用における使用のためのテストキット又は自動検出器若しくは分析器を用
いての使用のためのテストキットを提供することは、本発明の範囲に含まれる。
実施例
以下に示す実施例は、本発明の利点を説明し、当業者が本発明を製造及び実施
することを補助するために提供される。実施例は、どんなことがあっても、開示
又は特許権による保護の範囲を制限することを意図していない。
ゲノムＤＮＡ単離及び定量化は、文献（Puers,C.,et al.(1993)"Identificati
on of repeat sequence heterogeneity at the polymorphic short tandem repe
at locus HUMTH01[AATG]nand reassignment of alleles in population analysi
s by using a locus-specific allelic ladder,"Am.J.Hum.Genet.53:953-958）
に記載されているものと本質的に同様にして行った。これらの方法は当業者に既
知であり、好ましいものであるが、本発明の適用に対して要求されるものではな
い。
増幅産物は、０．４ｍｍ厚の４％変性ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミ
ド：ビス−アクリルアミド＝１９：１）を用いた電気泳動により分離した。前記
ゲルは７Ｍ尿素（Sambrook et al.,(1989)）を含んでおり、銀染色分析に関する
場合はガラスプレートに化学的に架橋していた(Kobayashi,Y.（1988）"A method
to cast thin sequencing gels,"BRL Focus 10:73-74)。蛍光分析に関する場合
は架橋を使用しなかった。ＤＮＡサンプルを、ローディング溶液２．５μｌ（１
０ｍＭ ＮａＯＨ、９５％ホルムアミド、０．０５％ブロモフェノールブルー、
０．０５％キシレンシアノール）とを混合し、９５℃で２分間変性し、ローディ
ング前に氷中で冷却した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した後、増幅した反応産物及びＤ
ＮＡサイズ標準コントロールを、銀染色、蛍光検出、放射性検出又は前記方法の
組合せを使用して検出した。ある実施例においては、ゲル中の反応産物及びサイ
ズ標準を、先行技術に記載されている標準的染色方法及び検出方法を使用した銀
染色により検出した(Bassam et al.,(1991)を参照のこと)。染色したゲルの永久
イメージは、オートマチック・プロセッサー・コンパチブルフィルム（ＡＰＣフ
ィルム、プロメガ・コーポレーション、カタログ番号ＤＱ４４１１）に暴露する
ことにより得た。その他の実施例においては、検出を、先行技術(Schumm et al.
,(1994))に記載された方法を使用した蛍光スキャンにより行った。
以下に示す実施例は、本発明の方法の使用例であり、ある場合においては、本
発明のプライマーの１種以上を使用して、１以上のＤＮＡサンプルに由来する少
なくとも３つのＳＴＲ座位に存在する対立遺伝子を同時に測定した例である。表
１及び２は、以下に示す各実施例に記載した多重増幅反応において、どの座位の
セットが同時増幅したかを要約したものである。２つの表とも、各多重反応にお
ける各座位の増幅にどのプライマー対を使用したかということも示している。表
１は、本明細書に記載した多重反応に由来する増幅した対立遺伝子を蛍光スキャ
ンニングを使用して検出した実施例のすべてを列挙している。一方、表２は、銀
染色を使用して、増幅した対立遺伝子を検出した実施例を列挙している。
表１に列挙した各プライマー対の１つのプライマーは、多重増幅反応における
使用の前に、蛍光標識した。ある場合においては、異なる標識を使用して、異な
る座位に対するプライマーを標識し、以下に示す実施例において使用する蛍光ス
キャナーを使用してスキャンしたときに、異なるプライマーを使用して生成した
対立遺伝子が互いに区別できるようになるようにした。以下に示す実施例におい
ては、２つの異なる蛍光標識を使用した。表１において、「ＦＬ」はフルオレセ
イン標識化を示し、「ＴＭＲ」はテトラメチルローダミン標識化を示している。
更に表１は、各実施例において、多重増幅反応に使用した各プライマー対うちの
どのプライマーが、標識されているか（例えば、「ＦＬ−２」は、多重増幅反応
に使用する前に、フルオレセインを用いて５’末端を標識した配列番号２のプラ
イマーを意味する）を示している。
同一の「ＦＬ」及び「ＴＭＲ」という略語を以下の実施例において使用する。
しかしながら、標識の略語は、本明細書に記載した増幅反応に使用した標識プラ
イマーの配列番号の直前に置かれる(例えば、「ＦＬ−２」の代わりに、「ＦＬ−
配列番号２」)。
以下に示す４組の実施例（実施例２及び３、４及び５、７及び８並びに１９及
び２３）においては、同一のプライマーのセット及び分析する各ＳＴＲ座位用の
各プライマー対の１つに共有結合により結合した同一の蛍光標識を使用して、同
一の座位のセットを分析した。しかしながら、各実施例においては、異なるプラ
イマーのセットを標識した。これらの実施例の組は、
本発明の方法の多重増幅反応に使用する前に、プライマー対のどのプライマーを
標識したかを問わず、同様の低いバックグラウンド及び同一の対立遺伝子測定結
果が、検出方法として蛍光標識を使用した同一のプライマー対から得ることがで
きることを示すために、本明細書に含まれる。 幾つかのケースにおいては、同一の座位のセット及び同一のプライマー対が、
表１及び表２に現れていることに注意すべきである。このような場合、同一の対
立遺伝子のセットを、それぞれ蛍光染色及び銀染色を使用して分析した。セット
が重複する２つのケースは、実施例２４及び３３並びに実施例２５及び３０であ
る。これらの実施例は、いずれの方法を用いても同一の結果が得られたことを明
確に示している。 実施例１座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー(Perkin Elm
er)、フォスターシティ、カリフォルニア）を、以下に示す増幅プロトコルを用
いて使用した。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で
１．５分間のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で
１．５分間のサイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．２５
μＭのＤ３Ｓ１５３９プライマー１（配列番号７）及び２(ＦＬ−配列番号８)、
各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(ＦＬ−
配列番号２)、各々０．２１９μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３
）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において同時増幅した
ＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２座位Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重 増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１７Ｓ
１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増
幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／
μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォス
ターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。
９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．２５
μＭのＤ１７Ｓ１２９８プライマー１（配列番号９）及び２(ＦＬ−配列番号１
０)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２１９μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番
号３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマ
ー１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１７Ｓ
１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例３座位Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重 増幅の蛍光検出
座位Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８を、
配列番号９をＦＬ−配列番号９で置換して、かつＦＬ−配列番号１０を配列番号
１０で置換したことを除いて実施例２と同様にして増幅した。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図３は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１７Ｓ
１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８ついて同時増幅した
ＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例４座位Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ２０Ｓ
４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．２５
μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号１１）及び２(ＦＬ−配列番号１
２)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２１９μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番
号３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマ
ー１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図４は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ２０Ｓ
４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅した
ＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例５座位Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
座位Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８を、配
列番号１１をＦＬ−配列番号１１で置換して、かつＦＬ−配列番号１２を配列番
号１２で置換したことを除いて実施例４と同様にして増幅した。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図５は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ２０Ｓ
４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅した
ＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例６座位Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増幅 の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ９Ｓ９
３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅し
た。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／
μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォス
ターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。
９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７０
μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号１３）及び２(ＦＬ−配列番号１４)
、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(ＦＬ
−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３
）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図６は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ９Ｓ９
３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅したＤ
ＮＡサンプルを含んでいる。
実施例７座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重 増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増
幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フ
ォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用し
た。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間
のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間
のサイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７５
μＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(ＦＬ−配列番号
１６)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(
ＦＬ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番
号３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマ
ー１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図７は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例８座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重 増幅の蛍光検出
座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８を、
配列番号１５をＦＬ−配列番号１５で置換して、かつＦＬ−配列番号１６を配列
番号１６で置換したことを除いて実施例７と同様にして増幅した。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図８は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例９座位Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１４Ｓ
１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１４Ｓ１１８プライマー１（配列番号１７）及び２(ＦＬ−配列番号１
８)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図９は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１４Ｓ
１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅した
ＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１０座位Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１４Ｓ
５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１４Ｓ５６２プライマー１（ＦＬ−配列番号１９）及び２(配列番号２
０)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１０は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１４
Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１１座位Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１４Ｓ
５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１４Ｓ５４８プライマー１（配列番号２１）及び２(ＦＬ−配列番号２
２)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１１は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１４
Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１２座位Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び
ｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌ
を使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスター
シティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６
℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイク
ルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイク
ルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１６Ｓ４９０プライマー１（ＦＬ−配列番号２３）及び２(配列番号２
４)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１２は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６
Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１３座位Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１６Ｓ７５３プライマー１（配列番号２５）及び２(ＦＬ−配列番号２
６)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１３は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６
Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１４座位Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重 増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１７Ｓ
１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増
幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／
μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォス
ターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。
９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ１７Ｓ１２９９プライマー１（配列番号２７）及び２(ＦＬ−配列番号
２８)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(
ＦＬ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番
号３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマ
ー１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで４５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１４は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１７
Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅
したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１５座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．６０
μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号３
０)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．５０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１５は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６
Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８について同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１６座位Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ２２Ｓ
６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５０
μＭのＤ２２Ｓ６８３プライマー１（配列番号３１）及び２(ＦＬ−配列番号３
２)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．３７５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１６は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ２２
Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８とともに同時増幅し
たＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１７座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８、ＨＵＭ ＣＳＦ１ＰＯ及びＨＵＭＴＰＯＸの多重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ及
びＨＵＭＴＰＯＸにおいて、同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×Ｓ
ＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９
．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００
μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．
０６Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラ
ー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示
す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃
で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃
で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間
のサイクルを１回。
１２種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．６
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．３２５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(
ＦＬ−配列番号２)、各々０．２２μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番
号３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．５５μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー
１（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．４０μＭのＨＵＭＣＳＦ１
ＰＯプライマー（ＴＭＲ−配列番号３３）及び２(配列番号３４)、各０．４０μ
ＭのＨＵＭＴＰＯＸプライマー１（配列番号３５）及び２(ＴＭＲ−配列番号３
６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１７は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜４は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ（「ＣＳＦ１
ＰＯ」）及びＨＵＭＴＰＯＸ（「ＴＰＯＸ」）について同時増幅したＤＮＡサンプ
ルを含んでいる。
実施例１８座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８、ＨＵＭ ＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＴＨ０１の多重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、
ＨＵＭＴＰＯＸ及びＨＵＭＴＨ０１において、同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、
２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１
(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎ
ｇの鋳型及び０．０７Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用して行った。
サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ、カリフォル
ニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２分間；９４℃
で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１０回；９０℃
で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２０回；続いて
６０℃で３０分間のサイクルを１回。
１４種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．３０μＭのＨＵＭＣＳＦ１Ｐ
Ｏプライマー（ＴＭＲ−配列番号３３）及び２(配列番号３４)、各０．４０μＭ
のＨＵＭＴＰＯＸプライマー１（配列番号３５）及び２(ＴＭＲ−配列番号３５)
、各０．４０μＭのＨＵＭＴＨ０１プライマー１（配列番号３７）及び２(ＴＭ
Ｒ−配列番号３８)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１８は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１Ｐ
Ｏ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ（「ＴＰＯＸ」）及びＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）ととも
に同時増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例１９座位Ｄ１６Ｓ５３９、D７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８、ＨＵＭ ＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１及びＨＵＭｖＷＦＡ３１の多重 増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、
ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１及びＨＵＭｖＷＦＡ３１において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０８Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイ
クルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
１６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．３０μＭのＨＵＭＣＳＦ１Ｐ
Ｏプライマー（ＴＭＲ−配列番号３３）及び２(配列番号３４)、各０．４０μＭ
のＨＵＭＴＰＯＸプライマー１（配列番号３５）及び２(ＴＭＲ−配列番号３６)
、各０．４０μＭのＨＵＭＴＨ０１プライマー１（配列番号３７）及び２(ＴＭ
Ｒ−配列番号３８)、各０．４０μＭのＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１（配列
番号３９）及び２(ＴＭＲ−配列番号４０)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図１９は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１Ｐ
Ｏ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ(「ＴＰＯＸ」)、ＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）及びＨＵＭ
ｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）について同時増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２０座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８、ＨＵＭ Ｆ１３Ａ１及びＨＵＭＦＥＳＦＰＳの多重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１及
びＨＵＭＦＥＳＦＰＳにおいて、同時に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１
×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐ
Ｈ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２
００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型
及び０．０６Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用して行った。サーマル
サイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ、カリフォルニア）を
以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２分間；９４℃で１分間
、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１０回；９０℃で１分間
、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２０回；続いて６０℃で
３０分間のサイクルを１回。
１２種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．１０μＭのＨＵＭＦ１３Ａ０
１プライマー１（ＴＭＲ−配列番号４１）及び２(配列番号４２)、各１．０μＭ
のＨＵＭＦＥＳＦＰＳプライマー１（ＴＭＲ−配列番号４３）及び２(配列番号
４４)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２０は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１（「Ｆ１３Ａ
０１」）及びＨＵＭＦＥＳＦＰＳ（「ＦＥＳＦＰＳ」）について同時増幅したＤＮ
Ａサンプルを含んでいる。
実施例２１座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８、ＨＵＭ Ｆ１３Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ及びＨＵＭＢＦＸＩＩＩの多重増幅の蛍光検 出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、
ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ及びＨＵＭＢＦＸＩＩＩにおいて、同時に増幅した。ＰＣＲ
増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
中、５ｎｇの鋳型及び０．０７Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用して
行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ、カ
リフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２分間
；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１０回
；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２０回
；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
１４種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．１０μＭのＨＵＭＦ１３Ａ０
１プライマー（ＴＭＲ−配列番号４１）及び２(配列番号４２)、各１．０μＭの
ＨＵＭＦＥＳＦＰＳプライマー１（ＴＭＲ−配列番号４３）及び２(配列番号４
４)、各０．５０μＭのＨＵＭＢＦＸＩＩＩプライマー１（ＴＭＲ−配列番号４
５）及び２(配列番号４６)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２１は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１(「Ｆ１３Ａ０
１」)、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ（「ＦＥＳＦＰＳ」）及びＨＵＭＢＦＸＩＩＩ（「Ｆ１
３Ｂ」）について同時増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２２座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ １３Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ及びＨＵＭＬＩＰＯＬの 多重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、
ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ及びＨＵＭＬＩＰＯＬにおいて、同時
に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０８Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フ
ォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用し
た。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間
のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間
のサイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
１６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＦＬ−配列番号
３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(Ｆ
Ｌ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライマー１
（配列番号５）及び２(ＦＬ−配列番号６)、各０．１０μＭのＨＵＭＦ１３Ａ０
１プライマー１（ＴＭＲ−配列番号４１）及び２(配列番号４２)、各１．０μＭ
のＨＵＭＦＥＳＦＰＳプライマー１（ＴＭＲ−配列番号４３）及び２(配
列番号４４)、各０．５０μＭのＨＵＭＢＦＸＩＩＩプライマー１（ＴＭＲ−配
列番号４５）及び２(配列番号４６)、各０．２０μＭのＨＵＭＬＩＰＯＬプライ
マー１（ＴＭＲ−配列番号４７）及び２(配列番号４８)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２２は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３Ａ０１(「Ｆ１３Ａ０
１」)、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ(「ＦＥＳＦＰＳ」)、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ（「Ｆ１３Ｂ」
）及びＨＵＭＬＩＰＯＬ（「ＬＰＬ」）について同時増幅したＤＮＡサンプルを含
んでいる。
実施例２３座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣ ＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１及びＨＵＭｖＷＦＡ３１の多重増 幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、
ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１及びＨＵＭｖＷＦＡ３１において、同時に増幅
した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０８Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０(パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア)を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
１６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７
５μＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(ＴＭＲ−配列番
号３０)、各々０．４０μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(
ＴＭＲ−配列番号２)、各々０．３０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列
番号３）及び２(ＴＭＲ−配列番号４)、各々０．６０μＭのＤ５Ｓ８１８プライ
マー１（配列番号５）及び２(ＴＭＲ−配列番号６)、各０．４０μＭのＨＵＭＣ
ＳＦ１ＰＯプライマー１（ＦＬ−配列番号３３）及び２(配列番号３４)、各０．
５０μＭのＨＵＭＴＰＯＸプライマー１（配列番号３５）及び２(ＦＬ−配列番
号３６)、各０．２０μＭのＨＵＭＴＨ０１プライマー１（配列番号３７）及び
２(ＦＬ−配列番号３８)、各０．５５μＭのＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマ−１（
配列番号３９）及び２(ＦＬ−配列番号４０)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドケル電気泳動により分離し、次いでＦＭＢＩＯフルオロイメージャー（登録商
標）（ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング、サンブルーノ、カリフォルニ
ア）を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２３は、同一のゲルを５０５ｎｍ及び６２５ｎｍでスキャン（それぞれ、蛍
光標識物質及びテトラメチルローダミン標識物質を明らかにする）したときの、
各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜３は、座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ
７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ(「ＣＳＦ１Ｐ
Ｏ」)、ＨＵＭＴＰＯＸ(「ＴＰＯＸ」)、ＨＵＭＴＨ０１（「ＴＨ０１」）及びＨＵＭ
ｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）について同時増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２４座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１の多 重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォ
スターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した
。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．７５
μＭのＤ３Ｓ１５３９プライマー１（配列番号７）及び２(ＦＬ−配列番号４９)
、各々０．７５μＭのＤ１９Ｓ２５３プライマー１（ＦＬ−配列番号５０）及び
２(配列番号５１)、各々０．５０μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号
３）及び２(ＦＬ−配列番号４)、各々０．５０μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマ−
１（配列番号５２）及び２(ＦＬ−配列番号５３)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２４は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ３Ｓ
１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１について同時増
幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２５座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の多 重増幅の蛍光検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォ
スターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した
。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．３０
μＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（ＦＬ−配列番号１５）及び２(配列番号
５４)、各々０．４０μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号５５）及び２(
ＦＬ−配列番号１４)、各々０．５０μＭのＤ４Ｓ２３６８プライマー１（配列
番号５６）及び２(ＦＬ−配列番号５７)、各々０．５０μＭのＤ２０Ｓ４８１プ
ライマー１（配列番号５２）及び２(ＦＬ−配列番号５３)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでフルオロイメージャー（登録商標）蛍光ス
キャナー（モレキュラー・ダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア）
を使用した蛍光シグナル検出により可視化した。
図２５は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１について同時増
幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２６
座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０及びＤ１３Ｓ３１７の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０及びＤ１３Ｓ３１７において、同時に増幅した。ＰＣＲ増
幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
）中、５〜２５ｎｇの鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを
使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシ
ティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃
で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクル
を１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクル
を２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５μ
ＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(配列番号５８)、各々
０．５μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(配列番号２)、各
々０．５μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３）及び２(配列番号４)
。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図２６は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜４は、座位Ｄ１６
Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０及びＤ１３Ｓ３１７について同時増幅したＤＮＡサンプ
ルを含んでいる。レーン５は、ＤＮＡテンプレートなしに同一の手順に付したサ
ンプル、すなわち負の対照を示している。
実施例２７座位Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＨＵＭｖＷＦＡ３１の 多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１６Ｓ
５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＨＵＭｖＷＦＡ３１において、同時
に増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、
フォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用
した。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分
間のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分
間のサイクルを２０回；続いて６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．３μ
ＭのＤ１６Ｓ５３９プライマー１（配列番号２９）及び２(配列番号３０)、各々
０．３μＭのＤ７Ｓ８２０プライマー１（配列番号１）及び２(配列番号２)、各
々０．５μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３）及び２(配列番号４)
、各０．５μＭのＨＵＭｖＷＦＡ３１プライマー１（配列番号５９）及び２(配
列番号６０)。
増幅した産物を、３２ｃｍゲル中、４０Ｗで５０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図２７は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜３は、座位Ｄ１６
Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＨＵＭｖＷＦＡ３１（「ｖＷＡ」）
について同時増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例２８
座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ１３Ｓ３１７の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ１３Ｓ３１７において、同時に増幅した。ＰＣＲ
増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
中、５ｎｇの鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用して
行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ、カ
リフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２分間
；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１０
回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２０
回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(配列番号５４)、各
々０．３μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号５５）及び２(配列番号６
１)、各々０．５μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３）及び２(配列
番号４)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図２８は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜３は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ１３Ｓ３１７について同時増幅したＤＮＡサン
プルを含んでいる。
実施例２９
座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ４Ｓ２３６８の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ４Ｓ２３６８において、同時に増幅した。ＰＣＲ
増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
中、ｎｇ数が未確定の鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを
使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシ
ティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃
で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクル
を１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクル
を２０回、６０℃で３０分間のサイクルを１回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(配列番号５４)、
各々０．３μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号５５）及び２(配列番号
６１)、各々０．１５μＭのＤ４Ｓ２３６８プライマー１（配列番号５６）及び
２(配列番号５７)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６０分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図２９は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜６は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ４Ｓ２３６８とともに同時増幅したＤＮＡサン
プルを含んでいる。
実施例３０座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の多 重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）中、ｎｇ数が未確定の鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマ
ー、フォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて
使用した。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．
５分間のサイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．
５分間のサイクルを２０回；６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(配列番号５４)、各
々４．０μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号５５）及び２(配列番号１
４)、各々０．２μＭのＤ４Ｓ２３６８プライマー１（配列番号５６）及び２(配
列番号５７)、各々０．２μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号５
２）及び２(配列番号５３)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６７分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３０は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜４は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１とともに同時増
幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。
実施例３１座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３及びＤ１３Ｓ３１７の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ１９Ｓ２５３及びＤ１３Ｓ３１７において、同時に増幅した。ＰＣＲ
増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
中、５．０ｎｇの鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μｌを使用
して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスターシティ
、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９６℃で２
分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを１
０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイクルを２
０回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ３Ｓ１５３９プライマー１（配列番号７）及び２(配列番号４９)、各々１
．０μＭのＤ１９Ｓ２５３プライマー１（配列番号５０）及び２(配列番号５１)
、各々０．５μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３）及び２(配列番
号４)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３１は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜４は、座位Ｄ３Ｓ
１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３及びＤ１３Ｓ３１７について同時増幅したＤＮＡサン
プルを含んでいる。レーン５は、ＤＮＡ鋳型なしに同一の手順に付したサンプル
、すなわち負の対照を示している。
実施例３２座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の多 重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）中、５ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォ
スターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した
。９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間の
サイクルを２０回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ３Ｓ１５３９プライマー１（配列番号７）及び２(配列番号４９)、各々０
．５μＭのＤ１９Ｓ２５３プライマー１（配列番号５０）及び２(配列番号５１)
、各々０．１μＭのＤ４Ｓ２３６８プライマー１（配列番号５６）及び２(配列
番号５７)、各々０．１μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号５２）及
び２(配列番号５３)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６５分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３２は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜４は、座位Ｄ３Ｓ
１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１について同時増
幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。レーン５は、ＤＮＡ鋳型なしに同一の手順
に付したサンプル、すなわち負の対照を示している。
実施例３３座位Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１の多 重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ３Ｓ１
５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に
増幅した。ＰＣＲ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰ）中、０．５〜２５０ｎｇの鋳型及び０．０４Ｕ ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ／μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエ
ルマー、フォスターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用
いて使用した。９６℃で２分間;９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で
１．５分間のサイクルを10回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１
．５分間のサイクルを２０回；６０℃で３０分間のサイクルを１回。
８種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々０．５μ
ＭのＤ３Ｓ１５３９プライマー１（配列番号７）及び２(配列番号４９)、各々０
．５μＭのＤ１９Ｓ２５３プライマー１（配列番号５０）及び２(配列番号５1）
、各々０．５μＭのＤ１３Ｓ３１７プライマー１（配列番号３）及び２(配列番
号４)、各々０．２μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号５２）及び２(
配列番号５３)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６８分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３３は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ３Ｓ
１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３及びＤ１３Ｓ３１７及びＤ２０Ｓ４８１について同時
増幅したＤＮＡサンプルを含んでいる。レーン６は、ＤＮＡ鋳型なしに同一の手
順に付したサンプル、すなわち負の対照を示している。
実施例３４座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ２０Ｓ４８１の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に増幅した。ＰＣＲ
増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍＭ
ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）
中、０．５〜２５０ｎｇの鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／μ
ｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォスタ
ーシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。９
６で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイク
ルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサイク
ルを２０回；６０℃で３０分間のサイクルを１回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(配列番号５４)、各
々４．０μＭのＤ９Ｓ９３０プライマー１（配列番号５５）及び２(配列番号１
４)、各々０．２μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号５２）及び２(配
列番号５３)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６８分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３４は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０及びＤ２０Ｓ４８１について同時増幅したＤＮＡサン
プルを含んでいる。レーン６は、ＤＮＡ鋳型なしに同一の手順に付したサンプル
、すなわち負の対照を示している。
実施例３５座位Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１の多重増幅の銀検出
本実施例においては、ＤＮＡ鋳型を、１つの反応容器中、個々の座位Ｄ１０Ｓ
１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１において、同時に増幅した。ＰＣ
Ｒ増幅を、２５μｌの１×ＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ(２５℃でｐＨ９．０)、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2及び各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
）中、０．５〜２５０ｎｇの鋳型及び０．０３Ｕ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ／
μｌを使用して行った。サーマルサイクラー４８０（パーキンエルマー、フォス
ターシティ、カリフォルニア）を以下に示す増幅プロトコルを用いて使用した。
９６℃で２分間；９４℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを１０回；９０℃で１分間、６０℃で１分間及び７０℃で１．５分間のサ
イクルを２０回；６０℃で３０分間のサイクルを１回。
６種の増幅プライマーを、以下に示すように組合せて使用した。各々１．０μ
ＭのＤ１０Ｓ１２３９プライマー１（配列番号１５）及び２(配列番号５４)、各
々０．２μＭのＤ４Ｓ２３６８プライマー１（配列番号５６）及び２(配列番号
５７)、各々０．２μＭのＤ２０Ｓ４８１プライマー１（配列番号５２）及び２(
配列番号５３)。
増幅した産物を、４０ｃｍゲル中、６０Ｗで６８分間、変性ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分離し、次いでBassamら（1991）のプロトコルにしたがう
銀染色分析により可視化した。
図３５は、各座位の増幅した断片を示している。レーン１〜５は、座位Ｄ１０
Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８及びＤ２０Ｓ４８１について同時増幅したＤＮＡサ
ンプルを含んでいる。レーン６は、ＤＮＡ鋳型なしに同一の手順に付したサンプ
ル、すなわち負の対照を示している。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ
Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ
，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，
ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ラバック ドーン アール
アメリカ合衆国 ウィスコンシン州
53532 デフォレスト ウェンデル ウェ
イ 6649
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．１以上のＤＮＡサンプルに由来する少なくとも４つのＳＴＲ座位に存在する 対立遺伝子を同時測定する方法であって、 ａ）分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡサ ンプルが、同時に増幅することができる少なくとも４つの座位のセットを有し、 かつセットが、Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ７Ｓ８２０ 、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ１４ Ｓ５４８、Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ１６Ｓ７５３ 、Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ ２２Ｓ６８３、ＨＵＭＣＳＦ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭ ＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＦ１３Ａ０１、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬ及 びＨＵＭｖＷＦＡ３１からなる群より選ばれる工程、 ｂ）多重増幅反応において、座位のセットを同時増幅する工程であって、反応 産物が、セット内において同時増幅した各座位に由来する増幅した対立遺伝子の 混合物である工程、及び、 ｃ）混合物中の増幅した対立遺伝子を評価し、ＤＮＡサンプル内のセット中に おける分析された各座位に存在する対立遺伝子を測定する工程を特徴とする方法 。 ２．同時増幅する少なくとも４つの座位のセットが、４つの座位のセットであり 、Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１及び、 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、ＨＵＭｖＷＦＡ３１からなる 群より選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．同時増幅する少なくとも４つの座位のセットが、６つの座位のセットであり 、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳ Ｆ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ及び、 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳからなる群より選ばれる、請求の範囲第１項に記載 の方法。 ４．同時増幅する少なくとも４つの座位のセットが、７つの座位のセットであり 、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳ Ｆ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１及び、 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩからなる群より選ばれる、請 求の範囲第１項に記載の方法。 ５．同時増幅する少なくとも４つの座位のセットが、８つの座位のセットであり 、Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳ Ｆ１ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１及び、 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬからなる 群より選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 ６．多重増幅反応を、分析する少なくとも４つの座位に隣接する少なくとも４つ のプライマー対を使用して行う、請求の範囲第１項に記載の方法。 ７．更に、対立遺伝子をゲル電気泳動により分離するときに、同時増幅したセッ ト中でその他の座位の対立遺伝子と重複しない、各座位由来の対立遺伝子を生成 する、多重増幅反応用プライマー対を選択する工程を含む、請求の範囲第６項に 記載の方法。 ８．多重増幅反応に使用する各プライマー対の少なくとも１つが、 セット中の座位の１つがＤ７Ｓ８２０であるとき、配列番号１及び配列番号２ 、 セット中の座位の１つがＤ１３Ｓ３１７であるとき、配列番号３及び配列番号 ４、 セット中の座位の１つがＤ５Ｓ８１８であるとき、配列番号５及び配列番号６ 、 セット中の座位の１つがＤ３Ｓ１５３９であるとき、配列番号７、配列番号８ 及び配列番号４９、 セット中の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９８であるとき、配列番号９、配列番号 １０、 セット中の座位の１つがＤ２０Ｓ４８１であるとき、配列番号１１、配列番号 １２、配列番号５２、配列番号５３、 セット中の座位の１つがＤ９Ｓ９３０であるとき、配列番号１３、配列番号１ ４、配列番号５５、配列番号６１、 セット中の座位の１つがＤ１０Ｓ１２３９であるとき、配列番号１５、配列番 号１６、配列番号５４、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ１１８であるとき、配列番号１７、配列番号 １８、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ５６２であるとき、配列番号１９、配列番号 ２０、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ５４８であるとき、配列番号２１、配列番号 ２２、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ４９０であるとき、配列番号２３、配列番号 ２４、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ７５３であるとき、配列番号２５、配列番号 ２６、 セット中の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９９であるとき、配列番号２７、配列番 号２８、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ５３９であるとき、配列番号２９、配列番号 ３０、配列番号５８、 セット中の座位の１つがＤ２２Ｓ６８３であるとき、配列番号３１、配列番号 ３２、 セット中の座位の１つがＨＵＭＣＳＦ１ＰＯであるとき、配列番号３３、配列 番号３４、 セット中の座位の１つがＨＵＭＴＰＯＸであるとき、配列番号３５、配列番号 ３６、 セット中の座位の１つがＨＵＭＴＨ０１であるとき、配列番３７、配列番号３ ８、 セット中の座位の１つがＨＵＭｖＷＦＡ３１であるとき、配列番号３９、配列 番号４０、配列番号５９、配列番号６０、 セット中の座位の１つがＨＵＭＦ１３Ａ０１であるとき、配列番号４１、配列 番号４２、 セット中の座位の１つがＨＵＭＦＥＳＦＰＳであるとき、配列番号４３、配列 番号４４、 セット中の座位の１つがＨＵＭＢＦＸＩＩＩであるとき、配列番号４５、配列 番号４６、 セット中の座位の１つがＨＵＭＬＩＰＯＬであるとき、配列番号４７、配列番 号４８、 セット中の座位の１つがＤ１９Ｓ２５３であるとき、配列番号５０、配列番号 ５１、及び、 セット中の座位の１つがＤ４Ｓ２３６８であるとき、配列番号５６、配列番号 ５７からなる群より選ばれる配列を有している、請求の範囲第６項記載の方法。 ９．多重増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である請求の範囲第６項に記載の方 法。 10．増幅した対立遺伝子を、対立遺伝子とサイズ標準とを比較することにより評 価し、サイズ標準が、ＤＮＡマーカー及び座位特異的アレリックラダーからなる 群より選ばれる、請求の範囲第１項に記載の方法。 11．対立遺伝子を分離し、分離した対立遺伝子のポリアクリルアミドゲルを形成 するポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、増幅した対立遺伝子を評価す る、請求の範囲第１項に記載の方法。 12．ポリアクリルアミドゲル中の分離した対立遺伝子を、銀染色分析を用いて対 立遺伝子を可視化することにより測定する、請求の範囲第11項に記載の方法。 13．セット中の各座位に隣接する領域に結合することができるプライマーを、座 位の同時増幅に使用し、各座位の同時増幅に使用するプライマーの少なくとも１ つが、座位から生成する増幅した対立遺伝子が蛍光標識されるように共有結合に より結合している蛍光標識を有しており、ポリアクリルアミドゲル中の分離した 対立遺伝子を、蛍光分析を用いて対立遺伝子を可視化することにより測定する、 請求の範囲第11項に記載の方法。 14．蛍光標識が、フルオレセイン及びテトラメチルローダミンからなる群より選 ばれる標識である、請求の範囲第13項に記載の方法。 15．分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルがヒト組織から分離され、ヒト組 織が、血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、胎盤細胞及び胎児細胞を含む羊水 並びに前記組織のいずれかの混合物からなる群より選ばれる、請求の範囲第１項 に記載の方法。 16．１以上のＤＮＡサンプルに由来する３つのＳＴＲ座位に存在する対立遺伝子 を同時測定する方法であって、 ａ）分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡサ ンプルが、同時に増幅することができる３つの座位のセットを有し、かつセット が、 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７；及び、 Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１３Ｓ３１７からなる群より選ばれる工程 、 ｂ）多重増幅反応において、座位のセットを同時増幅する工程であって、反応 産物が、セット内の同時増幅した各座位に由来する増幅した対立遺伝子の混合物 である工程、及び、 ｃ）混合物中の増幅した対立遺伝子を評価し、ＤＮＡサンプル内のセット中に おける分析された各座位に存在する対立遺伝子を測定する工程を特徴とする方法 。 17．３対のプライマーを使用して多重増幅反応を行い、各プライマー対が、反応 において同時増幅する座位のセット内の３つのＳＴＲ座位の１つに隣接している 、請求の範囲第16項に記載の方法。 18．多重増幅反応に使用する各プライマー対の少なくとも１つが、 Ｄ７Ｓ８２０が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号１及 び配列番号２、 Ｄ１３Ｓ３１７が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号３ 及び配列番号４、 Ｄ２０Ｓ４８１が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号１ １、配列番号１２、配列番号５２、配列番号５３、 Ｄ９Ｓ９３０が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号１３ 、配列番号１４、配列番号５５及び配列番号６１、 Ｄ１０Ｓ１２３９が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号 １５、配列番号１６及び配列番号４４、 Ｄ１６Ｓ５３９が同時増幅する座位のセット内の１つであるとき、配列番号２ ９及び配列番号３０、 セット中の座位の１つであるとき、配列番号５６及び配列番号５７からなる群 より選ばれる配列を有している、請求の範囲第17項に記載の方法。 19．多重増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応である請求の範囲第16項に記載の方 法。 20．増幅した対立遺伝子を、対立遺伝子とサイズ標準とを比較することにより評 価し、サイズ標準が、ＤＮＡマーカー及び座位特異的アレリックラダーからなる 群より選ばれる、請求の範囲第16項に記載の方法。 21．対立遺伝子を分離し、分離した対立遺伝子のポリアクリルアミドゲルを形成 するポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、増幅した対立遺伝子を評価す る、請求の範囲第16項に記載の方法。 22．ポリアクリルアミドゲル中の分離した対立遺伝子を、銀染色分析を用いて対 立遺伝子を可視化することにより測定する、請求の範囲第21項に記載の方法。 23．ポリアクリルアミドゲル中の分離した対立遺伝子を、蛍光分析を用いて対立 遺伝子を可視化することにより測定する、請求の範囲第21項に記載の方法。 24．分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルがヒト組織から分離され、ヒト組 織が、血液、精液、膣細胞、毛髪、唾液、尿、胎盤細胞及び胎児細胞を含む羊水 並びに前記組織のいずれかの混合物からなる群より選ばれる、請求の範囲第16項 に記載の方法。 25．少なくとも３つの座位におけるＳＴＲ配列を同時分析するためのキットであ って、少なくとも３つのＳＴＲ座位のセットを同時増幅するためのオリゴヌクレ オチドプライマーを有する容器を含んでおり、座位のセットが、 Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ１３Ｓ３１７； Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１７Ｓ１２９８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ２０Ｓ４８１、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ１１８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ５６２、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１４Ｓ５４８、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ４９０、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１７Ｓ１２９９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ２２Ｓ６８３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ１６Ｓ７５３、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８； Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ３Ｓ１５３９、Ｄ１９Ｓ２５３、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１０Ｓ１２３９、Ｄ９Ｓ９３０、Ｄ４Ｓ２３６８、Ｄ２０Ｓ４８１； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、ＨＵＭｖＷＦＡ３１； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ １ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ １ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ； Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＣＳＦ １ＰＯ、ＨＵＭＴＰＯＸ、ＨＵＭＴＨ０１、ＨＵＭｖＷＦＡ３１及び、 Ｄ１６Ｓ５３９、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ５Ｓ８１８、ＨＵＭＦ１３ Ａ０１、ＨＵＭＦＥＳＦＰＳ、ＨＵＭＢＦＸＩＩＩ、ＨＵＭＬＩＰＯＬからなる 群より選ばれることを特徴とするキット。 26．セット中の各座位用のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、 セット中の座位の１つがＤ７Ｓ８２０であるとき、配列番号１及び配列番号２ 、 セット中の座位の１つがＤ１３Ｓ３１７であるとき、配列番号３及び配列番号 ４、 セット中の座位の１つがＤ５Ｓ８１８であるとき、配列番号５及び配列番号６ 、 セット中の座位の１つがＤ３Ｓ１５３であるとき、配列番号７、配列番号８及 び配列番号４９、 セット中の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９８であるとき、配列番号９、配列番号 １０、 セット中の座位の１つがＤ２０Ｓ４８１であるとき、配列番号１１、配列番号 １２、配列番号５２、配列番号５３、 セット中の座位の１つがＤ９Ｓ９３０であるとき、配列番号１３、配列番号１ ４、配列番号５５、配列番号６１、 セット中の座位の１つがＤ１０Ｓ１２３９であるとき、配列番号１５、配列番 号１６、配列番号５４、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ１１８であるとき、配列番号１７、配列番号 １８、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ５６２であるとき、配列番号１９、配列番号 ２０、 セット中の座位の１つがＤ１４Ｓ５４８であるとき、配列番号２１、配列番号 ２２、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ４９０であるとき、配列番号２３、配列番号 ２４、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ７５３であるとき、配列番号２５、配列番号 ２６、 セット中の座位の１つがＤ１７Ｓ１２９９であるとき、配列番号２７、配列番 号２８、 セット中の座位の１つがＤ１６Ｓ５３９であるとき、配列番号２９、配列番号 ３０、配列番号５８、 セット中の座位の１つがＤ２２Ｓ６８３であるとき、配列番号３１、配列番号 ３２、 セット中の座位の１つがＨＵＭＣＳＦ１ＰＯであるとき、配列番号３３、配列 番号３４、 セット中の座位の１つがＨＵＭＴＰＯＸであるとき、配列番号３５、配列番号 ３６、 セット中の座位の１つがＨＵＭＴＨ０１であるとき、配列番号３７、配列番号 ３８、 セット中の座位の１つがＨＵＭｖＷＦＡ３１であるとき、配列番号３９、配列 番号４０、配列番号６０、 セット中の座位の１つがＨＵＭＦ１３Ａ０１であるとき、配列番号４１、配列 番号４２、 セット中の座位の１つがＨＵＭＦＥＳＦＰＳであるとき、配列番号４３、配列 番号４４、 セット中の座位の１つがＨＵＭＢＦＸＩＩＩであるとき、配列番号４５、配列 番号４６、 セット中の座位の１つがＨＵＭＬＩＰＯＬであるとき、配列番号４７、配列番 号４８、 セット中の座位の１つがＤ１９Ｓ２５３であるとき、配列番号５０、配列番号 ５１、及び、 セット中の座位の１つがＤ４Ｓ２３６８であるとき、配列番号５６、配列番号 ５７からなる群より選ばれる配列を有している、請求の範囲第25項に記載のキッ ト。 27．更に、少なくとも１つの多重増幅反応用の試薬を有する容器を含む、請求の 範囲第25項に記載のキット。 28．更に、アレリックラダーを有する容器を含む、請求の範囲第25項に記載のキ ット。 29．アレリックラダーの各段階及び各セット中の各座位用の少なくとも１つのオ リゴヌクレオチドが、共有結合により結合している標識を有している、請求の範 囲第28項に記載のキット。 30．標識が蛍光標識である、請求の範囲第29項に記載のキット。 31．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーが、容器内のその他のプラ イマー対の蛍光標識とは異なる、プライマーに共有結合により結合している蛍光 標識を有する、請求の範囲第30項に記載のキット。 32．ヒトＤＮＡの座位Ｄ３Ｓ１５３９に隣接しているオリゴヌクレオチドプライ マー対であって、対の一方のプライマーが配列番号７の配列を有し、他方のプラ イマーが、配列番号８及び配列番号４９からなる群より選ばれる配列を有してい るプライマー対。 33．ヒトＤＮＡの座位Ｄ１７Ｓ１２９８に隣接しているオリゴヌクレオチドプラ イマー対であって、対の一方のプライマーが配列番号９の配列を有し、他方のプ ライマーが配列番号１０の配列を有しているプライマー対。 34．ヒトＤＮＡの座位Ｄ２０Ｓ４８１に隣接しているオリゴヌクレオチドプライ マー対であって、対の一方のプライマーが、配列番号１１及び配列番号５２から なる群より選ばれる配列を有し、他方のプライマーが、配列番号１２及び配列番 号５３からなる群より選ばれる配列を有しているプライマー対。 35．ヒトＤＮＡの座位Ｄ９Ｓ９３０に隣接しているオリゴヌクレオチドプライマ ー対であって、対の一方のプライマーが配列番号５５の配列を有し、他方のプラ イマーが、配列番号１４及び配列番号６１からなる群より選ばれる配列を有して いるプライマー対。 36．ヒトＤＮＡの座位Ｄ４Ｓ２３６８に隣接しているオリゴヌクレオチドプライ マー対であって、対の一方のプライマーが配列番号５６の配列を有し、他方のプ ライマーが、配列番号５６及び配列番号５７からなる群より選ばれる配列を有し ているプライマー対。 37．１以上のＤＮＡサンプルに由来する少なくとも４つのＳＴＲ座位に存在する 対立遺伝子を同時測定する方法であって、 ａ）分析する少なくとも１つのＤＮＡサンプルを得る工程であって、ＤＮＡサ ンプルが、同時に増幅することができる少なくとも４つの座位のセットを有し、 かつセット内の３つの座位が、Ｄ７Ｓ８２０、Ｄ１３Ｓ３１７及びＤ５Ｓ８１８ である工程、 ｂ）多重増幅反応において、座位のセットを同時増幅する工程であって、反応 産物が、セット内の同時増幅した座位に由来する増幅した対立遺伝子の混合物で ある工程、及び、 ｃ）混合物中の増幅した対立遺伝子を評価し、ＤＮＡサンプル内のセット中に おける分析した各座位に存在する対立遺伝子を測定する工程を特徴とする方法。 38．多重増幅反応を、分析する少なくとも４つの座位に隣接する少なくとも４つ のプライマー対を使用して行う、請求の範囲第37項に記載の方法。 39．更に、対立遺伝子をゲル電気泳動により分離するときに、同時増幅したセッ ト中でその他の座位の対立遺伝子と重複しない、各座位由来の対立遺伝子を生成 する、多重増幅反応用プライマー対を選択する工程を含む、請求の範囲第６項に 記載の方法。 40．多重増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応である、請求の範囲第37項に記載の方 法。 41．増幅した対立遺伝子を、対立遺伝子とサイズ標準とを比較することにより評 価し、サイズ標準が、ＤＮＡマーカー及び座位特異的アレリックラダーからなる 群より選ばれる、請求の範囲第37項に記載の方法。 42．対立遺伝子を分離し、分離した対立遺伝子のポリアクリルアミドゲルを形成 する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、増幅した対立遺伝子を評価 する、請求の範囲第37項に記載の方法。 43．ポリアクリルアミドゲル中の分離した対立遺伝子を、銀染色分析を用いて対 立遺伝子を可視化することにより測定する、請求の範囲第42項記載の方法。 44．セット中の各座位に隣接する領域に結合することができるプライマーを、座 位の同時増幅に使用し、各座位の同時増幅に使用するプライマーの少なくとも１ つが、座位から生成する増幅した対立遺伝子が蛍光標識されるように共有結合に より結合している蛍光標識を有しており、ポリアクリルアミドゲル中の分離した 対立遺伝子を、蛍光分析を用いて対立遺伝子を可視化することにより測定する、 請求の範囲第42項に記載の方法。 45．蛍光標識が、フルオレセイン及びテトラメチルローダミンからなる群より選 ばれる標識である、請求の範囲第44項に記載の方法。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010523115A (ja) * | 2007-04-04 | 2010-07-15 | ネットワーク・バイオシステムズ・インコーポレーテッド | 集積化された核酸分析 |
| JP2011526788A (ja) * | 2008-06-30 | 2011-10-20 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 粗製核酸サンプルからの直接増幅のための方法 |
| US9310304B2 (en) | 2011-05-12 | 2016-04-12 | Netbio, Inc. | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of STR loci |
Families Citing this family (62)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2118048C (en) * | 1994-09-30 | 2003-04-08 | James W. Schumm | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
| US6479235B1 (en) * | 1994-09-30 | 2002-11-12 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
| US7008771B1 (en) | 1994-09-30 | 2006-03-07 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
| ES2288760T3 (es) | 1996-04-25 | 2008-01-16 | Bioarray Solutions Ltd. | Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies. |
| US6156512A (en) * | 1996-05-23 | 2000-12-05 | Promega Corp | Allelic ladders for short tandem repeat loci |
| EP1591541B1 (en) * | 1997-04-01 | 2012-02-15 | Illumina Cambridge Limited | Method of nucleic acid sequencing |
| US6238863B1 (en) * | 1998-02-04 | 2001-05-29 | Promega Corporation | Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers |
| US6312902B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6235480B1 (en) * | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6391551B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6277578B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-21 | Promega Corporation | Deploymerization method for nucleic acid detection of an amplified nucleic acid target |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US6268146B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6270973B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US7090975B2 (en) | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| JP3911909B2 (ja) | 1999-06-09 | 2007-05-09 | 株式会社日立製作所 | Ｄｎａ試料調製方法及びｄｎａ試料調製装置 |
| US6533912B2 (en) | 1999-07-13 | 2003-03-18 | Molecular Dynamics, Inc. | Increased throughput analysis of small compounds using multiple temporally spaced injections |
| US7087414B2 (en) * | 2000-06-06 | 2006-08-08 | Applera Corporation | Methods and devices for multiplexing amplification reactions |
| US6605451B1 (en) | 2000-06-06 | 2003-08-12 | Xtrana, Inc. | Methods and devices for multiplexing amplification reactions |
| JP4744778B2 (ja) | 2000-06-21 | 2011-08-10 | バイオアレイ ソルーションズ リミテッド | 特定のランダム粒子アレイを適用した複数の被検体分子の分析方法 |
| US9709559B2 (en) | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
| US20020058265A1 (en) * | 2000-09-15 | 2002-05-16 | Promega Corporation | Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors |
| US6844152B1 (en) * | 2000-09-15 | 2005-01-18 | Promega Corporation | Detection of microsatellite instability and its use in diagnosis of tumors |
| WO2002022874A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Ventana Medical Systems, Inc. | Oligonucleotides for labeling oligonucleotide probes and proteins |
| AR031640A1 (es) * | 2000-12-08 | 2003-09-24 | Applied Research Systems | Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido |
| KR100443569B1 (ko) * | 2000-12-15 | 2004-08-09 | 학교법인 인하학원 | 길이다형성 ｄｎａ 염기서열을 이용한 다중 증폭중합효소연쇄반응 조건의 최적화에 의한 개인식별 및친자감별 방법 |
| GB0104690D0 (en) * | 2001-02-26 | 2001-04-11 | Cytogenetic Dna Services Ltd | Diagnostic test |
| US7262063B2 (en) | 2001-06-21 | 2007-08-28 | Bio Array Solutions, Ltd. | Directed assembly of functional heterostructures |
| GB0119274D0 (en) * | 2001-08-08 | 2001-10-03 | Univ Durham | Fusion proteins for insect control |
| US20030082606A1 (en) * | 2001-09-04 | 2003-05-01 | Lebo Roger V. | Optimizing genome-wide mutation analysis of chromosomes and genes |
| US20080138800A1 (en) * | 2001-10-15 | 2008-06-12 | Alice Xiang Li | Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection |
| KR20040068122A (ko) * | 2001-10-15 | 2004-07-30 | 바이오어레이 솔루션스 리미티드 | 공동 검색과 효소-매개된 탐지에 의한 다형성 좌위의 다중분석 |
| US20070065830A1 (en) * | 2002-09-04 | 2007-03-22 | Children's Hospital Medical Center Of Akron, Inc. | Cloning multiple control sequences into chromosomes or into artificial centromeres |
| US7526114B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-04-28 | Bioarray Solutions Ltd. | Analysis, secure access to, and transmission of array images |
| AU2003298706A1 (en) | 2002-12-04 | 2004-06-23 | Applera Corporation | Multiplex amplification of polynucleotides |
| US7560232B2 (en) * | 2002-12-19 | 2009-07-14 | Promega Corporation | Methods of capturing, detecting and quantifying RNA:DNA hybrids and a modified RNase H useful therein |
| WO2005029705A2 (en) | 2003-09-18 | 2005-03-31 | Bioarray Solutions, Ltd. | Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers |
| CN1882699A (zh) | 2003-09-22 | 2006-12-20 | 佰尔瑞溶液有限公司 | 带有多个能共价结合生物分子的官能基团的表面固定化多电解质 |
| US7432362B2 (en) * | 2003-09-30 | 2008-10-07 | Reliagene Technologies Inc. | Assay for human DNA for gender determination |
| US7074567B2 (en) * | 2003-09-30 | 2006-07-11 | Reliagene Technologies Inc. | Assay for human DNA for gender determination |
| US7563569B2 (en) | 2003-10-28 | 2009-07-21 | Michael Seul | Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes |
| CA2544202C (en) | 2003-10-29 | 2012-07-24 | Bioarray Solutions Ltd. | Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna |
| US20050112591A1 (en) * | 2003-11-25 | 2005-05-26 | Applera Corporation | Novel method for isolating single stranded product |
| US20050239889A1 (en) * | 2004-04-26 | 2005-10-27 | Jean Gosselin | In vivo release of endogenous anti-microbial mediators by leukotriene B4 (LTB4) administration |
| US20060014190A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-19 | Hennessy Lori K | Methods for analyzing short tandem repeats and single nucleotide polymorphisms |
| US7848889B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-12-07 | Bioarray Solutions, Ltd. | Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification |
| US20080311565A1 (en) * | 2004-10-22 | 2008-12-18 | Promega Corporation | Methods and Kits for Detecting Germ Cell Genomic Instability |
| CN1327005C (zh) * | 2004-12-03 | 2007-07-18 | 公安部第二研究所 | 荧光标记短串联重复序列基因座的复合扩增检验系统 |
| US8486629B2 (en) | 2005-06-01 | 2013-07-16 | Bioarray Solutions, Ltd. | Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation |
| GB0522310D0 (en) | 2005-11-01 | 2005-12-07 | Solexa Ltd | Methods of preparing libraries of template polynucleotides |
| GB0524069D0 (en) * | 2005-11-25 | 2006-01-04 | Solexa Ltd | Preparation of templates for solid phase amplification |
| EP2021503A1 (en) * | 2006-03-17 | 2009-02-11 | Solexa Ltd. | Isothermal methods for creating clonal single molecule arrays |
| EP2121983A2 (en) | 2007-02-02 | 2009-11-25 | Illumina Cambridge Limited | Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates |
| WO2010038042A1 (en) | 2008-10-02 | 2010-04-08 | Illumina Cambridge Ltd. | Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications |
| US9550985B2 (en) | 2009-06-15 | 2017-01-24 | Netbio, Inc. | Methods for forensic DNA quantitation |
| US8182994B2 (en) * | 2009-09-15 | 2012-05-22 | Illumina Cambridge Limited | Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing |
| RU2485178C2 (ru) * | 2011-07-12 | 2013-06-20 | Олег Евгеньевич Аникеев | Способ выделения днк |
| US9556482B2 (en) | 2013-07-03 | 2017-01-31 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Commerce | Mouse cell line authentication |
| GB201418980D0 (en) | 2014-10-24 | 2014-12-10 | Univ Portsmouth | Cell assay kit and method |
| WO2017087724A1 (en) | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Omniome, Inc. | Methods for determining sequence profiles |
| WO2024030857A1 (en) * | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Idexx Laboratories, Inc. | Human mouse fractional abundance assays |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US5192659A (en) * | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
| US5364759B2 (en) * | 1991-01-31 | 1999-07-20 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
| WO1993018177A1 (en) * | 1992-03-13 | 1993-09-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Diagnosis of cystic fibrosis using allele specific multiplex polymerase chain reactions |
| WO1993018178A1 (en) * | 1992-03-13 | 1993-09-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | DIAGNOSIS OF β-THALASSEMIA USING A MULTIPLEX AMPLIFICATION REFRACTORY MUTATION SYSTEM |
| US5422252A (en) * | 1993-06-04 | 1995-06-06 | Becton, Dickinson And Company | Simultaneous amplification of multiple targets |
| US5599666A (en) * | 1994-03-28 | 1997-02-04 | Promega Corporation | Allelic ladders for short tandem repeat loci |
| CA2118048C (en) * | 1994-09-30 | 2003-04-08 | James W. Schumm | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
-
1996
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010523115A (ja) * | 2007-04-04 | 2010-07-15 | ネットワーク・バイオシステムズ・インコーポレーテッド | 集積化された核酸分析 |
| US9366631B2 (en) | 2007-04-04 | 2016-06-14 | Netbio, Inc. | Integrated systems for the multiplexed amplification and detection of six and greater dye labeled fragments |
| US9889449B2 (en) | 2007-04-04 | 2018-02-13 | Ande Corporation | Integrated systems for the multiplexed amplification and detection of six and greater dye labeled fragments |
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| JP2011526788A (ja) * | 2008-06-30 | 2011-10-20 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 粗製核酸サンプルからの直接増幅のための方法 |
| US9310304B2 (en) | 2011-05-12 | 2016-04-12 | Netbio, Inc. | Methods and compositions for rapid multiplex amplification of STR loci |
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