JP2000506743A

JP2000506743A - 細胞死を引き起こす新規受容体

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Publication number: JP2000506743A
Application number: JP10516905A
Authority: JP
Inventors: デリ−エスポスティ・ランキン，マリアピア・エイ; グッドウィン，レイモンド・ジー
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1996-10-04
Filing date: 1997-10-03
Publication date: 2000-06-06
Also published as: US20070298460A1; US7416877B1; WO1998014565A1; EP0960196A1; EP0960196A4; CA2266327A1; AU5193598A; AU718474B2; US20040180826A1

Abstract

(57)【要約】単離されたアポトーシス誘導受容体、こうした受容体をコードするDNA、およびそれらから作成される薬剤組成物が開示される。単離受容体は、免疫反応を制御するのに使用してもよい。受容体はまた、それらの阻害剤をスクリーニングするのにも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】細胞死を引き起こす新規受容体発明の技術分野本発明は、一般的にはサイトカイン受容体の分野に、そしてより詳細には免疫制御活性を有するサイトカイン受容体タンパク質に関する。発明の背景免疫系が効率的に機能するには、免疫系が外来のものに反応することが可能であるが自己抗原には反応しないことを確実にするために、細胞増殖および分化および細胞死の間に完璧なバランスが必要である。中枢寛容（central tolerance ）とは、Ｔ細胞が胸腺で発現される自己MHC抗原に相互作用する能力に依存して、胸腺におけるＴ細胞の正または負の選択を導く機構を指す。末梢において、末梢に特有に発現する自己抗原と相互作用する成熟Ｔ細胞は除去され、外来抗原により活性化されているＴ細胞も同様である。これは末梢寛容（peripheral toler ance）として知られる。不適切に活性化されたＴ細胞の除去は、壊死による細胞死とは区別されるアポトーシスとして知られるプログラム細胞死を通じて起こると考えられている。TN Fファミリーの２つのメンバー、Fasリガンド（FasL）およびTNFが、免疫寛容を調節する作用機構のいくつかに関与していることが報告されている(ClevelandおよびIhle，Cell 81:479;1995に概説されている)。FasLおよびTNFはその生物学的作用を、TNFRスーパーファミリーであるそれぞれの受容体に結合することにより仲介している(Smlthら，Cell 76:959;1994)。 Fas（FasLの受容体）およびTNF受容体Ｉ型（TNFRI）はどちらも、細胞質領域に特有のモチーフを含み、これは死（death）ドメインと名付けられている(Tart agliaら，Cell 74:845，1993;ItohおよびNagata，J．Biol．Chem．268:10932，1 993)。一過性トランスフェクション系における死ドメインの過剰発現の結果、アポトーシスが起こることが示されている。Fas/FasLおよびTNF/TNFRI 相互作用の生物学的作用は、共に別個のそして同様の情報伝達経路両方を通して起こると考えられている(Schultze-Osthoffら，EMB0 J．13:4587，1994;WongおよびGoeddel，J．Immunol．152:1751，1994)。 lprおよびgldマウスモデルは、末梢寛容におけるFas/FasLと関連付けられてきた；しかし、末梢Ｔ細胞除去はlprマウスでは起こる。成熟Ｔ細胞のこのFas非依存性アポトーシスは、部分的にＴＮＦが仲介していることが示されている(Zheng ら，Nature 377:348，1995)。これらのデータにより、認識されていないものも含め、複数のアポトーシス機構が末梢寛容に関与している可能性があることが暗示される。さらに、中枢寛容を仲介する機構は未知のままである。アポトーシスにおいて役割を果たしている他の分子の存在および同一性を調べるのが望ましい。こうした分子を同定することにより、アポトーシスを制御するさらなる手段と共に、免疫系による自己寛容の発達および自己免疫疾患の病因へのさらなる識見が提供されるであろう。発明の概要本発明は、アポトーシス誘導受容体（AIR）と称される新規受容体であって、当該受容体を発現するある種の細胞のアポトーシスを誘導する前記受容体を同定する。当該受容体は、417アミノ酸残基を有するＩ型膜貫通タンパク質である。受容体の可溶性型を調製し、そして治療環境において細胞死を調節するのに用いてもよい；したがって、新規受容体の可溶性型を含む薬剤組成物もまた提供される。当該受容体の可溶性型はまた、in vitroでAIR発現細胞のアポトーシスを妨げ、またはAIR活性のアゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするのにも有用であるであろう。AIRの細胞質ドメインはAIR誘導細胞死の阻害剤のための検定を開発するのにも有用であるであろう。こうした阻害剤は、in vitroと共に、治療環境において細胞死を制御する用法を有するであろう。欠失型(deleted form)および新規受容体を含む融合タンパク質もまた開示される。AIR活性のアゴニストは、AIRを発現する腫瘍細胞を殺すのに、または自己免疫疾患においてA IRを発現するＴ細胞を殺すのに用いてもよい。これらおよび本発明の他の側面は、以下の本発明の詳細な説明を参照することにより明らかになるであろう。図の簡単な説明図１は、AIRおよびTNFRI死ドメイン配列を並列したものを示す。TNFRI死ドメインの83アミノ酸配列を、AIR細胞質領域由来の相同配列と比較している。同一および保存性アミノ酸（＋）は中央の行に示されている。発明の詳細な説明新規TNF受容体様配列がESTデータベース中に同定された。当該EST配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして末梢血Ｔ細胞ライブラリーより全長cDNAをクローニングした。コードされるタンパク質は、アポトーシス誘導受容体を示す、AIRと名付けられた。受容体はＩ型膜貫通タンパク質であり、4 17アミノ酸残基を有し、予測される24アミノ酸のシグナル配列、173アミノ酸の細胞外ドメイン、27アミノ酸の膜貫通ドメイン、および193アミノ酸の細胞質テールを持つ。AIRの細胞質領域は、Ｉ型TNF受容体死ドメインをコードする83アミノ酸配列と、有意なアミノ酸相同性（48％同一性、64％類似性）を示した。TNFR IおよびFasの間に保存されたこの領域は、AIRを発現する細胞に対するアポトーシス情報を伝達するのに必要であり、そして十分である。 NCBIデータバンクの検索により、AIR DNAと同一性を示す領域を有する５つの発現配列タグ(expressed sequence tag)(EST)が同定された。これらのEST(NCBI 寄託番号H41522、H46374、H46211、H46662、およびH46424)は、すべてヒトcDNA 断片である。当該NCBI記録は、当該ESTにコードされるいかなるポリペプチドも明らかにせず、そしてあるとしてもどれが読み枠であるのか示さない。しかし、たとえ、本明細書中の完全なAIRコード領域の開示により明らかになる読み枠の知識を用いてESTを発現しても、コードされるポリペプチドのいずれも、本明細書に請求されるAIRポリペプチドの生物学的特性を有することはないであろう。言いかえれば、５つのESTがそれぞれ、発現ベクターのイニシエーターであるメチオニンコドンの下流の、本明細書に明らかにされる読み枠に挿入されたとしても、その結果発現されるポリペプチドはいずれも、アポトーシスを誘導するのに十分なAIRタンパク質部分を含まないであろう。アポトーシスおよびTNF/TNFRスーパーファミリー免疫系が効率的に機能するためには、細胞増殖および分化および細胞死の間に完璧なバランスが必要である。中枢寛容は、胸腺におけるＴ細胞の正および負の選択を導く機構を指す。Ｔ細胞は、胸腺において発現される自己MHC抗原と相互作用する能力に依存して、正または負に選択されると考えられている；自己反応性Ｔ細胞は除去される一方、非自己抗原を認識するものは、生存および分化するよう選択される。末梢において、末梢に特有に発現される自己抗原と相互作用する成熟Ｔ細胞は除去され、外来抗原により活性化されているＴ細胞も同様である。これらの機構は、免疫系が外来のものに反応可能であるが、自己抗原には反応せず、そして活性化されたリンパ球は役割を達成した後、除去されることを、確実にする。 TNFRスーパーファミリーの２つのメンバー、FasおよびTNFRIは、末梢寛容を調節する作用機構のいくつかに重要な役割を果たすと考えられている。Fasはアポトーシスを仲介することが報告されており、そして自己反応性Ｔ細胞をクローン除去する役割を果たすと考えられている(Itohら，Cell 66:233，1991;Watanabe- Fukunagaら，Nature 356:314，1992)。FasリガンドをコードするDNAが単離されており；Fas抗原を発現する細胞にFasリガンドが結合するとアポトーシスが誘導されることが実証されている(Sudaら，Cell 75:1169，1993;Takahashiら，Inter national Immunology 6:1567，1994)。lprおよびgldマウスモデルは、末梢において自己または外来抗原により活性化された後のＴ細胞を除去するのを導く過程において、Fas/FasL系が関与することを示している。しかし、lprマウスでは、いくつかの末梢Ｔ細胞除去が依然として起こる。この成熟Ｔ細胞のFas独立アポトーシスは、部分的にTNFが仲介していることが示されている。これらのＴ細胞の除去はアポトーシスにより起こる。アポトーシスは壊死(nec rosis)とは区別可能な、形態学的に定義される細胞死のタイプである。FasおよびTNFRIはどちらも、細胞質領域に存在する特有なモチーフである、死ドメインを含む(Tartagliaら，Cell 74:845，1993;ItohおよびNagata，J．Biol．Chem． 268:10932，1993)。このドメインは、ショウジョウバエにおけるすべてではなくともほとんどのプログラム細胞死に必要とされるreaperと称されるショウジョウバエタンパク質と、ある程度の類似性を示す(Whiteら，Science 264:677，1994) 。一過性トランスフェクション系において死ドメインが過剰発現される結果、アポトーシスが起こることが示されている。 Fas/FasLおよびTNF/TNFRI相互作用の生物学的作用は共に、別個のそして同様の情報伝達経路両方を通して起こると考えられている(Schultze-Osthoffら，EMB O J．13:4587，1994;WongおよびGoeddel，J．Immunol．152:1751,1994)。どちらの受容体もリガンド結合とチロシンリン酸化が結びついており、そしてどちらもスフィンゴミエリナーゼを活性化する。システイン・プロテイナーゼもまた、Fa sLおよびTNF誘導細胞死双方に関連付けられており；システイン・プロテアーゼを阻害する牛痘（cowpox）ウイルス産物、crmAは、FasLおよびTNF誘導アポトーシス双方を阻害する。FasLおよびTNFはどちらも、それぞれの受容体に結合した数時間以内に細胞死を誘導することから、どちらの情報伝達系も潜在性（latent ）細胞質作用分子を調節することが示される；しかし、TNFにより誘導される死の方がFasLにより誘導されるものより遅い傾向にある。現在アポトーシスに関して入手可能な主要データは、FasおよびTNFRIに仲介されるものと共に、付加的な認識されていないリガンド／受容体相互作用を含む、複数のアポトーシス機構が免疫系内の末梢寛容に関与している可能性があることを暗示する。さらに、中枢寛容を仲介する機構も未知のままである。FasLおよび TNFは、胸腺における正および負の選択が、lprおよびTNFRノックアウトマウスにおいて正常であるらしいことから、後者には関与していないらしい。本明細書に記載される新規受容体は、FasおよびTNFRIの双方と、ある程度の類似性を共有し、そして自己寛容の発達中の（末梢または胸腺における）細胞死の制御に重要である可能性がある。DNA 、タンパク質および類似体（analog）本発明は、単離AIRポリペプチド、およびAIR活性（すなわち、適切に誘発された際、死ドメインを含むAIR突然変異タンパク質（mutein）または類似体を発現する細胞のアポトーシスを引き起こすこと；または可溶性型では、AIR特異的抗体に結合すること、またはAIRを通じた情報伝達によって誘導されるアポトーシスを阻害すること）を有するその類似体（または突然変異タンパク質）を提供する。こうしたタンパク質は実質的に、内因性成分の混入がなく、そして所望により、結合する天然型グリコシル化を伴わない。本発明の範囲内のAIR誘導体はまた、生物学的活性を保持する一次タンパク質(primary protein)のさまざまな構造型を含む。イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基が存在するため、例えば、AIRタンパク質は酸性または塩基性塩の形であってもよく、また中性型であってもよい。個々のアミノ酸残基もまた、酸化または還元により修飾されてもよい。一次アミノ酸構造は、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびそれに匹敵するものなどの、他の化学部分と共有または凝集結合体を形成することにより、またはアミノ酸配列突然変異体を生成することにより、修飾されてもよい。共有結合誘導体は、特定の官能基をアミノ酸側鎖またはＮまたはＣ末端に結合することにより調製してもよい。 AIR誘導体はまた、M-マレイミドベンゾイルスクシミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシミドなどのシステインおよびリジン残基の架橋剤により得てもよい。本発明のタンパク質はまた、反応性側基を通じて、臭化シアン活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性化アガロース構造などのさまざまな不溶性基質と共有結合させてもよく、またはポリオルフィン表面に（グルタルアルデヒドによる架橋を伴いまたは伴わず）吸収させることによってもよい。ひとたび基質に結合すれば、AIRまたはAIRに類似の他のタンパク質に対して作成された抗体、ならびに、AIRまたはそれに相同なタンパク質に結合する他のタンパク質と（検定または精製の目的で）選択的に結合させるのに用いてもよい。 AIRの可溶性型もまた、本発明の範囲内である。AIRのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列が配列番号１および２に示されている。コンピューター解析により、当該タンパク質は、アミノ酸24および25の間に切断部位を持つＮ末端シグナルペプチドを有することが示された。当業者は、実際の切断部位がコンピューター解析により予測されたものと異なる可能性があることを認識するであろう。したがって、切断されたペプチドのＮ末端アミノ酸は、予測された切断部位の両方向に約５アミノ酸以内であることが予期される。シグナルペプチドの後には、173アミノ酸の細胞外ドメイン、27アミノ酸の膜貫通ドメイン、および193 アミノ酸の細胞質テールが続くと予測される。可溶性AIRはシグナルペプチドおよび細胞外ドメイン（配列番号１の残基１から197）またはその断片を含む。あるいは、異なるシグナルペプチドにより、配列番号１の残基１から24を置換してもよい。さらに、細胞外ドメインの断片もまたAIR可溶性型を提供するであろう。断片は、細胞外領域の望ましい部分を単離する既知の技術を用いて調製してもよく、そして例えば、TNFRファミリーの他のメンバーと細胞外ドメインを比較し、そして他のファミリーメンバーを調製したのと類似の型を選択することにより、調製してもよい。あるいは、特有の制限部位または当業に知られるPCR技術を用いて、発現させそして活性を解析してもよい多くの切断型(truncated form)を調製してもよい。本発明の範囲内のAIRタンパク質の他の誘導体には、当該タンパク質またはその断片と、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体が含まれる。Ｎ末端またはＣ末端融合としての組換え培養体中の合成などである。例えば、結合ペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質を合成部位から細胞膜または壁の内側または外側の機能部位へ運ぶようにする、当該タンパク質のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母 α因子リーダー）であってもよい。タンパク質融合物は、AIRタンパク質および同族体の精製または同定を容易にするために付加されるペプチド（例えばポリHis）を含んでもよい。本発明のタンパク質のアミノ酸配列はまた、Hoppら，Bio/Technology 6:1204(1988)に記載されたような同定ペプチドに結合させてもよい。こうした抗原性の高いペプチドは、特異的なモノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、迅速な検定および発現されたタンパク質の容易な精製を可能にする。Hoppらの配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に切断され、精製されたタンパク質からペプチドを除去することが可能である。こうしたペプチドでキャップされた融合タンパク質はまた、大腸菌（E．coli）における細胞内分解に抵抗性がある可能性がある。融合タンパク質はさらに、免疫グロブリンFc領域に結合するAIRアミノ酸配列を含む。典型的なFc領域は配列番号４に示されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有するヒトIgG₁である。Fc領域の断片もまた使用してもよく、Fc突然変異タンパク質も同様である。例えば、Fc領域のヒンジ領域内のある残基は、FcγRIへの高親和性結合に重要である。CanfieldおよびMorrison（J．Exp．Med．173:148 3;1991）は、Leu₍₂₃₄₎およびLeu₍₂₃₅₎は、IgG₃のU937細胞に存在するFcγRIへの高親和性結合に重要であることを報告した。同様の結果が、Lundら（J．Immunol ．147:2657，1991;Molecular Immunol．29;53，1991）により得られた。こうした突然変異を、単独または他と組み合わせて、IgG₁のFc領域に作成し、IgG₁のFc Rへの親和性を減少させてもよい。使用したFc領域の部分によっては、融合タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合を形成することにより二量体として発現させてもよい。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖両方を用いて作成されるのであれば、４つまでのAIR領域を持つタンパク質オリゴマーを形成することが可能である。別の態様において、AIRタンパク質はさらに、オリゴマー化ジッパードメインを含む。1993年８月13日に出願されたUSSN 08/107,353に、ジッパードメインが記載されており、その関連する開示は本明細書に援用される。ロイシンジッパードメインの例には、酵母転写因子GCN4およびラット肝臓に見られる熱安定性DNA 結合タンパク質(C/EBP;Landschulzら，Science 243:1681，1989)、ヘテロ二量体を優先して形成する、核トランスフォーミングタンパク質、fosおよびjun(O'She aら，Science 245;646，1989;TurnerおよびTijan，Science 243:1689，1989)、およびネズミプロトオンコジーンc-mycの遺伝子産物（Landschulzら，Science 2 40:1759，1988）に見られるものがある。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（fusogenic）タンパク質もまた、ロイシンジッパードメインを所有する(BucklandおよびWild，Nature 338:547，1989;Britton，Nature 353:39 4，1991;DelwartおよびMosialos，AIDS Research and Human Retroviruses 6:70 3，1990)。二量体となる能力の減少が最小限であるように、二量体形成ジッパードメイン中の個々のロイシン残基と、保存性アミノ酸を置換してもよい。本発明の範囲にやはり含まれるのは、AIRの細胞内ドメインの断片または誘導体である。こうした断片は、本明細書中に言及されるいずれかの技術を用いて調製し、そして配列番号１に示されるAIRの細胞質ドメインと同一のペプチド、および、例えば死ドメインなどの細胞質領域の部分を含むペプチドを含む。可溶性型を調製するのに用いられるすべての技術はまた、細胞質ドメインの断片または類似体を調製するのに用いてもよい(すなわち、RT-PCR技術または切断を調製するため選択された制限酵素の使用)。本発明はまた、結合する天然型グリコシル化を伴うまたは伴わないAIRも含む。酵母または噛乳動物系、例えばCOS-7細胞で発現されたタンパク質は、発現系により、分子量およびグリコシル化型が天然分子と同様またはわずかに異なってもよい。大腸菌などの細菌における本発明のタンパク質をコードするDNAの発現は、非グリコシル化分子を提供する。不活性化N-グリコシル化部位を有するAIR タンパク質の機能的突然変異類似体は、オリゴヌクレオチド合成および連結により、または部位特異的突然変異誘発技術により、産生してもよい。これらの類似体タンパク質は、酵母発現系を用いて、高収率で均質な炭水化物減少型を産生してもよい。真核生物タンパク質のN-グリコシル化部位は、３つ組アミノ酸Asn-A₁ -Zにより特徴付けられる。ここでA₁はPro以外のアミノ酸いずれかであり、そしてＺはSerまたはThrである。この配列において、アスパラギンは炭水化物が共有結合する側鎖アミノ基を提供する。こうした部位は、Asnまたは残基Ｚを別のアミノ酸に置換するか、AsnまたはＺを欠失させるか、またはA₁およびＺの間にＺでないアミノ酸を、またはAsnおよびA₁の間にAsnでないアミノ酸を挿入することにより、除去してもよい。 AIRタンパク質誘導体もまた、天然AIRまたはそのサブユニットの突然変異により得てもよい。本明細書で称すAIR突然変異タンパク質は、AIRタンパク質に相同であるが、１つまたは複数の欠失、付加または置換のため、天然AIRとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。AIRペプチドをコードするDNA中に作成されるすべての突然変異の影響は、突然変異AIRペプチドがAIR誘導細胞死を阻害する能力を、例えばAIR特異的抗体により、解析することによって、容易に決定することが可能である。さらに、AIR類似体、突然変異体または誘導体の活性は、本明細書に記載されるいかなる検定によって測定してもよい。本発明のタンパク質の類似体は、例えば、残基または配列のさまざまな置換、または生物学的活性に必要でない、末端または内部残基または配列の欠失により、構築してもよい。例えば、システイン残基を欠失させ、または他のアミノ酸と置換して、再生時に誤った分子内ジスルフィド架橋が形成されるのを防いでもよい。突然変異誘導の他の方法には、隣接する２つの塩基性アミノ酸を修飾して、 KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を高めることが含まれる。欠失または挿入戦略が採られる際、欠失または挿入が生物学的活性に及ぼす潜在的な影響を考慮すべきである。本発明のタンパク質のサブユニットは、末端または内部残基または配列を欠失させることにより構築してもよい。AIRの可溶性型は、（例えば、制限酵素を使用して膜貫通および細胞質領域をコードするDNA 部分を欠失させることにより）容易に調製し，そしてそのAIR誘導細胞死を阻害する能力を試験してもよい。細胞質領域に対応するポリペプチド，およびその断片（例えば、死ドメイン）は、同様の技術により調製してもよい。作成可能な突然変異のタイプに関するさらなる指示は、本発明のAIRタンパク質の構造解析を行うことによると共に、AIR配列を同様の構造を有するタンパク質と比較することにより、提供される。一般的に置換は保存的に行われるべきである；すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、AIRの生物学的活性（すなわち、例えば、細胞外ドメイン突然変異体タンパク質に関して、天然AIRと実質的に同等に，本発明のタンパク質がAIRに対する抗体に結合する能力、または一過性トランスフェクション系において過剰発現によりアポトーシスを誘導する能力）に影響を与えないものである。保存性置換の例には、結合ドメイン（細胞外ドメインに関してはリガンドまたは抗体結合領域、または細胞質ドメインに関しては他の細胞内タンパク質と相互作用する領域）外部のアミノ酸置換、および天然AIRの二次および／または三次構造を改変しないアミノ酸置換が含まれる。さらなる例には、Ile、Val、Leu、またはAlaといった１つの脂肪属残基を、互いに置換するもの、またはLysおよびArg；GluおよびAsp；またはGlnおよびAsn間といった、１つの極性残基から別のものへの置換が含まれる。他のこうした保存性置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、よく知られている。類似体AIRまたはその断片の発現のため構築されるヌクレオチド配列の突然変異は、もちろん、コード配列の読み枠相（phase）を保存していなければならず、そして好ましくは、受容体mRNAの翻訳に不利な影響を与えるであろうループまたはヘアピンなどの二次mRNA構造を産生するようにハイブリダイズする可能性がある相補的領域を生成しない。 AIRタンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列の突然変異は、最終産物においてすべては発現されないであろう。例えば、主に転写されたmRNA における二次構造ループを避けるため(本明細書に援用されるEPA 75,444Aを参照されたい)、または、例えば大腸菌発現に関しよく知られる大腸菌優先コドンなど、選択された宿主によって、より容易に翻訳されるコドンを提供するため、ヌクレオチド置換を作成して、発現を高めてもよい。突然変異部位は、あらかじめ決定してもよいが、突然変異の性質自体があらかじめ決定されている必要はない。例えば、突然変異体の最適な特性を選択するため、無作為突然変異を行い、そして発現された突然変異タンパク質を望ましい活性に関してスクリーニングしてもよい。突然変異配列を含み、天然配列の断片に連結可能であるように制限部位を隣接させたオリゴヌクレオチドを合成することにより、突然変異を特定の部位に導入してもよい。連結した結果生じた再構築配列は、望ましいアミノ酸付加、置換、または欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチドによる部位特異的突然変異誘発法を用いて、必要な置換、欠失、または付加に従って改変された特定のコドンを有する改変遺伝子を提供してもよい。上記に示された改変を作成する典型的な方法は、Walderら (Gene 42:133，1986)；Bauerら(Gene 37:73，1985)；Craik(BioTechniques，Jan uary 1985，12-19)；Smithら（Genetic Engineering:Principles and Methods， Plenum Press，1981）により開示されており；そして米国特許第4,518,584号および第4,737,462号が適切な技術を開示しており、そしてこれらは本明細書に援用される。本発明のタンパク質の他の態様には、中程度にストリンジェント条件下（プレ洗浄溶液は５Ｘ SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)、そしてハイブリダイゼーション条件は50℃、５Ｘ SSC、一晩）でAIRをコードするDNA配列にハイブリダイズ可能なDNAによりコードされるAIRポリペプチド、およびAIRをコードするものに縮重する他の配列が含まれる。１つの態様において、AIRポリペプチドは、配列番号１に示される天然AIRタンパク質のアミノ酸配列に、アミノ酸配列が少なくとも約70%同一である。好ましい態様において、AIRポリペプチドは、AIR天然型に対して、アミノ酸配列が少なくとも約80%同一であり；最も好ましいポリペプチドは、天然AIRに少なくとも約90%同一なものである。同一性パーセントは、例えば、Devereuxら（Nucl．Acids Res．12:387，1984 ）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGC G）より入手可能なGAPコンピュータープログラムなどの、コンピュータープログラムを用いて決定してもよい。AIRタンパク質由来の断片に関して、同一性は、断片に存在するAIRタンパク質部分に基づいて計算される。細胞外ドメインのAIR類似体の生物学的活性は、AIRアゴニスト性抗体または他のアゴニストにより死が誘発される際、AIR誘導細胞死を類似体または突然変異タンパク質が阻害する能力を試験することにより、決定してもよい。また別に、天然AIRに結合する抗体を用いた適切な検定、例えば酵素免疫検定またはドットブロットを使用して、AIR類似体または突然変異タンパク質が細胞死を阻害する能力を評価してもよい。細胞外ドメインのAIR類似体または突然変異タンパク質の生物学的活性は、類似体がトランスフェクションされた細胞内で過剰発現される際、アポトーシスを引き起こす能力を試験することにより決定してもよい。また別に、適切な検定、例えば、AIRの細胞質領域が情報伝達に関与する他の細胞内タンパク質と関与する能力を評価する情報伝達検定および方法もまた、AIR類似体または突然変異タンパク質の活性を評価するのに有用であろう。こうした方法は当業によく知られている。本発明はまた、上述されたAIRタンパク質および類似体をコードするいかなるD NAも含む、AIR DNAを含む。コード縮重のため、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にはかなりの多様性がある可能性がある。本発明の態様に含まれるDNAは、中程度にストリンジェントな条件下（例えば、プレ洗浄溶液は５Ｘ SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)、そしてハイブリダイゼーション条件は50℃、５Ｘ SSC、一晩）、または、好ましくは、ストリンジェントな条件下（例えば、ハイブリダイゼーションは６Ｘ SSC、63℃で一晩；洗浄は３Ｘ SSC、55 ℃）で配列番号１のDNAにハイブリダイズ可能なものである。 AIRヌクレオチド配列の断片もまた有用である。１つの態様において、こうした断片は、本明細書に開示されるAIR DNAの少なくとも約17の連続するヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも約25ヌクレオチドを含み、より好ましくは、少なくとも約30の連続するヌクレオチドを含む。こうした断片に相補的なDNA およびRNAが、配列番号１のAIR DNA、または前述のポリペプチドをコードするものの一本鎖および二重鎖型両方と共に提供される。AIR DNA断片は一般的に、少なくとも約17ヌクレオチドを含み、好ましくは約17から約30ヌクレオチドを含む。こうした核酸断片（例えば、AIRの細胞外ドメインに対応するプローブ）は、プローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）におけるプライマーとして使用される。当該プローブは、in vitro検定においてAIR核酸の存在を検出するのに、およびノーザンおよびサザンブロットのような方法に、用法がある。AIRを発現する細胞タイプもまた、同定される可能性がある。こうした方法はよく知られており、そして当業者が意図する特定の適用によって、適切なプローブ長を選択してもよい。PCRには、望ましいAIR DNA配列の末端に対応する5'および3'プライマーを使用し、慣用技術を用いて、その配列を単離し、そして増幅する。 AIR核酸の他の有用な断片は、AIR mRNA（センス）またはAIR DNA（アンチセンス）配列を標的として結合することが可能な、一本鎖核酸配列（RNAまたはDNAのどちらか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドである。与えられたタンパク質のcDNA配列に基づき、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを生成する能力は、例えば、SteinおよびCohen，Cancer Res．48:2659，198 8およびvan der Krolら，BioTechniques 6:958，1988に記載されている。DNA 、タンパク質および類似体の使用本明細書に記載されるAIR DNA、タンパク質および類似体は、薬剤組成物の調製を含む、多くの使用法を有するであろう。例えば、AIRの可溶性型は、AIRが仲介するアポトーシスのアンタゴニストとして有用であろう。AIR組成物（タンパク質およびDNAの両方）もまた、AIRに対するアゴニストおよびアンタゴニスト性抗体を開発するのに有用であろう。前者は、例えば、AIRを発現する腫瘍細胞または自己反応性Ｔ細胞において、細胞死を誘導するのに有用であろうし；後者は、AIR発現細胞のアポトーシスを阻害するのに有用であろう。本発明のDNAは組換えタンパク質の発現、ならびにAIR転写物の存在または分布の（定量的または定性的）解析のプローブとして有用である。AIRアンタゴニストは、in vitroでA IRを発現する細胞（PBTなど）の培養を容易にするのに有用であろう。本発明のタンパク質はまた、例えば、患者標本における、可溶性AIRを検出する、またはAIR関連アポトーシス活性をモニターするのに使用するキットを調製するのに有用であろう。AIRタンパク質はまた、この活性のアンタゴニストまたは擬似体（mimetics）（例えば、相互作用をそれぞれ阻害または模倣するペプチドまたは小分子）をスクリーニングする際に必要であるように、他の試料または組成物におけるAIR関連アポトーシス活性をモニターする用法があるであろう。こうしたキットでは、さまざまな検定形式が有用で、（限定されるわけではないが）ELISA、ドットブロット、固相結合検定(バイオセンサーを用いるものなど) 、迅速形式検定および生物学的定量法が含まれる。本発明に従って精製されたAIRは、AIR阻害剤の、そしてしたがってAIR誘導細胞死の阻害剤の発見を容易にするであろう。精製AIRポリペプチドを潜在的阻害剤のスクリーニングに使用することは重要であり、そして実質的に、混入物質との干渉する反応の可能性が除かれる可能性がある。こうしたスクリーニング検定は、AIRの細胞外ドメイン、細胞内ドメイン、またはこれらペプチドのいずれかの断片のいずれかに利用してもよい。分子のAIR誘導アポトーシス阻害活性を検出するには、典型的には、AIRに結合可能である、そして例えばアゴニスト性抗体の結合を阻害する分子を検出するスクリーニング検定において、細胞外ドメイン由来の可溶性型AIRの使用、またはAIRおよび他の、情報伝達に関与する細胞内タンパク質との相互作用の阻害を検出する検定において、細胞外ドメイン由来のポリペプチドの使用を含む。さらに、分子のAIR活性に拮抗する（antagonize）または作用する（agonize）能力を確かめるのに使用してもよい。こうした方法に含まれるのは、AIRキメラ、例えばAIR細胞内ドメインおよび既知のリガンドを有するタンパク質由来の細胞外ドメインのキメラの使用である。さまざまな分子の情報伝達に対する影響をその後、既知のリガンドを利用してアポトーシス情報を伝達することによりモニターしてもよい。さらに、AIRポリペプチドはまた、構造に基づくAIR阻害剤の設計に使用してもよい。こうした構造に基づく設計はまた、「合理的薬剤設計」としても知られる。AIRポリペプチドは、例えば、いずれもよく知られた方法である、Ｘ線結晶、核磁気共鳴または相同性モデル化（homology modeling）により、三次元的に解析してもよい。阻害剤設計を補助するため、AIR構造情報の分子モデル化ソフトウェア系における使用もまた、本発明に含まれる。こうしたコンピュータ補助モデル化および薬剤設計は、化学高次構造解析、分子の静電位、タンパク質フォールディングなどの情報を利用してもよい。本発明の特定の方法は、AIRの基質への結合部位と思われる部位に関し三次元構造を解析し、予測された反応部位を取りこむ新規分子を合成し、そして上述の新規分子を検定する、ことを含む。組換えAIRの発現本発明のタンパク質は好ましくは、組換え発現ベクターにAIRタンパク質またはその類似体をコードするDNA配列を挿入し、そして発現を促進する条件下で組換え微生物発現系において当該DNA配列を発現することによる、組換えDNA法により産生される。本発明により提供されるタンパク質をコードするDNA配列は、cDN A断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーを、または一連のオリゴヌクレオチドを組み合わせて、組換え発現ベクターに挿入し、そして組換え転写ユニットにおいて発現することが可能である合成遺伝子を提供してもよい。組換え発現ベクターには、機能可能であるように、哺乳類、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適切な転写または翻訳制御要素に連結された、AIR、同族体、または生物学的に同等な類似体をコードする合成またはcDNA由来DNA断片を含む。こうした制御要素には、後に詳細に論じるように、転写プロモーター、所望による転写を調節するオペレーター配列、適切なmRNAリボゾーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。通常複製起点により与えられる宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を、さらに取りこませてもよい。 DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している際、機能可能であるように連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のDNAは、ポリペプチドに、当該ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現されていれば、機能可能であるよう連結されており；プロモーターは、コード配列に、当該配列の転写を調節していれば、機能可能であるように連結されており；また、リボゾーム結合部位は、コード配列に、翻訳を可能とするように配置されていれば、機能可能であるよう連結されている。一般的に、機能可能であるよう連結されることは、隣接していること、そして分泌リーダーの場合は隣接しており、そして読み枠内であることを意味する。微生物で発現させようとするAIRまたは同族体をコードするDNA配列は、好ましくはDNAのmRNAへの転写を時期尚早に終結させる可能性があるイントロンを含まないであろう。細菌での使用に有用な発現ベクターには、よく知られるクローニングベクター pBR322（ATCC 37017）の遺伝的要素を含む商業的に入手可能なプラスミド由来の選択可能なマーカーおよび細菌複製起点を含んでもよい。こうした商業的ベクターには、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals、スウェーデン、ウプサラ）およびpGEM1（Promega Biotec、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。これらのpBR322「骨格」部分は、発現に適したプロモーターおよび構造配列と組み合わされる。大腸菌は典型的には、大腸菌種由来のプラスミド、pBR322（Boliva rら，Gene 2:95，1977）の誘導体を用いて形質転換される。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてしたがって形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。組換え微生物発現ベクターに通常用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモータ系(Changら，Nature 275:6 15，1978;およびGoeddelら，Nature 281:544，1979)、トリプトファン（trp）プロモーター系(Goeddelら，Nucl．Acids Res．8:4057，1980;およびEPA 36,776号 )およびtacプロモーター(Maniatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratory，p.412，1982)が含まれる。特に有用な細菌発現系は、ファージλP_LプロモーターおよびcI857ts熱不安定性リプレッサーを使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Cult ure Collection）より入手可能なプラスミドベクターで、λP_Lプロモーターの誘導体を取りこむものには、大腸菌株JMB9（ATCC 37092）に常住するプラスミドpH UB2、および大腸菌RR1（ATCC 53082）に常住するpPLc28が含まれる。酵母ベクターの適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら，J．Biol．Chem．255:2073，1980）または他の解糖酵素(Hessら，J．Adv．Enzyme Reg．7:149．1968;およびHollandら，Bioc hem．17:4900，1978)、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。酵母発現での使用に適したベクターおよびプロモーターは、R．Hitzemanら，EPA 73,657号にさらに記載されている。好ましい酵母ベクターを、大腸菌における選択および複製のため、pBR322由来のDNA配列（Amp^r遺伝子および複製起点）およびグルコース抑制可能ADH2プロモーターおよびα因子分泌リーダーを含む酵母DNA配列を用いて、組み立ててもよい。ADH2プロモーターはRussellら（J．Biol．Chem．258:2674，1982）およびBe ierら（Nature 300:724，1982）により記載されている。異種性タンパク質の分泌を導く酵母α因子リーダーを、プロモーターおよび構造遺伝子の間に挿入し、発現させてもよい。例えば、Kurjanら，Cell 30:933，1982;およびBitterら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 81:5330，1984を参照されたい。リーダー配列をその 3'末端近傍に、１つまたはそれ以上の有用な制限部位を含むよう修飾して、外来遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にしてもよい。脊椎動物細胞を形質転換するのに用いられる発現ベクターにおける転写および翻訳調節配列は、ウイルス源より提供されてもよい。例えば、よく用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス2、シミアンウイルス40（SV40）およびヒトサイトメガロウイルス由来である。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライシングおよびポリアデニル化部位を使用して、異種性DNA 配列の発現に必要とされる他の遺伝的要素を提供してもよい。初期および後期プロモーターは、どちらも、SV40ウイルス複製起点もまた含む断片として、容易にウイルスから得られることから、特に有用である(Fiersら，Nature 273:113，19 78)。ウイルス複製起源に位置するHindIII部位からBglI部位に伸長するおよそ25 0bp配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいSV40断片もまた使用してもよい。さらに、ウイルスゲノムプロモーター、調節および／またはシグナル配列もまた、こうした調節配列が選択された宿主細胞で共存可能であれば、利用してもよい。典型的なベクターは、OkayamaおよびBerg（Mol．Cell．Biol．3:28 0，1983）に開示されたように構築してもよい。 C127ネズミ乳房上皮細胞において哺乳動物受容体cDNAを安定した高レベルで発現する有用な系を、実質的に、Cosmanら（Mol．Immunol．23:935，1986）に記載されたように構築してもよい。AIR DNA発現に好ましい真核ベクターはpDC406（M cMahanら，EMBO J．10:2821，1991）と称され、そしてSV40、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびエプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルス（EBV）由来の制御配列を含む。他の好ましいベクターには、pDC406由来のpDC409およびpDC410 が含まれる。pDC410はEBV複製起点をSV40ラージＴ抗原をコードする配列と置換することによりpDC406より得られた。pDC409はpDC406と異なり、マルチクローニング部位の外部のBglII制限部位が欠失しており、マルチクローニング部位のBgl II部位が唯一のものとなっている。 EBV複製起点を含む発現ベクター、例えばpDC406およびpDC409のエピゾーム複製を許す有用な細胞株は、CV-1/EBNA（ATCC CRL 10478）である。CV-1/EBNA細胞株は、CV-1細胞株にエプスタイン・バーウイルス核抗原１（EBNA-1）をコードする遺伝子をトランスフェクションすることにより得られ、そしてヒトCMV極初期エンハンサー／プロモーターにドライブされて恒常的にEBNA-1を発現する。宿主細胞形質転換された宿主細胞は、組換えDNA技術を用いて構築された発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされ、そして本発明のタンパク質をコードする配列を含む細胞である。形質転換された宿主細胞は、望ましいタンパク質（AIRまたはその同族体）を発現してもよいが、本発明のDNAをクローニングまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞は、当該タンパク質を発現する必要はない。発現されたタンパク質は、選択されたDNAによっては、好ましくは、培養上清に分泌されるであろうが、細胞膜中に置かれてもよい。ウイルスタンパク質の発現に適した宿主細胞には、原核、酵母または高次真核細胞が含まれ、適切なプロモーターの調節下に置かれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルスspp（Bacillus ssp）が含まれる。高次真核細胞には、後述される哺乳動物起源の樹立された細胞株が含まれる。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示されるDNA構築物由来のRNAを使用してウイルスタンパク質を産生するのに用いてもよい。細菌、真菌、および哺乳動物細胞宿主に適したクローニングおよび発現ベクターは、Pouwelsら（Clo ning Vectors:A Laboratory Manual，ニューヨーク州エルセビア，1985）に記載されており、その関連する開示は本明細書に援用される。原核発現宿主は、甚だしいタンパク質分解およびジスルフィド加工を必要としないAIRまたは同族体の発現に使用してもよい。原核発現ベクターは、一般的に、例えば抗生物質耐性を与える、または独立栄養に必要なものを供給するタンパク質をコードする遺伝子等の１つまたはそれ以上の表現型選択可能マーカー、並びに、宿主内での増幅を確実にする、宿主に認識される複製起点を含む。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトミセス(Streptomyces)、およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属のさまざまな種が含まれるが、他のものも選択材料として使用してもよい。組換えAIRは酵母宿主で発現されてもよく、好ましくはS．セレビシエ（S．cer evisiae）などのサツカロミセス（Saccharomyces）種由来である。他の属の酵母、ピキア（Pichia）またはクロイベロミセス（Kluyveromyces）属もまた、使用してもよい。酵母ベクターは、一般的に2μ酵母プラスミドまたは自己複製配列（ARS）由来の複製起点、プロモーター、ウイルスタンパク質をコードするDNA、ポリアデニル化および転写終結配列および選択遺伝子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは酵母および大腸菌双方の形質転換を可能にする複製起点および選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子および、トリプトファン中での生育能を欠く酵母突然変異株の選択マーカーを提供するS．セレビシエのtrp1遺伝子、および下流の構造配列の転写を誘導する高発現酵母遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。酵母宿主細胞ゲノムにおけるtrp1損傷の存在は、その後、トリプトファン非存在下での成長により、形質転換を検出するのに効果的な環境を提供する。適切な酵母形質転換プロトコールは、当業者に知られており；典型的な技術は Hinnenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1929，1978に記載されており、Trp⁺ 突然変異体を、0.67%酵母窒素基剤、0.5％カザミノ酸、2％グルコース、10μg/m lアデニンおよび20μg/mlウラシルからなる選択培地中で選択する。ADH2プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株は、80μg/mlアデニンおよび 80μg/mlウラシルを補った1％酵母エキス、2％ペプトン、および1％グルコースからなるリッチ培地中で発現させるため増殖させてもよい。ADH2プロモーターの脱抑制は、培地グルコースの枯渇により起こる。粗精製の酵母上清をろ過により採取し、さらなる精製の前に4℃に保持する。さまざまな哺乳動物または昆虫細胞培養系を用いて、組換えタンパク質を発現してもよい。異種性タンパク質を昆虫細胞中で産生するバキュロウイルス系は、 LuckowおよびSummers，Bio/Technology 6:47(1988)により概説されている。適切な哺乳動物宿主細胞株には、Gluzman（Cell 23:175，1981）に記載されるサル腎臓細胞のCOS-7株、および適切なベクターを発現可能な他の細胞株、例えばCV-1/ EBNA(ATCC CRL 10478)、Ｌ細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO) 、HeLaおよびBHK細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、その他の5' または3'隣接非転写配列などの非転写要素、並びに、必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシング供与および受容部位、および転写終結配列などの5'または3'非翻訳配列などを含んでもよい。組換えAIRの精製精製AIR、同族体(homolg)、または類似体は、適切な宿主／ベクター系を培養し、本発明のDNAの組換え翻訳産物を発現させ、その後、前記産物を培地または細胞抽出物から精製することにより調製される。例えば、組換えタンパク質を培地に分泌する系の上清は、まず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過装置を用いて濃縮してもよい。濃縮段階に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用してもよい。例えば、適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合する対構造（co unter structure）タンパク質またはレクチンまたは抗体分子を含んでもよい。あるいは、陰イオン交換レジン、例えば、遊離の(pendant)ジエチルアミノエチル（DEAE）基を有するマトリックスまたは支持体を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製によく用いられる他のタイプであってもよい。あるいは、陽イオン交換段階を用いてもよい。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む、さまざまな不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーもまた、本発明のタンパク質を精製する手段を提供する。アフィニティークロマトグラフィーは、AIRおよびその同族体を精製するのに特に好ましい方法である。例えば、免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質として発現されるAIRは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製してもよい。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含むAIRタンパク質は、オリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含むレジン上で精製してもよい。AIRタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、当業によく知られる方法を利用してアフィニティークロマトグラフィー精製に使用してもよい。リガンドもまた、AIRのアフィニティー精製のアフィニティーマトリックスを調製するのに使用してもよい。最後に、１つまたはそれ以上の疎水性逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-H PLC）段階であって、RP-HPLC媒体、例えばメチルまたは他の脂肪属側鎖を有するシリカゲルを使用する前記段階を使用して、AIR組成物をさらに精製してもよい。前述のいくつかのまたはすべての精製段階を、さまざまな組み合わせで、使用し、均質な組換えタンパク質を提供してもよい。細菌培養で産生された組換えタンパク質は、通常、まず細胞沈殿物からの抽出に続き、１つまたはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階により単離される。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製段階として使用してもよい。組換えウイルスタンパク質発現に使用される微生物細胞は、いかなる慣用法により破壊してもよく、凍結融解サイクル、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。本発明のタンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母発酵は、精製を非常に単純化する。大規模発酵の結果分泌される組換えタンパク質は、Urdalら（J． Chromatog．296:171，1984）に開示されたものと類似の方法により精製してもよい。この参考文献は、ヒトGM-CSFの分離用HPLCカラム上での精製のための、２つの連続した逆相HPLC段階を記載する。組換え培養体で合成されるタンパク質は、培養体から本発明のタンパク質を回収するのに取られた精製段階に依存する量および性質の、タンパク質を含む細胞構成要素が存在することにより、特徴付けられる。これらの構成要素は通常、酵母、原核または非ヒト高次真核起源のものであろうし、そして好ましくは約１重量パーセントより少ない桁での、無害な混入物質量で存在する。さらに、組換え細胞培養体は、元の種に天然に見られるように、通常本発明のタンパク質と関連している可能性がある他のタンパク質を含まず、当該タンパク質を産生することが可能である。AIR 組成物の使用および投与本発明は、効果的な量のタンパク質および適切な希釈剤およびキャリアーを含む治療組成物を使用する方法、および免疫反応を制御する方法を提供する。AIR または同族体の可溶性サイトカイン受容体またはサイトカイン、または他の免疫制御分子との共同での使用もまた意図される。治療的使用には、精製タンパク質が、好ましくはヒトである患者に、徴候に適した様式で治療のため投与される。したがって、例えば、免疫機能を制御するために投与されるAIRタンパク質組成物は、大丸薬（bolus）注射、連続注入、移植物からの維持放出(sustained release)、または他の適切な技術により与えられてもよい。典型的には、治療剤は、精製AIRを、生理学的に認められるキャリアー、添加剤（excipient）または希釈剤と共に含む組成物の形で投与されるであろう。こうしたキャリアーは、使用される投薬量および濃度ではレシピエントに無害であろう。普通、こうしたタンパク質組成物の調製は、本発明のタンパク質を緩衝液、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量（約10残基より少ない）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、ショ糖またはデキストリンを含む炭水化物、EDTAなどのキレート剤、グルタチオンおよび他の安定化剤および添加剤と混合することを必要とする。中性緩衝生理食塩水または同種の血清アルブミンと混合した生理食塩水は、典型的に適切な希釈剤である。好ましくは、産物は、適切な添加溶液（例えばショ糖）を希釈剤として用い、凍結乾燥物として処方する。適切な投与量は試験により決定することが可能である。投与量および頻度は、もちろん、治療される徴候の性質および重症度、望ましい反応、患者の状態などの要因に依存するであろう。 AIRおよびアンタゴニスト性モノクローナル抗体などの他のAIRアンタゴニストの可溶性型を、AIR誘導細胞死を阻害する目的で投与してもよい。AIRは活性化Ｔ細胞中で発現され、そしてこれらの細胞のアポトーシス死に役割を果たしている可能性がある。したがってAIR可溶性型は、Ｔ細胞が不適切に殺される疾患、例えばAIDSを防ぎまたは治療するのに有用である可能性がある。以下の例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。当業者は、実施例に態様化された本発明の改変が作成されてもよいことを、特に本明細書に引用されるさまざまな参考文献の解説、本明細書に援用される開示に照らし、認識するであろう。実施例１本実施例は、新規腫瘍壊死因子受容体様タンパク質の同定および単離を記載する。腫瘍壊死因子受容体Ｉ型（TNFRI；p60、Schallら，Cell，61:361，1990;Loe tscherら，Cell，61:351，1990）と、ある程度の相同性を有するcDNAがNCBI EST （発現された配列標識）データベース中に同定された(寄託番号H41522)。その後さらなる相同ESTが同定され(寄託番号H46374、H46424、H46211、H46662)、そして、重複するESTに保存され、GCが約50％しかない配列を有し、そしてあいまいなヌクレオチドを含まない配列部分に基づいて、オリゴヌクレオチドプライマーが合成された。実質的に1995年６月29日に出願されたUSSN 08/496,632に記載されるように、第一鎖cDNAのパネル上でRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）を使用し、プライマーを用いて、さまざまな組織において潜在的に対応するRN A転写物の分布を決定した。胎児脳は、同定された配列に対応するmRNAが転写されている組織として同定され；以前記載されたPCR産物をランダムプライム法またはさらなるPCR反応により³²P-dCTPで標識して用い、ヒト胎児脳cDNAライブラリー（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）をスクリーニングした。この過程により、EST中に同定された配列を含む多数のcDNAクローンが同定された。配列解析により、単離されたcDNAがTNF受容体ファミリーに相同であることが確認され、そしてこのファミリーメンバーの細胞外ドメインに特徴的なシステインリッチ偽リピート（pseudo-repeat）の保存が示された。しかし、単離されたすべてのクローンはリーダーペプチドおよび膜貫通領域を欠いていた。したがって、さらなるクローンが他のライブラリーから単離された。ヒト末梢血Ｔ細胞（ PBT）ライブラリー（Parkら，Blood 74:56，1989）由来のクローンを解析することにより、全長cDNA転写物の単離ができ、そしてまた胎児脳より得られたクローンがスプライシングされないイントロンを含むことも示された。全長クローンが単離された後、当該ESTが、胎児脳から得られたクローンに存在していたもののような、イントロン由来のヌクレオチド配列を含むことが明らかになった。 PBTライブラリーから単離された新規転写物は、アポトーシス誘導受容体（AIR ）と称され、417アミノ酸（aa）Ｉ型膜タンパク質をコードし、27 aaのシグナル配列、４つのシステインリッチ偽リピートにより特徴付けられる170 aaの細胞外ドメイン、27 aaの膜貫通領域および193 aaの細胞質領域を持つ。細胞質領域AIR は、TNFRIおよびFasの間に保存される領域である、死ドメインの特性を有する配列を含む。これは情報伝達がTNFRIまたはFasを通して起こる際のアポトーシス情報を伝達するのに必要であり、そして十分な領域である(Tartagliaら，Cell 74: 845，1993;ItohおよびNagata，J．Biol．Chem． 268:10932，1993)。AIRの死ドメインは、TNFRIの死ドメインをコードする80 aa 配列と有意な相同性（48％同一性、64％類似性）を示し、そしてまたFasの死ドメインとも類似である(19.5％同一性、47％類似性)。AIRのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１に示されている。予測されるシグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１から24に渡っている。アミノ酸198から224は、膜貫通領域を形成すると予測される。細胞質領域内（アミノ酸225から417）に、推定される死ドメインがアミノ酸335から413に渡っている。実施例２本実施例は、AIR mRNAの細胞および組織分布を記載する。AIR mRNAの細胞および組織分布を決定するため、AIR cDNAをプローブとして用いて、さまざまな細胞株および組織由来のポリA⁺RNAを、ノーザンブロット解析により調べた。さまざまな組織由来のポリA⁺RNA（レーン当たり2μg）を含むフィルターをClonetech（カリフォルニア州パロアルト）より購入した。さまざまな細胞または細胞株由来のポリアデニル化RNAを単離し、１％アガロースホルムアルデヒドゲル上に分画し(レーン当たり2μg)、Hybondナイロン膜（Amersham）上にブロットした。フィルターに対し、AIR cDNAのコード領域に対応するアンチセンスRNAリボプローブをプローブとして用いた。ハイブリダイゼーションを63℃で行った後、0.2Ｘ SS C、0.1% SDSで68℃で３回洗浄した。ブロットは−70℃で８から48時間露光させた。ノーザン解析により、脾臓、胸腺および末梢血リンパ球で強いAIR発現が見られ、主な転写物は〜3.0kbで、より小さい〜1.5kb転写物と共に現れた。低レベルの発現が結腸および小腸で見られた。卵巣、精巣、および前立腺では転写物は検出されなかった。K299細胞株（末期巨大細胞脱分化リンパ腫（high grade large cell anaplastic lymphoma）と診断された患者の末梢血から樹立された）およびクローン22と名付けられたＴ細胞株もAIRを発現していた。AIR発現はまた、樹状細胞でもRT-PCRにより見られた。当該受容体の発現は制御可能である：PMAとイオノマイシンで新鮮なPBTを剌激すると、AIRメッセージのアップレギュレーションが起こり、一方PMAとイオノマイシンでK299細胞を処理すると、AIR発現がダウンレギュレーションされる。放射性ハイブリッドのパネルを用いたAIRの染色体位置決定により、当該遺伝子は、TNFRII、CD30およびOX40遺伝子をコードする領域のごく近傍である、ヒト染色体1pのテロメア末端に位置付けられた。実施例３本実施例はAIR/Flagと称される可溶性AIR/Flag（登録商標）タンパク質を発現する構築物の構築を記載する。AIR/Flag（登録商標）はリーダー配列、およびアミノ酸25からアミノ酸197（配列番号１）のAIR領域、およびFlag（登録商標）と称されるオクタペプチド（配列番号３）を含む。構築物は、本質的に他の可溶性構築物で記載されたように調製され、配列番号１のアミノ酸25から197をコードするDNA断片（PCRまたは他の適切な方法によって得られた）を適切なリーダー配列を含む適切な発現ベクター中に連結することにより調製された。その結果生じたDNA構築物を、サル腎臓細胞株CV-1/EBNA（ATCC CRL 10478）などの適切な細胞株にトランスフェクションした。AIR/Flag（登録商標）はFlag（登録商標）抗体アフィニティーカラムを用いて精製し、そして本明細書に記載される方法いずれを用いて生物学的活性を解析してもよい。実施例４本実施例はAIR/Fc融合タンパク質を発現するAIR DNA構築物の構築を記載する。ヒトIgG1のFc領域に融合した可溶性型AIRを、哺乳動物発現ベクターpDC409（U SSN 08/571,579）中で構築した。この発現ベクターは、サイトメガロウイルス読み枠R27080のリーダー配列に続き、AIRアミノ酸25-199、それに続きヒトIgG₁の定常ドメインの突然変異型（配列番号４）を含む。 AIR/Fc発現プラスミドは、CV-1/EBNA細胞にトランスフェクションされ、そして上清を１週間集めた。AIR/Fc融合タンパク質は、実質的に実施例５で記載されるように、プロテインＡセファロースカラム（Pharmacia、スウェーデン、ウプサラ）上で精製した。タンパク質濃度は、ヒトIgG1の定常ドメインに特異的な酵素結合免疫吸収検定およびBCA解析（Pharmacia）により測定し、そして純度は、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動解析後にゲルの銀染色を行い確認した。精製AIR-FcのSDS-PAGE（還元剤存在下）解析により、分子量〜52kDaに移動するタンパク質が示された。興味深いことに、ジスルフィド結合ホモ二量体は、成分のわずか〜30％にしか対応せず、より高次の凝集体が残りの70％に対応していた。実施例５本実施例は、AIR融合タンパク質の精製を記載する。AIR/Fc融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィーを用いる慣用法により精製される。AIR/Fc融合タンパク質を含むおよそ１リットルの培養上清を、哺乳動物細胞上清を（例えば0.45μｍフィルターで）ろ過し、そしてろ過物をプロテインA/G抗体アフィニティーカラム（Schleicher and Schuell、ニューハンプシャー州キーン）に４℃で、1.5cm x12.0cmカラムに対し流速80ml／時間で適用することにより精製する。カラムは0.5M NaClを含むPBSで、遊離タンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなくなるまで洗浄する。最後に、カラムをPBSで洗浄する。結合した融合タンパク質を、25mMクエン酸緩衝液、pH2.8で溶出し、そして500mM H epes緩衝液、pH9.1でpH7に調整する。 Flag（登録商標）を含むAIR融合タンパク質もまた、実質的にHoppら，Bio/Tec hnology 6:1204(1988)に記載されるように、Flag（登録商標）に結合する抗体を用いて検出および／または精製してもよい。生物学的活性を、例えば、本明細書の実施例に記載されるように、AIR誘導細胞死の阻害により測定してもよい。実施例６本実施例は、AIRに対するモノクローナル抗体の調製を例示する。例えば、精製組換えAIRの調製、または高レベルのAIRを発現するトランスフェクションされた細胞を使用して、米国特許第4,411,993号に開示されたもののような、慣用技術を用い、AIRに対するモノクローナル抗体を生成する。AIRをコードするDNAもまた、例えばPardollおよびBeckerlegがImmunity 3:165，1995で概説するように、免疫源として使用してもよい。こうした抗体はAIR誘導細胞死に干渉する(アンタゴニスト性抗体)、またはAIRを架橋することによりアポトーシスを誘導する（アゴニスト性抗体）際に、AIRまたはAIR活性の診断または研究検定の構成要素として、またはAIRアフィニティー精製において有用である可能性がある。げっ歯類を免疫するため、AIR免疫源は、アジュバント（完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、またはRibiアジュバントR700（Ribi、モンタナ州ハミルトン）などの他のアジュバントなど）中で乳化し、そして例えば、 BALB/cマウスまたはルイス（Lewis）ラットなどの選択されたげっ歯類に、10-10 0μgの範囲で皮下注射する。DNAは皮内（Razら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9 1:9519，1994）または筋内（Wangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:4156，19 93）に投与してもよい；生理食塩水がDNAに基づく抗原に適した希釈剤であることが見出されている。10日から３週間後、免疫された動物を付加的な免疫源により追加免疫（boost）し、そしてその後、毎週、２週間毎、３週間毎の免疫化スケジュールに従って定期的に追加免疫する。血清試料を、後眼窩（retro-orbital）出血または尾先端切除により定期的に採取し、ドットブロット検定(抗体サンドイッチ)、ELISA(酵素結合免疫吸収検定 )、免疫沈降、またはFACS解析を含む他の適切な検定により試験する。適切な抗体力価が検出された後、陽性動物は、抗原を含む生理食塩水を静脈内に投与される。３から４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を回収し、そしてネズミ骨髄腫細胞株（例えばNSLまたは好ましくはAg 8.653[ATCC CRL 1580]）に融合させる。この方法により生成されたハイブリドーマ細胞株を、複数のマイクロタイタープレートの選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むもの、またはHAT）中に置き、非融合細胞、骨髄腫-骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞-脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。こうして生成されたハイブリドーマクローンは、AIRへの反応性をELISAにより、例えばEngvallら，Immunochem．8:871(1971)により、および米国特許第4,703, 004号で開示される技術を適用して、スクリーニングしてもよい。好ましいスクリーニング技術は、Beckmanら，J．Immunol．144:4212（1990）に記載される抗体捕捉技術である。陽性クローンをその後、同一遺伝子型のげっ歯類の腹腔に注入し、高濃度（＞１mg/ml）の抗AIRモノクローナル抗体を含む腹水を産生する。その結果生じるモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿後、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製してもよい。また別に、抗体のプロテインＡまたはプロテインＧに対する結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用してもよく、AIRタンパク質への結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも同様である。モノクローナル抗体は、AIR-Fc融合タンパク質を免疫源として用いて生成された。これらの試薬をスクリーニングし、AIRタンパク質に対する反応性を確認する。本明細書に記載されるmABの活性をモニターする方法を用いて、アゴニスト性（すなわち、AIRに結合し、そしてアポトーシス情報を伝達する抗体）およびアンタゴニスト性（すなわち、AIRに結合し、そしてアポトーシス情報を伝達せず、そして実際はアポトーシスを阻害する可能性がある抗体）抗体両方を単離する。実施例７本実施例は、AIRが、トランスフェクションされた細胞のアポトーシスを引き起こす能力を例示する。リガンドの非存在下でのAIRのアポトーシス活性を決定するため、全長転写物を、一過性トランスフェクション系で過剰発現した。この方法は、FasおよびTNFRIが仲介するアポトーシスを立証するのに使用され成功しており、そして過剰発現により誘導された死ドメイン配列の自己凝集は、リガンドが仲介する、効果的な情報伝達に必要とされる細胞質領域の並列を模倣するという事実に頼っている。 CVI/EBNA細胞（スライド当たり1.65 x 10⁵細胞）をスライド当たり総量2μgの DNAを用い、DEAE-デキストラン法により、一過性にコトランスフェクションした。各DNA混合物は、0.5μgの試験転写物(pDC409-AIR；pDC302-TNFRI、またはpDC3 02-FAS；pDC302はMosleyら，Cell 59:335，1989に記載されている)、0.25μgのp DC409-β-ガラクトシダーゼおよび0.25μgのpSVneoに1.0μgのpDC303-crmA（pDC 303は、米国特許第5,350,683号に記載される；crmAは、インターロイキン１β変換酵素の阻害剤をコードする牛痘読み枠で、FasまたはTNFRIを介したアポトーシスを遮断することが可能である；Cell 69:597，1992を参照されたい）または1.0 μgの空のpDC302ベクターDNAを加えたものを含む。crmA、pDC302およびpDC409のコントロールが、当該実験に含まれる。すべての試料には、適切な量の空のpDC3 02ベクターDNAを加え、トランスフェクション当たりのDNA総量を一定に保った。 48時間後、細胞をPBSで洗浄し、1% NP-40を加えた1.0mlのPBSで30分間溶解し、そしてo-ニトロフェニル-b-D-ガラクトピラノシドを基質として用いβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。溶解物中のβ-ガラクトシダーゼ量（X-Gal u/ml）を、その結果生じた有色産物の吸光度を測定し、そしてそれを既知のβ-ガラクトシダーゼ標準と比較することにより決定した。この検定から吸光度の減少が得られることは、β-ガラクトシダーゼ発現の損失を示し、そしてβ-ガラクトシダーゼとコトランスフェクションされたタンパク質を発現する細胞の死と相関する。 CVI/EBNA細胞中のAIR過剰発現は、細胞死を導く。形態学的および共焦点顕微鏡解析により、観察された細胞死は、アポトーシス機構に仲介されることが示唆された。AIRがアポトーシスを仲介するさらなる証拠が、トランスフェクション細胞のヘキスト（Hoechst）染色により得られた。Fas誘導アポトーシス同様、AI Rが仲介する細胞死は、特異的にインターロイキン１β変換酵素を阻害する牛痘遺伝子産物であるcrmAの共発現により部分的に遮断された。80 aaの死ドメイン配列を有するAIRの細胞質ドメインは、アポトーシス情報の伝達に必要不可欠であった。これは、AIRの膜貫通および細胞質ドメインに融合されたCD40細胞外ドメインを含むキメラを用いて立証された。CD40-AIRキメラの過剰発現は、全長AI Rが過剰発現された際に観察されるのと同じアポトーシスを導いた。実施例７本実施例は、可溶性AIR/Fc融合タンパク質が、CD8α⁺樹状細胞（DC）の異種刺激能を増強することが可能であることを実証する。CD8α⁺DCは最近同定された抗原提示細胞の小群で、リンパ系関連DC（すなわち、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびNK細胞になることが可能であるリンパ系関連BM前駆細胞由来(Wuら，J．Exp．Med．184: 903，1996)）と記載されている。CD8α⁺DCは、高レベルのFasLを発現し、そして in vitroで活性化されたFas発現CD4⁺Ｔ細胞を殺すことが示されている(SussおよびShortman，J．Exp．Med．183:1789，1996)。In vitro研究により、CD8α⁺脾臓 DCは、異種反応性および赤血球凝集素特異的なCD4⁺Ｔ細胞の増殖刺激に、より効率的でないことが示されている(SussおよびShortman、上記)。 Maraskovskyら（J．Exp．Med．184:1953，1996）は、CD8α⁺リンパ系関連DCは顕著に、他のDCに比較して、異種反応性またはKLH特異的CD4⁺Ｔ細胞の増殖刺激に2-3倍、効果的でないことを見出した。さらに、CD8α⁺DCが見かけ上Ｔ細胞刺激能を欠いているのは、実際は、in vitro刺激の間に、CD4⁺Ｔ細胞のアポトーシス死を直接誘導する能力のためであった；この効果はgld（FasL-/-）マウス由来のDCまたはlpr（Fas-/-）マウス由来のCD4⁺Ｔ細胞を使用した際には見られず、CD8α⁺上に発現されたFasLの直接的な役割を示した(SussおよびShortman 、上記)。これにより、FasLを発現するCD8α⁺ＤＣは、プログラム細胞死経路を通じてＴ細胞活性化を負に制御する可能性があることが示唆された。しかし、Fa sが仲介する死の役割は、標的Ｔ細胞のアポトーシスに、特に標的がCD8⁺Ｔ細胞であるときは、部分的にしか責任がないことが示されている(Kroninら，J．Immu nol．157:3819，1996)。 CD8⁺Ｔ細胞の場合、CD8α⁺DCは最初、培養物におけるCD8⁺Ｔ細胞増殖を刺激する効果があったが、Ｔ細胞増殖は後に有意に減少した(Kroninら、上記)。lprまたはgldマウスを用いた研究により、Fasが誘導するアポトーシスが関与していないことが示され、CD4⁺Ｔ細胞で見られたものと異なる機構であることが示唆された。増殖の減少は、高レベルのIL-2が培養物に加えられたときのみ回復し、CD8⁺ Ｔ細胞でIL-2産生の有意な減少が見られるのと相関した（IL-3、GM-CSFおよびIF N-γ産生もまた減少していたが、CD8⁺Ｔ細胞ではIL-2が最も制限的サイトカインであるようだった)。これにより、CD8α⁺DCは、実際にはＴ細胞増殖を誘導する能力に欠陥があるのではなく、CD8⁺Ｔ細胞に反応して適切なサイトカイン産生を誘導しないことが示された。したがって、CD8⁺DCは、Fas仲介経路を通して活性化CD4⁺Ｔ細胞を殺す可能性もあるが、また、未知の経路を通じてＴ細胞サイトカイン産生を調節することによりCD8⁺Ｔ細胞を制御する可能性もある。 CD8α⁺DCの制御的性質がさらに、Inabaら，J．Exp．Med．186，665（1997）により実証されており、二次リンパ系組織のＴ細胞領域に局在するCD8α⁺DCは、顕著に自己ペプチドに使用されるMHC分子を発現することを示している。さらに、これらのCD8α⁺DCはin vitroで、まず自己ペプチド反応性Ｔ細胞クローンの増殖を、そしてその後死を誘導した。これらの知見により、CD8α⁺DCは機能的に特殊化してＴ細胞活性化の過程を制御し、そしてＴ細胞サイトカインレパートリーの発展を制御すると共に、自己反応性Ｔ細胞の末梢寛容の維持に重大な役割を果たしている可能性がある。機能的に成熟したCD8α⁺DCを、以前報告されたように(Maraskovskyら、上記、およびPulendranら，J．Immunol．159:2222，1997)、CHO由来ヒトFlt3リガンド（FL）で連続９日間処理したマウスの脾臓から、単離した。FLはin vivoでDC数を劇的に上昇させることが示されている(USSN 08/539,142、1995年10月４日出願 )。簡潔には、FL処理マウス由来の脾臓細胞をモノクローナル抗体(mAb)、抗B220 (B細胞に対して)、抗Thy l(T細胞に対して)、抗Gr-1(骨髄細胞に対して)、抗NK 1.1（NK細胞に対して）および抗Ter 119（赤血球細胞に対して）と共にインキュベーションし、成熟系統細胞（mature lineage cell）を標識した。 mAbでコーティングされた細胞をその後、ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ラットIg （Dynabeads、Dynal Oslo、ノルウェイ）でコーティングされた磁気ビーズとインキュベーションした。その後、磁気を用いてmAbおよび磁気ビーズにコーティングされた細胞（成熟系統細胞）を細胞懸濁から除き、DCが濃縮された集団を残した。DCを同定するため抗CD11cと、そしてCD8α⁺リンパ系関連DCを同定するため抗CD8α⁺と、枯渇脾臓細胞をインキュベーションした。CD11⁺CD8α⁺DCをその後、FACStar Plus（商標）（Becton Dickinson、カリフォルニア州サンホセ）を用いて蛍光表示式細胞分取器（FACS）により高純度（>95%）で単離し、そしてAI R/Fcの生物学的評価に用いた。マウスCD8α⁺DCは、フローサイトメトリー解析により評価されるように、細胞表面にヒトAIR/Fcタンパク質（実質的に実施例４に記載されたように調製されたもの）に結合する対構造を発現した。したがって、AIR/FcがCD8α⁺DCの生物学的活性に及ぼす影響を評価した。AIR/FcをCD8α⁺DCに加えると、混合リンパ球反応（MLR）におけるその異種刺激能が増強された。異種性Ｔ細胞（１ｘ10⁵）を、上述のように培養されたさまざまな数の照射（2000rad）DCとインキュベーションし、96ウェル丸底培養プレートで0.2mlの培地中で４日間培養した。培養物は、0 .5mCi[³H]チミジンで８時間パルス標識し、そして細胞をグラスファイバーシート上に採取して気相βカウンターでカウントした。 AIRにより誘導される潜在的アポトーシス細胞死により、in vivoでAIR/AIR リガンド系はFas/FasL系に用いられるのと同様の方式でのアポトーシス誘導を通して細胞死を調節している可能性が示唆される。Ｔ細胞上にAIRが高発現し、そしてCD8α⁺DC上にAIR対構造が存在する場合、AIRおよびDC発現対構造もまた、CD 8α⁺DCの異種刺激能が低いことに貢献している可能性がある。実施例８本実施例は、ネズミAIR同族体を単離するのに用いられ、ヒトAIR配列から設計されたプローブを用いる、種間ハイブリダイゼーション技術を例示する。ヒトAI Rプローブは、ヒトAIRタンパク質の細胞外ドメインをコードする451ヌクレオチド断片（327-778）をPrimer Itキット（Stratagene、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いたランダムプライマー法で³²P標識することにより産生された。ネズミ7B9Ｔ細胞（Mosleyら，Cell 59:335;1989）由来cDNAライブラリーを、λZAP ファージベクター中に構築し、そして商業的に入手可能なキット（Gigapak(登録商標)、Stratagene、カリフォルニア州サンディエゴ）を用い、実質的に1997年２月４日に刊行された米国特許第5,599,905号に記載されたように、製造者の指示に従って、in vitroでパッケージングした。ヒトAIRプローブは、10Ｘデンハルト溶液、50mM Tris pH7.5、1M NaCl，0.1％ピロリン酸ナトリウム、１Ｘ SSCおよび200mg/ml変性サケ精子DNAを含む緩衝液中で、cDNAライブラリーと63℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後、63℃で６Ｘ SSC中で30分、２Ｘ SSC中で30分、１Ｘ SSC中で60分、および室温で0.5Ｘ SSC中で30分洗浄した。ハイブリダイズしたクローンは、オートラジオグラフィーで視覚化した。ヒトAIRと相同な完全コード領域を含む配列を持つクローンが単離された。しかし、このクローンはまた、２つのイントロンと思われる配列も含んでいた。ネズミAIR cDNAクローンの細胞外ドメインに第二および第三のシステインリッチ偽リピートをコードする断片を用いて、一本鎖PCRプローブを生成し、7B9 cDNAライブラリーを再スクリーニングするのに用いた。ネズミプローブは、50％ホルムアミドを含むスターク緩衝液（Wahlら，1979，PNAS 76:3683-3687）中で、ファージDNAと37℃で一晩ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションの後、42℃で２Ｘ SSC中で30分、２回、および0.5Ｘ SSC中で30分、２回洗浄した。ハイブリダイズしたクローンは、オートラジオグラフィーで視覚化した。以前単離されたクローンと同一のコード配列を含むが、イントロン配列を含まないクローンが単離された。しかし、このクローンは、ネズミAIRの開始メチオニンからの最初の78アミノ酸を欠いていた。全長コード配列cDNA構築物は、２つのオリジナルcDNAクローン由来の配列を、イントロンを含まずPCRによりつなぎ合わせることで得られた。このクローンのヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列が、配列番号５および６に図解されている。ヒトAIR同様、ネズミAIR はＩ型膜貫通タンパク質で、411アミノ酸残基を有し、予測される30アミノ酸のシグナル配列、159アミノ酸の細胞外ドメイン、21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および195アミノ酸の細胞質テールを持つ。ネズミAIRの細胞質領域は、ヒトAIR の細胞質領域と有意な相同性を示し、そして死ドメインモチーフをコードする。

【手続補正書】【提出日】１９９９年６月２５日（１９９９．６．２５）【補正内容】請求の範囲を下記の通り補正する。『請求の範囲１．（a）配列番号２のアミノ酸１から417までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（b）配列番号６のアミノ酸１から411までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（c）（a）のDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能なDNA分子であって、そして生物学的に活性のあるアポトーシス誘導受容体（AIR）をコードする前記DNA分子；および（d）（a)、（ｂ）または（ｃ）のDNAによりコードされるタンパク質の生物学的に活性のある断片をコードするDNA分子からなる群より選択される、単離ＤＮＡ。２．少なくとも長さ約17ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、少なくとも長さ約25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および少なくとも長さ約30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる群より選択され、アポトーシス誘導受容体(A IR)の細胞質ドメインをコードする配列番号１のDNA由来のヌクレオチド配列を有する、請求項１の単離DNA。３．（a）配列番号２のアミノ酸１から417までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（b）配列番号６のアミノ酸１から411までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（c）（a）のタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも約70％同一である生物学的に活性のあるアポトーシス誘導受容体ポリペプチドをコードするDNA分子；および（d） (a)、（ｂ）または（c）のDNAによりコードされるタンパク質の断片をコードし、そして生物学的に活性のあるアポトーシス誘導受容体（AIR）をコードするDNA分子からなる群より選択される、請求項１の単離ＤＮＡ。４．配列番号２のアミノ酸ｘ１ないしｘ２、ここにおいて、ｘ１は１ないし２９（アミノ酸１および２９も含む）のいずれかのアミノ酸であり、ｘ２は１９０ないし２００（アミノ酸１９０および２００も含む）のいずれかのアミノ酸である、を含むポリペプチドからなるグループから選択されるポリペプチドをコードする、単離ＤＮＡ。５．配列番号２のアミノ酸ｘ１ないしｘ２、ここにおいて、ｘ１は２２５ないし３３５（アミノ酸２２５および３３５も含む）のいずれかのアミノ酸であり、ｘ２は４１０ないし４１７（アミノ酸４１０および４１７も含む）のいずれかのアミノ酸である、を含むポリペプチドからなるグループから選択されるポリペプチドをコードする、単離ＤＮＡ。６．請求項１ないし５のいずれか１項に記載のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。７．請求項６の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。８．発現を促進する条件下で請求項７の宿主細胞を培養し、そしてタンパク質を回収することを含む、タンパク質を調製する方法。９．（a）配列番号２のアミノ酸１から417のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（b）配列番号６のアミノ酸１から411のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（c）（a）のタンパク質をコードするDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能なDNAによりコードされ、そしてアポトーシスを誘導するポリペプチド；および（d） (a)、または（ｂ）のポリペプチドの断片であって、アポトーシスを誘導可能な前記断片からなる群より選択される、単離ポリペプチド。１０．（a）配列番号２のアミノ酸１から417のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（b）配列番号６のアミノ酸１から411のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（c）アミノ酸配列が（a）のポリペプチドに少なくとも約70％同一であり、そしてアポトーシスを誘導するポリペプチド；および（d）（a）または（b）のポリペプチドの断片であって、アポトーシスを誘導可能な前記断片からなる群より選択される、請求項９の単離ポリペプチド。１１．単離されそして精製された可溶性ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸ｘ１ないしｘ２、ここにおいて、ｘ１は２２５ないし３３５（アミノ酸２２５および３３５も含む）のいずれかのアミノ酸であり、ｘ２は４１０ないし４１７（アミノ酸４１０および４１７も含む）のいずれかのアミノ酸である、を含む前記ポリペプチド、当該ポリペプチドの断片であってアポトーシスを誘導可能な前記断片、からなる群から選択される、前記可溶性ポリペプチド。１２．請求項１１のポリペプチド、および適切な希釈剤またはキャリアーを含む組成物。１３．アポトーシス誘導受容体ポリペプチドに免疫反応性の抗体。１４．モノクローナル抗体である、請求項１３の抗体。』

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．単離DNAであって：（a）配列番号２のアミノ酸１から417までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（b）配列番号５のアミノ酸１から411までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（c）（a）のDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能なDNA分子であって、そして生物学的に活性のあるAIRをコードする前記DNA分子；および（d） (a)、(ｂ)または（ｃ）のDNAによりコードされるタンパク質の生物学的に活性のある断片をコードするDNA分子からなる群より選択される、前記DNA。２．請求項１のDNAであって、少なくとも長さ約17ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、少なくとも長さ約25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および少なくとも長さ約30ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる群より選択され、 AIRの細胞質ドメインをコードする配列番号１のDNA由来のヌクレオチド配列を有する、前記DNA。３．請求項１の単離DNAであって：（a）配列番号２のアミノ酸１から417までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（b）配列番号５のアミノ酸１から411までのアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA；（c）（a）のタンパク質のアミノ酸配列に少なくとも約70％同一である生物学的活性AIRポリペプチドをコードするDNA分子；および（d） (a)、(ｂ)または（c）のDNAによりコードされるタンパク質の断片をコードし、そして生物学的に活性のあるAIRをコードするDNA 分子からなる群より選択される、前記DNA。４． AIRポリペプチドをコードする単離DNAであって、当該AIRポリペプチドが配列番号２に示されたアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸１およびアミノ酸29の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ末端、およびアミノ酸190およびアミノ酸200の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるカルボキシ末端を有する、前記単離DNA。５． AIRポリペプチドをコードする単離DNAであって、当該AIRポリペプチドが配列番号２に示されたアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸225およびアミノ酸335の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ末端、およびアミノ酸410およびアミノ酸417の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるカルボキシ末端を有する、前記単離DNA。６．請求項１のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。７．請求項３のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。８．請求項４のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。９．請求項５のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。１０．請求項６の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。１１．請求項７の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。１２．請求項９の発現ベクターにより形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。１３．発現を促進する条件下で請求項10の宿主細胞を培養し、そしてAIRを回収することを含む、AIRタンパク質を調製する方法。１４．発現を促進する条件下で請求項11の宿主細胞を培養し、そしてAIRを回収することを含む、AIRタンパク質を調製する方法。１５．発現を促進する条件下で請求項12の宿主細胞を培養し、そしてAIRを回収することを含む、AIRタンパク質を調製する方法。１６．単離AIRポリペプチドであって：（a）配列番号２のアミノ酸１から417のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（b）配列番号６のアミノ酸１から411のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（c）（a）のタンパク質をコードするDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション可能なDNAによりコードされ、そして生物学的に活性があるAIRポリペプチド；および（d） (a)、または（ｂ）のポリペプチドの生物学的活性断片からなる群より選択される、前記単離AIRポリペプチド。１７．請求項16の単離AIRポリペプチドであって：（a）配列番号２のアミノ酸１から417のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（b）配列番号６のアミノ酸１から411のアミノ酸配列を有するポリペプチド；（c）アミノ酸配列が（a）のポリペプチドに少なくとも約70％同一であり、そして生物学的に活性がある、AIRポリペプチド；および（d）（a）または（b）のポリペプチドの生物学的活性断片からなる群より選択される、前記単離AIRポリペプチド。１８．単離されそして精製された可溶性ポリペプチドであって、配列番号２に示されたアミノ酸配列を含み、配列番号２のアミノ酸225およびアミノ酸335の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるアミノ末端、およびアミノ酸410およびアミノ酸417の間（両端も含む）のアミノ酸からなる群より選択されるカルボキシ末端を有する、前記可溶性ポリペプチド、および当該ポリペプチドの生物学的活性断片。１９．請求項１８のAIRポリペプチド、および適切な希釈剤またはキャリアーを含む、組成物。２０． AIRに免疫反応性を持つ抗体。２１．モノクローナル抗体である、請求項20の抗体。