JP2000506534A

JP2000506534A - タンパク質含有溶液からのタンパク質の精製方法

Info

Publication number: JP2000506534A
Application number: JP9533055A
Authority: JP
Inventors: ランケ―マドゼン，アンデルス; アーゲラウストセン，マズ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2000-05-30
Also published as: DE69719497T2; IN190120B; EP0894091B1; CN1213377A; ATE233784T1; WO1997034919A1; AU2151997A; US6087148A; DE69719497D1; EP0894091A1; DK0894091T3; CN1216899C

Abstract

(57)【要約】タンパク質含有溶液から１のタンパク質を精製し、そして結晶形態で単離する方法であって：そのタンパク質含有溶液を結晶化有効量の水−混和性有機溶媒（例えば、低級アルコール又はケトン）で処理し；そしてその着目のタンパク質を結晶形態において単離することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質含有溶液からのタンパク質の精製方法本発明の分野本発明は、タンパク質含有溶液、例えば発酵ブロス中に存在するタンパク質、例えば酵素の結晶化のための単純、安価、かつ、ひじょうに有効な方法に関する。本発明の背景工業的目的をもつ酵素は、通常、液体又は非結晶固体として提供される。結晶性ではなく非結晶性の固体としてのそれらの利用能は、主に、公知の酵素結晶化方法が一般に工業的規模で使用されるためにはあまりに高価であると認められている事実により依る。酵素の結晶化に関する多くの文献が存在する。酵素結晶化技術は極めて経験的であるので、特定の結晶化手順の結晶に関して一般化することは困難である。これまで知られたタンパク質結晶化方法のほとんどの特徴的な要件は：純粋で濃縮された開始溶液；ひじょうに長い結晶化時間；及び多量の化学物質、例えば塩である〔例えば、Biotechnology and Bioengineering 48（1995）pp．316-323 参照〕。水溶性ポリマー（例えば、ポリエチレン・グリコール）を使用する工業的な酵素結晶化方法が記載されている（WO 95／01989参照）。本発明の要約本発明の目的は、それにより結晶性タンパク質、特に酵素がそのタンパク質を含有する溶液から得られることができ、そして多量の化学物質、例えば塩の添加を必要としないような有効、かつ、安価な方法を提供することである。本発明の方法の重要、かつ、ひじょうに価値の高い特徴は、その方法が、不純な、タンパク質含有溶液（すなわち、着目のタンパク質に加えて、さまざまな他の物質を含有する溶液）、特に他のタンパク質を含有する溶液、例えば発酵ブロスから得られる溶液から、高純度で、結晶性タンパク質の単離を許容するということである。本発明の方法は、短い結晶化時間を使用して高収率を得ることを可能にし、そして単純、安価、かつ、環境に優しく、そして工業的要求に合ったものである。従って、本発明は、タンパク質含有溶液、例えば２以上のタンパク質を含む溶液、例えば発酵ブロスから得られる溶液から、１のタンパク質の、精製、及び結晶化形態での単離方法であって：（ａ）上記タンパク質含有溶液を、結晶化有効量の水相溶性（水溶性）有機溶媒で処理し；そして（ｂ）着目のタンパク質を結晶化形態で単離する、を含む方法を提供する。本発明の文脈において特定の関連を有するタンパク質含有溶液は、水性溶液（すなわち、一般に、着目のタンパク質がその中に溶解されているところの溶媒液体の実質的に全て、又は少なくとも大部分を、水が構成している溶液）である。本発明の詳細な開示従って、本発明は、とりわけ、発酵ブロス中に存在するタンパク質（又はポリペプチド）の結晶化方法を提供する。これに関して、用語“発酵”は、微生物（例えば、バクテリア又は真菌）により引き起こされた分解又は変換プロセスだけをいうのではなく、動物又は植物起源をもつ細胞の助けを借りて引き起こされる対応のプロセスをもいうことをいうと意図される。発酵ブロスは、着目のタンパク質又はポリペプチドに加えて、通常、多数の他の物質、例えば基質化合物、例えば炭水化物、塩、細胞、及び他の代謝産物（例えば、核酸、並びに着目の特定のタンパク質又はポリペプチド以外のタンパク質又はポリペプチド）を含有する。本発明の方法が発酵ブロスに適用されることが予定されているとき、そのブロスは、まず、１以上の固／液分離技術、例えば凝集、遠心分離、濾過又はマイクロフィルトレーション、又はそのいずれかの組合せに供される。本発明の方法は、驚ろくべきことに、比較的不純な溶液に対してよく作用するようであり、そして通常、本発明の方法を行う前に（例えば、その溶液から異物タンパク質を除去する目的をもって）クロマトグラフィー法により発酵ブロス（又は、例えば発酵ブロスの固／液分離処理により得られた、タンパク質含有溶液）を精製する必要はないであろう。本発明の他の側面においては、タンパク質含有溶液は、有機溶媒で処理される前に濃縮される。このような濃縮は、好適には、１以上の知られた手順により、例えば限外濾過（逆浸透）又は蒸発により達成されることができる。本発明のさらなる側面においては、タンパク質含有溶液は、低分子量の物質（例えば、塩）の除去のための手順に供されることができる。このような処理は、ダイアフィルトレーション及び透析を含む。タンパク質含有溶液の濃度は、本発明の方法を実施するために本質的ではないけれども、収率及び取扱いの容易性の視点からそれは、しばしば望ましいものであろう。一般的に言えば、本発明に従って有機溶媒で処理されることが予定されているタンパク質含有溶液中の着目のタンパク質の濃度は、0.1〜2 5重量％の範囲内（％ｗ／ｗ；そのタンパク質含有溶液の重量に基づく）、好ましくは0.5〜15％ｗ／ｗ、特に５〜15％ｗ／ｗの範囲内にあるであろう。本発明の文脈において好ましいタンパク質は、先に既にある程度述べたように、酵素、例えば：ヒドロラーゼ（EC 3）〔プロテアーゼ（ペプチダーゼ、EC 3.4）；カルボン酸エステル・ヒドロラーゼ（EC 3.1.1）、例えばリパーゼ（例えば、トリアシルグリセロール・リパーゼ、EC 3.1.1.3）；グリコシダーゼ（EC 3.2）、例えばアミラーゼ（例えば、α−アミラーゼ、EC 3.2.1.1、β−アミラーゼ、EC 3.2.1.2、及びグルコアミラーゼ、EC 3.2.1.3）、セルラーゼ（例えば、エンド−１，４− β−グルカナーゼ、EC 3.2.1.4）及びキシラナーゼ(例えば、キシラン・エンド −１，３−β−キシロシダーゼ、EC 3.2.1.32)を含む〕；酸化還元酵素（EC １）〔フェノール−オキシダーゼ、例えば、ラッカーゼ(EC 3.10.3.2)及びEC 1.10.3の下に分類される他のラッカーゼ関連酵素；及びペルオキシダーゼ(EC 1.11)、例えばEC 1.11.1.7の下に分類されるものを含む〕；並びにイソメラーゼ（EC 5）〔キシロース・イソメラーゼ（EC 5.3.1.5）を含む〕である。酵素：本願明細書及び請求の範囲中に言及される酵素分類番号（EC番号）は、Recommendations （1992）of the Nomenclature Committee of the Internationa l Union of Biochemistry and Molecular Biology ，Academic Press Inc.，1992 に従う。プロテアーゼ本発明に従って結晶化されることができるプロテアーゼ（ペプチダーゼ）は、細胞、例えば微生物、特にバクテリア又は真菌の細胞を使用する発酵プロセスにより得られることができるプロテアーゼを含む。このようなプロテアーゼの化学的に又は遺伝子修飾された突然変異体が包含される。プロテアーゼは、セリン・プロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼであることができる。アルカリ性プロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルス（Bacillus）から得られたもの、例えばスブチリシン・ノボ（Novo）、スブチリシン・カールスベルグ(Carlsberg)、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO 89／06279中に記載されているもの）である。トリプシン様プロテアーゼの例は、（例えば、ブタ又はウシ起源の）トリプシン及びWO 89／06270中に記載されているフザリウム（Fusarium ）プロテアーゼである。好適な商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素は、Novo Nordisk A/S(Denmark) により、商品名Alcalase，Savinase，Durazym、及びEsperaseの下で販売されているもの、Gist-Brocadesにより商品名Maxatase，Maxacal，Maxapem及びPropera seの下で販売されているもの、Genencor Internationalにより商品名Purafect及びPurafect OXPの下で販売されているもの、及びSolvay Enzymesにより商品名Op ticlean及びOptimaseの下で販売されているものを包含する。リパーゼ本発明に従って結晶化されることができるリパーゼは、細胞、例えば微生物、特にバクテリア又は真菌の細胞を使用する発酵のプロセスにより得られることができるリパーゼを包含する。このようなリパーゼの化学的に又は遺伝子修飾された突然変異体も包含される。適当なリパーゼの例は、例えば、EP 258 068及びEP 305 216中に記載されているようなフミコーラ・ラヌギノーサ(Humicola Lanuginosa)のリパーゼ、例えばE P 238 023中に記載されているようなリゾムコー・ミエヘイ(Rhizomucor miehei) のリパーゼ、EP 214 761中に記載されているキャンディダ(Candida)のリパーゼ、例えばキャンディダ・アンタークティカ(C ．antarctica)のリパーゼ、例えばキャンディダ・アンタークティカのリパーゼＡ又はＢ、例えばEP 218 272中に記載されているようなシュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼ、例えばシュードモナス・アルカリゲネス（P ．alcaligenes）又はシュードモナス・シュードアルカリゲネス（P ．pseudoalcaligenes）のリパーゼ、例えばEP 331 376中に記載されているようなシュードモナス・セパシア（P ．cepacia）のリパーゼ、例えば GB 1,372,034中に開示されているようなシュードモナス・スタッツェリ(P ．stut zeri )リパーゼ、シュードモナス・フルオレッセンス（P ．fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）のリパーゼ、例えばバチルス・サブチリス(B ．subtil is )のリパーゼ〔Dartois et al.，Biochemica et Biophysica Acta 1131(1993) ，pp．253-260〕、バチルス・ステアロサーモフィラス(B ．stearothermophilus) のリパーゼ(JP 64／744992)又はバチルス・プミラス（B ．pumilus）のリパーゼ( WO 91／16422)を包含する。多くのクローン化されたリパーゼが本発明に関して重要であることができる。クローン化されたリパーゼは、Yamaguchi et al．〔Gene 103(1991)，pp．61-67 〕により記載されたペニシリウム・カメンベルチ(Penicillium camembertii)のリパーゼ、ゲオトリカム・カンジダム（Geotricum candidum）のリパーゼ〔Schi mada et al.，J ．Biochem．106(1989)，pp．383-388〕、及びさまざまなリゾプス（Rhizopus）のリパーゼ、例えばリゾプス・デレマー（R ．delemar）のリパーゼ〔Hass et al.，Gene 109(1991)，pp．117-113〕リゾプス・ニベウス(R ．nive us )のリパーゼ〔Kugimiya et al.，Biosci ．Biotech．Biochem．56(1992)，pp． 716-719〕並びにリゾプス・オリザエ(R ．oryzae)のリパーゼを包含する。他のタイプの脂肪分解酵素、例えばクチナーゼ(Cutinases)も、本発明に従って結晶化されることができる。関連のクチナーゼの例は、(WO 88／09367中に記載されたような)シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)由来のクチナーゼ、及び（例えば、WO 90／09446中に記載された）フザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼである。特に重要なリパーゼは、商業的に入手可能なリパーゼ、例えばM1 Lipase^TM、L umafast^TM及びLipomax^TM(Gist-Brocades)，Lipolase^TM及びLipolase Ultra^TM（N ovo Nordisk A/S）、並びにLipase P“Amano”(Amano Pharmaceutical Co．Ltd. )である。アミラーゼ本発明に従って結晶化されることができるアミラーゼ（例えば、α−又はβ− アミラーゼ）は、細胞、例えば微生物、特にバクテリア又は真菌の細胞を使用する発酵プロセスにより得られることができるアミラーゼを包含する。このようなアミラーゼの化学的に又は遺伝子修飾された突然変異体も包含される。関連のアミラーゼは、例えば英国特許第1,296,839号中により詳細に記載されている、バチルス、特にバチルス・リケニフォルミス（B ．licheniformis）の特定の株から得られたα−アミラーゼを包含する。特に重要なアミラーゼは、商業的に入手可能なアミラーゼであり、そのいくつかの非限定的な例は、（Novo Nor disk A/Sから入手可能な）Termamyl^TM，Fungamyl^TM及びBAN^TM、及び（Gist-Bro cadesから入手可能な）Rapidase^TM及びMaxamyl P^TMである。本発明に関連して重要な酵素は、例えば、バチルス、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobactor）又はサーモアナエロバクテリウム(Thermoanaerobacteri um )の属のバクテリアから得られることができるCGTases(サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、EC 2.4.1.19)を包含する。セルラーゼ本文脈において、用語“セルラーゼ”は、セルロース〜グルコース、セロビオース、セロトリオース及び他のセロ−オリゴ糖類の分解を触媒する酵素をいう。本発明に関連して特に好適なセルロースのタイプは、エンド−１，４−β−グルカナーゼ（EC 3.2.1.4）、特に組換えエンド−１，４−β−グルカナーゼである。本発明に従う結晶化のために適当なセルラーゼは、微生物セルラーゼ、顕著には、バクテリア又は真菌のセルラーゼを包含する。関連のバクテリアのセルラーゼの例は、以下の属：シュードモナス(Pseudomonas)、バチルス（Bacillus）、セルロモナス（Cellulomonas）、クロストリジウム(Clostridium)、ミクロスポラ（Microspora）、サーモトガ（Thermotoga）及びカルドセラム（Caldocellum ）、並びに放線菌目（Actinomycets）、例えばストレプトミセス（Streptomyces ）、テルモモノスポラ（Termomonospora）及びアシドセマス(Acidothemus)の中の１内のバクテリアに由来し又はそれにより生産されることができるセルラーゼである。これに関する関連のバクテリア種は、シュードモナス・セルロリティカス（Pseudomonas cellulolyticus）、バシルス・ラウタス(Bacillus lautus)、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)、ミクロスポラ・ビスポラ（Microsp ora bispora ）、テルモモノスポラ・フスカ（Termomon ospora fusca ）、テルモモノスポラ・セルロリティカム(Termomonospora cellul olyticum )及びアシドセマス・セルロリテイカス（Acidothemus cellulolyticus ）を包含する。関連の真菌は、トリコダーマ(Trichoderma)、ミロセシウム（Myrothecium)、アスペルギルス(Aspergillus)、ファナエロカエート（Phanaerochaete）、ニューロスポラ（Neurospora）、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、及びボトリティス（Botrytis）の属内の真菌、特にトリコダーマ・ビリデ（Trichoderm a viride ）、トリコダーマ・レーセイ（Trichoderma reesei）、トリコダーマ・ランジブラチアタム(Trichoderma longibrachiatum)、ミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、ファナエロカエート・クリソスポリウム（Phanaerochaete chrysosporium）、ニューロスポラ・クラッサ (Neurosporacrassa)、ネオカリマスティクス・パートリシアラム(Neocallimasti x partriciarum )及びボトリテイス・シネレア（Botrytis cinerea）の中から選ばれた真菌に由来し又はそれにより生産されることができる酸性セルラーゼを包含する。他の重要な真菌セルラーゼは、アスペルギルス(Aspergillus)、ペニシリウム(Penicillium )、ミセリオフトーラ（Myceliophthora）、フミコーラ（Humicola）、イルペックス(Irpex)、フザリウム（Fusarium）、スタチボトリス（Stachybot rys ）、スコプラリオプシス（Scopulariopsis）、カエトミウム（Chaetomium）、ミコゴン（Mycogone）、バーティシリウム（Verticillium）、ミロセシウム(M yrothecium )、パプロスポラ(Papulospora)、グリオクラジウム(Gliocladium)、セファロスポリウム（Cephalosporium）及びアクレモニウム（Acremonium）の属内の真菌、例えばフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、フザリウム・オキシスポラム（Fesarium oxyspo rum ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ(Myceliopthora thermophila)、ペニシリウム・ジャンシネラム（Penicillium janthinellum）及びセファロスポリウム・エスピー（Cephalosporium sp.）の中から選ばれた真菌、好ましくは、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）DSM 1800、フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）DSM 2672、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Myce liopthora thermophila ）CBS 117.65、及びセファロスポリウム種（Cephalospor ium sp.）RYM-202の中から選ばれた真菌に由来し又はそれにより生産されることができる中性又はアルカリ性セルラーゼである。さらなる重要なセルラーゼは、親セルラーゼとして、真菌又はバクテリア起源をもつセルラーゼ、例えばフミコーラ、トリコダーマ及びフザリウム属の中の１内の真菌株から得られることができるセルラーゼをもつ変種である。酸化還元酵素：本発明に従う結晶化のために適当な酸化還元酵素は、ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ、例えば、ラッカーゼを包含する。ペルオキシダーゼペルオキシダーゼ活性を示す特に重要な酵素は、酵素分類EC 1.11.1.7の下に分類されるもの、並びにペルオキシダーゼ活性を示すこれらの酵素の断片である。本発明の方法による結晶化のために適当なペルオキシダーゼは、好適には、微生物、例えば真菌又はバクテリアにより生産されることができるペルオキシダーゼである。いくつかの好ましい真菌は、亜門不完全菌（Denteromy cotina）に属する株、綱糸状不完全菌類（Hyphomycetes）、例えばフザリウム（Fusarium）、フミコーラ（Humicola ）、トリコダーマ（Tricoderma）、ミロセシウム(Myrothecium)、ベルティシラム(Verticillum)、アルスロミセス(Arthromyces)、カルダリオミセス(C aldariomyces )、ウロクラジウム（Ulocladium）、エンベリシア（Embellisia）、クラドスポリウム（Cladosporium）、又はドレシュレラ（Dreschlera）、特にフザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）DSM 2672、フミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)、トリコダーマ・レシイ(Trichoderma resii)、ミロセシウム・ベルカナ（Myrothecium verrucana）IFO 6113、ベルティシラム・アルボアトラム(Verticillum alboatrum)、ベルティシラム・ダーリイ（Verti cillum dahlie ）、アルスロミセス・ラモサス（Arthromyces ramosus）FERM P-7 754、カルダリオミセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・チャータラム（Ulocladium chartarum）、エンベリシア・アリ(Embellisia alli )又はドレシュレラ・ハロデス（Dreschlera halodes）を包含する。他の好ましい真菌は、亜門担子菌(Basidiomycotina)、に属する株、担子菌綱（class Basidiomycetes）、例えばコプリナス（Coprinus）、ファネロカエテ(P hanerochaete )、コリオラス（Coriolus）又はトラメテス（Trametes）、特にコプリナス・シネレウスｆ．ミクロスポラス（Coprinus cinereus f ．microsporus ）IFO 8371、コプリナス・マクロリザス（Coprinus macrorhizus）、ファネロカエーテ・クリソスポリウム（Rhanerochaete chrysosporium）(例えば、NA-12)又はトラメテス(Trametes)(従来ポリポラス(Polyporus)といわれていたもの)、例えばトラメテス・ベルシカラー（T ．versicolor）（例えば、28-A）を包含する。さらなる好ましい真菌は、亜門接合菌（Zygomycotina）に属する株、ケカビ綱（Mycoraceae）、クモノスカビ（Rhizopus）、又はケカビ(Mucor)、特にムコー・ヒエマリス（Mucor hiemalis）を包含する。いくつかの好ましいバクテリアは、放線菌目（Actinomycetales）の株、例えばストレプトミセス・スフェロイデス（Streptomyces spheroides）ATTC 23965 、ストレプトミセス・サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）IF O 12382又はストレプトバーティシラム・バーティシリウムssp．バーティシリウム(Streptoverticillum verticillium ssp ．verticillium)を包含する。他の好ましいバクテリアは、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）ATCC 1 2905、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillusstearothermophilus)、ロドバクター・スファエロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドモナス・パルストリ(Rhodomonas palustri)、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis ）、シュードモナス・プロシニア（Pseudomonas purrocinia）ATCC 1595 8及びシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）NRRL B-1 1を包含する。さらなる好ましいバクテリアは、ミクソコックス（Myxococcus）に属する株、例えばミクソコックス・ビレッセンス（M ．virescens）を包含する。本発明の方法に関連して特に重要なペルオキシダーゼは、組換えにより製造されたペルオキシダーゼ、例えばWO 92／16634中に記載されたようなコプリナス（Coprinus ）種、特にコプリナス・マクロリザス（C ．macrorhizus）又はコプリナス・シネレウス(C ．cinereus)由来のペルオキシダーゼ、又はその変種、例えばW O 94/12621中に記載されたような変種である。ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素本発明に関連して、ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素は、以下の：酵素分類EC 1.10.3.2に含まれるいずれかのラッカーゼ酵素；酵素分類EC 1. 10.3.1に含まれるいずれかのカテコール・オキシダーゼ酵素；酵素分類EC 1.3.3 .5に含まれるいずれかのビリルビン・オキシダーゼ酵素；及び酵素分類EC 1.14. 18.1に含まれるいずれかのモノフェノール・モノオキシゲナーゼ酵素を包含する。適当なラッカーゼは、微生物起源をもつラッカーゼ、顕著には、バクテリア又は真菌（糸状菌及び酵母を含むもの）由来のラッカーゼである。好適な例は、コウジカビ(Aspergillus)、アカパンカビ（Neurospora）、例えばニューロスポラ・クラッサ(N ．crassa)、ポドスポラ(Podospora)、ボトリティス（Botrytis）、コリビア（Collybia）、ツリガネタケ(Fomes)、マツオウジ（Lentinus）、ヒラタケ(Pleurotus)、ホウロウタケ（Trametes）、例えばトラメテス・ビローサ（T ．villosa ）及びトラメテス・ベルシカラー(T ．versicolor)、リゾクトニア(Rhi zoctonia )、例えばリゾクトニア・ソラニ(R ．solani)、ヒトヨタケ（Coprinus）、例えばコプリナス・プリカティリス(C ．plicatilis)及びコプリナス・シネレウス(C ．cinereus)、ナヨタケ（Psatyrella）、ミセリオフトーラ（Myceliophth ora ）、例えばミセリオフトーラ・サーモフィラ（M ．thermophila）、スチタリジウム（Schytalidium）、ポリポラス(Polyporus)、例えばポリポラス・ピンシタス(P ．pinsitus)、フレビア(Phlebia)、例えばフレビア・ラジタ(P ．radita)( WO 92／01046)、又はカワラタケ（Coriolus）、例えばコリオラス・ヒルスタス（C.hirsutus）JP 2-238885の株に由来するラッカーゼ、特にトラメテス（Trame tes ）、ミセリオフトーラ（Myceliophthora）、スキタリジウム（Schytalidium ）又はポリポラス(Polyporus)から得ることができるラッカーゼを包含する。有機溶媒本発明の方法における使用のために好適な水−混和性有機溶媒は、概して、標準大気圧において、25℃の温度において、又は（約30℃までの温度を含む）25℃ の近傍において液体である。水溶性ポリマー、例えばWO 95／01989中に開示される水溶性ポリマー（その中のいくつか、例えばそのための分子量範囲の下端におけるポリエチレン・グリコールは、上述の温度及び圧力条件下で液体であることができる）は、本発明に関連して水−混和性有機溶媒の範囲内にはない。本発明に関連して好適な水−混和性溶媒は、さまざまな低級脂肪族アルコール、顕著には、Ｃ₁−Ｃ₃脂肪族アルコール、そして低級脂肪族ケトン、顕著にはＣ₁ −Ｃ₅ケトンを包含する。好ましい水−混和性有機溶媒は、全ての割合において水と混和性である溶媒である。このカテゴリー内の低級脂肪族アルコールは、Ｃ₁−Ｃ₃脂肪族アルコールの全て（すなわち、メタノール、エタノール、１−プロパノール及び２−プロパノール）及びＣ₄アルコール、tert−ブチル・アルコール（２−メチル−２−プロパノール）を包含し；メタノール、エタノール及び２−プロパノールが特に好ましい。同様に、好ましいＣ₃−Ｃ₅ケトンは、アセトン（２−プロパノン）である。他の水−混和性の、低脂肪族アルコール、例えば２−ブタノール及びイソブチル・アルコール（２−メチル−１−プロパノール）、並びに水−混和性Ｃ₃−Ｃ₅ ケトン、例えばメチル・エチル・ケトン（２−ブタノン）及びジエチル・ケトン（３−ペンタノン）が、本発明の方法の特定の態様における使用のために適当なものであることができる。さらなる本発明に関連の重要な水−混和性有機溶媒は、グリコール、特に低級脂肪族グリセロール（ジオール）、例えばエチレン・グリコール（１，２−ジヒドロキシエタン）、１，２−プロピレン・グリコール（１，２−ジヒドロキシプロパン）及び１，３−プロピレン・グリコール（１，３−ジヒドロキシプロパン；トリメチレン・グリコールとしても知られているもの）を包含する。（他のタンパク質を含む）さまざまな他の物質／不純物を含有するタンパク質含有溶液からの工業用酵素の結晶化のために、水溶性ポリマー、例えばポリエチレン・グリコール及びポリプロピレン・グリコールを使用することは記載されているけれども（WO 95／01989参照）、本発明者らは、結晶性タンパク質の不純な溶液から、特に他のタンパク質種を含有する溶液（例えば、発酵ブロス由来の溶液）から、結晶性タンパク質を得るために、単純な、水−混和性の有機溶媒、例えばエタノールその他が首尾よく、かつ、信頼性をもって適用されることができるということを示し、又は暗示するための先行の開示を全く知らない。実際、このような溶媒は、むしろ、水性溶液中、タンパク質分子、例えば酵素に対して有害な（例えば、変性性の）効果をもつものと一般に認められてきたようである。従って、例えば、A．McPhersonによるレビュー記事〔Eur. J. Biochem. 189(199 0)，pp．1-23〕は、タンパク質及び核酸の結晶化に関して、以下のように教示している(その文献中の第５頁を参照のこと)(下線を強調のために追加した)： “慣用の分子の結晶化のための一般的方法、例えば溶媒の蒸発、劇的な温度変化、又は強有機溶媒の添加は、不適であり、かつ、破壊的である。それらは、より緩やかで、かつ、制限された技術で取って代わられなければならない。” 後者の文献は、タンパク質又は核酸のための沈殿剤としての有機溶媒の使用の先行の報告に関して、さらに以下のように教示している(文献中第12頁参照)(強調のために下線を追加した)： “一般に、使用される最も一般的な有機溶媒は、エタノール、アセトン、ブタノール及びいくつかの他の一般的な実験室試薬である。…有機溶媒は、核酸、特にtRNA及び２本鎖オリゴヌクレオチドの結晶化のためにより一般的な用途をもっている。ここで、それらは結晶の成長のための主な手段である。これは、一部、有機溶媒に対するポリヌクレオチドのより大きな抵抗性及びそれらのポリアニオン性の表面に起因する。それらは、タンパク質よりも誘電効果に対してさらにより感度が高いようである。唯一の一般法則は、有機溶媒は低温において、０℃において又はそれ未満で使用されなければならず、そしてそれらは、ひじょうにゆっくりと、そしてよく混合しながら添加されなければならないということである。” 上記McPherson文献は、さらに、タンパク質の結晶の成長の促進に関して、以下のように教示している(文献中第19頁参照)(下線を強調のために追加した)： “確かに、周期的な結合の形成を促進する１の主要な手段は、結晶化されるであろう分子の集団ができるだけ均質であることを保証することである。…それは、不所望の種のタンパク質の汚染が除去されるということだけでなく、標的集団内では、全ての個体が絶対的な物理学的及び化学的な一致を呈するということをも意味する。” 従って、不純な、タンパク質含有溶液（例えば、２以上のタンパク質種を含有する発酵ブロス由来の溶液）からの、所望のタンパク質、特に酵素の結晶化が、一般的な要求、例えば、McPherson(前掲書中)により教示されるように、低温で操作すること又は有機溶媒の添加に関していずれかの特別な手段を講ずることを伴わずに、単純な、水−混和性有機溶媒、例えばエタノールを使用して、達成されることができるということを発見したことは、ひじょうに驚ろくべきことである。本発明の方法において使用される水−混和性溶媒は、通常、得られた混合物中の溶媒の濃度が１〜50重量％（％ｗ／ｗ）、しばしば５〜50％ｗ／ｗ、例えば10 〜50％ｗ／ｗ、例えば20〜45％ｗ／ｗの範囲内にあるような量で着目のタンパク質含有溶液に添加されるであろう。しかしながら、ある場合には、例えば、本発明の方法により特定のリパーゼ（脂肪分解性酵素）結晶化するとき、例えば、その溶媒／タンパク質含有溶液混合物の約90％ｗ／ｗ、又はたぶんさらに高い値に対応する量で、より高いパーセンテージの溶媒を使用することが必要かもしれない。本発明に従えば、タンパク質含有溶液への水−混和性有機溶媒の添加は、例えば、その溶媒を徐々に、かつ、本質的に連続的に導入することにより；又はその溶媒を同一の又は相違するサイズのいくつかの部分において添加することにより；又はその溶媒の全てを１の部分で添加することにより、行われることができる。溶媒が添加されるやり方の選択は、とりわけ、着目のタンパク質又はポリペプチドだけではなく、着目のタンパク質以外のさまざまな物質／不純物の溶解度特性にも基づくものである。例として、リパーゼがひじょうに不純なタンパク質含有溶液（例えば、多くの成分を含有する発酵ブロス由来のもの）から結晶化されることが予定されている状況を考えることができる：先にある程度示したように、例えば、高い割合の低級アルコール、例えばエタノールのを含有する水性培地中のリパーゼの溶解度は、しばしば、多くの他のタイプの酵素の溶解度よりもかなり大きなものであり、そしてこのようなリパーゼの結晶化は、そのリパーゼの結晶化を開始するために十分な溶媒濃度が達成される前にそのタンパク質含有溶液の他の成分が溶液から分離する（例えば、沈殿）であろう程に高い、例えばエタノールの濃度を要求するであろう。このような場合、固相の不純物による固体の、結晶性リパーゼの汚染を回避するために、不所望の固相不純物の（例えば、濾過による）分離、及びその後の除去を許容するために十分な間隔で数部分としてその有機溶媒を添加することが望ましいであろう。このような不純物が溶液から分離され、そして除去されるとき、着目の酵素の結晶化を開始させるために十分なレベルまでその濃度を高めるために、さらなる有機溶媒が添加されることができる。適当な場合、２以上の水−混和性有機溶媒が、本発明の方法において好適に使用されることができる。従って、例えば、好適な割合における２以上の水−混和性有機溶媒の混合物の結晶化有効量が、着目のタンパク質の結晶化を生じさせるために使用されることができる。あるいは、例えば、異なる水−混和性有機溶媒の適当な量を、タンパク質含有溶液に少しずつ添加されることができる。本発明の方法のいくつかの態様においては、水−混和性有機溶媒に加えて、適当な塩が上記タンパク質含有溶液に添加されることができる。これらは、好適には、タンパク質、例えば酵素の結晶化のために自己の権利で使用されることができる塩であろうし、そしてこのような塩は、アセテート、スルフェート（HSO₄ ^- ／SO₄ ^2-）、カーボネート（HCO₃ ^-／CO₃ ^2-）及びホスフェート（H₂PO⁴ ^-／HPO₄ ^2- ／PO₄ ^3-）、例えば、それらのアルカリ金属（例えば、Li⁺，Na⁺又はＫ⁺）塩、アルカリ土類金属（例えば、Ca²⁺）塩、又はMg²⁺塩を包含する。本発明に関連して、タンパク質含有溶液に、水−混和性有機溶媒と共に、上記の塩が添加されるとき、添加されるべき上記塩の適当な量は、とりわけ、添加される有機溶媒の量に依存するであろう。従って、例えば（タンパク質含有溶液と水混和性有機溶媒の混合物中の）溶媒濃度が正常な範囲の上端にある（例えば、50％ｗ／ｗの近傍内）にある、本発明の方法の態様を実施するとき、着目のタイプの塩は、典型的には、0. 5〜１％ｗ／ｗまでの塩濃度を与えるように導入されるであろう。しかしながら、より低い濃度の有機溶媒が使用される場合、塩の濃度を高めることが適当であることができる。好ましいタイプの水−混和性有機溶媒が、一般に、着目のタンパク質の結晶化が完結した後に残存する液体から（例えば、蒸留により）回収されることができるであろうということは明らかであろうし、そしてそれ故、本発明の方法に関連して、このような有機溶媒をリサイクルし、そして再使用することが、実行可能であり、そして環境的及び経済的観点から高く望ましいであろう。pH の調整それに水−混和性有機溶媒が添加される又は添加されているところのタンパク質含有溶液のpHは、通常、結晶化及び、好ましくは、タンパク質の溶解度に関して最適である値に調整されるであろう。所定のタンパク質（例えば、酵素）のための最適な値は、とりわけ、その正にその性質に依存するであろうし、そして例えば、トライアルを行うことにより、典型的には、pH10、次にpH９、pH８、pH７ …そしてpH３まで同様に下げて上記結晶化手順を行うことにより開始することにより、決定されることができる。例えば、所定の酵素のための最適値はpH４とpH ５の間にあることが判明している場合、このpH範囲内のトライアルは、次にその最適pH値をより正確に確立するために行われることができる。大部分の酵素のための最適pH値は、通常、pH４〜pH９の範囲内にあるであろう。ある場合には、pHを、着目のタンパク質についての等電点（pI）に等しい値に、又はその近傍内に、調整することが有利であることができる。従って、本発明の方法の特定の態様においては、pHは、（pI−１）≦ pH≦（pI＋１）であるような値に調整される。他の場合には、結晶化プロセスの間に、pHを徐々に下げること（すなわち、pH 勾配を使用すること）、あるいは結晶化プロセスの間のpHにおける段階的変更を行うことが有利であることができる。好適な酸又は塩基のいずれをもpHを調整するために使用することができる。使用される酸は、無機又は有機であることができる。いくつかの例は、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸及びギ酸である。好ましい酸は、リン酸、ギ酸、クエン酸、及び酢酸である。好ましい塩基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウム、特に水酸化ナトリウムである。結晶化本発明の方法を使用して、48時間未満の結晶化期間内に、しばしば、36時間以下の期間内に、そしてしばしば24時間以下の期間内に、結晶化を開始させるためにいずれの種結晶を添加する必要性を伴わずに、満足ゆく程度まで結晶化を行うことが、通常可能であろう。結晶化されるべきタンパク質又はポリペプチドの性質及びタンパク質含有溶液中に存在する他の物質（不純物）の性質を含む、適用される特定の条件に依存して、しばしば、12時間以下の期間内に、そして、ある場合には、約６時間の期間内にさえ、満足いく程度に結晶化が達成されることができる。温度本発明の方法を使用するとき、着目のタンパク質（例えば、酵素）の結晶化は、通常、０℃を上廻る温度においてひじょうに満足ゆくように生じるであろう。一般に、それからタンパク質が結晶化されるところのタンパク質含有溶液の温度は、好適には、０℃から40℃まで、好ましくは０℃から30℃まで、より典型的には５℃から30 ℃まで、例えば約７℃から約28℃までであろう。適当な場合、例えば、比較的低い温度（例えば、約０℃から約７℃までの範囲内の温度）から出発し、そして次にその温度を、好適な時間期間にわたり（例えば、数時間までの期間にわたり）最終的に望ましい温度まで徐々に（あるいは、段階的に）上昇させる温度勾配が、使用されることができる。本発明の方法の多くの態様においては、少しずつの又は段階的な温度上昇を使用するときの最終温度は、しばしば、25℃の近傍内に（例えば、約22℃から約28℃までに）あるであろう。結晶化後の単離本発明の方法は、タンパク質、例えば酵素が結晶化することを引き起こす。結晶性タンパク質の単離は、慣用の方法により、例えば、遠心分離及び／又は濾過により、場合により、その単離された生成物の乾燥を伴って、行われることができる。単離されたタンパク質、特に酵素が、その後に粒状化される場合、湿った、未乾燥の生成物から出発して、標準的な粒状化手順を直接的に行うことが適切であることができる。次に乾燥は、上記粒状化手順の間に生じるであろう。ひじょうに高純度の結晶性産物が望まれる場合、（一般に、むしろ高い純度を有するであろう）本発明の方法の開始の、結晶性生成物は、例えば、本発明の方法により、適当な水性培地中の好適な濃度に再溶解され、そして再結晶化されることができる。しかしながら、実質的に純粋なタンパク質、例えば酵素の再結晶化のための他の方法が、使用されることもできる。もちろん、再結晶化は、適宜、１回以上繰り返されることができる。最終的な結晶性生成物は、配達され、そして／又はそのまま使用されることができる。望ましい場合、その結晶は、例えば、液相製品を得るため適当な培地中の好適な濃度に（生産者又は消費者により）溶解されることができる。本発明は、さらに、本発明に係る方法により得られることができる、又は得られた、結晶性タンパク質産物にも関する。本発明の精製／結晶化方法は、タンパク質又はポリペプチドだけではなく、オリゴペプチド及びオリゴペプチド配列を含む化合物（組成物）を包含するさまざまな他のタイプの物質にも適用可能であると信じられる。このような物質は、例えば、特定のペプチド・ホルモンを包含する。本発明を、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図されていない、以下の実施例において、さらに説明する：実施例１エタノールを使用するフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)セルラーゼの結晶化フミコーラ・インソレンス(H．insolens)のセルラーゼ（エンド−１，４−β −グルカナーゼ）を、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）内でクローン化した。着目の酵素及び他の発酵副生成物を含有する発酵ブロスを（Dow DDS Gr6lpp膜；カット−オフ約20kDを使用した）ドラム濾過及びその後の限外濾過に供した。この限外濾過濃縮物を、さらに、低分子量の物質（例えば、塩）を除去するために２容量の脱イオン水を使用したダイアフィルトレーションに供した。得られた溶液は、１リッター当り87グラムのセルラーゼを含有しており（これは、51％ｗ／ｗの溶液の乾燥物含量を構成し）、そして6.7のpH及び0.7mS／cm の比伝導率を有していた。 45.9ｇの無水（99.9％）エタノールを、撹拌しながら100ｇのセルロース溶液に添加した。温度を27℃に維持した。17時間後、得られた結晶を遠心分離により収穫した。収率は（結晶の容量に対してその８倍の体積の）0.1％ｗ／ｗの水性NaCl溶液中に再溶解された結晶生成物のセルロース分解活性の測定に基づき、85.4％であった。（例えば、いわゆるS-CEVU単位で表される）セルロース活性の測定のために、後者の酵素溶液の計測されたアリコート(0.1％ｗ／ｗNaCl中に再溶解された結晶生成物2を、カルボキシメチルセルロース(CMC；酵素基質)と共にインキュベースする。この反応条件は以下のようなものである：温度：40℃（サーモスタットにかける） pH ：7.5（0.1％ｗ／ｗPEG 6000を含有する0.1Ｍホスフェート・バッファー）基質濃度：3.11％（pH7.5バッファー中）酵素濃度範囲：0.097〜0.181 S-CEVU／ml インキュベーション時間：30分間上記基質のセルロース分解性の分解は、バイブレーション粘度計(Mivi 3000， Sofraser，France)を使用して計測される粘度における減少をもたらす。この粘度における減少は、サンプルのセルロース分解活性に比例する。S-CEVU（Stabil ized Cellulase Viscosity Units）における活性は、適当なNovo Nordisk A/Sセルロース分解性酵素標準に対して測定される。実施例２（比較例）PEG 300 を使用したフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)セルラーゼの結晶化 33.6ｇのポリエチレン・グリコール300(PEG 300；BASFからのもの）を、撹拌しながら、実施例１において使用されたものと同一のセルロース溶液100ｇに添加した。この温度を27℃に維持した。20時間後、得られた結晶を遠心分離により収穫した。この収率は、実施例１において記載されたように測定され、83％であった。上記実施例から、エタノールの使用は、PEG 300が使用されるときよりも高い、結晶生成物の収率をもたらすことは明らかである。実施例３２−プロパノール又はアセトンを使用したフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)セルラーゼの結晶化アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）内でクローン化されたH．i nsolensセルラーゼ（エンド−１，４−β−グルカナーゼ）を含有する生発酵ブロスのバッチを、等重量の水で希釈した。10％（ｗ／ｗ）水性水酸化ナトリウム溶液の添加により、希釈されたブロスのpHを9.5に調整した後、それを、Seitz E K1フィルター・パッド(filter pads)を使用して、ドラム濾過、そしてその後、細菌濾過に供した。得られた濾液を、22％ｗ／ｗの乾燥物含量まで（Dow DDS Gr61pp膜を使用した）限外濾過に供した。この限外濾過濃縮物を、さらに、３容量の水道水を使用したダイアフィルトレーションに供し、そしてその後、30℃で２時間pH5.5において３％（ｗ／ｗ）のPicatif^TM FGV 120活性炭を使用して炭素処理に供した。次に、この炭素をSeitz K900フィルター・パッド及びSeitz EK1 フィルター・パッドを通した濾過により除去した。得られた濃縮物は、1.06mS／cmの比伝導率を有していた。与えられた濃縮物（セルラーゼ含有溶液）の純度のレベルの指標は、440nmにおける濃縮物の吸光度（OD）対１リッターの溶液中の活性セルロースの（グラムにおける）重量の比、すなわちOD_440nm／ｇ活性セルロースの大きさにより提供される。この値が高くなればなる程、その純度は低くなる。先に言及した炭素処理し、濾過された濃縮物については、この比の値は21.7であり、これは、本発明の方法における水−混和性有機溶媒と、それぞれ、２−プロパノールとアセトンを使用して調製された結晶化セルラーゼから調製した溶液について、同じやり方で計測された、以下に与える値と比較されることができる（下を見よ）。炭素処理され、濾過された濃縮物のpHを6.5に調整した後、着目のセルラーゼの結晶化に関して、それぞれ、２−プロパノールとアセトンの有効性を調べるために、アリコートを取り出した。２つの溶媒のそれぞれの、（上記濃縮物のアリコートの重量に対して）それぞれ30％ｗ／ｗと35％ｗ／ｗの量を、約５℃の温度において、濃縮物の対応の濃縮物に添加し、そしてそれと混合した。この温度において15分後、この温度を28℃ まで上昇させ、そしてこの温度で24時間維持した。得られた結晶懸濁液を、遠心分離により収穫し、そしてその結晶ケーキのそれぞれを、0.1％（ｗ／ｗ）水性塩化ナトリウム溶液の８倍容量中の溶解により配合した。そのセルラーゼ活性（ S-CEVU；実施例１参照）及びOD_440nmを各溶液について計測した。結果を以下の表中に要約する：以上の結果から、結晶性酵素生成物（この場合、セルラーゼ）の高収率及び高純度を、本発明の方法の態様において水−混和性有機溶媒として２−プロパノール又はアセトンを使用して得ることができることは明らかである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年３月２３日（１９９８．３．２３）【補正内容】請求の範囲 1. ２以上のタンパク質を含む、タンパク質含有溶液から１のタンパク質を精製し、そして結晶形態で単離する方法であって：（ａ）上記タンパク質含有溶液を、結晶化有効量の水−混和性有機溶媒で処理し；そして（ｂ）上記着目のタンパク質を結晶形態において単離する、ことを含む方法。但し、上記水−混和性有機溶媒は、水溶性ポリマーではない。 2. 前記タンパク質含有溶液が発酵ブロス由来である、請求項１に記載の方法。 3. 前記タンパク質含有溶液が、前記発酵ブロスを固／液分離手順に供することにより得られる溶液である、請求項２に記載の方法。 4. 前記タンパク質含有溶液が、前記有機溶媒の添加の前に濃縮される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 5. 前記有機溶媒の添加前の、前記タンパク質含有溶液中の前記タンパク質の濃縮が、0.1〜25％ｗ／ｗの範囲内、好ましくは0.5〜15％ｗ／ｗの範囲内、例えば５〜15％ｗ／ｗの範囲内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 6. 前記結晶化が０℃を超える温度で生じる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 7. 前記の精製されることが予定されるタンパク質が酵素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 8. 前記酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及び酸化還元酵素から成る群から選ばれる、請求項７に記載の方法。 9. 前記水−混和性有機溶媒が、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトンから成る群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】 1. ２以上のタンパク質を含む、タンパク質含有溶液から１のタンパク質を精製し、そして結晶形態で単離する方法であって：（ａ）上記タンパク質含有溶液を、結晶化有効量の水−混和性有機溶媒で処理し；そして（ｂ）上記着目のタンパク質を結晶形態において単離する、ことを含む方法。但し、上記水−混和性有機溶媒は、水溶性ポリマーではない。 2. 前記タンパク質含有溶液が発酵ブロス由来である、請求項１に記載の方法。 3. 前記タンパク質含有溶液が、前記発酵ブロスを固／液分離手順に供することにより得られる溶液である、請求項２に記載の方法。 4. 前記タンパク質含有溶液が、前記有機溶媒の添加の前に濃縮される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 5. 前記有機溶媒の添加前の、前記タンパク質含有溶液中の前記タンパク質の濃縮が、0.1〜25％ｗ／ｗの範囲内、好ましくは0.5〜15％ｗ／ｗの範囲内、例えば５〜15％ｗ／ｗの範囲内にある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 6. 前記結晶化が０℃を超える温度で生じる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 7. 前記の精製されることが予定されるタンパク質が酵素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 8. 前記酵素が、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及び酸化還元酵素から成る群から選ばれる、請求項７に記載の方法。 9. 前記水−混和性有機溶媒が、メタノール、エタノール、２−プロパノール及びアセトンから成る群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。 10．請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られることができる結晶性タンパク質産物。