JP2000503773A

JP2000503773A - 特異的結合アッセイの改良

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Publication number: JP2000503773A
Application number: JP9541582A
Authority: JP
Inventors: バドリー，ロバート・アンドリユー; ベリー，マーク・ジヨン; ポーター，フイリツプ; ウオツタム，トレバー・アンソニー・ケネス
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1996-05-23
Filing date: 1997-05-20
Publication date: 2000-03-28
Also published as: ATE247830T1; DE69724249T2; AU2961397A; EP0901630B1; DE69724249D1; CA2254108A1; US6294391B1; WO1997044664A1; EP0901630A1; CA2254108C

Abstract

(57)【要約】サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体にサンプルを接触させる工程、固体支持体上の固定化された材料の質量の減少を検出する工程を含んでなり、前記結合パートナーまたは類似体は、目的とする分析物の存在下に固体支持体から特異的に置換され、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化が引き起こされるような方法が開示される。その方法を実施するためのデバイスも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】特異的結合アッセイの改良発明の分野本発明は、目的の分析物の存在を検出する方法、およびその方法を実施するためのアッセイデバイスに関する。発明の背景サンプル中の目的の分析物の存在を検出するために特定の分子の特異的結合特性を利用する数多くのアッセイが記述されている。典型的には、そのようなアッセイは、免疫グロブリン（例えば、抗体またはその機能結合フラグメント）と、免疫グロブリンが結合するハプテンまたは抗原との間の特異的結合を含む。そのようなアッセイの例は、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。従来、目的の分析物と、それに対する特異的結合親和性を有する結合パートナーとの間の結合を検出するために、その結合パートナーを標識化することが必要である。既知の標識は、酵素、放射標識、蛍光または化学発光標識、電気活性標識（例えば、レドックス標識）および着色粒子（例えば、ラテックスビード）を含む。上記に概略した一般的性質のアッセイの改良は、「置換」アッセイに関する。そのようなアッセイにおいて、サンプル中における目的の分析物の存在は、予め存在している結合パートナー／配位子複合体からの標識化結合パートナーまたは標識化配位子の置換を引き起こす。一般的に言って、置換される標識化物質の量は、サンプル中の目的の分析物の濃度に比例する。また、目的の分析物と、利用できる結合部位に結合するための標識化競合物質（例えば、標識化分析物または類似物）との間に競合が生じる「競合」アッセイを用いることかできる。競合及び／又は置換に依存する幾つかのアッセイ法が従来技術において記載されている。例えば、ＥＰ０，３２４，５４０は血漿または血清のような生物学的サンプル中の遊離配位子（錯体形成した配位子ではなく、典型的にタンパクに結合したもの）の量を測定するように設計されたアッセイを開示している。このアッセイ法は、標識化されたモノクローナル抗体である「信号試薬」の使用を必要とする。モノクローナルは、配位子類似体（サンプル中に存在する天然配位子錯化タンパクに結合していないもの）と競合している遊離配位子に結合する。典型的には、類似体は（例えば、粒子またはビード上に）固定化される。類似体は、抗配位子モノクローナル抗体への配位子よりも低い親和性を有するように選択される。アッセイはこのように、免疫競合の原理に基づいており、サンプル中の遊離配位子の存在は配位子類似体に結合する標識化抗体の量を減少させるように作用する。ＷＯ９１／０５２６２は、流体中の分子分析物（特に、例えば、ステロイドおよび他の低分子量分析物）の存在を検出するデバイスおよび方法を開示している。典型的には、水性生物学的サンプルが、毛細管作用により試験ストリップに沿って引き出される。サンプルが進行する時、それは標識化分析物を、ストリップの端部における貯蔵領域から、抗分析物抗体である第１の結合手段へ搬送する。サンプル中における遊離分析物の不存在下では、標識化分析物（例えば、分析物／酵素複合物）が第１の結合手段に結合した状態を維持する。しかしながら、遊離分析物がサンプル中に存在する場合、それは、抗酵素抗体である第２の結合手段に一部の標識化分析物が結合するように、標識化分析物を置換する（または、少なくとも、第１の結合手段上の結合部位のために競合する）傾向がある。適当な基質溶液中にストリップを置くことにより発色する。ＥＰ０，３８３，３１３は、「競合結合法によりハプテン、抗原または抗体を測定するための」組成物およびアッセイ法を開示している。そこに開示されている発明は、抗体またはその配位子を標識化することを必要とする。しかしながら、そのようなアッセイが有用であっても、標識化を必要とする点は不都合である。放射標識は、取り扱いおよび処置において明らかな危険をもたらす。酵素または他の活性標識は、貯蔵中に劣化し、アッセイの感受性に影響を及ぼし得る。着色された粒子の使用は、粒子の比較的大きな表面積が、アッセイの正確さに影響を与え得る非特異的結合部位を誘導する点において問題を引き起こす。本発明は、従来の標識された試薬の使用を必要としないアッセイ法およびデバイスを提供することによりこれらの困難性を低減することを目的とする。発明の概要一つの局面において、本発明は、サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、該方法は分析物に対する特異的結合親和性を有する可逆的に固定化された結合パートナーの固体支持体からの特異的置換、または分析物の可逆的固定化類似体の固体支持体からの類似の特異的置換を含んでなり、その置換は、目的とする分析物の存在に応答して起こると共に検出し得る信号を発生させるものであり、前記可逆的固定化結合パートナーも分析物の類似体も従来の標識を含まないことを特徴とする方法を提供する。概して、この方法は、結合パートナーまたは類似体の特異的置換の結果として、固体支持体上に固定化された材料の質量の減少の検出を含む。第２の局面において、本発明は、サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体にサンプルを接触させる工程、固体支持体上の固定化された材料の質量の減少を検出する工程を含んでなり、前記結合パートナーまたは類似体は、目的とする分析物の存在下に固体支持体から特異的に置換され、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化が引き起こされるような方法を提供する。固体支持体上に固定化された材料の質量の変化は、例えば、音波またはエバネッセント波型センサーによりまたは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出され得る多くの質量依存現象において検出され得る変化を引き起こし得る。検出法は全て当該分野において知られている（例えば、ＥＰ０３４１９２７、ＥＰ０４１６７３０およびＥＰ０４５３２２４に開示されているものを参照）。検出のための特に好適な質量依存現象は、材料が固定化される固体支持体の表面の屈折率である。第３の局面において、本発明は、サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、該アッセイデバイスは分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体、および固体支持体上の固定化された材料の質量の変化を検出する検出手段を含んでなり、サンプル中における目的とする類似体の存在か固体支持体からの結合パートナーまたは類似体の特異的置換を引き起こし、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化が引き起こされるようなデバイスを提供する。本発明は、また、サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーをその上に可逆的に固定化された状態で有するかまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体を含んでなり、前記結合パートナーまたは類似体は、従来の標識を含んでおらず、目的とする分析物の存在に応答して固体支持体から特異的に置換されて検出可能な信号を発生させるようなデバイスも提供する。本発明のアッセイ法およびデバイスは、目的とする分析物の存在を検出するために定性的方法で用いることができる。それらは、存在する分析物の量を測定するために定量的方法で用いることもできる。多くの実施態様において、置換された結合パートナーまたは分析物の類似体は、望ましくは、どんな標識も含まない（または、どの標識にも錯化、複合またはどのようにも結合しない。）。しかしながら、以下に説明するような特定の実施態様において、置換された結合パートナーまたは類似体が従来のものでない標識を含むことが望ましい。ここで用いられる「従来の標識」という用語は、酵素、放射標識、蛍光または化学発光標識、化学活性標識（例えば、レドックス標識）および着色された粒子（例えば、ラテックス、または着色されたもしくは金属性ゾル）のような標識を意味する。前記標識の全てが、標識物質の質量を単に検出する以外のなんらかの方法において主に検出され得る。本発明においては、従来のものでない標識は、検出し得る信号を発生させるためにその質量のみに依存する。本発明の最も好ましい態様において、結合パートナーまたは分析物の類似体の置換は、直接検出されて（例えば、典型的にはエバネッセント波または音波型あるいはＳＰＲセンサーにより）、それにより信号を発生させる現象である。本発明の方法／デバイスにおいて、信号が、ある標識された部分に「貯蔵される」のではなく、結合パートナーまたは類似体の置換部位において本質的に発生することが理解される。結合パートナーまたは分析物は、特異的結合対の構成員であることが都合良い。そのような特異的結合対の多くの例が知られている（例えば、ＤＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク、ホルモンおよびそれらのレセプター、抗原およびその抗体）。典型的には、結合パートナーはタンパタであり、好ましくは免疫グロブリン（例えば、抗体）またはその機能結合フラグメントであり、その用語は特にＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ₂などのことをいう。特定の好ましい実施態様において、結合パートナーは、２つの異なる配位子への特異的結合活性を有するタンパクである。そのようなタンパクの例は、当業者に良く知られている二方向特異的抗体または「ディアボディーズ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」である。可逆的固定化結合パートナーまたは分析物類似体は、当業者に知られた多くの方法のいずれかにおいて、固体支持体に結合することができる。結合パートナーまたは分析物類似体は、普通は、特別の化学薬剤（例えば、非常に低く［=ｐＨ２］緩衝された５０ｍＭグリシンまたは非常に高く［=ｐＨ１２］緩衝された５０ｍＭジエチルアミン等のような溶液）の適用により固体支持体から除去することができるが、アッセイを行う（生物学的系において通常見られるような）条件下においては、目的とする分析物の存在によってのみ固体支持体から放出される。典型的には、アッセイされたサンプルは、生物学的サンプル（体液、例えば尿、全血または血清のような）であり、アッセイ条件は広く生理学的（例えば、約１０〜４０℃、約ｐＨ５〜９）なものとすることによって、結合パートナーまたは分析物類似体が目的とする分析物の存在によってのみ固体支持体から放出されるようにする。幾つかの異なる形式で、本発明のアッセイ法を実施するまたはアッセイデバイスを用いることができる。例えば、可逆的固体化結合パートナーは、抗原との相互作用を介して固体支持体に結合している免疫グロブリンであり得る。高濃度の遊離抗原のサンプル中における存在は、固体支持体からの免疫グロブリンの置換を引き起こす傾向がある。そのようなアッセイは、通常、サンプル中に高濃度の目的とする遊離分析物が存在するときのみ有効である。一つの実施態様において、目的とする分析物の類似体が固体支持体上に（共有相互作用を介して）固定化されることが都合良い。これを実施するのに適した方法は当業者にとって周知である。次に、分析物に特異的な結合パートナーが（例えば、非共有相互作用を介して）分析物の類似体に（比較的緩く）結合されて、それにより固体支持体に結合パートナーが可逆的に固定化される。従って、本発明の好ましい実施態様は、目的の分析物の類似体（類似体は、典型的に、固体支持体に共有結合する）と共に、非共有相互作用を介して固体支持体に結合された免疫グロブリンを有し、この免疫グロブリンは、分析物よりも類似体に対してより低い親和性を有する。従って、低い濃度であってもサンプル中に目的とする分析物が存在することによって、免疫グロブリンの置換が起こる傾向がある。望ましくは、目的とする分析物への免疫グロブリンの結合親和性は、類似体への親和性よりも５〜１００倍、典型的には１０〜２０倍大きい。明らかな理由により、本発明の方法／デバイスは、約５ｋＤ以下の分子量を有する比較的低分子量分析物（例えば、ステロイドなど）を検出するのに適用された場合、特に有利である。一つのそのような分析物はステロイドエストラジオール、またはエストロン−３−グルタロニドのような代謝産物である。すなわち、例えば、目的とする分析物がエストロン−３−グルクロニドである場合、本発明により分析物の存在を検出するために用いられるその適当な類似体はエストリオール−３−グルクロニドであり得る。他の可能性のある好適な類似物は、当業者に明らかであり、例えば、エストロン、エストロン−３−スルフェート、エストリオール、エストラジオールおよびエストラジオール−３−グルクロニドを含む。別の実施態様において、本発明のアッセイ法は、分析物の結合パートナーではなく、分析物の類似体の置換を含み得る。例えば、免疫グロブリンを、少なくとも一つの抗原結合部位を抗原の結合に利用できるような方法で、免疫グロブリンを固体支持体上に固定化することができる。典型的に、アッセイの実施前に、実質的に全ての利用できる結合部位を、目的とする分析物の類似体で占領し、免疫グロブリンは目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有し、それにより、目的とする分析物を含むサンプルの添加時に、類似体が、免疫グロブリンの結合部位から置換される。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ）は複数の結合部位を有することができ、一つの結合部位が、固体支持体に結合した抗原と相互作用し、他のものがアッセイ前に自由に分析物類似体により占領される。また、抗体は、単一の結合部位（ＩｇのＦｖまたはＦａｂフラグメントのような）を有することができるが、単一の結合部位を占領のために利用することができるように固体支持体に固定化される。免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ）は、以下の実施例２に記載のように抗 −Ｆｃ抗体を介して都合良く固定化され得る。すなわち、一つの実施態様において、抗−Ｆｃ抗体が固体支持体上に（典型的には、共有相互作用を介して）固定化される。次に、目的の分析物に特異的な第２の抗体を、抗−Ｆｃ抗体により固体支持体上に捕獲する。次に分析物−特異的抗体の結合部位を、目的とする分析物の類似体により実質的に充分に占領し、それにより分析物−特異的抗体との非共有相互作用を介して固体支持体上に類似体が可逆的に固定化される。目的とする分析物に対する分析物−特異的抗体の親和性は、望ましくは類似体への親和性より５〜１００倍大きい。固定支持体がバイオセンサーデバイスの一部を含むことが好都合である。バイオセンサーデバイスは、生物学的分子認識成分を含む分析デバイスと定義することができ、このデバイスは、典型的に、生物学的認識成分と相互作用する分析物の存在及び／又は濃度に依存する電気信号を発生する。そのようなバイオセンサーデバイスは良く知られており、例えば、ＥＰ０３４１９２７、ＥＰ０４１６７３０およびＥＰ０４５３２２４に記載されている。好ましくは、バイオセンサーは固体支持体の質量依存特性（例えば、音波の増幅、エバネッセント波の増幅、または表面プラズモン共鳴）における変化を検出する。エバネッセント波またはＳＰＲ現象（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ著，１９９５年ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第３巻，４７〜５４頁およびその中の参考文献）を利用するそのようなデバイスの例は、ＢｉａｃｏｒｅＡＢにより販売されているＢＩＡｌｉｔｅ^TMデバイスおよびＢＩＡｃｏｒｅ^TM 、ＡｆｆｉｎｉｔｙＳｅｎｓｏｒｓＬｉｍｉｔｅｄ（英国）により販売されているＩＡｓｙｓ^TMデバイス、およびＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｅｎｓｏｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（スイス国チューリッヒ在）により販売されているＢＩＯＳ−１デバイスを含む。そのようなデバイスのセンサー表面からの抗体分子の置換は、容易に検出し得る比較的大きな質量低下を引き起こす。しかしながら、目的とする分析物の類似体が分析物により置換される実施態様では、エバネッセント波型センサーおよび他の質量依存バイオセンサーに対して、類似体が分析物よりも充分に高い分子量を有さなくてはならず、さもなくば質量の実質的変化が非常に小さく検出が困難になることが当業者には明らかである。例えば、分析物がステロイドまたはペプチドのように低分子量化合物である場合、類似体は、分析物と類似体との間の大きな分子量差を形成するように、高分子量物質に結合することができる。結合に適している高分子量物質は、オブアルブミンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク、脂質等のような他の物質を含む。これらの物質は、酵素、放射標識、蛍光または化学発光標識、レドックス標識または着色された粒子などのような従来の標識ではなく、分析物と類似体との間の分子量差の形成にのみ役立つことに注目すべきである。また、類似体がペプチドである場合、類似体の分子量は、融合タンパクの一部としてペプチドを用いることにより、分析物よりも増加し得る。ペプチドをポリペプチドのＮ−末端、またはより好ましくはＣ−末端に融合し得ることが好都合である。そのような融合タンパクをコード化するＤＮＡ配列の形成方法は当業者に良く知られている。ポリペプチドにより表される追加分子質量は、従来のものでない標識として見ることができる。しかしながら、融合したまたは場合によっては結合したポリペプチドは、例えば酵素標識とは異なりいかなる特別の活性も維持する必要がなく、そのためにアッセイ成分は、貯蔵中の活性の損失故に感受性が低くならない。同様に、比較的大きなラテックスビード（従来技術におけるように）ではなく単一のポリペプチドを用いることによって、アッセイの確度に悪影響が及ばないように比較的少ない非特異的結合部位が導入される。図面の簡単な説明図１は、下記実施例１で利用される化合物（Ｉ）エストロンβ−Ｄ−グルクロニド（エストロン−３−グルクロニドまたはＥ３Ｇと略記）および（ＩＩ）エストリオール３−（β−Ｄ−グルクロニド）（エストリオール−３−グルクロニドと略記）の構造式を示す。図２は、下記実施例１に記載のアッセイ法を模式的に表す。図３は、エストリオール−３−グルクロニドセンサーチップの調製を示すセンサーグラム（秒で測定される時間を基準とする任意共鳴単位「ＲＵ」）である。図４は、エストロン−３−グルクロニドによる４１５５抗体の置換を示す、時間（秒）に対する共鳴単位のグラフである。図５は、エストロン−３−グルクロニドの濃度（ｎＭ）に対する置換された４１５５抗体の量（ＲＵ）のグラフである。図６は、下記実施例２に記載のアッセイ形式の模式図である。図７は、ウサギ抗マウス（ＲＡＭ）Ｆｃセンサーチップの調製を示すセンサーグラム（時間（秒）に対する任意共鳴単位）である。図８は、抗ヒト乳脂肪グロブリンＨＭＦＧ１抗体のＲＡＭＦｃセンサーチップへの結合およびＣＰＤＴＲペプチド複合体のＨＭＦＧ１抗体への結合を示すセンサーグラム（時間（秒）に対する共鳴単位）である。図９は、ＫＰＤＱＲペプチドによるＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲペプチド複合体の置換を示すセンサーグラム（時間（秒）に対する共鳴単位）である。実施例実施例１この実施例においては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用するアッセイを記述する。この現象は、今まで幾つかの文献に記載され、エバネッセント波バイオセンサー（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔｗａｖｅｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：前記Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ１９９５年の文献を再度参照されたい）の基礎である。要約すると、異なる屈折率の二つのメディア間のインターフェースにおける光入射が、特定の入射角において、共鳴している「エバネッセント」波を発生する。共鳴は、メディアの屈折率の変化に非常に敏感である。屈折率の変化は、新しい入射角において共鳴を発生させる。屈折率の変化は、二つのメディア間のインターフェースにおいて薄い金フィルムに結合する質量により起こり、屈折率の変化は金フィルムに結合している質量に比例する。この実施例は、エストロン−３−グルクロニド（ステロイドホルモン代謝産物）の検出のアッセイに関し、その類似体、すなわちエストリオール−３−グルクロニドの使用を含む。これらの化合物の構造の詳細を図１に示す。さらなる情報として、この実施例はＰｈａｒｍａｃｉａＢＩＡｌｉｔｅ^TM消失波バイオセンサー（Ｊｏｎｓｓｏｎら著，１９９１年ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＩＩ，６２０〜６２７頁）を利用している。図２は、アッセイ法を模式的に説明する。工程「Ａ」において、目的とする分析物（中実三角形により表されるエストロン−３−グルクロニド）の類似体（図２において中実円により表されるエストリオール−３−グルクロニド）を、固体支持体（ＰｈａｒｍａｃｉａＢＩＡｌｉｔｅ^TMバイオセンサーのセンサーチップ）の活性デキストラン被覆表面上に共有的に固定化した。工程「Ｂ」においては、次に、エストロン−３−グルクロニドに特異的な抗体（Ｙ型により表されるモノクローナル４１５５）を固定化類似体に結合させた。抗体は類似体に対して比較的低い結合親和性を有し、それにより抗体はバイオセンサーチップに比較的緩く保持（可逆的に固定化）される。従って、目的の分析物（抗体が比較的高い結合親和性を有する）を含むサンプルの導入は、抗体を固定化類似体よりも分析物(工程「Ｃ」)に選択的に結合させ、それによりセンサーチップからの抗体の置換を引き起こし、その置換はセンサーデバイスにより容易に検出することができる。第１の工程として、ＢＩＡｌｉｔｅ^TMバイオセンサーにおいてエストリオール −３−グルクロニドをセンサーチップ上に固定化した。固定化の方法は、Ｊｏｈｎｓｓｏｎら著（１９９５年，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，第８巻，１２５〜１３１頁）およびＯ’Ｓｈａｐｅｓｓｙら著（１９９２年，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２０５巻，１３２〜１３６頁）により実質的に記載された。要約すると、プロセスは以下の通りである：ＣＭ５センサーチップをＢｉａｌｉｔｅ^TM装置に装着し、ＨＢＳ流動緩衝液中で平衡させた。装置のポンプ流量は、５μｌ／分に設定し、温度は２５℃に維持した。次に、デキストラン表面を、Ｐｈａｒｍａｃｉａアミンカップリングキットからの１−エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ −ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化化学薬剤を用いて、ＥＤＣ／ＮＨＳ混合物をサンプルループに注入しデキストラン表面に３５μｌを負荷することにより活性化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化は、図３のセンサーグラムの位置（１）において見ることができる。表面をＥＤＣ／ＮＨＳ２０％（ｖ／ｖ）により活性化した後、水中のエチレンジアミン（ＥＤＡ）（Ｆｌｕｋａ，Ｃｏｄｅ０３５５０）をサンプルループ中に注入した。この溶液３５μｌを表面に負荷した。これにより、表面の基がカルボキシルからアミン誘導体に変化する。これは、図３のセンサーグラムの位置（２）において見ることができる。エストリオール−３−グルクロニド（Ｓｉｇｍａ，ＣｏｄｅＥ−２００２）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化混合物中に１．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、７分間反応させた。次に、この溶液をサンプルループに注入し、この溶液５７μｌをデキストラン／ＥＤＡ表面に負荷した。これは、図３のセンサーグラムの位置（３）において見ることができる。次に、センサーチップをＨＥＰＥＳ緩衝塩水（ＨＢＳ）で洗った。アッセイを以下のように行った。ｉ）エストリオール−３−グルクロニドセンサーチップをＢｉａｌｉｔｅ^TM装置に装着し、ＨＢＳ流動緩衝液中で平衡させた。温度を２５℃に維持し、ポンプ流量を５μｌ／分に維持した。ｉｉ）エストロン−３−グルクロニドに特異的なマウスモノクローナル抗体（細胞系「４１５５」により製造）を、ＨＢＳ緩衝液中で３０μｇ／ｍｌに希釈した。この溶液を、サンプルループ中に注入し、バイオセンサーチップ表面に３５ μｌを負荷した。４１５５モノクローナル細胞系を調製し、Ｇａｎｉら著（１９９４年，Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，第４８巻，２７７〜２８２頁）により記載された方法に従ってスクリーニングした。Ｇａｎｉ等の文献は、抗−プロゲステロン抗体の増幅に関するものであるが、エストロンおよびその類似体と反応する抗体の製造において実質的に同じ技術を用いている。細胞系４１５５から得られる以外の抗体は、当業者により（そのような技術を用いて）容易に製造することができ、そのような抗体は、定性的に類似の特定を有する。さらに、市販の抗エストロングルクロニドモノクローナル抗体（ニュージーランドのＷａｌｌａｃｅｖｉｌｌｅＡｎｉｍａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅ．からのもの）が、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓＤｉｒｅｃｔｏｒｙｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔｓ（第９版，１９９６〜１９９７年）に記載されている。ｉｉｉ）エストロン−３−グルクロニド（Ｓｉｇｍａ製，ｃｏｄｅＥ１７５２）を、ＨＢＳ緩衝液に１ｍｇ／ｍｌで溶解した。これを、さらにＨＢＳ緩衝液によりそれぞれ２０．５ｎＭ、２．０５ｎＭおよび０．２０５ｎＭに希釈した。使用した濃度は、尿で見つかるＥ３Ｇの生理学的濃度を表す（Ｓｔａｎｃｙｚｋら著，１９３０年，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓ．＆Ｇｙｎａｅ．，第１３７（４）巻，４４３〜４５０頁）。２０．５ｎＭのＥ３Ｇ溶液を、サンプルループ中に注入し、バイオセンサーチップ表面に３５μｌを負荷して、結合した４１５５抗体を置換した。ｉｖ）注入完了後、残りの抗体を、バイオサンサーチップ表面で１００ｍＭＨＣｌの１０μｌの負荷により除去した。ｖ）工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）を、それそれ２．０５ｎＭおよび０．２０５ｎＭに希釈したエストロン−３−グルクロニド希釈液を用いて繰り返した。センサーチップの調製センサーチップの固定化のセンサーグラムを図３に示す。表面に結合したステロイドを、センサーグラムの痕跡を見、固定化の前後のベースラインを比較することにより検出することができなかった。これは、エストリオール−３−グルクロニドの分子量がＢＩＡｌｉｔｅ^TMの検出限界を下回っているからである。エストリオール−３−グルクロニドセンサーチップでの置換反応の調査４１５５抗体は、センサーチップに共有結合しているエストリオール−３−グルクロニドに大量に結合することができた。４１５５抗体を、エストロン−３− グルクロニドの注入時にチップの表面から置換した。エストロン−３−グルクロニドにより置換された抗体の量は、ステロイドの濃度に依存していた（図４参照：実線は０．２ｎＭのＥ３Ｇを用いた結果を示し、鎖線は２．０ｎＭのＥ３Ｇを用いた結果を示し、鎖線は２．０ｎＭのＥ３Ｇを用いた結果を示し、点線は２．０ｎＭのＥ３Ｇを用いた結果を示し、および点線は２０ｎＭのＥ３Ｇを用いた結果を示している。）。これらの間の線形関係を示すために、（ｉ）ＲＵ単位の置換した抗体の量（左側垂直軸）および（ｉｉ）表面に結合した量と比べた置換抗体の％（右側垂直軸）に対してステロイドの濃度をプロットしてグラフ（図５）を作成した。実験において用いたエストロン−３−グルクロニド（Ｅ３Ｇ）の濃度は、ヒト尿サンプルで見つかるＥ３Ｇの濃度の生理学的範囲に及んだ。置換実験において、Ｅ３Ｇステロイドにより置換された抗体の量がＥ３Ｇの濃度に正比例している（図５参照）ことが明らかに見られる。この置換反応は、ＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置を用いた表面プラズモン共鳴による検出のための最低閾値をそれ自体が下回るバイオセンサーにより小さい分子の配位子を測定する可能性を示している。置換反応は、酵素または放射活性分子による試薬の標識を必要としない新規免疫アッセイ法の基礎を形成し得る。このタイプのアッセイが作用するのに必要なものは、デキストランに固定化され得る低い親和性抗原類似体のみである。実施例２ＨＭＦＧ１抗体からの交差活性合成ペプチドオブアルブミン複合体の置換この置換反応の模式図を図６に見ることができる。図６において、固体支持体は活性化デキストランを被覆したＰｈａｒｍａｃｉａＢＩＡｌｉｔｅ^TMバイオセンサーのセンサーチップである。第１の抗体（ＩｇＧのＦｃ部分に特異的なポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ［「ＲＡＭ」］）を活性化デキストランに共有的に固定化した（「Ａ」）。次に、目的とする分析物に特異的な第２（マウス）抗体を添加する（「Ｂ」）。この実施例において目的とする分析物は、ヒト乳脂肋グロブリン（ＨＭＦＧ）１タンパク質から誘導されたペプチド（ＫＰＤＱＲ）である。抗ＨＭＦＧ１モノクローナル抗体は、Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕら著（１９８１年，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，第２８巻，１７頁）に記載されている。抗ＨＭＦＧ１モノクローナル抗体は、ＲＡＭ第１抗体によりセンサーチップ上に捕獲される。第１および第２抗体分子をＹ型により図中に示す。次に、目的とするペプチド分析物の類似体（単一文字アミノ酸コードを用いるペプチドＣＰＤＴＲ）を導入した。この実施例において、分析物と類似体の両方が低分子量ペプチドであるが、分子量の違いによって区別することは容易でない。従って、高分子量ポリペプチド（オブアルブミン）をペプチド類似体に化学的に複合させた。このペプチド−オブアルブミン複合体(図６において中実楕円として示す)を、抗ＨＭＦＧ１抗体により比較的低い親和性で結合し、それにより、類似体を固体支持体上に可逆的に固定化した（Ｃ）。目的とするペプチド分析物(ＫＰＤＱＲ、図６において中実三角形として示す)を導入したとき、抗ＨＭＦＧ１はそこに選択的に結合する傾向がある（類似体に対するよりも目的の分析物に対してより高い親和性を有する）。従って（「Ｄ」）、分析物はセンサーチップに結合され、より高分子量の類似体であるオブアルブミン複合体を置換した。センサーチップに結合した質量の変化は、ＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置により検出することができる。ａ）ポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｆｃ特異的）センサーチップの調製ｉ）カルボシキメチルデキストラン（ＣＭ５）センサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製，ＣｏｄｅＢＲ−１０００−１４）をＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置に装着し、ＨＥＰＥＳ緩衝塩水（ＨＢＳ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製，ＣｏｄｅＢＲ−１００１−８８）で平衡させた。装置のポンプ流量は、５μｌ／分に設定し、温度は２５℃に維持した。ｉｉ）次に、デキストラン表面を、アミンカップリングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製，ＣｏｄｅＢＲ−１０００−５０）からのＥＤＣおよびＮＨＳ活性化化学薬剤を用いて活性化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ混合物をサンプルループに注入しデキストラン表面に３５μｌを負荷した。ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化は、図７のセンサーグラムの位置（１）において見ることができる。ｉｉｉ)ポリクローナルウサギ抗マウス免疫グロブリンＧ(Ｆｃ特異的)（ＲＡＭＦｃ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製，ＣｏｄｅＢＲ−１０００−５７）を、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ５．０中で５０μｇ／ｍｌまで希釈し、サンプルループ中に注入した。この溶液３５μｌをデキストラン表面に負荷した。デキストランへのＲＡＭＦｃの結合は、図７のセンサーグラムの位置（２）において見ることができる。ｉｖ）ＲＡＭＦｃ負荷が一旦完了すると、非結合ＲＡＭＦｃをＨＢＳ流動緩衝液によりデキストラン表面から洗い流し、デキストラン表面上の残りの活性化エステル部位をエタノールアミンと反応させる。１ＭエタノールアミンｐＨ８．５（Ｐｈａｒｍａｃｉａアミンカップリングキット，ＣｏｄｅＢＲ−１０００−５０）をサンプルループ中に注入し、デキストラン／ＲＡＭＦｃ表面に３５μｌを負荷した。これは、図７のセンサーグラムの位置（３）において見ることができる。ｖ）表面から非共有的に付加しているＲＭＡＦｃを除去するために、１００ｍＭＨＣｌをサンプルループ中に注入し、この溶液１０μｌをデキストラン／ＲＡＭＦｃ表面に負荷した。これは、図７のセンサーグラムの位置（４）において見ることができる。ｂ）置換反応のための合成ペプチドＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＣＰＤＴＲ）およびＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（ＫＰＤＱＲ）の調製ここで用いたペプチドは、抗ＨＭＦＧ１抗体が結合しているヒト乳脂肪グロブリン１タンパク中の天然エピトープＰｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ− Ａｒｇ（ＰＤＴＲ）配列の種々の変異種である（Ｂｒｉｇｇｓら著，１９９１年，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７３巻，５０５〜５０７頁）。ＣＰＤＴＲ中のＣｙｓ（Ｃ）を添加して、ペプチドを市販のマレイミド活性化オブアルブミンに結合させ、有用な複合体を形成した。この複合体は、ペプチド単独ではＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置により検出される充分な質量を有さないため必要である。分子をＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置登録する前に、約５０００ダルトンの閾値が必要である。この実施例に記載した作業は、モノクローナル抗体ＨＭＦＧ１を用いて行った実験に関するものであり、定性的に類似の特性を有する他の抗体は当業者により容易に製造することができる。さらに、市販の抗乳脂肪グロブリンモノクローナル抗体（独国Ｈａｎａｕ在Ｐａｅｓｅｌ＆ＬｏｒｅｉＧｍｂＨ．から得られる）が、、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓＤｉｒｅｃｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔｓ（第９版，１９９６〜１９９７年）に記載されている。ＨＭＦＧ１エピプトープ中の臨界的アミノ酸残留分を確認するために行われる作業（Ｐｒｉｃｅら著，１９９１年，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，第１３９巻，８３〜９０頁）において、天然ＰＤＴＲ配列とは異なる親和性を有する多くの変異種を形成した。Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（ＰＤＱＲ）は、ＰＤＴＲよりもＨＭＦＧ１抗体により高い親和性を有するＰＤＴＲ配列の類似体である。ペプチドの溶解性を向上させるためにＮ −末端リシンを用いてペプチドＫＰＤＱＲを合成した。しかしながら、このペプチドはＰＤＱＲ配列を含むので、それは免疫置換反応の調査にも好適であった。Ｎ−末端リシンは実質的悪影響無しに容易に取り除くことができた。ｉ）既に公開された標準的技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ著，１９６３年，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第８５巻，２１４９〜２１５４頁）を用いてＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＧＥＭ半自動合成機においてペプチドを合成した。簡単に言えば、Ｆｍｏｃ−アミノ酸試薬（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）をＰｙＢＯＰ化学薬剤（Ｇｒａｎｔ著，１９９２年，「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｕｓｅｒ’ｓｇｕｉｄｅ」，ニューヨーク在Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ出版）を用いて連続的に活性化した。これら活性化されたアミノ酸を、固体支持体ＮｏｖａｓｙｎＴＧＲ樹脂（０．８ｇ）（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）に結合させて固体マトリックスに付着した保護ペプチドを製造した。合成全体を通してジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒を用いた。ペプチドを無水酢酸（ＤＭＦ中１０％）と反応させてＮ末端を保護した。ｉｉ）次に、ペプチドを脱保護し、標準的開裂条件を用いて、ペプチド当たり２０ｍｌの開裂溶液［９２．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（Ａｌｄｒｉｃｈ製）、２．５％（ｖ／ｖ）エタンジオール（Ａｌｄｒｉｃｈ製）、２．５％（ｖ／ｖ）水、２．５％（ｖ／ｖ）トリイソプロピルシラン（Ａｌｄｒｉｃｈ製）］を用いて開裂させた。溶液を濾過して樹脂を除去し、減圧下に３０℃ でコールドフィンガー（ドライアイス／アセトン）トラップを用いて回転蒸発させて全ての過剰溶媒を除去した。この手順は３０分かかった。ｉｉｉ）残りの化学薬剤不純物を、ジエチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ製）でペプチドを沈殿させ、過剰のジエチルエーテルを用いてこの沈殿を繰り返して抽出することにより除去した。ｉｖ）次に、ペプチド沈殿を、水で可溶化し凍結乾燥した。得られる粉末を−２０℃で必要となるまで貯蔵した。ｃ）ＣＰＤＴＲペプチドオブアルブミン複合体の調製ペプチドを、燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中に、５ｍｇ／ｍｌの濃度となるまで溶解し、ＰＢＳ１ｍｌに溶解した予備活性化マレイミドオブアルブミン（Ｐｉｅｒｃｅ製）５ｍｇと混合した。この混合物を室温で２．５時間反応させた。次に、過剰のペプチドを、サンプルを５リットルのＰＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ製）により４℃で１６時間透析することにより除去した。次に、複合体を、透析液から除去し、４℃で必要になるまで貯蔵した。ｄ）ＫＰＤＱＲペプチドによるモノクローナルＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲペプチド−オブアルブミン複合体の置換ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（Ｆｃ特異的）バイオセンサーチップを、ＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置に入れ合体操作を行った。ＨＥＰＥＳ緩衝塩水（ＨＢＳ）流動緩衝（Ｐｈａｒｍａｃｉａ生成物，コードＢＲ−１００１−８８）流量を５ μｌ／分とした。ＲＡＭＦｃセンサーチップの調製のための典型的センサーグラムを図７に示す。図７において、１はデキストラン表面のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化を表し、２は活性化デキストランに結合するＲＡＭＦｃを表し、３はエタノールアミンでの残留活性化デキストラン部位の保護を表し、４は非共有結合物質を除去するための１００ｍＭＨＣｌ添加を表す。ヒト乳脂肪グロブリン１に特異的なマウスモノクローナル抗体を、ＨＢＳ緩衝液中で５０μｇ／ｍｌまで希釈し、この溶液３５μｌをバイオセンサーチップ中に注入した。注入後、バイオセンサーチップを自動的に洗い、マウスＨＭＦＧ１特異的抗体の１０４０ＲＵを、ポリクローナルウサギ抗マウス抗体（Ｆｃ特異的）抗体により結合した。ＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体を、ＨＢＳ緩衝液で１０倍に希釈し、この溶液をバイオセンサーチップ中に注入した。約２０４の共鳴単位を、マウスＨＭＦＧ１特異的抗体により結合した。ペプチドＫＰＤＱＲをＨＢＳ緩衝液中で２００μｇ／ｍｌまで希釈し、この溶液３５μｌをバイオセンサーチップ中に注入してＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体を置換した。次に、残りの結合ＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体およびマウス抗ＨＭＦＧ１を、１００ｍＭＨＣｌでセンサーチップを簡単に洗うことにより除去した。ペプチドＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇを注入しない以外は同じ方法において対照実験を行った。結果ＲＡＭＦｃセンサーチップの調製センサーチップの結合により、手順の終わりに固定化された約８０００ＲＵのＲＡＭＦｃを有する高性能ＲＡＭＦｃ特異的センサーチップが得られた（図７参照）。ＲＡＭＦｃは、マウスＨＭＦＧ１抗体を、各抗体分子について複数の結合部位に結合させ、それにより分子の結合力を高めた。高結合力の効果により、ＲＡＭＦｃ層からのモノクローナル抗体の解離は無視できる程度である。これは、ＲＡＭＦｃからのＨＭＦＧ１の解離に対し殆どが平坦線である図８の位置２において見ることができる。この条件は、置換実験におけるＲＵの損失が、ＫＰＤＱＲペプチドによるＣＰＤＴＲ−オブアルブミンの免疫特異的置換によるものであって、ＲＡＭＦｃ層から解離するＨＭＦＧ１モノクローナル抗体ではないことを確認するために必要である。図８において、（１）はＲＡＭＦｃセンサーチップに結合しているＨＭＦＧ１を表し、（２）はＲＡＭＦｃ層からのＨＭＦＧ１抗体の解離を表し、（３）はＨＭＦＧ１抗体に結合しているＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体を表し、（４）はＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体の解離を表す。分子結合現象からのＳＰＲ信号は、分子の質量及びこの現象が生じている共鳴する金層からの距離により低下する。幾つかの分子の層を集めることを必要とする分子相互作用研究は、分子の各層が添加され金層からの距離が増加するときに生じる信号の減少を補わなければならない。この問題に対する補償は、試験系の第１の層において多量の配位子を固定化することにより達成される。これにより、信号減少が克服され、最終的分子結合現象が容易に観察される。ＲＡＭＦｃセンサーチップは、１０００ＲＵのマウスモノクローナルＨＭＦＧ１抗体を結合することができた。これは、ＣＰＤＴＲ−オブアルブミンペプチド複合体のＨＭＦＧ１抗体への結合および、ＨＭＦＧ１抗体に結合しているＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体へのペプチドＫＰＤＱＲによる置換効果が容易に観察されることを確保するのに充分である（図８参照）。ペプチドＫＰＤＱＲによるＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体の置換ペプチドＫＰＤＱＲによりＣＰＤＴＲ−オブアルブミンが置換されたかどうか観察するために、ＢＩＡ評価パッケージにおいて生データを分析した。実質的に、その後のペプチド置換を伴うまたは伴わないＨＭＦＧ１工程へのＣＰＤＴＲ− オブアルブミン複合体の結合のためのデータの二つの領域を、別のグラフとしてプロットして重ねた。データを調和させたまま保つために、ＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体についての注入点において両グラフを並べた（図９参照）。ペプチドを注入しなかった曲線（図９における実線）は、ＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体の正常な解離を示している。これは実質的に免疫特異的置換が測定されるベースラインである。ペプチドを添加した曲線（図９における破線）は、免疫置換を示している。ペプチドＫＰＤＱＲ注入（図において下方向の垂直矢印により示す）開始直後、共鳴単位信号に急激な上昇が生じる。これは、装置のＨＢＳ流動緩衝液からＫＰＤＱＲペプチド緩衝液への変化に起因し、「バルク屈折率変化（ｂｕｌｋｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘｃｈａｎｇｅ）」（バルク屈折率変化は、サンプルと、装置のＨＢＳ流動緩衝液と異なる緩衝組成物とをセンサーチップに注入したときに起こる。ＨＢＳとサンプル緩衝液のイオン強度の相違により屈折率の変化が生じるが、ここでエバネッセント波がデキストラン層の探針となる。屈折率の変化が、センサーグラムで観察される共鳴信号が直ぐに変化させる。）と呼ぶ。大規模屈折率変化により引き起こされるこの共鳴単位の増加は、ＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体の免疫置換が発生し、この置換による質量の損失が共鳴信号の低下を引き起こすので迅速に失われる。結局、ペプチドが可能なＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体の全てを除去し、残っているものは全て、置換することのできない高度の結合力を有する多重結合ＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体であるので、信号曲線は平坦である。ペプチド注入の終了時に、サンプル緩衝液からＨＢＳ装置流動緩衝液への切り替えにより引き起こされる共鳴単位信号が直ちに低下した。ペプチドを注入したものと注入しないものの、すなわち免疫置換と通常の解離との曲線の比較により、ＫＰＤＱＲペプチドにより引き起こされるＨＭＦＧ１抗体からのＣＰＤＴＲ−オブアルブミン複合体１００ＲＵのさらなる損失があることが示される（図９において双方向垂直矢印により示される）。これらの実施例に表されるデータから、いかなるアッセイ成分も標識する必要なくステロイドやペプチドのような低分子量分析物を検定する特別の利点を伴って本発明をいかに用い得るかを知ることができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年６月２日（１９９８．６．２）【補正内容】エストラジオールおよびエストラジオール−３−グルクロニドを含む。別の実施態様において、本発明のアッセイ法は、分析物の結合パートナーではなく、分析物の類似体の置換を含み得る。例えば、免疫グロブリンを、少なくとも一つの抗原結合部位を抗原の結合に利用できるような方法で、免疫グロブリンを固体支持体上に固定化することができる。典型的には、アッセイの実施前に、実質的に全ての利用できる結合部位を、目的とする分析物の類似体で占領し、免疫グロブリンは目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有し、それにより、目的とする分析物を含むサンプルの添加時に、類似体が、免疫グロブリンの結合部位から置換される。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＭ）は複数の結合部位を有することができ、一つの結合部位が、固体支持体に結合した抗原と相互作用し、他のものがアッセイ前に自由に分析物類似体により占領される。また、抗体は、単一の結合部位（ＩｇのＦｖまたはＦａｂフラグメントのような）を有することができるが、単一の結合部位を占領のために利用することができるように固体支持体に固定化される。免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ）は、以下の実施例２に記載のように抗−Ｆｃ抗体を介して都合良く固定化され得る。すなわち、一つの実施態様において、抗−Ｆｃ抗体が固体支持体上に（典型的には、共有相互作用を介して）固定化される。次に、目的の分析物に特異的な第２の抗体を、抗−Ｆｃ抗体により固体支持体上に捕獲する。次に分析物−特異的抗体の結合部位を、目的とする分析物の類似体により実質的に充分に占領し、それにより分析物−特異的抗体との非共有相互作用を介して固体支持体上に類似体が可逆的に固定化される。目的とする分析物に対する分析物−特異的抗体の親和性は、望ましくは類似体への親和性より５〜１００倍大きい。固定支持体がバイオセンサーデバイスの一部を含むことが好都合である。バイオセンサーは、生物学的分子認識成分を含む分析デバイスと定義することができ、このデバイスは、典型的に、生物学的認識成分と相互作用する分析物の存在及び／又は濃度に依存する電気信号を発生する。ｖ）表面から非共有的に付加しているＲＡＭＦｃを除去するために、１００ｍＭＨＣｌをサンプルループ中に注入し、この溶液１０μｌをデキストラン／ＲＡＭＦｃ表面に負荷した。これは、図７のセンサーグラムの位置（４）において見ることができる。ｂ）置換反応のための合成ペプチドＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＣＰＤＴＲ）およびＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（ＫＰＤＱＲ）の調製ここで用いたペプチドは、抗ＨＭＦＧ１抗体か結合しているヒト乳脂肪グロブリン１タンパタ中の天然エピトープＰｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ（ＰＤＴＲ）配列の種々の変異種である（Ｂｒｉｇｇｓら著，１９９１年，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７３巻，５０５〜５０７頁）。ＣＰＤＴＲ中のＣｙｓ（Ｃ）を添加して、ペプチドを市販のマレイミド活性化オブアルブミンに結合させ、有用な複合体を形成した。この複合体は、ペプチド単独ではＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置により検出される充分な質量を有さないため必要である。分子をＢＩＡｌｉｔｅ^TM装置登録する前に、約５０００ダルトンの閾値が必要である。この実施例に記載した作業は、モノクローナル抗体ＨＭＦＧ１を用いて行った実験に関するものであり、定性的に類似の特性を有する他の抗体は当業者により容易に製造することができる。さらに、市販の抗乳脂肪グロブリンモノタローナル抗体(独国Ｈａｎａｕ在Ｐａｅｓｅｌ＆ＬｏｒｅｉＧｍｂＨから得られる)が、、Ｌｉｎｓｃｏｔｔ’ｓＤｉｒｅｃｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔｓ（第９版，１９９６〜１９９７年）に記載されている。ＨＭＦＧ１エピプトープ中の臨界的アミノ酸残留分を確認するために行われる作業（Ｐｒｉｃｅら著，１９９１年，Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，第１３９巻，８３〜９０頁）において、天然ＰＤＴＲ配列とは異なる親和性を有する多くの変異種を形成した。Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（ＰＤＱＲ）は、ＰＤＴＲよりもＨＭＦＧ１抗体により高い親和性を有するＰＤＴＲ配列の類似体である。ペプチドの溶解性を向上させるためにＮ−末端リシンを用いてペプチドＫＰＤＱＲを合成した。しかしながら、このペプチドはＰＤＱＲ配列を含むので、それは免疫置換反応の調査にも好適であった。Ｎ−末端リシンは実質的悪影響無しに容易に取り除くことができた。請求の範囲１．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、該方法が分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体にサンプルを接触させる工程を含み；結合パートナーまたは分析物を固体支持体上に可逆的に固定化する相互作用の結合親和性が、それそれ、目的とする分析物への結合パートナーの結合親和性または目的とする分析物への固体支持体の結合親和性より低く、それによって、前記結合パートナーまたは類似体は、目的とする分析物の存在下に固体支持体から特異的に置換され、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る低下が引き起こされ、；固体支持体上の固定化された材料の質量の減少を検出する工程を含む方法。２．可逆的固定化結合パートナーが免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントである請求項１に記載の方法。３．可逆的固定化結合パートナーが二方向特異的抗体である請求項１または２に記載の方法。４．可逆的固定化結合パートナーが目的とする分析物の類似体との相互作用により固体支持体上に固定化され、結合パートナーが目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有する請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。５．目的とする分析物の類似体が免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントとの相互作用により固体支持体上に固定化され、前記免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントが目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有する請求項１に記載の方法。６．固体支持体がバイオセンサーデバイスの一部を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。７．固体支持体がエバネッセント波、音波または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーデバイスの一部を含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。８．目的とする分析物がエストラジオールまたはその代謝産物である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。９．目的とする分析物がエストロン−３−グルクロニドまたはエストリオール −３−グルクロニドである請求項１〜８のいずれかに記載の方法。１０．固体支持体上に固定化された材料の質量の低下が支持体の表面における屈折率の変化により検出される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１１．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体を含み；結合パートナーまたは分析物を固体支持体上に可逆的に固定化する相互作用の結合親和性が、それぞれ、目的とする分析物への結合パートナーの結合親和性または目的とする分析物への固体支持体の結合親和性より低く、それによって、サンプル中における目的とする類似体の存在が固体支持体からの結合パートナーまたは類似体の特異的置換を引き起こし、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化が引き起こされ；および固体支持体上の固定化された材料の質量の低下を検出する検出手段を含むデバイス。１２．請求項１〜１０のいずれか一項の方法の実施に用いるための請求項１１に記載のデバイス。１３．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、該方法は分析物に対する特異的結合親和性を有する可逆的に固定化された結合パートナーの固体支持体からの特異的置換、または分析物の可逆的固定化類似体の固体支持体からの類似の特異的置換を含んでなり、結合パートナーまたは分析物を固体支持体上に可逆的に固定化する相互作用の結合親和性が、それそれ、目的とする分析物への結合パートナーの結合親和性または目的とする分析物への固体支持体の結合親和性より低く、それによって、該置換は、目的とする分析物の存在に反応して起こると共に検出し得る信号を発生させるものであり、前記可逆的固定化結合パートナーも分析物の類似体も酵素標識、放射標識、蛍光または化学発光標識、電気活性標識または着色粒子を含まないことを特徴とする方法。１４．さらに請求項１〜１０のいずれか一項に従う請求項１３に記載の方法。１５．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーをその上に可逆的に固定化された状態で有するまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体を含んでなり、結合パートナーまたは分析物を固体支持体上に可逆的に固定化する相互作用の結合親和性が、それぞれ、目的とする分析物への結合パートナーの結合親和性または目的とする分析物への固体支持体の結合親和性より低く、それによって、結合パートナーまたは類似体が、目的とする分析物の存在に反応して固体支持体から特異的に置換され、それにより、検出され得る信号が発生し、特徴として前記可逆的固定化結合パートナーも分析物の類似体も酵素標識、放射標識、蛍光または化学発光標識、電気活性標識または着色粒子を含まないようなアッセイデバイス。１６．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法の実施に用いるための請求項１５に記載のアッセイデバイス。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ポーター，フイリツプイギリス国、ベツドフオード・エム・ケー・45・７・ビー・ビー、ロザー・クローズ・２ (72)発明者ウオツタム，トレバー・アンソニー・ケネスイギリス国、ニア・ロイストン・エス・ジー・８・６・エル・エル、メルドレス、ウエスト・ウエイ・18

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、該方法が分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体にサンプルを接触させる工程、固体支持体上の固定化された材料の質量の減少を検出する工程を含んでなり、前記結合パートナーまたは類似体は、目的とする分析物の存在下に固体支持体から特異的に置換され、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化が引き起こされるような方法。２．可逆的固定化結合パートナーが免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントである請求項１に記載の方法。３．可逆的固定化結合パートナーが二方向特異的抗体である請求項１または２に記載の方法。４．可逆的固定化結合パートナーか目的とする分析物の類似体との相互作用により固体支持体上に固定化され、結合パートナーが目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有する請求項１、２または３のいずれか一項に記載の方法。５．目的とする分析物の類似体が免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントとの相互作用により固体支持体上に固定化され、前記免疫グロブリンまたはその機能結合フラグメントが目的とする分析物よりも類似体に対してより低い結合親和性を有する請求項１に記載の方法。６．固体支持体がバイオセンサーデバイスの一部を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。７．固体支持体がエバネッセント波、音波または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーデバイスの一部を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。８．目的とする分析物がエストラジオールまたはその代謝産物である請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。９．目的とする分析物がエストロン−３−グルクロニドまたはエストリオール −３−グルクロニドである請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。１０．固体支持体上に固定化された材料の質量の低下が支持体の表面における屈折率の変化により検出される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。１１．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体、および固体支持体上の固定化された材料の質量の変化を検出する検出手段を含んでなり、サンプル中における目的とする類似体の存在が固体支持体からの結合パートナーまたは類似体の特異的置換を引き起こし、それにより、そこに固定化された材料の質量の検出し得る変化か引き起こされるようなデバイス。１２．請求項１〜１０のいずれか一項の方法の実施に用いるための請求項１１に記載のデバイス。１３．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出する方法であって、該方法は分析物に対する特異的結合親和性を有する可逆的に固定化された結合パートナーの固体支持体からの特異的置換、または分析物の可逆的固定化類似体の固体支持体からの類似の特異的置換を含んでなり、該置換は、目的とする分析物の存在に反応して起こると共に検出し得る信号を発生させるものであり、前記可逆的固定化結合パートナーも分析物の類似体も従来の標識を含まないことを特徴とする方法。１４．さらに請求項１〜１０のいずれか一項に従う請求項１３に記載の方法。１５．サンプル中における目的とする分析物の存在を検出するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは分析物への特異的結合親和性を有する結合パートナーをその上に可逆的に固定化された状態で有するまたは分析物の類似体をその上に可逆的に固定化された状態で有する固体支持体を含んでなり、前記結合パートナーまたは類似体は、従来の標識を含んでおらず、目的とする分析物の存在に反応して固体支持体から特異的に置換されて検出し得る信号を発生させるようなアッセイデバイス。１６．請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法の実施に用いるための請求項１５に記載のアッセイデバイス。