JP2000501617A - 酵母細胞におけるｎ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、N末端伸長タンパクポリペプチドをコードするDNA配列を具備したDNA構築物、その様なDNA断片を有するベクター、及び前記ベクターで形質転換した酵母細胞、並びに酵母を含む真核生物細胞において異種タンパクを産生する方法に関する。前記DNA構築物は以下の構造をコードする：シグナルペプチド-リーダーペプチド-EEAEPK-ポリペプ

Description

【発明の詳細な説明】 酵母細胞におけるＮ末端を伸長されたタンパクの発現のためのベクター 発明の分野 本発明は、真核生物細胞（好ましくは酵母細胞）において発現及びプロセッシ ングされたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするDNA配列を具備するDNA 構築物、前記DNA断片を有するベクター、及び前記ベクターで形質転換した細胞( 酵母細胞を含む)、並びに酵母における異種タンパクの産生方法に関する。 発明の背景 酵母生物体は、細胞内で合成され、細胞の外で機能する多くのタンパクを産生 する。その様な細胞外タンパクは、分泌タンパクと呼ばれている。これらの分泌 タンパクは、先ず最初に、前駆物質、又は予備形態(preform)［発現された生成 物が小胞体（ER）の膜を横切る効果的な方向付けを確実にするプレ配列（preseq uence）を含む］として細胞内に発現される。プレ配列（通常シグナルペプチド と呼ばれる）は、一般的に移動中に必要な生成物から切り取られる。分泌経路に 侵入すると、タンパクはゴルジ装置に輸送される。ゴルジからのタンパクは、細 胞液胞や細胞膜のような画分に導かれる異なる経路に入って、又は細胞外に送ら れて細胞外の培地に分泌されてもよい(Pfeffer,S.R.and Rothman,J.E.Ann.Rev.B iochem.56(1987),829-852)。 幾つかの研究方法が、酵母に対して異種であるタンパクを、酵母において発現 及び分泌するために示唆されてきた。欧州公開番号第0088632A号は、酵母の異種 タンパクを発現し、プロセッシングし、更に分泌させる方法であって、DNA（所 望するタンパクおよびシグナルペプチドをコードする）を導入した発現ベクター で酵母生物体を形質転換することと、形質転換した生物体の培養体を調製するこ とと、その培養体を増殖させることと、及び該培養液からタンパクを回収するこ ととによる方法を開示している。前記のシグナルペプチドは、所望するタンパク 自身のシグナルペプチド、異種シグナルペプチド、又は本来のペプチドと異種シ グナルペプチドのハイブリッドであってもよい。 酵母に対して異種のシグナルペプチドを使用するときに直面する問題は、異種 シグナルペプチドが、効率のよい移動および／またはシグナルペプチドの後方で の前駆体ポリペプチドを切除することを確実に実行できない可能性があることで ある。 サッカロミセス・セレビシアエ・ MFα1（Saccharomyces cerevisiae MFα１ ：α因子）は、19アミノ酸長シグナル若しくはペプチドと、それに続く64アミノ 酸長「リーダー」を具備する165アミノ酸プレプロ体［3つのN−結合グルコシレ ーション部位が包含し、(LysArg(Asp/Glu,Ala)_2-3α因子)₄がその後に続いてい る］として合成される。プレプロMFα1のシグナル-リーダー部分は、S.セレビシ アエにおける異種タンパクの合成および分泌を獲得するために広く使用されてき た。 酵母に対して異種であるシグナル／リーダーペプチドの使用は、なかんずく、 米国特許第4,546,082号、欧州特許第0116201A号、0123294A号、0123544A号、016 3529A号、0123289A号及び欧州特許第0100561B号から知られている。 欧州特許第0123289A号において、S.セレビシアエα因子前駆体の利用が開示さ れているのに対し、欧州特許第100561号は、サッカロミセス・セレビシアエ・ P HO5シグナルの利用を開示しており、更にPCT国際公開番号ＷＯ 95/02059は、外 来タンパク分泌のためのYAP3シグナルペプチドを利用することについて開示して いる。 米国特許第4,546,082号及び欧州特許公開第0016201A号、0123294A号、0123544 A号及び0163529A号は、酵母において発現された異種タンパクの分泌方法におい て、サッカロミセス・セレビシアエ（MFα1又はMFα2）由来のα−因子シグナル リーダーを利用する方法を開示している。所望するタンパクの遺伝子の5’末端 で、S.セレビシアエMFα1シグナル／リーダー配列をコードするDNA配列を融合す ることにより、所望するタンパクの分泌及びプロセッシングが決定された。 欧州特許第206783号は、S.セレビシアエ由来のポリペプチドの分泌系を開示し ており、それによると、α因子リーダー配列が切って短くされ、本来のリーダー 配列に存在する４つのα因子ペプチドを除去する。これは、α因子プロセッシ ング部位であるLys-Arg-Glu-Ala-Glu-Alaを介して異質ポリペプチドに融合させ たそれ自身のリーダーペプチドを残すためである。この構築は、より小さいペプ チド（50アミノ酸未満）の生成にとっては効率のよいプロセッシングを導くこと を示している。より大きなポリペプチドの分泌及びプロセッシングのためには、 本来のα因子リーダー配列を切って短くし、リーダーペプチドとポリペプチドと の間の１又は２のα因子ペプチドを残す。 多数の分泌されたタンパクは、順次タンパク分解プロセッシング系（カルボキ シ末端で２つの連続した塩基性アミノ酸でなるペプチド結合を切断できる）に曝 される。この酵素による活性は、S.セレビシアエでは、KEX2遺伝子によりコード される(Julius,D.A.ら、Cell 37(1984b),1075)。KEX2プロテアーゼによる前記生 成物のプロセッシングは、因子α1（MFα1又はα因子）に関する活性化S.セレビ シアエの分泌には必要とされるが、因子ａに関する活性化Ｓ．セレビシアエの分 泌には関連性がない。 分泌されるべきポリペプチドの分泌及び適切なプロセッシングは、上記で挙げ られた文献に示されるように、構築されたベクターで形質転換する酵母生物体を 培養した幾つかの場合で得られる。しかしながら、多くの場合、分泌のレベルは 非常に低いか、分泌が見られず、又は蛋白分解のプロセッシングが不適格若しく は不完全であることもある。PCT国際公開番号第ＷＯ 90/10075号に記述されるよ うに、これは、ある点では、リーダーペプチドのC末端と異種タンパクのＮ末端 との間に位置するプロセッシング部位の暴露が、不十分であるため、その蛋白分 解切断が困難か、またはこれが容易でないことに起因すると考えられている。 国際公開番号第ＷＯ 90/10075号は、リーダーペプチドのＣ末端及び／又はリ ーダーペプチドに融合された異種ポリペプチドのN末端にあるプロセッシング部 位の近くにある一定の修飾を提供することにより得られた、異種ポリペプチドの 改良されたプロセッシングを有する酵母発現系を記述している。このように、的 確なプロセッシングをしたタンパクの方が、修飾を行わなかったリーダーペプチ ド-異種ポリペプチド構造体を用いたよりも高収率で得ることが可能である。本 発明の目的は、リーダーペプチドに融合した異種ポリペプチドの新規N末端修飾 （より効率的な発現及び／又はプロセッシングを確定できる）を提供すること、 並びに異種ポリペプチドのN末端の伸長部分の切除を改善した異種ポリペプチド の新規N末端修飾を提供することである。 発明の概要 本発明は、培養用培地からの生産物の精製中、又はその後に、インビトロにお けるタンパク分解により切り取ることが可能な伸長部分として設計された、異種 ポリペプチドのN末端の修飾を記述している。 本発明は、以下の構造を持ったポリペプチドをコードするDNA構築物に関する ： シグナルペプチド−リーダーペプチド−EEAEPK-異種タンパク。 IUPAC-IUB生化学命名法委員会(IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenc lature)により認定された規定（1974）に従って、慣習的なアミノ酸の１文字コ ードを本明細書及びクレームにおいて一貫して使用した。 本明細書に関して、「シグナルペプチド」の語は、プレ配列（酵母において発 現される細胞外タンパクの前駆体フォームのＮ末端配列として存在する）を意味 することが理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパクを分泌するた めに小胞体に送り込むことである。シグナルペプチドは、通常、この過程の途中 で切り離される。シグナルペプチドは、タンパクを産生する酵母生物体に対して 異種(heterologous)であっても同種(homologous)であってもよい。本発明におけ る好ましいシグナルペプチドは、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(YAP3)シグ ナルペプチド、又はその何れかの機能的な類似物である。YAP3は、イーグル−ミ タニら(Egel-Mitani，M.et al.,YEAST,6,p.127-137,1990)により、クローニング され、特徴付けされている。 「リーダーペプチド」という表現は、プロペプチド配列の形態にあるペプチド を指すことが理解されるであろう。その機能は、培地中に分泌するために、異種 タンパクを分泌させ、小胞体からゴルジ装置に、更に、分泌胞(secretory vesic le)へと方向づけすることである[即ち、発現されたタンパク又はポリペプチドを 細胞膜及び(もし存在するならば)細胞壁を経て細胞外に輸送することであり、又 は、少なくとも細胞膜を経て、細胞壁を有する細胞のペリプラズム間隙に輸送 することである]。好ましくは、リーダーペプチドは、ここで開示した配列認識 番号５のようなLA19リーダーペプチドである。 「異種タンパク」という表現は、ホスト生物体において、その本来の性質では 産生されないタンパク又はポリペプチドを示すことを意図し、好ましくは、酵母 において、その本来の性質では産生されないポリペプチドを示す。しかしながら 、当業者にとっては、同種ポリペプチドを産生すること(哺乳類の細胞における グルカゴンの産生のような場合)、また前記ポリペプチドも「異種タンパク」の 意味に含まれることが分かるであろう。 配列EEAEPKは、異種ポリペプチドのN末端での伸長部分を形成する。この伸長 部分は、発酵の収量を増加させる(increases the fermentation yield)のみでは なく、ジペプチジルアミノペプチダーゼ(DPAP A)プロセッシングに対する保護を 提供し、ポリペプチドの同種N末端を生じる。伸長部分は、発酵中の蛋白分解性 の切断に抵抗するように構成され、その結果、その後にインビトロにおける成熟 のために、N末端が伸長された異種タンパク生成物を培養用培地から精製するこ とができる[例えば、トリプシン又はアクロモバクターリチクスプロテアーゼI(A chromobacter lyticus protease I)による]。N末端の伸長部分EEAEPKの必要なイ ンビトロにおける除去は、トリプシン又はアクロモバクターリチクスプロテアー ゼＩの何れかにより難なく達成され、おそらくこれは、N末端伸長ペプチドの融 通性のためであり、これにより成熟した異種タンパクの収量が改善される。 本発明は、更に、真核生物細胞、好ましくは酵母細胞において複製が可能な、 且つ本発明のDNA構築物を有する組替え発現ベクターに関する。好ましくは、DNA 構築物は、合成リーダーペプチド、好ましくは LA19リーダーペプチドを具備す る。加えて、本発明は、本願の図２に記述するDNA構築物に関する。本発明はま た、異種タンパク発現が可能であり、且つ本発明のベクターで形質転換した真核 生物細胞、好ましくは酵母細胞に関する。 更に、本発明は、酵母における異種タンパク産生のための方法であって、形質 転換した酵母株を適切な培地中で培養して、異種タンパクを発現及び分泌させる こと、その後にそのタンパクを培地及び／又は細胞から単離することとを具備す る方法に関する。 図面の簡単な説明 添付した図面を参照しながら更に本発明を説明する、 ここで、 図１は、本発明のN末端伸長ポリペプチドを発現する遺伝子を含有する発現プラ スミドpAK729を示し、以下の記号を使用している： TPI-プロモーター：S.セレビシアエ由来のTPI遺伝子プロモーター配列を示す。 ２：シグナル／リーダーペプチド（例えば、EEAEPK N末端伸長MI3インスリン前 駆体を伴ったYAP3シグナルペプチドおよびLA１９リーダーペプチド由来）をコー ドする領域を示す。 TPI-ターミネーター：S.セレビシアエのTPI遺伝子ターミネーター配列を示す。 TPI-ポンベ：S.ポンベ由来のTPI遺伝子を示す。 オリジン：S.セレビシアエにおけるDNA複製のそのオリジンを含んだS.セレビシ アエ2μプラスミド由来の配列を示す。 AMP-R：アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌中のDNA複製のオリジンを含むpB R322/pUC13由来の配列。 配列認識番号１は、YAP3シグナルペプチド(アミノ酸番号２から２１)、LA19リー ダーペプチド(アミノ酸番号２２から６４)、N末端伸長 EEAEPK(アミノ酸番号６ ５から７０)、MI3インスリン前駆体B_chain(1-29)-Ala-Ala-Lys-A_chain(1-21)（ アミノ酸番号７１から１２３）をコードするpAK729のDNA配列及びアミノ酸配列 である。 配列認識番号２は、例２のYAP3シグナルペプチド-LA19リーダー EEAEPK-MI1イン スリン前駆体複合体をコードするpAK733のDNA配列及びアミノ酸配列である。 配列認識番号３は、例３のYAP3シグナルペプチド-LA19リーダーEEAEPK-MI5イ ンスリン前駆体複合体をコードするpAK749のDNA配列及びアミノ酸配列である。 配列認識番号４は、例４のYAP3シグナルペプチド-LA19リーダーEEAEPK-X14イン スリン前駆体複合体をコードするpAK866のDNA配列及びアミノ酸配列である。 配列認識番号５は、LA19リーダーDNA配列である。 発明の詳細な説明 本発明の方法により生成したN末端伸長異種タンパクは、真核生物細胞、好ま しくは酵母細胞において都合よく産生され得る何れのタンパクであってもよい。 その様なタンパクの例は、アプロチニン(aprotinin)、ティッシュファクターパ スウェイインヒビター(tisuue factor pathway inhibitor)、又は他のプロテア ーゼインヒビター、及びインスリン又はインスリン前駆体、インスリン類似物、 インスリン様成長因子 I、II、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン、インタ ーロイキン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、トランスフォーミンググ ロースファクターａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１(GLP-1)、グ ルカゴン様ペプチド２(GLP-2)、GRPP、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血 小板由来成長因子、リパーゼ等の酵素、又はこれらタンパクの何れか一つの機能 的な類似物が挙げられる。本明細書に関して、「機能的な類似物」の語は、本来 のタンパクと同様な機能を有するポリペプチドを意味する(これは本来のタンパ クの生物学的な活性のレベルと言うよりは寧ろ、その性質に関することが理解さ れることを意図する)。ポリペプチドは、本来のタンパクと構造上同じであって よく、本来のタンパクに由来していてもよい(本来のタンパクのC末端およびN末 端のどちらか一方または両方に、１以上のアミノ酸を付加すること、本来のアミ ノ酸配列における１以上の異なる部位で、１以上のアミノ酸を置換すること、本 来のタンパク質のアミノ酸配列における１末端若しくは両末端、又は１以上の部 位において１以上のアミノ酸が欠失していること、又は本来のアミノ酸配列の１ 以上の部位で１以上のアミノ酸を挿入することによる)。その様な修飾は、上記 で言及したタンパクの幾つかにおいてよく知られている。 「インスリン前駆体」又は「インスリン類似物の前駆体」により、プロインス リンを含む単鎖ポリペプチド（1以上のその後の化学的及び／又は酵素的な方法 により、天然のヒトインスリンで見られるような３つのジスルフィドによる架橋 の適切な確立を持つ２重鎖インスリン又はインスリン類似体分子に変換され得る ）であることが理解される。このような方法で産生可能なインスリン又はインス リン類似物の例は、ヒトインスリン、好ましくはデス(B30)ヒトインスリン、ブ タインスリン；及び少なくとも１Lys又はArgを有するインスリン類似物、好まし くは、Phe^B1を欠失したインスリン類似物、A鎖及び／又はB鎖がN末端伸長を有す るインスリン類似物、及びA鎖及び／又はB鎖がC末端伸長を有するインスリン類 似物である。他の好ましいインスリン類似物は、１以上のアミノ酸残基、好まし くは１、２又は３のアミノ酸残基が他のコードされ得るアミノ酸残基により置換 されたようなものである。例えば、親インスリンは、A21の位置におけるAsnの代 わりに、Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr又はVa lからなる群、詳しくはGly、Ala、Ser及びThrからなる群より選択されたアミノ 酸残基を持つことが可能である。また、インスリン類似物は、上記の概略のよう な変更を組み合わせることにより修飾することも可能である。同様に、親インス リンは、B28の位置におけるProの代わりに、Asp、Lys等からなる群から選択した アミノ酸残基を有すること、及び親インスリンは、B29の位置におけるLysの代わ りに、アミノ酸Proをもつことが出来る。ここで用いた「コードされ得るアミノ 酸残基」の表現は、遺伝子コード、即ち、３ヌクレオチド(「コドン」)によりコ ードされ得るアミノ酸残基を表す。 最も好ましいインスリン前駆体は、MI1、B(1−29)-A(1-21)；MI3、B(1-29)-Al a-Ala-Lys-A(1-21)(例えば、欧州特許第163 529号に記述される)；X14、B(1-27- Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)(例えば、国際公開番号第95/00550号に記述され る)；B(1-27-Asp-Lys)-A(1-21)；B(1-27-Asp-Lys)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21 )；B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)(例えば、国際公開番号第95/07931号に記述さ れる)；M15、B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1-21)；及びB(1-29)-Ser-Asp-Asp -Ala-Arg-A(1-21)である。 本発明のポリペプチドをコードする本発明のDNA構築物は、確立された標準的 な方法により合成して製造することができる[例えば、ビューケージらにより記 述されたホスホアミダイト法(phosphoamidite method；S.L.Beaucage and M.H. Caruthers,Tetrahedron Letters 22,1981,pp.1859-1869)、又はマテスらにより 記述された方法(Matthes et al.,EMBO Journal 3,1984,pp.801-805)]。ホスホア ミダイト法により、オリゴヌクレオチドを合成し(例えば、自動DNA合成装置を用 いて)、精製し、二重鎖にし、結合して合成DNA構築物を形成する。DNA構築物を 製造する一般的に好ましい方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)であり、例えば 、サンブルックらにより記述される(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Lab oratory Manual,Cold Spring Harbor,NY,1989)。 本発明のDNA構築物は、また、ゲノムオリジン又はcDNAオリジン、例えば、標 準技術（Sambrood et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Sprin g Harbor,1989を参照されたい）による本発明のポリペプチドの全部又は一部分 をコードするDNA配列の、ゲノム又はcDNAライブラリー構築及びスクリーニング を前もって行うことにより得ることが出来る。この場合、シグナル及びリーダー ペプチドをコードするゲノム又はcDNAを、異質タンパクをコードするゲノム又は cDNA配列に結合してもよく、その後にDNA配列をポリペプチドのアミノ酸配列EEA EPKに対応する部位で修飾してもよい(同種組替えのために必要なアミノ酸配列を コードする合成オリゴヌクレオチドを、周知の方法、又は適切なオリゴヌクレオ チドを用いたPCRにより好ましく生成された必要な配列を挿入することによる)。 最後に、DNA構築物は、ゲノム又はcDNAオリジンの断片（即ち、完全なDNA構築 物のウイルス部分に相当する断片）をアニーリングすることにより標準技術に従 って適切に調製した混合した合成オリジンとゲノムオリジン、混合した合成オリ ジンとcDNAオリジン、又は混合したゲノムオリジンとcDNAオリジンであってもよ い。例えば、異種タンパクをコードするDNA配列が、ゲノム又はcDNAオリジンで あってもよく、同時に、シグナル及びリーダーペプチドをコードする配列、並び にN末端伸長EEAEPKをコードする配列を合成により調製してもよいと認識できる 。 １つの局面において、本発明は、酵母において複製が可能であり、且つ上記の ポリペプチドをコードするDNA構築物を有する組替え発現ベクターに関する。該 組替え発現ベクターは、酵母生物体において複製が可能である如何なるベクター でもよい。該ベクターにおいて、本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は 、適切なプロモーター配列に作動的に結合されるべきである。該プロモーターは 、酵母において転写活性を示し、且つ酵母に対する同種タンパク又は異種タンパ クの何れかをコードする遺伝子に由来する何れのDNA配列でもよい。プロモータ ーは、好ましくは酵母に対して同種のタンパクをコードする遺伝子に由来する。 適切なプロモーターの例は、サッカロミセス・セレビシアエ Mα1、TPI、ADH又 はPGKプロモーターである。 本発明のポリペプチドをコードするDNA配列は、また、適切なターミネーター ［例えば、TPIターミネーター(T.Alber and G.Kawasaki,J.Mol.Appl.Genet.1,19 82,pp.419-434を参照されたい)］に作動的に結合する。 本発明の組替え発現ベクターは、酵母において複製が可能なDNA配列を具備す る。その様な配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子REPI-3及び複製のオリ ジンである。本ベクターは、また、選択性可能なマーカー（例えば、P.R.Russel l,Gene 40,1985,pp.125-130に記述されるシゾサッカロミセス・ポンペTPI遺伝子 ）である。 本発明のポリペプチドをコードするDNA配列（即ち、プロモーター及びターミ ネーター）の結合に使用される方法、酵母の複製に必要な情報を備えた適切な酵 母ベクターにそれらを挿入する方法は、当業者に周知である(Sambrook et al., の上述の引用文献を参照されたい)。該ベクターは、まず、本発明のポリペプチ ドをコードする完全なDNA配列を含むDNA構築物を調製し、次に、この断片を適切 な発現ベクターに挿入し、又は、続いて個々の要素（シグナル、リーダー又は異 種タンパク）のための遺伝子情報を含むDNA断片を挿入し、続いて結合すること により構築できることが理解されるであろう。 本発明の方法で使用される酵母生物体又は真核生物ホスト細胞は、培養系にお いて、大量の当該異種タンパク又はポリペプチドを産生する何れの適切な酵母生 物体でもよい。適切な酵母生物体の例は、以下；酵母種サッカロミセス・セレビ シアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルイビリ(Saccharomyc es Kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、サ ッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)、クルイベロミセス・ラク チス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorph a)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア・メタノリカ(Pichia metha nolica)、ピチア・クルイベリ(Pichia Kluyveri)、セロウイア・リポリチカ(Yar rowia lipolytica)、カンジダ・ sp.(Candida sp.)、カンジダ・ウチリス(Candi da utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ゲオトリクウム・ sp.(Geo trichum sp.)及びゲオトリクウム・フェロメンタンス(Geotrichum fermentans) ；から選択された株、好ましくは酵母種サッカロミセス・セレビシアエである。 当業者にとっては、ホスト生物体として、何れの他の真核生物細胞［アスペルギ ルス（Aspergillus）属の細胞、ストレプトミセス（Streptomyces）属の細胞、 昆虫細胞又は哺乳動物細胞等］からも選択することが可能であることが明らかで あると見なされるであろう。 酵母細胞の形質転換は、例えば、プロトプラスト形成により達成されて、本質 的に知られる方法での形質転換が後に続く。該細胞の培養で使用される培地は、 酵母又はガニスムス（ganisms）が成長するために適切な従来の何れの培地でも よい。分泌される異種タンパク(そのかなりの割合が、正確にプロセッシングさ れた形態で培地中に存在するであろう)は、従来の方法［遠心又は濾過による培 地からの酵母細胞の分離、塩析（例えば、硫酸アンモニウム）によるタンパク類 の沈澱、続くクロマトグラフィ法(例えば、イオン交換クロマトグラフィ、アフ ィニティクロマトグラフィ等)による精製を含む］により培地から回収されてよ い。タンパクが、ペリプラズム間隙に分泌される場合は、細胞を酵素的又は機械 的に粉砕しする。 培養用培地又はペリプラズム間隙への分泌の後、タンパクを様々な手段に処し て、配列EEAEPKを取り除いてよい。 伸長は、発酵の間、DPAP等の酵母プロテアーゼのタンパク分解活性に対して異 種タンパクのN末端を保護しているので、伸長部分は異種タンパクに安定して結 合していることは明らかである。また、異種タンパクにおけるN末端伸長は、該 タンパクの化学的なプロセッシング中に、異種タンパクのN末端のアミノ酸基を 保護するために用いてもよい(即ち、BOC又は同様な保護基の置換基として用いて もよい)。その様な場合、アミノ酸配列EEAEPKを、回収した異種タンパクか ら、蛋白分解酵素(塩基性アミノ酸に特異的、即ちK(Lys))を用いた手段により取 り除いてもよく、その結果、末端伸長部分は、Kの位置で切除される。その様な 蛋白分解酵素の例は、トリプシン、又はアクロモバクター・リチクス・プロテア ーゼＩである。 本発明を、以下の例において更に詳しく説明するが、何れにしても以下の記述 により本発明の範囲が制限されることはない。 例１．EEAPK-MI3インスリン前駆体を発現する酵母株yAK729の構築 N末端伸長インスリン前駆体EEAEPK-MI3のN末端伸長部をコードする合成遺伝子 を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて構築した。 以下の２オリゴヌクレオチドが合成された： #672 5'-TCTCCATGGCTAAGAGAGAAGAAGCTGAACCAAAGTTCGTT-3' #2785 5'-AATTTATTTTACATAACACTAG-3' オリゴヌクレトチドは、自動ＤＮＡ合成装置（アプライド・バイオシステムズ ・モデル 380Ａ）を用いて、ホスホアミダイト・ケミストリー(phosphoamidite chemistry)及び商業的に入手可能な試薬（Beaucage,S.L.and Caruthers,M.H.,Te trahedron Letters 22(1981)1859-1869）を用いて合成した。 以下のPCRは、PwoDNAポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・GmbH,Sand h oefter Strasse 116,Mannheim,Germany）を用いて、製造業者の使用説明書に従 って行った。PCR mixには、100μlの鉱油を被せた(シグマ・ケミカル・ Co.,St. Louis MO,USA)。 PCR 5μl オリゴヌクレオチド #672（50pmol） 5μl オリゴヌクレオチド #2785（50pmol） 10μl 10X PCR緩衝液 8μl dNTP mix 0.5μl Pwo酵素 テンプレートとして0.5μl pAK680プラスミド（0.2μgDNA） 71μl蒸留水 全12サイクル行い、１サイクルは94C、45se.;40C、lmin；72C、1.5minで行っ た。次にPCR混合物を2.5%アガロースゲル上に位置し、電気泳動を標準技術（Sam brook J,Fritsch El and Maniatis T,Molecular cloning,Cold Spring harbour laboratory press,1989）を用いて行った。得られたDNA断片は、アガロースゲル から切り抜き、ジーン・クリーン・キット（gene clean Kit;Bio 101 inc.,PO B OX 2284,La Jolla,CA 92038,USA）により製造業者の説明書に従って単離した。 精製したPCR DNA断片を14μlの水及び制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し 、制限エンドヌクレアーゼNcol及びXbalを用いて標準技術（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory pres s,1989）に従い切断した。209ヌクレオチド塩基対におけるNcol-Xbal DNA断片を 、アガロース電気泳動に供し、上述のジーン・クリーン・キットを用いて精製し た。 プラスミドpAK721（図１を参照されたい）を制限エンドヌクレアーゼであるBg III及びXbalにより切断し、10849ヌクレオチド塩基対のベクター断片を、上述の ジーン・クリーン・キットを用いて単離した。プラスミドpAK721は、制限エンド ヌクレアーゼ BgIII及びNcolで切断し、160ヌクレオチド塩基対のDNA断片を上記 のジーン・クリーン・キットを用いて単離した。３つのＤＮＡ断片を、T4 DNAリ ガーゼと標準条件（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T，Molecular clonin g,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を用いて互いに結合した。次 にリゲーションミックス(ligation mix)を適合する大腸菌株（Ｅ.coli strain;R -,M+）中にトランスフォームし、続いて、アンピシリン抵抗性により選択した。 得られた大腸菌由来のプラスミドを標準技術（Sambrook J,Fritsch EF and Ma niatis T,Molecular colning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を 用いて単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼ（即ち、Nco Ｉ及びXbal）を用い て挿入を確認した。選択されたプラスミドが、EEAEPK-MI3インスリン前駆体 ＤＮＡのための正確なＤＮＡ配列をコードしていることと、合成 LA19リーダーD NAをコードするDNAの後に挿入されていることとが、DNA配列分析（Sequenase,U. S.Biochemica Corp.,USA）により示された。該プラスミドはpAK729と命名された 。 YAP3シグナルペプチド-LA19リーダー EEAEPK-MI3インスリン前駆体複合体をコ ードするDNA配列は、配列認識番号１に示した。 プラスミドpAK721を、国際出願番号PCT/DK95/00250に記述の通りにS.セレビシ アエ株MT663中にトランスフォームし、得られた株をyAK721と命名した。 酵母発現プラスミドpAK729は、C-POT型（図１を参照されたし）であり、国際 公開番号第ＷＯ EP 171 142号に記述されたものと同じであり、プラスミド選択 、及びＳ．セレビシアエでの安定化のために、シゾサッカロミセス・ポンベりん 酸トリオースイソメラーゼ遺伝子（POT）を含んでいる。pAK729はまた、S.セレ ビシアエリん酸トリオースイソメラーゼプロモーター及びターミネーターも含ん でいる。プロモーター及びターミネーターは、YAP3シグナルペプチド−LA19リー ダーペプチド−EEAEPK-MI3インスリン前駆体をコードするEcoRIXbal断片の間の 配列を除いたプラスミドの全配列である時に、プラスミドpKFN1003（国際公開番 号ＷＯ90/100075号に記述される）に記述されたものと同じとなる。 例２．EEAEPK-MI3インスリン前駆体を発現している酵母株yAK733の構築 Ｎ末端が伸長されたインスリン前駆体であるEEAEPK-MI1のN末端伸長部分をコ ードする合成遺伝子をリーダー及び伸長及びインスリン前駆体を、コードする種 々のDNA断片を組み合わせることにより構築した。 プラスミドpAK721（図１を参照されたい）を制限エンドヌクレアーゼ BgIII及 びXbalを用いて切断し、10849ヌクレオチド塩基対のベクター断片を上述のジー ン・クリーン・キットを使用して単離した。 プラスミドpAK730を、制限エンドヌクレアーゼ HindIII及びXbaIを用いて切断 し、131ヌクレオチド塩基対のＤＮＡ断片を上述のジーン・クリーン・キットを 使用して単離した。 プラスミドpAK729を制限エンドヌクレアーゼ BgIII及びHindIIIを用いて切 断し、229ヌクレオチドのDNA断片を上述のように単離した。 ３つのDNA断片を、T4 DNAリガーゼと標準条件（Sambrook J,Fritsch EF and M aniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989） を使用して互いに結合した。次に、リゲーションミックスを適合する大腸菌株（ R-,M+）にトランスフォームし、続いて、アンピシリン抵抗性を用いて選択した 。得られた大腸菌由来からプラスミドを標準技術（Sambrook J,Fritsch EL and Maniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989） を使用して単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて挿入物を確認した。 選択したプラスミドは、DNA配列分析（Sequenase,U.S．Biochemical Corp.,USA ）により、EEAEPK-MI1インスリン前駆体 DNAに対して正確なＤＮＡ配列をコード していること、及び合成 LA19リーダー及び伸長DNAをコードするDNAの後ろに挿 入されていることが示された。このプラスミドはpAK733と命名された。 YAP3シグナルペプチド-LA19-リーダー EEAEPK-MI1インスリン前駆体複合体を コードするDNA配列を配列認識番号２に示した。 プラスミドpAK733を国際出願番号第PCT/DK95/00250号に記述されるのように、 S.セレビシアエ株MT633にトランスフォームし、得られた株をyAK733と命名した 。酵母発現プラスミドpAK733はC-POT型（図１を参照されたい）であり、国際公 開番号第ＷＯ EP 171 142号に記述されたものと同じであり、プラスミドの選択 、及びS.セレビシアエにおける安定化のためにシゾサッカロミセス・ポンベリん 酸トリオースイソメラーゼ遺伝子（POT）を含んでいる。pAK733は、また、S.セ レビシアエリん酸トリオースイソメラーゼプロモーター及びターミネーターを含 んでいる。プロモーター及びターミネーターは、YAP3シグナルペプチド-LA19リ ーダー-EEAEPK-MI1インスリン前駆体をコードするEcoRI-Xbal断片の間の配列を 除いたプラスミドの全配列であるときに、プラスミドpKFN1003（国際公開番号W9 0/10075に記述される）で記述されるものと同じとなる。 例3．EEAEPK-MI5インスリン前駆体を発現する酵母株yAK749の構築 N末端を伸長されたインスリン前駆体EEAEPK-MI5のN末端の伸長部分をコードす る合成遺伝子を、リーダー及び伸長部分並びにインスリン前駆体をコードす る種々のDNA断片を組み合わせることにより構築した。 プラスミドpAK743を、制限エンドヌクレアーゼBgIII及びNhelを用いて切断し 、10757ヌクレオチド塩基対のベクター断片を上述のジーン・クリーン・キット を使用して単離した。 プラスミドpAK405を、制限エンドヌクレアーゼHindIII及びNhelを用いて切断 し、238ヌクレオチド塩基対のDNA断片をジーン・クリーン・キットを使用して単 離した。 プラスミドpAK729を、制限エンドヌクレアーゼBgIII及びHindIIIを用いて切断 し、229ヌクレオチドのDNA断片を上記のように単離した。 ３つのDNA断片を、T4 DNAリガーゼと標準条件（Sambrook J,Fritsch EF and M aniatis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989） を使用して互いに結合した。次に、リゲーションミックスを、適合する大腸菌株 （R-,M+）にトランスフォーミングし、アンピシリン抵抗性を用いて選択した。 得られた大腸菌由来のプラスミドを標準技術（Sambrook J,Fritsch EL and Mani atis T,Molecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を用 いて単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて挿入物を確認した。選択し たプラスミドを、DNA配列分析（Sequenase,U.S．Biochemical Corp.,USA）によ り、EEAEPK-MI5インスリン前駆体 DNAのための正しいDNA配列をコードしている こと、及び合成LA19リーダー及び伸長DNAをコードするDNAの後に挿入されている ことを示した。 YAP3シグナルペプチド-LA19リーダー EEAEPK-MI5インスリン前駆体複合体をコ ードするDNA配列を配列認識番号３に示す。 プラスミドpAK749を、国際出願番号第PCT/DK95/00250号に記述されるようなS. セレビシアエ株MT663にトランスフォームし、得られた株をyAK749と命名した。 酵母発現プラスミドpAK749は、C-POT型（図１を参照されたい）であり、国際公 開番号ＷＯ EP 171 142号に記述されるものと同じであり、pAK749は、プラスミ ドの選択、及びS.セレビシアエでの安定化のために、シゾサッカロミセス・ポン ベリん酸トリオースイソメラーゼ遺伝子（POT）を含む。また、pAK749は、S.セ レビシアエリん酸トリオースイソメラーゼプロモーター及びターミネー ターも含んでいる。プロモーター及びターミネーターは、YAP3シグナルペプチド -LA19リーダー-EEAEPK-MI5インスリン前駆体をコードするEcoRI-Xbal断片の間の 配列を除いたプラスミドの全配列であるときに、プラスミドpKFN1003（国際公開 番号第ＷＯ 90/100075号に記述される）に記述されるものと同じとなる。 例４．EEAEPK-X14インスリン前駆体を発現する酵母株yAK866の構築 N末端を伸長されたインスリン前駆体EEAEPK-X14のN末端延長部分をコードする 合成遺伝子を、リーダー及び伸長部及びX14インスリン前駆体をコードする様々 なDNA断片を組み合わせることにより構築した。 プラスミドpAK743は、制限エンドヌクレアーゼBgIII及びNhelを用いて切断し 、10757ヌクレオチド塩基対のベクター断片を上述のジーン・クリーン・キット を使用して単離した。 プラスミドpAK602は、制限エンドヌクレアーゼHindIII及びNhelを用いて切断 し、232ヌクレオチド塩基対のDNA断片を上述のジーン・クリーン・キットを使用 し単離した。 プラスミドpAK729を制限エンドヌクレアーゼBgIII及びHindIIIを用いて切断し 、229ヌクレオチドのDNA断片を上述のように単離した。 ３つのDNA断片を、T4 DNAリガーゼ及び標準条件（Sambrook J,Fritsch EF and Maniatis T,Moleular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989） を使用して互いに結合した。次に、リゲーションミックスを適合する大腸菌（R- ,M+）にトランスフォームし、アンピシリン抵抗性を用いて選択した。得られた 大腸菌由来のプラスミドを標準技術(Sambrook J,Fritsch EL and Maniatis T, M olecular cloning,Cold spring Harbour laboratory press,1989）を使用して単 離し、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて挿入物を確認した。選択されたプ ラスミドは、DNA配列分析（Sequenase,U.S.Biochemical Corp.,USA）により、EE AEPK-X14インスリン前駆体DNAの正確なDNA配列をコードしていること、及び合成 LA19リーダー及び伸長DNAをコードするDNAの後に挿入されていることが示された 。このプラスミドをpAK866と命名した。 YAP3シグナルペプチドLA19リーダー EEAEPK-X14インスリン前駆体複合体を コードするDNA配列を配列認識番号４に示す。 プラスミドpAK866を、国際出願番号第PCT/DK95/00250号に記述されるようなS. セレビシアエ株MT663にトランスフォームし、得られた株をyAK866と命名した。 酵母発現プラスミドpAK866は、C-POT型（図１を参照されたい）であり、国際公 開番号第ＷＯ EP 171 142号に記述されるものと同じであり、シゾサッカロミセ ス・ポンベリん酸トリオースイソメラーゼ遺伝子（POT）を、プラスミド選択の ため及びS.セレビシアエおける安定化のために含んでいる。pAK866は、また、S. セレビシアエリん酸トリオースイソメラーゼプロモーター及びターミネーターを 含む。プロモーター及びターミネーターは、YAP3シグナルペプチド-LA19リーダ ー-EEAEPK-X14インスリン前駆体をコードするEcoRI-Xbal断片の間の配列を除い たプラスミドの全配列であるときに、プラスミドpKFN1003（国際公開番号第ＷＯ 90/100075号に記述される）に記述されるものと同じとなる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 ペテルソン、アネッテ・フロスト デンマーク国、デーコー―3520 ファル ム、エルメリ・トゥエンティファースト （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ポリペプチドをコードし、且つ以下の構造［シグナルペプチド-リーダー ペプチド-EEAEPK-異種タンパク］を有するDNA構築物。 ２． 請求項１に記載のDNA構築物であって、シグナルペプチドが酵母アスパラ ギン酸プロテアーゼ３（YAP3）シグナルペプチド又はその機能的類似物である構 築物。 ３． 請求項１又は２のどちらか１項に記載のDNA構築物であって、前記リーダ ーペプチドが、合成リーダーペプチド、好ましくは本明細書中の配列認識番号５ のLA19リーダーペプチドである構築物。 ４． 請求項１から３の何れか１項に記載のDNA構築物であって、異種タンパク が、以下の群［アプロチニン、ティッシュファクターパスウェイインヒビター（ tisuue factor pathway inhibitor）又は他のプロテアーゼインヒビター、及び インスリン又はインスリン前駆体、インスリン類似物、インスリン様成長因子 I 若しくは II、ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモン、インターロイキン、組 織型プラスミノーゲンアクチベーター、トランスフォーミング成長因子ａ若しく はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１(GLP-1)、グルカゴン様ペプチド２( GLP-2)、GRPP、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来成長因子、酵 素（リパーゼ等）またはこれらのタンパクの何れか１つの機能的な類似物］から 選択される構築物。 ５． 請求項１、２又は３の何れか１項に記載のDNA構築物であって、異種タン パクが、以下よりなる群［アプロチニン、ティッシュファクターパスウェイイン ヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、インスリン様成長因子Ｉ若しくは II、ヒト成長ホルモン若しくはウシ成長ホルモン、インターロイキン、組織型プ ラスミノーゲンアクチベーター、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、第VII 因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板成長因子、酵素、インスリン又はインス リン前駆体、及びこれら何れのタンパクの機能的な類似物］から選択される構築 物。 ６． 請求項４又は５の何れか１項に記載のDNA構築物であり、異種タンパクが 、インスリン又はインスリン前駆体、好ましくは以下よりなる群［MI1、B(1-29) -A (1-21);MI3,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21);X14,B(1-27-Asp-Lys)-Ala-Ala-Lys-A (1-21);B(1-29)-Ala-Ala-Arg-A(1-21)；MI5、B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Lys-A(1 -21)；及びB(1-29)-Ser-Asp-A(1-21)］から選択される構築物。 ７． 請求項４又は５の何れか１項に記載のDNA構築物であって、異種タンパク が、インスリン又はインスリン前駆物質、好ましくはインスリン前駆体MI3、又 はその機能的な類似物である構築物。 ８． 本明細書にある配列認識番号１、２、３又は４に記述のDNA構築物。 ９． 真核生物細胞において複製が可能で、且つ請求項１から８の何れか１項に 記載のDNA構築物を有する組替え発現ベクター。 １０．酵母において複製が可能、且つ請求項１から８の何れか１項に記載のDNA 構築物を有する組替え発現ベクター。 １１．異種タンパクを発現することが可能であり、且つ請求項１０に記載のベク ターを用いてトランスフォームされた酵母細胞。 １２．サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミ セス・クルイビリ(Saccharomyces Kluyveri)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Sch izosaccharomyces pombe)、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum) 、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ハンセヌラ・ポリモル ファ(Hansenula polymorpha)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、ピチア ・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・クルイベリ(Pichia Kluyveri)、 ヤロウイア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ・ sp.(Candida sp.) 、カンジダ・ウチリス(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi) 、ゲオトリクウム・ sp.(Geotrichum sp.)及びゲオトリクウム・フェロメンタン ス（Geotrichum fermentans）の種類から選択された請求項１１に記載の酵母細 胞であり、好ましくはサッカロミセス・セレビシアエである酵母細胞。 １３．異種タンパクを産生するための方法であって、請求項１１又は１２の何れ か１項に記載の酵母細胞を適切な培地中で培養して、異種タンパクを発現及び分 泌させることと、その後、前記タンパクを培養用培地及び／又は前記細胞から単 離することとを具備した方法。 １４．異種タンパクを産生するための方法であって、請求項１１又は１２の何 れか１項に記載の酵母細胞を適切な培地中で培養して、異種タンパクを発現及び 分泌させることと、その後、前記タンパクを培養用培地から単離することとを具 備した方法。 １５．請求項１３又は１４の何れか１項に記載の方法であって、蛋白分解酵素( 塩基性アミノ酸に特異的)で処理を伴う方法により回収した異種タンパクから、 アミノ酸配列EEAEPKを取り除く方法。 １６．請求項１５に記載の方法であって、前記蛋白分解酵素がトリプシンとアク ロモバクテロ・リチクス・プロテアーゼＩ（Achromobacter lyticus protease I ）とからなる群より選択される方法。